Способ определения жизнеспособности цист лямблий в биологическом материале при низких температурах
Владельцы патента RU 2725951:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр "Якутский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук" (RU)
Изобретение относится к области ветеринарии. Способ определения жизнеспособности цист лямблий в биологическом материале при низких температурах предусматривает подготовку взеси тест-образцов, внесение диагностикума Ovatec Plus, нанесение взвеси на предметное стекло, окрашивание исследуемой взвеси путем нанесения 1 капли 0,1% водного раствора эозина и фиксацию фиксатором-красителем по Май-Грюнвальду "ГЕМСТАНДАРТ-МГ". После чего накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом. При этом жизнеспособные цисты остаются неокрашенными, а мертвые – приобретают желтый цвет. Изобретение позволяет определить живые цисты лямблий в фекалиях при низких температурах. 1 табл.
Изобретение относится к области ветеринарной медицины и представляет собой способ определения жизнеспособности цист лямблий в биологических материалах - фекалиях при критически низких температурах. Исследование опытных образцов биологического материала цист лямблий переносят на предметное стеклометодом механического обогащения с применением экспресс диагностикум OvatecPlus (Израиль), затем окрашивают. Для окрашивания на поверхность полученной взвеси наносят по 1 капле 0,1% водного раствора эозинаи фиксируют окрашенной взвеси по Май-Грюнвальду, накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскоп. Жизнеспособные цисты кишечных простейших остаются неокрашенными, а мертвые приобретают желтую окраску.
Известен способ по исследованию воды на наличие цист лямблий и ооцист криптоспоридий методом иммуномагнитного разделения и мечения флюоресцирующими антителами, включающий отбор проб, проведение исследований и оценку результатов (Методические указания МУК 4.2.2314-08, МУК 4.2.2959-11). Указанный способ достаточно длительный по времени и трудоемкий и для его реализации необходимо дорогостоящее оборудование и реактивы, ограничен объектом исследования - вода.
А также, известен способ определение паразитологических агентов в клиническом материале - кале, в смывах объектов окружающей среды, в почве адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлюоресцентным мечением с разработанной пробоподготовкой биологического материала к проведению исследований и получен патент «Способ смывах с объектов окружающей среды, в почве», 2016 г. Однако, данный способ диагностирования лямблиоза показывает только условную интенсивность цист лямблий с внесением в пробу иммуномагнитных частиц и последующей оценки микроскопированием с применением насадки «Опти-Люм» на микроскоп, где результат учитывают исходя из того, что цисты лямблий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты, от округлых до овальных, от 8 до 14 мкм в длину на 7-10 мкм в ширину, с ярко подсвеченными краями, ооцисты же криптоспоридий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты и предлагает сокращение времени лабораторных исследований при обнаружении цист лямблий.
Также известен метод окрашивание простейших раствором Люголя описанный, как новые методы лабораторной диагностики гельминтозов и принципы работы паразитологической лаборатории, которые были учтены в инструкции Минздрава СССР, 1985 г., однако раствор Люголя хранят в темной стеклянной банке при комнатной температуре в течение одного месяца. А также известны исследования о не выживаемости цист лямблий при температуре -25°С.
Технической задачей заявляемого изобретения является определение выживаемости цист лямблий при экстремальных условиях Якутии, при низких температурах -5°С; -15°С; -25°С.
В основу изобретения положена задача способа определения выживаемости цист лямблий при низких температурах Якутии -5°С; -15°С; -25°С. Определение выживаемости цист лямблий при низких температурах определяет возможность сохранения жизнеспособности кишечных простейших и способность заражать животных лямблиями.
Предлагаемый способ реализуется следующим образом.
Для определения жизнеспособности кишечных простейших проведены экспериментальные опыты по использованию биологического материала с цистами лямблий. Как мы знаем цисты лямблий очень устойчивы и способны сохраняться во внешней среде, в сточной воде, на продуктах питания, в фекалиях и др., например: в водопроводной или прудовой воде, цисты лямблий сохраняются в течение 1-3 месяцев, это при температуре воды в диапазоне от 4 до 20°С. Цисты служат источником распространения лямблиоза и выживания их цист в неблагоприятных условиях внешней среды. Острая стадия лямблиоза обычно проявляется у животных диареей и потерей аппетита. Возможна небольшая лихорадка во время этого периода. Признаки лямблиоза могут продолжаться в течение нескольких месяцев. Вред, который причиняют лямблии, заключается не только в изменении структуры слизистой кишечника, но и в нарушении микрофлоры кишечника (развитии дисбактериоза). Так, при бурном увеличении количества лямблий появляются и размножаются болезнетворные бактерии и грибы, которые в норме отсутствуют в кишечнике.
При использовании предлагаемого изобретения технический результат достигается в способе определение жизнеспособности цист лямблий в биологическом материале Тест-образцы содержащие цисты лямблий для проведения лабораторного исследования проводят при содержании в комнатной температуре +18 - +22°С - тест-образцы исследуют 1 раз в 3 сут., температура холодильника +2 - +4°С - 1 раз в 3 сут., и низких температурах внешней среды -5°С - 1 раз в 3 сут., -10°С - 1 раз в 3 сут., -15°С - 1 раз 3 сут., -25°С - 1 раз 3 сут. При переносе цист из тест-образцов на предметное стекло используют экспресс диагностикум Ovatec Plus (Израиль), для определения жизнеспособности цист взвесь от тест-образцов окрашивают, для этого на поверхность исследуемой взвеси наносят по 1 капле 0,1% водного раствора эозина, затем фиксируют фиксатор-красителем по Май-Грюнвальду "ГЕМСТАНДАРТ-МГ", затем накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскоп. Жизнеспособные цисты кишечных простейших остаются неокрашенными, а мертвые приобретают желтую окраску.
При определении сроков выживаемости цист лямблий (кишечных простейших) готовятся тест-образцы вложенные в капроновые мешочки, перевязывают сверху нитками и погружают в пробирки высотой 10-15 см, диаметром 2 см. Пробирки с исследуемым материалом помещают в перфорированные бумажные ящички, фиксируют при помощи проволоки, ставят в условиях исследования при комнатной температуре (+18 - +22°С), для исследования тест-образцов берут по одной пробирке 1 раз в 3 сут., в условиях бытового холодильника (+2 - +4°С) - исследуют также 1 раз в 3 сут., при низких температурах внешней среды (-5°С) - 1 раз в 3 сут., -10°С - 1 раз в 3 сут., -15°С - 1 раз 3 сут., -25°С - 1 раз 3 сут.
Для выделения из тест-образцов цист лямблий применяют экспресс диагностикум Ovatec Plus (Израиль) получают на предметном стекле взвесь с объемом 0,2 мл, на тонкий слой взвеси наносят по 1 капле 0,1% водного раствора эозина на 1 мин. и фиксируют фиксатором-красителем по Май-Грюнвальду "ГЕМСТАНДАРТ-МГ" на 30 сек., окрашенную взвесь накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскоп при х 200 ув. Жизнеспособные цисты кишечных простейших остаются неокрашенными, а мертвые приобретают желтую окраску. Показатели выживаемости цист лямблий в тест-образцах при -25°С сравниваются с положительным показателем контрольного исследования биологического материала в начале опыта по количеству живых цист лямблий.
Выживаемость цист лямблий определяют при исследовании 500 проб натурного материала при разных показателях температуры, эффективность способа определения выживаемости цист лямблий при низких температурах показывает, что в экспериментальной серии исследований тест-образцов биологического материала составляет 100% цист лямблий, а при низких температурных режимах от 95 до 60% цист лямблий обнаруживают жизнеспособными.
Таким образом, способ определения жизнеспособности цист лямблий при критически низких температурах в биологическом материале - фекалиях позволяет определить, что при низких температурах окружающей среды до -25°С, более 30 дней выживают 60% цист лямблий.
Способ определения жизнеспособности цист лямблий в биологическом материале при низких температурах, заключающийся в подготовке взвеси тест-образцов, внесении диагностикума Ovatec Plus, нанесении взвеси на предметное стекло, окрашивании исследуемой взвеси путем нанесения 1 капли 0,1% водного раствора эозина и фиксации фиксатором-красителем по Май-Грюнвальду "ГЕМСТАНДАРТ-МГ", после чего накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом, при этом жизнеспособные цисты остаются неокрашенными, а мертвые приобретают желтую окраску.
