Гидрофильный гель для местной доставки 5-аминолевулиновой кислоты
Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно к композиции для использования при фотодинамической терапии, а также для фотодинамической детекции аномально пролиферирующих клеток, содержащей а) 5-амино-4-оксопентановую кислоту (5-аминолевулиновую кислоту или 5-ALA) или ее HCl соль (5-ALA-HCl) в качестве активного ингредиента; b) первый агент, усиливающий проникновение 5-аминолевулиновой кислоты в кожу, выбранный из одного или нескольких неэтоксилированных водорастворимых соединений простых эфиров; и c) второй агент, усиливающий проникновение 5-аминолевулиновой кислоты в кожу, выбранный из одного или нескольких соединений гликозаминогликанов, где указанная композиция представляет собой композицию для местного применения в форме маловязкого гидрогеля, имеющего вязкость приблизительно 1000-13000 мПа⋅с при 32°С. Настоящее изобретение обеспечивает улучшенное проникновение 5-аминолевулиновой кислоты в кожу и обеспечивает надлежащую стабильность 5-аминолевулиновой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли, такой как гидрохлорид. 11 з.п. ф-лы, 2 табл., 12 пр., 6 ил.
Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение относится к фармацевтическому раствору геля для местного применения, который содержит 5-аминолевулиновую кислоту (5-ALA). Настоящее изобретение также относится к фармацевтическому препарату, содержащему такую композицию. Состав такого типа можно применять при фотодинамической терапии, а также при фотодинамической детекции аномально пролиферирующих клеток.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
В настоящее время в мире наблюдается устойчивый рост частоты возникновения злокачественных опухолей, что в значительной степени обусловлено постоянно увеличивающимся возрастом населения в крупных промышленно развитых странах и изменением образа жизни. Поскольку частота возникновения многих видов злокачественной опухоли постоянно растет, это вызывает высокий спрос на различные виды лечения более высокого качества. Среди различных типов предзлокачественных и злокачественных опухолей, предзлокачественные поражения, такие как старческий кератоз, и другие типы немеланомной злокачественной опухоли кожи по-прежнему остаются серьезной и растущей проблемой в странах с большим населением белых людей со светлым цветом лица (светлые волосы, голубые глаза) и/или высоким воздействием УФ-излучения.
Фотодинамическая терапия является быстроразвивающимся и перспективным терапевтическим способом лечения таких предзлокачественных и злокачественных заболеваний, которые связаны с пролиферацией клеток. 5-ALA уже более двух десятилетий используют в коммерческих продуктах из-за ее высокого коэффициента безопасности, который обусловлен ее эндогенной природой, нетоксичности и селективности в отношении клеток злокачественной опухоли. Она известна как фотосенсибилизатор второго поколения, поскольку чувствительность к дневному свету после обработки существенно снижена всего лишь до 1-2 дней по сравнению с 30-60 днями у все еще присутствующего на рынке препарата Photofrin® (порфимер натрия).
В терапевтических целях 5-ALA применяют местно или вводят системно, и она неизбирательно проникает во все клетки, где она метаболизируется в активный сенсибилизатор PPIX (протопорфирин IX) с использованием пути биосинтеза гема. Поскольку злокачественные или неопластические (быстрорастущие) клетки обычно имеют более низкие уровни внутриклеточного железа (Fe2+), чем нормальные здоровые клетки, PPIX не может быть быстро превращен в его конечный продукт гем и поэтому накапливается только в клетках злокачественной опухоли.
Поскольку PPIX является мощным фотосенсибилизатором, этот метаболический путь можно использовать в фотодинамической терапии (PDT). Это уже одобренная терапевтическая стратегия, которая делает 5-ALA одним из наиболее успешных пролекарств, применяемых при лечении широкого спектра предзлокачественных и злокачественных поражений. (M. Wachowska et al., Aminolevulinic Acid as a Prodrug in Photodynamic Therapy of Cancer, Molecules 2011, 16, 4140-4164).
После избирательного накопления фотосенсибилизатора в опухоли его можно активировать посредством освещения светом соответствующей длины волны и дозы.
Молекула PPIX поглощает свет, а затем поглощенная энергия переносится на молекулярный кислород, создавая синглетное состояние кислорода 1O2. Синглетный кислород, который образуется в результате процесса PDT на PPIX, затем приводит к окислительному повреждению внутриклеточных макромолекул и, следовательно, приводит к гибели клеток. Такой цитотоксический эффект, в частности оказываемый на пролиферирующие клетки, обусловлен реакциями синглетного кислорода, например, с клеточной мембраной и митохондриями или запускает образование свободных радикалов, которые повреждают клетки. Вариант индуцированной посредством PDT гибели клеток обычно представляет собой смесь апоптоза, некроза и аутофагии. Общепризнанно, что помимо прямой клеточной цитотоксичности в общий эффект PDT вносят свой вклад два других важных фактора: закупорка сосудов (которая останавливает ангиогенез и тем самым предотвращает метастазирование) и местная воспалительная реакция.
Помимо 5-ALA весьма важна длина волны света, выбранная для возбуждения PPIX, а также глубина проникновения самой 5-ALA в пораженную ткань. Для чисто поверхностной обработки наилучшей для лечения обычно считается длина волны максимального поглощения. Однако для более глубоких очагов должен быть достигнут компромисс между уровнем возбуждения и глубиной проникновения света, что обычно означает сдвиг к более длинным (т.е. более красным) длинам волн. 5-ALA является полярной молекулой и встречается в физиологических условиях в виде заряженного цвиттериона. Это объясняет ее низкую растворимость в липидах, и это в конечном счете ограничивает ее проникновение через внешний слой кожи, stratum corneum (роговой слой), который имеет липидную природу.
Более того, облучение фотосенсибилизатора приводит к возникновению характерного флуоресцентного излучения, которое можно использовать для детекции пролиферирующих клеток.
Из уровня техники известен ряд исследований с применением местно наносимых композиций на основе 5-аминолевулиновой кислоты. Несмотря на то, что эти исследования имеют общий признак использования 5-аминолевулиновой кислоты или ее производных, существуют различия в отношении других параметров, таких как период проникновения, период лечения, тип используемого света и применяемая доза света.
Хотя из результатов исследований, раскрытых в предшествующем уровне техники, ясно виден потенциал фотодинамической терапии с применением 5-аминолевулиновой кислоты, различные составы, которые уже присутствуют на рынке, имеют ряд недостатков.
Общую значимость для разработки PDT-терапии имеет руководство по фотосенсибилизаторам в клинической PDT (RR Allison et al., Photodiagnosis and Photodynamic Therapy (2004) 1, 27—42), в котором обозначены соответствующие моменты, которые необходимо учитывать. Среди них перечислены наиболее важные требования, которым должен отвечать продукт:
- должны образовываться нетоксичные и не должны образовываться токсичные или канцерогенные побочные продукты; в противном случае можно применять химиотерапевтические средства;
- обязательным является легкое выведение (короткий период полувыведения фотосенсибилизатора);
- должен легко проникать в кожу, достаточно глубоко, чтобы достичь всей злокачественной ткани, и надежно и избирательно накапливаться в митохондриях клеток злокачественной опухоли для эффективной индукции апоптоза при освещении;
- для предупреждения случайной обработки необходима надежная активация светом соответствующей длины волны;
- фоточувствительность всей кожи на протяжении периода длительностью несколько часов или лишь несколько дней после обработки является более предпочтительной относительно периода длительностью нескольких недель или месяцев;
- быть универсальным для местного, перорального, ингаляционного или внутривенного введения, без возникновения побочных эффектов, таких как, например, аллергические реакции или гипертония;
- во всех без исключения случаях должен доставляться до необходимого места и активироваться в нужный момент;
- более длинные волны активации обеспечивают более глубокое проникновение в ткани;
- возможность применения в сочетании с другими формами лечения, такими как хирургия, лучевая терапия и химиотерапия;
- безусловно должен позволять обработку превышающей дозой освещения без возникновения побочных эффектов;
- легко и безопасно вводится, целенаправленно воздействует на соответствующую структуру, не воздействует на нормальные ткани, активируется, когда это необходимо, до тех пор, пока указанная структура не будет уничтожена, а затем устраняется, не нанося необратимого повреждения остальной части организма.
В частности, применительно к 5-ALA известно, что она разрушается в водном растворе, однако она должна быть стабильной в течение периода применения для сохранения терапевтической полезности. Наилучшую стабильность у водных растворов наблюдают при pH <6 (V. von Arx et al. (J. Pharm. Pharmacol. 49: 652-656, 1997)).
Другим недостатком является то, что глубина проникновения фотосенсибилизатора в поврежденную ткань снижается из-за его низкой растворимости в липидах. Как результат, пораженная ткань во многих случаях для фотодинамической терапии доступна только в ее поверхностных слоях, хотя глубина, на которую проникает свет, используемый для активации фотосенсибилизатора, также позволяет обрабатывать более глубоко лежащие слои.
Помимо глубины проникновения для пациентов и врачей имеет значение кинетика распределения в коже и последующая метаболизация в PPIX в клетках. Современные способы лечения достигают результата только после периода инкубации длительностью несколько часов для клинически значимого накопления PPIX для PDT-лечения, тогда как был бы весьма желателен более короткий период обработки (T. Maisch et al. (Experimental Dermatology, 17, 813-820).
Цель настоящего изобретения
Таким образом, целью настоящего изобретения является получение композиции, содержащей 5-ALA, которая преодолевает недостатки, известные у продуктов предшествующего уровня техники, и которая обеспечивает улучшенное проникновение 5-ALA в ткань пациента и, в то же время, обеспечивает надлежащую стабильность 5-ALA. Еще одной целью настоящего изобретения является получение композиции, содержащей 5-ALA, которая эффективно обеспечивает быстрое накопление PPIX после введения пациенту.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Эти цели достигаются с помощью композиции по настоящему изобретению, содержащей
a) 5-ALA или ее HCl соль в качестве активного ингредиента;
b) первое способствующее проникновению вещество, выбранное из одного или нескольких водорастворимых соединений простых эфиров, предпочтительно неэтоксилированных водорастворимых соединений простых эфиров; и
c) второе способствующее проникновению вещество, выбранное из одного или нескольких соединений гликозаминогликанов.
Авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что двухстадийный подход может привести к неожиданно повышенному проникновению 5-ALA в глубокие слои ткани. На первой стадии применяют способствующее проникновению химическое вещество, выбранное из одного или нескольких водорастворимых соединений простых эфиров, предпочтительно неэтоксилированных водорастворимых соединений простых эфиров, которое изменяет коэффициент разделения stratum corneum, позволяя гидрофильным молекулам проникать в кожу. Благодаря такому подходу компонентам а) и с) позволяется проникать в stratum corneum намного лучше, чем это было раскрыто в композициях известного уровня техники.
Термин «неэтоксилированный» означает соединения простых эфиров, которые не были этоксилированы с помощью этиленоксида.
После прохождения этими компонентами stratum corneum в эпидермисе, второе способствующее проникновению вещество, т.е. вещество, выбранное из одного или нескольких соединений гликозаминогликанов, обеспечивает проникновение 5-ALA или его HCl соли в дерму путем гидратации клеток базального слоя. Гидратация базального слоя необходима для стимуляции открытия плотных соединений с целью обеспечения параклеточного транспорта 5-ALA.
Такой двухстадийный синергический подход был максимально адаптирован к характеристикам пораженной кожи (например, пораженной старческим кератозом), которая, как известно, является сухой, чешуйчатой и огрубевшей. Таким образом, настоящая композиция делает возможным максимальное проникновение 5-ALA или ее HCl соли в кожу даже без необходимости какой-либо окклюзионной повязки поверх обрабатываемой области.
Окклюзионную повязку обычно используют при местной PDT с применением таких присутствующих в настоящее время на рынке продуктов, как Metvix® или Ameluz®, представляющих собой галеновые формы, которые содержат высокий уровень масел и жиров.
При повышенных температурах окружающей среды (как, например, в летнее время) такие масляные/жировые продукты имеют склонность к превращению в жидкость под окклюзионной повязкой, что приводит к размыванию за пределы требуемой области обработки и, следовательно, к снижению их эффективности. При еще более неблагоприятных условиях они могут стекать каплями на лицо пациента, в случае обработки областей на лбу, что приводит к загрязнению других областей лица, таких как глаза, и это вызывает сильный дискомфорт у пациента, что приводит к снижению соблюдения больным режима и схемы лечения. Другой продукт, Alacare®, уже сам по себе является составом с окклюзионной повязкой.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано следующее:
на фиг. 1 показано изображение необработанного уха свиньи, отображающее естественную флуоресценцию порфирина;
на фиг. 2 показаны изображения флуоресценции порфирина (пример 11, таблица 1), отображающие глубину проникновения состава по настоящему изобретению в ухо свиньи после периода инкубации, составлявшего 4 часа;
на фиг. 3 изображен флуоресцентный сигнал порфирина на уровне 614-643 нм для примера 12 после периода инкубации, составлявшего 15 мин.;
на фиг. 4 изображен флуоресцентный сигнал порфирина на уровне 614-643 нм для примера 12 после периода инкубации, составлявшего 60 мин.;
на фиг. 5 изображен флуоресцентный сигнал порфирина на уровне 614-643 нм для Levulan® Kerastick после периода инкубации, составлявшего 15 мин.;
на фиг. 6 изображен флуоресцентный сигнал порфирина на уровне 614-643 нм для Levulan® Kerastick после периода инкубации, составлявшего 60 мин.
Подробное раскрытие настоящего изобретения
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, композиция по настоящему изобретению содержит 5-ALA в форме ее гидрохлоридной соли (5-ALA HCl), которая содержится в композиции в диапазоне концентраций 5-30 мас. %. Еще более предпочтительный диапазон концентраций 5-ALA HCl составляет приблизительно 10-25 мас. % от общей массы композиции.
Композиция по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой композицию для фармацевтического применения и, таким образом, будет содержать одно или несколько фармацевтически приемлемых вспомогательных средств. Такие вспомогательные средства, например, выбраны из гелеобразующих полимеров, в частности полимеров для образования гидрогеля.
Полимерами таких типов могут быть избранные (без ограничения) гидрогели, образующие высокопоглощающие природные или синтетические полимерные сети, которые могут включать поливиниловый спирт, полиакрилат натрия, акрилатные сополимеры или природные гидрогелевые материалы, такие как агароза, метилцеллюлоза, гиалуроновая кислота/гиалуронат. Другими гелеобразующими полимерами являются гидроксипропилцеллюлоза, метилгидроксиэтилцеллюлоза или карбоксиметилцеллюлоза натрия. Дополнительным полимером является ксантановая камедь.
Для дополнительной информации следует обратиться к Rudolf Voigt, Pharmazeutische Technologie, 11th Edition, 2010, в частности к странице 396 и последующим страницам.
Другими вспомогательными средствами, которые можно применять в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, являются вещества для консервирования композиции, хелатообразующие вещества, буферные вещества и/или регуляторы кислотности.
В качестве обычных консервантов можно применять эфиры парагидроксибензойной кислоты, такие как метилпарабен, этилпарабен или пропилпарабен (или их натриевые соли, а также в комбинации), или, альтернативно, сорбат калия или сорбиновую кислоту. Консервирующую активность можно также достичь с помощью спиртовых добавок, таких как, например, добавки, которые содержат более 15% пропиленгликоля или глицерина.
Дополнительные вспомогательные средства можно выбрать из увлажнителей, таких как глицерин, пропиленгликоль или сорбит, предпочтительно в концентрациях 10-20 мас. % от общей массы композиции. Такие ингредиенты будут предотвращать высыхание гидрогеля и повышать применимость конечного фармацевтического продукта.
Более того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению в случае гидрогеля может содержать регуляторы кислотности, которые обеспечивают подходящее значение рН. Как упомянуто выше, 5-ALA разрушается в водном растворе и имеет наилучшую стабильность при рН ниже 6. Поэтому подходящим подходом является доведение значения рН всей композиции до такого диапазона рН, например, путем установления значения рН в хорошо переносимом диапазоне 3,5-4,5 с помощью подходящих ингредиентов. Такие ингредиенты можно выбрать из различных видов кислот или кислых солей, таких как дигидрат тринатрия цитрата.
В случае необходимости дополнительными вспомогательными средствами для применения в гидрогеле по настоящему изобретению являются хелатообразующие вещества, такие как ЭДТА, и буферные вещества.
В композицию, помимо перечисленных выше средств, также можно включить дополнительные вспомогательные средства. По поводу композиций, отличных от композиций для местного применения в форме гидрогелей, обычно следует обратиться к стандартной фармацевтической литературе, такой как Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, 2013.
Предпочтительно, гидрогель принимает форму маловязкого гидрогеля. Термин «маловязкий» обычно в настоящем документе определяют как описание вязкости от 1000 до 13000 мПа·с (и включая крайние значения диапазона), измеренной при 32°С. Вязкость можно измерять с помощью реометра с системой «конус-плита» (Rheostress RS-1, Thermo Haake, Карлсруэ, Германия) с размером 35 мм, углом конуса 2°, в осциллирующем режиме с постоянной деформацией на частоте 1 Гц и с авторастяжением. Измерение осуществляют при линейном изменении температуры от 20°C до 40°C со скоростью 1°C / мин. с помощью встроенного элемента Пельтье в реометре. Показания вязкости [мПа·с] снимают с полученной в результате кривой на 25 и 32°С, причем последняя представляет собой среднюю температуру поверхности кожи.
Предпочтительный диапазон вязкости для маловязкого гидрогеля составляет приблизительно 3000-7000 мПа·с.
В соответствии с более предпочтительным вариантом осуществления, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит одно или несколько водорастворимых соединений простых эфиров, предпочтительно неэтоксилированных водорастворимых соединений простых эфиров, выбранных из изосорбидных соединений, предпочтительно из простого 2,5-пентилэтилового эфира 1,4:3,6-диангидросорбита (пентилэтилизосорбида), простого эфира 2,5-лаурилглицерина и 1,4:3,6-диангидросорбита (лаурилглицерилизосорбида) и простого 2,5-диметилового эфира 1,4:3,6-диангидросорбита (диметилизосорбида). Эта группа соединений простых эфиров выполняет роль способствующего проникновению химического вещества, которое изменяет коэффициент разделения stratum corneum и посредством этого позволяет гидрофильным молекулам проникать в кожу. Подходящие диапазоны концентраций этих соединений простых эфиров обычно находятся в диапазоне приблизительно 4-15 мас. %, более предпочтительно в диапазоне 8-12 мас. % от общей массы композиции.
Одно или несколько соединений гликозаминогликанов, образующих гидрофильное способствующее проникновению в кожу вещество, предпочтительно выбирают из хондроитинсульфата, кератансульфата, дерматансульфида, гепаринсульфата, гепарансульфата и/или гиалуроновой кислоты/гиалуроната натрия. Группу из гиалуроновой кислоты и ее натриевой соли также называют «несульфатированным гликозаминогликаном».
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, композиция по настоящему изобретению содержит первое способствующее проникновению вещество, выбранное из одного или нескольких неэтоксилированных водорастворимых соединений простых эфиров, и второе способствующее проникновению вещество, выбранное из одного или нескольких изосорбидных соединений.
Такие соединения обычно добавляют в композицию по настоящему изобретению в диапазоне концентраций 0,5-1,5 мас. % (от общей массы композиции), более предпочтительно в диапазоне 0,8-1,2 мас. %.
В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой маловязкий гидрогель и содержит 5-ALA HCl, диметилизосорбид и гиалуронат натрия. Необязательными вспомогательными средствами являются тринатрия цитрат в качестве регулятора рН, динатрия эдетат в качестве хелатообразующего вещества, метил- и пропилпарабен в качестве консервантов и ксантановая камедь в качестве усилителя вязкости. Кроме того, гидрогель содержит очищенную воду фармацевтической степени чистоты.
В такой предпочтительной композиции 5-ALA HCl присутствует в количестве приблизительно 20 мас. %, диметилизосорбид содержится в количестве приблизительно 10 мас. % и гиалуронат натрия в количестве приблизительно 1 мас. % от общей массы композиции (включая воду).
Фармацевтическая композиция для местного применения по настоящему изобретению может быть составлена в устройстве для нанесения 5-ALA-содержащих гидрогелей, таком как двухкамерная система, в которой активный ингредиент 5-ALA отделен от гелевой матрицы (которая содержится в отдельной камере), при этом содержимое обеих камер смешивают перед обработкой путем разрыва герметизирующей перегородки, которая разделяет обе камеры, с получением готового к использованию раствора геля для местного применения, который можно поместить на область нанесения на коже.
Таким образом, гидрогель можно хранить в двухкамерной системе, которая может быть выполнена из прозрачного ламинированного полимера и состоять из двух камер, разделенных разрушаемой стенкой. Выбранный материал защищает чувствительный активный ингредиент в одной камере от действия кислорода и воды, тем самым обеспечивая долгосрочную стабильность 5-ALA, в то время как в другой камере хранят матрицу гидрогеля. Было обнаружено, что в такой двухкамерной пробирке ингредиент 5-ALA имел долгосрочную стабильность при различных условиях хранения без разрушения.
Например, герметизирующую перегородку, которая разделяет две камеры, можно сломать путем приложения давления на содержащую жидкость камеру, что приводит к разрушению герметизирующей перегородки. После открытия герметизирующей перегородки полученную суспензию необходимо энергично замешивать до получения прозрачного геля. После этой процедуры продукт готов к окончательному нанесению на кожу пациента.
Композицию по настоящему изобретению применяют при фотохимиотерапевтическом лечении или при диагностике нарушений или патологий внутренних или внешних поверхностей организма. Такие нарушения или патологии выбраны из предзлокачественных и злокачественных опухолей, предзлокачественных поражений кожи, таких как старческий кератоз, и других типов немеланомной злокачественной опухоли кожи, SCC (плоскоклеточной карциномы) или BCC (базальноклеточной карциномы).
Теперь настоящее изобретение будет описано с помощью приведенных далее примеров, которые иллюстрируют настоящее изобретение.
Примеры
Проводили испытания состава для дополнительного выяснения, удовлетворяет ли он вышеуказанным требованиям для местно применяемых фотосенсибилизаторов. Образцы примеров в соответствии с настоящим изобретением готовили по двухстадийному способу следующим образом.
Стадия I: динатрия эдетат (Komplexon III, Merck, Дармштадт) растворяли в очищенной воде при комнатной температуре, приблизительно 22°C, при перемешивании с помощью магнитной мешалки (IKAMAG RT 15, IKA Werke, Германия) со скоростью перемешивания 300 об/мин в течение 5 минут. К полученному раствору добавляли гиалуронат натрия (HA-EP1, 760 кДа, Shandong Freda Biopharm Co., Ltd, Цзинань, Китай) и диспергировали с помощью стеклянной палочки медленными круговыми движениями в течение 1 минуты. Полученную дисперсию хранили в холодильнике при 2-8°С в течение 12-18 часов. По прошествии этого периода гиалуронат натрия был полностью разбухшим, а полученный препарат имел прозрачный и вязкий характер.
Стадия II: метилпарабен и пропилпарабен (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Букс, Швейцария), при их наличии, растворяли в диметилизосорбиде (Dottisol®, Dottikon Exclusive Synthesis, Доттикон, Швейцария) при перемешивании с помощью той же магнитной мешалки, которую использовали ранее, со скоростью перемешивания 300 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре, приблизительно 22°C. Полученный прозрачный раствор добавляли к полученному на стадии I препарату при перемешивании с помощью той же магнитной мешалки, которую использовали ранее, со скоростью перемешивания изначально 300 об/мин. Скорость перемешивания постепенно увеличивали до 700 об/мин в течение 20 мин при комнатной температуре, приблизительно 22°С, с получением в результате прозрачного геля.
В этот прозрачный гель медленно (в течение 1 мин) добавляли дигидрат тринатрия цитрата (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Букс, Швейцария) при перемешивании с помощью той же магнитной мешалки, которую использовали ранее, со скоростью перемешивания 700 об/мин и перемешивание с той же скоростью продолжали в течение 30 минут при комнатной температуре, приблизительно 22°C. Затем добавляли ксантановую камедь, при ее наличии (тип: FNCS, Jungbunzlauer, Базель, Швейцария), при перемешивании с помощью роторно-статорного гомогенизатора (Polytron PT 10-35 GT, Kinematica, Швейцария) со скоростью 5000 об/мин в течение 20 мин при комнатной температуре, приблизительно 22°С, до получения однородного геля.
Для получения конечного продукта гель-матрицу смешивали с соответствующим количеством 5-ALA (ингредиентом a).
Вязкость измеряли с помощью реометра с системой «конус-плита» (Rheostress RS-1, Thermo Haake, Карлсруэ, Германия), с размером 35 мм, углом конуса 2°, в осциллирующем режиме с постоянной деформацией на частоте 1 Гц и с авторастяжением. Измерение осуществляли при линейном изменении температуры от 20°C до 40°C со скоростью 1°C / мин. с помощью встроенного элемента Пельтье в реометре. Показания вязкости [мПа·с] снимали с полученной в результате кривой на 25 и 32°С, причем последняя представляла собой среднюю температуру поверхности кожи.
Числовые значения в приведенных ниже таблицах 1 и 2 представляют собой массовый % от общего продукта. В композициях использовали следующие соединения:
a) 5-ALA HCl: активный ингредиент;
b) диметилизосорбид: способствующее проникновению через поверхность вещество;
c) HA-Na LMW: (гиалуронат натрия, низкомолекулярный) — способствующее проникновению в кожу вещество;
d) тринатрия цитрат: регулятор рН;
e) динатрия эдетат: хелатообразующее с металлами вещество;
f) метилпарабен: консервант;
g) пропилпарабен: консервант;
h) ксантановая камедь: усилитель вязкости;
i) очищенная вода: наполнитель.
Таблица 1.
| Пример 1 | Пример 2 | Пример 3 | Пример 4 | Пример 5 | Пример 6 | |
| 5-ALA HCl | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 |
| Диметилизосорбид | - | 15 | - | 4 | 11 | - |
| HA-Na LMW | - | - | 1 | 1 | 1 | 2 |
| Тринатрия цитрат | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| Динатрия эдетат | - | - | - | - | - | - |
| Метилпарабен | - | - | - | - | - | - |
| Пропилпарабен | - | - | - | - | - | - |
| Ксантановая камедь | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Очищенная вода | 67,5 | 52,5 | 66,5 | 62,5 | 57,5 | 65,5 |
| Вязкость при 25°C [мПа·с] | 2300 | 3450 | 5300 | 7750 | 3000 | 12850 |
| Вязкость при 32°C [мПа·с] | 2180 | 3350 | 4600 | 6650 | 2400 | 11300 |
| Пример 7 | Пример 8 | Пример 9 | Пример 10 | Пример 11 | |
| 5-ALA HCl | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 |
| Диметилизосорбид | - | - | 15 | 15 | 10 |
| HA-Na LMW | - | 0,5 | 0,5 | 1,5 | 1 |
| Тринатрия цитрат | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| Динатрия эдетат | 0,02 | 0,02 | 0,02 | 0,02 | 0,02 |
| Метилпарабен | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
| Пропилпарабен | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,03 |
| Ксантановая камедь | 0,8 | 0,3 | 1,0 | - | - |
| Очищенная вода | 67,05 | 67,05 | 51,35 | 51,35 | 56,85 |
| Вязкость при 25°C [мПа·с] | 6600 | 2000 | 6200 | 6800 | 4100 |
| Вязкость при 32°C [мПа·с] | 6600 | 1750 | 6100 | 5700 | 3900 |
Для оценки идеальных соотношений двух способствующих проникновению веществ были спроектированы эксперименты в соответствии с нормативными требованиями (ICH) для подхода «качество, заложенное проектом» (Quality by Design — QbD).
В рамках разработки было проведено испытание ex vivo на коже уха свиньи для оценки глубины проникновения и неожиданно было обнаружено, что с помощью композиции по настоящему изобретению можно достичь очень значительных глубин проникновения (>1 мм, фиг. 2). Большие глубины проникновения были особенно неожиданными, поскольку ранее предполагали, что из-за своей гидрофильности 5-аминолевулиновая кислота в любом случае не сможет так легко проникать через эпидермис.
Другим неожиданным преимуществом является то, что с помощью второго способствующего проникновению вещества по настоящему изобретению 5-аминолевулиновая кислота, по всей видимости, поглощается через базальную мембрану в дерму.
Также в рамках разработки было проведено испытание ex vivo с временным разрешением на коже уха свиньи для исследования кинетики распределения и метаболизирования.
В этих опытах применяли гораздо более короткие периоды инкубации, а полученный в результате флуоресцентный сигнал (среднюю интенсивность пикселей) регистрировали по рассеиванию энергии, причем каждый энергетический канал имел ширину спектра сигнала 5 нм в пределах общего диапазона детекции 584-716 нм. В соответствии с характерным спектром флуоресцентного излучения порфиринов (уро/копропорфирина и PPIX), были отобраны лишь значения от 614 нм до 643 нм, и они отображены на фиг. 3 и 4 (графики, построенные с помощью программного обеспечения Microscope software (ZEN Black, Release Version 8.1, ZEISS AG, Оберкохен, Германия)). Значения интегральной интенсивности (в виде средней интенсивности пикселей) эпидермального слоя для соответствующего диапазона длин волн приведены в таблице 2. Наряду с примером 12, инкубировали и измеряли коммерчески доступный продукт Levulan® Kerastick. Одна ампула Levulan® Kerastick содержит 1,5 мл среды в виде раствора, содержащего спирт USP (содержание этанола = 48% об./об.), воду, лаурет-4, изопропиловый спирт и полиэтиленгликоль. Другая ампула содержит 354 мг ALA HCl в виде сухого твердого вещества.
Таблица 2.
| Пример 12 | Levulan® Kerastick |
|
| 5-ALA HCl | 20 | Коммерчески доступный продукт, содержит 20 мас. % 5-ALA HCl |
| Диметилизосорбид | 10 | |
| HA-Na LMW | 1 | |
| Тринатрия цитрат | 12 | |
| Динатрия эдетат | 0,02 | |
| Метилпарабен-Na | 0,075 | |
| Пропилпарабен-Na | 0,025 | |
| Очищенная вода | 56,88 | |
| Эпидермальная область образца | ||
| Период инкубации | Средняя интенсивность пикселей для уро/копропорфирина и PPIX (614-643 нм) | |
| 15 мин. инкубации | 3,01 | 1,97 |
| 60 мин. инкубации | 7,16 | 5,38 |
Неожиданным преимуществом было то, что спустя 15 минут периода инкубации уже можно было детектировать в эпидермальном слое значительные количества порфиринов и, по сравнению с коммерчески доступным продуктом, могла быть достигнута гораздо более высокая концентрация порфиринов. Спустя 60 минут периода инкубации результат для примера, описанного в настоящем изобретении, был большим, чем соответствующие значения коммерчески доступного продукта.
В соответствии с настоящим изобретением, состав содержал активное вещество, которое представляет собой 5-аминолевулиновую кислоту в форме ее гидрохлоридной соли, которая превращалась в клетке в протопорфирин IX. Матрица представляла собой преимущественно водную фазу, которая была оптимальной для применения на коже, а рН, скорректированный для обработки, находился в приемлемом и хорошо переносимом диапазоне от рН 3,5 до рН 4,5. Такой диапазон рН обеспечивал стабильность продукта в течение 24 часов для терапевтического применения. Скорректированная вязкость приводила к образованию довольно маловязкого геля для конечной смеси при температуре 32°C (температура кожи) в диапазоне 3000-5000 мПа·с. Такая вязкость обеспечивала возможность легкого распределения геля по области нанесения и достижения также труднодоступных поверхностей кожи, при этом он обладал достаточной адгезией к коже, что позволяло ему оставаться на коже без неконтролируемого распределения.
Результаты
Проводили опыты ex vivo на коже уха свиньи с учетом следующей стандартной литературы:
- W. Meyer, Dermatologist 47 .178-182, 1996; Meyer et al., Münch Tierarztl Wschr. 114: 92-99, 2001; Meyer et al., Münch Tierarztl Wschr 114: 100-111, 2001);
- патентный документ WO 2004092726 A1;
- Biana Godin, Elka Touitou Transdermal skin delivery: Predictions for humans from in vivo, ex vivo and animal models;
- Histochemical Techniques, JD Bancroft.
Было описано, что кожа уха свиньи является наиболее близким подходом относительно кожи человека в том, что касается физиологических и геометрических аспектов. Толщина эпидермиса человека описана как равная 0,08-0,12 мм. Подкожная жировая ткань в коже уха свиньи, в отличие от кожи человека, отсутствует, на приведенных изображениях видно, что состоит она только из дермального слоя, лежащего под эпидермальным слоем.
Уши свиней брали у недавно забитых свиней (Süddeutsches Schweinefleischzentrum Ulm Donautal GmbH, Германия). Чтобы оставить кожу как можно более неповрежденной, уши свиней срезали до того, как всю свинью мыли с использованием горячей воды.
Определенное количество лекарственного препарата наносили на отмеченную квадратную область кожи уха свиньи, а затем все ухо свиньи инкубировали в инкубаторе Heracell 150i Incubator (Thermo Scientific, Уолтем, США) при 37°C. Спустя 4 часа уши свиньи извлекали из инкубатора и ранее отмеченные области, содержащие лекарственный препарат, вырезали с помощью скальпеля.
Полученный лоскут кожи уха свиньи затем погружали в среду для заливки для получения криотом (№ 020108926, Leica Instruments, Нуслох). После замораживания залитых лоскутов при -20°C получали вертикальные срезы определенной толщины с помощью микротома Cryo Microtome (CM-3050S, Leica Instruments, Нуслох). Затем эти срезы фиксировали на стеклянных предметных стеклах с помощью глицеринового геля (водная среда для заливки срезов Glycerol Gelatin («глицериновый желатин»), Sigma-Aldrich, Сент-Луис, США). Затем эти образцы хранили при -40°С.
Показанные на фигурах изображения получали с помощью конфокального рентгеномикроскопа (CLSM 510 Meta ZEISS AG, Оберкохен, Германия) с применением 10× объектива (10× 0.3NA EC Plan-Neofluar Ph1 M27, ZEISS AG, Оберкохен, Германия). На изображении проиллюстрирован верхний слой кожи уха свиньи, оно было получено с помощью объектива с выбранным увеличением 10×, и его размер составляет 1,4 мм × 1,4 мм. На фиг. 2 показана глубина проникновения состава по настоящему изобретению, примера 11, в ухо свиньи. Как можно видеть, у композиции по настоящему изобретению наблюдали гораздо большую глубину проникновения, чем в случае сравнительных примеров (проиллюстрировано стрелкой).
Также, в случае фиг. 3 - фиг. 6, изображения получали с помощью конфокального рентгеномикроскопа, но с использованием 20× объектива. На изображении проиллюстрирован верхний слой кожи уха свиньи, оно было получено с помощью объектива с выбранным увеличением 20×, и его размер составляет 0,7 мм × 0,7 мм. На фиг. 3 показано распределение интенсивности сигнала от порфирина для композиции примера 12 в эпидермальном слое спустя 15 мин. периода инкубации, а на фиг. 4 — спустя 60 мин. периода инкубации. Для сравнения, на фиг. 5 показано распределение интенсивности сигнала от порфирина в эпидермальном слое для Levulan® Kerastick спустя 15 мин. периода инкубации, а на фиг. 6 — спустя 60 мин. периода инкубации. Ясно видно, что характерные сигналы от профиринов можно было детектировать в эпидермальном слое и даже глубже, и было обнаружено, что они были намного сильнее в сравнении с коммерчески доступным составом. Виден результат функционирования уникального механизма проникновения, согласно описанному настоящему изобретению, в том, что касается более быстрого распределения и метаболизирования молекулы 5-ALA в терапевтический полезный порфириновый фотосенсибилизатор для PDT-лечения.
1. Композиция для использования при фотодинамической терапии, а также для фотодинамической детекции аномально пролиферирующих клеток, содержащая:
а) 5-амино-4-оксопентановую кислоту (5-аминолевулиновую кислоту или 5-ALA) или ее HCl соль (5-ALA-HCl) в качестве активного ингредиента;
b) первый агент, усиливающий проникновение 5-аминолевулиновой кислоты в кожу, выбранный из одного или нескольких неэтоксилированных водорастворимых соединений простых эфиров; и
c) второй агент, усиливающий проникновение 5-аминолевулиновой кислоты в кожу, выбранный из одного или нескольких соединений гликозаминогликанов,
где указанная композиция представляет собой композицию для местного применения в форме маловязкого гидрогеля, имеющего вязкость приблизительно 1000-13000 мПа·с при 32°С.
2. Композиция по п. 1, где активный ингредиент представляет собой 5-аминолевулиновую кислоту в форме ее гидрохлоридной соли (5-ALA HCl) и содержится в композиции в диапазоне концентраций 5-30% (мас./мас.), более предпочтительно 10-25% (мас./мас.) от общей массы композиции.
3. Композиция по п. 1 или 2, которая представляет собой фармацевтическую композицию и содержит одно или несколько фармацевтически приемлемых вспомогательных средств.
4. Композиция по п. 1, где одно или несколько неэтоксилированных водорастворимых соединений простых эфиров выбраны из изосорбидных соединений, предпочтительно простого 2,5-пентилэтилового эфира 1,4:3,6-диангидросорбита (пентилэтилизосорбида), простого эфира 2,5-лаурилглицерина и 1,4:3,6-диангидросорбита (лаурилглицерилизосорбида) и простого 2,5-диметилового эфира 1,4:3,6-диангидросорбита (диметилизосорбида).
5. Композиция по п. 1, где одно или несколько неэтоксилированных водорастворимых соединений простых эфиров содержатся в композиции в диапазоне концентраций 4-15% (мас./мас.), более предпочтительно в диапазоне 8-12% (мас./мас.) от общей массы композиции.
6. Композиция по п. 1, где одно или несколько соединений гликозаминогликанов выбраны из хондроитинсульфата, кератансульфата, дерматансульфата, гепаринсульфата, гепарансульфата и/или гиалуроновой кислоты/гиалуроната натрия (несульфатированного гликозаминогликана).
7. Композиция по п. 6, где одно или несколько соединений гликозаминогликанов содержатся в композиции в диапазоне концентраций 0,5-1,5% (мас./мас.), более предпочтительно в диапазоне 0,8-1,2% (мас./мас.) от общей массы композиции.
8. Композиция по п. 1, которая представляет собой маловязкий гидрогель и содержит 5-ALA HCl, диметилизосорбид и гиалуронат натрия.
9. Композиция по п. 8, содержащая 5-ALA HCl в количестве приблизительно 20% (мас./мас.), диметилизосорбид в количестве приблизительно 10% (мас./мас.) и гиалуронат натрия в количестве приблизительно 1% (мас./мас.).
10. Композиция по п. 1, которая дополнительно содержит один или несколько консервантов, хелатообразующих веществ и/или буферных веществ/регуляторов кислотности.
11. Композиция по п. 1 для применения при фотохимиотерапевтическом лечении или при диагностике нарушений или патологий внутренних или внешних поверхностей организма.
12. Композиция по п. 11 для применения при фотохимиотерапевтическом лечении или при диагностике, где нарушения или патологии внутренних или внешних поверхностей организма выбраны из предзлокачественных и злокачественных опухолей, предзлокачественных поражений кожи, таких как старческий кератоз, и других типов немеланомной злокачественной опухоли кожи, SCC (плоскоклеточной карциномы) или BCC (базальноклеточной карциномы).
