Новая термостабильная тагатоза-6-фосфатфосфатаза и способ получения тагатозы с ее использованием
Настоящее изобретение относится к тагатозо-6-фосфатфосфатазе, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции для получения тагатозы, содержащей тагатозо-6-фосфатфосфатазу по настоящему изобретению, и к способу получения тагатозы с использованием тагатозо-6-фосфатфосфатазы по настоящему изобретению. Изобретение позволяет получить тагатозу с высокой степенью эффективности. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 7 ил., 5 пр.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к тагатозо-6-фосфатфосфатазе и к способу получения тагатозы с ее применением.
Предшествующий уровень техники
Способ получения D-тагатозы из D-галактозы посредством использования изомеразы L-арабинозы и способ получения тагатозы из D-фруктозы посредством использования L-рибулозо-5-фосфат-4-эпимеразы были описаны, как способы получения тагатозы с помощью обычной одноферментной реакции превращения. Однако в такой одноферментной реакции превращения имеется определенный уровень равновесия реакции между субстратом и продуктом (продукт/субстрат = примерно 20% - 50%). Следовательно, в случае получения тагатозы высокой чистоты с использованием одноферментной реакции превращения требуется дополнительный процесс очистки для выделения и удаления высокой концентрации субстрата из продукта реакции.
С другой стороны, для способа получения D-тагатозы с использованием многоферментной реакции превращения уже описан (корейские патенты 10-1627921 и 10-1620904) способ получения, включающий получение D-фруктозо-6-фосфата из аденозинтрифосфата (АТР) и фруктозы путем использования гексокиназы (ЕС 2.7.1.1), превращение D-фруктозо-6-фосфата в D-тагатозо-6-фосфат путем использования D-фруктозо-1,6-бисфосфатадолазы (ЕС 4.1.2.13), имеющей активность фруктозо-6-фосфат-4-эпимеразы, и получение D-тагатозы из D-тагатозо-6-фосфата путем использования фитазы в качестве фосфатазы. Однако для многоферментной реакции требуется дорогостоящая АТФ в качестве донора фосфата и эта реакция ограничена в применимости способа из-за низкой физико-химической стабильности (нагрев, рН и т.д.) адениннуклеотидов АМФ, АДФ и АТФ. Кроме того, фитазы индуцируют необратимые реакции в связи с разнообразием их субстратов и, таким образом, ограничены в повышении выхода тагатозы.
Техническая задача
Авторы настоящего изобретения выполнили большой объем работ для разработки способа получения тагатозы с высоким выходом при использовании дешевого сырья. В результате, когда тагатозо-6-фосфат образуется в результате превращения из сахарозы, крахмала или мальтодекстрина, которые являются дешевым сырьем, в глюкозу или глюкозо-1-фосфат, глюкозо-6-фосфат и фруктозо-6-фосфат, было обнаружено, что тагатоза может быть получена посредством однореакторных ферментативных превращений, где множество ферментов, вовлеченных в путь получения тагатозы, можно использовать одновременно, путем осуществления дефосфорилирования тагатозо-6-фосфата, в качестве необратимой реакции с использованием тагатозо-6-фосфатфосфатазы по настоящему изобретению; и при этом уровень превращения в тагатозу может быть значительно увеличен, и тем самым осуществлено настоящее изобретение.
Техническое решение
Целью настоящего изобретения является предложение
тагатозо-6-фосфатфосфатазы, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.
Другой целью настоящего изобретения является предложение нуклеиновой кислоты, кодирующей тагатозо-6-фосфатфосфатазу по настоящему изобретению.
Еще одной целью настоящего изобретения является предложение трансформанта, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую тагатозо-6-фосфатфосфатазу по настоящему изобретению.
Еще одной целью настоящего изобретения является предложение композиции для получения тагатозы, содержащей тагатозо-6-фосфатфосфатазу по настоящему изобретению, микроорганизм, экспрессирующий тагатозо-6-фосфатфосфатазу, или культуру микроорганизма, экспрессирующего тагатозо-6-фосфатфосфатазу.
Еще одной целью настоящего изобретения является предложение способа получения тагатозы с использованием тагатозо-6-фосфатфосфатазы по настоящему изобретению.
Полезные эффекты
Поскольку тагатозо-6-фосфатфосфатаза по настоящему изобретению является термостабильной, ее можно использовать для промышленного производства тагатозы, получение тагатозы в высокой концентрации возможно при использовании пути с необратимой реакцией, и тагатозу можно получать с помощью однореакторного ферментативного превращения путем использовании в качестве сырья сахарозы, крахмала или мальтодекстрина, которые являются дешевым сырьем. Следовательно, поскольку способ получения тагатозы высокой чистоты может быть упрощен, этот способ получения имеет преимущество в том, что он является и простым, и экономичным.
Краткое описание графических материалов
На Фиг. 1 схематически показан реакционный путь, способный производить тагатозу из крахмала (например мальтодекстрина), сахарозы или глюкозы, и показаны участвующие в реакции ферменты.
На Фиг. 2 показаны результаты анализа молекулярной массы тагатозо-6-фосфатфосфатазы (Е: Т6РР) по настоящему изобретению посредством электрофореза белков в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE). "М" представляет собой маркер размера белка и "СЕ" представляет супернатант после разрушения трансформанта.
На Фиг. 3 представлен график, показывающий активность тагатозо-6-фосфатфосфатазы по настоящему изобретению в превращении тагатозо-6-фосфата в тагатозу.
На Фиг. 4 представлен график, показывающий активность тагатозо-6-фосфатфосфатазы по настоящему изобретению в зависимости от буферного раствора и диапазона рН.
На Фиг. 5 представлен график, показывающий активность тагатозо-6-фосфатфосфатазы по настоящему изобретению в зависимости от температуры.
На Фиг. 6 представлен график, показывающий активность тагатозо-6-фосфатфосфатазы по настоящему изобретению при добавлении иона металла.
На Фиг. 7 представлен график, показывающий субстратную специфичность тагатозо-6-фосфатфосфатазы по настоящему изобретению в отношении тагатозо-6-фосфата.
Лучший вариант осуществления изобретения
Ниже настоящее изобретение описано более подробно. При этом каждое из пояснений и типичных воплощений, раскрытых в данном описании изобретения, может быть применено к другим пояснениям и типичным воплощениям. Таким образом, все комбинации различных факторов, раскрытых в данном описании изобретения, входят в объем настоящего изобретения. Кроме того, объем настоящего изобретения не следует ограничивать конкретным раскрытием, представленным ниже.
Для достижения цели настоящего изобретения в одном аспекте настоящего изобретения предлагается тагатозо-6-фосфатфосфатаза, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.
Тагатозо-6-фосфатфосфатаза по настоящему изобретению может содержать полипептид, имеющий гомологию с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, составляющую по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 97% или 99%. Например, очевидно, что белок, имеющий аминокислотную последовательность с делецией, модификацией, заменой или добавлением некоторых последовательностей, входит в объем настоящего изобретения, пока он обладает гомологией и проявляет эффективность, соответствующую эффективности белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.
Кроме того, когда белок обладает эффективностью, соответствующей эффективности тагатозо-6-фосфатфосфатазы по настоящему изобретению, которая состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, он не исключает мутации, которая может образоваться при добавлении бессмысленной последовательности выше или ниже аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, природной мутации или молчащей мутации. Кроме того, белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, также входит в объем настоящего изобретения.
Кроме того, тагатозо-6-фосфатфосфатаза может кодироваться нуклеотидной последовательностью SED ID NO: 2, или тагатозо-6-фосфатфосфатаза может кодироваться нуклеотидной последовательностью, имеющей гомологию с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2, составляющую по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 97%, или 99%, без ограничения ими. Исходя из вырожденности генетического кода, очевидно, что белки, которые состоят из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или полинуклеотиды, которые могут быть транслированы в белки, имеющие гомологию с вышеуказанными белками, также могут быть включены в объем настоящего изобретения.
При использовании здесь термин "гомология" относится к степени соответствия с данной аминокислотной последовательностью или нуклеотидной последовательностью, и эта гомология может быть выражена в процентах. В настоящем описании гомология последовательности, имеющей активность, идентичную или подобную данной аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности, выражена как "% гомологии". Гомология последовательности может быть определена, например, с помощью стандартного программного обеспечения, в частности программы BLAST 2.0, которая вычисляет такие параметры, как счет, идентичность, подобие и т.д., или путем сравнения последовательностей в эксперименте Саузерн-гибридизации в определенных жестких условиях, при этом определение подходящих условий гибридизации находится в компетенции специалистов в данной области и они могут быть определены способом, хорошо известным специалистам в данной области техники (например, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York). При использовании здесь термин "жесткие условия" относится к условиям, которые предназначены для обеспечения специфичной гибридизации между полинуклеотидами. Например, эти условия конкретно описаны в литературе (например в J. Sambrook et al., см. выше).
В настоящем описании изобретения жесткие условия могут быть подобраны для определения гомологии. Чтобы подтвердить гомологию полинуклеотидов, можно использовать условия гибридизации низкой жесткости, соответствующей значению Tm 55°С. Например, можно использовать условия 5Х SSC (смесь хлорида и цитрата натрия), 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), 0,25% молока и без формамида; или 30% формамида, 5Х SSC и 0,5% SDS. Можно использовать условия гибридизации умеренной жесткости, соответствующие высоким значениями Tm; например 40% формамида и 5Х или 6Х SSC. Можно использовать условия гибридизации, соответствующие высоким значениям Tm; например 50% формамида и 5Х или 6Х SSC, но условия гибридизации не ограничены приведенными выше примерами.
Для гибридизация требуется, чтобы две нуклеиновые кислоты имели комплементарные последовательности, хотя возможны несоответствия между основаниями в зависимости от жесткости гибридизации. Термин "комплементарный" используется для описания отношений между нуклеотидными основаниями, которые способны к гибридизации друг с другом. Например, в отношении ДНК, аденозин комплементарен тимину, а цитозин комплементарен гуанину. Следовательно, настоящее изобретение может также включать по существу подобные нуклеиновокислотные последовательности, а также выделенные фрагменты нуклеиновой кислоты, комплементарные всей последовательности.
Конкретно, полинуклеотид, имеющий гомологию, может быть определен с использованием условий гибридизации, включающих стадию гибридизации при значении Tm 55°С и с использованием вышеописанных условий. Кроме того, значение Tm может составлять 60°С, 63°С или 65°С, но не ограничено ими. Специалисты в данной области техники могут подходящим образом подобрать значение Tm в соответствии с целью.
Подходящая жесткость гибридизации полинуклеотидов зависит от длины и степени комплементарности полинуклеотидов, и переменные хорошо известны в данной области. По мере увеличения подобия или гомологии двух нуклеотидов, значение Tm для гибридов этих полинуклеотидов, имеющих такую последовательность, увеличивается. Относительная стабильность при гибридизации полинуклеотидов (соответствующая более высокому значению Tm) уменьшается в следующем порядке: РНК:РНК, ДНК:РНК, ДНК:ДНК. Формула расчета значений Tm для гибридов, длина которых превышает 100 нуклеотидов, опубликована в уровне техники (Sambrook et al., см. выше, 9.50-9.51). Для гибридизации более коротких полинуклеотидов, например олигонуклеотидов, несовпадающее положение может быть более важным и длина олигонуклеотидов может определять их специфичность (Sambrook et al., см. выше, 11.7-11.8).
В частности, полинуклеотиды могут быть обнаружены с использованием следующих условий гибридизации: 1) стадия гибридизации с концентрацией соли ниже 500 мМ и температурой по меньшей мере 37°С; и стадия промывки 2Х SSPE при по меньшей мере 63°С; 2) стадия гибридизации с концентрацией соли ниже 200 мМ и температурой по меньшей мере 37°С; или 3) обе стадии гибридизации и промывки при 63°С с 2Х SSPE.
Длина гибридизационной нуклеиновой кислоты может составлять, например, по меньшей мере примерно 10 нуклеотидов, 15 нуклеотидов, 20 нуклеотидов или по меньшей мере 30 нуклеотидов. Кроме того, специалисты в данной области техники могут подобрать температуру и концентрацию соли в промывочном растворе по мере необходимости в зависимости от таких факторов, как длина зонда.
Тагатозо-6-фосфатфосфатаза по настоящему изобретению может представлять собой фермент, полученный из Thermotoga sp., и, в частности, может представлять собой фермент, полученный из Thermotoga neapolitana, но не ограничивается этим.
В другом аспекте настоящего изобретения предлагается нуклеиновая кислота, кодирующая тагатозо-6-фосфатфосфатазу по настоящему изобретению.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен трансформант, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую тагатозо-6-фосфатфосфатазу по настоящему изобретению.
При использовании здесь термин "трансформация" относится к процессу введения в клетку-хозяина вектора, включающего нуклеиновую кислоту, кодирующую целевой белок, и тем самым обеспечения экспрессии белка, кодируемого этой нуклеиновой кислотой в клетке-хозяине. Для трансформирующей нуклеиновой кислоты не имеет значения, встроена ли эта трансформирующая нуклеиновая кислота в хромосому клетки-хозяина и расположена в ней, или она расположена вне хромосомы, при условии, что она может экспрессироваться в клетке-хозяине, и оба случая включены в настоящее изобретение. Кроме того, нуклеиновая кислота включает ДНК и РНК, которые кодируют целевой белок. Нуклеиновая кислота может быть вставлена в любой форме, в которой она может быть введена в клетку-хозяина и экспрессирована в ней. Например, нуклеиновая кислота может быть введена в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой генную конструкцию, включающую все существенные элементы, необходимые для собственной экспрессии. Экспрессионная кассета может, как правило, включать промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, сигнал терминации транскрипции, домен, связывающий рибосому, и сигнал терминации трансляции. Экспрессионная кассета может находиться в форме экспрессионного вектора, способного к саморепликации. Кроме того, нуклеиновая кислота может быть введена в клетку-хозяина, как есть, и функционально связана с последовательностью, необходимой для ее экспрессии в клетке-хозяине, но нуклеиновая кислота не ограничена этим.
Кроме того, при использовании здесь, термин "функционально связанный" относится к функциональной связи между последовательностью промотора, который инициирует и опосредует транскрипцию нуклеиновой кислоты, кодирующей целевой белок по настоящему изобретению и вышеуказанной последовательностью гена.
Способ по настоящему значению для трансформации вектора включает любой метод введения нуклеиновой кислоты в клетку и может быть осуществлен путем выбора подходящей стандартной методики, известной в данной области техники, в соответствии с клеткой-хозяином. Примеры способа могут включать электропорацию, осаждение фосфатом кальция (СаРО4), осаждение хлоридом кальция (CaCl2), микроинъекцию, метод с использованием полиэтиленгликоля (PEG), метод DEAE-декстрана, метод катионных липосом, метод ацетат лития-ДМСО и т.д., но не ограничены ими.
В качестве клетки-хозяина предпочтительно использовать хозяина, обладающего высокой эффективностью по введению ДНК и высокой эффективностью экспрессии введенной ДНК. Например, это может быть Е. coli, без ограничения им.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предлагается композиция для получения тагатозы, содержащая тагатозо-6-фосфатфосфатазу по настоящему изобретению, микроорганизм, экспрессирующий тагатозо-6-фосфатфосфатазу, или культура микроорганизма, экспрессирующего тагатозо-6-фосфатфосфатазу.
Композиция для получения тагатозы может дополнительно содержать фермент, участвующий в пути продуцирования тагатозы (см. Фиг. 1) по настоящему изобретению, микроорганизм, экспрессирующий фермент, участвующий в пути продуцирования тагатозы по настоящему изобретению, или культуру микроорганизма, экспрессирующего фермент, участвующий в пути продуцирования тагатозы по настоящему изобретению. Однако это всего лишь пример; то есть фермент, который должен содержаться в композиции по настоящему изобретению для получения тагатозы, и субстрат, используемый для получения тагатозы, не ограничены, при условии, что тагатоза может быть получена с использованием тагатозо-6-фосфатфосфатазы по настоящему изобретению.
Композиция по настоящему изобретению для получения тагатозы может дополнительно содержать: (а) (1) крахмал, мальтодекстрин, сахарозу или их комбинацию, глюкозу, глюкозо-1-фосфат, глюкозо-6-фосфат, фруктозо-6-фосфат или тагатозо-6-фосфат; (2) фосфат; (3) фруктозо-6-фосфат-4-эпимеразу; (4) глюкозо-6-фосфатизомеразу; (5) фосфоглюкомутазу или глюкокиназу; и/или (6) α-глюканофосфорилазу, крахмалфосфорилазу, мальтодекстринфосфорилазу или сахарозафосфорилазу или α-амилазу, пуллуланазу, изоамилазу, глюкоамилазу или сахаразу; или (б) микроорганизм, экспрессирующий любой из указанных ферментов, или культуру указанного микроорганизма, но без ограничения ими.
Крахмал/мальтодекстринфосфорилазы (ЕС 2.4.1.1) и α-глюканофосфорилаза по настоящему изобретению могут включать любые белки при условии, что они являются белками, которые подвергаются переносу фосфорила от фосфата к глюкозе, и тем самым обладают активностью продуцирования глюкозо-1-фосфата из крахмала или мальтодекстрина. Сахарозафосфорилаза (ЕС 2.4.1.7) по настоящему изобретению может включать любой белок при условии, что он является белком, который подвергается переносу фосфорила от фосфата к глюкозе, и тем самым обладает активностью продуцирования глюкозо-1-фосфата из сахарозы. α-Амилаза (ЕС 3.2.1.1), пуллуланаза (ЕС 3.2.1.41), глюкоамилаза (ЕС 3.2.1.3), и изоамилаза по настоящему изобретению, которые представляют собой ферменты для осахаривания крахмала, могут включать любые белки при условии, что эти белки обладают активностью превращения крахмала или мальтодекстрина в глюкозу. Сахараза (ЕС 3.2.1.26) по настоящему изобретению может включать любой белок при условии, что этот белок обладает активностью превращения сахарозы в глюкозу. Фосфоглюкомутаза (ЕС 5.4.2.2) по настоящему изобретению может включать любой белок при условии, что этот белок обладает активностью превращения глюкозо-1-фосфата в глюкозо-6-фосфат. Глюкокиназа может включать любой белок при условии, что этот белок способен переносить фосфат на глюкозу и тем самым обладает активностью превращения в глюкозо-6-фосфат. В частности, глюкокиназа может быть полифосфат-зависимой глюкокиназой и, более конкретно, может быть полифосфат-зависимой глюкокиназой, происходящей из Deinococcus geothermalis, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, и нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 7, или может быть полифосфат-зависимой глюкокиназой, происходящей из Anaerolinea thermophila, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, и нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 8. Глюкозо-6-фосфатизомераза по настоящему изобретению может включать любой белок при условии, что этот белок обладает активностью превращения глюкозо-6-фосфата во фруктозо-6-фосфат. Фруктозо-6-фосфат-4-эпимераза по настоящему изобретению может включать любой белок при условии, что этот белок обладает активностью превращения фруктозо-6-фосфата в тагатозо-6-фосфат.
Композиция по настоящему изобретению для получения тагатозы может дополнительно содержать ион или соль металла, выбранного из группы, состоящей из Mg, Mn и Zn. В частности, соль металла по настоящему изобретению может представлять собой соль металла, выбранного из группы, состоящей из MgCl2, MgSO4, MnCl2, MnSO4, ZnCl2 и ZnSO4.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения тагатозы, включающий превращение тагатозо-6-фосфата в тагатозу посредством взаимодействия тагатозо-6-фосфата с тагатозо-6-фосфатфосфатазой по настоящему изобретению, микроорганизм, экспрессирующий тагатозо-6-фосфатфосфатазу, или культура микроорганизма, экспрессирующего тагатозо-6-фосфатфосфатазу.
Способ получения по настоящему изобретению может дополнительно включать превращение фруктозо-6-фосфата в тагатозо-6-фосфат посредством реакции фруктозо-6-фосфата с фруктозо-6-фосфат-4-эпимеразой, микроорганизм, экспрессирующий фруктозо-6-фосфат-4-эпимеразу, или культуру микроорганизма, экспрессирующего фруктозо-6-фосфат-4-эпимеразу, перед превращением тагатозо-6-фосфата в тагатозу.
Кроме того, способ получения может дополнительно включать превращение глюкозо-6-фосфата во фруктозо-6-фосфат посредством реакции глюкозо-6-фосфата с глюкозо-6-фосфатизомеразой, микроорганизм, экспрессирующий глюкозо-6-фосфатизомеразу, или культуру микроорганизма, экспрессирующего глюкозо-6-фосфатизомеразу, перед превращением фруктозо-6-фосфата по настоящему изобретению в тагатозо-6-фосфат.
Кроме того, способ получения может дополнительно включать превращение глюкозо-1-фосфата в глюкозо-6-фосфат посредством реакции глюкозо-1-фосфата с фосфоглюкомутазой, микроорганизм, экспрессирующий фосфоглюкомутазу, или культуру микроорганизма, экспрессирующего фосфоглюкомутазу, перед превращением глюкозо-6-фосфата по настоящему изобретению во фруктозо-6-фосфат.
Кроме того, способ получения может дополнительно включать превращение глюкозы в глюкозо-6-фосфат посредством реакции глюкозы с глюкокиназой, микроорганизм, экспрессирующий глюкокиназу, или культуру микроорганизма, экспрессирующего глюкокиназу, и фосфат, перед превращением глюкозо-6-фосфата по настоящему изобретению во фруктозо-6-фосфат.
Кроме того, способ получения может дополнительно включать превращение крахмала, мальтодекстрина, сахарозы или их комбинации в глюкозо-1-фосфат посредством взаимодействия крахмала, мальтодекстрина, сахарозы или их комбинации с фосфатом и α-глюканофосфорилазой, крахмалфосфорилазой, мальтодекстринфосфорилазой или сахарозафосфорилазой; микроорганизм, экспрессирующий α-глюканофосфорилазу, крахмалфосфорилазу, мальтодекстринфосфорилазу или сахарозафосфорилазу; или культуру микроорганизма, экспрессирующего α-глюканофосфорилазу,
крахмалфосфорилазу, мальтодекстринфосфорилазу или сахарозафосфорилазу, перед превращением глюкозо-1-фосфата по настоящему изобретению в глюкозо-6-фосфат.
Кроме того, способ получения может дополнительно включать превращение крахмала, мальтодекстрина, сахарозы или их комбинации в глюкозу посредством взаимодействия крахмала, мальтодекстрина, сахарозы или их комбинации с α-амилазой, пуллуланазой, глюкоамилазой, сахаразой или изоамилазой; микроорганизм, экспрессирующий α-амилазу, пуллуланазу, глюкоамилазу, сахаразу или изоамилазу; или культуру микроорганизма, экспрессирующего α-амилазу, пуллуланазу, глюкоамилазу, сахаразу или изоамилазу, перед превращением глюкозы по настоящему изобретению в глюкозо-6-фосфат.
Способ получения может дополнительно включать превращение глюкозы в крахмал, мальтодекстрин или сахарозу посредством реакции глюкозы с 4-α-глюкантрансферазой, микроорганизм, экспрессирующий 4-α-глюкантрансферазу, или культуру микроорганизма, экспрессирующего 4-α-глюкантрансферазу.
В способе получения "взаимодействие" можно проводить при рН 5,0-8,0, температуре 60°С-90°С и/или в течение от 1 минуты до 24 часов. В частности, взаимодействие по настоящему изобретению можно проводить при рН 6,0-8,0, рН 6,5-8,0 или рН 6,5-7,5. Кроме того, взаимодействие по настоящему изобретению можно проводить при 60°С-90°С, 70°С-90°С или при 75°С-85°С. Кроме того, взаимодействие по настоящему изобретению можно проводить в течение от 1 минуты до 12 часов, от 1 минуты до 6 часов, от 1 минуты до 3 часов, от 1 минуты до 1 часа, от 5 минут до 24 часов, от 5 минут до 12 часов, от 5 минут до 6 часов, от 5 минут до 3 часов, от 5 минут до 1 часа, от 10 минут до 24 часов, от 10 минут до 12 часов, от 10 минут до 6 часов, от 10 минут до 3 часов или от 10 минут до 1 часа.
Кроме того, взаимодействие по настоящему изобретению можно проводить в присутствии иона или соли металла, выбранного из группы, состоящей из Mg, Mn и Zn. В частности, соль металла по настоящему изобретению может быть солью металла, выбранного из группы, состоящей из MgCl2, MgSO4, MnCl2, MnSO4, ZnCl2 и ZnSO4.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения тагатозы, включающий взаимодействие крахмала, мальтодекстрина, сахарозы или их комбинации и фосфата с (а) тагатозо-6-фосфатфосфатазой; фруктозо-6-фосфат-4-эпимеразой; глюкозо-6-фосфатизомеразой; фосфоглюкомутазой или глюкокиназой; и α-глюканофосфорилазой, крахмалфосфорилазой, мальтодекстринфосфорилазой, сахарозафосфорилазой, α-амилазой, пуллуланазой, изоамилазой, глюкоамилазой или сахаразой; или (б) микроорганизм, экспрессирующий любой из указанных ферментов, или культуру указанного микроорганизма.
Осуществление изобретения
Ниже настоящее изобретение подробно описано со ссылкой на сопровождающие типичные воплощения. Однако типичные воплощения, раскрытые в данном документе, предназначены только для иллюстративных целей и не должны рассматриваться, как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Пример 1: Получение рекомбинантного экспрессионного вектора, содержащего ген тагатозо-6-фосфатфосфатазы, и трансформированного микроорганизма.
Чтобы обнаружить новую термостабильную D-тагатозо-6-фосфатфосфатазу, был выделен ген из Thermotoga neapolitana, термофильного микроорганизма, и затем были получены рекомбинантный экспрессионный вектор и трансформированный микроорганизм.
В частности, на основании последовательностей генов Thermotoga neapolitana, зарегистрированных в Genbank, был выбран ген t6pp, который, как ожидается, кодирует тагатозо-6-фосфатфосфатазу. Затем, на основании информации о его аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 1) и нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 2), были сконструированы и синтезированы прямой праймер (SEQ ID NO: 3) и обратный праймер (SEQ ID NO: 4). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с синтезированными праймерами, используя хромосомную ДНК (геномную ДНК) Thermotoga neapolitana в качестве матрицы. В частности, при выполнении ПЦР проводили в общей сложности 25 циклов в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 30 секунд, отжиг при 55°С в течение 30 секунд и полимеризация при 68°С в течение 2 минут. Полученные продукты встраивали в рЕТ21а (Novagen Inc.), который представляет собой плазмидный вектор для экспрессии в Е. coli, с использованием ферментов рестрикции NdeI и XhoI, и затем был сконструирован рекомбинантный экспрессионный вектор, названный pET21a-CJ_tn_t6pp. pET21a-CJ_tn_t6pp был трансформирован в штамм Е. coli BL21(DE3) с помощью обычного метода трансформации (Sambrook et al. 1989) с получением микроорганизма, трансформированного с помощью рекомбинантного вектора, включающего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, и полученный микроорганизм был назван как Е. coli BL21(DE3)/CJ_tn_t6pp.
Штамм E.coli BL21 (DE3)/CJ_tn_t6pp был депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов (КССМ), который является международным депозитарным органом в соответствии с Будапештским договором, 23 июня 2016 года, и получил регистрационный номер КССМ11850Р.
Пример 2: Получение рекомбинантного фермента
Для получения рекомбинантной тагатозафосфатазы (ниже называемой Т6РР), Е. coli BL21 (DE3)/CJ_tn_t6pp инокулировали в пробирку для культивирования, содержащую 5 мл жидкой среды LB и затем инициировали посевную культуру в инкубаторе-встряхивателе при 37°С вплоть до достижения значения поглощения при 600 нм, равного 2,0. Раствор посевной культуры инокулировали в культуральную колбу, содержащую жидкую среду LB и выполняли основное культивирование. При достижении значения поглощения при 600 нм, равного 2,0, добавляли 1 мМ IPTG (изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида) для индукции экспрессии/продуцирования Т6РР. Посевное культивирование и основное культивирование проводили при скорости перемешивания 200 об/мин при температуре 37°С. По завершению основного культивирования культуральный раствор центрифугировали при 4°С при 8000×g в течение 20 минут и затем извлекали клетки. Полученные клетки дважды промывали буфером 50 мМ Tris-HCl (рН 7,0), суспендировали в этом же буфере и затем клетки разрушали с помощью ультразвукового клеточного деструктора. Клеточный дебрис центрифугировали при 4°С при 13000×g в течение 20 минут и затем получали только супернатант. Т6РР очищали из супернатанта с помощью аффинной хроматографии с гистидиновой меткой (His-tag).
Молекулярную массу подтверждали анализом SDS-PAGE, и в результате было обнаружено, что молекулярная масса очищенной Т6РР составляла примерно 29 кДа (обозначен как "Е" на Фиг. 2а).
Пример 3: Определение активности Т6РР в превращении в тагатозу
Для анализа активности Т6РР в превращении тагатозо-6-фосфата в тагатозу, тагатозо-6-фосфат (50 мМ) суспендировали в 50 мМ буфере Tris-HCl (рН 7,5) и к нему добавляли очищенную Т6РР (0,1 ед./мл) и MgCl2 (10 мМ). После этого полученные продукты подвергали взаимодействию при 70°С в течение 10 минут и затем продукты реакции анализировали с помощью ВЭЖХ. Анализ ВЭЖХ выполняли с использованием колонки НРХ-87Н (Bio-Rad, Inc.) с потоком 5 мМ серной кислоты в подвижной фазе при скорости 0,6 мл/мин при 60°С. Тагатозу и тагатозо-6-фосфат определяли с помощью рефрактометрического детектора.
В результате было обнаружено, что из продукта Т6РР-взаимодействия была получена тагатоза (Фиг. 3).
Пример 4: Определение активности Т6РР в зависимости от рН, температуры и добавления иона металла
4-1. Определение активности в зависимости от рН
Чтобы исследовать влияние рН на Т6РР, очищенную Т6РР (0,1 ед./мл) добавляли к тагатозо-6-фосфату (50 мМ), суспендированному в 50 мМ буфере с различными значениями рН (рН 4,0-7,0, цитрат натрия; рН 4,0-7,0, ацетат натрия; рН 6,0-8,0, фосфат калия: рН 7,0-9,0, Tris-HCl) и затем подвергали взаимодействию при 70°С в течение 10 минут. После этого тагатозу количественно анализировали посредством ВЭЖХ при тех же аналитических условиях, что и в Примере 3.
В результате было подтверждено, что Т6РР показала максимальную активность в буфере Tris-HCl (особенно при рН 7,0) и, что Т6РР показала 80% или более своей активности в очень широком диапазоне рН (5,0-8,0) по сравнению с максимальной активностью (Фиг. 4).
4-2. Определение активности в зависимости от температуры
Чтобы проанализировать активность Т6РР в зависимости от температуры, очищенную Т6РР (0,1 ед/мл) добавляли к тагатозо-6-фосфату (50 мМ), суспендированному в 50 мМ буфере Tris-HCl (рН 7,0) и затем подвергали взаимодействию при 40°С, 50°С, 60°С, 70°С, 80°С и 90°С в течение 10 минут. После этого тагатозу количественно анализировали посредством ВЭЖХ при тех же аналитических условиях, что и в Примере 3.
В результате было показано, что Т6РР проявляет высокую активность при 70°С -90°С, и, в частности, проявляет максимальную активность при 80°С (Фиг. 5).
4-3. Определение активности в зависимости от добавления иона металла
Чтобы исследовать влияние добавления иона металла на активность Т6РР, каждый из ионов металла (например NiSO4, CuSO4, MnSO4, CaCl2, ZnSO4, MgCl2, CoSO4 и АРО) добавляли к тагатозо-6-фосфату (50 мМ), суспендированному в 50 мМ буфере Tris-HCl (рН 7,0) до конечной концентрации 0,5 мМ. Для удаления ионов металла добавляли Т6РР (0,1 ед./мл), которая была подвергнута диализу путем обработки 10 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), и затем полученные продукты подвергали взаимодействию при 70°С в течение 10 минут. После этого тагатозу количественно анализировали с помощью ВЭЖХ при тех же аналитических условиях, что и в Примере 3.
В результате было подтверждено, что активность Т6РР в большей степени увеличивалась при добавлении иона Mg, и что активность также увеличивалась при добавлении ионов Mn и Zn (Фиг. 6).
Пример 5: Анализ субстратной специфичности Т6РР
Чтобы определить, обладает ли Т6РР субстратной специфичностью к тагатозо-6-фосфату, анализировали активность Т6РР в отношении различных фосфорилированных сахаридов. Каждый из глюкозо-1-фосфата (50 мМ), глюкозо-6-фосфата (50 мМ), фруктозо-6-фосфата (50 мМ), тагатозо-6-фосфата (50 мМ) и тагатозо-6-фосфата (50 мМ) использовали в качестве субстрата. Добавляли 50 мМ буфер Tris-HCl (рН 7,0) и очищенную Т6РР (1 ед./мл), и затем полученные продукты подвергали взаимодействию при 70°С в течение 1 часа. После этого каждый из сахаридов и фосфорилированных сахаридов количественно анализировали с помощью ВЭЖХ в тех же аналитических условиях, что и в Примере 3.
В результате было подтверждено, что Т6РР обладает активностью дефосфорилирования только в отношении тагатозо-6-фосфата (Фиг. 7).
Хотя настоящее изобретение описано со ссылкой на конкретные иллюстративные воплощения, специалистам в области техники, к которой относится настоящее изобретение, понятно, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без отступления от технической сущности или существенных характеристик настоящего изобретения. Следовательно, описанные выше воплощения следует считать иллюстративными во всех отношениях и неограничивающими. Кроме того, объем настоящего изобретения определен прилагаемой формулой изобретения, а не подробным описанием изобретения и следует понимать, что все модификации или варианты, выводимые из значений и объема настоящего изобретения, а также их эквиваленты включены в объем прилагаемой формулы изобретения.
1. Применение тагатозо-6-фосфатфосфатазы, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, для получения тагатозы.
2. Композиция для получения тагатозы, содержащая тагатозо-6-фосфатфосфатазу, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, микроорганизм, экспрессирующий указанную тагатозо-6-фосфатфосфатазу, или культуру указанного микроорганизма, где композиция дополнительно содержит:
(а) (1) крахмал, мальтодекстрин, сахарозу или их комбинацию; (2) фосфат; (3) фруктозо-6-фосфат-4-эпимеразу; (4) глюкозо-6-фосфатизомеразу; (5) фосфоглюкомутазу или глюкокиназу; и/или (6) α-глюканфосфорилазу, крахмалфосфорилазу, мальтодекстринфосфорилазу, сахарозафосфорилазу, α-амилазу, пуллуланазу, изоамилазу, глюкоамилазу или сахаразу; или (б) микроорганизм, экспрессирующий любой из указанных ферментов, или культуру указанного микроорганизма.
3. Способ получения тагатозы, включающий: превращение тагатозо-6-фосфата в тагатозу посредством взаимодействия тагатозо-6-фосфата с тагатозо-6-фосфатфосфатазой, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, с микроорганизмом, экспрессирующим тагатозо-6-фосфатфосфатазу, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или с культурой указанного микроорганизма.
4. Способ по п. 3, дополнительно включающий превращение фруктозо-6-фосфата в тагатозо-6-фосфат посредством взаимодействия фруктозо-6-фосфата с фруктозо-6- фосфат-4-эпимеразой, с микроорганизмом, экспрессирующим фруктозо-6-фосфат-4-эпимеразу, или с культурой указанного микроорганизма, перед превращением тагатозо-6-фосфата в тагатозу.
5. Способ по п. 4, дополнительно включающий превращение глюкозо-6-фосфата во фруктозо-6-фосфат посредством взаимодействия глюкозо-6-фосфата с глюкозо-6-фосфатизомеразой, с микроорганизмом, экспрессирующим глюкозо-6-фосфатизомеразу, или с культурой указанного микроорганизма, перед превращением фруктозо-6-фосфата в тагатозо-6-фосфат.
6. Способ по п. 5, дополнительно включающий превращение глюкозо-1-фосфата в глюкозо-6-фосфат посредством взаимодействия глюкозо-1-фосфата с фосфоглюкомутазой, с микроорганизмом, экспрессирующим фосфоглюкомутазу, или с культурой указанного микроорганизма, перед превращением глюкозо-6-фосфата во фруктозо-6-фосфат.
7. Способ по п. 5, дополнительно включающий превращение глюкозы в глюкозо-6- фосфат посредством взаимодействия глюкозы с глюкокиназой, с микроорганизмом, экспрессирующим глюкокиназу, или с культурой указанного микроорганизма и фосфатом, перед превращением глюкозо-6-фосфата во фруктозо-6-фосфат.
8. Способ по п. 6, дополнительно включающий превращение крахмала, мальтодекстрина, сахарозы или их комбинации в глюкозо-1-фосфат посредством взаимодействия крахмала, мальтодекстрина, сахарозы или их комбинации с фосфатом и α-глюканфосфорилазой, крахмалфосфорилазой, мальтодекстринфосфорилазой или сахарозафосфорилазой; с микроорганизмом, экспрессирующим α-глюканфосфорилазу, крахмалфосфорилазу, мальтодекстринфосфорилазу или сахарозафосфорилазу; или с культурой указанного микроорганизма, перед превращением глюкозо-1-фосфата в глюкозо-6-фосфат.
9. Способ по п. 7, дополнительно включающий превращение крахмала, мальтодекстрина, сахарозы или их комбинации в глюкозу посредством взаимодействия крахмала, мальтодекстрина, сахарозы или их комбинации с α-амилазой, пуллуланазой, глюкоамилазой, сахаразой или изоамилазой; с микроорганизмом, экспрессирующим α-амилазу, пуллуланазу, глюкоамилазу, сахаразу или изоамилазу; или с культурой указанного микроорганизма, перед превращением глюкозы в глюкозо-6-фосфат.
10. Способ по любому из пп. 3-9, где взаимодействие осуществляют при pH 5,0-8,0, температуре 60-90°C и/или в течение от 1 мин до 24 ч.
11. Способ по любому из пп. 3-9, где взаимодействие осуществляют в присутствии иона или соли металла, выбранного из группы, состоящей из Mg, Mn и Zn.
