Химерный антигенный рецептор и т-клетки, в которых экспрессируется химерный антигенный рецептор

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой химерный антигенный рецептор для лечения рака, экспрессирующего IL13Rα2, содержащий антигенсвязывающий домен; шарнирную область; трансмембранный домен; костимулирующий домен и цитоплазматический домен сигнализации, причем антигенсвязывающий домен связывается с IL13Rα2 и причем в антигенсвязывающем домене 11-е, 64-е, 67-е и 107-е положения аминокислотной последовательности, обозначенной как SEQ ID NO: 1, замещены лизином(K), аспарагиновой кислотой(D), аспарагиновой кислотой(D) и лизином(K) соответственно. Изобретение касается также CAR-T-клетки, экспрессирующей указанный химерный антигенный рецептор. Изобретение позволяет лечить рак с высокой степенью эффективности. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 16 ил., 5 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к химерному антигенному рецептору, распознающему поверхностный антиген раковой клетки, и T-клетке, в которой рецептор экспрессируется. Конкретно, настоящее изобретение относится к химерному антигенному рецептору с превосходным показателем экспрессии и T-клетке, в которой рецептор экспрессируется. Более конкретно, настоящее изобретение относится к химерному антигенному рецептору и T-клетке, в которой экспрессируется рецептор, указанный химерный антигенный рецептор, содержащий домен связывания поверхностного антигена раковой клетки; шарнирную область; трансмембранный домен; костимулирующий домен; и цитоплазматический домен сигнализации, отличается тем, что костимулирующий домен состоит из мутированного CD28 или TNFRSF9. Дополнительно, настоящее изобретение относится к химерному антигенному рецептору и T-клетке, в которой рецептор экспрессируется, рецептору, отличающемуся тем, что антигенсвязывающий домен связыватся с антигеном, выбранным из группы, состоящей из IL13Rα2, антигена, ассоциированного с ангиогенной активностью, EGFRvIII, EphA2, αVβ3 и глипикана 1.

Кроме того, настоящее изобретение относится к химерному антигенному рецептору и T-клетке, в которой рецептор экспрессируется, рецептору, отличающемуся тем, что три глицина дополнительно вводят между антигенсвязывающим доменом и шарнирной областью.

Дополнительно, настоящее изобретение относится к химерному антигенному рецептору и T-клетке, в которой рецептор экспрессируется, рецептору, отличающемуся тем, что в цитоплазматическом домене сигнализации используется сигнальный домен CD3ζ нормального индивидуума, где содержится избыточный Глутамин, но не CD3ζ сигнальный домен Т-клеток Юркат.

Кроме того, настоящее изобретение относится к химерному антигенному рецептору и T-клетке, в которой рецептор экспрессируется, причем химерный антигенный рецептор содержит любой один из предварительно определенного антигенсвязывающего домена, костимулирующего домена и цитоплазматического домена сигнализации, описанных выше, или все из них.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

T-клетки (далее в настоящем описании, их иногда именуют как ʺCAR-T-клеткиʺ), экспрессирующие химерные антигенные рецепторы (далее в настоящем описании их иногда называют ʺCARʺ) представляют собой рекомбинантные T-клетки, в которых ген, кодирующий рецептор, распознающий поверхностный антиген раковой клетки, специфически экспрессируемый на поверхности раковой клетки, вводят в T-клетку для уничтожения раковой клетки. Доктор Zelig Fshhar из Института Науки имени Вейцмана в Израиле, который является химиком и иммунологом, достиг с сотрудниками успешных результатов при получении T-клеток, обеспеченных химерными антигенными рецепторами, разработав теорию о том, что, когда T-клетки с рецептором, специфически связывающимся с антигеном, экспрессируемым в раковой клетке, получают искусственно, происходит иммунный ответ, нацеленный только на раковую клетку, таким образом, чтобы уничтожить раковую клетку, и затем они сообщили об этом факте в PNAS в 1989 г.

Однако в CAR-T-клетках, продуцируемых на ранней стадии, т.е. 1-ом поколении CAR-T-клеток, в качестве домена сигнализации применяли только CD3ζ, но их терапевтический эффект был незначительным, и также, недостаток состоял в том, что его продолжительность была короткой. Таким образом, были приложены усилия, чтобы улучшить реакционную способность CAR-T-клеток, и, в результате, было получено 2-ое поколение CAR-T-клеток, в которых комбинируют костимулирующий домен (CD28 или CD137/4-1BB) и CD3ζ, где число CAR-T-клеток, присутствующих в организме, значительно увеличивалось в сравнении с числом 1-го поколения CAR-T-клеток. В то же время, во 2-ом поколении CAR-T-клеток используют один тип костимулирующего домена, а CAR-T-клетки, в которых используются два типа костимулирующего домена, относятся к 3-ему поколению CAR-T-клеток. Большинство недавних исследований были сосредоточены на 2-ом поколении и 3-ем поколении CAR-T-клеток. В то же время, относительно способов лечения злокачественных новообразований с использованием CAR-T-клеток сообщалось, что когда цитотоксические T-клетки, трансформированные для распознавания CD19, вводили инъекционно трем пациентам с терминальной стадией хронического лимфоидного лейкоза (CCL), лейкоз полностью излечивался у двух пациентов, и это состояние продолжалось в течение приблизительно 10 месяцев (N. Engl J Med 2011; 365:725-733 August 25, 2011, Sic. Transl. Med 2011 Aug 10; 3(95):95ra73). CAR-T-клетки, применяемые в настоящем изобретении, соответствуют 2-ому поколению, и в них применяют 4-1BB в качестве костимулирующего домена и CD3ζ в качестве домена сигнализации. Антигенсвязывающий домен CAR-T-клеток распознает CD19, который обнаруживается на поверхности лейкозных раковых клеток в качестве антигена.

В дополнение, сообщалось, что, когда пациентов с острым лейкозом лечили посредством введения CTL019, 27 из 30 пациентов испытывали полную ремиссию, 67% всех пациентов испытывали полную ремиссию в течение 2 лет, и 78% пациентов выживали в течение 2 лет. Принимая во внимание, что рассматриваемые пациенты являлись рецидивирующими или рефрактерными пациентами, этот результат был очень удивительным (N Engl j Med 2014; 371:1507-1517, October 16, 2014).

В настоящее время, для проверки терапевтических способов с использованием различных CAR-T-клеток, были проведены клинические тесты на различных гемобластозах, таких как лимфома, миелома и т.д., и ожидается, что CAR-T-клетки станут доступными в качестве доступного медицинского препарата на рынке. Так как лечение злокачественного новообразования с использованием CAR-T-клеток является аутогенным способом, этот продукт не может быть серийно производимым; однако, это лечение является специфичным по отношению к пациенту, так что его терапевтический эффект является несравнимо более высоким, чем у существующих противораковых лекарственных средств.

[Патентная литература]

Выложенная заявка на патент Республики Корея № 10-2013-0124521

[Непатентная литература]

Immunol Rev, 2014, 257(1):107-126

N Engl J Med 2014; 371: 1507-1517, October 16, 2014

Science Translational Medicine 18 Feb 20115: Vol. 7, Issue 275, pp. 275ra22

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задача настоящего изобретения состоит в получении CAR и CAR-T-клеток со значительно превосходящими показателями экспрессии и терапевтическими эффектами в сравнении с общеизвестными CAR-T-клетками. Более конкретно, задача настоящего изобретения состоит в получении, у 2-ого поколения и 3-его поколения CAR-T-клеток, костимулирующего домена, способного к введению в различные CAR-T-клетки, так как костимулирующий домен играет основную роль в функции. Кроме того, задача настоящего изобретения состоит в получении различных антигенсвязывающих доменов, способных к связыванию с антигеном, экспрессируемым на поверхности конкретной раковой клетки, и также способных к образованию CAR-T-клеток. В дополнение, задача настоящего изобретения состоит в разработке способа улучшения показателей экспрессии различных CAR-T-клеток и их терапевтических эффектов, с химерным антигенным рецептором, характеризуемым обладанием дополнительных аминокислотных последовательностей, которые могут дополнительно вводиться между антигенсвязывающим доменом и шарнирным доменом.

СРЕДСТВО РЕШЕНИЯ ЗАДАЧИ

В качестве средства решения вышеуказанных задач, настоящее изобретение описывает следующую техническую идею.

В заявке раскрыты химерный антигенный рецептор и CAR-T-клетка, в которой рецептор экспрессируется, химерный антигенный рецептор, содержащий антигенсвязывающий домен; шарнирную область; трансмембранный домен; костимулирующий домен; и цитоплазматический домен сигнализации, характеризуемый независимым содержанием специфичного костимулирующего домена, или специфичного антигенсвязывающего домена, и специфичной аминокислотной последовательности, добавленной между антигенсвязывающим доменом и шарнирным доменом, или отличающийся тем, что в цитоплазматическом домене сигнализации используется домен сигнализации CD3ζ нормального пациента, в котором содержится избыточный глутамин, а не домен сигнализации CD3ζ Т-клетое Юркат, или содержащий их комбинацию.

ЭФФЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ

CAR-T-клетка, содержащая антигенсвязывающий домен; или костимулирующий домен; или домен сигнализации, описанный в настоящем изобретении, обладает тем эффектом, что терапевтическая эффективность и показатель экспрессии являются значительно превосходящими.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Приведенные в настоящем описании варианты осуществления иллюстрируют на чертежах с целью иллюстративного представления настоящего изобретения. Однако, следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается точными расположениями и способами вариантов осуществления, иллюстрируемых на чертежах.

Фиг. 1 иллюстрирует ретровирусный вектор и трансген, представляющие основные функциональные элементы одного варианта осуществления CAR-T-клетки, описанной в настоящем изобретении. Конкретно, эта Фиг. иллюстрирует ретровирусный вектор для клинического применения, показывающий экспрессии мутированного IL13(E11K.R64D.S67D.R107K), шарнира человеческого CD8α и трансмембранного домена человеческого CD8/человеческого CD3, чтобы придать более высокую антигенную аффинность, чем в случае двух аминокислотных заместителей (Glu-11, Arg-107) IL13, и мутантного человеческого CD28(RLLH→RGGH), человеческого TNFRSF9, и домена сигнализации CD3 дзета здорового пациента, чтобы увеличить показатель экспрессии CAR. Эта Фиг. не иллюстрируется при постоянном накоплении.

Фиг. 2 показывает, что показатель экспрессии увеличивается после добавления трех глицинов между антигенсвязывающим доменом и шарнирной областью, чтобы увеличить растворимость белка CAR таким образом, чтобы увеличить экспрессию химерного антигенного рецептора.

Фиг. 3 показывает, что показатель экспрессии увеличивается при использовании мутанта (RLLH→RGGH) человеческого CD28, чтобы увеличить экспрессию химерного антигенного рецептора белка CAR.

Фиг. 4 показывает результат анализа трансформированных T-клеток с использованием анализа методом проточной цитометрии, чтобы подтвердить чистоту CAR-T-клеток и показатель экспрессии CAR, полученного посредством способа получения, установленного для клинического теста. Эта Фиг. показывает показатель экспрессии CAR и чистоту T-клеток.

Фиг. 5 показывает сравнение цитотоксичности T-клеток, в которые вводят IL13 (Glu-11, Arg-107), в котором два положения заменяют, и IL13 (IL13.E11K.R64D.S67D.R107K), в котором заменяют четыре положения.

Фиг. 6 показывает зависимое от скорости подавления увеличение противоопухолевой активности CAR в линии клеток U251 рака головного мозга человека для CAR-T-клеток, состоящих из IL13 (E11K.R64D.S67D.R107K).TNFRSF9.CD3ζ, в котором заменяют четыре положения.

Фиг. 7 показывает получение цитокина IFN-γ после культивирования линии клеток U251 рака головного мозга человека (сверхэкспрессия IL13Rα2), которые являются клетками-мишенями, с использованием CAR-T-клеток, состоящих из IL13 (E11K.R64D.S67D.R107K).TNFRSF9.CD3ζ, в котором заменены четыре положения или HUVEC (отсутствие экспрессии IL13Rα2), которые являются контролем из нормальных клеток, при отношении, равном 0,5: 1 в течение 19 часов.

Фиг. 8 показывает дозозависимое (CAR+число T-клеток) увеличение секреции цитокина IFN-γ после культивирования линии клеток U251 рака головного мозга человека, которые являются клетками-мишенями, при использовании CAR-T-клеток, содержащих (IL13.E11K.R64D.S67D.R107K).TNFRSF9.CD3ζ, в котором заменены четыре положения.

Фиг. 9A является изображением, упрощенно показывающим эффективность экспериментального способа на ʺголыхʺ мышах in vivo с использованием CAR-T-клеток, содержащих IL13 (E11K.R64D.S67D.R107K)TNFRSF9.CD3ζ, в котором заменены четыре положения; а Фиг. 9B показывает результат измерения размера опухоли животного через 12 дней после лечения с использованием CAR-T-клеток или PBS.

Фиг. 9C показывает форму, размер и массу раковой ткани, удаленной из ʺголыхʺ мышей через 15 дней после лечения с использованием CAR-T-клеток или PBS.

Фиг. 10A является изображением удаленных раковых тканей окрашенных с использованием антител против человеческого CD3, чтобы окрасить человеческие CAR-T-клетки или T-клетки, из ʺголыхʺ мышей через 15 дней после лечения с использованием TMZ+PBS (PBS вводили один раз внутривенно, и TMZ и IL-2 вводили внутрибрюшинно и внутривенно один раз в день в течение четырех дней).

Фиг. 10B является изображением раковых тканей, окрашенных с использованием антител против человеческого CD3, чтобы окрасить человеческие CAR-T или T-клетки, удаленных из ʺголыхʺ мышей через 15 дней после лечения с использованием TMZ+YYB103 (TMZ и CAR-T-клетки, содержащие IL13 (E11K.R64D.S67D.R107K)TNFRSF9.CD3ζ, в котором заменяют четыре положения, вводили один раз внутривенно, а TMZ и IL-2 вводили внутрибрюшинно и внутривенно один раз в день в течение четырех дней).

Фиг. 11A является изображением раковых тканей, окрашенных с использованием H&E, удаленных из ʺголыхʺ мышей через 15 дней после лечения с использованием TMZ+PBS (PBS вводили один раз внутривенно, а TMZ и IL-2 вводили внутрибрюшинно и внутривенно один раз в день в течение четырех дней).

Фиг. 11B является изображением раковых тканей, окрашенных с использованием H&E, удаленных из ʺголыхʺ мышей через 15 дней после лечения с использованием TMZ+YYB103 (TMZ и CAR-T-клетки, содержащие IL13 (E11K.R64D.S67D.R107K)TNFRSF9.CD3ζ, в котором заменяют четыре положения, который вводили один раз внутривенно, а TMZ и IL-2 вводили внутрибрюшинно и внутривенно один раз в день в течение четырех дней).

Фиг. 12 показывает получение антиангиогенного CAR. Для успешных противораковых терапий с использованием CAR требуются не только антиген-специфичные CAR-T-клетки, но также реализация доступа CAR-T-клеток к раковым клеткам и поддержание функции CAR-T-клеток в иммуносупрессорном микроокружении опухоли. Следовательно, получали антиангиогенный CAR. Фиг. 12A иллюстрирует ретровирусный вектор и трансген, представляющий основной функциональный элемент антиангиогенного CAR; Фиг. 12B показывает результат анализа проверки трансформированных клеток на предмет экспрессии на клеточной поверхности антиангиогенного CAR с использованием анализа методом проточной цитометрии.

Фиг. 13-16 показывают 4 типа получения CAR, с целевым действием на основной опухолевый антиген различных злокачественных новообразований. A на соответствующих Фиг. иллюстрируют ретровирусный вектор и трансген, представляющий основной функциональный элемент; B на соответствующих Фиг. показывают результат анализа проверки трансформированных клеток на предмет экспрессии на клеточной поверхности антиангиогенного CAR с использованием анализа методом проточной цитометрии.

ЛУЧШИЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

CAR-T-клетка согласно настоящему изобретению представляет собой рекомбинантную T-клетку, в которую вводят ген рецептора, распознающего раковую клетку в качестве антигена, где T-клетка состоит из антигенсвязывающего домена, распознающего антиген; шарнирной области (или спейсера), соединяющей антигенсвязывающий домен и трансмембранный домен; трансмембранного домена; костимулирующего домена; и цитоплазматического домена сигнализации.

Антигенсвязывающий домен, который является участком, куда поступает основной сигнал, и который присутствует вне клеточной мембраны, распознает раковую клетку, экспрессирующую специфичный антиген. Таким образом, при лечении злокачественного новообразования с использованием CAR-T-клеток, детальный субъект лечения определяется антигенсвязывающим доменом. Настоящее изобретение описывает, например, химерный антигенный рецептор, способный специфически связываться с IL13Rα2, сверхэкспрессируемым в глиобластоме, но антигенсвязывающий домен конкретно этим не ограничивается. Глиобластома (GMB) или мультиформная глиобластома представляет собой одну из наиболее распространенных опухолей головного мозга, на долю которой приходится около 12-15% опухолей головного мозга, и представляет собой обычное злокачественное новообразование головного мозга. Поскольку этот вид рака является относительно редким в сравнении с колоректальным раком или раком легкого, исследования его способа лечения активно не проводились. Клетки глиобластомы являются сходными с астроцитами, но астроциты служат для поддержания нервных клеток и обеспечения питания для нервов и защитной реакции на повреждение тканей мозга. Полагают, что геномная аномалия стволовых клеток или незрелые астроциты вовлечены в появление и малигнизацию глиобластомы. Для лечения глиобластомы применяют хирургическое вмешательство, лучевую терапию и химиотерапию. В качестве средств для химиотерапии применяют темозоломид, ломустин и кармустин и т.д., и недавно, проводились клинические испытания таких методов, как лечение противоопухолевой вакциной и молекулярно-таргетное лечение. Однако применимые терапевтические средства для лечения глиобластомы все еще отсутствуют, и, в частности, несмотря на попытку лечения глиобластомы, сверхэкспрессирующей IL13Rα2, с использованием CAR-T-клеток, применяя мутантный IL13, где 11-ое положение заменено на E11Y, группа из Бэйлорского медицинского колледжа сообщила, что терапевтический эффект с использованием CAR-T-клеток, с применением мутантного IL13, где 11-ое положение заменено на E11Y, был слабым in vivo. Однако, CAR-T-клетка, описанная в настоящем изобретении, проявляет превосходное терапевтическое воздействие на глиобластому.

Последовательность антигенсвязывающего домена, связывающегося с IL13Rα2, является идентичной с SEQ ID NO. 1, и, в частности, мутантный IL13, где 11-ое, 64-ое, 67-ое и 107-ое положения заменены на E11K.R64D.S67D.R107K, соответственно, впервые описан в настоящем изобретении. Следует отметить, однако, что аминокислоты, замененные в соответствующих положениях, могут быть заменены на аминокислоты, имеющие сходное свойство с конкретными аминокислотами. Таким образом, аминокислоты могут быть заменены на аргинин (R) или гистидин (H), вместо лизина (K), в 11-ом положении; на глутаминовую кислоту (E), вместо аспарагиновой кислоты (D), в 64-ом и 67-ом положениях; и гистидин (H), вместо лизина (K), в 107-ом положении.

IL13 (E11K.R64D.S67D.R107K), в котором четыре положения являются мутированными, описанный в настоящем изобретении, и аналог, с аминокислотной заменой, имеющей такое же свойство в том же положении, имеет улучшенную антигенную аффинность.

Антигенсвязывающий домен настоящего изобретения может быть получен таким образом, чтобы связываться с антигеном, экспрессируемым в различных раковых клетках, а также с IL13Rα2, сверхэкспрессируемым в глиобластоме. Например, антигенсвязывающий домен (SEQ ID NO. 2), способный к связыванию с антигеном, ассоциированным с ангиогенной активностью; антигенсвязывающий домен (SEQ ID NO. 3), связывающийся с EGFRvIII, который является основным опухолевым антигеном глиобластомы и рака легкого, и т.д.; антигенсвязывающий домен (SEQ ID NO. 4), связывающийся с EphA2, который является опухолевым антигеном глиобластомы, рака молочной железы, рака простаты и т.д.; антигенсвязывающий домен (SEQ ID NO. 5), связывающийся с αVβ3, который является резистентным маркером стволовости карциномы, и ингибиторы рецептора тирозинкиназы (RTKI), такие как эрлотиниб для рака поджелудочной железы, рака легкого и рака молочной железы; антигенсвязывающий домен (SEQ ID NO. 6), связывающийся с глипиканом 1, сверхэкспрессируемым при раке поджелудочной железы, глиобластоме, раке молочной железы и т.д., описаны в настоящем изобретении. Фиг. 12-16 показывают пять типов получения CAR, включающие указанные выше антигенсвязывающие домены. Соответствующие Фиг. иллюстрируют ретровирусный вектор и трансген, представляющий основной функциональный элемент, и показывают результат анализа проверки трансформированных клеток на предмет экспрессии антиангиогенного CAR с использованием анализа методом проточной цитометрии.

Дополнительная характеристика настоящего изобретения заключается в дополнительном введении трех глицинов между антигенсвязывающим доменом и шарнирной областью, чтобы увеличить растворимость белка CAR для увеличения экспрессии химерного антигенного рецептора. В соответствии с исследованием авторов настоящего изобретения, различие в растворимости между рецептором, в который вводят три глицина между антигенсвязывающим доменом и шарнирной областью, и рецептором в котором не вводят три глицина, составляет около 10 раз, и это различие приводит к большой разнице в показателе экспрессии по отношению к получению CAR-T-клеток, и различие по показателю экспрессии в конечном счете непосредственно связано с терапевтическим эффектом. По этой причине, можно считать этот результат очень передовой технической разработкой. В дополнение, указанные три глицина (G) могут быть заменены на аланин(A), валин(V), лейцин(L) или изолейцин(I), которые являются аминокислотами, имеющими сходное свойство.

Еще одна другая характеристика настоящего изобретения заключается в применении специфичного костимулирующего домена. В CAR-T-клетках, когда антигенсвязывающий домен и антиген связываются друг с другом, сигнал активирует иммунный ответ T-клеток через цитоплазматический домен сигнализации (CD3ζ). Костимулирующий домен, который является участком, куда поступает костимулирующий сигнал, играет роль при передаче сигнала таким образом, что CAR-T-клетка, распознающая специфичный антиген, связывающийся с антигенсвязывающим доменом, вызывает иммунный ответ, чтобы способствовать более длительной пролиферации и устойчивости в организме. В то же время, такой костимулирующий домен является компонентом, который не присутствовал в первом поколении CAR-T-клеток, и 2-ое поколение CAR-T-клеток использует один костимулирующий домен, а 3-е поколение CAR-T-клеток использует два костимулирующих домена. CAR-T-клетка улучшает пролиферацию и устойчивость в организме в течение более длительного времени. В костимулирующем домене внутри клеток на протяжении поколений, таких как 1-ое поколение, 2-ое поколение, 3-е поколение, и т.д., и, таким образом, клетки развиваются в рекомбинации с генами, таким образом, что CAR-T-клетки против раковых клеток получают в организме даже после инъекции небольшого числа клеток, и клетки могут существовать в организме в течение долгого времени даже после инъекции. Это означает, что, в случае первого поколения, существовало ограничение передачи сигнала, так как оно содержит только CD3ζ без костимулирующего домена, но во 2-ом и 3-ем поколениях, дополнительно вводятся 4-1BB или OX40, и т.д., чтобы таким образом улучшить пролиферацию и устойчивость в организме в течение более длительного времени.

В дополнение, авторы настоящего изобретения применяли костимулирующий домен, который генерирует мутант в предварительно заданном положении CD28, таким образом, что посредством улучшения показателя экспрессии CAR-T-клеток, терапевтический эффект может проявляться, даже если применяют меньше CAR-T-клеток, и, кроме того, авторы изобретения обнаружили, что посредством использования двух костимулирующих доменов, в которых мутированные CD28 и TNFRSF9 объединяются, улучшаются ʺпролиферация и устойчивость в организмеʺ, приводя к увеличенной терапевтической эффективности.

Соответственно, дополнительная техническая характеристика настоящего изобретения заключается в химерном антигенном рецепторе и CAR-T-клетке, в которой рецептор экспрессируется, причем химерный антигенный рецептор состоит из антигенсвязывающего домена; трансмембранного домена; костимулирующего домена и цитоплазматического домена сигнализации, где костимулирующий домен содержит CD28 или TNFRSF9, или CD28 и TNFRSF9. В этом случае, CD28 может содержать мутант (Последовательности №№ 6-9 с заменой RLLH на RGGH) для увеличения экспрессии химерного антигенного рецептора. Аминокислотные последовательности CD28 и TNFRSF9 дикого типа, которые могут содержаться в качестве костимулирующего домена настоящего изобретения, обозначают как Последовательности №№. 7 и 8. В дополнение, в мутированном CD28 (Последовательности №№ 6-9 имеют замену RLLH на RGGH), аминокислотной заменой является глицин(G), но он может быть заменен на аминокислоту, сходную с ним, например аланин(A), валин(V), лейцин(L) или изолейцин(I). Шарнирная область настоящего изобретения является частью, соединяющей антигенсвязывающий домен и трансмембранный домен, и ее также называют спейсером. Цель шарнирной области состоит в расширении антигенсвязывающего домена из мембраны T-клетки. В качестве шарнирной области настоящего изобретения, может применяться шарнирная область, обычно используемая в рассматриваемой области техники, и, например, шарнирная область может быть получена из шарнирной области CD8 (SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10). Как было указано выше, одна другая техническая характеристика настоящего изобретения заключается в трех глицинах, дополнительно вводимых между антигенсвязывающим доменом и шарнирной областью.

Трансмембранный домен настоящего изобретения играет роль в качестве анкера молекулы CAR и в то же время роль при передаче сигнала, полученного от антигенсвязывающего домена, к костимулирующему домену и цитоплазматическому домену сигнализации. Трансмембранный домен не ограничивается трансмембранным доменом настоящего изобретения, и могут применяться типичные трансмембранные домены, применяемые для получения CAR, и, например, может применяться человеческий трансмембранный домен CD8/CD3 (SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12).

В качестве цитоплазматического домена сигнализации настоящего изобретения, применяют домен сигнализации CD3ζ нормального пациента, в котором содержится избыточный глутамин, а не домен сигнализации CD3ζ Т-клеток Юркат, а избыточный глутамин означает глутамин(Q) в 50-ом положении в SEQ ID NO. 13.

Техническая идея настоящего изобретения включает как применение вышеуказанных технических характеристик по отдельности, так и применение их комбинации. А именно, осуществление технических характеристик настоящего изобретения включает все CAR-T-клетки, содержащие предварительно заданный антигенсвязывающий участок, описанный в настоящем изобретении; CAR-T-клетки, в которых три глицина дополнительно вводят между антигенсвязывающим доменом и шарнирной областью; и CAR-T-клетки, содержащие костимулирующий домен, описанный в настоящем изобретении.

Последовательности нуклеиновой кислоты полипептида, составляющего домены, описанные в настоящем описании, могут быть получены с использованием рекомбинантных методов, известных в рассматриваемой области техники, и например, могут быть получены посредством скрининга библиотеки из клеток, экспрессирующих ген, с использованием стандартной технологии или индуцирования гена из известного вектора, содержащего такой же ген, или непосредственного выделения из клеток или тканей, содержащих такой же ген. Альтернативно, интересующий ген может быть генерирован синтезом, а не клонированием.

Способ введения и экспрессии гена в клетках является известным в рассматриваемой области техники. Вектор экспрессии может быстро вводиться в клетки-хозяева любым способом, известным в рассматриваемой области техники. Например, в настоящем изобретении, CAR-T-клетки могут быть получены посредством соединения окончательно продуцируемого фрагмента гена CAR с вектором экспрессии ретровируса MFG, расщепляемого с использованием XhoI/NotI. Следует понимать, что настоящее изобретение включает любые разнообразные мутанты для каждого из компонентов структуры.

Злокачественные новообразования, подлежащие лечению, могут включать несолидные опухоли (например, гематологические опухоли, например, лейкемию и лимфому), а также глиобластому, или могут включать солидные опухоли.

В этой связи, требуется несколько стадий для получения рекомбинантных CAR-T-клеток и инъекции клеток пациентам со злокачественным новообразованием. T-клетки выделяют из крови пациентов, и затем ДНК, сконструированную с CAR, вводят в T-клетки, используя вектор экспрессии, и CAR-T-клетки пролиферируют, и затем их инъекционно вводят назад пациенту.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее в настоящем описании, настоящее изобретение будет раскрыто посредством примеров. Следует отметить, однако, что следующие примеры не предназначены для ограничения технического объема настоящего изобретения в любом смысле.

Пример 1: Построение вектора экспрессии, имеющего 2-ое поколение (YYB-103, IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3ζ) и 3-е поколение (YYB-103A, IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3ζ) химерных антигенных рецепторов, специфически связывающихся с IL13Rα2, сверхэкспрессируемым в раковых клетках.

Автор настоящего изобретения получил мутантный IL13 (E11K.R64D.S67D.R107K), чтобы придать более высокую аффинность к антигену, чем в случае двух аминокислотных замен (Glu-11, Arg-107) IL13, и получил химерные антигенные рецепторы, содержащие один костимулирующий домен (TNFRSF9) и два костимулирующих домена (CD28, TNFRSF9) цитоплазматического домена сигнализации CAR-T-клеток (Фиг. 1). В настоящем изобретении, три глицина были добавлены между антигенсвязывающим доменом и шарнирной областью, чтобы увеличить растворимость белка CAR для увеличения экспрессии химерного антигенного рецептора (Фиг. 2). Цитоплазматический домен сигнализации CD28, применяемый в настоящем изобретении, содержит мутантные (RLLH→RGGH) последовательности ДНК человеческого CD28 для увеличения растворимости белка CAR, чтобы увеличить экспрессию химерного антигенного рецептора (Фиг. 3). Применяли человеческий домен сигнализации CD3ζ здорового пациента с нормой, а не домен сигнализации CD3ζ Т-клеток Юркат. Человеческий IL13(P35225.1), человеческий CD3(P20963-1), человеческий CD8α(P01732), человеческий CD28(P10747), человеческий TNFRSF9(Q07011), и сигнальную последовательность человеческой каппа легкой цепи (HuVHCAMP) оптимизировали, используя научные литературные источники и общедоступную базу данных, и получали 2-е и 3-е поколение химерных антигенных рецепторов, (YYB-103, IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3ζ и YYB-103A, IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.28.TNFRSF9.CD3ζ), содержащие кодон-оптимизированную синтетическую ДНК (Фиг. 1). Законченная конструкция содержит консенсусную связывающую рибосомы последовательность Козака, сигнальную последовательность человеческой каппа легкой цепи (HuVHCAMP), последовательность зрелого белка человеческого IL13.E11K.R64D.S67D.R107K (человеческого IL13(E11K.R64D.S67D.R107K)), добавление трех глицинов (GGG) между антигенсвязывающим доменом и шарнирной областью, чтобы увеличить растворимость белка CAR для увеличения экспрессии химерного антигенного рецептора (Фиг. 2), шарнирную область человеческого CD8α, человеческий трансмембранный домен CD8/CD3, костимулирующий домен цитозольного CD28, трансформированный в мутантный (RLLH→RGGH), костимулирующий домен цитозольного TNFRSF9, цитоплазматический домен сигнализации CD3ζ здорового пациента и часть расщепления Xhol/NotI. Полные последовательности YYB-103 и YYB-103A представлены в Последовательностях №№ 14 и 15. Окончательно полученный фрагмент гена CAR соединяли с вектором экспрессии ретровируса MFG, расщепленного с использованием XhoI/NotI (Emtage PC, и т.д., Clin Cancer Res, 2008 14L8112-8122) (Фиг. 1). В настоящем примере, чтобы сравнить активность химерных антигенных рецепторов, дополнительно получали две аминокислотных замены (Glu-11, Arg-107), 3-его поколения химерных антигенных рецепторов (YYB-103B, IL13(E11K.R107K).28.TNFRSF9.CD3ζ) IL13 (SEQ ID NO. 16).

Пример 2: Получение T-клеток, трансформированных во 2-ое поколение (YYB-103, IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3ζ) и 3-е поколение (YYB-103A, IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.28.TNFRSF9.CD3ζ) химерных антигенных рецепторов, специфически связывающихся с IL13Rα2, сверхэкспрессируемым в раковых клетках.

Клон PG13 с высоким титром, экспрессирующий CAR, получали посредством временного инфицирования клеток феникс-эмпо и феникс-эко с использованием вектора экспрессии ретровируса YYB-103 или YYB-103A, полученного в Примере 1, и последовательно трансдуцированных клеток PG13 с использованием бесклеточного ресурса векторов из инфицированных клеток феникс-эмпо и феникс-эко. Одиночный клон с высоким титром получали на проточном цитометре после окрашивания клеток PG13/YYB-103 с использованием моноклональных антител против IL-13 (BD Pharmingene). Одиночный клон PG13/YYB-103 с высоким титром получали посредством второго субклонирования в соответствии с анализом с предельным разбавлением. Субклон PG13/YYB-103-13 показал стабильно высокую экспрессию CAR, и был выбран для трансдукции моноядерных клеток периферической крови (PBMC) человека. Эффективность трансдукции PBMC/YYB-103-13 проверяли, используя моноклональные антитела против IL-13 (BD Pharmingen), применяя анализ методом проточной цитометрии. Супернатант клеток PG13/YYB-103-13 содержал ретровирус, и его собирали для генетической модификации PBMC. PBMC отделяли, применяя центрифугирование, помещая цельную кровь, полученную от здорового человеческого донора в Ficoll Paque (GE Healthcare). Отделенные PBMC культивировали посредством добавления 100 нг/мл моноклональных антител против CD3 (eBioscience) при условии 100 МЕ/мл человеческого IL-2 (NOVARTIS) для активации фракции T-клеток (BL Levine, Cancer Gene Therapy, 2015, 22:79-84). Через 2-3 дня активации, большинство клеток представляли собой T-клетки и содержали естественные клетки-киллеры при отношении 0-2%. Через 2-3 дня стадии активации, T-клетки подвергали трансдукции два раза в течение 2 дней, используя ретровирусный супернатант и промывали, а затем клетки пролиферировали в течение 4-7 дней в колбе. Клетки культивировали в устройстве с перемешиваемой платформой (система биореактора WAVE) в течение 12-14 дней. IL-2 поддерживали в количестве 100 МЕ/мл. CAR-T-клетки модифицированные таким образом, применяли для аналитического эксперимента (Фиг. 4).

Экспериментальный пример 1: Проверка показателя экспрессии CAR на поверхности T-клеток, трансформированных до химерного антигенного рецептора

Метод эксперимента (проточный цитометрический анализ)

Для проточной цитометрии (>30000 событий), применяли оборудование BD LSRII (Becton Dickinson) и программное обеспечение BD FACSDiva (Becton Dickinson). Конкретно, перед добавлением PE-конъюгированных моноклональных антител против человеческого IL-13 (BD Pharmingen), клетки однократно промывали PBS, содержащим 2% альбумина бычьей сыворотки. После промывки, клетки взаимодействовали с соответствующими антителами в течение 30 минут при 4°C в состоянии, где доступ света блокировали, и затем однократно промывали, а затем проверяли показатель экспрессии CAR на поверхности трансдуцированных T-клеток. В дополнение, чтобы подтвердить экспрессию IL13Rα2 и IL13Rα1 на клеточной поверхности, применяли антитела против человеческого IL13Rα (R&D systems), вторичные ослиные антитела против козьего IgG, меченные фикоэритрином (R&D systems), и антитела против человеческого IL13Rα, меченные фикоэритрином (R&D systems), и в качестве контроля, включали изотипические антитела.

Результат эксперимента

Чтобы подтвердить экспрессию IL13Rα2-специфичного CAR(YYB-103, IL13.E11K.R107K.TNFRSF9.CD3ζ; YYB-103A,IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.28.TNFRSF9.CD3ζ; YYB-103B,IL13.E11K.R107K.28.TNFRSF9.CD3ζ), полученного в Примере 1, на поверхности T-клеток, культивирование T-клеток проводили в течение 12-14 дней, согласно Примеру 2, и затем проводили проточный цитометрический анализ согласно методу эксперимента. В результате анализа, показатели экспрессии химерных антигенных рецепторов, экспрессируемых на поверхности живых T-клеток, составляли от 90,5% до 92,8% у семи (7) доноров крови. При поддержании культивирования, экспрессия IL13Rα2-специфичного химерного антигенного рецептора стабильно поддерживалась в течение 4 недель без активации или трансдукции дополнительных T-клеток. В дополнение, в культивируемых клетках анализировали отношения суммарных T-клеток, CD4 T-клеток, CD8 T-клеток, B-клеток и моноцитов. В результате, было подтверждено, что B-клетки существовали в количестве 0,5-1,2%, а моноциты отсутствовали.

Пример 3: Измерение цитотоксичности и секреции IFN-γ у T-клеток, трансформированных до 2-ого поколения (YYB-103, IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3ζ) и 3-его поколения (YYB-103A, IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3ζ) химерных антигенных рецепторов, специфически связывающихся с IL13Rα2, сверхэкспрессируемым в раковых клетках

IL13Rα2-специфичную цитотоксичность и секрецию IFN-γ измеряли, используя CAR-T-клетки, полученные в Примере 2. Чтобы измерить IL13Rα2-специфичную цитотоксичность и секрецию IFN-γ, применяли U251, которая представляет собой клеточную линию глиобластомы человека, сверхэкспрессирующую IL13Rα2, и первичную HUVEC, которая не экспрессирует IL13Rα2, в качестве нормальных контрольных клеток.

Экспериментальный пример 1: Проверка цитотоксичности для глиобластомы, сверхэкспрессирующей IL13Rα2

Метод эксперимента

Чтобы измерить цитотоксичность IL13Rα2-специфичных эффекторных CAR-T-клеток (IL13Rα2-специфичный CAR+T-клеточный эффектор), анализ на цитотоксичность проводили, используя набор DELFIA (Perkin Elmer). Конкретно, эффекторные клетки CAR-T-клеток применяли через 12-14 дней после активации клеток против-CD3, и эксперимент выполняли три раза в условиях, где эффекторные клетки помещали в 96-луночный планшет, в котором клетки-мишени с IL13Rα2 находились при соотношении 5:1 (эффектор:мишень) и соотношении 0,625:1 (эффектор:мишень) и взаимодействовали в течение 2 часов при 37°C. В 96-луночный планшет, используемый в этом аналитическом эксперименте, добавляли 5000 клеток-мишеней на лунку, и U251, которая является клеточной линией глиобластомы, сверхэкспрессирующей IL13Rα2, применяли в качестве клеток-мишеней, а первичные HUVEC применяли в качестве нормальных контрольных клеток.

Результат эксперимента

Анализировали, действительно ли раковые клетки-мишени (U251), сверхэкспрессирующие IL13Rα2, эффективно уничтожались IL13Rα2-специфичными CAR (YYB-103, IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3ζ; YYB-103A,IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.28.TNFRSF9.CD3ζ; YYB-103B,IL13.E11K.R107K.28.TNFRSF9.CD3ζ) T-клетками, полученными согласно настоящему изобретению. В качестве метода эксперимента применяли метод сравнения и анализа цитотоксичности посредством культивирования раковых клеток-мишеней (U251) и нормальных вышеуказанных клеток (HuVEC) вместе с соответствующими активированными CAR-T-клетками. Как проиллюстрировано на Фиг. 5, во всех случаях в результате получали, что, когда экспрессировался CAR, специфичный к IL13Rα2, экспрессия CAR индуцировала уничтожение клеток U251 глиобластомы, экспрессирующих IL13Rα2 на высоком уровне, по сравнению с активированными T-клетками, которые не были трансдуцированы (Фиг. 5). Конкретно, в случае T-клеток, экспрессирующих YYB-103(IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3ζ), YYB-103A(IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3ζ) и YYB-103B(IL13.E11K.R107K.28TNFRSF9.CD3ζ) CAR, полученных в Примере 2 настоящего изобретения, по мере увеличения отношения E:T, цитотоксичность постепенно увеличивалась; однако, в случае T-клеток, которые не экспрессировали CAR, цитотоксичность увеличивалась редко. В дополнение, в результате сравнения YYB-103B(IL13.E11K.R107K.28.TNFRSF9.CD3ζ) CAR, в котором две аминокислоты из IL13 были заменены, и YYB-103 (IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3ζ) и YYB-103A(IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.28.TNFRSF9.CD3ζ), в которых четыре аминокислоты из IL13 были заменены, что применяли, чтобы придать более высокую антигенную аффинность, в случае YYB-103B, в котором только две аминокислоты были заменены, 67,4% цитотоксичности были показаны при отношении E:T, равном 5:1, но когда применяли YYB-103 и YYB-103A, с мутантным IL13.E11K.R64D.S67D.R107K, в котором четыре аминокислоты IL13 были заменены, были показаны 85,6% и 87,7% цитотоксичности, соответственно. Это показывает, что цитотоксичность T-клеток, в которые вводили мутантный IL13.E11K.R64D.S67D.R107K, в котором четыре аминокислоты из IL13 были заменены, является превосходящей как у 2-го поколения, так и 3-его поколения, в сравнении с цитотоксичностью T-клеток, в которые вводили мутантный IL13.E11K.R107K, в котором были заменены две аминокислоты из IL13.

В результате эксперимента, при использовании в качестве нормальных контрольных клеток HUVEC, которые не экспрессируют IL13Rα2, но минимально экспрессируют IL13Rα1, в качестве объекта для сравнения с клетками-мишенями, было подтверждено, что CAR-T-клетки (12,3-14% цитотоксичности), специфичные к IL13Rα2, имеют очень слабую цитотоксичность (Фиг. 5). Это показывает, что вследствие свойства клеток HUVEC, которые экспрессируют IL13Rα1 и не экспрессируют IL13Rα2, химерный антигенный рецептор, применяемый в эксперименте, специфически связывается с IL13Rα2. Посредством настоящего экспериментального примера было продемонстрировано, что IL13Rα2-специфичные T-клетки с химерным антигенным рецептором не проявляют токсичности по отношению к нормальным клеткам (HUVEC) и могут в значительной степени уничтожать раковые клетки-мишени (U251), экспрессирующие IL13Rα2.

Экспериментальный пример 2: Измерение изменения противоопухолевой активности в соответствии с показателем экспрессии CAR

Метод эксперимента

Чтобы измерить изменение противоопухолевой активности в соответствии с показателем экспрессии IL13Rα2-специфичного CAR, выполняли анализ на цитотоксичность. Конкретно, 2-ое поколение IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFSFR9.CD3ζ, которое представляет собой YYB-103, применяли в качестве эффекторных клеток для CAR-T-клеток, а линию клеток U251, сверхэкспрессирующих IL13Rα2, применяли в качестве клеток-мишеней. Для анализа цитотоксичности, отношение эффекторных клеток и клеток-мишеней составляло 0,625:1 и 5:1, и доля T-клеток, экспрессирующих CAR, составляла 0-70%. Подробный метод анализа цитотоксичности был идентичен методу эксперимента Экспериментального примера 2.

Результат эксперимента

В случае, когда T-клетки, экспрессирующие IL13Rα2-специфичный CAR, отсутствуют, были показаны 16,4% и 2,5% цитотоксичности, соответственно, при соотношении 5:1 и 0,625:1. Однако можно показать, что по мере того, как увеличивалась доля T-клеток, экспрессирующих IL13Rα2-специфичный CAR, цитотоксичность увеличивалась, и было продемонстрировано, что когда доля T-клеток, экспрессирующих IL13Rα2-специфичный CAR составляла 70%, были показаны 86% и 26% цитотоксичности, соответственно, при соотношениях 5:1 и 0.625:1, и, таким образом, T-клетки с IL13Rα2-специфичным химерным антигенным рецептором могут уничтожать IL13Rα2-специфичные раковые клетки-мишени (U251) (Фиг. 6).

Экспериментальный пример 3: Проверка выработки цитокина (IFN-γ) T-клетками, трансформированными с IL13Rα2-специфичным химерным антигенным рецептором

Метод эксперимента

200 мкл культуральной среды помещали в каждую лунку в 96-луночном планшете для тканевых культур, и добавляли клетки-мишени (1×10⁵). Чтобы измерить цитотоксичность в соответствии с показателем экспрессии CAR, нетрансдуцированные активированные T-клетки и 10-70% CAR-T-клеток, специфичных к IL13Rα2, помещали в приготовленный 96-луночный планшет для тканевых культур с эффектором (1×10⁵), и культивировали в одно и то же время, проводя эксперимент в двух повторностях. В дополнение, чтобы подтвердить, действительно ли CAR-T-клетки показывают зависимое от числа увеличение противоопухолевой активности, проводили серийное разведение, исходя из 7500 CAR-T, и затем помещали к эффектору и культивировали в одно и то же время, проводя эксперимент в двух повторностях. Через 19 часов культивирования, проводили эксперимент по анализу IFN-γ, используя супернатант культуры, применяя анализатор ELISA (R&D systems) согласно инструкциям от производителя анализатора (Фиг. 7 и 8).

Результат эксперимента

Обычно, активированные T-клетки генерируют цитокины, которые способствует их росту и активации, и среди них, IFN-γ секретируется CD8-клетками, CD4 T-клетками, NK-клетками и т.д., и он играет важную роль при характерном иммунном и адаптивном иммунном ответах. В частности, он играет важную роль при движении T-клеток к участку опухоли, а также ингибировании появления злокачественного новообразования. Посредством настоящего экспериментального примера, было продемонстрировано, что генерация IFN-γ увеличивается, когда T-клетки, экспрессирующие IL13Rα2-специфичный CAR, встречаются с клетками-мишенями. В соответствии с методом эксперимента, T-клетки, экспрессирующие IL13Rα2-специфичный CAR, культивировали в то же самое время, что и клетки-мишени (клетки HUVEC, клетки U251), а затем IFN-γ количественно измеряли посредством анализа ELISA.

Фиг. 7 показывает увеличенный IFN-γ при связывании с антигеном IL13Rα2, в соответствии с соотношением трансдукции продуцируемого химерного антигенного рецептора, и можно понять, что аспекты генерации IFN-γ изменяются в зависимости от доли CAR-T-клеток. В случае использования U251, которые являются раковыми клетками-мишенями, T-клетки, в которые не трансдуцировали химерный антигенный рецептор, редко генерировали IFN-γ. В случае T-клеток, в которые трансдуцировали химерный антигенный рецептор, генерация IFN-γ увеличивалась до доли в 30%, и с учетом того, что генерация более не увеличивалась, определяют, что 30% доля CAR-T-клеток является достаточной для уничтожения раковых клеток-мишеней. С учетом того, что в случае HUVEC, которые представляют линию клеток, которые не сверхэкспрессируют IL13Rα2, даже, если доля CAR-T-клеток увеличивается, генерация IFN-γ не увеличивается, полагают, что генерация IFN-γ CAR-T-клетками является специфичной к антигену IL13Rα2. Фиг. 8 показывает увеличенный IFN-γ согласно числу CAR+T-клеток у двух доноров, YY6 и YY7, и по мере того, как число клеток увеличивается, увеличивается IFN-γ. Это показывает, что при уничтожении раковых клеток, CAR-T-клетки зависят от числа клеток.

Пример 4: Оценка эффективности in vivo при использовании YYB-103

Чтобы оценить, действительно ли YYB-103 проявляет эффективность in vivo, опухолевые клетки вводили посредством подкожной инъекции ʺголымʺ мышам для индуцирования опухоли, и после лечения с использованием YYB-103 подтверждали изменение размера опухоли и продолжительность действия CAR-T-клеток в опухолевой ткани.

Экспериментальный пример 1: Получение ʺголыхʺ мышей с опухолью, с использованием линии клеток U251, проверка эффективности YYB-103

Линию клеток U251 вводили посредством подкожной инъекции ʺголымʺ мышам. Через 9 дней, контрольной группе с PBS и группе лечения вводили YYB-103 один раз внутривенно. Темозоломид (TMZ) и IL-2 вводили внутрибрюшинно и внутривенно контрольной группе и экспериментальной группе один раз в день в течение четырех дней. Размер опухолей измеряли после 12-дневного лечения, и через 15 дней лечения проводили посмертное вскрытие для измерения массы опухолевой ткани и гистологического анализа (Фиг. 9)

Результат эксперимента

В результате измерения размера опухоли через 12 дней лечения для измерения эффективности YYB-103, который вводили животным модельным ʺголымʺ мышам с установленной подкожной опухолью в контрольной группе, размер опухоли уменьшался на около 44%, от 234,8 мм³ до 132,4 мм³. Однако, в случае введения YYB-103 в группе лечения, размер опухоли уменьшался на около 78%, от 288,2 мм³ до 64,6 мм³. Исходя из этого, можно видеть, что группа лечения показала терапевтический эффект приблизительно в 1,8 раз больший в сравнении с контрольной группой (Фиг. 9B). В результате измерения массы опухолевой ткани, полученной посредством выполнения посмертного вскрытия после 15 дней лечения, можно видеть, что масса опухолевой ткани ʺголыхʺ мышей, подвергшихся обработке в группе лечения, YYB-103, была меньше, чем масса опухолевой ткани мышей, обработанных в контрольной группе (Фиг. 9C). Наряду с этим, при проведении лечения с использованием YYB-103, было показано, что в опухолевой ткани ингибируется ангиогенез, в отличие от опухолевой ткани, подвергшейся лечению в контрольной группе (Фиг. 11A и Фиг. 11B).

Чтобы подтвердить, что YYB-103 продолжает действовать в опухолевой ткани после 15 дней лечения, проводили окрашивание, используя антитела против человеческого CD3, который является маркером человеческих T-клеток. В результате, было показано, что опухолевая ткань, подвергшаяся обработке в контрольной группе, не окрашивалась, поскольку мыши не содержали человеческих T-клеток (Фиг. 10A).

Было подтверждено, что в опухолевой ткани, подвергшейся лечению с использованием YYB-103, существовали многочисленные человеческие T-клетки, и это непосредственно оказывало влияние на снижение размера опухоли, подвергшейся лечению с использованием YYB-103 (Фиг. 10B).

В результате наблюдения опухолевой ткани при окрашивании H&E опухолевой ткани через 15 дней лечения, было видно, что в группе, которая не подвергалась действию YYB-103, наблюдали множество кровеносных сосудов. Таким образом, представляется, что вследствие действия YYB-103, на участке опухоли ингибируется ангиогенез, что приводит к менее агрессивной опухоли (Фиг. 11A & Фиг. 11B).

Пример 5: Конструкция CAR, способного к распознаванию различных солидных опухолей и ангиогенных кровеносных сосудов, и получение линии клеток PG13, стабильно экспрессирующих CAR.

Если ангиогенез, который обеспечивает рост нового кровеносного сосуда на участке опухоли, ингибируют, можно ингибировать распространение и рост раковых клеток. Для успешных противоопухолевых терапий с использованием CAR требуются не только антиген-специфичные CAR-T-клетки, но также доступ CAR-T-клеток к раковым клеткам и поддержание функции CAR-T-клеток в иммуносупрессорном микроокружении опухоли. Следовательно, чтобы достичь цели, получали антиангиогенный CAR (Фиг. 12A).

Получали CAR, нацеленный на EGFRvIII, который является основным опухолевым антигеном глиобластомы, рака легкого и т.д. (Фиг. 13A).

EphA2 (Мембраносвязанный эритропоэтин-продуцирующий гепатоклеточный рецептор тирозинкиназы класса A2) сверхэкспрессируется при раке молочной железы, раке простаты, раке мочевого пузыря, раке кожи, раке легкого, раке яичника и раке головного мозга и т.д., и таким образом, получали CAR, нацеленный на EphA2 (Фиг. 14A).

Интегрин альфа(V) бета(3) (αVβ3), который является гликопротеиновым мембранным рецептором, в высокой степени экспрессируется в активированных опухолевых эпителиальных клетках. Получали CAR, нацеленный на αVβ3, который является резистентным маркером стволовости карциномы, и ингибиторы рецептора тирозинкиназы (RTKI), такие как эрлотиниб для рака поджелудочной железы, рака легкого и рака молочной железы (Фиг. 15A).

GPC1 является важным для эффективного роста, распространения и ангиогенеза раковых клеток, и GPC1 сверхэкспрессируется при раке поджелудочной железы, раке молочной железы, глиобластоме (Фиг. 16A).

Экспериментальный пример 1: Проверка показателя экспрессии CAR на поверхности клеток PG13, трансформированных с использованием CAR, способного к распознаванию ангиогенных кровяных сосудов, EGFRvIII, EphA2, Интегрина αVβ3 или GPC1

Метод эксперимента (проточный цитометрический анализ)

Для проточной цитометрии (>30000 событий), применяли оборудование BD LSRII (Becton Dickinson) и программное обеспечение BD FACSDiva (Becton Dickinson). Конкретно, перед добавлением антител, клетки однократно промывали PBS, содержащим 2% альбумина бычьей сыворотки. После промывки клетки взаимодействовали с соответствующими антителами в течение 30 минут при 4°C в состоянии, где свет блокировали, и затем их однократно промывали, и проверяли показатель экспрессии CAR на поверхности клеток PG13, трансформированных с использованием CAR, причем применяли моноклональные антитела против человеческого фибронектина, PE-конъюгированные моноклональные антитела против человеческого EphA2 (R&D Systems) PE-конъюгированные моноклональные антитела против человеческого альфа v бета 3 (BioLegend), а в случае антител без комбинации с флуоресценцией, дополнительно применяли PE-конъюгированные моноклональные антитела против мышиного IgG1 (Santa Cruz Biotechnology) или ослиные вторичные антитела против козьего IgG, меченные фикоэритрином (R&D systems), для проведения флуоресцентного окрашивания.

Результат эксперимента

В результате подтверждения показателей экспрессии соответствующих CAR в клеточной линии трансдуцированных PG13, было показано, что химерный антигенный рецептор экспрессируется на поверхности почти всех живых клеток клеточной линии PG13 (Фиг. 12B, Фиг. 13B, Фиг. 14B, Фиг. 15B и Фиг. 16B).

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

Настоящее изобретение относится к CAR-T-клеткам, которые интенсивно разрабатываются в области лечения злокачественных новообразований, и является применимыми в медицинской промышленности в области специфичного для пациента лечения злокачественных новообразований.

Свободный текст списка последовательностей

SEQ ID NO. 1 {Последовательность антигенсвязывающего домена IL-13 дикого типа, связывающегося с IL13Rα2}

Длина: 112

Тип: лигандный белок

Наименование: человеческий

Последовательность:

GPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSA GQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGQFN

SEQ ID NO. 2 {антигенсвязывающий домен, способный к связыванию с антигеном, ассоциированным с ангиогенной активностью}

Длина: 92

Тип: лигандный белок

Наименование: человеческий

Последовательность:

EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVLQPPSTATISGLKPGVDYTITVYAVVERNGRELNT PPISINYRTHHHHHH

SEQ ID NO. 3 {антигенсвязывающий домен, связывающийся с EGFRvIII}

Длина: 252

Тип: белок scFv

Наименование: человеческий

Последовательность:

QVQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSKFGMSWVRQTPDKRLEWVASISTGGYNTFYSDNVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARGYSSTSFAMDYWGQGTMVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCMTSTDIDDDMNWYQQKPGKTPKLLIYEGNTLRPGVPSRFSGSGSGTDFIFTISSLQPEDIATYYCLQSFNV PLTFGGGTKVEIKEQKLISEEDL

SEQ ID NO. 4 {антигенсвязывающий домен, связывающийся с EphA2}

Длина: 141

Тип: лигандный белок

Наименование: человеческий

Последовательность:

DRHTVFWNSSNPKFRNEDYTIHVQLNDYVDIICPHYEDHSVADAAMEQYILYLVEHEEYQLCQPQSKDQVRWQCN RPSAKHGPEKLSEKFQRFTAFALAKEFKAGHSYYYISKPIHQHEDRCLRLKVTVSGEQKLISEEDL

SEQ ID NO. 5 {антигенсвязывающий домен, связывающийся с αVβ3}

Длина: 104

Тип: лигандный белок

Наименование: человеческий

Последовательность:

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTPRGDWNEGSKPISINYRTEQKLISEEDL

SEQ ID NO. 6 {антигенсвязывающий домен, связывающийся с глипиканом 1}

Длина: 418

Тип: лигандный белок

Наименование: человеческий

Последовательность:

TSPCDNFDCQNGAQCIVRINEPICQCLPGYQGEKCEKLVSVNFINKESYLQIPSAKVRPQTNITLQIATDEDSGILLYKGDKDHIAVELYRGRVRASYDTGSHPASAIYSVETINDG NFHIVELLALDQSLSLSVDGGNPKIITNLSKQSTLNFDSPLYVGGMPGKSNVASLRQAPGQNGTSFHGCIRNLYINSELQDFQKVPMQTGILPGCEPCHKKVCAHGTCQPSSQAGFTCECQEGWMGPLCDQRTNDPCLGNKCVHGTCLPINAFSYSCKCLEGHGGVLCDEEEDLFNPCQAIKCKHGKCRLSGLGQPYCECSSGYTGDSCDREISCRGERIRDYYQKQQGY AACQTTKKVSRLECRGGCAGGQCCGPLRSKRRKYSFECTDGSSFVDEVEKVVKCGCTRCVSEQKLISEEDL

SEQ ID NO. 7 {CD28 дикого типа}

Длина: 41

Тип: белок

Наименование: человеческий

Последовательность:

RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS

SEQ ID NO. 8 {TNFRSF9}

Длина: 42

Тип: белок

Наименование: человеческий

Последовательность:

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

SEQ ID NO. 9 {последовательность шарнирной области-1}

Длина: 47

Тип: белок

Наименование: человеческий

Последовательность:

KPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD

SEQ ID NO. 10 {последовательность шарнирной области -2}

Длина: 45

Тип: белок

Наименование: человеческий

Последовательность:

KPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEAARPAAGGAVHTRGLDFA

SEQ ID NO. 11 {последовательность трансмембранного домена-1}

Длина: 21

Тип: белок

Наименование: человеческий

Последовательность:

IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT

SEQ ID NO. 12 {последовательность трансмембранного домена -2}

Длина: 23

Тип: белок

Наименование: человеческий

Последовательность:

LAYLLDGILFIYGVILTALFLRV

SEQ ID NO. 13 {CD3ζ, содержащий избыточный глутамин}

Длина: 113

Тип: белок

Наименование: человеческий

Последовательность:

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO. 14 {YYB 103}

Длина: 359

Тип: белок

Наименование: человеческий

Последовательность:

MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTAT KDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO. 15 {YYB 103A}

Длина: 400

Тип: белок

Наименование: человеческий

Последовательность:

MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITRSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO. 16{YYB-103B, IL13(E11K.R107K).29.TNFRSF9.CD3ζ}

Длина: 400

Тип: белок

Наименование: человеческий

Последовательность:

MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITRSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO. 17{YYB 104}

Длина: 339

Тип: белок

Наименование: человеческий

Последовательность:

MGWSCIILFLVATATGVHSEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVLQPPSTATISGLKPGVDYTITVYAVVERNGRELNTPPISINYRTHHHHHHGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO. 18 {YYB 104-1}

Длина: 308

Тип: белок

Наименование: человеческий

Последовательность:

MGWSCIILFLVATATGVHSEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVLQPPSTATISGLKPGVDYTITVYAVVERNGRELNTPPISINYRTHHHHHHGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITRSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO. 19 {YYB 105}

Длина: 497

Тип: белок

Наименование: человеческий

Последовательность:

MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSKFGMSWVRQTPDKRLEWVASISTGGYNTFYSDNVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARGYSSTSFAMDYWGQGTMVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCMTSTDIDDDMNWYQQKPGKTPKLLIYEGNTLRPGVPSRFSGSGSGTDFIFTISSLQPEDIATYYCLQSFNVPLTFGGGTKVEIKEQKLISEEDLGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEAARPAAGGAVHTRGLDFALAYLLDGILFIYGVILTALFLRVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO. 20{YYB 105-1}

Длина: 538

Тип: белок

Наименование: человеческий

Последовательность:

MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSKFGMSWVRQTPDKRLEWVASISTGGYNTFYSDNVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARGYSSTSFAMDYWGQGTMVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCMTSTDIDDDMNWYQQKPGKTPKLLIYEGNTLRPGVPSRFSGSGSGTDFIFTISSLQPEDIATYYCLQSFNVPLTFGGGTKVEIKEQKLISEEDLGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEAARPAAGGAVHTRGLDFALAYLLDGILFIYGVILTALFLRVRSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO. 21 {YYB 106}

Длина: 388

Тип: белок

Наименование: человеческий

Последовательность:

MGWSCIILFLVATATGVHSDRHTVFWNSSNPKFRNEDYTIHVQLNDYVDIICPHYEDHSVADAAMEQYILYLVEHEEYQLCQPQSKDQVRWQCNRPSAKHGPEKLSEKFQRFTAFALAKEFKAGHSYYYISKPIHQHEDRCLRLKVTVSGEQKLISEEDLGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ ALPPR

SEQ ID NO. 22{YYB 106-1}

Длина: 429

Тип: белок

Наименование: человеческий

Последовательность:

MGWSCIILFLVATATGVHSDRHTVFWNSSNPKFRNEDYTIHVQLNDYVDIICPHYEDHSVADAAMEQYILYLVEHEEYQLCQPQSKDQVRWQCNRPSAKHGPEKLSEKFQRFTAFALAKEFKAGHSYYYISKPIHQHEDRCLRLKVTVSGEQKLISEEDLGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITRSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALH MQALPPR

SEQ ID NO. 23{YYB 107}

Длина: 351

Тип: белок

Наименование: человеческий

Последовательность:

MGWSCIILFLVATATGVHSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTPRGDWNEGSKPISINYRTEQKLISEEDLGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO. 24{YYB 107-1}

Длина: 392

Тип: белок

Наименование: человеческий

Последовательность:

MGWSCIILFLVATATGVHSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTPRGDWNEGSKPISINYRTEQKLISEEDLGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITRSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO. 25 {YYB 108}

Длина: 665

Тип: белок

Наименование: человеческий

Последовательность:

MGWSCIILFLVATATGVHSTSPCDNFDCQNGAQCIVRINEPICQCLPGYQGEKCEKLVSVNFINKESYLQIPSAKVRPQTNITLQIATDEDSGILLYKGDKDHIAVELYRGRVRASYDTGSHPASAIYSVETINDGNFHIVELLALDQSLSLSVDGGNPKIITNLSKQSTLNFDSPLYVGGMPGKSNVASLRQAPGQNGTSFHGCIRNLYINSELQDFQKVPMQTGILPGCEPCHKKVCAHGTCQPSSQAGFTCECQEGWMGPLCDQRTNDPCLGNKCVHGTCLPINAFSYSCKCLEGHGGVLCDEEEDLFNPCQAIKCKHGKCRLSGLGQPYCECSSGYTGDSCDREISCRGERIRDYYQKQQGYAACQTTKKVSRLECRGGCAGGQCCGPLRSKRRKYSFECTDGSSFVDEVEKVVKCGCTRCVSEQKLISEEDLGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO. 26{YYB 108-1}

Длина: 706

Тип: белок

Наименование: человеческий

Последовательность:

MGWSCIILFLVATATGVHSTSPCDNFDCQNGAQCIVRINEPICQCLPGYQGEKCEKLVSVNFINKESYLQIPSAKVRPQTNITLQIATDEDSGILLYKGDKDHIAVELYRGRVRASYDTGSHPASAIYSVETINDGNFHIVELLALDQSLSLSVDGGNPKIITNLSKQSTLNFDSPLYVGGMPGKSNVASLRQAPGQNGTSFHGCIRNLYINSELQDFQKVPMQTGILPGCEPCHKKVCAHGTCQPSSQAGFTCECQEGWMGPLCDQRTNDPCLGNKCVHGTCLPINAFSYSCKCLEGHGGVLCDEEEDLFNPCQAIKCKHGKCRLSGLGQPYCECSSGYTGDSCDREISCRGERIRDYYQKQQGYAACQTTKKVSRLECRGGCAGGQCCGPLRSKRRKYSFECTDGSSFVDEVEKVVKCGCTRCVSEQKLISEEDLGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITRSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

1. Химерный антигенный рецептор для лечения рака, экспрессирующего IL13Rα2, содержащий антигенсвязывающий домен; шарнирную область; трансмембранный домен; костимулирующий домен и цитоплазматический домен сигнализации, причем антигенсвязывающий домен связывается с IL13Rα2 и

причем в антигенсвязывающем домене 11-е, 64-е, 67-е и 107-е положения аминокислотной последовательности, обозначенной как SEQ ID NO: 1, замещены лизином(K), аспарагиновой кислотой(D), аспарагиновой кислотой(D) и лизином(K) соответственно.

2. Химерный антигенный рецептор по п. 1, обозначенный как SEQ ID NO: 14.

3. Химерный антигенный рецептор по п. 1, обозначенный как SEQ ID NO: 15.

4. CAR-T-клетка, экспрессирующая химерный антигенный рецептор по любому из пп. 1-3, представляющая собой рекомбинантную T-клетку, в которую введен ген рецептора, распознающего раковую клетку в качестве антигена, где T-клетка содержит антигенсвязывающий домен, распознающий антиген; шарнирную область, соединяющую антигенсвязывающий домен и трансмембранный домен; трансмембранный домен; костимулирующий домен и цитоплазматический домен сигнализации, отличающаяся тем, что клетка содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую химерный антигенный рецептор по любому из пп. 1-3.

5. Химерный антигенный рецептор по п. 1, в котором три глицина дополнительно введены между антигенсвязывающим доменом и шарнирной областью.

6. Химерный антигенный рецептор по п. 1, в котором костимулирующий домен представляет собой TNFRSF9 или мутантный CD28.

7. Химерный антигенный рецептор по п. 6, в котором TNFRSF9 обозначен как SEQ ID NO: 8.

8. Химерный антигенный рецептор по п. 6, в котором в мутантном CD28 аминокислота в положениях 6-9 аминокислотной последовательности, обозначенной как SEQ ID NO: 7, замещена с RLLH на RGGH.