Способ отбора жеребцов арабской чистокровной породы с высокой выживаемостью сперматозоидов до и после криоконсервации по элементному составу волос
Владельцы патента RU 2723622:
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт коневодства" (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ отбора жеребцов арабской чистокровной породы с высокой выживаемостью сперматозоидов до и после криоконсервации по элементному составу волос включает настриг требуемого образца волос по массе не менее 0,24 г с участка гривы в области проекции первого шейного позвонка, отбор проксимального участка волоса равного по длине 3,3 см. Способ отличается тем, что в качестве критерия для оценки выживаемости сперматозоидов в свежей и после оттаивания (криоконсервации) при Т 2-4°С сперме используется показатель выживаемости сперматозоидов, который рассчитывается по формуле
ПВС - показатель выживаемости сперматозоидов, %
Zn - количество цинка в волосе с гривы, ммоль/кг
Hg - количество ртути в волосе с гривы, ммоль/кг
1000 - корректирующий коэффициент.
При значении ПВС ниже 115,0%, жеребцов относят к группе животных с низкой выживаемостью сперматозоидов в свежей и размороженной сперме, при значении ПВС выше 115,1%, жеребцов относят к группе с высокой выживаемостью сперматозоидов в сперме. Изобретение может быть использовано для отбора жеребцов арабской чистокровной породы с высокой выживаемостью сперматозоидов в свежей и оттаянной (после криоконсервации) сперме. 3 табл.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к области животноводства, в частности к коневодству, и может быть использовано для отбора жеребцов арабской чистокровной породы с высокой выживаемостью сперматозоидов в свежей и оттаянной (после криоконсервации) спермы.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Роль химических элементов в функционировании живого организма не вызывает сомнения, доказано их участие в большинстве биохимических процессов и разнообразных функциях. При этом каждый макро- или микроэлемент характеризуется определенным оптимальным диапазоном содержания в организме. Отклонения в концентрации химических элементов способны привести к возникновению реакций различной степени выраженности, физиологическим изменениям в пределах обычной регуляции, значительным нарушениям метаболизма и специфическим заболеваниям (Авцын А.П. Микроэлементозы человека: этиология, классификация, органопатология / А.П. Авцын, А.А. Жаворонков, М.А. Риш, Л.С. Строчкова. - М.: Медицина, 1991. - 496 с.).
Все больше данных свидетельствуют о том, что макро- и микроэлементы имеют большое значение в метаболизме сперматозоидов, их функции, выживании и окислительном стрессе (Pipan M.Z. The influence of macro- and microelements in seminal plasma on diluted boar sperm quality / M.Z.Pipan, J.Mrkun, B.J.Strajn, J.Kos, 
// Acta Vet. Scand. - 2017. - Vol.59, №11. doi: 10.1186/sl3028-017-0279-y).
Важным показателем качества спермы является выживаемость сперматозоидов, показывающая продолжительность их жизни. Зачастую от этого зависит эффективность случки животного.
Известно исследование (Багиров, В.А. Репродуктивная функция жеребцов чистокровной арабской породы в зависимости от элементного статуса, оцененного по составу волоса из гривы / В.А. Багиров, В.В. Калашников, А.М. Зайцев, М.М. Атрощенко, С.А. Мирошников, О.А. Завьялов, А.Н. Фролов // С.-х. биология. - 2017. - Т. 52, №6. - С. 1184-1193), в котором приводится сравнение репродуктивных качеств жеребцов арабской чистокровной породы лошадей в зависимости от уровня концентраций химических элементов в волосах с гривы.
Основным отличием данного исследования от заявляемого способа является то, что в нем приводятся результаты оценки репродуктивных качеств жеребцов в связи с различным уровнем средних концентраций химических элементов в волосах с гривы, но нет сравнительной оценки этих качеств. При этом в нем не приводятся границы интервалов либо какие-то формулы, позволяющие оценить выживаемость сперматозоидов свежей и оттаянной (после криоконсервации) спермы для сопоставления полученных при использовании способа результатов, что в принципе делает невозможным оценить репродуктивные качества жеребцов по концентрации элементов в волосах.
Ближайшим аналогом (прототипом) заявляемого способа является способ оценки воспроизводительных качеств жеребцов по элементному составу волос с гривы, при этом критерием для оценки воспроизводительных качеств жеребцов является уровень концентрации стронция (Sr) в волосах с гривы (Патент RU №2703383 Российской Федерации, МПК А01К 67/00 (2006.01) Способ оценки воспроизводительных качеств жеребцов по элементному составу волос с гривы: №2018143678: заявл. 10.12.2018: опубл. 16.10.2019 / Калашников В.В., Зайцев A.M., Атрощенко М.М., Мирошников С.А., Фролов А.Н., Завьялов О.А., Рогачев Б.Г., Калинкова Л.В., Калашникова Т.В., Блохина Н.В., Курилкина М.Я.; заявитель ФГБНУ «ВНИИ коневодства». - 4 с. - Текст: непосредственный.).
Недостатком способа является то, что он не учитывает уровень эссенциальных элементов, имеющих важное значение в репродуктивных качествах человека и животных, таких как Zn, влияние которого доказано исследованиями широкого ряда ученых (Fallah A. Zinc is an Essential Element for Male Fertility: A Review of Zn Roles in Men's Health, Germination, Sperm Quality, and Fertilization / A.Fallah, A.Mohammad-Hasani, A.H.Colagar // J. Reprod. Infertil.- 2018. - Vol.19, №2. - P. 69-81. Kerns K. Zinc: A Necessary Ion for Mammalian Sperm Fertilization Competency / K.Kerns, M.Zigo, P.Sutovsky // Int. J. Mol. Sci. - 2018. - Vol.19, 12. - P. E4097.). К тому же он не позволяет оценить репродуктивные качества жеребцов арабской чистокровной породы по выживаемости сперматозоидов в свежей сперме, что говорит о неприменимости его при использовании свежей спермы при осеменении кобыл.
Для оценки выживаемости сперматозоидов до и после криоконсервации по элементному составу волос мы предлагаем использовать коэффициент взаимодействия элементов.
Следовательно, заявленный нами способ соответствует условию патентоспособности изобретения «новизна». Изобретение является применимым, так как оно может быть использовано в коневодстве для отбора жеребцов арабской чистокровной породы с высокой выживаемостью сперматозоидов в свежей и оттаянной (после криоконсервации) спермы по коэффициенту взаимодействия элементов.
Предлагаемый нами способ отбора жеребцов арабской чистокровной породы с высокой выживаемостью сперматозоидов в свежей и оттаянной (после криоконсервации) сперме по элементному составу волос позволяет оценить это качество, не прибегая к отбору самой спермы, с последующим изучением их выживаемости. Другими словами, не имея продукта (в данном случае спермы), мы сможем оценить их выживаемость.
РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Экспериментальная часть работы выполнялась в условиях Терского племенного конного завода №169 Ставропольского края. Способ реализуется в два этапа. На первом этапе исследований, используя ранее разработанную методику (Мирошников, С.А. Разработка способа отбора проб волос лошадей для исследования на элементный состав / С.А. Мирошников, О.А. Завьялов, А.Н. Фролов, М.Я. Курилкина, В.В. Калашников, А.М. Зайцев, М.М. Атрощенко, Ф.Х. Сиразетдинов // Животноводство и кормопроизводство. - 2018. - Т. 101, №4. - С. 95-101.), были отобраны образцы волос с гривы жеребцов арабской чистокровной породы (n=21).
Был изучен элементный состав волос по 7 токсичным элементам (Al, As, Cd, Pb, Sn, Hg, Sr) и 8 эссенциальным микроэлементам (Zn, Fe, Cu, Mn, I, Se, Cr, Co) методом атомно-эмиссионной и масс-спектрометрии (АЭС-ИСП и МС-ИСП). На основании этих данных, были рассчитаны коэффициенты ранговой корреляции Спирмена для всех жеребцов. В результате было установлено наличие достоверных корреляционных связей между выживаемостью сперматозоидов в свежей и оттаянной (после криоконсервации) сперме и эссенциальным микроэлементом: Zn (r равна 0,46 и r равна 0,42) и токсичным: Hg (r равна -0,37 и r равна -0,36) (Табл. 1). 
Учитывая вышеизложенное, нами была предложена формула для расчета показателя выживаемости сперматозоидов (ПВС):
ПВС - показатель выживаемости сперматозоидов, %
Zn - количество цинка в волосе с гривы, ммоль/кг
Hg - количество ртути в волосе с гривы, ммоль/кг
1000 - корректирующий коэффициент.
Рассчитанный коэффициент ранговой корреляции Спирмена, показал достоверную положительную корреляционную связь между ПВС и выживаемостью сперматозоидов в свежей r равна 0,49 и оттаянной (после криоконсервации) сперме r равна 0,68.
При распределении животных по группам, в зависимости от показателя выживаемости сперматозоидов, был применен центильный метод, определены границы 25 и 75 процентиля, эффективность использования которых подтверждается исследованиями (Скальная, М.Г. О пределах физиологического (нормального) содержания Са, Mg, Р, Zn и Cu в волосах человека / М.Г. Скальная, В.А. Демидов, А.В. Скальный // Микроэлементы в медицине. - 2003. - Т. 4, №2. - Р. 5-10.).
На основании этих расчетов мы предположили, что при значении показателя выживаемости сперматозоидов ниже 115,0%, жеребцов следует относить к группе животных с низкой выживаемостью сперматозоидов в свежей и размороженной сперме, при значении ПВС - 115,1 - 260,7%, жеребцов следует относить к группе со средней и при значении выше 260,8%, жеребцов следует относить к группе животных с высокой выживаемостью сперматозоидов в сперме.
На втором этапе были изучены репродуктивные качества жеребцов указанной породы по показателям качества спермы (n=36).
Сперму, предназначенную для исследований, получали у жеребцов арабской чистокровной породы на кобылу той же породы в охоте с помощью искусственной вагины образца ФГБНУ «ВНИИ коневодства», с интервалом 48 часов. От каждого жеребца получили не менее 5-и эякулятов. После периода полового покоя у жеребцов, показатели спермы первых двух эякулятов в обработке не использовали.
После получения спермы, каждый эякулят первоначально оценивали по следующим показателям: объем, концентрация, прогрессивная подвижность сперматозоидов в свежей сперме, выживаемость сперматозоидов в свежей сперме. Для разбавления спермы использовали лактозо-хелато-цитратно-желточную (ЛХЦЖ) среду в объемном соотношении 1:3 (Инструкция по искусственному осеменению и трансплантации эмбрионов лошадей [Текст]. - Дивово, 2012. - 72 с.).
Замораживание спермы проводили в парах жидкого азота по технологии, разработанной ФГБНУ «ВНИИ коневодства». Хранили замороженную сперму в жидком азоте при температуре - 196°С. Оттаивание криоконсервированной спермы проводили в водяной бане при температуре 40°С в течение 60 секунд. После оттаивания криоконсервированной спермы также определяли прогрессивную подвижность сперматозоидов, выживаемость сперматозоидов при температуре (Т) 2-4°С.
Показатели репродуктивной функции жеребцов в зависимости от рассчитанного нами показателя выживаемости сперматозоидов представлены в таблице 2. 
Установлено, что у жеребцов I группы достоверно снижена выживаемость сперматозоидов в свежей и после оттаивания (криоконсервации) при Т 2-4°С сперме по сравнению со II и III группами на 37,3 (Р не больше 0,01) и 32,4% (Р не больше 0,01); 60,3 (Р не больше 0,01) и 65,3% (Р не больше 0,001) соответственно. Достоверных различий между II и III группами не обнаружено и их следует объединить.
Для того чтобы предложенный способ был верным и достоверным, была произведена коррекция нашего предположения. Оказалось, что при значении ПВС ниже 115,0%, жеребцов следует относить к группе животных с низкой выживаемостью сперматозоидов в свежей и размороженной спермы, при значении ПВС выше 115,1%, жеребцов следует относить к группе с высокой выживаемостью сперматозоидов в сперме.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ осуществляется следующим образом:
1. Производится отбор образцов волос по массе не менее 0,24 г с участка гривы жеребца арабской чистокровной породы в области проекции первого шейного позвонка.
2. Волос корректируется по длине. Для исследований отбирается проксимальный участок волоса равный 3,3 см.
3. Полученные образцы оцениваются по содержанию Zn и Hg методом АЭС-ИСП и МС-ИСП. Кроме того определяют выживаемость сперматозоидов в свежей и оттаянной (после криоконсервации) при Т 2-4°С сперме в этих же образцах. 
Таким образом, при практическом использовании предлагаемого способа, для установления уровня выживаемости сперматозоидов в свежей и размороженной сперме, достаточно определить показатель выживаемости сперматозоидов на основании концентрации двух элементов Zn и Hg в волосе с гривы жеребцов.
Способ отбора жеребцов арабской чистокровной породы с высокой выживаемостью сперматозоидов до и после криоконсервации по элементному составу волос, включающий настриг требуемого образца волос по массе не менее 0,24 г с участка гривы в области проекции первого шейного позвонка, отбор проксимального участка волоса равного по длине 3,3 см, отличающийся тем, что в качестве критерия для оценки выживаемости сперматозоидов в свежей и после оттаивания (криоконсервации) при Т 2-4°С сперме используется показатель выживаемости сперматозоидов, который рассчитывается по формуле:
ПВС - показатель выживаемости сперматозоидов, %
Zn - количество цинка в волосе с гривы, ммоль/кг
Hg - количество ртути в волосе с гривы, ммоль/кг
1000 - корректирующий коэффициент
при этом, при значении показателя выживаемости сперматозоидов ниже 115,0%, жеребцов относят к группе животных с низкой выживаемостью сперматозоидов в свежей и размороженной сперме, при значении показателя выживаемости сперматозоидов выше 115,1%, жеребцов относят к группе с высокой выживаемостью сперматозоидов в сперме.
