Способ создания антитромбогенного покрытия на полимерных сосудистых протезах

Изобретение относится к области медицины и раскрывает способ создания антитромбогенного покрытия на внутренней и внешней поверхностях полимерного протеза кровеносного сосуда. Способ включает модификацию внешней и/или внутренней поверхности имплантата путем образования гидрофильного углеродного слоя на внешней и внутренней поверхностях полимерного протеза сосуда методом ионно-плазменной имплантации с последующим созданием на углеродистой поверхности сплошного белкового покрытия (альбумина, фибриногена или тропоэластина), модификацию внешней поверхности осуществляют бомбардировкой ионами азота высокой энергии, создание сплошного белкового покрытия на карбонизированных поверхностях протеза осуществляют путем его погружения в фосфатно-солевой буферный раствор с белком. Изобретение может быть использовано для создания на поверхности полимерного протеза сосуда активного био- и гемо- совместимого устойчивого слоя с низкой тромбогенностью и для ускоренной эндотелизации по всей внутренней и внешней поверхностям протеза за счет нанесения на них сплошного белкового покрытия. 8 з.п. ф-лы, 6 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к разработке новых материалов и покрытий для протезов кровеносных сосудов, а также для сосудистых катетеров. Использование предлагаемого в изобретении способа позволяет уменьшить коагуляцию форменных элементов крови и формирование тромба на поверхности используемых в сердечно-сосудистой хирургии полимерных протезов, непосредственно контактирующих с кровью. Этот способ позволяет изменять физико-химические свойства поверхности полимеров, что дает возможность сократить время пролиферации клеток эндотелия на внутренней поверхности протезов кровеносных сосудов.

Уровень техники.

В сосудистой хирургии широко распространено использование имплантатов из полимерных материалов: полиуретана, политетрафторэтилена (ПТФЭ), в том числе экспандированного, полиэтилентерефталата (лавсан), поликапролактона, полигликолида, нейлона и других полиамидов. Их применение вызывает опасность возникновения тромбозов сосудов и тромбоэмболического синдрома и, как следствие, снижение проходимости кровотока. Такие негативные побочные эффекты возникают особенно часто при использовании сосудов малого диаметра, менее 4 мм.

Важно отметить, что в 89-99% случаев применения протезов из лавсана и ПТФЭ в краткосрочном периоде использования (до одного месяца) отсутствовали проблемы с их проходимостью [Бокерия Л.А., Темрезов М.Б., Коваленко В.И., Хирургическое лечение больных с атеротромботическим поражением артерий нижних конечностей - выбор трансплантата при бедренно-подколенном шунтировании //Анналы хирургии. 2010. - №2. - С. 5-8.] [Devine С., McCollum С. Heparin-bonded Dacron or polytetrafluoroethylene for femoropopliteal bypass grafting: A multicenter Trial. J Vasc Surg 2004; 40; 924-931]. Однако при долговременном применении имплантатов из данных видов материалов статистика ухудшается, нарушается проходимость протезов по причине их тромбоза. Через 3 года применения этих имплантатов замена требуется в 31% случаев, а через 5 лет - в 61% случаев [Klinkert Р, Post PN, Breslau PJ, et al. Saphenous vein versus PTFE for above-knee femoropopliteal bypass: a review of the literature. Eur J Vasc Endovasc Surg 2004; 27:357-362], [Rychlik I.J. et al. A meta-analysis to compare Dacron versus polytetrafluroethylene grafts for above knee femoropopliteal arterybypass. // J Vasc Surg. 2014; 60; 2; 506-515].

Большой вклад в процесс тромбообразования вносят структура и физико-химические свойства поверхности используемых материалов. Они влияют на активацию системы комплимента, адгезию клеток и, в первую очередь, на адсорбцию протеинов. Эти явления в совокупности запускают каскадные механизмы реакций тромбообразования [Биосовместимые материалы: Учебное пособие / Под ред. В.И. Севастьянова, М.П. Кирпичникова - М: МИА, 2011].

Чтобы снизить процесс тромбообразования в послеоперационный период, поверхность имплантата модифицируют различными способами. Наиболее перспективными являются плазменные методы обработки материалов. Они формируют на поверхности имплантатов различные функциональные группы, изменяют морфологию поверхности, ее смачиваемость, оптические свойства и электрическую проводимость.

Известен способ эндотелизации протезов кровеносных сосудов (патент РФ №2659704, приоритет 31.03.2017, МПК A61L 27/04, A61L 31/08, A61L 33/02, опубликован 03.07.2018 Бюл. №19). Способ включает плазмохимическую модификацию поверхности с нанесением металлсодержащего покрытия. Данный способ позволяет получать био- и гемо- совместимое покрытие на внешней и внутренней поверхностях сосудистых протезов, характеризующееся низкой тромбогенностью и высокой устойчивостью. Проведены исследования in vitro на предмет клеточной адгезии и роста клеточной культуры на поверхности с нанесенным покрытием, согласно формуле изобретения. Недостатком данного изобретения является невозможность создания сплошного покрытия на внутренней и внешней поверхностях протеза.

Этот недостаток приведет к тому, что на поверхностях, где отсутствует покрытие, адсорбция белков из плазмы крови будет осуществляться, как на поверхности исходного полимерного материала. Использование данного способа может отсрочить процесс тромбообразования, но не решить проблемы разработки тромоборезистентных покрытий и материалов.

Таким образом, несплошность получаемого покрытия обеспечит условия для: запуска механизмов активации системы комплимента; отложения фибрина; коагуляции клеток крови на поверхности протеза, что в итоге снизит эффективность данного способа обработки поверхности как средства противодействия процессу тромбообразования. В качестве недостатков предлагаемого способа следует также отметить, что:

- отсутствуют результаты его испытаний в условиях in vitro с цельной или гепаринизированной кровью;

- его эффективность не подтверждена результатами экспериментов in vivo.

Все это ставит под сомнение преимущество обработанного с помощью данного способа материала по сравнению с необработанными материалами.

Данный способ принят за прототип.

Раскрытие изобретения.

Задачей заявляемого изобретения является способ создания на поверхности полимерных протезов вен и артерий активного углеродного покрытия, способного ковалентно связывать с ним молекулы белков с сохранением их конформации и активности.

Техническим результатом данного изобретения является создание на поверхности полимерного протеза сосуда активного био- и гемо-совместимого устойчивого слоя с низкой тромбогенностью, ускоренная эндотелизация по всей внутренней и внешней поверхностям протеза за счет нанесения на них сплошного белкового покрытия.

Технический результат достигается за счет образования гидрофильного углеродного слоя оптимальной толщины и активности на внешней и внутренней поверхностях полимерного протеза сосуда методом ионно-плазменной имплантации с последующим нанесением на углеродистую поверхность слоя белка, сохраняющего свою молекулярную конформацию, биологическую активность и адгезионные свойства.

Способ создания антитромбогенного покрытия на полимерных сосудистых протезах, на поверхности полимерного протеза кровеносного сосуда, осуществляется следующим образом: модификацию внешней и/или внутренней поверхности имплантата проводят с помощью метода ионно-плазменной имплантации, бомбардировкой ионами азота высокой энергии 5-20 кэВ при длительности импульса 10-40 микросекунд, дозе ионов 5*10¹⁴-10¹⁶ ионов на см². Модификацию внутренней поверхности осуществляют с использованием системы, включающей конусное сопло внутри вакуумного реактора и электрод, расположенный вокруг обрабатываемого протеза сосуда. Через сопло и полость полимерного протеза сосуда в реактор подают газ азот. После осуществления модификации внешней и/или внутренней поверхностей протеза на его активных карбонизованных поверхностях создают сплошное белковое покрытие путем погружения протеза в фосфатно-солевой буферный раствор с белком.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения. Интервалы значений параметров в примерах установлены экспериментально.

Пример 1. Обработка внешней поверхности протеза методом ионно-плазменной имплантации (режим 1).

Сосудистый протез представляет собой прямолинейную полимерную трубку. Для обработки внешней поверхности протеза методом ионно-плазменной имплантации трубка помещается на металлическую плоскую закрытую металлической сеткой пластину (держатель), которая соединяется с высоковольтным источником питания. Пластина помещается в вакуумный реактор, из которого откачивается воздух с помощью безмасляного спирального насоса и турбомолекулярного насоса до давления 10^-5 Торр. Затем реактор заполняется азотом высокой чистоты (99,999%).

В заполняемом азотом реакторе поддерживается давление 2 мТорр за счет откачки избыточного газа насосами. Для создания плазмы внутри реактора используется высокочастотный генератор импульсов с частотой 13.75 МГц и выходной мощностью 100 Вт, который через согласующий блок подает импульсное напряжение на антенну, расположенную снаружи стеклянной части реактора.

На держатель подается импульсное высокое напряжение от низкочастотного высоковольтного генератора импульсов. За счет этого происходит разгон и имплантация ионов на внешнюю поверхность полимерного протеза, расположенного на держателе. Средний поток ионов на образец устанавливается таким образом, чтобы исключить перегрев образца при самых длительных режимах обработки. Измеряемая температура держателя не превышает 40°С в течение 1 часа обработки. Величина напряжения составляет 5-20 кВ, длительность импульса 10-40 микросекунд. Фронт нарастания импульса 1 мкс. Частота повторения импульсов 50 Гц. Средний ток составлял 1.4-1.5 мА.

Пример 2. Обработка внешней поверхности имплантата методом ионно-плазменной имплантации (режим 2).

Для обработки внешней поверхности протеза методом ионно-плазменной имплантации полимерные трубки помещаются на металлическую плоскую закрытую металлической сеткой пластину (держатель), которая соединяется с высоковольтным источником питания. Пластина помещается в вакуумный реактор, из которого откачивается воздух с помощью безмасляного спирального насоса и турбомолекулярного насоса до давления 10^-5 Торр. Затем реактор заполняется азотом высокой чистоты (99,999%). Поддерживается давление 4-5 мТорр.

На держатель подается импульсное высокое напряжение от высоковольтного генератора импульсов. Средний поток ионов на образец устанавливается так, чтобы исключить перегрев образца при самых длительных режимах обработки. Измеряемая температура держателя не превышает 40°С в течение 1 часа обработки. Величина напряжения составляет 5-20 кВ, длительность импульса 10-40 микросекунд. Создание плазмы происходит под действием электрического поля, образованного низкочастотным импульсным генератором. Разгон ионов и их имплантация на внешнею поверхность полимерного протеза, расположенного на держателе, происходит за счет низкочастотного импульсного генератора. Фронт нарастания импульса 0,1-1 мкс. Частота повторения импульсов 100 Гц. Средний ток составляет 5.5-6 мА при среднем токе зарядки и разрядки в режиме отсутствия барьерного разряда 3.8 мА.

Доза облучения ионами (флюенс) для обоих режимов обработки (пример 1 и 2) внешней поверхности полимерного протеза определялась по результатам измерения спектров УФ-поглощения полиэтилена и сравнения со спектрами полиэтилена, обработанного на ионном имплантере с известной плотностью потока ионов [A. Kondyurin, М. Bilek, Ion Beam Treatment of Polymers. Application aspects from medicine to space, Second Edition, Elsevier, Oxford, 2014].

Для получения требуемой структуры и активности углеродного слоя на поверхности полимеров необходимо производить обработку с дозой облучения от 5*10¹⁴ до 10¹⁶ ионов на см².

Согласно определенной плотности потока ионов, имплантаты из полиуретана для лабораторных животных обрабатывались с дозой облучения 1e16 ионов на квадратный сантиметр (ионов/см²).

При вышеописанной схеме обработки поток ионов направлен перпендикулярно к плоской поверхности держателя, на которой горизонтально лежат прямолинейные трубки протезов. За счет этого за один вышеописанный цикл обрабатывается только часть внешней поверхности трубки. Для обработки всей внешней поверхности имплантата полный цикл обработки повторяется три раза. При этом после первого и второго цикла трубки поворачиваются относительно своих осей на 120 градусов в одном направлении.

Пример 3. Обработка внутренней поверхности протеза сосуда методом ионно-плазменной имплантации.

Протезы сосудов могут иметь разные диаметры от 1 до 10 мм, а также бифуркации, поэтому для таких медицинских имплантатов инвертировать внешнюю на внутреннюю поверхность без повреждения углеродного слоя практически невозможно. Для обработки внутренней поверхности таких протезов сосудов используется система, включающая конусное сопло внутри вакуумного реактора и электрод, расположенный вокруг обрабатываемого протеза сосуда. Основание конусного сопла соединяется с помощью полимерной трубы с газовым входом в реакторе. Выходное отверстие сопла направляется в полость полимерного протеза сосуда. Между соплом и отверстием полимерного протеза создается зазор 1-2 мм. Производится откачка воздуха из вакуумного реактора до давления 1е-5 Торр. Далее в реактор подается поток газообразного азота высокой чистоты (99,999%) через сопло. Скорость потока подбирается таким образом, чтобы давление на входе реактора составляло 1-2 Торр. При этом давление в реакторе при постоянной откачке избыточного газа вакуумными насосами составляет не более 4 мТорр. На электрод подаются импульсы высокого напряжения 5-15 кВ длительностью 10-40 микросекунд с частотой повторения импульсов 50-100 Гц. Обработка внутренней поверхности осуществляется с помощью получения барьерного разряда между вакуумным реактором с нулевым потенциалом и высоковольтным электродом, расположенным вокруг обрабатываемого полимерного протеза сосуда.

Период обработки внутренней поверхности протезов сосуда с внешним диаметром 2 мм и длиной 7-10 см из полиуретана для экспериментов на лабораторных животных составлял 10 минут.

Пример 4. Исследование изменений молекулярной структуры внутренней и внешней поверхностей протеза сосуда в результате ионно-плазменной имплантации.

Сформированный методом ионно-плазменной имплантацией углеродный нанослой на внутренней и внешней поверхностях полимера, в частном случае на полиуретане, исследовался с помощью ИК спектроскопии. Спектры регистрировались на Фурье-ИК спектрометре со спектральным микроскопом. По данным спектров ИК МНПВО наблюдались колебания гидроксильной группы в окрестности 3370 см^-1, двойных связей С=O, С=С и C=N на промежутке 1750-1600 см^-1, аминной группы в области 1534 см^-1. Появление кислородсодержащих групп связано с окислением поверхности при взаимодействии с внешней средой после разгерметизации вакуумного реактора. Это явление в значительной степени обусловлено наличием неспаренных электронов при атоме углерода в поверхностном нанослое, что подтверждается результатами ЭПР спектроскопии.

Пример 5. Создание сплошного белкового покрытия и оценка адсорбции белков на внутренней и внешней поверхностях полимерного протеза сосуда.

После ионно-плазменной обработки полимерные имплантаты погружались в фосфатно-солевой буферный раствор с протеином. Использовались растворы различных белков - альбумина, фибриногена, тропоэластина и др. Такая обработка раствором позволила сформировать на внешней и внутренней поверхностях протезов сплошной слой из молекул протеина. Концентрация раствора составляла 100 мкг/мл, экспозиция образцов имплантатов в растворе составляла 12 часов. После изъятия из раствора имплантат высушивался. Для сравнительного анализа такой же обработке раствором с протеином подвергались образцы, не обработанные методом ионно-плазменной имплантации.

Далее оценивалась адсорбция белков на поверхности имплантатов методом ИК МНПВО спектроскопии. В ИК спектрах анализировались линии Амид 1 и Амид 2. Был произведен сравнительный анализ интенсивности линий спектров полимерных образцов (в частном случае полиуретана), обработанных и не обработанных методом ионно-плазменной имплантации. Было установлено, что интенсивность линий белка в спектре обработанного полимера в несколько раз выше, чем в спектре необработанного. Интенсивность линий белка на обработанных полимерных протезах была близка к показателям спектра монослойного покрытия из молекул протеинов. Для необработанных образцов имплантатов анализ интенсивности показал несплошность покрытия.

Для оценки адгезионных свойств протеинового слоя проводилась отмывка белка с поверхности полимерного имплантатов, обработанных и не обработанных ионно-плазменным методом. Для этого образцы полимерных протезов с нанесенным слоем протеинов помещались в 2% раствор додецилсульфата натрия, выдерживались 1 час при температуре 70°С и три раза промывались в деионизированной воде. После образцы просушивались 24 часа при температуре 23-25°С без доступа пыли. Далее производилась регистрация спектров ИК МНПВО и анализировалась интенсивность линий белка Амид 1 и Амид 2, как описано выше. Было установлено, что после отмывки интенсивность линий спектра белка на обработанных образцах понизилась, но по-прежнему соответствовала показателям спектра монослойного покрытия из молекулам протеинов. Интенсивность линий спектра белка на необработанных образцах после отмывки существенно снизилась.

Проведенный сравнительный анализ позволил установить более высокие адгезионные свойства слоя протеинов на поверхности имплантата, обработанного методом ионно-плазменной имплантации, в сравнении с необработанным имплантатом. Этот результат подтверждает справедливость предположения о том, что ионно-плазменная имплантация приводит к формированию неспаренных электронов на атомах углерода в поверхностном слое. Это, в свою очередь, позволяет сформировать ковалентные связи модифицированной поверхности имплантата с молекулами белка, что объясняет повышенные адгезионные свойства. Результаты данных экспериментов позволяют сделать вывод о том, что адсорбированные молекулы протеинов на гидрофильных углеродных поверхностях протеза сосуда невозможно смыть жидкостями организма, например, плазмой крови.

Пример 6. Оценка тромбообразования в полостях полимерных протезов сосудов после имплантации в кровеносный сосуд лабораторных животных.

Для оценки процесса тромбообразования на внутренних поверхностях необработанных и обработанных методом ионно-плазменной имплантации полимерных имплантатов, в частном случае из полиуретана, были проведены операции по внедрению протеза сосуда в кровеносное русло сонной артерии кроликов.

На момент операции проводилась антикоагулянтная терапия: гепарин - 0,05 мл и атропин 1% - 0,1 мл. Операция по установке имплантатов проводилась под общим наркозом с использованием препарата «Золетил». После выбривания места операции и разрезания мягких тканей в левую сонную артерию, на которую для остановки кровотока накладывались 2 сосудистые клипсы, пинцетом вводились имплантаты. Для сшивания сосудистого разреза использовался шовный материал PROLEN №007 и дополнительно наносился сульфакрилатный клей. Для закрытия раны мягких тканей использовался шовный материал «Викрил» 4/0. После операции животным подкожно вводили изотонический раствор хлорида натрия 20 мл и внутримышечно - фуросемид 0,5 мл, дексаметазон 0,5 мл, сульфокамфокаин 0,5 мл и цефтриаксон 100 мг. Время операции составляло не более 1 часа. В послеоперационный период разжижающие кровь препараты не применялись. Проводился ежедневный мониторинг животных. По результатам мониторинга у животных нарушений выявлено не было.

После 7 дней экспозиции к животным применялась эвтаназия. Далее операционным методом иссекался сосуд с имплантатом и окружающими мягкими тканями и погружался в формалин. Затем осуществлялась стандартная методика фиксации исследуемых тканей с протезом сосуда в парафиновых блоках для дальнейших гистологических исследований. На микротоме производились срезы тканей в парафиновых блоках. Полученные срезы окрашивались гематоксилином, эозином и подвергались крашению по Зербино. Далее с помощью микроскопии был завершен гистологический анализ срезов.

В результате анализа для группы животных с необработанными полимерными имплантатами наблюдалась типичная картина тромбообразования на поверхности инородного тела, которое контактирует с кровью. Полость имплантата характеризовалась большими тромбами, слабой пролиферацией интимы и медленным формированием щелевидной полости.

Для опытной группы животных с протезами сосудов, обработанными ионно-плазменным методом и с нанесенным протеиновым слоем, наблюдалась более оптимистичная морфологическая картина.

Во-первых, во внутренних полостях имплантатов сформировались тромбы сравнительно небольших размеров. Во-вторых, со стороны интимы наблюдалась пролиферация эндотелия и замещение тромботических масс соединительной тканью.

Из сравнения полученных результатов по процессу тромбообразования для контрольной и опытной групп животных следует, что опытная группа характеризуется наличием более крупных полостей кровотока, ускоренной канализацией тромбов и эндотелизацией полостей кровотока и протеза сосуда. Размер полостей кровотока у опытной группы в 2,5 раза превышает размер у контрольной. Эти данные получены путем подсчета восстановленных каналов кровотока при обработке микрофотографий. Данный результат является статистически достоверным, р-значение равно 0.0275, нулевая гипотеза о случайности результатов отвергается.

1. Способ создания антитромбогенного покрытия на полимерных сосудистых протезах, на поверхности полимерного протеза кровеносного сосуда, при этом полимерный сосудистый протез изготовлен из полиуретана, способ включает модификацию внешней и/или внутренней поверхностей имплантата путем образования на внешней и/или внутренней поверхностях полимерного протеза сосуда гидрофильного углеродного слоя методом ионно-плазменной имплантации с последующим созданием на углеродистой поверхности сплошного белкового покрытия, при этом белок выбирается из альбумина, фибриногена или тропоэластина, причём модификацию внешней поверхности осуществляют бомбардировкой ионами азота высокой энергии 5-20 кэВ при длительности импульса 10-40 микросекунд, дозе ионов 5⋅10¹⁴-10¹⁶ ионов на см²; модификацию внутренней поверхности осуществляют с использованием системы, включающей конусное сопло внутри вакуумного реактора и электрод, расположенный вокруг обрабатываемого протеза сосуда, через сопло и полость полимерного протеза сосуда в реактор подают газ азот; создание сплошного белкового покрытия на углеродных поверхностях протеза осуществляют путём его погружения в фосфатно-солевой буферный раствор с белком.

2. Способ по п. 1, в котором полный цикл обработки наружной поверхности методом ионно-плазменной имплантации выполняют последовательно 3 раза, при повороте протеза каждый раз на 120 градусов.

3. Способ по п. 1, в котором ионно-плазменную имплантацию осуществляют при создании плазмы с помощью высокочастотного генератора с частотой 13,75 МГц, а имплантацию ионов азота в образец с помощью низкочастотного генератора.

4. Способ по п. 1, в котором ионно-плазменную имплантацию ионов азота в поверхность протеза с созданием плазмы осуществляют с помощью низкочастотного генератора.

5. Способ по п. 3, в котором ионно-плазменную имплантацию азотом осуществляют при поддержании постоянного давления на уровне 2 мТорр и параметрах режима низкочастотного генератора: фронт нарастания импульса 1 мкс, частота 50 Гц и средний ток 1,4-1,5 мА.

6. Способ по п. 4, в котором ионно-плазменную имплантацию азотом осуществляют при поддержании переменного давления на уровне 4-5 мТорр и параметрах режима низкочастотного генератора: фронт нарастания импульса 0,1-1 мкс, частота 100 Гц и средний ток 5,5-6 мА.

7. Способ по п. 1, в котором скорость потока газа азота, подаваемого через сопло, определяют таким образом, чтобы давление на выходе из реактора составляло 1-2 Торр, при этом давление в реакторе поддерживают на уровне не более 4 мТорр, на электрод подают импульсы высокого напряжения в 5-15 кВ с длительностью 10-40 микросекунд и частотой повторения импульсов 50-100 Гц.

8. Способ по п. 1, в котором концентрация раствора составляет 100 мкг/мл.

9. Способ по п. 8, в котором продолжительность экспозиции протеза в растворе составляет 12 часов.