Способ подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических соединений в биоматериале
Владельцы патента RU 2713661:
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Дальневосточный федеральный университет» (ДВФУ) (RU)
Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способу количественного определения хлорорганических пестицидов и полихлорированных бифенилов во внутренних органах и тканях человека. Для этого хлорорганические соединения экстрагируют п-гексаном из измельченной пробы с последующей очисткой соэкстрактивных веществ концентрированной серной кислотой. Полученный концентрат экстракта подвергают адсорбционной очистке и разделению хлорорганических соединений методом колоночной хроматографии в нормально-фазовом режиме, при этом используют силикат магния с фракцией 100-200 меш, активированный при 675°С. Колонки последовательно промывают вначале неполярным, а затем поляризованным элюентом. В качестве поляризованного элюента используют смесь п-гексан:дихлорметан=2:3. Изобретение позволяет повысить чувствительность метода для количественного определения α-, β-, γ-, δ-гексахлорциклогексана, 2,4- и 4,4-дихлордифенилтрихлорэтана, 2,4- и 4,4-дихлордифенилдихдорэтана, 2,4- и 4,4-дихлордифенилэтилена, дильдрина, эндрина в органах и тканях человека. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 ил., 1 пр.
Изобретение относится к способам количественного определения стойких хлорорганических соединений - хлорорганических пестицидов (α-, β-, γ-, δ-гексахлорциклогексана, 2,4- и 4,4-дихлордифенилтрихлорэтана, 2,4- и 4,4-дихлордифенилдихдорэтана, 2,4- и 4,4-дихлордифенилэтилена, дильдрина, эндрина) и полихлорированныхбифенилов - газохроматографическим и хроматомасс-спектрометрическим методами в органах и тканях человека и может быть использовано в биологии, экологии, медицине.
Известен способ подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических пестицидов в крови, включающий экстракцию пестицидов из крови п-гексаном, очистку от соэкстративных веществ концентрированной серной кислотой, концентрирование п-гексанового экстракта (см. RU №2414711, МПК G01N 33/50, G01N 33/48, 2011).
Недостатком этого решения является ограниченная область применения из-за невозможности исследования органов и тканей человека.
Известен также способ подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических соединений (ХОС) в биоматериале, включающий отбор пробы, ее измельчение и последующую экстракцию хлорорганических соединений п-гексаном, и последующую очистку от соэкстрактивных веществ концентрированной серной кислотой и получение концентрата п-гексанового экстракта хлорорганических соединений (см. патент РФ №2543360, МПК G01N 33/483, 2015).
Недостатком этого способа является недостаточная чувствительность способа к целевым хлорорганическим соединениям в концентрате п-гексанового экстракта за счет невысокого соотношения «сигнал/шум» в ходе хроматографии экстракта.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является повышение чувствительности метода к целевым хлорорганическим соединениям в концентрате п-гексанового экстракта.
Технический результат, проявляющийся при решении поставленной задачи, выражается в повышении чувствительности метода к целевым хлорорганическим соединениям в концентрате п-гексанового экстракта, за счет повышения соотношения «сигнал/шум» в ходе хроматографии экстракта.
Для решения поставленной задачи способ подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических соединений в биоматериале, включающий отбор пробы, ее измельчение и последующую экстракцию хлорорганических соединений п-гексаном, и последующую очистку от соэкстрактивных веществ концентрированной серной кислотой и получение концентрата п-гексанового экстракта хлорорганических соединений, отличается тем, что концентрат п-гексанового экстракта подвергают адсорбционной очистке и предварительному разделению на полярные и неполярные хлорорганические соединения, для чего используют колоночную хроматографию в нормально-фазовом режиме, при этом используют полярный сорбент с фракцией 100-200 меш, причем колонки последовательно промывают вначале неполярным элюентом, а затем поляризованным элюентом, раздельно отбирая материал после каждой промывки. Кроме того, в качестве полярного сорбента используют силикат магния, активированный при 675°С. Кроме того, как поляризованный элюент используют смесь «п-гексан:дихлорметан» в пропорции 2:3.
Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».
Совокупность признаков формулы изобретения обеспечивает возможность повышения чувствительности метода к целевым хлорорганическим соединениям в концентрате п-гексанового экстракта, за счет повышения соотношения «сигнал/шум» в ходе хроматографии экстракта.
При этом признаки отличительной части формулы изобретения решают следующие функциональные задачи.
Признак «…концентрат п-гексанового экстракта подвергают адсорбционной очистке…» обеспечивает значимое увеличение соотношения «сигнал/шум» за счет очистки экстракта от высокополярных нецелевых соединений.
Признак, указывающий, что концентрат п-гексанового экстракта также подвергают «предварительному разделению на полярные и неполярные хлорорганические соединения» обеспечивает значимое увеличение соотношения «сигнал/шум» за счет разделения экстрагированных веществ на экстракт низкополярных полихлорированных бифенилов и экстракт поляризованных хлорорганических пестицидов.
Признак, указывающий, что для разделения на полярные и неполярные хлорорганические соединения «используют колоночную хроматографию в нормально-фазовом режиме» обеспечивает далее принцип разделения смеси хлорорганических веществ п-гексанового экстракта.
Признак, указывающий, что «при этом используют полярный сорбент с фракцией 100-200 меш» задает характеристики твердой фазы для эффективного разделения экстрагированных в п-гексан хлорорганических веществ.
Признак, указывающий, что «колонки последовательно промывают вначале неполярным элюентом» обеспечивает далее хроматографическое отделение твердой фазой из п-гексанового экстракта низкополярных полихлорированных бифенилов.
Признаки, указывающие, что колонки промывают «затем поляризованным элюентом» задают последовательность контакта твердой фазы с поляризованным элюентом для эффективного отделения хлорорганических пестицидов в колонке при одновременном удержании высокополярных нецелевых примесей.
Признаки, указывающие, что материал отбирают «раздельно после каждой промывки» задают операцию разделения п-гексанового экстракта на концентраты полихлорированных бифенилов и хлорорганических пестицидов.
Признаки первого дополнительного пункта формулы изобретения задают качественные характеристики твердой фазы.
Признаки второго дополнительного пункта формулы изобретения задают уровень поляризации элюента для эффективного отделения хлорорганических пестицидов от твердой фазы при одновременном удержании высокополярных нецелевых примесей.
На фиг. 1 показана хроматограмма определения хлорорганических соединений (ХОС) в «стандарте» (биоматериале с заведомо известным уровнем содержания ХОС), при котором не применялось предварительное разделение смеси. Слияние отдельных близкостоящих пиков и высокий уровень «шума» на исследуемом интервале нивелирует возможность измерения хлорорганических соединений.
На фиг. 2 показана хроматограмма определения полихлорированных бифенилов в «стандарте» (биоматериале с заведомо известным уровнем содержания ХОС), при котором применено предварительное отделение смеси. Слияние отдельных близкостоящих пиков не наблюдается, высокий уровень «сигнала» на исследуемом интервале дает возможность качественного и количественного измерения исследуемых хлорорганических соединений.
На фиг. 3 показана хроматограмма определения хлорорганических пестицидов в «стандарте» (биоматериале с заведомо известным уровнем содержания ХОС), при котором применено предварительное отделение смеси, где розовым и черным цветами обозначены хлорорганические пестициды. Высокий уровень «сигнала» на исследуемом интервале дает возможность качественного и количественного измерения исследуемых хлорорганических соединений. В соответствии с чувствительностью метода наблюдается различная интенсивность отдельно стоящих пиков, что позволяет вести их количественный анализ.
На фиг. 4 показана компьютерная модель совмещения хроматограмм после определения хлорорганических веществ в «стандарте» (биоматериале с заведомо известным уровнем содержания ХОС), при котором применено предварительное отделение смеси. Слияние отдельных близкостоящих пиков не наблюдается, высокий уровень «сигнала» на исследуемом интервале дает возможность качественного и количественного измерения исследуемых хлорорганических соединений в сравнении с фиг. 1.
Объем пробы определяют исходя из концентраций анализируемых веществ в образце, чувствительности аналитического метода и воспроизводимости результатов при повторе количественного анализа.
Предел обнаружения определялся из расчета три стандартных отклонения на восемь - десять анализируемых на ХОСобразцов. Для анализа следовых концентраций ХОС обычно используют образцы от 1 до 10 г. Однако для более эффективного определения ХОС с высоким коэффициентом «октанол-вода» необходимо учитывать различное содержание липидов в органах и тканях человека, поскольку такой подход позволяет унифицировать дальнейшие этапы, включая экстракцию.
Для обеспечения повторяемости исследований обязательны к соблюдению следующие правила сбора проб.
Поперечно-полосатая мускулатура: отбираются мышцы, обычно задействованные в акте дыхания (musculusphrenicus, musculusserratus и др.); в качестве образца собирается поперечный срез мышцы в фасциальном футляре.
Подкожная жировая клетчатка: при висцероабдоминальном типе ожирения сбор образцов ведется с абдоминальной области; при глютеофеморальном типе ожирения сбор образцов ведется с феморальной области.
Желчный пузырь: гомогенизируется весь объем образца, включая обнаруживаемые конкременты любого типа (желчные камни).
Для сбора проб применяют одноразовый инструмент во избежание контаминации анализируемыми веществами.
Пример реализации способа
Отбирают пробу из внутренних органов или ткани человека. Все пробы помещают в стеклянные контейнеры достаточного объема и замораживают до температуры -20°С или ниже. Пустая пробирка необходима для контроля чистоты тары.
Пробы внутренних органов и тканей человека измельчают на ультрагомогенизаторе механически. Взвешивают такое количество гомогенизированной пробы, чтобы получить до 0,5 г сухого липофильного экстракта (табл. 1). В таблице 1 приведен максимальный объем проб, который может быть оптимально очищен при однократной кислотной экстракции.
Таблица. 1
Распределение липидов в органах и тканях человека
| Орган | % липидов | Вес пробы, г |
| Большой сальник | 90 | 0,6 |
| Желчный пузырь | 4 | 12,5 |
| Легкие | 1,3 | 38,5 |
| Мозг (затылочная доля) | 3,6 | 13,9 |
| Мозг (лобная доля) | 3,2 | 15,6 |
| Мозг (целый) | 3 | 16,4 |
| Мозг (мозжечок) | 1,9 | 26,1 |
| Мозг (продолговатый) | 3,5 | 14,4 |
| Мочевой пузырь | 4,5 | 11 |
| Паранефрос | 65 | 0,8 |
| Печень | 2 | 25,1 |
| Подкожная жировая клетчатка | 73,6 | 0,7 |
| Поперечно-полосатая мускулатура | 6 | 8,3 |
| Почка | 8,9 | 5,6 |
| Селезенка | 1,2 | 43,2 |
| Толстая кишка | 52,6 | 1 |
| Яичник | 0,7 | 75,1 |
В плоскодонную коническую колбу без шлифа вместимостью 100 см3 вносят ацетон, навеску гомогенизированной пробы и интенсивно встряхивают, после чего добавляют необходимый для экстракции объем п-гексана (объемы растворителей рассчитываются в соответствии с пропорцией навеска гомогенизированной пробы:ацетон:п-гексан как 2:4:3, но не менее 8 см3 ацетона и, соответственно, 6 см3 п-гексана), закрывают колбу парафиновой пленкой типа Parafilm и оставляют экстрагироваться на лабораторном шейкере со скоростью не более 1 Гц на 25 минут.
Полученный раствор липофильного экстракта декантируют через простой фильтр («белая лента»), смоченный п-гексаном, в делительную воронку ВД-3-250-29/32 с PTFE краном. Содержимое воронки двукратно промывают порциями п-гексана по 2-3 см3. В делительную воронку вносят 50 см3 1% раствор KCl (предпочтительно) или NaCl, встряхивают и отстаивают до разделения фаз. После разделения фаз водно-ацетоновый слой удаляют.
На аналитических весах (4 класс точности) взвешивают круглодонную колбуК-1-100-29/32, предварительно просушенную в сушильном шкафу в течение 30-40 минут до стабилизации веса, охлажденную до комнатной температуры в эксикаторе с индикаторным силикагелем. Данные вносят в лабораторный журнал.
Оставшийся в воронке слой фильтруют через безводный сульфат натрия, смоченный в п-гексане, в круглодонную колбу К-1-100-29/32 и ставят на роторный испаритель (водяная баня - 35°С + вакуум) до полного выпаривания п-гексана. Далее колбу помещают в сушильный шкаф на 102°С до стабилизации веса.
После стабилизации веса липофильного экстракта колбу взвешивают повторно. Данные вносят в лабораторный журнал и рассчитывают массу навески и процентное содержание общих жиров, полученных во время экстракции, для последующего пересчета концентраций ХОС как нг/г липидов (общепринятые измерения концентрации органических загрязняющих веществ в живых организмах).
Для очистки полученного липофильного экстракта от соэкстративных веществ, в вытяжном шкафу, в колбу с липофильным экстрактом вносят 20-25 см3 п-гексана, тщательно перемешивают и вносят 10 см3 H2SO4конц.
Содержимое повторно перемешивают и оставляют на 24 часа. Отделяют часть кислоты автоматическим кислотостойким дозатором с одноразовым полипропиленовым наконечником и п-гексановый слой переносят в делительную воронку ВД-3-250-29/32 с PTFE краном.
Промывают раствор экстрагированных исследуемых веществ в п-гексане порцией 20 см3 1% бикарбоната натрия, и далее порциями бидистиллированной воды объемом 20-30 см3 до нейтральной реакции универсального бумажного индикатора.
Раствор исследуемых веществ в п-гексанефильтруют через безводный сульфат натрия в коническую колбу KO-30-14/23; КО-30-29/32 и ставят на роторный испаритель (водяная баня - 35°С) до полного выпаривания п-гексана.
Полученный концентрат п-гексанового экстракта подвергают адсорбционной очистке. Адсорбционную очистку полярных и неполярных ХОС производят методом колоночной хроматографии в нормально-фазовом режиме. В качестве полярного сорбента используют силикат магния, активированный при 675°С (Florisil® (100-200 меш). Навеску сорбента массой 2,8 г выдерживают 20 минут в петролейном эфире перед загрузкой в хроматографическую колонку.
Колоночную хроматографию проводят в хроматографической колонке (диаметр - 10 мм) с фриттой, оснащенной PTFE-краном. При закрытом кране сорбент загружают в колонку, добиваясь ровного мениска твердой фазы, после чего мениск петролейного эфира доводят до мениска твердой фазы, удаляя излишек петролейного эфира открытием крана хроматографической колонки.
Концентрат п-гексанового экстракта для адсорбционной очистки полихлорированных бифенилов растворяют в 10 см3 петролейного эфира, в качестве низкополярного элюента, и загружают в хроматографическую колонку. После колонку двукратно промывают 5 см3 петролейного эфира. Хроматографию проводят в маркированную колбу КО-30-29/32 со скоростью не более 0,04 см3/сек.
При достижении мениском элюента границы твердой фазы хроматографию останавливают. В качестве более полярного элюента для адсорбционной очистки пестицидов используют смесь «п-гексан:дихлорметан» в пропорции 2:3 по аналогии с очисткой бифенилов. Отбор элюента, содержащего смесь пестицидов, также ведут в маркированную тару со скоростью, не превышающей 0,04 см3/сек.
При достижении мениском полярного элюента границ твердой фазы хроматографию останавливают и вносят напрямую в колонку 5 см3 петролейного эфира, который пропускают через твердую фазу со скоростью 0,02 см3/сек для деполяризации элюента в объеме твердой фазы. Рекомендуется производить очистку не более трех проб на одну загрузку флоризила (силиката магния, активированного при 675°С). Из полученных смесей выпаривают элюент на водяной бане при температуре 70°С, после чего колбы необходимо остудить до комнатной температуры.
Для загрузки в хроматограф фракции бифенилов и пестицидов в колбах растворяют в 1 см3 п-гексана, переносят в маркированные виалы объемом 1,5 см3 и после высыхания на воздухе закрывают крышками с PTFE-септами. Партию передают на газохроматографический и/или хроматомасс-спектрометрический анализ.
Определение концентраций хлорорганических пестицидов и полихлорированныхбифенилов в образцах проводят на газовом хроматографе с масс-селективным детектором, и на газовом хроматографе с детектором электронного захвата.
Хроматограммы с бифенилами и пестицидами представлены на фиг. 2.
Использовались капиллярные колонки 5ms (в токе защитной смеси газов гелия и азота при стабильном потоке 1 см3/мин) и 5ms (в токе защитного газа гелия при стабильном потоке 1 см3/мин). Температуры колонки, инжектора и детектора газового хроматографа с детектором электронного захвата составили 210°С, 250°С и 280°С, соответственно, газового хроматографа с масс-спектрометрическим детектором - 100-310°С (подъем температуры составляет 7°С в минуту до предела в 310°С), 250°С, 200°С, соответственно. Масс-спектрометр работал в режиме электронной ионизации (EI). Программное обеспечение работало в режиме «поиска и определения». Одно- и двухзарядные ионы учитывались раздельно.
Проба растворяется в 0,5 см3 п-гексана и «закалывается» аликвота в объеме 2 мм3.
Время удержания, массы и объем подтвержденных ионов целевых веществ являлись идентификационными критериями.
Таким образом, показанный способ подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических соединений во внутренних органах и тканях человека позволяет работать с высоким содержанием целевых веществ в пробах, повышает репрезентативность метода и снижает робастность выборки в целом.
1. Способ подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических соединений в биоматериале, включающий отбор пробы, ее измельчение и последующую экстракцию хлорорганических соединений п-гексаном, и последующую очистку от соэкстрактивных веществ концентрированной серной кислотой и получение концентрата п-гексанового экстракта хлорорганических соединений, отличающийся тем, что концентрат п-гексанового экстракта подвергают адсорбционной очистке и предварительному разделению на полярные и неполярные хлорорганические соединения, для чего используют колоночную хроматографию в нормально-фазовом режиме, при этом используют полярный сорбент с фракцией 100-200 меш, причем колонки последовательно промывают вначале неполярным элюентом, а затем поляризованным элюентом, раздельно отбирая материал после каждой промывки.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве полярного сорбента используют силикат магния, активированный при 675°С.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что как поляризованный элюент используют смесь п-гексан: дихлорметан в пропорции 2:3.
