Соединение для модуляции экспрессии гена c9orf72 и его применение

Группа изобретений относится к соединениям и способам снижения экспрессии мРНК и/или белка гена C9ORF72, содержащих экспансию гексануклеотидного повтора, у животных с помощью специфических ингибиторов C9ORF72. Такие специфические ингибиторы C9ORF72 включают антисмысловые соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16-20 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеотидных оснований, содержащую по меньшей мере 12 последовательных нуклеотидных оснований, которые на 100% комплементарны части равной длины из нуклеотидных оснований 1446-1479 SEQ ID NO: 2. Модифицированный олигонуклеотид может содержать по меньшей мере одну модификацию, выбранную из модифицированного сахара и модифицированной межнуклеозидной связи. Соединение, конъюгаты и композиции на его основе пригодны для лечения, предупреждения или облегчения нейродегенеративного заболевания, связанного с нуклеиновой кислотой C9ORF72, содержащей экспансию гексануклеотидного повтора, у нуждающегося в этом индивида. 8 н. и 47 з.п. ф-лы, 28 табл., 6 пр.

 

Перечень последовательностей

Настоящая заявка подается вместе с перечнем последовательностей в электронном формате. Перечень последовательностей представлен в виде файла с названием BIOL0211WOSEQ.txt, созданного 14 октября 2013 г., размером 184 Кб. Данные в электронном формате для перечня последовательностей включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Предложены композиции и способы снижения экспрессии мРНК и белка C9ORF72 у животных. Такие способы пригодны для лечения, предупреждения или облегчения протекания нейродегенеративных заболеваний, включающих амиотрофический латеральный склероз (АЛС), лобно-височную деменцию (ЛВД), синдром кортикобазальной дегенерации (КБД), атипичный синдром паркинсонизма и оливопонтоцеребеллярную дегенерацию (ОПЦД).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Амиотрофический латеральный склероз (АЛС) представляет собой нейродегенеративное заболевание, заканчивающееся смертельным исходом, с характерной клинической картиной прогрессирующего паралича, приводящего к смерти от остановки дыхания, как правило, в период от двух до трех лет после появления симптомов (Rowland and Shneider, N. Engl. J. Med., 2001, 344, 1688-1700). АЛС является третьим наиболее распространенным нейродегенеративным заболеванием западного мира (Hirtz et al., Neurology, 2007, 68, 326-337) и в настоящее время для него отсутствуют эффективные способы лечения. Приблизительно 10% случаев в природе являются наследственными, тогда как подавляющее количество пациентов с данным диагностированным заболеванием классифицируются как спорадически заболевшие, поскольку заболевание у них возникает случайным образом в пределах всей популяции (Chio et al., Neurology, 2008, 70, 533-537). На основе клинических, генетических и эпидемиологических данных становится понятно, что АЛС и лобно-височная деменция (ЛВД) представляют собой перекрывающееся пространство общего заболевания, характеризующегося патологическим процессом из-за наличия положительных включений TDP-43 во всей центральной нервной системе (Lillo and Hodges, J. Clin. Neurosci., 2009, 16, 1131-1135; Neumann et al., Science, 2006, 314, 130-133).

К настоящему времени обнаружили несколько генов, являющихся причиной классического наследственного АЛС, например, SOD1, TARDBP, FUS, OPTN и VCP (Johnson et al., Neuron, 2010,68, 857-864; Kwiatkowski et al., Science, 2009, 323, 1205-1208; Maruyama et al., Nature, 2010, 465, 223-226; Rosen et al., Nature, 1993, 362, 59-62; Sreedharan et al., Science, 2008, 319, 1668-1672; Vance et al., Brain, 2009, 129, 868-876). Проведенный недавно анализ сцепления между генными локусами родственников с многочисленными случаями заболеваний АЛС, ЛВД и АЛС-ЛВД показал, что существует важный локус этого заболевания на коротком плече хромосомы 9 (Boxer et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 2011, 82, 196-203; Morita et al., Neurology, 2006, 66, 839-844; Pearson et al. J. Nerol., 2011, 258, 647-655; Vance et al., Brain, 2006, 129, 868-876). Это локус хромосомы 9р21АЛС-ЛВД расположен в последнем главном аутосомально-доминантном гене, мутация которого вызывает АЛС. Мутация, вызывающая АЛС-ЛВД, представляет собой большую экспансию гексануклеотидного (GGGGCC) повтора в первом интроне гена C9ORF72 (Renton et al., Neuron, 2011, 72, 257-268; DeJesus-Hernandez et al., Neuron, 2011, 72, 245-256). Основной гаплотип, включающий ген C9ORF72, представлен в большинстве случаев мутаций, связанных с этим участком (Renton et al., Neuron, 2011, 72, 257-268). Этот локус на хромосоме 9р21 отвечает почти за половину случаев наследственного АЛС и почти за одну четверть всех случаев возникновения АЛС в группе из 405 пациентов из Финляндии (Laaksovirta et al, Lancet Neurol., 2010, 9, 978-985).

Основной гаплотип, включающий ген C9ORF72, присутствует в большинстве случаев мутаций, связанных с эти участком.

В настоящее время не существует эффективных способов терапии для лечения таких нейродегенеративных заболеваний, поэтому целью настоящей заявки является предоставление композиций и способов для лечения таких нейродегенеративных заболеваний.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе представлены композиции и способы модуляции уровней мРНК и белка C9ORF72 в клетках, тканях и в организмах животных. В некоторых вариантах реализации изобретения специфические ингибиторы C9ORF72 модулируют экспрессию мРНК и белка C9ORF72. В некоторых вариантах реализации изобретения специфические ингибиторы C9ORF72 являются нуклеиновыми кислотами, белками или малыми молекулами.

В некоторых вариантах реализации изобретения модуляция может происходить в клетке или ткани. В некоторых вариантах реализации изобретения эта клетка или ткань находится в организме животного. В некоторых вариантах реализации изобретения это животное является человеком. В некоторых вариантах реализации изобретения снижаются уровни мРНК C9ORF72. В некоторых вариантах реализации изобретения снижаются уровни белка C9ORF72. В некоторых вариантах реализации изобретения преимущественно снижаются уровни определенных вариантов мРНК C9ORF72. В некоторых вариантах реализации изобретения преимущественно снижаемые уровни вариантов мРНК C9ORF72 являются вариантами, содержащими интрон 1. В некоторых вариантах реализации изобретения интрон 1 содержит экспансию гексануклеотидного повтора. В некоторых вариантах реализации изобретения эта экспансия гексануклеотидного повтора связана с заболеванием, ассоциированным с белком C9ORF72. В некоторых вариантах реализации изобретения эта экспансия гексануклеотидного повтора связана с заболеванием, ассоциированным с экспансией гексануклеотидного повтора C9ORF72. В некоторых вариантах реализации изобретения эта экспансия гексануклеотидного повтора содержит по меньшей мере 30 повторов GGGGCC. В некоторых вариантах реализации изобретения эта экспансия гексануклеотидного повтора связана с заболеванием, ассоциированным с фокусами ядер клеток. В некоторых вариантах реализации изобретения композиции и способы, описанные в данном документе, пригодны для снижения уровней мРНК C9ORF72, уровней белка C9ORF72 и уменьшения фокусов ядер клеток. Такое снижение может происходить времязависимым способом или дозозависимым способом.

Предложены также способы, пригодные для предупреждения, лечения и ослабления протекания заболеваний, нарушений и состояний, ассоциированных с белком C9ORF72. В некоторых вариантах реализации изобретения такие заболевание, нарушения и состояния, ассоциированные с белком C9ORF72, являются нейродегенеративными заболеваниями. В некоторых вариантах реализации изобретения нейродегенеративное заболевание представляет собой амиотрофический латеральный склероз (АЛС), лобно-височную деменцию (ЛВД), синдром кортикобазальной дегенерации (КБД), атипичный синдром паркинсонизма и оливопонтоцеребеллярную дегенерацию (ОПЦД).

Такие заболевания, нарушения и состояния могут в целом сопровождаться одним или более факторами риска, причинами и исходами заболевания. Определенные факторы риска и причины развития нейродегенеративного заболевания и, в частности, АЛС и ЛВД, включают генетическую предрасположенность и пожилой возраст.

В некоторых вариантах реализации изобретения способы лечения включают введение индивиду, нуждающемуся в этом, специфического ингибитора C9ORF72. В некоторых вариантах реализации изобретения специфический ингибитор C9ORF72 является нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота является антисмысловым соединением. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение является одноцепочечным антисмысловым олигонуклеотидом. В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид комплементарен нуклеиновой кислоте C9ORF72.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Должно быть понятно, что как предыдущее общее описание, так и последующее подробное описание сущности изобретения приведены только в качестве примеров и объяснений и не ограничивают данное изобретение, указанное в формуле. В данном документе использование единственного числа включает множественное, если прямо не указано что-либо другое. В данном документе считается, что использование слова «или» обозначает «и/или», если не указано что-либо другое. Кроме того, в данном документе принимается во внимание, что использование слова «и» обозначает «и/или», если не указано что-либо другое. Более того, использование термина «включающий», а также других форм, таких как «включает» и «включенный», не является ограничивающим. Также такие термины, как «элемент» или «компонент» охватывают как элементы, так и компоненты, содержащие одну составляющую, и элементы и компоненты, содержащие более одной подсоставляющей, если прямо не указано что-либо другое.

Заголовки разделов, использованные в данном документе, применены только с целью упорядочивания текста и не должны истолковываться как ограничивающие описанный объект изобретения. Все документы или части документов, цитируемые в этом описании, включая без ограничения патенты, заявки на патенты, опубликованные заявки на патенты, статьи, книги, исследования, номера доступа к базе данных GENBANK и связанную информацию о последовательностях, которую можно получить из баз данных, таких какНациональный центр биотехнологической информации (NCBI) и других данных, относящихся ко всему описанию данного документа, намеренно включены посредством ссылок для частей обсуждаемого здесь документа, а также в их полном объеме.

Определения

Если конкретные определения не предусмотрены, то данная номенклатура используется в связи с, а также в пределах процедур и методик аналитической химии, синтетической органической химии, медицинской и фармацевтической химии, описанных в данном документе, является хорошо известной и обычно используемой в данной области техники. Для химического синтеза и химического анализа могут быть использованы стандартные методики.

Если не указано иное, то указанные ниже термины имеют следующие значения:

«2'-O-метоксиэтильная группа» (также обозначаемая 2'-МОЕ и 2'-ОСН₂СН₂-ОСН₃ и МОЕ) относится к О-метоксиэтил-модификации положения 2' фуранозильного кольца. Модифицированный 2'-O-метоксиэтильный сахар является модифицированным сахаром.

«2'-МОЕ нуклеозид» (также обозначаемый 2'-O-метоксиэтилнуклеозидом) обозначает нуклеозид, содержащий 2'-O-метоксиэтильную группу.

«5-метилцитозин» обозначает цитозин, модифицированный метальной группой, присоединенной к положению 5'. 5-метилцитозин является модифицированным нуклеотидным основанием.

«Около» обозначает нахождение в пределах значения ±7%. Например, если утверждается, что «соединение приводит к по меньшей мере около 70% ингибированию C9ORF72», следовательно это подразумевает, что уровни C9ORF72 ингибированы в пределах диапазона от 63 до 77%.

«Совместное введение» относится к совместному введению двух фармацевтических агентов любым способом, при котором фармацевтическое действие обоих агентов проявляется у пациента одновременно. Совместное введение не требует, чтобы оба фармацевтических агента вводились в одной фармацевтической композиции, в одной и той же лекарственной форме или одинаковым путем. Не требуется, чтобы действие обоих фармацевтических агентов проявляло себя в одно и то же время. Эффекты должно быть перекрывающимися только на некоторый период времени и не должны быть одинаковыми по продолжительности.

«Введение» обозначает поступление фармацевтического агента животному и включает, без ограничения, введение медицинским работником или самостоятельное введение.

Термины «облегчение», или «облегчать», или «облегчающий», относятся к уменьшению по меньшей мере одного показателя, признака или симптома заболевания, нарушения или состояния. Тяжесть показателей может определяться путем субъективных или объективных определений, которые известны специалистам в данной области.

«Животное» относится к человеку или животному, не являющемуся человеком, включая, без ограничения: мышей, крыс, кроликов, собак, кошек, свиней и приматов кроме человека, включая без ограничения обезьян и шимпанзе.

«Антитело» относится к молекуле, для которой характерна способность определенным образом специфически взаимодействовать с антигеном, при этом антитело и антиген определяются относительно друг друга. Обозначение «антитело» может относиться к полной молекуле антитела или к его любому фрагменту или к участку, такому, как тяжелая цепь, легкая цепь, Fab-участок или Fc-участок.

«Антисмысловая активность» обозначает любую доступную для обнаружения или измерения активность, которую можно отнести к гибридизации антисмыслового соединения с его нуклеиновой кислотой-мишенью. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловая активность представляет снижение количества или экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени или белка, кодируемого такой нуклеиновой кислотой-мишенью.

«Антисмысловое вещество» обозначает олигомерное соединение, которое способно претерпевать гибридизацию с нуклеиновой кислотой-мишенью с помощью водородных связей. Примеры антисмысловых соединений включают одноцепочечные и двухцепочечные соединения, такие как антисмысловые олигонуклеотиды, миРНК, мшРНК, оцРНК и вещества, действующие на основе захватывания. Антисмысловые механизмы включают, без ограничения, опосредованный РНКазой H антисмысловой механизм; механизмы интерференции РНК (RNAi), которые используют пути RISC и включают, без ограничения, механизмы с участием миРНК, оцРНК и микроРНК; и механизмы на основе захватывания, включающие, без ограничения, однотипно модифицированные олигонуклеотиды. Определенные антисмысловые соединения могут действовать посредством более, чем одного такого механизма и/или посредством дополнительных механизмов.

«Антисмысловое ингибирование» обозначает снижение уровней нуклеиновой кислоты-мишени или уровней белка-мишени в присутствии антисмыслового соединения комплементарного нуклеиновой кислоте-мишени по сравнению с уровнями нуклеиновой кислоты-мишени или уровнями белка-мишени в отсутствии антисмыслового соединения. Ингибирование может быть обеспечено любыми способами, включая деградацию РНКазой Н, такую как с помощью гэпмера, и стерическую блокировку, такую как с помощью однотипно модифицированного олигонуклеотида.

«Антисмысловой олигонуклеотид» обозначает одноцепочечный олигонуклеотид с последовательностью нуклеотидных оснований, которая допускает гибридизацию с соответствующим сегментом нуклеиновой кислоты-мишени.

«Бициклический сахар» обозначает фуранозильное кольцо, модифицированное образованием мостика между двумя атомами. Бициклический сахар является модифицированным сахаром.

«Бициклический нуклеозид» (также называемый BNA - бициклической нуклеиновой кислотой) обозначает нуклеозид, имеющий сахарный фрагмент, содержащий мостиковое соединение двух атомов углерода сахарного кольца, благодаря чему образуется бициклическая кольцевая система. В некоторых вариантах реализации изобретения этот мостик соединяет 4'-углерод и 2'-углерод сахарного кольца.

«Ассоциированное с C9ORF72 заболевание» обозначает любое заболевание, ассоциированное с любой нуклеиновой кислотой C9ORF72 или продуктом ее экспрессии. Такие заболевания могут включать нейродегенеративное заболевание. Такие нейродегенеративные заболевания могут включать АЛС и ЛВД.

«Ассоциированное с экспансией гексануклеотидного повтора C9ORF72 заболевание» обозначает любое заболевание, связанное нуклеиновой кислотой C9ORF72, содержащей экспансию гексануклеотидного повтора. В некоторых вариантах реализации изобретения эта экспансия гексануклеотидного повтора может содержать последовательности GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC или GGGGCG, повторяющиеся по меньшей мере 30 раз. Такие заболевания могут включать нейродегенеративное заболевание. Такие нейродегенеративные заболевания могут включать АЛС и ЛВД.

«Нуклеиновая кислота C9ORF72» означает любую нуклеиновую кислоту, кодирующую последовательность C9ORF72. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота C9ORF72 содержит последовательность ДНК, кодирующую C9ORF72, последовательность РНК, транскрибирующуюся с ДНК, кодирующей C9ORF72 (включая геномную ДНК, содержащую интроны и экзоны), и последовательность мРНК, кодирующую C9ORF72. «мРНК C9ORF72» означает мРНК, кодирующую белок C9ORF72.

«Специфический ингибитор C9ORF72» относится к любому агенту, способному специфически ингибировать экспрессию мРНК C9ORF72 и/или белка C9ORF72 на молекулярном уровне. Например, специфические ингибиторы C9ORF72 включают нуклеиновые кислоты (включая антисмысловые соединения), миРНК, аптамеры, антитела, пептиды, малые молекулы и другие агенты, способные ингибировать экспрессию мРНК C9ORF72 и/или белка C9ORF72. Аналогичным образом в некоторых вариантах реализации изобретения специфические ингибиторы C9ORF72 могут влиять на другие молекулярные процессы в организме животного.

«Кэп-структура», или «концевой кэп-фрагмент», обозначает химические модификации, которые были внедрены в какой-либо из концов антисмыслового соединения.

«cEt», или «стерически затрудненный этил» обозначает бициклический нуклеозид, несущий сахарный фрагмент, содержащий мостиковое соединение 4'-углерода и 2'-углерода, при этом данный мостик имеет формулу: 4'-СН(CH₃)-O-2'.

«Стерически затрудненный этилнуклеозид» (также обозначаемый cEt-нуклеозид) означает нуклеозид, содержащий бициклический сахарный фрагмент, включающий мостик 4'-СН(СН₃)-O-2'.

«Химически отличающийся участок» относится к участку антисмыслового соединения, который определенным образом химически отличается от другого участка того же антисмыслового соединения. Например, участок, несущий 2'-O-метоксиэтилнуклеозиды, химически отличается от участка, несущего нуклеозиды без 2'-O-метоксиэтил модификаций.

«Химерное антисмысловое соединение» обозначает антисмысловое соединение, которое имеет по меньшей мере два химически отличающихся участка.

«Совместное введение» обозначает введение индивиду двух и более фармацевтических агентов. Эти два или более фармацевтических агентов могут быть представлены в виде одной фармацевтической композиции или могут быть представлены в виде отдельных фармацевтических композиций. Каждый из двух и более фармацевтических агентов могут вводиться посредством одного пути или разными путями введения. Совместное введение охватывает параллельное или последовательное введение.

«Комплементарность» обозначает способность к спариванию между нуклеотидными основаниями первой нуклеиновой кислоты и второй нуклеиновой кислоты.

Термин «последовательные нуклеотидные основания» обозначает нуклеотидные основания, непосредственно соседствующие друг с другом.

«Растворитель» обозначает ингредиент композиции, который не обладает фармакологической активностью, но является фармацевтически необходимым или желательным. В качестве примера, растворитель в композиции для инъекций может быть жидкостью, например, солевой раствор.

«Доза» обозначает установленное количество фармацевтического агента, доставляемого за одно введение или за установленный период времени. В некоторых вариантах реализации изобретения доза может быть введена с одним, двумя или более болюсными введениями, таблетками или инъекциями. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения, когда требуется подкожное введение, а нужная доза должна быть в таком объеме, который не может быть легко достигнут посредством одной инъекции, в таком случае могут использоваться две или более инъекций для достижения необходимых доз. В некоторых вариантах реализации изобретения данный фармацевтический агент вводят путем инфузии в течение продолжительного периода времени или непрерывно. Дозы могут быть заданы как количество фармацевтического агента за час, день, неделю или месяц.

«Эффективное количество» обозначает количество фармацевтического агента, достаточное для того, чтобы вызвать требуемый физиологический результат у индивида, нуждающегося в данном фармацевтическом агенте. Эффективное количество может отличаться у индивидов в зависимости от здоровья и физического состояния индивида, требующего лечения, таксономической группы индивидов, требующих лечения, лекарственной формы композиции, оценки медицинского состояния индивида и других сопутствующих факторов.

«Экспрессия» означает преобразование информации гена C9ORF72 в мРНК посредством транскрипции и затем в белок посредством трансляции. Экспрессия может привести к фенотипическому проявлению гена C9ORF72.

«Полная комплементарность», или «100% комплементарность», обозначает, что каждое нуклеотидное основание первой нуклеиновой кислоты имеет комплементарное нуклеотидное основание на второй нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах реализации изобретения первая нуклеиновая кислота является антисмысловым соединением, а нуклеиновая кислота-мишень является второй нуклеиновой кислотой.

«Гэпмер» обозначает химерное антисмысловое соединение, в котором внутренний участок, содержащий множество нуклеозидов, что обеспечивает расщепление РНКазой Н, расположено между внешними участками, содержащими один или более нуклеозидов, причем эти нуклеозиды, содержащие данный внутренний участок, химически отличаются от нуклеозида или нуклеозидов, содержащихся во внешних участках. Внутренний участок может называться «гэп», а внешние участки могут называться «крылья».

«Уменьшенный гэп» обозначает химерное антисмысловое соединение, содержащее гэп-сегмент из 9 или меньшего количества последовательных 2'-дезоксирибонуклеотидов расположенных между и непосредственно соседствующих с 5'- и 3'-сегментами крыльев, содержащими от 1 до 6 нуклеозидов.

«Расширенный гэп» означает химерное антисмысловое соединение, содержащее гэп-сегмент из 12 или большего количества последовательно 2'-дезоксирибонуклеотидов расположенных между и непосредственно соседствующих с 5'- и 3'-сегментами крыльев, содержащими от 1 до 6 нуклеозидов.

«Экспансия гексануклеотидного повтора» означает наборы из шести оснований (например, GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG или GGGGGC), повторяющиеся по меньшей мере дважды. В некоторых вариантах реализации изобретения такая экспансия гексануклеотидного повтора может быть расположено на интроне 1 нуклеиновой кислоты C9ORF72. В некоторых вариантах реализации изобретения патогенная экспансия гексануклеотидного повтора включает по меньшей мере 30 повторов из GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG или GGGGGC в нуклеиновой кислоте C9ORF72 и связанное с заболеванием. В некоторых вариантах реализации изобретения эти повторы являются последовательными. В некоторых вариантах реализации изобретения эти повторы прерываются 1 или более нуклеотидными основаниями. В некоторых вариантах реализации изобретения экспансия гексануклеотидного повтора дикого типа включает 23 или меньшее количество повторов из GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG или GGGGGC в нуклеиновой кислоте C9ORF72. В некоторых вариантах реализации изобретения эти повторы являются последовательными. В некоторых вариантах реализации изобретения эти повторы прерываются 1 или более количеством нуклеотидными основаниями.

«Гибридизация» обозначает ренатурацию (соединение) молекул комплементарных нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах реализации изобретения молекулы комплементарных нуклеиновых кислот включают антисмысловое соединение и нуклеиновую кислоту-мишень.

«Идентификация животного, пораженного ассоциированным с C9ORF72 заболеванием» указывает на идентификацию животного с диагностированным ассоциированным с белком C9ORF72 заболеванием или предрасположенного к развитию ассоциированного с белком C9ORF72 заболевания. Индивиды, предрасположенные к развитию ассоциированного с C9ORF72 заболевания, включают тех, которые обладают одним и более факторами риска для развития ассоциированного с C9ORF72 заболевания, включая обладающих личной или семейной историей или генетической предрасположенностью к одному или большему количеству ассоциированных с C9ORF72 заболеваний. Такая идентификация может выполняться любым способом, включающим оценку истории болезни индивида и стандартные клинические анализы или обследования, такие как генетическое исследование.

«Непосредственно соседствующий» означает, что между непосредственно соседствующими элементами отсутствуют промежуточные элементы.

«Индивид» указывает на человека или животное кроме человека, выбранное для лечения или оказания терапии.

«Ингибирование C9ORF72» указывает на снижение уровней экспрессии мРНК и/или белка C9ORF72 в присутствии специфического ингибитора C9ORF72, включая антисмысловой олигонуклеотид C9ORF72, по сравнению с уровнями экспрессии мРНК и/или белка C9ORF72 в отсутствии специфического ингибитора C9ORF72, такого как антисмысловой олигонуклеотид C9ORF72.

Термин «межнуклеозидная связь» относится к химической связи между нуклеозидами.

«Связанные нуклеозиды» обозначают соседствующие нуклеозиды, связанные вместе.

Термины «мисмэтч», или «некомплементарное нуклеотидное основание», относятся к случаю, когда нуклеотидное основание первой нуклеиновой кислоты не способно спариваться с соответствующим нуклеотидным основанием второй нуклеиновой кислоты или нуклеиновой кислоты-мишени.

«Модифицированная межнуклеозидная связь» относится к замещению или любому изменению встречающейся в природе межнуклеозидной связи (т.е. фосфодиэфирной межнуклеозидной связи).

«Модифицированное нуклеотидное основание» относится к любому нуклеотидному основанию, отличающемуся от аденина, цитозина, гуанина, тимидина и урацила. «Немодифицированное нуклеотидное основание» означает пуриновые основания: аденин (А) и гуанин (G), и пиримидиновые основания: тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U).

«Модифицированный нуклеотид» обозначает нуклеотид, независимо содержащий модифицированный сахарный фрагмент, модифицированную межнуклеозидную связь или модифицированное нуклеотидное основание. «Модифицированный нуклеозид» означает нуклеозид, независимо содержащий модифицированный сахарный фрагмент и модифицированное нуклеотидное основание.

«Модифицированный олигонуклеотид» обозначает олигонуклеотид, содержащий модифицированную межнуклеозидную связь, модифицированный сахар или модифицированное нуклеотидное основание.

Термин «модифицированный сахар» относится к замещению или изменению в природном сахаре.

«Мотив» указывает на набор химически отличающихся участков в антисмысловом соединении.

«Встречающаяся в природе межнуклеозидная связь» обозначает 3' и 5'-фосфодиэфирную связь.

«Природный сахарный фрагмент» обозначает сахар, обнаруженный в ДНК (2'-Н) или РНК (2'-ОН).

«Нуклеиновая кислота» относится к молекуле, состоящей из мономерных нуклеотидов. Нуклеиновая кислота включает рибонуклеиновые кислоты (РНК), дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), одноцепочечные нуклеиновые кислоты, двухцепочечные нуклеиновые кислоты, малые интерферирующие рибонуклеиновые кислоты (миРНК) и микроРНК (микроРНК).

«Нуклеотидное основание» означает гетероциклический фрагмент, способный спариваться с основанием другой нуклеиновой кислоты.

«Последовательность нуклеотидных оснований» указывает на порядок последовательных нуклеотидных оснований, независимый от любого сахара, связи или модификации нуклеотидных оснований.

«Нуклеозид» обозначает нуклеотидное основание, связанное с сахаром.

«Нуклеозидный миметик» включает такие структуры, которые используются для замещения сахара или сахара и основания и не обязательно связи в одном или более положений олигомерного соединения, такие, как, например, нуклеозидные миметики, содержащие морфолин, циклогексенил, циклогексил, тетрагидропиранил, бицикло- и трициклосахарные миметики, например, нефуранозные сахарные фрагменты. Нуклеотидный миметик включает такие структуры, которые используются для замещения нуклеозида и связи в одном или более положений олигомерного соединения, такие как, например, пептид-нуклеиновые кислоты или морфолины (морфолины связаны с помощью -N(H)-C(=O)-O- или другой нефосфодиэфирной связи). Заместители сахаров перекрываются немного более широким термином нуклеозидного миметика, но подразумевают только указание на замещение сахарного фрагмента (фуранозного кольца). Тетрагидропиранильные кольца, представленные в данном документе, являются иллюстрациями примера заместителя сахара, в котором фуранозная сахарная группа была замещена системой тетрагидропиранильного кольца.

«Нуклеотид» обозначает нуклеозид, несущий фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью данного нуклеозида.

«Олигомерное соединение», или «олигомер», обозначает полимер из связанных субъединиц мономеров, который способен гибридизироваться с по меньшей мере одним участком молекулы нуклеиновой кислоты.

«Олигонуклеотид» означает полимер из связанных нуклеозидов, каждый из которых может быть модифицированным или немодифицированным независимо друг от друга.

«Парентеральное введение» обозначает введение с помощью инъекции или инфузии. Парентеральное введение включает подкожное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, внутриартериальное введение, внутрибрюшинное введение или внутричерепное введение, например, интратекальное или интрацеребровентрикальное введение.

«Пептид» обозначает молекулу, образованную соединением по меньшей мере двух аминокислот амидными связями. Пептид относится к полипептидам и белкам.

«Фармацевтически агент» обозначает субстанцию или субстанции фармацевтической композиции, которая обеспечивает терапевтическую пользу при введении индивиду. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическим агентом является антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на последовательность C9ORF72.

«Фармацевтическая композиция» означает смесь субстанций, пригодных для введения индивиду. Например, фармацевтическая композиция может содержать один или более фармацевтических агентов и стерильный водный раствор.

«Фармацевтически приемлемое производное» охватывает фармацевтически приемлемые соли, конъюгаты, пролекарства или изомеры соединений, описанных в данном документе.

Термин «фармацевтически приемлемые соли» охватывает физиологически и фармацевтически приемлемые соли антисмысловых соединений, т.е. соли, сохраняющие требуемую биологическую активность исходного олигонуклеотида и не обладают в дополнение к ней нежелательным токсикологическим действием.

«Фосфоротиоатная связь» указывает на соединение между нуклеозидами, в котором фосфодиэфирная связь модифицирована замещением одного из немостиковых атомов кислорода атомом серы. Фосфоротиоатная связь (P=S) представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь.

«Часть» обозначает определенное количество последовательных (т.е., связанных) нуклеотидных оснований нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения часть представляет собой определенное количество последовательных нуклеотидных оснований нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения часть представляет собой определенное количество последовательных нуклеотидных оснований антисмыслового соединения.

«Предупреждать», или «предупреждение», относится к замедлению или упреждению проявления или развития заболевания, нарушения или состояния в течение периода времени - от минут до бесконечности. Предупреждение также означает снижение риска развития заболевания, нарушения или состояния.

«Пролекарство» обозначает, что терапевтический агент приготовлен в виде неактивной формы, которая превращается в свою активную форму в организме или в клетках под воздействием эндогенных ферментов или других химических веществ или условий.

Термин «побочные явления» обозначает физиологические реакции, обусловленные лечением, отличные от требуемого действия. В некоторых вариантах реализации изобретения побочные явления включают реакции в месте инъекции, исследуемые нарушения функционирования печени и почек, токсичность для печени и почек, нарушения центральной нервной системы, миопатии и дискомфорт.

«Одноцепочечный олигонуклеотид» указывает на олигонуклеотид, который не гибридизируется с комплементарной цепью.

Термин «способный специфически гибридизироваться» относится к антисмысловому соединению, имеющему достаточную степень комплементарности между антисмысловым олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью для индуцирования требуемого действия, при этом проявляя минимальное или отсутствие влияния на нецелевые нуклеиновые кислоты в условиях, требующих достичь специфического связывания, т.е. в физиологических условиях в случае проведения анализов in vivo и при терапевтических воздействиях.

«Нацеливание», или «целевой», обозначает процесс конструирования и выбора антисмыслового соединения, которое будет специфически гибридизироваться с нуклеиновой кислотой-мишенью и индуцировать требуемое действие.

Термины «нуклеиновая кислота-мишень», «РНК-мишень» и «транскрипт РНК-мишени» все относятся к нуклеиновым кислотам, способным быть мишенями для антисмысловых соединений.

«Сегмент-мишень» означает последовательность нуклеотидов нуклеиновых кислот-мишеней, на которую нацелено антисмысловое соединение. «Сайт-мишень 5'» относится к самому крайнему нуклеотиду с 5'-конца сегмента-мишени. «Сайт-мишень 3'» относится к самому крайнему нуклеотиду с 3'-конца сегмента-мишени.

«Терапевтически эффективное количество» обозначает количество фармацевтического агента, которое обеспечивает терапевтическую пользу для индивида.

Термин «лечить», или «лечение», относится к введению фармацевтической композиции с целью вызвать изменение или улучшение течения заболевания, нарушения или состояния.

«Немодифицированный нуклеотид» обозначает нуклеотид, который состоит из встречающихся в природе нуклеотидных оснований, сахарных фрагментов и межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения немодифицированный нуклеотид является нуклеотидом РНК (т.е. β-D-рибонуклеозиды) или нуклеотидом ДНК (т.е.β-D-дезоксирибонуклеозиды).

Некоторые варианты реализации изобретения

Некоторые варианты реализации изобретения предлагают способы снижения экспрессии мРНК и белка C9ORF72.

Некоторые варианты реализации изобретения предлагают способы лечения, предупреждения или облегчения заболеваний, нарушений и состояний, ассоциированных с C9ORF72, у индивида, нуждающегося в таком воздействии. Подразумеваются также способы получения лекарственного средства для лечения, предупреждения или облегчения заболевания, нарушения и состояния, ассоциированного с C9ORF72. Ассоциированные с белком C9ORF72 заболевания, нарушения и условия включают нейродегенеративные заболевания. В некоторых вариантах реализации изобретения нейродегенеративное заболевание может быть АЛС или ЛВД. В некоторых вариантах реализации изобретения нейродегенеративное заболевание может быть наследственным или спорадическим.

Некоторые варианты реализации изобретения предлагают применение специфического ингибитора C9ORF72 для лечения, предупреждения или облегчения ассоциированного с белком C9ORF72 заболевания. Некоторые варианты реализации изобретения предлагают применение специфического ингибитора C9ORF72 для лечения, предупреждения или облегчения ассоциированного с экспансией гексануклеотидного повтора C9ORF72 заболевания. В некоторых вариантах реализации изобретения эта экспансия гексануклеотидного повтора может содержать последовательности GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC или GGGGCG. В некоторых вариантах реализации изобретения специфические ингибиторы C9ORF72 представляют собой нуклеиновые кислоты (включая антисмысловые соединения), пептиды, антитела, малые молекулы и другие агенты, способные ингибировать экспрессию мРНК C9ORF72 и/или белка C9ORF72.

Описанные в данном документе ингибиторы представляют собой соединения, содержащие одноцепочечные антисмысловые олигонуклеотиды комплементарные нуклеиновой кислоте C9ORF72 или гомологу нуклеиновой кислоты C9ORF72.

В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота C9ORF72 является нуклеиновой кислотой C9ORF72 человека.

В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота C9ORF72 содержит экспансию гексануклеотидного повтора.

В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота C9ORF72 не содержит экспансию гексануклеотидного повтора.

В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид способен специфически гибридизироваться с нуклеиновой кислотой C9ORF72 человека.

В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид является по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% комплементарным части нуклеиновой кислоты C9ORF72 человека равной длины.

В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид является комплементарным любому экзону, интрону, 5'-нетраслируемому участку, 3'-нетраслируемому участку, участку повтора, точке сплайсинга, точке сплайсинга экзон: экзон, сайленсеру экзонного сплайсинга (ESS), энхансеру экзонного сплайсинга (ESE), экзону 1а, экзону 1b, экзону 1с, экзону 1d, экзону 1e, экзону 2, экзону 3, экзону 4, экзону 5, экзону 6, экзону 7, экзону 8, экзону 9, экзону 10, экзону 11, интрону 1, интрону 2, интрону 3, интрону 4, интрону 5, интрону 6, интрону 7, интрону 8, интрону 9 или интрону 10 нуклеиновой кислоты C9ORF72 человека.

Описанные в данном документе олигонуклеотиды представляют собой соединения, которые содержат одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов и содержащий последовательность нуклеотидных оснований, включающих по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 последовательных нуклеотидных оснований последовательностей SEQ ID NO: 30-369.

В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модификацию.

В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения каждая межнуклеозидная связь одноцепочечного антисмыслового олигонуклеотида является модифицированной межнуклеозидной связью.

В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированная межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной межнуклеозидной связью.

В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеозид.

В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеозид, несущий модифицированный сахар.

В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеозид, содержащий бициклический сахар.

В некоторых вариантах реализации изобретения бициклический сахар содержит мостик 4'-2', выбранный из: мостика 4'-(СН₂)_n-O-2', где n равно 1 или 2; и 4'-СН₂-O-СН₂-2'.

В некоторых вариантах реализации изобретения бициклический сахар содержит мостик 4'-СН(CH₃)-O-2'.

В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один модифицированный нуклеозид, несущий модифицированный сахар, содержит небициклический 2'-модифицированный сахарный фрагмент.

В некоторых вариантах реализации изобретения 2'-модифицированный сахарный фрагмент содержит 2'-O-метоксиэтильную группу.

В некоторых вариантах реализации изобретения 2'-модифицированный сахарный фрагмент содержит 2'-O-метильную группу.

В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один модифицированный нуклеозид, несущий модифицированный сахар, содержит заместитель сахара.

В некоторых вариантах реализации изобретения заместитель сахара является морфолином.

В некоторых вариантах реализации изобретения заместитель сахара является пептид-нуклеиновой кислотой.

В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид является модифицированным.

В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид содержит по меньшей мере одно модифицированное нуклеотидное основание.

В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированное нуклеотидное основание является 5'-метилцитозином.

В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид содержит:

гэп-сегмент, состоящий из связанных дезоксинуклеозидов;

сегмент 5'-крыла, состоящий из связанных нуклеозидов;

сегмент 3'-крыла, состоящий из связанных нуклеозидов;

при этом данный гэп-сегмент расположен непосредственно соседствующим с или расположен между сегментом 5'-крыла и сегментом 3'-крыла, причем каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит модифицированный сахар.

В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид содержит:

гэп-сегмент, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;

сегмент 5'-крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов;

сегмент 3'-крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов;

при этом данный гэп-сегмент расположен непосредственно соседствующим с или расположен между сегментом 5'-крыла и сегментом 3'-крыла, причем каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтильный сахар; и в котором каждая межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной связью.

В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид состоит из 15 связанных нуклеозидов.

В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид состоит из 16 связанных нуклеозидов.

В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид состоит из 17 связанных нуклеозидов.

В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид состоит из 18 связанных нуклеозидов.

В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид состоит из 19 связанных нуклеозидов.

В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов.

В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид состоит из 21 связанного нуклеозида.

В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид состоит из 22 связанных нуклеозидов.

В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид состоит из 23 связанных нуклеозидов.

В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид состоит из 24 связанных нуклеозидов.

В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид состоит из 25 связанных нуклеозидов.

В настоящем документе описаны применения данного соединения в производстве лекарственного средства для лечения нейродегенеративного заболевания.

В данном документе предложены способы преимущественного ингибирования экспрессии транскриптов мРНК, содержащих экспансию гексануклеотидного повтора, путем обеспечения контакта клетки с антисмысловым олигонуклеотидом, нацеленным на экзон 1B в обратном направлении считывания.

Антисмысловые соединения

Олигомерные соединения включают, без ограничения: олигонуклеотиды, олигонуклеозиды, аналоги олигонуклеотидов, миметики олигонуклеотидов, антисмысловые соединения, антисмысловые олигонуклеотиды и миРНК. Олигомерное соединение может быть антисмысловым к нуклеиновой кислоте-мишени, что указывает на то, что оно способно претерпевать гибридизацию с нуклеиновой кислотой-мишенью с помощью водородных связей.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение имеет такую последовательность нуклеотидных оснований, которая записана в направлении 5'-3' и содержит обратно комплементарный фрагмент к сегменту-мишени нуклеиновой кислоты-мишени, на которую это соединение нацелено. В некоторых таких вариантах реализации изобретения антисмысловой олигонуклеотид имеет такую последовательность нуклеотидных оснований, которая записана в направлении 5'-3' и содержит обратно комплементарный фрагмент к сегменту-мишени нуклеиновой кислоты-мишени, на которую этот олигонуклеотид нацелен.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту C9ORF72, состоит в длину из 12-30 субъединиц. Другими словами, такие антисмысловые соединения состоят из 12-30 связанных субъединиц. В некоторых вариантах реализации изобретения данное антисмысловое соединение состоит из 8-80, 12-50, 15-30, 18-24, 19-22 или 20 связанных субъединиц. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения состоят в длину из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 связанных субъединиц и имеют диапазон длин, определенных любыми двумя из указанных выше значений. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение является антисмысловым олигонуклеотидом, а связанные субъединицы представляют собой нуклеозиды.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72, могут быть укороченные или усеченные. Например, может быть удалена одна субъединица с 5'-конца (5'-усечение) или в альтернативном варианте - с 3'-конца (3'-усечение). Укороченное или усеченное антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту C9ORF72, может иметь две субъединицы, удаленные с 5'-конца антисмыслового соединения или в альтернативном варианте иметь две субъединицы, удаленные с 3'-конца. В альтернативном варианте удаленные нуклеозиды могут быть распределены по всему антисмысловому соединению, например, в антисмысловом соединении имеется один удаленный нуклеозид с 5'-конца и один удаленный нуклеозид с 3'-конца.

Когда одна дополнительная субъединица присутствует в удлиненном антисмысловом соединении, то эта дополнительная субъединица может быть расположена на 5'- или 3'-конце антисмыслового соединения. Когда присутствуют две или более субъединиц, то эти добавленные субъединицы могут соседствовать друг с другом, например в антисмысловом соединении, имеющем две субъединицы, добавленные к 5'-концу (5'-добавление) или в альтернативном варианте- к 3'-концу (3'-добавление) данного антисмыслового соединения.

В альтернативном вариантедобавленные субъединицы могут быть распределены по всему антисмысловому соединению, например в антисмысловом соединении имеется одна добавленная субъединица к 5'-концу и одна добавленная субъединица к 3'-концу.

Можно увеличить или уменьшить длину антисмыслового соединения, такого как антисмысловой олигонуклеотид, и/или внедрить некомплементарные основания без исчезновения активности. Так, в статье Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7305-7309, 1992) наборы антисмысловых олигонуклеотидов длиной 13-25 нуклеотидных оснований исследовали на их способность индуцировать расщепление РНК-мишени в модели с инъецированием ооцитов. Антисмысловые олигонуклеотиды длиной 25 нуклеотидных оснований с 8 или 11 некомплементарными основаниями возле концов этих антисмысловых олигонуклеотидов были способны непосредственно специфически расщеплять мРНК-мишень, хоть и в меньшей степени, чем антисмысловые олигонуклеотиды, которые не содержали некомплементарные основания. Аналогичным образомспецифическое расщепление мишени было достигнуто с использованием антисмысловых олигонуклеотидов размером 13 нуклеотидных оснований, включая те, которые несли 1 или 3 некомплементарные основания.

В статье Gautschi et al (J. Natl. Cancerlnst. 93: 463-471, March 2001) продемонстрирована способность олигонуклеотида, имеющего 100% комплементарность к мРНК bcl-2 и несущего 3 некомплементарных основания к мРНК bcl-xL, снижать экспрессию как гена bcl-2, так и bcl-xL в условиях in vitro и in vivo. Более того, этот олигонуклеотид продемонстрировал сильную противоопухолевую активность in vivo.

Авторами Maher и Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16: 3341-3358, 1988) проверены наборы тандемных антисмысловых олигонуклеотидов из 14 нуклеотидных оснований и антисмысловых олигонуклеотидов из 28 и 42 нуклеотидных оснований, содержащих последовательность из двух или трех тандемных антисмысловых олигонуклеотидов, соответственно, относительно их способности подавлять трансляцию дегидрофолатредуктазы (DHFR) человека при анализе на ретикулоцитах кролика. Каждый из этих трех антисмысловых олигонуклеотидов размером 14 нуклеотидных оснований сам по себе был способен ингибировать трансляцию, хоть и в более ограниченной степени, чем антисмысловые олигонуклеотиды размером 28 и 42 нуклеотидных оснований.

Мотивы антисмысловых соединений

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72, несут химически модифицированные субъединицы, сгруппированные в наборы, или мотивы, для того, чтобы придать антисмысловым соединениям свойства, такие как усиленная ингибирующая активность, повышенная аффинность связывания нуклеиновой кислоты-мишени или устойчивость к деградации нуклеазами in vivo.

Химерные антисмысловые соединения, как правило, содержат по меньшей мере один участок, модифицированный так, чтобы придать повышенную устойчивость к деградации нуклеазами, повышенное поглощение клетками, повышенную аффинность связывания нуклеиновой кислоты-мишени и/или повышенную ингибирующую активность. Второй участок химерного антисмыслового соединения произвольно может служить субстратом для клеточной эндонуклеазы - РНКазы Н, которая расщепляет нить РНК в дуплексе РНК:ДНК.

Антисмысловые соединения, содержащие гэпмер-мотив, считают химерными антисмысловыми соединениями. В гэпмере внутренний участок, несущий множество нуклеотидов, которые обеспечивают расщепление РНКазой Н, расположен между внешними участками, имеющими множество нуклеотидов, которые химически отличаются от нуклеозидов внутреннего участка. В том случае, если антисмысловой олигонуклеотид несет гэпмер-мотив, то гэп-сегмент, как правило, служит в качестве субстрата для расщепления эндонуклеазами, тогда как сегменты-крылья содержат модифицированные нуклеозиды. В некоторых вариантах реализации изобретения участки гэпмера дифференциируются по типам сахарных фрагментов, каждый из которых содержит отличающийся участок. Типы сахарных фрагментов, которые используются для дифференциации участков гэпмера, в некоторых вариантах реализации могут включать β-D-рибонуклеозиды, β-D-дезоксирибонуклеозиды, 2'-модифицированные нуклеозиды (2'-модифицированные нуклеозиды могут включать среди прочих варианты 2'-МОЕ и 2'-O-CH₃) и модифицированные бициклическим сахаром нуклеозиды (такие модифицированные бициклическим сахаром нуклеозиды могут включать те, которые содержат мостик 4'-(CH₂)_n-O-2', где n=1 или n=2, и 4'-СН₂-O-СН₂-2'). Предпочтительно, чтобы каждый отдельный участок содержал однотипные сахарные фрагменты. Мотив крыло-гэп-крыло часто описывают как «X-Y-Z», где X представляет длину участка 5'-крыла, Y представляет длину гэп-участка, a Ζ представляет длину участка 3'-крыла. В данном документе считается, что гэпмер, описываемый как «Х-Y-Z», содержит в себе такую конфигурацию, что гэп-сегмент расположен непосредственно соседствующим с каждым сегментом 5'-крыла и сегментом 3'-крыла. Таким образом, не существует промежуточных нуклеотидов между сегментом 5'-крыла и гэп-сегментом или гэп-сегментом и сегментом 3'-крыла. Любое из антисмысловых соединений, описанных в данном документе, может содержать гэпмер-мотив. В некоторых вариантах реализации изобретения значения X и Ζ равны, в других вариантах они разные. В предпочтительном варианте реализации значение Y находится между 8 и 15 нуклеотидами. Значения Χ, Y или Ζ могут быть любыми из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 или более нуклеотидов. Поэтому гэпмеры, описанные в данном документе, включают, без ограничения, соотношения, например: 5-10-5, 5-10-4, 4-10-4, 4-10-3, 3-10-3, 2-10-2, 5-9-5, 5-9-4, 4-9-5, 5-8-5, 5-8-4, 4-8-5, 5-7-5, 4-7-5, 5-7-4 или 4-7-4.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение имеет мотив «крыломер» с конфигурацией крыло-гэп или гэп-крыло, т.е. конфигурацию Χ-Υ или Υ-Ζ, как описано выше для конфигурации гэпмера. Таким образом, конфигурации гэпмера, описанные в данном документе, включают, без ограничения, например, соотношения: 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13, 5-13, 5-8 или 6-8.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72, содержат мотив гэпмера 5-10-5.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72, содержат мотив гэпмера 5-10-4.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72, содержат мотив гэпмера 4-10-4.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72, содержат мотив гэпмера 4-10-3.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72, содержат мотив гэпмера 5-9-5.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту C9ORF72, имеет мотив с уменьшенным гэпом. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловой олигонуклеотид с уменьшенным гэпом, нацеленный на нуклеиновую кислоту C9ORF72, несет гэп-сегмент из 9, 8, 7 или 6 2'-дезоксирибонуклеотидов, расположенных непосредственно с соседствующими с или между сегментами-крыльями из 5, 4, 3, 2 или 1 химически модифицированного нуклеозида. В некоторых вариантах реализации изобретения химическая модификация включает бициклический сахар. В некоторых вариантах реализации изобретения бициклический сахар содержит мостик 4'-2', выбранный из: мостика 4'-(СН₂)_n-O-2', где n равен 1 или 2, и 4'-СН₂-O-СН₂-2'. В некоторых вариантах реализации изобретения бициклический сахар содержит мостик 4'-СН(CH₃)-O-2'. В некоторых вариантах реализации изобретения химическая модификация содержит небициклический 2'-модифицированный сахарный фрагмент. В некоторых вариантах реализации изобретения небициклический 2'-модифицированный сахарный фрагмент содержит 2'-O-метилэтильную группу или 2'-O-метильную группу.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту C9ORF72, модифицировано однотипным способом. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение содержит 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый из нуклеозидов является химически модифицированным. В некоторых вариантах реализации изобретения химическая модификация содержит небициклический 2'-модифицированный сахарный фрагмент. В некоторых вариантах реализации изобретения 2'-модифицированный сахарный фрагмент содержит 2'-O-метоксиэтильную группу. В некоторых вариантах реализации изобретения 2'-модифицированный сахарный фрагмент содержит 2'-O-метильную группу. В некоторых вариантах реализации изобретения однотипно модифицированные антисмысловые соединения могут нацеливаться на C9ORF72 или на ее любую часть, такую как экспансия гексануклеотидного повтора. В некоторых вариантах реализации изобретения, нацеливание однотипно модифицированного антисмыслового соединением на экспансию гексануклеотидного повтора снижает синтез повторов РНК путем блокирования взаимодействия с белками, связывающими РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения это приводит к отсутствию токсичной РНК в фокусах ядер, которая вместо этого разрушается.

Нуклеиновые кислоты-мишени, участки-мишени и нуклеотидные последовательности

Нуклеотидные последовательности, которые кодируют белок C9ORF72, включают, без ограничения, следующие: комплементарные последовательности с № доступа в базе данных GENBANK NM 001256054.1 (включена в данный документ как SEQ ID NO: 1), № доступа в базе данных GENBANK NT 008413.18, усеченная от нуклеотидного основания 27535000 до 27565000 (включена в данный документ как SEQ ID NO: 2), № доступа в базе данных GENBANK BQ068108.1 (включена в данный документ как SEQ ID NO: 3), № доступа в базе данных GENBANK NM 018325.3 (включена в данный документ как SEQ ID NO: 4), № доступа в базе данных GENBANK DN993522.1 (включена в данный документ как SEQ ID NO: 5), № доступа в базе данных GENBANK NM 145005.5 (включена в данный документ как SEQ ID NO: 6), № доступа в базе данных GENBANK DB079375.1 (включена в данный документ как SEQ ID NO: 7), № доступа в базе данных GENBANK BU 194591.1 (включена в данный документ как SEQ ID NO: 8), идентификатор последовательности 4141014 А (включена в данный документ как SEQ ID NO: 9) и идентификатор последовательность 4008 73 А (включена в данный документ как SEQ ID NO: 10).

Последовательность, описанная под каждым из SEQ ID NO в Примерах, содержащихся в данном документе, не зависит от любой модификации сахарного фрагмента, межнуклеозидной связи или нуклеотидного основания. Как таковое антисмысловое соединение, определенное SEQ ID NO, независимо может содержать одну или более модификаций сахарного фрагмент, межнуклеозидной связи или нуклеотидного основания. Антисмысловые соединения, описанные под номером Isis (№ Isis - нумерация компании Isis Pharmaceutical), указывают на комбинацию последовательности нуклеотидных оснований и мотива.

В некоторых вариантах реализации изобретения участок-мишень представляет собой структурно определенный участок нуклеиновой кислоты-мишени. Например, участок-мишень может охватывать 3'-нетранслируемый участок, 5'-нетранслируемый участок, экзон, интрон, соединение экзона/интрона, кодирующий участок, участок инициации трансляции, участок терминации трансляции или другой определенный участок нуклеиновой кислоты. Структурно определенные участки C9ORF72 могут быть получены по номеру доступа из баз данных последовательностей, таких как NCBI, и такая информация внесена в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации изобретения участок-мишень может охватывать последовательность от сайта-мишени 5' одного сегмента-мишени в пределах участка-мишени до сайта-мишени 3' другого сегмента-мишени в пределах такого же участка-мишени.

Нацеливание включает определение по меньшей мере одного сегмента-мишени, с которым гибридизируется антисмысловое соединение, вследствие чего проявляется требуемое действие. В некоторых вариантах реализации изобретения требуемое действие заключается в снижении уровней мРНК нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения требуемое действие заключается в снижении уровней белка, кодируемого нуклеиновой кислотой-мишенью, или фенотипическом изменении, ассоциированным с нуклеиновой кислотой-мишенью.

Участок-мишень может содержать один или более сегментов-мишеней. Множество сегментов-мишеней в пределах участка-мишени могут быть перекрывающимися. В альтернативном варианте они могут быть неперекрывающимися. В некоторых вариантах реализации изобретения сегменты-мишени в пределах участка-мишени разделены не более чем около 300 нуклеотидами. В некоторых вариантах реализации изобретения сегменты-мишеней в пределах участка-мишени разделены количеством нуклеотидов, которое равно, равно около, равно не более чем, равно не более чем около 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 10 нуклеотидам на нуклеиновой кислоте-мишени или является диапазоном, определенным любым из двух предыдущих значений. В некоторых вариантах реализации изобретения сегменты-мишени в пределах участка-мишени разделены не более чем или не более чем около 5 нуклеотидами на нуклеиновой кислоте-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения сегменты-мишени являются последовательными. Подразумеваются участки-мишени, определенные диапазоном, содержащим инициирующую нуклеиновую кислоту, которая является любым из сайтов-мишеней 5' или сайтов-мишеней 3', перечисленных в данном документе.

Подходящие сегменты-мишени могут быть найдены в пределах 5'-нетранслируемого участка, 3'-нетранслируемого участка, интрона, экзона, соединения экзона/интрона. Сегменты-мишени, содержащие инициирующий ко дон или терминирующий ко дон также являются подходящими в качестве сегментов-мишеней. Подходящий сегмент-мишень может специально исключать обозначенный структурно определенный участок, такой как инициирующий кодон или терминирующий кодон.

Установление подходящих сегментов-мишеней предполагает сравнение последовательности нуклеиновой-кислоты мишени с другими последовательностями всего генома. Например, алгоритм BLAST может использоваться для идентификации участков сходства среди разных нуклеиновых кислот. Это сравнение может предотвратить выбор последовательностей антисмысловых соединений, которые могут неспецифическим путем гибридизироваться с последовательностями, отличающимися от выбранной нуклеиновой кислоты-мишени (т.е. нецелевыми или нечетко целевыми последовательностями).

Существуют вариации активности (например, которые определяют по проценту снижения уровней нуклеиновых кислот-мишеней) антисмысловых соединений в пределах участка-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения снижения уровней мРНК C9ORF72 указывают на ингибирование экспрессии C9ORF72. Уменьшение уровней белка C9ORF72 указывает также на ингибирование экспрессии мРНК-мишени. Уменьшение фокусов в присутствии удлиненной РНК C9ORF72 указывает на ингибирование экспрессии C9ORF72. Дополнительно на ингибирование экспрессии C9ORF72 указывают фенотипические изменения. Например, улучшенные двигательная функция и дыхание могут указывать на ингибирование экспрессии C9ORF72.

Гибридизация

В некоторых вариантах реализации изобретения гибридизация происходит между антисмысловым соединением, описанным в данном документе, и нуклеиновой кислотой C9ORF72. Наиболее распространенный механизм гибридизации вовлекает водородные связи (например, водородные связи по Уотсону-Крику, Хугстину или обращенные связи по Хугстину) между комплементарными нуклеотидными основаниями молекул нуклеиновых кислот.

Гибридизация может проходить в различных условиях. Жесткие условия зависят от последовательности и определяются природой и составом молекул нуклеиновых кислот, требующих гибридизации.

Способы определения того, способна ли последовательность специфически гибридизироваться с нуклеиновой кислотой-мишенью, хорошо известны в данной области. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, предложенные в данном документе, способны специфически гибридизироваться с нуклеиновой кислотой C9ORF72.

Комплементарность

Антисмысловое соединение и нуклеиновая кислота-мишень комплементарны друг другу, если достаточное количество нуклеотидных оснований антисмыслового соединения может образовать водородную связь с соответствующими нуклеотидными основаниями нуклеиновой кислоты-мишени так, что будет проявляться требуемое действие (например, антисмысловое ингибирование нуклеиновой кислоты-мишени, такой, как нуклеиновой кислоты C9ORF72).

Некомплементарные нуклеотидные основания между антисмысловым соединением и нуклеиновой кислотой C9ORF72 могут быть приемлемыми при условии, что данное антисмысловое соединение остается способным специфически гибридизироваться с нуклеиновой кислотой-мишени. Более того, антисмысловое соединение может гибридизироваться на протяжении одного или более сегментов нуклеиновой кислоты C9ORF72 так, что промежуточные или соседствующие сегменты не вовлекаются в это гибридизационное событие (например, петлевая структура, некомплементарная или шпильковая структура).

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, представленные в данном документе, или их определенная часть, являются или по меньшей мере являются на 70, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% комплементарными нуклеиновой кислоте C9ORF72, сегменту-мишени или их определенной части. Процент комплементарности антисмыслового соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью может быть определен с использованием традиционных способов.

Например, антисмысловое соединение, в котором 18 из 20 нуклеотидных оснований антисмыслового соединения являются комплементарными участку-мишени, и поэтому может специфически гибридизироваться, будет представлять комплементарность на 90%. В этом примере оставшиеся некомплементарные нуклеотидные основания могут быть собраны в кластеры или рассеяны с комплементарными нуклеотидными основаниями и не требуют последовательного расположения друг к другу или к комплементарным нуклеотидным основаниям. Как таковоеантисмысловое соединение, которое содержит в длину 18 нуклеотидных оснований, имеющее 4 (четыре) некомплементарных нуклеотидных оснований, которые фланкированы двумя участками с полной комплементарностью к нуклеиновой кислоте-мишени, может иметь 77,8% общей комплементарности с нуклеиновой кислотой-мишенью, и поэтому должно попадать в пределы объема настоящего изобретения. Процент комплементарности антисмыслового соединения с участком нуклеиновой кислоты-мишени может быть определен традиционным способом с использованием программ BLAST (основные инструменты исследования для локального выравнивания) и программ Power BLAST, известных в данной области (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215,403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). Процент гомологии, идентичность последовательностей или комплементарность, могут быть определены, например, программой Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), используя установки по умолчанию, которая применяет алгоритм Смита и Уотермана (Adv. Appl. Math., 1981, 2,482489).

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, представленные в данном документе, или их определенные части, являются полностью комплементарными (т.е. на 100% комплементарными) нуклеиновой кислоте-мишени или ее определенной части. Например, антисмысловое соединение может быть полностью комплементарным нуклеиновой кислоте C9ORF72, или участку-мишени, или сегменту-мишени или ее последовательности-мишени. В данном документе считается, что «полностью комплементарный» обозначает, что каждое нуклеотидное основание антисмыслового соединения способно к точному спариванию оснований с соответствующими нуклеотидными основаниями нуклеиновой кислоты-мишени. Например, антисмысловое соединение размером 20 нуклеотидных оснований является полностью комплементарным последовательности-мишени, которая в длину составляет 400 нуклеотидных оснований, поскольку имеется соответствующая часть из 20 нуклеотидных оснований нуклеиновой кислоты-мишени, которая полностью комплементарна данному антисмысловому соединению. Полная комплементарность также может быть использована в сравнении с определенной частью первой и/или второй нуклеиновой кислоте. Например, часть размером 20 нуклеотидных оснований антисмыслового соединение размером 30 нуклеотидных оснований может быть полностью комплементарной последовательности-мишени, которая в длину составляет 400 нуклеотидных оснований. Часть размером 20 нуклеотидных оснований антисмыслового соединение размером 30 нуклеотидных оснований полностью комплементарна последовательности-мишени, если последовательность-мишень имеет соответствующую часть размером 20 нуклеотидных оснований, в которой каждое нуклеотидное основание является комплементарным части размером 20 нуклеотидных оснований этого антисмыслового соединения. В то же время целое антисмысловое соединение размером 30 нуклеотидных оснований может или не может быть полностью комплементарным последовательности-мишени, в зависимости от того, комплементарны ли также оставшиеся 10 нуклеотидных оснований антисмыслового соединения последовательности-мишени.

Размещение некомплементарного нуклеотидного основания может находиться на 5'-конце или 3'-конце данного антисмыслового соединения. В альтернативном варианте некомплементарное нуклеотидное основание или нуклеотидные основания могут находиться в антисмысловом соединении во внутреннем положении. Когда присутствуют два или более некомплементарных нуклеотидных оснований, они могут быть последовательными (т.е. связанными) или непоследовательными. В одном варианте реализации изобретения некомплементарное нуклеотидное основание расположено на сегменте-крыле гэпмера антисмыслового олигонуклеотида.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, которые в длину составлены из или составлены из вплоть до 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидных оснований, содержат не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 некомплементного(ых) нуклеотидного(ых) основания(ий) по сравнению с нуклеиновой кислотой-мишенью, такой, как нуклеиновая кислота C9ORF72, или ее определенной частью.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, которые в длину составлены из или составлены из вплоть до 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидных оснований, содержат не более 6, не более 5, не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 некомплементного(ых) нуклеотидного(ых) основания(ий) по сравнению с нуклеиновой кислотой-мишенью, такой, как нуклеиновая кислота C9ORF72, или ее определенной частью.

Антисмысловые соединения, предложенные в данном документе, также содержат те, которые комплементарны части нуклеиновой кислоты-мишени. В данном документе считается, что «часть» относится к определенному количеству последовательных (т.е. связанных) нуклеотидных оснований в пределах участка или сегмента нуклеиновой кислоты-мишени. «Часть» может также относиться к определенному количеству последовательных нуклеотидных оснований антисмыслового соединения. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения являются комплементарными по меньшей мере части сегмента-мишени размером 8 нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения являются комплементарными по меньшей мере части сегмента-мишени размером 9 нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения являются комплементарными по меньшей мере части сегмента-мишени размером 10 нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения являются комплементарными по меньшей мере части сегмента-мишени размером 11 нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения являются комплементарными по меньшей мере части сегмента-мишени размером 12 нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения являются комплементарными по меньшей мере части сегмента-мишени размером 13 нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения являются комплементарными по меньшей мере части сегмента-мишени размером 14 нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения являются комплементарными по меньшей мере части сегмента-мишени размером 15 нуклеотидных оснований. Подразумеваются также антисмысловые соединения, которые комплементарны части из по меньшей мере 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более нуклеотидных оснований сегменту-мишени или из диапазона, определенного любыми двумя из этих значений.

Идентичность

Антисмысловые соединения, предложенные в данном документе, также могут иметь определенный процент идентичности с конкретной нуклеотидной последовательностью, SEQ ID NO, или соединением, представленным специальным номером Isis, или его частью. В данном документе считается, что антисмысловое соединение является идентичным последовательности, описанной в данном документе, если оно имеет такую же способность к спариванию нуклеотидных оснований. Например, РНК, которая в описанной последовательности ДНК содержит урацил вместо тимидина, будет считаться идентичной последовательности ДНК, поскольку и урацил и тимидин образуют пару с аденином. Подразумеваются также укороченные и удлиненные версии антисмысловых соединений, описанные в данном документе, а также соединения, имеющие неидентичные основания по сравнению с антисмысловыми соединениями, описанными в данном документе. Неидентичные основания могут соседствовать друг с другом или быть распределенными по всему антисмысловому соединению. Процент идентичности антисмыслового соединения рассчитывают в соответствии с количеством соединений, которые имеют идентичное спаривание оснований по сравнению с последовательностью, с которой оно сопоставляется.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения или их части являются или по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичными одному или большему количеству антисмысловых соединений или последовательностям SEQ ID NO, или их частям, описанным в данном документе.

В некоторых вариантах реализации изобретения часть антисмыслового соединения сравнивается с частью равной длины нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения часть размером 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидных оснований сравнивается с частью равной длины нуклеиновой кислоты-мишени.

В некоторых вариантах реализации изобретения часть антисмыслового олигонуклеотида сравнивается с частью равной длины нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения часть размером 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидных оснований сравнивается с частью равной длины нуклеиновой кислоты-мишени.

Модификации

Нуклеозид представляет собой комбинацию основания-сахара. Часть нуклеотидного основания (известного как основание) нуклеозида обычно является фрагментом гетероциклического основания. Нуклеотиды являются нуклеозидами, которые дополнительно содержатфосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида. Для тех нуклеозидов, которые включают пентофуранозильный сахар, фосфатная группа может быть присоединена к 2', 3' или 5'-гидроксильному фрагменту сахара. Олигонуклеотиды образуются посредством ковалентного связывания соседствующих друг с другом нуклеозидов с образованием линейного полимерного олигонуклеотида. В пределах олигонуклеотидной структуры фосфатные группы обычно считаются образующими межнуклеозидные связи данного олигонуклеотида.

Модификации антисмысловых соединений охватывают замены или изменения межнуклеозидных связей, сахарных фрагментов или нуклеотидных оснований. Модифицированные антисмысловые соединения часто преобладают над природными формами, потому что обладают требуемыми свойствами, такими, как, например, усиленное поглощение клетками, усиленная аффинность к нуклеиновой кислоте-мишени, повышенная стабильность в присутствии нуклеаз или повышенная ингибиторная активность.

Химически модифицированные нуклеозиды могут применяться и для увеличения аффинности связывания укороченного или усеченного антисмыслового олигонуклеотида с нуклеиновой кислотой-мишенью. Следовательно, сопоставимые результаты часто могут быть получены с более короткими антисмысловыми соединениями, которые несут такие химически модифицированные нуклеозиды.

Модифицированные межнуклеозидные связи

Встречающаяся в природе межнуклеозидная связь РНК и ДНК представляет собой 3' 5' фосфодиэфирную связь. Антисмысловые соединения, содержащие одну или более модифицированных, такие, что не встречаются в природе, межнуклеозидных связей чаще выбираются для антисмысловых соединений, содержащих встречающиеся в природе межнуклеозидные связи, потому что обладают требуемыми свойствами, такими,как, например, усиленное поглощение клетками, усиленная аффинность к нуклеиновым кислотам-мишеням и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз.

Олигонуклеотиды, имеющие модифицированные межнуклеозидные связи, включают межнуклеозидные связи, которые сохраняют атом фосфора, а также межнуклеозидные связи, которые не содержат атом фосфора. Межнуклеозидные связи, содержащие типичный фосфор, включают без ограничения, фосфодиэфиры, фосфотриэфиры, метилфосфонаты, фосфорамидат и фосфоротиоаты. Способы получения содержащих фосфор и несодержащих фосфор связей хорошо известны.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72, содержат одну или более модифицированных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированные межнуклеозидные связи являются рассеянными по всему антисмысловому соединению. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированные межнуклеозидные связи являются фосфоротиоатными связями. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая межнуклеозидная связь антисмыслового соединения является фосфоротиоатной межнуклеозидной связью.

Модифицированные сахарные фрагменты

Антисмысловые соединения выборочно могут содержать один или более нуклеозидов, в которых каждая сахарная группа была модифицирована. Такие модифицированные сахаром нуклеозиды могут придавать антисмысловым соединениям повышенную стабильность к нуклеазам, увеличенную аффинность связывания или некоторые другие полезные биологические свойства. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеозиды содержат химически модифицированные фрагменты рибофуранозных колец. Примеры химически модифицированных рибофуранозных колец включают, без ограничения, добавление замещающих групп (включая 5'- и 2'-замещающие группы, образование мостиков из негеминальных атомов колец с образованием бициклических нуклеиновых кислот (BNA), замещение атома кислорода рибозильного кольца S, N(R) или C(R₁)(R₂) (R, R₁ и R₂ - независимо друг от друга являются Н, C₁-С₁₂ алкильной или защитной группой) или их комбинациями. Примеры химически модифицированных сахаров включают 2'-F-5'-метилзамещенный нуклеозид (см. международную заявку PCTWO 2008/101157, опубликованную 21 августа 2008 г. для других описанных 5', 2'-бисзамещенных нуклеозидов) или замещение атома кислорода рибозильного кольца атомом S с последующим замещением положения 2' (см. опубликованную патентную заявку США US 2005-0130923, опубликованную 16 июня 2005 г.) или в альтернативном варианте 5'-замещение BNA (см. международную заявку PCTWO 2007/134181, опубликованную 22 ноября 2007 г., в которой LNA (блокированная нуклеиновая кислота) замещена, например, 5'-метильной или 5'-винильной группой).

Примеры нуклеозидов, содержащих модифицированные сахарные фрагменты, включают, без ограничения, нуклеозиды, содержащие 5'-винил, 5'-метил (R или S), 4'-S, 2-F, 2'-ОСН₃, 2'-ОСН₂СН₃, 2'-OCH₂CH₂F и 2'-O(СН₂)₂ОСН₃ замещающие группы. Заместитель в положении 2' также может быть выбран из: аллил, амино, азидо, тио, О-аллил, O-C₁-С₁₀ алкил, OCF₃, OCH₂F, O(CH₂)₂SCH₃, O(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n), O-CH₂-C(=O)-N(R_m)(R_n), и O-CH₂-C(=O)-N(R₁)-(CH₂)₂-N(R_m)(R_n), где каждый радикал R₁, R_m и R_n является независимо H или замещенным или незамещенным C₁-C₁₀ алкилом.

В данном документе считается, что термин «бициклический нуклеозид» относится к модифицированному нуклеозиду, содержащему бициклический сахарный фрагмент. Примеры бициклических нуклеозидов включают, без ограничения, нуклеозиды, содержащие мостик между атомами 4' и 2' рибозильного кольца. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, предложенные в данном документе, включают один или более бициклических нуклеозидов, содержащих мостик между атомами 4'-2'. Примеры таких связанных мостиками 4'-2' бициклических нуклеозидов, включают без ограничения одну из формул: 4'-(СН₂)-O-2' (LNA); 4'-(CH₂)-S-2'; 4*-(СН₂)₂-O-2' (ΕΝΑ - нуклеиновые кислоты, связанные 4'-этиленовым мостиком); 4'-СН(СН₃)-O-2' и 4'-СН(CH₂OCH₃)-O-2' (и их аналоги, см. патент США 7399845, выданный 15 июля 2008 г.); 4'-С(CH₃)(CH₃)-O-2' (и ее аналоги, см. опубликованную международную заявку WO/2009/006478, опубликованную 8 января 2009 г.); 4'-СН₂-N(ОСН₃)-2' (и ее аналоги, см. международную заявку WO/2008/150729, опубликованную 11 декабря 2008 г.); 4'-CH₂-O-N(CH₃)-2' (см. заявку на патент США US 2004-0171570, опубликованную 2 сентября 2004 г.); 4'-CH₂-N(R)-O-2', где R является Н, С₁-С₁₂-алкилом или защитной группой (см. патент США 7427672, выданный 23 сентября 2008 г.); 4'-СН₂-С(Н)(СН₃)-2' (см. статью Chattopadhyaya et al, J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134) и 4'-CH₂-C(=CH₂)-2' (и ее аналоги см. международную заявку WO 2008/154401, опубликованную 8 декабря 2008 г.).

Дополнительные отчеты, касающиеся бициклических нуклеозидов также могут быть найдены в опубликованной литературе (см., например, статьи: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al, Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al, Proc. Nati Acad. Sci. U.S.Α., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al, J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al, J. Am. Chem. Soc, 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi etal, Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al, Chem. Biol, 2001, 8, 1-7; и Orum et al, Curr. Opinion Mol Ther., 2001, 3, 239-243; патенты США №№6268490; 6525191; 6670461; 6770748; 6794499; 7034133; 7053207; 7399845; 7547684 и 7696345; публикации патента США № US 2008-0039618; US 2009-0012281; серии патентов США №№60/989574; 61/026995; 61/026998; 61/056564; 61/086231; 61/097787 и 61/099844; опубликованные международные заявки РСТ WO 1994/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401 и WO 2009/006478. Каждый из предыдущих бициклических нуклеозидов может быть получен с содержанием одного или более конфигураций стереохимических сахаров, включая, например, α-L-рибофуранозу и β-D-рибофуранозу (см. международную заявку РСТ - PCT/DK98/00393, опубликованную 25 марта 1999 г. как заявка WO 99/14226).

В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические сахарные фрагменты нуклеозидов BNA включают без ограничений, соединения, содержащие по меньшей мере один мостик между положениями 4' и 2' пентофуранозного сахарного фрагмента, в котором такие мостики независимо содержат 1 или от 2 до 4 связанных групп, независимо выбранных из -[C(R_a)(R_b)]_n-, -C(R_a)=C(R_b)-, -C(R_a)=N-, -С(=O)-, -C(=NR_a)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R_a)₂-, -S(=O)_x- и -N(R_a)-;

где

x равен 0, 1 или 2;

n равен 1, 2, 3 или 4;

каждый радикал R_a и R_b независимо является Н, защитной группой, гидроксилом, C₁-С₁₂-алкилом, замещенным С₁-С₁₂-алкилом, С₂-С₁₂-алкенилом, замещенным С₂-С₁₂-алкенилом, С₂-С₁₂-алкинилом, замещенным С₂-С₁₂-алкинилом, С₅-С₂₀-арилом, замещенным С₅-С₂₀-арилом, гетероциклическим радикалом, замещенным гетероциклическим радикалом, гетероарилом, замещенным гетероарилом, С₅-С₇-алициклическим радикалом, замещенным С₅-С₇-алициклическим радикалом, галогеном, OJ₁, NJ₁J₂, SJ₁, N₃, COOJ₁, ацилом (C(=O)-H), замещенным ацилом, CN, сульфонилом (S(=O)₂-J₁) или сульфоксилом (S(=O)-J₁) и

каждый заместитель J₁ и J₂ независимо является Н, C₁-С₁₂-алкилом, замещенным C₁-С₁₂-алкилом, С₂-С₁₂-алкенилом, замещенным С₂-С₁₂-алкенилом, С₂-С₁₂-алкинилом, замещенным С₂-С₁₂-алкинилом, С₅-С₂₀-арилом, замещенным C₅-C₂₀-арилом, ацилом (С(=O)-Н), замещенным ацилом, гетероциклическим радикалом, замещенным гетероциклическим радикалом, С₁-С₁₂-аминоалкилом, замещенным С₁-С₁₂-аминоалкилом или защитной группой.

В некоторых вариантах реализации изобретения мостик бициклического сахарного фрагмента является структурой -[C(R_a)(R_b)]_n-, -[C(R_a)(R_b)]_n-O-, -C(R_aR_b)-N(R)-O- или -C(R_aR_b)-O-N(R)-. В некоторых вариантах реализации изобретения этот мостик представляет собой структуры 4'-СН₂-2', 4'-(СН₂)2-2', 4'-(СН₂)3-2', 4'-СН₂-O-2', 4'-(СН₂)₂-O-2', 4'-CH₂-O-N(R)-2' и 4'-CH₂-N(R)-O-2'-, где каждый R независимо является Н, защитной группой или C₁-С₁₂-алкилом.

В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды являются дополнительно определенные их изомерной конфигурацией. К примеру, нуклеозид, содержащий 4'-2'-метиленокси мостик, может быть в конфигурации α-L или β-D. Ранее, α-L-метиленокси (4'-СН₂-O-2') BNA были включены в антисмысловые олигонуклеотиды, которые показали антисмысловую активность (Frieden et al, Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).

В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды включают, без ограничения, (А) α-L-метиленокси(4'-CH₂-O-2') BNA, (В) β-D-метиленокси (4'-СН₂-O-2') BNA, (С) этиленокси(4'-(СН₂)₂-O-2') BNA, (D) аминокси (4'-CH₂-O-N(R)-2') BNA, (Ε) оксиамино (4'-CH₂-N(R)-O-2') BNA и (F) метил(метиленокси) (4'-CH(CH₃)-O-2') BNA, (G) метилентио (4'-CH₂-S-2') BNA, (H) метиленамино (4'-CH₂-N(R)-2') BNA, (I) метилкарбоцикло (4'-СН₂-СН(СН₃)-2') BNA и (J) пропиленкарбоцикло (4'-(СН₂)₃-2') BNA, как изображено ниже.

где Вх является фрагментом основания, a R независимо является Н, защитной группой или С₁-С₁₂-алкилом.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложенные бициклические нуклеозиды имеют Формулу I:

где

Bx является фрагментом гетероциклического основания;

-Q_a-Q_b-Q_c- представляют структуры -CH₂-N(R_c)-CH₂-, -C(=O)-N(R_c)-CH₂-, -CH₂-O-N(R_c), -CH₂-N(R_c)-O- или -N(R_c)-O-CH₂;

R_c является C₁-C₁₂-алкилом или аминозащитной группой; и

заместители Т_а и T_b являются каждый независимо Н, гидроксилзащитной группой, конъюгирующей группой, реакционно-способной фосфорной группой, фосфорным фрагментом или ковалентным соединением с веществом подложки.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложенные бициклические нуклеозиды имеют Формулу II:

где

Bx является фрагментом гетероциклического основания;

Т_а и T_b являются каждый независимо Н, гидроксилзащитной группой, конъюгирующей группой, реакционно-способной фосфорной группой, фосфорным фрагментом или ковалентным соединением с веществом подложки.

Z_a является C₁-С₆-алкилом, С₂-С₆-алкенилом, С₂-С₆-алкинилом, замещенным C₁-С₆-алкилом, замещенным С₂-С₆-алкенилом, замещенным С₂-С₆-алкинилом, ацилом, замещенным ацилом, замещенным амидом, тиолом или замещенным тиолом.

В одном варианте реализации изобретения каждая из замещающих групп независимо является моно- или полизамещенной с замещающими группами, независимо выбранными из галоген, оксо, гидроксил, OJ_c, NJ_cJ_d, SJ_c, N₃, OC(=X)J_c и NJ_eC(=X)NJ_cJ_d групп, где каждый заместитель J_c, J_d и J_e независимо является Н, C₁-С₆-алкилом или замещенным C₁-С₆-алкилом, а X является О или NJ_c.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложенные бициклические нуклеозиды имеют Формулу III:

где

Bx является фрагментом гетероциклического основания;

Т_а и T_b являются каждый независимо Н, гидроксилзащитной группой, конъюгирующей группой, реакционно-способной фосфорной группой, фосфорным фрагментом или ковалентным соединением с веществом подложки.

Z_b является C₁-С₆-алкилом, С₂-С₆-алкенилом, С₂-С₆-алкинилом, замещенным C₁-С₆-алкилом, замещенным С₂-С₆-алкенилом, замещенным С₂-С₆-алкинилом или замещенным ацилом (С(=O)-).

В некоторых вариантах реализации изобретения предложенные бициклические нуклеозиды имеют Формулу IV:

где

Вх является фрагментом гетероциклического основания;

Т_а и T_b являются каждый независимо Н, гидроксилзащитной группой, конъюгирующей группой, реакционно-способной фосфорной группой, фосфорным фрагментом или ковалентным соединением с веществом подложки.

R_d является C₁-С₆-алкилом, замещенным C₁-С₆-алкилом, С₂-С₆-алкенилом, замещенным С₂-С₆-алкенилом, С₂-С₆-алкинилом или замещенным С₂-С₆-алкинилом;

каждый заместитель q_a, q_b, q_c и q_d является независимо H, галогеном, C₁-С₆-алкилом, замещенным C₁-С₆-алкилом, С₂-С₆-алкенилом, замещенным С₂-С₆-алкенилом, С₂-С₆-алкинилом или замещенным С₂-С₆-алкинилом, C₁-С₆-алкоксилом, замещенным C₁-С₆-алкоксилом, ацилом, замещенным ацилом, C₁-С₆-аминоалкилом или замещенным C₁-С₆-аминоалкилом.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложенные бициклические нуклеозиды имеют Формулу V:

где

Bx является фрагментом гетероциклического основания;

T_a и T_b являются каждый независимо Н, гидроксилзащитной группой, конъюгирующей группой, реакционно-способной фосфорной группой, фосфорным фрагментом или ковалентным соединением с веществом подложки.

заместители q_a, q_b, q_e и q_f являются каждый независимо водородом, галогеном, С₁-С₁₂-алкилом, замещенным C₂-С₁₂-алкилом, С₂-С₁₂-алкенилом, замещенным C₂-C₁₂-алкенилом, С₂-С₁₂-алкинилом, замещенным С₂-С₁₂-алкинилом, С₁-С₁₂-алкокси, замещенной С₁-С₁₂-алкокси, OJ_j, SJ_j, SOJ_j, SO₂J_j, NJ_jJ_k, N₃, CN, C(=O)OJ_j, C(=O)NJ_jJ_k, C(=O)J_j, O-C(=O)NJ_jJ_k, N(H)C(=NH)NJ_jJ_k, N(H)C(=O)NJ_jJ_k или N(H)C(=S)NJ_jJ_k группами;

или q_e и q_f вместе являются =C(q_g)(q_h);

q_g и q_h являются каждый независимо H, галогеном, С₁-C₁₂-алкилом или замещенным C₁-C₁₂-алкилом.

Были описаны синтез и получение метиленокси-(4'-СН₂-O-2')-мономеров BNA аденина, цитозина, гуанина, 5-метилцитозина, тимина и урацила, вместе с их олигомеризацией, и свойства распознавания нуклеиновых кислот (Koshkin et al, Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). BNA и их получение также описаны в заявках WO 98/39352 и WO 99/14226.

Также были получены аналоги метиленокси-(4'-СН₂-O-2') BNA и 2'-тио-BNA (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). Также было описано получение блокированных нуклеозидных аналогов, содержащих олигодезоксирибонуклеотидные дуплексы в качестве субстратов для полимераз нуклеиновых кислот (Wengel et al., WO 99/14226). Более того, в данной области был описан синтез 2'-амино-BNA, нового конформационно ограниченного высокоаффинного олигонуклеотидного аналога (Singh et al, J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). В дополнение были получены 2'-амино- и 2'-метиламино-BNA, а ранее сообщили о термической стабильности таких дуплексов с комплементарными цепями РНК и ДНК.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложенные бициклические нуклеозиды имеют Формулу VI:

где

Bx является фрагментом гетероциклического основания;

T_a и T_b являются каждый независимо Н, гидроксилзащитной группой, конъюгирующей группой, реакционно-способной фосфорной группой, фосфорным фрагментом или ковалентным соединением с веществом подложки.

каждый q_i, q_j, q_k и q_l является независимо Н, галогеном, С₁-С₁₂-алкилом, замещенным С₁-С₁₂-алкилом, С₂-С₁₂-алкенилом, замещенным С₂-С₁₂-алкенилом, С₂-С₁₂-алкинилом, замещенным С₂-С₁₂-алкинилом, С₁-С₁₂-алкоксилом, замещенным С₁-С₁₂-алкоксилом, OJ_j, SJ_j, SOJ_j, SO₂J_j, NJ_jJ_k, N₃, CN, C(=O)OJ_j, C(-O)NJ_jJ_k, C(=O)J_j, O-C(=O)NJ_jJ_k, N(H)C(=NH)NJ_jJ_k, N(H)C(=O)NJ_jJ_k или N(H)C(=S)NJ_jJ_k группами; и

заместители q_i и q_j или q_l и q_k вместе являются =C(q_g)(q_h), где q_g и q_h являются каждый независимо Н, галогеном, С₁-С₁₂-алкилом или замещенным С₁-С₁₂-алкилом.

Был описан один карбоциклический бициклический нуклеозид, содержащий мостик 4'-(СН₂)₃-2' и мостик алкенильного аналога 4'-СН=СН-СН₂-2' (Freier et al, Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 и Albaek et al, J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). Были также описаны синтез и получение карбоциклических бициклических нуклеозидов вместе с их олигомеризацией и биохимическими исследованиями (Srivastava et al, J. Am. Chem. Soc, 2007, 129(26), 8362-8379).

В данном документе считается, что термин «4'-2' бициклическеский нуклеозид», или «бициклический нуклеозид 4'-2'» относится к бициклическому нуклеозиду, содержащему фуранозное кольцо, включающее мостик, соединяющий два углеродных атома фуранозного кольца, который соединяет углеродный атом 2' с углеродным атомом 4' сахарного кольца.

В данном документе считается, что «моноциклический нуклеозид» относится к нуклеозидам, содержащим модифицированные сахарные фрагменты, которые не являются бициклическими сахарными фрагментами. В некоторых вариантах реализации изобретения сахарный фрагмент или аналог сахарного фрагмента нуклеозида может быть модифицирован или замещен в любом положении.

В данном документе считается, что «2'-модифицированный сахар» указывает на фуранозильный сахар, модифицированный в положении 2'. В некоторых вариантах реализации изобретения такие модификации включают заместители, выбранные изгалогенида, включая без ограничения, замещенную и незамещенную алкокси группу, замещенный и незамещенный тиоалкил, замещенный и незамещенный аминоалкил, замещенный и незамещенный алкил, замещенный и незамещенный аллил и замещенный и незамещенный алкинил. В некоторых вариантах реализации изобретения 2'-модификации выбраны из заместителей, включающих без ограничения: O[(CH₂)_nO]_mCH₃, O(CH₂)_nNH₂, O(СН₂)_nCH₃, O(CH₂)_nF, O(CH₂)_nONH₂, OCH₂C(=O)N(H)CH₃, и O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃]₂, где n и m равны от 1 до около 10. Другие 2'-замещающие группы могут также выбираться из: С₁-С₁₂-алкила, замещенного алкила, алкенила, алкинила, алкарила, аралкила, O-алкарила или O-аралкила, SH, SCH₃, OCN, Cl, Br, CN, F, CF₃, OCF₃, SOCH₃, SO₂CH₃, ONO₂, NO₂, N₃, NH₂, гетероциклоалкила, гетероциклоалкарила, аминоалкамино группы, полиалкиламино группы, замещенного силила, расщепляющей РНК группы, репортерной группы, интеркалятора, улучшающей фармакокинетические свойства группы или улучшающей фармакодинамические свойства группы антисмыслового соединения и другие заместители, обладающие сходными свойствами. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированные нуклеозиды содержат боковую цепь 2'-МОЕ (Baker et al, J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Такое замещение 2'-MOE было описано как обладающее улучшенной аффинностью связывания по сравнению с немодифицированными нуклеозидами и другими модифицированными нуклеозидами, такими как 2'-O-метил, O-пропил и O-аминопропил. Было также показано, что олигонуклеотиды, содержащие заместитель 2'-МОЕ, являются антисмысловыми ингибиторами экспрессии генов с перспективными свойствами для использования in vivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995,78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al, Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637 и Altmann et al, Nucleosides Nucleotides, 1997, 76, 917-926).

В данном документе считается, что «модифицированный тетрагидропирановый нуклеозид», или «модифицированный ТГП нуклеозид», обозначает нуклеозид, содержащий шестичленный тетрагидропирановый сахар, замещенный в обычных нуклеозидах пентофуранозидным остатком (сахарный заменитель). Модифицированный ТГП нуклеозид включает, без ограничения, то, что называется в данной области гекситной нуклеиновой кислотой (HNA), анитной нуклеиновой кислотой (ANA), манитной нуклеиновой кислотой (MNA) (см. статью Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854), фтор-ΗΝΑ (F-HNA) или те соединения, которые имеют Формулу VII:

где независимо каждый указанный по меньшей мере один аналог тетрагидропиранового нуклеозида имеет Формулу VII:

Bx является фрагментом гетероциклического основания;

группы T_a и T_b являются каждая независимо межнуклеозидной связывающей группой, соединяющей аналог тетрагидропиранового нуклеозида с антисмысловым соединением или одна из групп T_a и T_b является межнуклеозидной связывающей группой, соединяющей аналог тетрагидропиранового нуклеозида с антисмысловым соединением, а другая группа из T_a и T_b является Н, гидроксилзащитной группой, группой конъюгирующего связывания или 5'- или 3'-концевой группой;

заместители q₁, q₂, q₃, q₄, q₅, q₆ и q₇ являются каждый независимо H, C₁-С₆-алкилом, замещенным C₁-С₆-алкилом, С₂-С₆-алкенилом, замещенным С₂-С₆-алкенилом, С₂-С₆-алкинилом или замещенным С₂-С₆-алкинилом; а каждый из радикалов R₁ и R₂ выбраны из водорода, гидроксила, галогена, замещенной или незамещенной алкокси группы, NJ₁J₂, SJ₁, N₃, OC(=X)J₁, OC(=X)NJ₁J₂, NJ₃C(=X)NJ₁J₂ и CN, где X является О, S или NJ₁ и каждый заместитель J₁, J₂ и J₃ является независимо H или С₁-С₆-алкилом.

В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются модифицированные ТГП нуклеозиды Формулы VII, в которых заместители q₁, q₂, q₃, q₄, q₅, q₆ и q₇ каждый является H. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один из заместителей q₁, q₂, q₃, q₄, q₅, q₆ и q₇ отличается от Н. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один из заместителей q₁, q₂, q₃, q₄, q₅, q₆ и q₇ является метилом. В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются ТГП нуклеозиды Формулы VII, в которых один из радикалов R₁ и R₂ является фторогруппой. В некоторых вариантах реализации изобретения R₁ является фторогруппой, a R₂ является H; R₁ является метокси группой, a R₂ является Н, и R₁ является H, a R₂ является метоксиэтокси группой.

В данном документе считается, что термин «2'-модифицированный», или «2'-замещенный», относится к нуклеозиду, содержащему сахар, несущий заместители в положении 2', отличные от Η или ОН. 2'-модифицированные нуклеозиды включают, без ограничения: бициклические нуклеозиды, в которых мостиковое соединение двух углеродных атомов сахарного кольца соединяет углерод 2' и другой углерод сахарного кольца; и нуклеозиды с немостиковыми 2'-заместителями, такими, как аллил, амино, азидо, тио, О-аллил, O-C₁-С₁₀-алкил, -OCF₃, O-(CH₂)₂-O-CH₃, 2'-O(CH₂)₂SCH₃, O-(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n) или O-CH₂-C(=O)-N(R_m)(R_n), где каждый радикал R_m и R_n независимо является Η или замещенным или незамещенным C₁-С₁₀-алкилом. 2'-модифицированые нуклеозиды могут дополнительно содержать другие модификации, например, в других положениях данного сахара и/или в данном нуклеотидном основании.

В данном документе считается, что обозначение «2'-F» относится к нуклеозиду, содержащему сахар, несущий фторогруппу в положении 2'.

В данном документе считается, что каждое обозначение «2'-ОМе», или «2'-ОСН₃», или «2'-O-метил»,относится к нуклеозиду, содержащему сахар, несущий -ОСН₃ группу в положении 2' сахарного кольца.

В данном документе считается, что каждое обозначение «МОЕ», или «2'-МОЕ», или «2'-ОСН₂СН₂ОСН₃», или «2'-O-метоксиэтил» относится к нуклеозиду, содержащему сахар, несущий -ОСН₂СН₂ОСН₃ группу в положении 2' сахарного кольца.

В данном документе считается, что «олигонуклеотид» относится к соединению, содержащему множество связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения один или более из этого множества нуклеозидов является модифицированным. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит один и более рибонуклеозидов (РНК) и/или дезоксирибонуклеозидов (ДНК).

В данной области также известны многие другие бицикло- и трициклосахарзаместительные системы колец, которые могут быть использованы для модификации нуклеозидов для введения в антисмысловые соединения (см., например, обзорную статью: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854). Такие системы колец могут претерпевать различные дополнительные замещения для усиления активности.

Способы получения модифицированных сахаров хорошо известны специалистам в данной области.

У нуклеотидов, содержащих модифицированные сахарные фрагменты, фрагменты нуклеотидных оснований (природных, модифицированных или их комбинации) сохраняются для проведения гибридизации с соответствующей нуклеиновой кислотой-мишенью.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения содержат один или более нуклеозидов, несущих модифицированные сахарные фрагменты. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный сахарный фрагмент является 2'-МОЕ группой. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированные 2'-МОЕ группой нуклеозиды сгруппированы в гэпмер-мотив. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный сахарный фрагмент является бициклическим нуклеозидом, содержащим мостиковую группу (4'-СН(CH₃)-O-2'). В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированные (4'-СН(CH₃)-O-2') нуклеозиды сгруппированы на протяжении крыльев гэпмер-мотива.

Композиции и способы составления фармацевтических композиций

Антисмысловые олигонуклеотиды могут быть смешаны с фармацевтически приемлемыми действующими или неактивными субстанциями для получения фармацевтических композиций или лекарственных форм. Композиции и способы получения лекарственных форм фармацевтических композиций зависят от ряда критериев, включая, без ограничения, путь введения, степень заболевания и требуемой дозы введения.

Антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту C9ORF72, может использоваться в фармацевтических композициях путем сочетания антисмыслового соединения с подходящим фармацевтически приемлемым растворителем или носителем. Фармацевтически приемлемый растворитель включает фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБР). ФСБР представляет собой растворитель, пригодный для применения в композициях, которые требуют парентеральной доставки. Соответственно, в одном варианте реализации изобретения, примененном в способах, описанных в данном документе, используется фармацевтическая композиция, содержащая антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту C9ORF72 и фармацевтически приемлемый растворитель. В некоторых вариантах реализации фармацевтически приемлемый растворитель является ФСБР. В некоторых вариантах реализации изобретения это антисмысловое соединение является антисмысловым олигонуклеотидом.

Фармацевтические композиции, содержащие антисмысловые соединения, охватывают любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких сложных эфиров или любой другой олигонуклеотид, который при введении животному, включая человека, способен обеспечить (прямо или опосредованно) получение биологически активного метаболита или его остатка. Соответственно, например, данное раскрытие также направлено на фармацевтически приемлемые соли антисмысловых соединений, пролекарста, фармацевтически приемлемые соли таких пролекарств и другие биоэквивалентные вещества. Подходящие фармацевтически приемлемые соли включают, без ограничения, соли натрия и калия.

Пролекарство может включать введение дополнительных нуклеозидов в один или оба конца антисмыслового соединения, которое расщепляется эндогенными нуклеазами организма с образованием активного антисмыслового соединения.

Конъюгированные антисмысловые соединения

Антисмысловые соединения могут быть ковалентно связанными с одним или более фрагментами или конъюгатами, которые усиливают активность, распределение в клетках или потребление клетками получающихся антисмысловых олигонуклеотидов. Типичные конъюгирующие группы включают холестериновые фрагменты и липидные фрагменты. Дополнительные конъюгирующие группы включают углеводы, фосфолипиды, биотин, феназин, фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины и красители.

Антисмысловые соединения могут быть модифицированы таким образом, чтобы содержать одну и более стабилизирующих групп, которые обычно присоединяются к одному или обоим концам антисмысловых соединений для усиления свойств, таких, как, например, стабильность к нуклеазам, включая кэп-структуры в составе стабилизирующих групп. Эти концевые модификации защищают антисмысловое соединение, несущее концевую нуклеиновую кислоту, от экзонуклеазной деградации и могут помочь при доставке и/или локализации соединения в клетке. Кэп может быть расположен на 5'-конце (5'-кэп) или на 3'-конце (3'-кэп) или может быть расположен на обоих концах. Кэп-структуры хорошо известны в данной области и включают, например, обращенные дезоксикэпы без азотистых оснований.

Дополнительно 3' и 5'-стабилизирующие группы, которые могут быть использованы на кэпе одного или обоих концов антисмыслового соединения для придания ему стабильности от нуклеаз, включают те, которые описаны в заявке WO 03/004602, опубликованной 16 января 2003 г.

Клеточная культура и обработка антисмысловыми соединениями

Действие антисмысловых соединений на уровень, активность или экспрессию нуклеиновых кислот C9ORF72 может быть протестировано in vitro на различных типах клеток. Типы клеток, используемые в таких анализах, могут быть получены у коммерческих поставщиков (например, Американская коллекция типовых культур, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) и культивированы в соответствии с инструкциями поставщиков с использованием коммерчески доступных реактивов (например, In vitro gen Life Technologies, Carlsbad, CA). Показательные типы клеток включают, без ограничения, клетки HepG2, клетки Hep3B и первичные гепатоциты.

Испытание антисмысловых олигонуклеотидов in vitro

В данном документе описаны способы для обработки клеток антисмысловыми олигонуклеотидами, которые могут быть надлежащим образом модифицированы для обработки другими антисмысловыми соединениями.

В целом, клетки обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами, когда клетки достигают в культуре приблизительно 60-80% заселенности.

Один реактив, обычно используемый для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, включает катионный липидный реактив для трансфекции LIPOFECTIN (Invitrogen, Carlsbad, СА). Антисмысловые олигонуклеотиды смешивают с реактивом LIPOFECTIN в среде OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, СА) до достижения требуемой конечной концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации LIPOFECTIN, которая обычно лежит в диапазоне 2-12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.

Другой реактив, используемый для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, включает реактив LIPOFECTAMINE (Invitrogen, Carlsbad, СА). Антисмысловой олигонуклеотид смешивают с реактивом LIPOFECTAMINE в среде с пониженным содержанием сыворотки OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, СА) до достижения требуемой концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации LIPOFECTAMINE, которая обычно лежит в диапазоне 2-12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.

Другая методика, используемая для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, включает электропорацию.

Клетки обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами традиционными способами. Клетки после обработки антисмысловыми олигонуклеотидами, как правило, выращивают 16-24 часов, в это время измеряют уровни РНК или белка нуклеиновой кислоты-мишени методами, известными в данной области и описанные в данном документе. В общем, когда обработки выполняют в многократных повторах, то данные представляют как средние значения повторных обработок.

Концентрация антисмыслового олигонуклеотида, как правило, варьирует для разных клеточных линий. Методы определения оптимальной концентрации антисмыслового олигонуклеотида для конкретной клеточной линии хорошо известны в данной области. Антисмысловые олигонуклеотиды при трансфекции с помощью реактива LIPOFECTAMINE часто используют в концентрациях в диапазонах от 1 нМ до 300 нМ. Антисмысловые олигонуклеотиды при трансфекции с помощью электропорации используют в более высоких концентрациях в диапазоне от 625 до 20000 нМ.

Выделение РНК

Анализ РНК может выполняться на суммарной клеточной РНК или поли(А)+ мРНК. Методы выделения РНК хорошо известны в данной области. РНК получают, используя методы хорошо известные в данной области, например, с применением реактива TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, СА) в соответствии с рекомендованными протоколами производителя.

Анализ ингибирования уровней или экспрессии мишеней

Ингибирование уровней или экспрессии нуклеиновой кислоты C9ORF72 может быть проанализировано разнообразными способами, известными в данной области. Например, нуклеиновая кислота-мишень можно количественно определить, например, путем Нозерн-блоттинг анализа, конкурентной полимеразной цепной реакции (ПЦР) или количественной ПЦР в режиме реального времени. Анализ РНК может выполняться на суммарной клеточной РНК или поли(А)+ мРНК. Методы выделения РНК хорошо известны в данной области.

Анализ Нозерн-блоттинга также является традиционным в этой области. Количественная ПЦР в режиме реального времени может быть беспрепятственно выполнена с использованием коммерчески доступной системы для детекции последовательностей ABI PRISM 7600, 7700 или 7900, поставляемой компанией PE-AppliedBiosystems, FosterCity, СА и используемой согласно инструкций производителя.

Анализ уровней РНК-мишеней методом количественной ПЦР в режиме реального времени Количественное определение уровней РНК-мишеней может выполняться методом количественной ПЦР в режиме реального времени, используя систему для детекции последовательностей ABI PRISM 7600, 7700 или 7900 (PE-AppliedBiosystems, FosterCity, СА) согласно инструкций производителя. Методы количественного определения ПЦР в режиме реального времени хорошо известны в данной области.

Перед проведением ПЦР в режиме реального времени выделенную РНК подвергают реакции с обратной транскриптазой (ОТ), которая синтезирует комплементарную ДНК (кДНК), что потом используется в качестве субстрата для амплификации в ПЦР в режиме реального времени. Реакции ПЦР ОТ и ПЦР в режиме реального времени выполняются последовательно в одной и том же лунке с образцом. Реактивы для ПЦР ОТ и ПЦР в режиме реального времени получают в компании Invitrogen (Carlsbad, СА). Реакции ПЦР-ОТ и ПЦР в режиме реального времени проводят методами, хорошо известными специалистам в данной области.

Количества гена (или РНК)-мишени, полученные методом ПЦР в режиме реального времени нормализируют, используя любой уровень экспрессии гена, экспрессия которого является постоянной, такой, как циклофилин А, или путем количественного определения суммарной РНК, используя краситель RIBOGREEN (Invitrogen, Inc. Carlsbad, СА). Экспрессию циклофилина А количественно определяют ПЦР в режиме реального времени, одновременно проводя анализ с мишенью путем мультиплексирования или анализируя по отдельности. Суммарную РНК количественно определяют, используя реактив для количественного определения РНК RIBOGREEN (Invetrogen, Inc. Eugene, OR). Методы количественного определения РНК с помощью красителя RIBOGREEN изложены в статье Jones, L.J., et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Для измерения флуоресценции RIBOGREEN используют прибор CYTOFLUOR 4000 (РЕ Applied Biosystems).

Зонды и праймеры разработаны для гибридизации с нуклеиновой кислотой C9ORF72. Способы для конструирования зондов и праймеров для ПЦР в режиме реального времени хорошо известны в данной области и могут включать применение программного обеспечения, такого, как программное обеспечение PRIM EREXPRESS (AppliedBiosystems, FosterCity, СА).

Анализ уровней белков

Антисмысловое ингибирование нуклеиновой кислоты C9ORF72 может оцениваться путем измерения уровней белка C9ORF72. Уровни белка C9ORF72 могут быть оценены или количественно определены различными способами, хорошо известными в данной области, такими как иммунопреципитация, Вестерн-блоттинг анализ (иммуноблоттинг), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), анализы количественного определения белков, анализы активности белков (например, анализы активности каспазы), иммуногистохимические методы, иммуноцитохимические методы или сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS). Антитела, направленные на мишень, могут быть идентифицированы и получены из различных источников, таких как каталог антител MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI), или могут быть получены посредством традиционных методов синтеза моноклональных или поликлональных антител, хорошо известных в данной области. Коммерчески доступные антитела пригодны для обнаружения белка C9ORF72 мыши, крысы, обезьяны и человека.

Испытание антисмысловых соединений in vivo

Антисмысловые соединения, например антисмысловые олигонуклеотиды, испытывают на животных для оценки их способности ингибировать экспрессию белка C9ORF72 и вызывать фенотипические изменения, такие как улучшение двигательной функции и дыхания. В некоторых вариантах реализации изобретения двигательную функцию измеряют с помощью теста с вращающимся стержнем, по силе захвата, лазанию по шесту, активности в тесте «открытое поле», в тесте с балансиром, испытанию по отпечатку задней лапы животного. В некоторых вариантах реализации изобретения интенсивность дыхания измеряют плетисмографией всего организма, устойчивостью к заражению и соответствующими измерениями на животном. Испытание может выполняться на здоровых животных или на экспериментальных моделях заболеваний. Для введения животным антисмысловые олигонуклеотиды изготавливают в виде лекарственной формы с фармацевтически приемлемым растворителем, таким как фосфатно-солевой буферный раствор. Введение включает парентеральные пути введения, такие как внутрибрюшинный, внутривенный и подкожный. Расчет дозы антисмысловых олигонуклеотидов и частоты дозирования находятся в пределах квалификации специалистов в данной области и зависит от таких факторов, как путь введения и масса тела животного. В последующем периоде времени после обработки антисмысловыми олигонуклеотидами выделяют РНК из ткани ЦНС или СМЖ и измеряют изменения экспрессии нуклеиновой кислоты C9ORF72.

Нацеливание на C9ORF72

Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в данном документе, могут гибридизироваться с нуклеиновой кислотой C9ORF72 на любой стадии процессинга РНК. Например, описанные в данном документе предложенные антисмысловые олигонуклеотиды являются комплементарными пре-мРНК или зрелой мРНК. Дополнительно, антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в данном документе, могут гибридизироваться с любым элементом нуклеиновой кислоты C9ORF72. Например, описанные в данном документе предложенные антисмысловые олигонуклеотиды являются комплементарными экзону, интрону, 5'-нетраслируемому участку, 3'-нетраслируемому участку, участку повтора, экспансии гексануклеотидного повтора, точке сплайсинга, точке сплайсинга экзонгэкзон, сайленсеру экзонного сплайсинга (ESS), энхансеру экзонного сплайсинга (ESE), экзону 1а, экзону 1b, экзону 1с, экзону 1d, экзону 1e, экзону 2, экзону 3, экзону 4, экзону 5, экзону 6, экзону 7, экзону 8, экзону 9, экзону 10, экзону 11, интрону 1, интрону 2, интрону 3, интрону 4, интрону 5, интрону 6, интрону 7, интрону 8, интрону 9 или интрону 10 нуклеиновой кислоты C9ORF72.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в данном документе, гибридизируются со всеми вариантами C9ORF72. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в данном документе, гибридизируются с определенными вариантами C9ORF72. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в данном документе, избирательно гибридизируются с вариантами C9ORF72, содержащими экспансии гексануклеотидного повтора. В некоторых вариантах реализации изобретения такие варианты C9ORF72, содержащие экспансии гексануклеотидного повтора, включают последовательности SEQ ID NO: 1-3 и 6-10. В некоторых вариантах реализации изобретения такая экспансия гексануклеотидного повтора включает по меньшей мере 30 повторов из любых наборов GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG или GGGGGC.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в данном документе, ингибируют экспрессию всех вариантов C9ORF72. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в данном документе, ингибируют экспрессию всех вариантов C9ORF72 в равной степени. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в данном документе, преимущественно ингибируют экспрессию определенных вариантов C9ORF72. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в данном документе, преимущественно ингибируют экспрессию вариантов C9ORF72, содержащих экспансию гексануклеотидного повтора. В некоторых вариантах реализации изобретения такие варианты C9ORF72, содержащие экспансию гексануклеотидного повтора, включают последовательности SEQ ID NO: 1-3 и 6-10. В некоторых вариантах реализации изобретения такая экспансия гексануклеотидного повтора включает по меньшей мере 30 повторов из любых наборов GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG или GGGGGC. В некоторых вариантах реализации изобретения такая экспансия гексануклеотидного повтора образует фокусы в ядрах клеток. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в данном документе, пригодны для уменьшения фокусов в ядрах клеток. Фокусы ядер клеток могут быть уменьшены по показателю процента клеток с фокусами, а также количества фокусов на клетку.

На основании ранних исследований, направленных на изучение экспансий повторов, невозможно предсказать, смогут ли антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на последовательность C9ORF72 за пределами экспансии повтора, успешно ингибировать экспрессию C9ORF72 по двум причинам. Первое - экспансия повтора C9ORF72 расположена в интроне и не известно, содержит ли РНК в фокусах только повторы или также и фланкирующую интронную последовательность. Например, в ранних исследованиях миотонической дистрофии 2 типа (ДМ2), которая является заболеванием, вызываемым мутацией экспансии CCTG в интроне 1 гена ZNF9, определили, что большие экспансии при ДМ2 не предотвращают аллельноспецифический сплайсинг пре-мРНК, ядерный экспорт этих транскриптов или установившиеся уровни мРНК. Данное исследование дополнительно продемонстрировало, что рибонуклеотидные ядерные включения, обнаруженные в связи с этим заболеванием, обогащены экспансией CCUG, но не фланкирующими интронными последовательностями. Благодаря этим данным предположили, что последующие молекулярные эффекты при мутации ДМ2 могут быть инициированы накоплением единственного участка повтора CCUG. Поэтому это исследование подразумевает, что нацеливание на единственную экспансию повтора CCUG может привести к облегчению протекания данного заболевания, поскольку нацеливание на фланкирующие последовательности, особенно на следующий в прямом направлении считывания участок этой экспансии повтора, не влияет на образование рибонуклеотидных ядерных включений (Margolis et al. Hum. Mol. Genet., 2006, 15: 1808-1815). Второе - не известно, насколько быстро интрон 1 гена C9ORF72, который содержит данные повторы, отщепляется и накапливается в фокусах. Поэтому невозможно предсказать, приведет ли нацеливание на пре-мРНК к удалению повторов РНК и фокусов.

Особенности C9OFF72

Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в данном документе, могут гибридизироваться с любым вариантом последовательности C9ORF72 в любом состоянии процессинга в пределах любого элемента гена C9ORF72. Например, антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в данном документе, могут гибридизироваться с экзоном, интроном, 5'-нетраслируемым участком, 3'-нетраслируемым участком, участком повтора, экспансией гексануклеотидного повтора, точкой сплайсинга, экзоном: точкой сплайсинга экзона, сайленсером экзонного сплайсинга (ESS), энхансером экзонного сплайсинга (ESE), экзоном 1а, экзоном 1b, экзоном 1с, экзоном 1d, экзоном 1e, экзоном 2, экзоном 3, экзоном 4, экзоном 5, экзоном 6, экзоном 7, экзоном 8, экзоном 9, экзоном 10, экзоном 11, интроном 1, интроном 2, интроном 3, интроном 4, интроном 5, интроном 6, интроном 7, интроном 8, интроном 9 или интроном 10. К примеру, антисмысловые олигонуклеотиды могут нацеливаться на любой из экзонов, описанных в табл.1-5 различных вариантов последовательностей C9ORF72. Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в данном документе, также могут нацеливаться на варианты не описанные ниже, такие, как описанные в базе данных GENBANK. Более того, антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в данном документе, также могут нацеливаться на элементы отличные от экзонов, и такие элементы описаны в базе данных GENBANK.

Некоторые показания для применения

В некоторых вариантах реализации изобретения в данном документе предложены способы лечения индивидов, включающие введение одной или более фармацевтических композиций, описанных в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения индивид страдает нейродегенеративным заболеванием. В некоторых вариантах реализации изобретения у индивида существует риск развития нейродегенеративного заболевания, включая, без ограничения, АЛС или ЛВД. В некоторых вариантах реализации изобретения индивида идентифицировали как страдающего ассоциированным с белком C9ORF72 заболеванием. В некоторых вариантах реализации изобретения индивида идентифицировали как страдающего ассоциированным с экспансией гексануклеотидного повтора C9ORF72 заболеванием. В некоторых вариантах реализации изобретения в данном документе предложены способы для профилактического снижения у индивида экспрессии C9ORF72. Некоторые варианты реализации изобретения включают нуждающегося в лечении индивида путем введения ему терапевтически эффективного количества антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту C9ORF72.

В одном варианте реализации введение терапевтически эффективного количества антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту C9ORF72, сопровождается мониторингом у индивида уровней C9ORF72 для определения ответа индивида на введение данного антисмыслового соединения. Ответ индивида на введение антисмыслового соединения может использоваться врачом для определения количества и длительности терапевтического воздействия.

В некоторых вариантах реализации изобретения введение антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту C9ORF72, приводит к снижению экспрессии C9ORF72 на по меньшей мере 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99%, или на диапазон, определенный любыми двумя из этих значений. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту C9ORF72, приводит к улучшению двигательной функции и дыхания животного. В некоторых вариантах реализации изобретения введение антисмыслового соединения к C9ORF72 улучшает двигательную функцию и дыхание на по меньшей мере 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99%, или на диапазон, определенный любыми двумя из этих значений.

В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции, содержащие антисмысловое соединение, нацеленное на C9ORF72, используют для получения лекарственного средства для лечения пациента, страдающего или склонного к нейродегенеративному заболеванию, включая АЛС и ЛВД.

Определенные виды комбинированной терапии

В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более фармацевтических композиций, описанных в данном документе, совместно вводят с одним или большим количеством других фармацевтических агентов. В некоторых вариантах реализации изобретения такая одна или более других фармацевтических композиций разработаны для лечения того же заболевания, нарушения или состояния, что и одна или более фармацевтических композиций, описанных в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения такая одна или более других фармацевтических композиций разработаны для лечения разных заболеваний, нарушений или состояний, что и одна или более фармацевтических композиций, описанных в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения такая одна или более других фармацевтических композиций разработаны для лечения нежелательной побочной реакции одной или более фармацевтических композиций, описанных в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более фармацевтических композиций, описанных в данном документе, совместно вводят с другим фармацевтическим агентом для лечения нежелательной реакции, вызванной другим фармацевтическим агентом. В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более фармацевтических композиций, описанных в данном документе, совместно вводят с другим фармацевтическим агентом для создания комбинированного действия. В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более фармацевтических композиций, описанных в данном документе, совместно вводят с другим фармацевтическим агентом для создания синергического действия.

В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более фармацевтических композиций, описанных в данном документе, и один или более других фармацевтических агентов вводятся в одно и то же время. В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более фармацевтических композиций, описанных в данном документе, и один или более других фармацевтических агентов вводятся в разное время. В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более фармацевтических композиций, описанных в данном документе, и один или более других фармацевтических агентов изготавливают вместе в виде одной лекарственной формы. В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более фармацевтических композиций, описанных в данном документе, и один или более других фармацевтических агентов изготавливают по отдельности.

В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические агенты, которые могут совместно вводиться с фармацевтической композицией, описанной в данном документе, включают препараты Рилузол (Рилутек), Лиоресал (Лиоресал) и Декспрамипексол.

В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические агенты, которые могут совместно вводиться со специфическим ингибитором C9ORF72, описанным в данном документе, включая без ограничения дополнительный ингибитор C9ORF72. В некоторых вариантах реализации изобретения данный совместно вводимый фармацевтический агент вводится перед введением фармацевтической композиции, описанной в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения данный совместно вводимый фармацевтический агент вводится после введения фармацевтической композиции, описанной в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения данный совместно вводимый фармацевтический агент вводится в то же время, что и фармацевтическая композиция, описанная в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения доза совместно вводимого фармацевтического агента является такой же, что и доза, которая могла бы вводиться, если совместно вводимый фармацевтический агент вводился бы самостоятельно. В некоторых вариантах реализации изобретения доза совместно вводимого фармацевтического агента является более низкой, чем доза, которая могла бы вводиться, если совместно вводимый фармацевтический агент вводился бы самостоятельно. В некоторых вариантах реализации изобретения доза совместно вводимого фармацевтического агента является более высокой, чем доза, которая могла бы вводиться, если совместно вводимый фармацевтический агент вводился бы самостоятельно.

В некоторых вариантах реализации изобретения совместное введение второго соединения усиливает действие первого соединения так, что совместное введение данных соединений приводит к действию, которое превышает действие вводимого самостоятельно первого соединения. В других вариантах реализации изобретения данное совместное введение приводит к действию, которое является аддитивным в отношении действия соединений, назначаемых самостоятельно. В некоторых вариантах реализации изобретения данное совместное введение приводит к действию, которое является сверхаддитивным в отношении действия соединений, назначаемых самостоятельно. В некоторых вариантах реализации изобретения первое соединение является антисмысловым. В некоторых вариантах реализации изобретения второе соединение является антисмысловым.

ПРИМЕРЫ

Примеры, не ограничивающие раскрытие и данные, включенные посредством ссылки.

В то время как определенные соединения, композиции и способы, описанные в данном документе, были описаны с характеристикой в соответствии с определенными вариантами реализации, следующие примеры только иллюстрируют соединения, описанные в данном документе, и не подразумевают ограничение указанных объектов. Каждая из ссылок, перечисленных в настоящей заявке, включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

Пример 1. Антисмысловое ингибирование гена C9ORF72 человека в клетках HepG2

Антисмысловые олигонуклеотиды были сконструированы для нацеливания на нуклеиновую кислоту C9ORF72 и их действие было испытано на мРНК C9ORF72 in vitro. Данные антисмысловые олигонуклеотиды испытывали в сериях экспериментов, которые обеспечивали сходные культуральные условия. Результаты каждого эксперимента представлены в отдельных таблицах, показанных ниже. Культивированные до плотности 20000 клеток на лунку клетки HepG2 трансфецировали с применением электропорации с помощью антисмыслового олигонуклеотида в концентрации 7000 нМ. По прошествии периода обработки в течение приблизительно 24 часов, РНК выделили из клеток и измерили уровни мРНК C9ORF72 методом количественной ПЦР в режиме реального времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор RTS3750 праймеров-зондов человека (прямая последовательность TGTGACAGTTGGAATGCAGTGA, обозначенная в данном документе как SEQ ID NO: 15; обратная последовательность GCCACTTAAAGCAATCTCTGTCTTG, обозначенная в данном документе как SEQ ID NO: 16; последовательность зонда TCGACTCTTTGCCCACCGCCA, обозначенная в данном документе как SEQ ID NO: 17). Уровни мРНК C9ORF72 скорректировали в соответствии с суммарным содержанием РНК, измеренным с помощью красителя RIBOGREEN®. Результаты представлены в виде процента ингибирования C9ORF72 по сравнению с необработанными контрольными клетками.

Антисмысловые олигонуклеотиды в табл. 6-10 были сконструированы в виде 5-10-5 МОЕ-гэпмеров. Данные гэпмеры составлены из 20 нуклеозидов в длину, причем центральный гэп-сегмент содержит десять 2'-дезоксирибонуклеотидов и фланкирован сегментами-крыльями как на 5'-конце, так и на 3'-конце, каждый включает сегмент по 5 нуклеозидов. Каждый нуклеозид на сегменте-крыле 5' и каждый нуклеозид на сегменте-крыле 3' несут модификацию МОЕ. Межнуклеозидные связи на всем протяжении каждого гэпмера являются фосфоротиоатными связями. Все цитозиновые остатки на всем протяжении каждого гэпмера являются 5-метилцитозинами. «Сайт инициации» указывает на самый крайний 5'-нуклеозид последовательности гена человека, на который нацелен антисмысловой олигонуклеотид. «Сайт терминации» указывает на самый крайний 3'-нуклеозид последовательности гена человека, на который нацелен антисмысловой олигонуклеотид. Каждый антисмысловой олигонуклеотид, перечисленный в табл. 6-9, нацелен на одну из последовательностей м РНК C9ORF72 человека, обозначенных в данном документе как SEQ ID NO: 1 (№ доступа в базе данных GENBANK NM 001256054.1) или геномную последовательность C9ORF72 человека, обозначенную в данном документе как SEQ ID NO: 2 (комплементарная последовательность № доступа в базе данных GENBANK NT 008413.18, усеченная от нуклеозида 27535000 до 27565000), или обе последовательности. Сокращение «н/д» указывает на то, что данный антисмысловой олигонуклеотид не был нацелен на эту конкретную последовательность гена. Антисмысловые олигонуклеотиды из табл. 10 нацелены на одну из последовательностей SEQ ID NO: 3 (№ доступа в базе данных GENBANK BQ068108.1) или SEQ ID NO: 4 (№ доступа в базе данных GENBANK NM_018325.3).

Как показано в табл. 6-10, некоторые из олигонуклеотидов, нацеленных на SEQ ID NO: 1, проявляют по меньшей мере 50% ингибирование, включая те, которые нацелены на нуклеотидные основания 90-647, 728-1541, 1598-1863, 1935-2146, 2232-2251, 2429-2576, 2632-2743, 2788-2807, 2860-2879, 2949-2968, 3062-3081, 3132-3151 и 3250-3269 SEQ ID NO 1. Они включают последовательности SEQ ID NO: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50, 51, 53, 55, 56, 57, 61, 62, 64, 66, 67, 72, 73, 75, 76, 81, 82, 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 96, 97, 100, 102, 103, 109, 111, 112, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 130, 131, 132, 133, 137, 139, 140, 141, 145, 146, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 165, 166, 168, 169, 170, 171, 174, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 188, 190, 192, 195, 197, 199, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331 и 332. Некоторые из этих олигонуклеотидов проявляют по меньшей мере 70% ингибирование, включая те, которые нацелены на нуклеотидные основания 90-359, 430-479, 550-569, 617-647, 940-959, 1013-1033, 1446-1465, 1687-1706, 1844-1863, 1935-2007 и 2679-2698 SEQ ID NO 1. Они включают последовательности SEQ ID NO: 32, 33, 34, 35, 36, 40, 41, 42, 43, 44, 47, 66, 67, 85, 96, 103, 117, 119, 154, 165, 168, 186, 320, 321, 324, 327, 328 и 331. Некоторые из этих олигонуклеотидов проявляют по меньшей мере 80% ингибирование, включая те, которые нацелены на нуклеотидные основания 90-265 и 310-329. Они включают последовательности SEQ ID NO: 32, 33, 35, 40, 42 и 321. Некоторые из этих олигонуклеотидов проявляют по меньшей мере 90% ингибирование, включая те, которые нацелены на нуклеотидные основания 190-209 и 310-329 SEQ ID NO 1. Они включают последовательности SEQ ID NO: 40 и 321.

Как показано в табл. 6-20, некоторые из олигонуклеотидов, нацеленных на SEQ ID NO: 2, проявляют по меньшей мере 50% ингибирование, включая те, которые нацелены на нуклеотидные основания 1552-1572, 2187-2238, 2728-2779, 3452-2471, 3752-3771, 5025-5044, 5656-5675, 6200-6219, 7594-7613, 7840-8328, 9415-9434, 12526-12545, 13357-13524, 13642-13661, 13790-14130, 14243-14335, 14699-14777, 15587-15606, 16395-16488, 18233-18373, 24306-24340, 24472-24491, 24565-24676, 26400-26424, 26606-26982, 27054-27265, 27351-27370, 27548-27998, 28068-28087, 28181-28270 и 28369-28388 SEQ ID NO 2. Они включают последовательности SEQ ID NO: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50, 51, 53, 55, 56, 57, 64, 67, 72, 73, 75, 76, 81, 82, 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 96, 97, 100, 102, 103, 111, 112, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 130, 131, 132, 133, 137, 139, 140, 141, 145, 146, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 165, 166, 168, 169, 170, 171, 174, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 188, 190, 192, 195, 197, 199, 205, 206, 208, 211, 212, 224, 226, 230, 231, 250, 251, 252, 256, 300, 301, 304, 306, 307, 310, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331 и 332. Некоторые из этих олигонуклеотидов проявляют по меньшей мере 70% ингибирование, включая те, которые нацелены на нуклеотидные основания 3452-2471, 7840-8159, 8230-8249, 12526-12545, 13642-13661, 14075-14094, 14316-14335, 14758-14777, 16395-16414, 16469, 16488, 24655-24674, 26963, 26982, 27054-27126 и 27798-27817 SEQ ID NO 2. Они включают последовательности SEQ ID NO: 32, 33, 34, 35, 36, 40, 41, 42, 43, 44, 47, 67, 85, 96, 103, 117, 119, 154, 165, 168, 186, 251, 306, 320, 321, 324, 327, 328 и 331. Некоторые из этих олигонуклеотидов проявляют по меньшей мере 80% ингибирование, включая те, которые нацелены на нуклеотидные основания 7848-8023 SEQ ID NO 2. Они включают последовательности SEQ ID NO: 32, 33, 35, 40, 42 и 321. Некоторые из этих олигонуклеотидов проявляют по меньшей мере 90% ингибирование, включая те, которые нацелены на нуклеотидные основания 7870-7889 и 7990-8009 SEQ ID NO 2. Они включают последовательности SEQ ID NO: 40 и 321.

Пример 2. Дозозависимое антисмысловое ингибирование гена C9ORF72 человека в 5 клетках HepG2

Антисмысловые олигонуклеотиды из исследования, описанного выше, проявившие значительное ингибирование мРНК C9ORF72 in vitro, были выбраны и испытаны в различных дозах на клетках HepG2. Данные антисмысловые олигонуклеотиды испытывали в сериях экспериментов, которые обеспечивали сходные культуральные условия. Результаты каждого эксперимента представлены в отдельных таблицах, показанных ниже. Клетки высадили на планшеты в плотности 20000 клеток на лунку и трансфецировали с применением электропорации с помощью концентраций антисмыслового олигонуклеотида 82,3 нМ; 246,9 нМ; 740,7 нМ; 2222,2 нМ; 6666,7 нМ или 20000 нМ. По прошествии периода обработки в течение приблизительно 16 часов РНК выделили из клеток и измерили уровни мРНК C9ORF72 методом количественной ПЦР в режиме реального времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор RTS3750 праймеров-зондов для последовательности C9ORF72 человека. Уровни мРНК C9ORF72 скорректировали в соответствии с суммарным содержанием РНК, измеренным с помощью красителя RIBOGREEN^®. Результаты представлены в виде процента ингибирования C9ORF72 по сравнению с необработанными контрольными клетками.

Концентрация полумаксимального ингибирования (IC₅₀) для каждого олигонуклеотида также представлена в табл. 11-13. Как показано, уровни мРНК C9ORF72 были снижены дозозависимым способом в обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами клетках.

Пример 3. Дозозависимое антисмысловое ингибирование гена C9ORF72 человека в клетках HepG2

Антисмысловые олигонуклеотиды из исследования, описанного выше, проявившие значительное ингибирование мРНК C9ORF72 in vitro, были выбраны и испытаны в различных дозах на клетках HepG2. Данные антисмысловые олигонуклеотиды испытывали в сериях экспериментов, которые обеспечивали сходные культуральные условия. Результаты каждого эксперимента представлены в отдельных таблицах, показанных ниже. Клетки высадили на планшеты в плотности 20000 клеток на лунку и трансфецировали с применением электропорации с помощью концентраций антисмыслового олигонуклеотида 246,9 нМ; 740,7 нМ; 2222,2 нМ; 6666,7 нМ или 20000 нМ. По прошествии периода обработки в течение приблизительно 16 часов РНК выделили из клеток и измерили уровни суммарной мРНК C9ORF72, а также уровни мРНК транскрипта экзона 1, методом количественной ПЦР в режиме реального времени. Для измерения уровней суммарной мРНК C9ORF72 использовали набор RTS3750 праймеров-зондов для последовательности C9ORF72 человека.

Для измерения уровня информационного транскрипта экзона 1 использовали набор RTS3905 праймеров-зондов (прямая последовательность GGGTCTAGCAAGAGCAGGTG, обозначенная в данном документе как SEQ ID NO: 18; обратная последовательность GTCTTGGCAACAGCTGGAGAT, обозначенная в данном документе как SEQ ID NO: 19; последовательность зонда TGATGTCGACTCTTTGCCCACCGC, обозначенная в данном документе как SEQ ID NO: 20). Уровни мРНК C9ORF72 скорректировали в соответствии с суммарным содержанием РНК, измеренным с помощью красителя RIBOGREEN^®. Результаты представлены в виде процента ингибирования C9ORF72 по сравнению с необработанными контрольными клетками.

Концентрация полумаксимального ингибирования (IC₅₀) для каждого олигонуклеотида также представлена в табл. 14 и 15. Как показано, уровни мРНК C9ORF72 были снижены дозозависимым способом в обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами клетках. Сокращение «н.д.» указывает на то, что для этой конкретной дозы данные отсутствуют.

Пример 4. Антисмысловое ингибирование гена C90RF72 человека в клетках HepG2

Антисмысловые олигонуклеотиды были сконструированы для нацеливания на экспансию гексануклеотидного повтора нуклеиновой кислоты C9ORF72 и их действие было испытано на мРНК C9ORF72 in vitro. Данные антисмысловые олигонуклеотиды испытывали в сериях экспериментов, которые обеспечивали сходные культуральные условия. Результаты каждого эксперимента представлены в отдельных таблицах, показанных ниже. Последовательности ISIS 576816 и ISIS 577065 были включены в данные исследования для сравнения. Культивированные до плотности 35000 клеток на лунку фибробласты C9ORF72 трансфецировали с применением электропорации с помощью антисмыслового олигонуклеотида в концентрации 7000 нМ. По прошествии периода обработки в течение приблизительно 24 часов РНК выделили из клеток и измерили уровни мРНК C9ORF72 методом количественной ПЦР в режиме реального времени. Для измерения уровней мРНК использовали наборы праймеров-зондов человека RTS3750, RTS 3905 или RTS4097 (прямая последовательность CAAGCCACCGTCTCACTCAA, обозначенная в данном документе как SEQ ID NO: 24; обратная последовательность GTAGTGCTGTCTACTCCAGAGAGTTACC, обозначенная в данном документе как SEQ ID NO: 25; последовательность зонда CTTGGCTTCCCTCAAAAGACTGGCTAATGT, обозначенная в данном документе как SEQ ID NO: 26). Зонд набора RTS3750 нацелен на экзон 2 транскрипта мРНК, и поэтому измеряет суммарное количество транскриптов мРНК. Зонд набора RTS3905 нацелен на экспансию гексануклеотидного повтора, содержащее транскрипт,, поэтому измеряет только транскрипты мРНК, которые содержат экспансию гексануклеотидного повтора. Зонд набора RTS4097 нацелен на последовательность гена на сайте 3' экспансии гексануклеотидного повтора. Уровни мРНК скорректировали в соответствии с суммарным содержанием РНК, измеренным с помощью красителя RIBOGREEN®. Результаты представлены в виде процента ингибирования C9ORF72 по сравнению с необработанными контрольными клетками. Сокращение «н.д.» указывает на то, что этого конкретного антисмыслового олигонуклеотида отсутствуют данные.

Антисмысловые олигонуклеотиды в табл.16 были сконструированы в виде однотипных МОЕ-олигонуклеотидов или гэпмеров 3-10-3 МОЕ, 4-10-3 МОЕ, 4-10-4 МОЕ, 5-10-4 МОЕ или 5-10-5 МОЕ. Однотипные МОЕ-олигонуклеотиды составлены из 20 нуклеозидов в длину, причем каждый нуклеозид содержит группу 2'-МОЕ. Гэпмеры 3-10-3 МОЕ составлены из 16 нуклеозидов в длину, причем центральный гэп-сегмент содержит десять 2'-дезоксирибонуклеотидов и фланкирован сегментами-крыльями как на 5'-конце, так и на 3'-конце, каждый сегмент включает по три нуклеозида. Гэпмеры 4-10-3 МОЕ составлены из 17 нуклеозидов в длину, причем центральный гэп-сегмент содержит десять 2'-дезоксирибонуклеотидов и фланкирован сегментами-крыльями как на 5'-конце, так и на 3'-конце, включающими по четыре или три нуклеозида, соответственно. Гэпмеры 4-10-4 МОЕ составлены из 18 нуклеозидов в длину, причем центральный гэп-сегмент содержит десять 2'-дезоксирибонуклеотидов и фланкирован сегментами-крыльями как на 5'-конце, так и на 3'-конце, каждый сегмент включает по четыре нуклеозида. Гэпмеры 5-10-4 МОЕ составлены из 19 нуклеозидов в длину, причем центральный гэп-сегмент содержит десять 2'-дезоксирибонуклеотидов и фланкирован сегментами-крыльями как на 5'-конце, так и на 3'-конце, включающими по пять или четыре нуклеозида, соответственно. Гэпмеры 5-10-5 составлены из 20 нуклеозидов в длину, причем центральный гэп-сегмент содержит десять 2'-дезоксирибонуклеотидов и фланкирован сегментами-крыльями как на 5'-конце, так и на 3'-конце, каждый сегмент включает по 5 нуклеозидов. Каждый нуклеозид на сегменте-крыле 5' и каждый нуклеозид на сегменте-крыле 3' содержит группу 2'-МОЕ. Межнуклеозидные связи на всем протяжении каждого олигонуклеотида являются фосфоротиоатными связями. Все цитозиновые остатки на всем протяжении каждого олигонуклеотида являются 5-метилцитозинами. «Сайт инициации» указывает на самый крайний 5'-нуклеозид последовательности гена человека, на который нацелен антисмысловой олигонуклеотид. «Сайт терминации» указывает на самый крайний 3'-нуклеозид последовательности гена человека, на который нацелен антисмысловой олигонуклеотид. Каждый антисмысловой олигонуклеотид, перечисленный в табл. 16, нацелен на геномную последовательность C9ORF72 человека, обозначенную в данном документе как SEQ ID NO: 2 (комплементарная последовательность в базе данных GENBANK № доступа NT 008413.18, усеченная от нуклеозида 27535000 до 27565000) или SEQ ID NO: 13, которая является удлиненным вариантом гексануклеотидного повтора от интрона 1 гена C9ORF72.

Полученные данные указывают на то, что определенные антисмысловые олигонуклеотиды преимущественно ингибируют уровни транскриптов мРНК C9ORF72, которые содержат данный гексануклеотидный повтор.

Пример 5. Ингибирование и переносимость при лечении антисмысловыми олигонуклеотидами C9ORF72 грызунов in vivo

Для оценки переносимости ингибирования экспрессии C9ORF72 in vivo сконструировали и оценили на моделях мышей и крыс антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72 мышевидных грызунов.

Последовательность ISIS 571883 сконструировали в виде гэпмера 5-10-5 МОЕ, состоящего в длину из 20 нуклеозидов, причем центральный гэп-сегмент содержит десять 2'-дезоксирибонуклеотидов и фланкирован сегментами-крыльями как на 5'-конце, так и на 3'-конце, каждый сегмент включает по пять нуклеозидов. Каждый нуклеозид на сегменте-крыле 5' и каждый нуклеозид на сегменте-крыле 3' несут модификацию МОЕ. Межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоатные связи. Все цитозиновые остатки на всем протяжении данного гэпмера являются 5-метилцитозинами. Последовательность ISIS 571883 имеет целевой сайт инициации из нуклеозида 33704 геномной последовательности C9ORF72 мышевидных грызунов, обозначенную в данном документе как SEQ ID NO: 11 (комплементарная последовательность из базы данных GENBANK № доступа NT_166289.1, усеченная от нуклеозида 3587000 до 3625000).

Последовательность ISIS 603538 сконструировали в виде гэпмера 5-10-5 МОЕ, состоящего в длину из 20 нуклеозидов, причем центральный гэп-сегмент содержит десять 2'-дезоксирибонуклеотидов и фланкирован сегментами-крыльями как на 5'-конце, так и на 3'-конце, каждый сегмент включает по пять нуклеозидов. Каждый нуклеозид на сегменте-крыле 5' и каждый нуклеозид на сегменте-крыле 3' несут модификацию МОЕ. Межнуклеозидные связи представляют собой или фосфоротиоатные связи или фосфатэфирные связи (Gs Ао Со Со Gs Cs Ts Ts Gs As Gs Ts Ts Ts Gs Co Co Ao Cs А, в которых «s» обозначает фосфоротиоатную межнуклеозидную связь, «о» обозначает фосфатэфирную связь, a A, G, С, Τ - соответствующие нуклеозиды). Все цитозиновые остатки на всем протяжении данного гэпмера являются 5-метилцитозинами. Последовательность ISIS 603538 имеет целевой сайт инициации из нуклеозида 2872 последовательности мРНК C9ORF72 крысы, обозначенную в данном документе как SEQ ID NO: 12 (№ доступа в базе данных GENBANK NM_001007702.1).

Эксперимент на мышах 1

Каждой мыши в группе из 4 мышей линии C57BL/6 инъекционно ввели 50, 100, 300, 500 или 700 мкг последовательности ISIS 571883, введение провели посредством интрацеребровентрикулярной болюсной инъекции. Контрольной группе из четырех мышей линии C57/BL6 сходным образом ввели ФСБР. Животным провели анестезию с помощью 3% изофлурана и поместили на стереотаксическую рамку. После стерилизации места хирургического вмешательства каждой мыши инъецировали на -0,2 мм фасно от брегмы (Международная анатомическая номенклатура) в глубину на 3 мм дорсовентрально к брегме вышеупомянутые дозы ISIS 571883 с использованием шприца Гамильтона. Полученный разрез был закрыт наложением шва. Мышам дали возможность восстановиться в течение 14 дней, после чего провели эвтаназию животных в соответствии с гуманным протоколом, утвержденным Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных. Ткани головного и спинного мозга собрали и быстро заморозили в жидком азоте. Перед замораживанием сделали пять поперечных срезов тканей, используя матрицу мозга мыши.

Анализ РНК

Для анализа экспрессии мРНК C9ORF72 экстрагировали РНК из среза головного мозга размером 2-3 мм за местом введения из фронтального кортекса головного мозга и из люмбального среза ткани спинного мозга. Экспрессию мРНК C9ORF72 измерили методом ПЦР в режиме реального времени. Полученные данные представлены в табл. 17. Результаты указывают, что лечение увеличивающимися дозами ISIS 571883 привели к дозозависимому ингибированию экспрессии мРНК C9ORF72.

Оценивали также индукцию микроглиального маркера AIF-1 путем измерения проявления токсичности на ЦНС. Полученные данные представлены в табл. 18. Результаты указывают, что лечение увеличивающимися дозами ISIS 571883 не привели к статистически значимому увеличению экспрессии мРНК AIF-1. Следовательно, инъекция ISIS 571883 на этой модели была признана переносимой.

Эксперимент на мышах 2

Каждой мыши в группе из 4 мышей линии C57BL/6 инъекционно ввели 500 мкг последовательности ISIS 571883, введение провели посредством интрацеребровентрикулярной (ИЦВ) болюсной инъекции по методике, сходной с описанной выше. Контрольной группе из четырех мышей линии C57/BL6 сходным образом ввели ФСБР. Мышей исследовали в равноудаленные временные точки после ИЦВ введения.

Анализ поведения

Применили два стандартных исследования для оценки двигательного поведения: исследование с вращающимся стержнем и анализ силы сжатия. В случае исследований с вращающимся стержнем измеряли время задержки падения. Полученные данные этих исследований представлены в табл. 19 и 20. Результаты указывают, что не было отмечено статистически значимых изменений двигательного поведения мышей по причине антисмыслового ингибирования последовательностью ISIS 571883 или из-за ИЦВ введения. Следовательно, антисмысловое ингибирование гена C9ORF72 на этой модели было признано переносимым.

Эксперимент на крысах

Каждой крысе в группе из 4 крыс линии Спрег-Доули инъекционно ввели 700, 1000 или 3000 мкг последовательности ISIS 603538, введение провели посредством интратекальной болюсной инъекции. Контрольной группе из четырех крыс линии Спрег-Доули сходным образом ввели ФСБР. Животным провели анестезию с помощью 3% изофлурана и поместили на стереотаксическую рамку. После стерилизации места хирургического вмешательства каждой крысе инъецировали 30 мкл раствора антисмыслового олигонуклеотида (ACO), вводимого через интратекальный катетер длиной 8 см на глубину 2 см в спинномозговой канал с промывкой 50 мкл. Крысам дали возможность восстановиться в течение 4 недель, после чего провели эвтаназию животных в соответствии с гуманным протоколом, утвержденным Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных.

Анализ РНК

Для анализа экспрессии мРНК C9ORF72 экстрагировали из среза головного мозга размером 2-3 мм за местом введения из фронтального кортекса головного мозга и из цервикального и люмбального срезов ткани спинного мозга. Экспрессию мРНК C9ORF72 измерили методом ПЦР в режиме реального времени. Полученные данные представлены в табл. 21. Результаты указывают, что лечение увеличивающимися дозами ISIS 603538 привели к дозозависимому ингибированию экспрессии мРНК C9ORF72.

Оценивали также индукцию микроглиального маркера AIF-1 путем измерения проявления токсичности на ЦНС. Полученные данные представлены в табл. 22. Результаты указывают, что лечение увеличивающимися дозами ISIS 603538 не привели к статистически значимому увеличению экспрессии мРНК AIF-1. Следовательно, инъекция ISIS 603538 на этой модели была признана переносимой.

Анализ массы тела

Массу тела крыс измерили во временные точки через равноудаленные интервалы. Полученные данные представлены в табл. 23. Результаты указывают, что лечение увеличивающимися дозами ISIS 603538 не привели к каким-либо статистически значимым изменениям массы тела крыс.

Пример 6. Преимущественное ингибирование экспрессии гена C9ORF72 человека в линиях фибробластов двух пациентов

Две разные клеточные клинии пациентов-людей (F09-152 и F09-229) проанализировали с антисмысловыми олигонуклеотидами, которые нацелены на последовательность пре-мРНК C9ORF72 перед экзоном 1В, т.е. антисмысловые олигонуклеотиды нацелены на экспансию гексануклеотидного повтора, содержащего транскрипт, и антисмысловые олигонуклеотиды нацелены в прямом направлении считывания экзона 1. Целевые сайты инициации и терминации и участки-мишени в сравнении с SEQ ID NO: 1 и 2 для каждого олигонуклеотида представлены в табл.24. Последовательности ISIS 577061 и ISIS 577065 нацелены на последовательность C9ORF72 в обратном направлении считывания экзона 1В и непосредственно в обратном направлении гексануклеотидного повтора. Остальные олигонуклеотиды ISIS из табл. 24 нацелены в прямом направлении считывания последовательности C9ORF72 экзона 1В и гексануклеотидного повтора.

Клетки высадили на планшеты в плотности 20000 клеток на лунку и трансфецировали с применением электропорации с помощью концентраций антисмыслового олигонуклеотида 246,9 нМ; 740,7 нМ; 2222,2 нМ; 6666,7 нМ и 20000 нМ. По прошествии периода обработки в течение приблизительно 16 часов РНК выделили из клеток и измерили уровни мРНК C9ORF72 методом количественной ПЦР в режиме реального времени. Использовали два набора праймеров-зондов: (1) набор RTS3750 праймеров-зондов для гена C9ORF72 человека, который измеряет суммарные уровни мРНК, и (2) набор RTS3905, который нацелен на экспансию гексануклеотидного набора, содержащего транскрипт, что измеряет только транскрипты мРНК, которые содержат экспансию гексануклеотидного набора. Уровни мРНК C9ORF72 скорректировали в соответствии с суммарным содержанием РНК, измеренным с помощью красителя RIBOGREEN^®. Результаты представлены в виде процента ингибирования C9ORF72 по сравнению с необработанными контрольными клетками.

Как показано в табл. 25, два олигонуклеотида, которые нацелены в обратном направлении считывания экзона 1В и поэтому направлены на транскрипты мРНК, содержащие экспансию гексануклеотидного повтора (ISIS 577061 и ISIS 577065), не ингибируют уровни суммарной мРНК C9ORF72 (при измерении с помощью набора RTS3750), также, как и ISIS 576974, 576816 и 577083, которые нацелены в прямом направлении экзона 1В и поэтому не направлены на транскрипт мРНК, содержащий экспансию гексануклеотидного повтора. Уровни экспрессии транскрипта мРНК C9ORF72, содержащего экспансию гексануклеотидного повтора, являются низкими (около 10% от суммарной экспрессии продуктов гена C9ORF72), поэтому, олигонуклеотиды, нацеленные на транскрипт мРНК, содержащий экспансию гексануклеотидного повтора, несильно ингибируют суммарную мРНК C9ORF72 (при измерении набором RTS3905), как приведено в табл. 25. Таким образом, последовательности ISIS 577061 и ISIS 577065 преимущественно ингибируют экспрессию транскриптов мРНК, содержащих экспансию гексануклеотидного повтора.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Isis Pharmaceuticals, Inc.

<120> КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ МОДУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА C9ORF72

<130> BIOL0211WO

<140> PCT/US2013/065073

<141> 2013-10-15

<150> 61/714,132

<151> 2012-10-15

<160> 369

<170> Версия PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 3339

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<222> (203)..(1648)

<400> 1

acgtaaccta cggtgtcccg ctaggaaaga gaggtgcgtc aaacagcgac aagttccgcc 60

cacgtaaaag atgacgcttg gtgtgtcagc cgtccctgct gcccggttgc ttctcttttg 120

ggggcggggt ctagcaagag caggtgtggg tttaggagat atctccggag catttggata 180

atgtgacagt tggaatgcag tg atg tcg act ctt tgc cca ccg cca tct cca 232

Met Ser Thr Leu Cys Pro Pro Pro Ser Pro

1 5 10

gct gtt gcc aag aca gag att gct tta agt ggc aaa tca cct tta tta 280

Ala Val Ala Lys Thr Glu Ile Ala Leu Ser Gly Lys Ser Pro Leu Leu

15 20 25

gca gct act ttt gct tac tgg gac aat att ctt ggt cct aga gta agg 328

Ala Ala Thr Phe Ala Tyr Trp Asp Asn Ile Leu Gly Pro Arg Val Arg

30 35 40

cac att tgg gct cca aag aca gaa cag gta ctt ctc agt gat gga gaa 376

His Ile Trp Ala Pro Lys Thr Glu Gln Val Leu Leu Ser Asp Gly Glu

45 50 55

ata act ttt ctt gcc aac cac act cta aat gga gaa atc ctt cga aat 424

Ile Thr Phe Leu Ala Asn His Thr Leu Asn Gly Glu Ile Leu Arg Asn

60 65 70

gca gag agt ggt gct ata gat gta aag ttt ttt gtc ttg tct gaa aag 472

Ala Glu Ser Gly Ala Ile Asp Val Lys Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys

75 80 85 90

gga gtg att att gtt tca tta atc ttt gat gga aac tgg aat ggg gat 520

Gly Val Ile Ile Val Ser Leu Ile Phe Asp Gly Asn Trp Asn Gly Asp

95 100 105

cgc agc aca tat gga cta tca att ata ctt cca cag aca gaa ctt agt 568

Arg Ser Thr Tyr Gly Leu Ser Ile Ile Leu Pro Gln Thr Glu Leu Ser

110 115 120

ttc tac ctc cca ctt cat aga gtg tgt gtt gat aga tta aca cat ata 616

Phe Tyr Leu Pro Leu His Arg Val Cys Val Asp Arg Leu Thr His Ile

125 130 135

atc cgg aaa gga aga ata tgg atg cat aag gaa aga caa gaa aat gtc 664

Ile Arg Lys Gly Arg Ile Trp Met His Lys Glu Arg Gln Glu Asn Val

140 145 150

cag aag att atc tta gaa ggc aca gag aga atg gaa gat cag ggt cag 712

Gln Lys Ile Ile Leu Glu Gly Thr Glu Arg Met Glu Asp Gln Gly Gln

155 160 165 170

agt att att cca atg ctt act gga gaa gtg att cct gta atg gaa ctg 760

Ser Ile Ile Pro Met Leu Thr Gly Glu Val Ile Pro Val Met Glu Leu

175 180 185

ctt tca tct atg aaa tca cac agt gtt cct gaa gaa ata gat ata gct 808

Leu Ser Ser Met Lys Ser His Ser Val Pro Glu Glu Ile Asp Ile Ala

190 195 200

gat aca gta ctc aat gat gat gat att ggt gac agc tgt cat gaa ggc 856

Asp Thr Val Leu Asn Asp Asp Asp Ile Gly Asp Ser Cys His Glu Gly

205 210 215

ttt ctt ctc aat gcc atc agc tca cac ttg caa acc tgt ggc tgt tcc 904

Phe Leu Leu Asn Ala Ile Ser Ser His Leu Gln Thr Cys Gly Cys Ser

220 225 230

gtt gta gta ggt agc agt gca gag aaa gta aat aag ata gtc aga aca 952

Val Val Val Gly Ser Ser Ala Glu Lys Val Asn Lys Ile Val Arg Thr

235 240 245 250

tta tgc ctt ttt ctg act cca gca gag aga aaa tgc tcc agg tta tgt 1000

Leu Cys Leu Phe Leu Thr Pro Ala Glu Arg Lys Cys Ser Arg Leu Cys

255 260 265

gaa gca gaa tca tca ttt aaa tat gag tca ggg ctc ttt gta caa ggc 1048

Glu Ala Glu Ser Ser Phe Lys Tyr Glu Ser Gly Leu Phe Val Gln Gly

270 275 280

ctg cta aag gat tca act gga agc ttt gtg ctg cct ttc cgg caa gtc 1096

Leu Leu Lys Asp Ser Thr Gly Ser Phe Val Leu Pro Phe Arg Gln Val

285 290 295

atg tat gct cca tat ccc acc aca cac ata gat gtg gat gtc aat act 1144

Met Tyr Ala Pro Tyr Pro Thr Thr His Ile Asp Val Asp Val Asn Thr

300 305 310

gtg aag cag atg cca ccc tgt cat gaa cat att tat aat cag cgt aga 1192

Val Lys Gln Met Pro Pro Cys His Glu His Ile Tyr Asn Gln Arg Arg

315 320 325 330

tac atg aga tcc gag ctg aca gcc ttc tgg aga gcc act tca gaa gaa 1240

Tyr Met Arg Ser Glu Leu Thr Ala Phe Trp Arg Ala Thr Ser Glu Glu

335 340 345

gac atg gct cag gat acg atc atc tac act gac gaa agc ttt act cct 1288

Asp Met Ala Gln Asp Thr Ile Ile Tyr Thr Asp Glu Ser Phe Thr Pro

350 355 360

gat ttg aat att ttt caa gat gtc tta cac aga gac act cta gtg aaa 1336

Asp Leu Asn Ile Phe Gln Asp Val Leu His Arg Asp Thr Leu Val Lys

365 370 375

gcc ttc ctg gat cag gtc ttt cag ctg aaa cct ggc tta tct ctc aga 1384

Ala Phe Leu Asp Gln Val Phe Gln Leu Lys Pro Gly Leu Ser Leu Arg

380 385 390

agt act ttc ctt gca cag ttt cta ctt gtc ctt cac aga aaa gcc ttg 1432

Ser Thr Phe Leu Ala Gln Phe Leu Leu Val Leu His Arg Lys Ala Leu

395 400 405 410

aca cta ata aaa tat ata gaa gac gat acg cag aag gga aaa aag ccc 1480

Thr Leu Ile Lys Tyr Ile Glu Asp Asp Thr Gln Lys Gly Lys Lys Pro

415 420 425

ttt aaa tct ctt cgg aac ctg aag ata gac ctt gat tta aca gca gag 1528

Phe Lys Ser Leu Arg Asn Leu Lys Ile Asp Leu Asp Leu Thr Ala Glu

430 435 440

ggc gat ctt aac ata ata atg gct ctg gct gag aaa att aaa cca ggc 1576

Gly Asp Leu Asn Ile Ile Met Ala Leu Ala Glu Lys Ile Lys Pro Gly

445 450 455

cta cac tct ttt atc ttt gga aga cct ttc tac act agt gtg caa gaa 1624

Leu His Ser Phe Ile Phe Gly Arg Pro Phe Tyr Thr Ser Val Gln Glu

460 465 470

cga gat gtt cta atg act ttt taa atgtgtaact taataagcct attccatcac 1678

Arg Asp Val Leu Met Thr Phe

475 480

aatcatgatc gctggtaaag tagctcagtg gtgtggggaa acgttcccct ggatcatact 1738

ccagaattct gctctcagca attgcagtta agtaagttac actacagttc tcacaagagc 1798

ctgtgagggg atgtcaggtg catcattaca ttgggtgtct cttttcctag atttatgctt 1858

ttgggataca gacctatgtt tacaatataa taaatattat tgctatcttt taaagatata 1918

ataataggat gtaaacttga ccacaactac tgtttttttg aaatacatga ttcatggttt 1978

acatgtgtca aggtgaaatc tgagttggct tttacagata gttgactttc tatcttttgg 2038

cattctttgg tgtgtagaat tactgtaata cttctgcaat caactgaaaa ctagagcctt 2098

taaatgattt caattccaca gaaagaaagt gagcttgaac ataggatgag ctttagaaag 2158

aaaattgatc aagcagatgt ttaattggaa ttgattatta gatcctactt tgtggattta 2218

gtccctggga ttcagtctgt agaaatgtct aatagttctc tatagtcctt gttcctggtg 2278

aaccacagtt agggtgtttt gtttatttta ttgttcttgc tattgttgat attctatgta 2338

gttgagctct gtaaaaggaa attgtatttt atgttttagt aattgttgcc aactttttaa 2398

attaattttc attatttttg agccaaattg aaatgtgcac ctcctgtgcc ttttttctcc 2458

ttagaaaatc taattacttg gaacaagttc agatttcact ggtcagtcat tttcatcttg 2518

ttttcttctt gctaagtctt accatgtacc tgctttggca atcattgcaa ctctgagatt 2578

ataaaatgcc ttagagaata tactaactaa taagatcttt ttttcagaaa cagaaaatag 2638

ttccttgagt acttccttct tgcatttctg cctatgtttt tgaagttgtt gctgtttgcc 2698

tgcaataggc tataaggaat agcaggagaa attttactga agtgctgttt tcctaggtgc 2758

tactttggca gagctaagtt atcttttgtt ttcttaatgc gtttggacca ttttgctggc 2818

tataaaataa ctgattaata taattctaac acaatgttga cattgtagtt acacaaacac 2878

aaataaatat tttatttaaa attctggaag taatataaaa gggaaaatat atttataaga 2938

aagggataaa ggtaatagag cccttctgcc ccccacccac caaatttaca caacaaaatg 2998

acatgttcga atgtgaaagg tcataatagc tttcccatca tgaatcagaa agatgtggac 3058

agcttgatgt tttagacaac cactgaacta gatgactgtt gtactgtagc tcagtcattt 3118

aaaaaatata taaatactac cttgtagtgt cccatactgt gttttttaca tggtagattc 3178

ttatttaagt gctaactggt tattttcttt ggctggttta ttgtactgtt atacagaatg 3238

taagttgtac agtgaaataa gttattaaag catgtgtaaa cattgttata tatcttttct 3298

cctaaatgga gaattttgaa taaaatatat ttgaaatttt g 3339

<210> 2

<211> 30001

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 2

caaagaaaag ggggaggttt tgttaaaaaa gagaaatgtt acatagtgct ctttgagaaa 60

attcattggc actattaagg atctgaggag ctggtgagtt tcaactggtg agtgatggtg 120

gtagataaaa ttagagctgc agcaggtcat tttagcaact attagataaa actggtctca 180

ggtcacaacg ggcagttgca gcagctggac ttggagagaa ttacactgtg ggagcagtgt 240

catttgtcct aagtgctttt ctacccccta cccccactat tttagttggg tataaaaaga 300

atgacccaat ttgtatgatc aactttcaca aagcatagaa cagtaggaaa agggtctgtt 360

tctgcagaag gtgtagacgt tgagagccat tttgtgtatt tattcctccc tttcttcctc 420

ggtgaatgat taaaacgttc tgtgtgattt ttagtgatga aaaagattaa atgctactca 480

ctgtagtaag tgccatctca cacttgcaga tcaaaaggca cacagtttaa aaaacctttg 540

tttttttaca catctgagtg gtgtaaatgc tactcatctg tagtaagtgg aatctataca 600

cctgcagacc aaaagacgca aggtttcaaa aatctttgtg ttttttacac atcaaacaga 660

atggtacgtt tttcaaaagt taaaaaaaaa caactcatcc acatattgca actagcaaaa 720

atgacattcc ccagtgtgaa aatcatgctt gagagaattc ttacatgtaa aggcaaaatt 780

gcgatgactt tgcaggggac cgtgggattc ccgcccgcag tgccggagct gtcccctacc 840

agggtttgca gtggagtttt gaatgcactt aacagtgtct tacggtaaaa acaaaatttc 900

atccaccaat tatgtgttga gcgcccactg cctaccaagc acaaacaaaa ccattcaaaa 960

ccacgaaatc gtcttcactt tctccagatc cagcagcctc ccctattaag gttcgcacac 1020

gctattgcgc caacgctcct ccagagcggg tcttaagata aaagaacagg acaagttgcc 1080

ccgccccatt tcgctagcct cgtgagaaaa cgtcatcgca catagaaaac agacagacgt 1140

aacctacggt gtcccgctag gaaagagagg tgcgtcaaac agcgacaagt tccgcccacg 1200

taaaagatga cgcttggtgt gtcagccgtc cctgctgccc ggttgcttct cttttggggg 1260

cggggtctag caagagcagg tgtgggttta ggaggtgtgt gtttttgttt ttcccaccct 1320

ctctccccac tacttgctct cacagtactc gctgagggtg aacaagaaaa gacctgataa 1380

agattaacca gaagaaaaca aggagggaaa caaccgcagc ctgtagcaag ctctggaact 1440

caggagtcgc gcgctagggg ccggggccgg ggccggggcg tggtcggggc gggcccgggg 1500

gcgggcccgg ggcggggctg cggttgcggt gcctgcgccc gcggcggcgg aggcgcaggc 1560

ggtggcgagt gggtgagtga ggaggcggca tcctggcggg tggctgtttg gggttcggct 1620

gccgggaaga ggcgcgggta gaagcggggg ctctcctcag agctcgacgc atttttactt 1680

tccctctcat ttctctgacc gaagctgggt gtcgggcttt cgcctctagc gactggtgga 1740

attgcctgca tccgggcccc gggcttcccg gcggcggcgg cggcggcggc ggcgcaggga 1800

caagggatgg ggatctggcc tcttccttgc tttcccgccc tcagtacccg agctgtctcc 1860

ttcccgggga cccgctggga gcgctgccgc tgcgggctcg agaaaaggga gcctcgggta 1920

ctgagaggcc tcgcctgggg gaaggccgga gggtgggcgg cgcgcggctt ctgcggacca 1980

agtcggggtt cgctaggaac ccgagacggt ccctgccggc gaggagatca tgcgggatga 2040

gatgggggtg tggagacgcc tgcacaattt cagcccaagc ttctagagag tggtgatgac 2100

ttgcatatga gggcagcaat gcaagtcggt gtgctcccca ttctgtggga catgacctgg 2160

ttgcttcaca gctccgagat gacacagact tgcttaaagg aagtgactat tgtgacttgg 2220

gcatcacttg actgatggta atcagttgtc taaagaagtg cacagattac atgtccgtgt 2280

gctcattggg tctatctggc cgcgttgaac accaccaggc tttgtattca gaaacaggag 2340

ggaggtcctg cactttccca ggaggggtgg ccctttcaga tgcaatcgag attgttaggc 2400

tctgggagag tagttgcctg gttgtggcag ttggtaaatt tctattcaaa cagttgccat 2460

gcaccagttg ttcacaacaa gggtacgtaa tctgtctggc attacttcta cttttgtaca 2520

aaggatcaaa aaaaaaaaag atactgttaa gatatgattt ttctcagact ttgggaaact 2580

tttaacataa tctgtgaata tcacagaaac aagactatca tataggggat attaataacc 2640

tggagtcaga atacttgaaa tacggtgtca tttgacacgg gcattgttgt caccacctct 2700

gccaaggcct gccactttag gaaaaccctg aatcagttgg aaactgctac atgctgatag 2760

tacatctgaa acaagaacga gagtaattac cacattccag attgttcact aagccagcat 2820

ttacctgctc caggaaaaaa ttacaagcac cttatgaagt tgataaaata ttttgtttgg 2880

ctatgttggc actccacaat ttgctttcag agaaacaaag taaaccaagg aggacttctg 2940

tttttcaagt ctgccctcgg gttctattct acgttaatta gatagttccc aggaggacta 3000

ggttagccta cctattgtct gagaaacttg gaactgtgag aaatggccag atagtgatat 3060

gaacttcacc ttccagtctt ccctgatgtt gaagattgag aaagtgttgt gaactttctg 3120

gtactgtaaa cagttcactg tccttgaagt ggtcctgggc agctcctgtt gtggaaagtg 3180

gacggtttag gatcctgctt ctctttgggc tgggagaaaa taaacagcat ggttacaagt 3240

attgagagcc aggttggaga aggtggctta cacctgtaat gccagagctt tgggaggcgg 3300

aggcaagagg atcacttgaa gccaggagtt caagctcaac ctgggcaacg tagaccctgt 3360

ctctacaaaa aattaaaaac ttagccgggc gtggtgatgt gcacctgtag tcctagctac 3420

ttgggaggct gaggcaggag ggtcatttga gcccaagagt ttgaagttac cgagagctat 3480

gatcctgcca gtgcattcca gcctggatga caaaacgaga ccctgtctct aaaaaacaag 3540

aagtgagggc tttatgattg tagaattttc actacaatag cagtggacca accacctttc 3600

taaataccaa tcagggaaga gatggttgat tttttaacag acgtttaaag aaaaagcaaa 3660

acctcaaact tagcactcta ctaacagttt tagcagatgt taattaatgt aatcatgtct 3720

gcatgtatgg gattatttcc agaaagtgta ttgggaaacc tctcatgaac cctgtgagca 3780

agccaccgtc tcactcaatt tgaatcttgg cttccctcaa aagactggct aatgtttggt 3840

aactctctgg agtagacagc actacatgta cgtaagatag gtacataaac aactattggt 3900

tttgagctga tttttttcag ctgcatttgc atgtatggat ttttctcacc aaagacgatg 3960

acttcaagta ttagtaaaat aattgtacag ctctcctgat tatacttctc tgtgacattt 4020

catttcccag gctatttctt ttggtaggat ttaaaactaa gcaattcagt atgatctttg 4080

tccttcattt tctttcttat tctttttgtt tgtttgtttg tttgtttttt tcttgaggca 4140

gagtctctct ctgtcgccca ggctggagtg cagtggcgcc atctcagctc attgcaacct 4200

ctgccacctc cgggttcaag agattctcct gcctcagcct cccgagtagc tgggattaca 4260

ggtgtccacc accacacccg gctaattttt tgtattttta gtagaggtgg ggtttcacca 4320

tgttggccag gctggtcttg agctcctgac ctcaggtgat ccacctgcct cggcctacca 4380

aagagctggg ataacaggtg tgacccacca tgcccggccc attttttttt tcttattctg 4440

ttaggagtga gagtgtaact agcagtataa tagttcaatt ttcacaacgt ggtaaaagtt 4500

tccctataat tcaatcagat tttgctccag ggttcagttc tgttttagga aatactttta 4560

ttttcagttt aatgatgaaa tattagagtt gtaatattgc ctttatgatt atccaccttt 4620

ttaacctaaa agaatgaaag aaaaatatgt ttgcaatata attttatggt tgtatgttaa 4680

cttaattcat tatgttggcc tccagtttgc tgttgttagt tatgacagca gtagtgtcat 4740

taccatttca attcagatta cattcctata tttgatcatt gtaaactgac tgcttacatt 4800

gtattaaaaa cagtggatat tttaaagaag ctgtacggct tatatctagt gctgtctctt 4860

aagactatta aattgataca acatatttaa aagtaaatat tacctaaatg aatttttgaa 4920

attacaaata cacgtgttaa aactgtcgtt gtgttcaacc atttctgtac atacttagag 4980

ttaactgttt tgccaggctc tgtatgccta ctcataatat gataaaagca ctcatctaat 5040

gctctgtaaa tagaagtcag tgctttccat cagactgaac tctcttgaca agatgtggat 5100

gaaattcttt aagtaaaatt gtttactttg tcatacattt acagatcaaa tgttagctcc 5160

caaagcaatc atatggcaaa gataggtata tcatagtttg cctattagct gctttgtatt 5220

gctattatta taaatagact tcacagtttt agacttgctt aggtgaaatt gcaattcttt 5280

ttactttcag tcttagataa caagtcttca attatagtac aatcacacat tgcttaggaa 5340

tgcatcatta ggcgattttg tcattatgca aacatcatag agtgtactta cacaaaccta 5400

gatagtatag cctttatgta cctaggccgt atggtatagt ctgttgctcc taggccacaa 5460

acctgtacaa ctgttactgt actgaatact atagacagtt gtaacacagt ggtaaatatt 5520

tatctaaata tatgcaaaca gagaaaaggt acagtaaaag tatggtataa aagataatgg 5580

tatacctgtg taggccactt accacgaatg gagcttgcag gactagaagt tgctctgggt 5640

gagtcagtga gtgagtggtg aattaatgtg aaggcctaga acactgtaca ccactgtaga 5700

ctataaacac agtacgctga agctacacca aatttatctt aacagttttt cttcaataaa 5760

aaattataac tttttaactt tgtaaacttt ttaatttttt aacttttaaa atacttagct 5820

tgaaacacaa atacattgta tagctataca aaaatatttt ttctttgtat ccttattcta 5880

gaagcttttt tctattttct attttaaatt ttttttttta cttgttagtc gtttttgtta 5940

aaaactaaaa cacacacact ttcacctagg catagacagg attaggatca tcagtatcac 6000

tcccttccac ctcactgcct tccacctcca catcttgtcc cactggaagg tttttagggg 6060

caataacaca catgtagctg tcacctatga taacagtgct ttctgttgaa tacctcctga 6120

aggacttgcc tgaggctgtt ttacatttaa cttaaaaaaa aaaaaagtag aaggagtgca 6180

ctctaaaata acaataaaag gcatagtata gtgaatacat aaaccagcaa tgtagtagtt 6240

tattatcaag tgttgtacac tgtaataatt gtatgtgcta tactttaaat aacttgcaaa 6300

atagtactaa gaccttatga tggttacagt gtcactaagg caatagcata ttttcaggtc 6360

cattgtaatc taatgggact accatcatat atgcagtcta ccattgactg aaacgttaca 6420

tggcacataa ctgtatttgc aagaatgatt tgttttacat taatatcaca taggatgtac 6480

ctttttagag tggtatgttt atgtggatta agatgtacaa gttgagcaag gggaccaaga 6540

gccctgggtt ctgtcttgga tgtgagcgtt tatgttcttc tcctcatgtc tgttttctca 6600

ttaaattcaa aggcttgaac gggccctatt tagcccttct gttttctacg tgttctaaat 6660

aactaaagct tttaaattct agccatttag tgtagaactc tctttgcagt gatgaaatgc 6720

tgtattggtt tcttggctag catattaaat atttttatct ttgtcttgat acttcaatgt 6780

cgttttaaac atcaggatcg ggcttcagta ttctcataac cagagagttc actgaggata 6840

caggactgtt tgcccatttt ttgttatggc tccagacttg tggtatttcc atgtcttttt 6900

tttttttttt ttttttgacc ttttagcggc tttaaagtat ttctgttgtt aggtgttgta 6960

ttacttttct aagattactt aacaaagcac cacaaactga gtggctttaa acaacagcaa 7020

tttattctct cacaattcta gaagctagaa gtccgaaatc aaagtgttga caggggcatg 7080

atcttcaaga gagaagactc tttccttgcc tcttcctggc ttctggtggt taccagcaat 7140

cctgagtgtt cctttcttgc cttgtagttt caacaatcca gtatctgcct tttgtcttca 7200

catggctgtc taccatttgt ctctgtgtct ccaaatctct ctccttataa acacagcagt 7260

tattggatta ggccccactc taatccagta tgaccccatt ttaacatgat tacacttatt 7320

tctagataag gtcacattca cgtacaccaa gggttaggaa ttgaacatat ctttttgggg 7380

gacacaattc aacccacaag tgtcagtctc tagctgagcc tttcccttcc tgtttttctc 7440

ctttttagtt gctatgggtt aggggccaaa tctccagtca tactagaatt gcacatggac 7500

tggatatttg ggaatactgc gggtctattc tatgagcttt agtatgtaac atttaatatc 7560

agtgtaaaga agcccttttt taagttattt ctttgaattt ctaaatgtat gccctgaata 7620

taagtaacaa gttaccatgt cttgtaaaat gatcatatca acaaacattt aatgtgcacc 7680

tactgtgcta gttgaatgtc tttatcctga taggagataa caggattcca catctttgac 7740

ttaagaggac aaaccaaata tgtctaaatc atttggggtt ttgatggata tctttaaatt 7800

gctgaaccta atcattggtt tcatatgtca ttgtttagat atctccggag catttggata 7860

atgtgacagt tggaatgcag tgatgtcgac tctttgccca ccgccatctc cagctgttgc 7920

caagacagag attgctttaa gtggcaaatc acctttatta gcagctactt ttgcttactg 7980

ggacaatatt cttggtccta gagtaaggca catttgggct ccaaagacag aacaggtact 8040

tctcagtgat ggagaaataa cttttcttgc caaccacact ctaaatggag aaatccttcg 8100

aaatgcagag agtggtgcta tagatgtaaa gttttttgtc ttgtctgaaa agggagtgat 8160

tattgtttca ttaatctttg atggaaactg gaatggggat cgcagcacat atggactatc 8220

aattatactt ccacagacag aacttagttt ctacctccca cttcatagag tgtgtgttga 8280

tagattaaca catataatcc ggaaaggaag aatatggatg cataaggtaa gtgatttttc 8340

agcttattaa tcatgttaac ctatctgttg aaagcttatt ttctggtaca tataaatctt 8400

atttttttaa ttatatgcag tgaacatcaa acaataaatg ttatttattt tgcatttacc 8460

ctattagata caaatacatc tggtctgata cctgtcatct tcatattaac tgtggaaggt 8520

acgaaatggt agctccacat tatagatgaa aagctaaagc ttagacaaat aaagaaactt 8580

ttagaccctg gattcttctt gggagccttt gactctaata ccttttgttt ccctttcatt 8640

gcacaattct gtcttttgct tactactatg tgtaagtata acagttcaaa gtaatagttt 8700

cataagctgt tggtcatgta gcctttggtc tctttaacct ctttgccaag ttcccaggtt 8760

cataaaatga ggaggttgaa tggaatggtt cccaagagaa ttccttttaa tcttacagaa 8820

attattgttt tcctaaatcc tgtagttgaa tatataatgc tatttacatt tcagtatagt 8880

tttgatgtat ctaaagaaca cattgaattc tccttcctgt gttccagttt gatactaacc 8940

tgaaagtcca ttaagcatta ccagttttaa aaggcttttg cccaatagta aggaaaaata 9000

atatctttta aaagaataat tttttactat gtttgcaggc ttacttcctt ttttctcaca 9060

ttatgaaact cttaaaatca ggagaatctt ttaaacaaca tcataatgtt taatttgaaa 9120

agtgcaagtc attcttttcc tttttgaaac tatgcagatg ttacattgac tgttttctgt 9180

gaagttatct ttttttcact gcagaataaa ggttgttttg attttatttt gtattgttta 9240

tgagaacatg catttgttgg gttaatttcc tacccctgcc cccatttttt ccctaaagta 9300

gaaagtattt ttcttgtgaa ctaaattact acacaagaac atgtctattg aaaaataagc 9360

aagtatcaaa atgttgtggg ttgttttttt aaataaattt tctcttgctc aggaaagaca 9420

agaaaatgtc cagaagatta tcttagaagg cacagagaga atggaagatc aggtatatgc 9480

aaattgcata ctgtcaaatg tttttctcac agcatgtatc tgtataaggt tgatggctac 9540

atttgtcaag gccttggaga catacgaata agcctttaat ggagctttta tggaggtgta 9600

cagaataaac tggaggaaga tttccatatc ttaaacccaa agagttaaat cagtaaacaa 9660

aggaaaatag taattgcatc tacaaattaa tatttgctcc cttttttttt ctgtttgccc 9720

agaataaatt ttggataact tgttcatagt aaaaataaaa aaaattgtct ctgatatgtt 9780

ctttaaggta ctacttctcg aacctttccc tagaagtagc tgtaacagaa ggagagcata 9840

tgtacccctg aggtatctgt ctggggtgta ggcccaggtc cacacaatat ttcttctaag 9900

tcttatgttg tatcgttaag actcatgcaa tttacatttt attccataac tattttagta 9960

ttaaaatttg tcagtgatat ttcttaccct ctcctctagg aaaatgtgcc atgtttatcc 10020

cttggctttg aatgcccctc aggaacagac actaagagtt tgagaagcat ggttacaagg 10080

gtgtggcttc ccctgcggaa actaagtaca gactatttca ctgtaaagca gagaagttct 10140

tttgaaggag aatctccagt gaagaaagag ttcttcactt ttacttccat ttcctcttgt 10200

gggtgaccct caatgctcct tgtaaaactc caatatttta aacatggctg ttttgccttt 10260

ctttgcttct ttttagcatg aatgagacag atgatacttt aaaaaagtaa ttaaaaaaaa 10320

aaacttgtga aaatacatgg ccataataca gaacccaata caatgatctc ctttaccaaa 10380

ttgttatgtt tgtacttttg tagatagctt tccaattcag agacagttat tctgtgtaaa 10440

ggtctgactt aacaagaaaa gatttccctt tacccaaaga atcccagtcc ttatttgctg 10500

gtcaataagc agggtcccca ggaatggggt aactttcagc accctctaac ccactagtta 10560

ttagtagact aattaagtaa acttatcgca agttgaggaa acttagaacc aactaaaatt 10620

ctgcttttac tgggattttg ttttttcaaa ccagaaacct ttacttaagt tgactactat 10680

taatgaattt tggtctctct tttaagtgct cttcttaaaa atgttatctt actgctgaga 10740

agttcaagtt tgggaagtac aaggaggaat agaaacttaa gagattttct tttagagcct 10800

cttctgtatt tagccctgta ggattttttt tttttttttt ttttttggtg ttgttgagct 10860

tcagtgaggc tattcattca cttatactga taatgtctga gatactgtga atgaaatact 10920

atgtatgctt aaacctaaga ggaaatattt tcccaaaatt attcttcccg aaaaggagga 10980

gttgcctttt gattgagttc ttgcaaatct cacaacgact ttattttgaa caatactgtt 11040

tggggatgat gcattagttt gaaacaactt cagttgtagc tgtcatctga taaaattgct 11100

tcacagggaa ggaaatttaa cacggatcta gtcattattc ttgttagatt gaatgtgtga 11160

attgtaattg taaacaggca tgataattat tactttaaaa actaaaaaca gtgaatagtt 11220

agttgtggag gttactaaag gatggttttt ttttaaataa aactttcagc attatgcaaa 11280

tgggcatatg gcttaggata aaacttccag aagtagcatc acatttaaat tctcaagcaa 11340

cttaataata tggggctctg aaaaactggt taaggttact ccaaaaatgg ccctgggtct 11400

gacaaagatt ctaacttaaa gatgcttatg aagactttga gtaaaatcat ttcataaaat 11460

aagtgaggaa aaacaactag tattaaattc atcttaaata atgtatgatt taaaaaatat 11520

gtttagctaa aaatgcatag tcatttgaca atttcattta tatctcaaaa aatttactta 11580

accaagttgg tcacaaaact gatgagactg gtggtggtag tgaataaatg agggaccatc 11640

catatttgag acactttaca tttgtgatgt gttatactga attttcagtt tgattctata 11700

gactacaaat ttcaaaatta caatttcaag atgtaataag tagtaatatc ttgaaatagc 11760

tctaaaggga atttttctgt tttattgatt cttaaaatat atgtgctgat tttgatttgc 11820

atttgggtag attatacttt tatgagtatg gaggttaggt attgattcaa gttttcctta 11880

cctatttggt aaggatttca aagtcttttt gtgcttggtt ttcctcattt ttaaatatga 11940

aatatattga tgacctttaa caaatttttt ttatctcaaa ttttaaagga gatcttttct 12000

aaaagaggca tgatgactta atcattgcat gtaacagtaa acgataaacc aatgattcca 12060

tactctctaa agaataaaag tgagctttag ggccgggcat ggtcagaaat ttgacaccaa 12120

cctggccaac atggcgaaac cccgtctcta ctaaaaatac aaaaatcagc cgggcatggt 12180

ggcggcacct atagtcccag ctacttggga ggatgagaca ggagagtcac ttgaacctgg 12240

gaggagaggt tgcagtgagc tgagatcacg ccattgcact ccagcctgag caatgaaagc 12300

aaaactccat ctcaaaaaaa aaaaaagaaa agaaagaata aaagtgagct ttggattgca 12360

tataaatcct ttagacatgt agtagacttg tttgatactg tgtttgaaca aattacgaag 12420

tattttcatc aaagaatgtt attgtttgat gttattttta ttttttattg cccagcttct 12480

ctcatattac gtgattttct tcacttcatg tcactttatt gtgcagggtc agagtattat 12540

tccaatgctt actggagaag tgattcctgt aatggaactg ctttcatcta tgaaatcaca 12600

cagtgttcct gaagaaatag atgtaagttt aaatgagagc aattatacac tttatgagtt 12660

ttttggggtt atagtattat tatgtatatt attaatattc taattttaat agtaaggact 12720

ttgtcataca tactattcac atacagtatt agccacttta gcaaataagc acacacaaaa 12780

tcctggattt tatggcaaaa cagaggcatt tttgatcagt gatgacaaaa ttaaattcat 12840

tttgtttatt tcattacttt tataattcct aaaagtggga ggatcccagc tcttatagga 12900

gcaattaata tttaatgtag tgtcttttga aacaaaactg tgtgccaaag tagtaaccat 12960

taatggaagt ttacttgtag tcacaaattt agtttcctta atcatttgtt gaggacgttt 13020

tgaatcacac actatgagtg ttaagagata cctttaggaa actattcttg ttgttttctg 13080

attttgtcat ttaggttagt ctcctgattc tgacagctca gaagaggaag ttgttcttgt 13140

aaaaattgtt taacctgctt gaccagcttt cacatttgtt cttctgaagt ttatggtagt 13200

gcacagagat tgttttttgg ggagtcttga ttctcggaaa tgaaggcagt gtgttatatt 13260

gaatccagac ttccgaaaac ttgtatatta aaagtgttat ttcaacacta tgttacagcc 13320

agactaattt ttttattttt tgatgcattt tagatagctg atacagtact caatgatgat 13380

gatattggtg acagctgtca tgaaggcttt cttctcaagt aagaattttt cttttcataa 13440

aagctggatg aagcagatac catcttatgc tcacctatga caagatttgg aagaaagaaa 13500

ataacagact gtctacttag attgttctag ggacattacg tatttgaact gttgcttaaa 13560

tttgtgttat ttttcactca ttatatttct atatatattt ggtgttattc catttgctat 13620

ttaaagaaac cgagtttcca tcccagacaa gaaatcatgg ccccttgctt gattctggtt 13680

tcttgtttta cttctcatta aagctaacag aatcctttca tattaagttg tactgtagat 13740

gaacttaagt tatttaggcg tagaacaaaa ttattcatat ttatactgat ctttttccat 13800

ccagcagtgg agtttagtac ttaagagttt gtgcccttaa accagactcc ctggattaat 13860

gctgtgtacc cgtgggcaag gtgcctgaat tctctataca cctatttcct catctgtaaa 13920

atggcaataa tagtaatagt acctaatgtg tagggttgtt ataagcattg agtaagataa 13980

ataatataaa gcacttagaa cagtgcctgg aacataaaaa cacttaataa tagctcatag 14040

ctaacatttc ctatttacat ttcttctaga aatagccagt atttgttgag tgcctacatg 14100

ttagttcctt tactagttgc tttacatgta ttatcttata ttctgtttta aagtttcttc 14160

acagttacag attttcatga aattttactt ttaataaaag agaagtaaaa gtataaagta 14220

ttcactttta tgttcacagt cttttccttt aggctcatga tggagtatca gaggcatgag 14280

tgtgtttaac ctaagagcct taatggcttg aatcagaagc actttagtcc tgtatctgtt 14340

cagtgtcagc ctttcataca tcattttaaa tcccatttga ctttaagtaa gtcacttaat 14400

ctctctacat gtcaatttct tcagctataa aatgatggta tttcaataaa taaatacatt 14460

aattaaatga tattatactg actaattggg ctgttttaag gctcaataag aaaatttctg 14520

tgaaaggtct ctagaaaatg taggttccta tacaaataaa agataacatt gtgcttatag 14580

cttcggtgtt tatcatataa agctattctg agttatttga agagctcacc tacttttttt 14640

tgtttttagt ttgttaaatt gttttatagg caatgttttt aatctgtttt ctttaactta 14700

cagtgccatc agctcacact tgcaaacctg tggctgttcc gttgtagtag gtagcagtgc 14760

agagaaagta aataaggtag tttattttat aatctagcaa atgatttgac tctttaagac 14820

tgatgatata tcatggattg tcatttaaat ggtaggttgc aattaaaatg atctagtagt 14880

ataaggaggc aatgtaatct catcaaattg ctaagacacc ttgtggcaac agtgagtttg 14940

aaataaactg agtaagaatc atttatcagt ttattttgat agctcggaaa taccagtgtc 15000

agtagtgtat aaatggtttt gagaatatat taaaatcaga tatataaaaa aaattactct 15060

tctatttccc aatgttatct ttaacaaatc tgaagatagt catgtacttt tggtagtagt 15120

tccaaagaaa tgttatttgt ttattcatct tgatttcatt gtcttcgctt tccttctaaa 15180

tctgtccctt ctagggagct attgggatta agtggtcatt gattattata ctttattcag 15240

taatgtttct gaccctttcc ttcagtgcta cttgagttaa ttaaggatta atgaacagtt 15300

acatttccaa gcattagcta ataaactaaa ggattttgca cttttcttca ctgaccatta 15360

gttagaaaga gttcagagat aagtatgtgt atctttcaat ttcagcaaac ctaatttttt 15420

aaaaaaagtt ttacatagga aatatgttgg aaatgatact ttacaaagat attcataatt 15480

tttttttgta atcagctact ttgtatattt acatgagcct taatttatat ttctcatata 15540

accatttatg agagcttagt atacctgtgt cattatattg catctacgaa ctagtgacct 15600

tattccttct gttacctcaa acaggtggct ttccatctgt gatctccaaa gccttaggtt 15660

gcacagagtg actgccgagc tgctttatga agggagaaag gctccatagt tggagtgttt 15720

tttttttttt ttttaaacat ttttcccatc ctccatcctc ttgagggaga atagcttacc 15780

ttttatcttg ttttaatttg agaaagaagt tgccaccact ctaggttgaa aaccactcct 15840

ttaacataat aactgtggat atggtttgaa tttcaagata gttacatgcc tttttatttt 15900

tcctaataga gctgtaggtc aaatattatt agaatcagat ttctaaatcc cacccaatga 15960

cctgcttatt ttaaatcaaa ttcaataatt aattctcttc tttttggagg atctggacat 16020

tctttgatat ttcttacaac gaatttcatg tgtagaccca ctaaacagaa gctataaaag 16080

ttgcatggtc aaataagtct gagaaagtct gcagatgata taattcacct gaagagtcac 16140

agtatgtagc caaatgttaa aggttttgag atgccataca gtaaatttac caagcatttt 16200

ctaaatttat ttgaccacag aatccctatt ttaagcaaca actgttacat cccatggatt 16260

ccaggtgact aaagaatact tatttcttag gatatgtttt attgataata acaattaaaa 16320

tttcagatat ctttcataag caaatcagtg gtctttttac ttcatgtttt aatgctaaaa 16380

tattttcttt tatagatagt cagaacatta tgcctttttc tgactccagc agagagaaaa 16440

tgctccaggt tatgtgaagc agaatcatca tttaaatatg agtcagggct ctttgtacaa 16500

ggcctgctaa aggtatagtt tctagttatc acaagtgaaa ccacttttct aaaatcattt 16560

ttgagactct ttatagacaa atcttaaata ttagcattta atgtatctca tattgacatg 16620

cccagagact gacttccttt acacagttct gcacatagac tatatgtctt atggatttat 16680

agttagtatc atcagtgaaa caccatagaa taccctttgt gttccaggtg ggtccctgtt 16740

cctacatgtc tagcctcagg actttttttt ttttaacaca tgcttaaatc aggttgcaca 16800

tcaaaaataa gatcatttct ttttaactaa atagatttga attttattga aaaaaaattt 16860

taaacatctt taagaagctt ataggattta agcaattcct atgtatgtgt actaaaatat 16920

atatatttct atatataata tatattagaa aaaaattgta tttttctttt atttgagtct 16980

actgtcaagg agcaaaacag agaaatgtaa attagcaatt atttataata cttaaaggga 17040

agaaagttgt tcaccttgtt gaatctatta ttgttatttc aattatagtc ccaagacgtg 17100

aagaaatagc tttcctaatg gttatgtgat tgtctcatag tgactacttt cttgaggatg 17160

tagccacggc aaaatgaaat aaaaaaattt aaaaattgtt gcaaatacaa gttatattag 17220

gcttttgtgc attttcaata atgtgctgct atgaactcag aatgatagta tttaaatata 17280

gaaactagtt aaaggaaacg tagtttctat ttgagttata catatctgta aattagaact 17340

tctcctgtta aaggcataat aaagtgctta atacttttgt ttcctcagca ccctctcatt 17400

taattatata attttagttc tgaaagggac ctataccaga tgcctagagg aaatttcaaa 17460

actatgatct aatgaaaaaa tatttaatag ttctccatgc aaatacaaat catatagttt 17520

tccagaaaat acctttgaca ttatacaaag atgattatca cagcattata atagtaaaaa 17580

aatggaaata gcctctttct tctgttctgt tcatagcaca gtgcctcata cgcagtaggt 17640

tattattaca tggtaactgg ctaccccaac tgattaggaa agaagtaaat ttgttttata 17700

aaaatacata ctcattgagg tgcatagaat aattaagaaa ttaaaagaca cttgtaattt 17760

tgaatccagt gaatacccac tgttaatatt tggtatatct ctttctagtc tttttttccc 17820

ttttgcatgt attttcttta agactcccac ccccactgga tcatctctgc atgttctaat 17880

ctgctttttt cacagcagat tctaagcctc tttgaatatc aacacaaact tcaacaactt 17940

catctataga tgccaaataa taaattcatt tttatttact taaccacttc ctttggatgc 18000

ttaggtcatt ctgatgtttt gctattgaaa ccaatgctat actgaacact tctgtcacta 18060

aaactttgca cacactcatg aatagcttct taggataaat ttttagagat ggatttgcta 18120

aatcagagac cattttttaa aattaaaaaa caattattca tatcgtttgg catgtaagac 18180

agtaaatttt ccttttattt tgacaggatt caactggaag ctttgtgctg cctttccggc 18240

aagtcatgta tgctccatat cccaccacac acatagatgt ggatgtcaat actgtgaagc 18300

agatgccacc ctgtcatgaa catatttata atcagcgtag atacatgaga tccgagctga 18360

cagccttctg gagagccact tcagaagaag acatggctca ggatacgatc atctacactg 18420

acgaaagctt tactcctgat ttgtacgtaa tgctctgcct gctggtactg tagtcaagca 18480

atatgaaatt gtgtctttta cgaataaaaa caaaacagaa gttgcattta aaaagaaaga 18540

aatattacca gcagaattat gcttgaagaa acatttaatc aagcattttt ttcttaaatg 18600

ttcttctttt tccatacaat tgtgtttacc ctaaaatagg taagattaac ccttaaagta 18660

aatatttaac tatttgttta ataaatatat attgagctcc taggcactgt tctaggtacc 18720

gggcttaata gtggccaacc agacagcccc agccccagcc cctacattgt gtatagtcta 18780

ttatgtaaca gttattgaat ggacttatta acaaaaccaa agaagtaatt ctaagtcttt 18840

tttttcttga catatgaata taaaatacag caaaactgtt aaaatatatt aatggaacat 18900

ttttttactt tgcattttat attgttattc acttcttatt tttttttaaa aaaaaaagcc 18960

tgaacagtaa attcaaaagg aaaagtaatg ataattaatt gttgagcatg gacccaactt 19020

gaaaaaaaaa atgatgatga taaatctata atcctaaaac cctaagtaaa cacttaaaag 19080

atgttctgaa atcaggaaaa gaattatagt atacttttgt gtttctcttt tatcagttga 19140

aaaaaggcac agtagctcat gcctgtaaga acagagcttt gggagtgcaa ggcaggcgga 19200

tcacttgagg ccaggagttc cagaccagcc tgggcaacat agtgaaaccc catctctaca 19260

aaaaataaaa aagaattatt ggaatgtgtt tctgtgtgcc tgtaatccta gctattccga 19320

aagctgaggc aggaggatct tttgagccca ggagtttgag gttacaggga gttatgatgt 19380

gccagtgtac tccagcctgg ggaacaccga gactctgtct tatttaaaaa aaaaaaaaaa 19440

aaaatgcttg caataatgcc tggcacatag aaggtaacag taagtgttaa ctgtaataac 19500

ccaggtctaa gtgtgtaagg caatagaaaa attggggcaa ataagcctga cctatgtatc 19560

tacagaatca gtttgagctt aggtaacaga cctgtggagc accagtaatt acacagtaag 19620

tgttaaccaa aagcatagaa taggaatatc ttgttcaagg gacccccagc cttatacatc 19680

tcaaggtgca gaaagatgac ttaatatagg acccattttt tcctagttct ccagagtttt 19740

tattggttct tgagaaagta gtaggggaat gttttagaaa atgaattggt ccaactgaaa 19800

ttacatgtca gtaagttttt atatattggt aaattttagt agacatgtag aagttttcta 19860

attaatctgt gccttgaaac attttctttt ttcctaaagt gcttagtatt ttttccgttt 19920

tttgattggt tacttgggag cttttttgag gaaatttagt gaactgcaga atgggtttgc 19980

aaccatttgg tatttttgtt ttgtttttta gaggatgtat gtgtatttta acatttctta 20040

atcattttta gccagctatg tttgttttgc tgatttgaca aactacagtt agacagctat 20100

tctcattttg ctgatcatga caaaataata tcctgaattt ttaaattttg catccagctc 20160

taaattttct aaacataaaa ttgtccaaaa aatagtattt tcagccacta gattgtgtgt 20220

taagtctatt gtcacagagt cattttactt ttaagtatat gtttttacat gttaattatg 20280

tttgttattt ttaattttaa ctttttaaaa taattccagt cactgccaat acatgaaaaa 20340

ttggtcactg gaattttttt tttgactttt attttaggtt catgtgtaca tgtgcaggtg 20400

tgttatacag gtaaattgcg tgtcatgagg gtttggtgta caggtgattt cattacccag 20460

gtaataagca tagtacccaa taggtagttt tttgatcctc acccttctcc caccctcaag 20520

taggccctgg tgttgctgtt tccttctttg tgtccatgta tactcagtgt ttagctccca 20580

cttagaagtg agaacatgcg gtagttggtt ttctgttcct ggattagttc acttaggata 20640

atgacctcta gctccatctg gtttttatgg ctgcatagta ttccatggtg tatatgtatc 20700

acattttctt tatccagtct accattgata ggcatttagg ttgattccct gtctttgtta 20760

tcatgaatag tgctgtgatg aacatacaca tgcatgtgtc tttatggtag aaaaatttgt 20820

attcctttag gtacatatag aataatgggg ttgctagggt gaatggtagt tctattttca 20880

gttatttgag aaatcttcaa actgcttttc ataatagcta aactaattta cagtcccgcc 20940

agcagtgtat aagtgttccc ttttctccac aaccttgcca acatctgtga ttttttgact 21000

ttttaataat agccattcct agagaattga tttgcaattc tctattagtg atattaagca 21060

ttttttcata tgctttttag ctgtctgtat atattcttct gaaaaatttt catgtccttt 21120

gcccagtttg tagtggggtg ggttgttttt tgcttgttaa ttagttttaa gttccttcca 21180

gattctgcat atccctttgt tggatacatg gtttgcagat atttttctcc cattgtgtag 21240

gttgtctttt actctgttga tagtttcttt tgccatgcag gagctcgtta ggtcccattt 21300

gtgtttgttt ttgttgcagt tgcttttggc gtcttcatca taaaatctgt gccagggcct 21360

atgtccagaa tggtatttcc taggttgtct tccagggttt ttacaatttt agattttacg 21420

tttatgtctt taatccatct tgagttgatt tttgtatatg gcacaaggaa ggggtccagt 21480

ttcactccaa ttcctatggc tagcaattat cccagcacca tttattgaat acggagtcct 21540

ttccccattg cttgtttttt gtcaactttg ttgaagatca gatggttgta agtgtgtggc 21600

tttatttctt ggctctctat tctccattgg tctatgtgtc tgtttttata acagtaccct 21660

gctgttcagg ttcctatagc cttttagtat aaaatcggct aatgtgatgc ctccagcttt 21720

gttctttttg cttaggattg ctttggctat ttgggctcct ttttgggtcc atattaattt 21780

taaaacagtt ttttctggtt ttgtgaagga tatcattggt agtttatagg aatagcattg 21840

aatctgtaga ttgctttggg cagtatggcc attttaacaa tattaattct tcctatctat 21900

gaatatggaa tgtttttcca tgtgtttgtg tcatctcttt atacctgatg tataaagaaa 21960

agctggtatt attcctactc aatctgttcc aaaaaattga ggaggaggaa ctcttcccta 22020

atgaggccag catcattctg ataccaaaac ctggcagaga cacaacagaa aaaagaaaac 22080

ttcaggccaa tatccttgat gaatatagat gcaaaaatcc tcaacaaaat actagcaaac 22140

caaatccagc agcacatcaa aaagctgatc tactttgatc aagtaggctt tatccctggg 22200

atgcaaggtt ggttcaacat acacaaatca ataagtgtga ttcatcacat aaacagagct 22260

aaaaacaaaa accacaagat tatctcaata ggtagagaaa aggttgtcaa taaaatttaa 22320

catcctccat gttaaaaacc ttcagtaggt caggtgtagt gactcacacc tgtaatccca 22380

gcactttggg aggccaaggc gggcatatct cttaagccca ggagttcaag acgagcctag 22440

gcagcatggt gaaaccccat ctctacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaatta gcttggtatg 22500

gtgacatgca cctatagtcc cagctattca ggaggttgag gtgggaggat tgtttgagcc 22560

cgggaggcag aggttggcag cgagctgaga tcatgccacc gcactccagc ctgggcaacg 22620

gagtgagacc ctgtctcaaa aaagaaaaat cacaaacaat cctaaacaaa ctaggcattg 22680

aaggaacatg cctcaaaaaa ataagaacca tctatgacag acccatagcc aatatcttac 22740

caaatgggca aaagctggaa gtattctcct tgagaaccgt aacaagacaa ggatgtccac 22800

tctcaccact ccttttcagc atagttctgg aagtcctagc cagagcaatc aggaaagaga 22860

aagaaagaaa gacattcaga taggaagaga agaagtcaaa ctatttctgt ttgcaggcag 22920

tataattctg tacctagaaa atctcatagt ctctgcccag aaactcctaa atctgttaaa 22980

aatttcagca aagttttggc attctctata ctccaacacc ttccaaagtg agagcaaaat 23040

caagaacaca gtcccattca caatagccgc aaaacgaata aaatacctag gaatccagct 23100

aaccagggag gtgaaagatc tctatgagaa ttacaaaaca ctgctgaaag aaatcagaga 23160

tgacacaaac aaatggaaat gttctttttt aacaccttgc tttatctaat tcacttatga 23220

tgaagatact cattcagtgg aacaggtata ataagtccac tcgattaaat ataagcctta 23280

ttctctttcc agagcccaag aaggggcact atcagtgccc agtcaataat gacgaaatgc 23340

taatattttt cccctttacg gtttctttct tctgtagtgt ggtacactcg tttcttaaga 23400

taaggaaact tgaactacct tcctgtttgc ttctacacat acccattctc tttttttgcc 23460

actctggtca ggtataggat gatccctacc actttcagtt aaaaactcct cctcttacta 23520

aatgttctct taccctctgg cctgagtaga acctagggaa aatggaagag aaaaagatga 23580

aagggaggtg gggcctggga agggaataag tagtcctgtt tgtttgtgtg tttgctttag 23640

cacctgctat atcctaggtg ctgtgttagg cacacattat tttaagtggc cattatatta 23700

ctactactca ctctggtcgt tgccaaggta ggtagtactt tcttggatag ttggttcatg 23760

ttacttacag atggtgggct tgttgaggca aacccagtgg ataatcatcg gagtgtgttc 23820

tctaatctca ctcaaatttt tcttcacatt ttttggtttg ttttggtttt tgatggtagt 23880

ggcttatttt tgttgctggt ttgttttttg tttttttttg agatggcaag aattggtagt 23940

tttatttatt aattgcctaa gggtctctac tttttttaaa agatgagagt agtaaaatag 24000

attgatagat acatacatac ccttactggg gactgcttat attctttaga gaaaaaatta 24060

catattagcc tgacaaacac cagtaaaatg taaatatatc cttgagtaaa taaatgaatg 24120

tatattttgt gtctccaaat atatatatct atattcttac aaatgtgttt atatgtaata 24180

tcaatttata agaacttaaa atgttggctc aagtgaggga ttgtggaagg tagcattata 24240

tggccatttc aacatttgaa cttttttctt ttcttcattt tcttcttttc ttcaggaata 24300

tttttcaaga tgtcttacac agagacactc tagtgaaagc cttcctggat caggtaaatg 24360

ttgaacttga gattgtcaga gtgaatgata tgacatgttt tcttttttaa tatatcctac 24420

aatgcctgtt ctatatattt atattcccct ggatcatgcc ccagagttct gctcagcaat 24480

tgcagttaag ttagttacac tacagttctc agaagagtct gtgagggcat gtcaagtgca 24540

tcattacatt ggttgcctct tgtcctagat ttatgcttcg ggaattcaga cctttgttta 24600

caatataata aatattattg ctatctttta aagatataat aataagatat aaagttgacc 24660

acaactactg ttttttgaaa catagaattc ctggtttaca tgtatcaaag tgaaatctga 24720

cttagctttt acagatataa tatatacata tatatatcct gcaatgcttg tactatatat 24780

gtagtacaag tatatatata tgtttgtgtg tgtatatata tatagtacga gcatatatac 24840

atattaccag cattgtagga tatatatatg tttatatatt aaaaaaaagt tataaactta 24900

aaaccctatt atgttatgta gagtatatgt tatatatgat atgtaaaata tataacatat 24960

actctatgat agagtgtaat atatttttta tatatatttt aacatttata aaatgataga 25020

attaagaatt gagtcctaat ctgttttatt aggtgctttt tgtagtgtct ggtctttcta 25080

aagtgtctaa atgatttttc cttttgactt attaatgggg aagagcctgt atattaacaa 25140

ttaagagtgc agcattccat acgtcaaaca acaaacattt taattcaagc attaacctat 25200

aacaagtaag tttttttttt ttttttgaga aagggaggtt gtttatttgc ctgaaatgac 25260

tcaaaaatat ttttgaaaca tagtgtactt atttaaataa catctttatt gtttcattct 25320

tttaaaaaat atctacttaa ttacacagtt gaaggaaatc gtagattata tggaacttat 25380

ttcttaatat attacagttt gttataataa cattctgggg atcaggccag gaaactgtgt 25440

catagataaa gctttgaaat aatgagatcc ttatgtttac tagaaatttt ggattgagat 25500

ctatgaggtc tgtgacatat tgcgaagttc aaggaaaatt cgtaggcctg gaatttcatg 25560

cttctcaagc tgacataaaa tccctcccac tctccacctc atcatatgca cacattctac 25620

tcctacccac ccactccacc ccctgcaaaa gtacaggtat atgaatgtct caaaaccata 25680

ggctcatctt ctaggagctt caatgttatt tgaagatttg ggcagaaaaa attaagtaat 25740

acgaaataac ttatgtatga gttttaaaag tgaagtaaac atggatgtat tctgaagtag 25800

aatgcaaaat ttgaatgcat ttttaaagat aaattagaaa acttctaaaa actgtcagat 25860

tgtctgggcc tggtggctta tgcctgtaat cccagcactt tgggagtccg aggtgggtgg 25920

atcacaaggt caggagatcg agaccatcct gccaacatgg tgaaaccccg tctctactaa 25980

gtatacaaaa attagctggg cgtggcagcg tgtgcctgta atcccagcta cctgggaggc 26040

tgaggcagga gaatcgcttg aacccaggag gtgtaggttg cagtgagtca agatcgcgcc 26100

actgcacttt agcctggtga cagagctaga ctccgtctca aaaaaaaaaa aaaatatcag 26160

attgttccta cacctagtgc ttctatacca cactcctgtt agggggcatc agtggaaatg 26220

gttaaggaga tgtttagtgt gtattgtctg ccaagcactg tcaacactgt catagaaact 26280

tctgtacgag tagaatgtga gcaaattatg tgttgaaatg gttcctctcc ctgcaggtct 26340

ttcagctgaa acctggctta tctctcagaa gtactttcct tgcacagttt ctacttgtcc 26400

ttcacagaaa agccttgaca ctaataaaat atatagaaga cgatacgtga gtaaaactcc 26460

tacacggaag aaaaaccttt gtacattgtt tttttgtttt gtttcctttg tacattttct 26520

atatcataat ttttgcgctt cttttttttt tttttttttt tttttttcca ttatttttag 26580

gcagaaggga aaaaagccct ttaaatctct tcggaacctg aagatagacc ttgatttaac 26640

agcagagggc gatcttaaca taataatggc tctggctgag aaaattaaac caggcctaca 26700

ctcttttatc tttggaagac ctttctacac tagtgtgcaa gaacgagatg ttctaatgac 26760

tttttaaatg tgtaacttaa taagcctatt ccatcacaat catgatcgct ggtaaagtag 26820

ctcagtggtg tggggaaacg ttcccctgga tcatactcca gaattctgct ctcagcaatt 26880

gcagttaagt aagttacact acagttctca caagagcctg tgaggggatg tcaggtgcat 26940

cattacattg ggtgtctctt ttcctagatt tatgcttttg ggatacagac ctatgtttac 27000

aatataataa atattattgc tatcttttaa agatataata ataggatgta aacttgacca 27060

caactactgt ttttttgaaa tacatgattc atggtttaca tgtgtcaagg tgaaatctga 27120

gttggctttt acagatagtt gactttctat cttttggcat tctttggtgt gtagaattac 27180

tgtaatactt ctgcaatcaa ctgaaaacta gagcctttaa atgatttcaa ttccacagaa 27240

agaaagtgag cttgaacata ggatgagctt tagaaagaaa attgatcaag cagatgttta 27300

attggaattg attattagat cctactttgt ggatttagtc cctgggattc agtctgtaga 27360

aatgtctaat agttctctat agtccttgtt cctggtgaac cacagttagg gtgttttgtt 27420

tattttattg ttcttgctat tgttgatatt ctatgtagtt gagctctgta aaaggaaatt 27480

gtattttatg ttttagtaat tgttgccaac tttttaaatt aattttcatt atttttgagc 27540

caaattgaaa tgtgcacctc ctgtgccttt tttctcctta gaaaatctaa ttacttggaa 27600

caagttcaga tttcactggt cagtcatttt catcttgttt tcttcttgct aagtcttacc 27660

atgtacctgc tttggcaatc attgcaactc tgagattata aaatgcctta gagaatatac 27720

taactaataa gatctttttt tcagaaacag aaaatagttc cttgagtact tccttcttgc 27780

atttctgcct atgtttttga agttgttgct gtttgcctgc aataggctat aaggaatagc 27840

aggagaaatt ttactgaagt gctgttttcc taggtgctac tttggcagag ctaagttatc 27900

ttttgttttc ttaatgcgtt tggaccattt tgctggctat aaaataactg attaatataa 27960

ttctaacaca atgttgacat tgtagttaca caaacacaaa taaatatttt atttaaaatt 28020

ctggaagtaa tataaaaggg aaaatatatt tataagaaag ggataaaggt aatagagccc 28080

ttctgccccc cacccaccaa atttacacaa caaaatgaca tgttcgaatg tgaaaggtca 28140

taatagcttt cccatcatga atcagaaaga tgtggacagc ttgatgtttt agacaaccac 28200

tgaactagat gactgttgta ctgtagctca gtcatttaaa aaatatataa atactacctt 28260

gtagtgtccc atactgtgtt ttttacatgg tagattctta tttaagtgct aactggttat 28320

tttctttggc tggtttattg tactgttata cagaatgtaa gttgtacagt gaaataagtt 28380

attaaagcat gtgtaaacat tgttatatat cttttctcct aaatggagaa ttttgaataa 28440

aatatatttg aaattttgcc tctttcagtt gttcattcag aaaaaaatac tatgatattt 28500

gaagactgat cagcttctgt tcagctgaca gtcatgctgg atctaaactt tttttaaaat 28560

taattttgtc ttttcaaaga aaaaatattt aaagaagctt tataatataa tcttatgtta 28620

aaaaaacttt ctgcttaact ctctggattt cattttgatt tttcaaatta tatattaata 28680

tttcaaatgt aaaatactat ttagataaat tgtttttaaa cattcttatt attataatat 28740

taatataacc taaactgaag ttattcatcc caggtatcta atacatgtat ccaaagtaaa 28800

aatccaagga atctgaacac tttcatctgc aaagctagga ataggtttga cattttcact 28860

ccaagaaaaa gttttttttt gaaaatagaa tagttgggat gagaggtttc tttaaaagaa 28920

gactaactga tcacattact atgattctca aagaagaaac caaaacttca tataatacta 28980

taaagtaaat ataaaatagt tccttctata gtatatttct ataatgctac agtttaaaca 29040

gatcactctt atataatact attttgattt tgatgtagaa ttgcacaaat tgatatttct 29100

cctatgatct gcagggtata gcttaaagta acaaaaacag tcaaccacct ccatttaaca 29160

cacagtaaca ctatgggact agttttatta cttccatttt acaaatgagg aaactaaagc 29220

ttaaagatgt gtaatacacc gcccaaggtc acacagctgg taaaggtgga tttcatccca 29280

gacagttaca gtcattgcca tgggcacagc tcctaactta gtaactccat gtaactggta 29340

ctcagtgtag ctgaattgaa aggagagtaa ggaagcaggt tttacaggtc tacttgcact 29400

attcagagcc cgagtgtgaa tccctgctgt gctgcttgga gaagttactt aacctatgca 29460

aggttcattt tgtaaatatt ggaaatggag tgataatacg tacttcacca gaggatttaa 29520

tgagacctta tacgatcctt agttcagtac ctgactagtg cttcataaat gctttttcat 29580

ccaatctgac aatctccagc ttgtaattgg ggcatttaga acatttaata tgattattgg 29640

catggtaggt taaagctgtc atcttgctgt tttctatttg ttctttttgt tttctcctta 29700

cttttggatt tttttattct actatgtctt ttctattgtc ttattaacta tactctttga 29760

tttattttag tggttgtttt agggttatac ctctttctaa tttaccagtt tataaccagt 29820

ttatatacta cttgacatat agcttaagaa acttactgtt gttgtctttt tgctgttatg 29880

gtcttaacgt ttttatttct acaaacatta taaactccac actttattgt tttttaattt 29940

tacttataca gtcaattatc ttttaaagat atttaaatat aaacattcaa aacaccccaa 30000

t 30001

<210> 3

<211> 1031

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 3

attcccggga tacgtaacct acggtgtccc gctaggaaag agaggtgcgt caaacagcga 60

caagttccgc ccacgtaaaa gatgacgctt ggtgtgtcag ccgtccctgc tgcccggttg 120

cttctctttt gggggcgggg tctagcaaga gcaggtgtgg gtttaggaga tatctccgga 180

gcatttggat aatgtgacag ttggaatgca gtgatgtcga ctctttgccc accgccatct 240

ccagctgttg ccaagacaga gattgcttta agtggcaaat cacctttatt agcagctact 300

tttgcttact gggacaatat tcttggtcct agagtaaggc acatttgggc tccaaagaca 360

gaacaggtac ttctcagtga tggagaaata acttttcttg ccaaccacac tctaaatgga 420

gaaatccttc gaaatgcaga gagtggtgct atagatgtaa agttttttgt cttgtctgaa 480

aagggagtga ttattgtttc attaatcttt gatggaaact ggaatgggga tcgcagcaca 540

tatggactat caattatact tccacagaca gaacttagtt tctacctccc acttcataga 600

gtgtgtgttg atagattaac acatataatc cggaaaggaa gaatatggat gcataaggaa 660

agacaagaaa aatgtccaga agattatctt agaaggcaca gagagaatgg aagatcaggg 720

tcagagtatt attccaatgc ttactggaga agtgattcct gtaatggaaa ctgctttcct 780

ctatgaaatt cccccgggtt cctggaggaa atagatatag gctgatacag ttacccaatg 840

atggatgaat attgggggac cgcctggtca ttgaaaggct ttcttttctc caggaaagaa 900

atttttttcc ttttccataa aaagcttggg aatggaagac aacaattccc attctttttt 960

tgcgttccac ccctatgtga caacagaaat ttttggggaa acaacaacga aaaaatttta 1020

tcccgcgcgc a 1031

<210> 4

<211> 3244

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<222> (108)..(1553)

<400> 4

gggcggggct gcggttgcgg tgcctgcgcc cgcggcggcg gaggcgcagg cggtggcgag 60

tggatatctc cggagcattt ggataatgtg acagttggaa tgcagtg atg tcg act 116

Met Ser Thr

1

ctt tgc cca ccg cca tct cca gct gtt gcc aag aca gag att gct tta 164

Leu Cys Pro Pro Pro Ser Pro Ala Val Ala Lys Thr Glu Ile Ala Leu

5 10 15

agt ggc aaa tca cct tta tta gca gct act ttt gct tac tgg gac aat 212

Ser Gly Lys Ser Pro Leu Leu Ala Ala Thr Phe Ala Tyr Trp Asp Asn

20 25 30 35

att ctt ggt cct aga gta agg cac att tgg gct cca aag aca gaa cag 260

Ile Leu Gly Pro Arg Val Arg His Ile Trp Ala Pro Lys Thr Glu Gln

40 45 50

gta ctt ctc agt gat gga gaa ata act ttt ctt gcc aac cac act cta 308

Val Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ile Thr Phe Leu Ala Asn His Thr Leu

55 60 65

aat gga gaa atc ctt cga aat gca gag agt ggt gct ata gat gta aag 356

Asn Gly Glu Ile Leu Arg Asn Ala Glu Ser Gly Ala Ile Asp Val Lys

70 75 80

ttt ttt gtc ttg tct gaa aag gga gtg att att gtt tca tta atc ttt 404

Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys Gly Val Ile Ile Val Ser Leu Ile Phe

85 90 95

gat gga aac tgg aat ggg gat cgc agc aca tat gga cta tca att ata 452

Asp Gly Asn Trp Asn Gly Asp Arg Ser Thr Tyr Gly Leu Ser Ile Ile

100 105 110 115

ctt cca cag aca gaa ctt agt ttc tac ctc cca ctt cat aga gtg tgt 500

Leu Pro Gln Thr Glu Leu Ser Phe Tyr Leu Pro Leu His Arg Val Cys

120 125 130

gtt gat aga tta aca cat ata atc cgg aaa gga aga ata tgg atg cat 548

Val Asp Arg Leu Thr His Ile Ile Arg Lys Gly Arg Ile Trp Met His

135 140 145

aag gaa aga caa gaa aat gtc cag aag att atc tta gaa ggc aca gag 596

Lys Glu Arg Gln Glu Asn Val Gln Lys Ile Ile Leu Glu Gly Thr Glu

150 155 160

aga atg gaa gat cag ggt cag agt att att cca atg ctt act gga gaa 644

Arg Met Glu Asp Gln Gly Gln Ser Ile Ile Pro Met Leu Thr Gly Glu

165 170 175

gtg att cct gta atg gaa ctg ctt tca tct atg aaa tca cac agt gtt 692

Val Ile Pro Val Met Glu Leu Leu Ser Ser Met Lys Ser His Ser Val

180 185 190 195

cct gaa gaa ata gat ata gct gat aca gta ctc aat gat gat gat att 740

Pro Glu Glu Ile Asp Ile Ala Asp Thr Val Leu Asn Asp Asp Asp Ile

200 205 210

ggt gac agc tgt cat gaa ggc ttt ctt ctc aat gcc atc agc tca cac 788

Gly Asp Ser Cys His Glu Gly Phe Leu Leu Asn Ala Ile Ser Ser His

215 220 225

ttg caa acc tgt ggc tgt tcc gtt gta gta ggt agc agt gca gag aaa 836

Leu Gln Thr Cys Gly Cys Ser Val Val Val Gly Ser Ser Ala Glu Lys

230 235 240

gta aat aag ata gtc aga aca tta tgc ctt ttt ctg act cca gca gag 884

Val Asn Lys Ile Val Arg Thr Leu Cys Leu Phe Leu Thr Pro Ala Glu

245 250 255

aga aaa tgc tcc agg tta tgt gaa gca gaa tca tca ttt aaa tat gag 932

Arg Lys Cys Ser Arg Leu Cys Glu Ala Glu Ser Ser Phe Lys Tyr Glu

260 265 270 275

tca ggg ctc ttt gta caa ggc ctg cta aag gat tca act gga agc ttt 980

Ser Gly Leu Phe Val Gln Gly Leu Leu Lys Asp Ser Thr Gly Ser Phe

280 285 290

gtg ctg cct ttc cgg caa gtc atg tat gct cca tat ccc acc aca cac 1028

Val Leu Pro Phe Arg Gln Val Met Tyr Ala Pro Tyr Pro Thr Thr His

295 300 305

ata gat gtg gat gtc aat act gtg aag cag atg cca ccc tgt cat gaa 1076

Ile Asp Val Asp Val Asn Thr Val Lys Gln Met Pro Pro Cys His Glu

310 315 320

cat att tat aat cag cgt aga tac atg aga tcc gag ctg aca gcc ttc 1124

His Ile Tyr Asn Gln Arg Arg Tyr Met Arg Ser Glu Leu Thr Ala Phe

325 330 335

tgg aga gcc act tca gaa gaa gac atg gct cag gat acg atc atc tac 1172

Trp Arg Ala Thr Ser Glu Glu Asp Met Ala Gln Asp Thr Ile Ile Tyr

340 345 350 355

act gac gaa agc ttt act cct gat ttg aat att ttt caa gat gtc tta 1220

Thr Asp Glu Ser Phe Thr Pro Asp Leu Asn Ile Phe Gln Asp Val Leu

360 365 370

cac aga gac act cta gtg aaa gcc ttc ctg gat cag gtc ttt cag ctg 1268

His Arg Asp Thr Leu Val Lys Ala Phe Leu Asp Gln Val Phe Gln Leu

375 380 385

aaa cct ggc tta tct ctc aga agt act ttc ctt gca cag ttt cta ctt 1316

Lys Pro Gly Leu Ser Leu Arg Ser Thr Phe Leu Ala Gln Phe Leu Leu

390 395 400

gtc ctt cac aga aaa gcc ttg aca cta ata aaa tat ata gaa gac gat 1364

Val Leu His Arg Lys Ala Leu Thr Leu Ile Lys Tyr Ile Glu Asp Asp

405 410 415

acg cag aag gga aaa aag ccc ttt aaa tct ctt cgg aac ctg aag ata 1412

Thr Gln Lys Gly Lys Lys Pro Phe Lys Ser Leu Arg Asn Leu Lys Ile

420 425 430 435

gac ctt gat tta aca gca gag ggc gat ctt aac ata ata atg gct ctg 1460

Asp Leu Asp Leu Thr Ala Glu Gly Asp Leu Asn Ile Ile Met Ala Leu

440 445 450

gct gag aaa att aaa cca ggc cta cac tct ttt atc ttt gga aga cct 1508

Ala Glu Lys Ile Lys Pro Gly Leu His Ser Phe Ile Phe Gly Arg Pro

455 460 465

ttc tac act agt gtg caa gaa cga gat gtt cta atg act ttt taa 1553

Phe Tyr Thr Ser Val Gln Glu Arg Asp Val Leu Met Thr Phe

470 475 480

atgtgtaact taataagcct attccatcac aatcatgatc gctggtaaag tagctcagtg 1613

gtgtggggaa acgttcccct ggatcatact ccagaattct gctctcagca attgcagtta 1673

agtaagttac actacagttc tcacaagagc ctgtgagggg atgtcaggtg catcattaca 1733

ttgggtgtct cttttcctag atttatgctt ttgggataca gacctatgtt tacaatataa 1793

taaatattat tgctatcttt taaagatata ataataggat gtaaacttga ccacaactac 1853

tgtttttttg aaatacatga ttcatggttt acatgtgtca aggtgaaatc tgagttggct 1913

tttacagata gttgactttc tatcttttgg cattctttgg tgtgtagaat tactgtaata 1973

cttctgcaat caactgaaaa ctagagcctt taaatgattt caattccaca gaaagaaagt 2033

gagcttgaac ataggatgag ctttagaaag aaaattgatc aagcagatgt ttaattggaa 2093

ttgattatta gatcctactt tgtggattta gtccctggga ttcagtctgt agaaatgtct 2153

aatagttctc tatagtcctt gttcctggtg aaccacagtt agggtgtttt gtttatttta 2213

ttgttcttgc tattgttgat attctatgta gttgagctct gtaaaaggaa attgtatttt 2273

atgttttagt aattgttgcc aactttttaa attaattttc attatttttg agccaaattg 2333

aaatgtgcac ctcctgtgcc ttttttctcc ttagaaaatc taattacttg gaacaagttc 2393

agatttcact ggtcagtcat tttcatcttg ttttcttctt gctaagtctt accatgtacc 2453

tgctttggca atcattgcaa ctctgagatt ataaaatgcc ttagagaata tactaactaa 2513

taagatcttt ttttcagaaa cagaaaatag ttccttgagt acttccttct tgcatttctg 2573

cctatgtttt tgaagttgtt gctgtttgcc tgcaataggc tataaggaat agcaggagaa 2633

attttactga agtgctgttt tcctaggtgc tactttggca gagctaagtt atcttttgtt 2693

ttcttaatgc gtttggacca ttttgctggc tataaaataa ctgattaata taattctaac 2753

acaatgttga cattgtagtt acacaaacac aaataaatat tttatttaaa attctggaag 2813

taatataaaa gggaaaatat atttataaga aagggataaa ggtaatagag cccttctgcc 2873

ccccacccac caaatttaca caacaaaatg acatgttcga atgtgaaagg tcataatagc 2933

tttcccatca tgaatcagaa agatgtggac agcttgatgt tttagacaac cactgaacta 2993

gatgactgtt gtactgtagc tcagtcattt aaaaaatata taaatactac cttgtagtgt 3053

cccatactgt gttttttaca tggtagattc ttatttaagt gctaactggt tattttcttt 3113

ggctggttta ttgtactgtt atacagaatg taagttgtac agtgaaataa gttattaaag 3173

catgtgtaaa cattgttata tatcttttct cctaaatgga gaattttgaa taaaatatat 3233

ttgaaatttt g 3244

<210> 5

<211> 761

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (693)..(693)

<223> n является a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (722)..(722)

<223> n является a, c, g или t

<400> 5

cacgaggctt tgatatttct tacaacgaat ttcatgtgta gacccactaa acagaagcta 60

taaaagttgc atggtcaaat aagtctgaga aagtctgcag atgatataat tcacctgaag 120

agtcacagta tgtagccaaa tgttaaaggt tttgagatgc catacagtaa atttaccaag 180

cattttctaa atttatttga ccacagaatc cctattttaa gcaacaactg ttacatccca 240

tggattccag gtgactaaag aatacttatt tcttaggata tgttttattg ataataacaa 300

ttaaaatttc agatatcttt cataagcaaa tcagtggtct ttttacttca tgttttaatg 360

ctaaaatatt ttcttttata gatagtcaga acattatgcc tttttctgac tccagcagag 420

agaaaatgct ccaggttatg tgaagcagaa tcatcattta aatatgagtc agggctcttt 480

gtacaaggcc tgctaaagga ttcaactgga agctttgtgc tgcctttccg gcaagtcatg 540

tatgctccat atcccaccac acacatagat gtggatgtca atactgtgaa gcagatgcca 600

ccctgtcatg aacatattta taatcagcgt agatacatga gatccgagct gacagccttc 660

tggagagcca cttcagaaga agacatggct cangatacga tcatctacac tgacgaaagc 720

tntactcctg atttgaatat ttttcaagat gtcttacaca g 761

<210> 6

<211> 1901

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<222> (125)..(793)

<400> 6

acgtaaccta cggtgtcccg ctaggaaaga gaggtgcgtc aaacagcgac aagttccgcc 60

cacgtaaaag atgacgcttg atatctccgg agcatttgga taatgtgaca gttggaatgc 120

agtg atg tcg act ctt tgc cca ccg cca tct cca gct gtt gcc aag aca 169

Met Ser Thr Leu Cys Pro Pro Pro Ser Pro Ala Val Ala Lys Thr

1 5 10 15

gag att gct tta agt ggc aaa tca cct tta tta gca gct act ttt gct 217

Glu Ile Ala Leu Ser Gly Lys Ser Pro Leu Leu Ala Ala Thr Phe Ala

20 25 30

tac tgg gac aat att ctt ggt cct aga gta agg cac att tgg gct cca 265

Tyr Trp Asp Asn Ile Leu Gly Pro Arg Val Arg His Ile Trp Ala Pro

35 40 45

aag aca gaa cag gta ctt ctc agt gat gga gaa ata act ttt ctt gcc 313

Lys Thr Glu Gln Val Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ile Thr Phe Leu Ala

50 55 60

aac cac act cta aat gga gaa atc ctt cga aat gca gag agt ggt gct 361

Asn His Thr Leu Asn Gly Glu Ile Leu Arg Asn Ala Glu Ser Gly Ala

65 70 75

ata gat gta aag ttt ttt gtc ttg tct gaa aag gga gtg att att gtt 409

Ile Asp Val Lys Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys Gly Val Ile Ile Val

80 85 90 95

tca tta atc ttt gat gga aac tgg aat ggg gat cgc agc aca tat gga 457

Ser Leu Ile Phe Asp Gly Asn Trp Asn Gly Asp Arg Ser Thr Tyr Gly

100 105 110

cta tca att ata ctt cca cag aca gaa ctt agt ttc tac ctc cca ctt 505

Leu Ser Ile Ile Leu Pro Gln Thr Glu Leu Ser Phe Tyr Leu Pro Leu

115 120 125

cat aga gtg tgt gtt gat aga tta aca cat ata atc cgg aaa gga aga 553

His Arg Val Cys Val Asp Arg Leu Thr His Ile Ile Arg Lys Gly Arg

130 135 140

ata tgg atg cat aag gaa aga caa gaa aat gtc cag aag att atc tta 601

Ile Trp Met His Lys Glu Arg Gln Glu Asn Val Gln Lys Ile Ile Leu

145 150 155

gaa ggc aca gag aga atg gaa gat cag ggt cag agt att att cca atg 649

Glu Gly Thr Glu Arg Met Glu Asp Gln Gly Gln Ser Ile Ile Pro Met

160 165 170 175

ctt act gga gaa gtg att cct gta atg gaa ctg ctt tca tct atg aaa 697

Leu Thr Gly Glu Val Ile Pro Val Met Glu Leu Leu Ser Ser Met Lys

180 185 190

tca cac agt gtt cct gaa gaa ata gat ata gct gat aca gta ctc aat 745

Ser His Ser Val Pro Glu Glu Ile Asp Ile Ala Asp Thr Val Leu Asn

195 200 205

gat gat gat att ggt gac agc tgt cat gaa ggc ttt ctt ctc aag taa 793

Asp Asp Asp Ile Gly Asp Ser Cys His Glu Gly Phe Leu Leu Lys

210 215 220

gaatttttct tttcataaaa gctggatgaa gcagatacca tcttatgctc acctatgaca 853

agatttggaa gaaagaaaat aacagactgt ctacttagat tgttctaggg acattacgta 913

tttgaactgt tgcttaaatt tgtgttattt ttcactcatt atatttctat atatatttgg 973

tgttattcca tttgctattt aaagaaaccg agtttccatc ccagacaaga aatcatggcc 1033

ccttgcttga ttctggtttc ttgttttact tctcattaaa gctaacagaa tcctttcata 1093

ttaagttgta ctgtagatga acttaagtta tttaggcgta gaacaaaatt attcatattt 1153

atactgatct ttttccatcc agcagtggag tttagtactt aagagtttgt gcccttaaac 1213

cagactccct ggattaatgc tgtgtacccg tgggcaaggt gcctgaattc tctatacacc 1273

tatttcctca tctgtaaaat ggcaataata gtaatagtac ctaatgtgta gggttgttat 1333

aagcattgag taagataaat aatataaagc acttagaaca gtgcctggaa cataaaaaca 1393

cttaataata gctcatagct aacatttcct atttacattt cttctagaaa tagccagtat 1453

ttgttgagtg cctacatgtt agttccttta ctagttgctt tacatgtatt atcttatatt 1513

ctgttttaaa gtttcttcac agttacagat tttcatgaaa ttttactttt aataaaagag 1573

aagtaaaagt ataaagtatt cacttttatg ttcacagtct tttcctttag gctcatgatg 1633

gagtatcaga ggcatgagtg tgtttaacct aagagcctta atggcttgaa tcagaagcac 1693

tttagtcctg tatctgttca gtgtcagcct ttcatacatc attttaaatc ccatttgact 1753

ttaagtaagt cacttaatct ctctacatgt caatttcttc agctataaaa tgatggtatt 1813

tcaataaata aatacattaa ttaaatgata ttatactgac taattgggct gttttaaggc 1873

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1901

<210> 7

<211> 562

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (166)..(166)

<223> n является a, c, g или t

<400> 7

agacgtaacc tacggtgtcc cgctaggaaa gagagatatc tccggagcat ttggataatg 60

tgacagttgg aatgcagtga tgtcgactct ttgcccaccg ccatctccag ctgttgccaa 120

gacagagatt gctttaagtg gcaaatcacc tttattagca gctacntttt gcttactggg 180

acaatattct tggtcctaga gtaaggcaca tttgggctcc aaagacagaa caggtacttc 240

tcagtgatgg agaaataact tttcttgcca accacactct aaatggagaa atccttcgaa 300

atgcagagag tggtgctata gatgtaaagt tttttgtctt gtctgaaaag ggagtgatta 360

ttgtttcatt aatctttgat ggaaactgga atggggatcg cagcacatat ggactatcaa 420

ttatacttcc acagacagaa cttagtttct acctcccact tcatagagtg tgtgttgata 480

gattaacaca tataatccgg aaaggaagaa tatggatgca taaggaaaga caagaaaatg 540

tccagaagat tatcttagaa gg 562

<210> 8

<211> 798

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<222> (81)..(590)

<400> 8

gggctctctt ttgggggcgg ggtctagcaa gagcagatat ctccggagca tttggataat 60

gtgacagttg gaatgcagtg atg tcg act ctt tgc cca ccg cca tct cca gct 113

Met Ser Thr Leu Cys Pro Pro Pro Ser Pro Ala

1 5 10

gtt gcc aag aca gag att gct tta agt ggc aaa tca cct tta tta gca 161

Val Ala Lys Thr Glu Ile Ala Leu Ser Gly Lys Ser Pro Leu Leu Ala

15 20 25

gct act ttt gct tac tgg gac aat att ctt ggt cct aga gta agg cac 209

Ala Thr Phe Ala Tyr Trp Asp Asn Ile Leu Gly Pro Arg Val Arg His

30 35 40

att tgg gct cca aag aca gaa cag gta ctt ctc agt gat gga gaa ata 257

Ile Trp Ala Pro Lys Thr Glu Gln Val Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ile

45 50 55

act ttt ctt gcc aac cac act cta aat gga gaa atc ctt cga aat gca 305

Thr Phe Leu Ala Asn His Thr Leu Asn Gly Glu Ile Leu Arg Asn Ala

60 65 70 75

gag agt ggt gct ata gat gta aag ttt ttt gtc ttg tct gaa aag gga 353

Glu Ser Gly Ala Ile Asp Val Lys Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys Gly

80 85 90

gtg att att gtt tca tta atc ttt gat gga aac tgg aat ggg gat cgc 401

Val Ile Ile Val Ser Leu Ile Phe Asp Gly Asn Trp Asn Gly Asp Arg

95 100 105

agc aca tat gga cta tca att ata ctt cca cag aca gaa ctt agt ttc 449

Ser Thr Tyr Gly Leu Ser Ile Ile Leu Pro Gln Thr Glu Leu Ser Phe

110 115 120

tac ctc cca ctt cat aga gtg tgt gtt gat aga tta aca cat ata atc 497

Tyr Leu Pro Leu His Arg Val Cys Val Asp Arg Leu Thr His Ile Ile

125 130 135

cgg aaa gga aga ata tgg atg cat aag gaa aga caa gaa aat gtc cag 545

Arg Lys Gly Arg Ile Trp Met His Lys Glu Arg Gln Glu Asn Val Gln

140 145 150 155

aag att atc tta gaa ggc aca gag aga atg gaa gat cag ggt cag 590

Lys Ile Ile Leu Glu Gly Thr Glu Arg Met Glu Asp Gln Gly Gln

160 165 170

agtattattc caatgcttac tggagaagtg attcctgtaa tgggactgct ttcatctatg 650

aaatcacaca gtgttcctga agaaatagat atagctgata cagtactcca tgatgatgat 710

atttggtgac agctgtcatg aaaggctttc ttctcaagta ggaatttttt cttttcataa 770

aagctgggat gaagccagat tcccatct 798

<210> 9

<211> 169

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 9

aaacagcgac aagttccgcc cacgtaaaag atgatgcttg gtgtgtcagc cgtccctgct 60

gcccggttgc ttctcttttg ggggcggggt ctagcaagag cagatatctc cggagcattt 120

ggataatgtg acagttggaa tgcggtgatg tcgactcttt gcccaccgc 169

<210> 10

<211> 176

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 10

aaaacgtcat cgcacataga aaacagacag acgtaaccta cggtgtcccg ctaggaaaga 60

gaggtgcgtc aaacagcgac aagttccgcc cacgtaaaag atgacgcttg atatctccgg 120

agcatttgga taatgtgaca gttggaatgc agtgatgtcg actctttgcc caccgc 176

<210> 11

<211> 38001

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 11

caaacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacactgg 60

catatcaagt ctctgttagg ctaggcgcat cctctcccac tgaggtcaga caagactgcc 120

cagctagaag aacatatccc acggacaggc aacagctttt gggacagcca cgctccagtt 180

gtttgggact cataaaagac taaactcaca cctgctacaa aagtgcaggg aggcctaggt 240

ccagcctgtg tgtgctcttt gcttagtggt gtctctgaga gccctaagga tcaaagtttg 300

ttgactctgt tggtcttcct gtggagttcc tatccccttc gtccccctcc ccaccctgca 360

atctttccct caactcttct ttaggcctgg tggtggtggt gtggtggcat ggaggaggtg 420

gtggaggggg tgggggtctt taatcccggt tcttgtgaga ccgaagcagg gacgatttcg 480

gagctctgtg agtttgaggc cagcctggtc tatagatcta gttccaggac agtcagagct 540

acatagagaa accctgcccc gagggggggg gggcgcgggg aatggttaaa gattattgca 600

ggacccagct gatctgtgga agaggtaacg ggtgtttatg tttttcgaaa ctcattgaac 660

aatgcacttc aattgtgcgc actttagaaa tataaagcca ccacgcgaaa agctgcgccc 720

caacttaaag gcaatttcca aggtacttct gggtccttgc ggttcagtgg ctgtctaggt 780

tcagaaacga aactggatcc ccgccccgcc cccccgcccc ccccctcccc agcgccctga 840

ggcagtttcg atttcctatg gccagccggc taggcagctt tttcatcggg actccttgga 900

aagtccccac ttcgttcatc tctggcggat ttgcgggagc cagggcgctc atcgatcgcc 960

tggagccaca gaatgacagc ggagcagcgg cagaatctgc aagcattcag agactatatc 1020

aagaagattc tggaccccac ctacatcctc agctacatga gttcctggct cgaggatggt 1080

gagtggtccc caactggggc tctcaggctc tccaccttag cgaggggaaa acatcactca 1140

gatcagaaac aattgaaggc tctgcccccc cccctccccc gcgctgtcct taagttaatt 1200

tgtgtaaccc ggtgtatgtg agactcccag gccatattag agtagacagc atagggattt 1260

gatggtcagg aacaaaattc ctgcaagctg tagtaacttg cataaggatg ccactctttt 1320

ctttctttca atgctgggga aatagtttgt ttctcttatt tacaccttct agactgctgt 1380

gtgcctccct ttgtcctgtc atgagaaact gagaaatcag aatgcgcccg cccctcctta 1440

gattcctgta cagagcaaag agcaaggctt tgggctcggg ccaaaggtgg aggtgggggc 1500

cgcaggaagc aagaggactg actgacacgc acatttctgt caaaggatgt tgctcacagg 1560

aagtccgtgg aagaaaactt tctccagact ccgtgtgttc agagtttaac acagttgttc 1620

atatctagct ttggggattt gattggtgga taatagactc tttgtaaatt gcactgggtg 1680

tttccacctg agcaaacaga cctccccacc tcacccccac ccccagggag aagggagagg 1740

gcgtttgaag gggtgaccga gggcgtgcgg cagctacttt tcattttgcc agttaaagcc 1800

tagatgtctt tcctggcgtt ggacgacggt ggcaactgca ggttaattct gactctcttg 1860

agttccgaag cctaacaggc tatgcagaga ggagtaaaag agcactaccc agggctaccc 1920

acatcccggt tgtgttagag agaagcagca aaaaagccct aatgattggg ggcggggtct 1980

gaggagagga aacccaccca agaggtttct taacaccagg gtcacttgcc tttcaatcct 2040

ttaatctgat ctttagtcat ttacattagc atacaaagta actagtttca atactgaaac 2100

aaagtaacta gtttgttcag ccattcctgc cattgctctt tgttcttatt taattgcctc 2160

ttctgtggct cttccacccc ctttacctgt ccctctctgg atgccctccc ccccaaatgg 2220

taccccgttc tgctttctta taacatgagg ttcatcacac tccctccctc cctccctccc 2280

ccatttaaag tatcatcctt tcctctcagg gtgcctgttt tagtttcatg aattttaggg 2340

ttttggtttt ttgtctgttt agttatgaga tttttttaaa aatgtggatt atgttgaatt 2400

tgtagattgt tcttggtgct agaggccttt ttatagtatt atttccaccc atcttgggag 2460

atctttctga aatcttccag tgtcttcaag aatttttttt tcccactgcc ttagaagttt 2520

gcattgtagc tatcgttcac ctctttggtt agggtttgtt gttatttgtt tgtttgaggc 2580

tattgtgaat agaactccct ccttccccca tatctttctg ggccaggttg ttcttagtat 2640

gtaagtaagc tactggtttc tgtatgttta tttagaaccc tgcctcttgg ttgacttttt 2700

atgagggctg agagtttgtg gtagtctttg gggggtcttt ataggattat ataagaatca 2760

tttgactcat tcctttccta tttgtctaac ttttgtttgt ttgtttgttt gtttttttga 2820

gacagggttt ctctgtatag ccctggcagt cctggaactc actttgtaga ccaggctggc 2880

ctcgaactca gaaatctgcc tgcctctgcc tcccgagtgc tgggattaaa ggcgtgcacc 2940

accacacccg gccatcattt ccaagttaaa gatttgatct acattagacg ccgccacgca 3000

gaaaaccttg agacttggtg gaaaggccaa aggccattaa aataaatttt cttttttctt 3060

tcttccattc tttcctttat tccttccttc ctttcttttt gttttctttc ttttcttttt 3120

cctttttcct gagacagggt ttctctgtat agccctggca tcctggaact cactctgtag 3180

accaggctgg cctcgaactc agaaatccac cagcctttgc ctcccaagtg ttgggattaa 3240

aggcattcgc caccactgcc caaatatttt atttatttat ttatttattt atttttatat 3300

atgtgatgag tacactggaa attccatcaa aaagagcagg tttgactggt gtcactagat 3360

ttactattga tagggatccc taaaggagag ctaaggtaaa gggctctccc tctcctaggt 3420

cttctgcata ccttccttga gtgttctggg ccagatctcc taagctctaa gaatgtgctg 3480

aaaacacact gggaactggc tccctccttg ggaatttgta ctccctctgc tgtgggaaac 3540

ttggatataa gaggctacag gaggacagtg agttataccc caggcacaga gttagcgtgt 3600

acattcaaaa cgcataccat tttgaaagta gcagctgcta gcatttcctg tcacctggtc 3660

aacctggtct ctttagctgc cccacccctt ccacttttct gctgtgtttc ttttactctc 3720

ttagcaaaaa ttggaatgaa agaccacaaa tgtatttgta attcaaaatg cttgctgcat 3780

cagctatact cgttactgtt gccatagggc gttcattccc acccaccccc aaccccttag 3840

tccagcagtt gcttcagagt tttgaagaag aggaggaagc ctttcttctt ccatgtgaca 3900

ccctccactg cgacttctgc ttactgtggg gaacttgagt ggaggacggg agtgtgcata 3960

gatgaaagag tggaggacgg gagtgtgcat agatgaagga gtggaggacg ggagtgtgca 4020

tacatgaagg agtggaggac gggagtgtgc atacatgaag gagtggagga cgggagtgtg 4080

catacatgaa ggagtggagg acgggagtgt gcatacatga aggagtggag gatgggagtg 4140

tgcatacatg aaggagtgga ggacgggagt gtgcatacat gaaggagtgg aggacgggag 4200

tgtgcataca tgaaggagag gaggacggga gtgtgcatag atgaaggaga ggaggacggg 4260

agtgtgcata gatgaaggag aggaggacgg gagtgtgcat agatgaagga gaggaggacg 4320

ggagtgtgca tagatgaagg agaggaggac gggagtgtgc atagatgaag gagtggagga 4380

cgggagtgtg catacatgaa ggagtggagg acgggagtgt gcatacatga aggagtggag 4440

gacgggagtg tgcatacatg aaggagtgga ggacgggagt gtgcatacat gaaggagtgg 4500

aggacgggag tgtgcataca tgaaggagag gaggacggga gtgtgcatag atgaaggaga 4560

ggaggacggg agtgtgcata gatgaaggag aggaggacgg gagtgtgcat agatgaagga 4620

gaggaggacg ggagtgtgca tacatgaagg aaaggaggac gggagtgtgc atagatgaag 4680

gagtggagga cgggagtgtg catacatgaa ggagtggagg acgggagtgt gcatacatga 4740

aggagtggag gacgggagtg tgcatatgaa ggagtggagg acgggagtgt gcatacatga 4800

aggagtggag gacgggagtg tgcatagatg aaggagagga ggacgggagt gtgcatagat 4860

gaaggagagg aggacgggag agtgcataga tgaaggagtg gaggacggga gtgtgcatac 4920

atgaaggagt ggaggacggg agtgtgcata catgaaggag tggaggacgg gagtgtgcat 4980

agatgaagga gaggaggacg ggagtgtgca tagatgaagg agaggaggac gggagagtgc 5040

atagatgaag gagtggagga cgggagtgtg catagatgaa ggagtggagg acgagagtgt 5100

gcatacatga aggagtggag gacgggagtg tgcgaggatg gatgagtgga gtctgctgcc 5160

tctcaaaggt cttctggttc catgagttgt tatgactccc agacccacat gggaaggtct 5220

ggtctgttat cttccagtga ctagtgcttc tgcaggctac tcacttgccc ttgcttctgt 5280

ttgcagagga ggtgcagtac attcaggctg agaagaacaa caagggccca atggaagctg 5340

cctcactctt cctccagtac ctgttgaagc tgcagtcaga gggctggttc caggcctttt 5400

tggatgccct gtaccatgca ggttggttcc ttcttcttcc tcacagttca gagtacttca 5460

ctctgctgcc tcagaaggct gaggggagaa aagtgactcg ttctgtgaca tctgtgtgtg 5520

gcttctgcct caggcgggaa atgtaaagac tattttgaat cagataagag aatggtttat 5580

accagaaata tccaaagcaa tctacagagt tgtaactact aggagaggtg acaatattag 5640

tagcatgccg gtatctttca agaggagaac gagtaaataa atcggtttta taatgtttac 5700

agtgctccat tatactgcaa tgaagcgtgt ggacatgtct gtaaatgaca acccagctga 5760

actgtaggca cgcagcattt aaatttgaat atcataaact ataatagcta taaagttcca 5820

catgagtcaa actaaacata tagggaagga aactggatct tgggcgaccc tggctgacca 5880

gtcctgggga gtaagcttaa taaactctcc ctgtctgact gagatcggtg tcctgtggtt 5940

tgtgaggcaa ttcctggact ctaacactta ggcaattaca tttcttgccc ctctgccact 6000

ctagcttatt cactggtgaa agaaggagaa tactttagtg ttaccaacaa tggggggggg 6060

ggggcggggg atgggaaatg ggaaaaagca ggcccggccc agtgtagtaa gaaagaaaca 6120

ccaaagaaag ccaagggctc ctgttgcttt cattgtattg gagtgtttgt cagtcggctg 6180

ggggatgggg tggggggtgg ggaagcacac ctttaatccc agctctgggg aggcagaggc 6240

aggcagatcc ctgtgagctc caccagtcat ggctggcctc agcaagaact gtatccatca 6300

catcctaaca caggtgtgtt gaattaacat ggtactgtta aagcaaacac gctgccttcc 6360

tcgggtgctg cggtccctag gaagccacac attggcagca tgttggcagc agttgtataa 6420

aaactaatgc ttttttttcc ttttcttttt aattcggtaa aagggtttaa atgtcatttg 6480

ttataaaact tggtttcctg ctatttccag gattaacaat tgacttattc tttctatttc 6540

ctgctttata gaccatcatt ttgatacatt atctatttgc atctcagtga tacatgctta 6600

tcttaccctt ttatttcgtt ttaagaattg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 6660

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtctgagag tgggcatgca tttatgagtg cattgcctag 6720

aggtcagaca ttcccctgga gctggagtta atggcagttg tgagggactg acgtgggtgc 6780

tgggatctga ccccagtccc ctgcaagaac acgatgaacc ttacttgcta agccatctcc 6840

ccagccctta gctgttgcag ttactctcca ttccaaataa gccctggcaa tgaaaacaag 6900

acttaattca tatgaataca tgctgtgcac ctagattggg cagatctacc gctacactac 6960

catcttctcc atctatgaga ctcccccttt tttttttctt tttttctttt ttgtggtttt 7020

ggttttttga gacagggttt ctctgtatag ccctggctgt cctggaactc actttgtaga 7080

ccaggctggc ctcgaactca gaaatccgcc tgcctctgcc tcccaagtgc tgggaattaa 7140

ggcgtgcgcc accaggcggt ttctccaggc tgtgtgcttc tgctccactt ttcttcctcc 7200

tcctctgtgg tatcctctcc ctcttcctct ttctccttct ctcttcccac cttcctctcc 7260

aacttccctt tatcagccca atcaccagct ctcctttatt ttactaattg aggtgggaag 7320

caggtttaca ggaaatcacc ggagtgctga ctcattcctt gttcgcagcc actcaatgca 7380

gaatggaatt accatcaaat ataattagcc ccagggctat ccacaacact tacctagcac 7440

atcaaatggc ccagcagggg atcaagagaa aaggaaactc aacttctgct tattttcctc 7500

atctcttatg tagccccatc agagaagctg ttgttttcct tttgtgggct ctaactaatt 7560

tgaatattat atttaagatc tattctctta agtaaaaatg gcacagctaa ctttaactgt 7620

aaaattatat gaggtttact aggaaaagtc ttgagtttaa gcaagaaagg gaattttaaa 7680

acatttgtat tggaacataa gtgctggaac atctctcttt gcaagtgagg tgctttgtgt 7740

gtacaaccct aagagtttct tttttttttt tttttaattt atttacttca tatttcagac 7800

agatctcatt tcaggtggtt gtgagccacc atgtggttgc tgggatttga actcaggacc 7860

tctggaagag cagtcagtgc tcctctgcgc tgagccatct ctccagcccc cctaagagtt 7920

tcataaagga atagtctgca ttaataaatt cagaaaaggc tcagaatata aagccaatat 7980

catcaagtag gtttccagtt tatgtattaa caaataatgc aaaaaagatt ttaagcaagc 8040

gattcctttt ataacagcac caagaacaat aaagttagga atgccagtgc tcctaactgc 8100

tgaaccacct cagcaatgca aacttttaca tcttagcact aagtccagct cctaattcgt 8160

gaatgtaaga tgtcattcat gtccgtgtcc ctatggttcg tttcagaagt ggtttatggt 8220

cttcgggtca taggtctttc ccctgctcag ctttgcttat tcctaacttt atttaaagtt 8280

ctcactgttg ttataaaagg aatcacttgg ggctggcgag atggctcagt gggtaagagc 8340

acccgactgc tcttccgaag gtcctgagtt caaatcccag caaccacatg gtggctcaca 8400

accatccgta acgagatctg actccctctt ctggagtgtc ggaagacagc tacagtgtat 8460

ttacatataa taaataaata aataaataaa tcttcaaaaa aattctaaaa aaatatggaa 8520

aaaaaaggaa tcacttagtt aaaaatctca ttcctagccg gttgtggtgg cacatacctt 8580

taatcccagc acttgggtgg cagaggcagg cggatttcta agtttgaggt ctacaaagtg 8640

agttccaggt ctctgaaaac cacaaaaaaa aaaaaaaaaa atagcactgg ctgctcttcc 8700

gaaggttctg agttcaaatc cctccaacca catagtggct cacaaccata tgtaatggga 8760

tctgatgccc tcttctggtg tgtctgaaga cagtaacagt gtacttacat ataataaata 8820

aataaatctt tgggtgggag tgagcggggc tggagagaga aggaaaagta tctgaagaca 8880

actacagtgt acttacatat aatagataaa taaatcttta aaaaaatcaa taaatgaaag 8940

atgccaatat tacccagagt tggcacagtg atacctttca taatgccaaa ttttggtggc 9000

aggattgttt gtttattaaa caggaataga aaaatttact ctcaaatttg tatgaaatct 9060

taaatggtca aaatattgga aagagaaact cacttggaaa ccttggggga cttatacttc 9120

ctggtgtcaa aacagtacag aacctccata aagccagata attagaccat tagcccagaa 9180

gtaaactctg aaggatatgg ccaaaggttc ttcaacaagg gtaccatgac cacccaaaag 9240

ggggaaaaaa aacccagtcc ctttaatatg aaaatacatt ggggtaagtg ggtatacata 9300

tgggaatgag aggtatcagg cataatcttg tgctatgatg tgaatttgaa atgttctcat 9360

cacattcatg ttttgagtgc ttggtcccca gcttgtgggg ttttaggagg tagagcctag 9420

ctagccaaag taacacgtgt atacgttcat gcatgtgtgc acacaggtat gagggtactt 9480

gtgtgtagcc cagaggctga cattcagtgt cttccttagg agctctccac cgtatgtttt 9540

tgggaatgga tctctcatta gacccagaat ttaccctctc gggctcgact ggctgggatt 9600

atagggtcat gctgctacac ttggcttttt acatgatagc tggggacagg aactcaggtc 9660

ccagccttgt gtggtgagca cttttctact aagcaccttc ttggtcctgg agctattttg 9720

attgttttag ttttttgggt ctataggggg gagaaaaaaa aaaaaaccac attgtcttcc 9780

cagggccttg aatgaagtaa atgagggtct gagaggcagg cacgcctggt ggatctgtcc 9840

aaaaacccca gagtacggca ttcttggatt cttttagtca gaagtcattt tccttctcca 9900

tttgcccatt gacttaatct tttcttggaa tggtgtggaa ggaaacactt ttcaagggca 9960

ggatgtaaga tttgtatttc ctctggtctt ctttactgtt tcctcttgag aagataaaca 10020

tgatgaattt gactaattta aaagtaaatt gagatgacaa agagatggct ctgtgattaa 10080

gagcacttgc tgatcttgca gaggacccag gtttggttcc tagacttaca tggtagctca 10140

caaccatctg taacttcagt tccaggaatc tgaccctctc ttctgctctc caaagatacc 10200

agacacactc acgatacaca gacacatgca aagtaaaata gaaataaata ttaaaaaaaa 10260

atatattgtg ggttgttgtt aaagtgcgtg aggggcattt tgaagatttt attctaaggt 10320

caaatacaag gcctcatatc tgtccttagg acttgaccct gaaagataat gaattttagg 10380

agacctaaac tgttgggtac caaaaatgag tattactccc attttggaaa atcatgaata 10440

gctgtattag ttgactttaa ctactgtgag taaatgcccg aggaaataaa aagcagaaaa 10500

atgagagcca agaggatctg tagcttctgc acccgtgcgt ggtgaggcag ggcaccatgg 10560

cgggagcatg tgggaaaagc cgcactttct ggtagacagg tggcaaaggg tgccgggcag 10620

gggccctgga caagatgcat tcttcaaagc acatctccag tgactcactt ctcccagaga 10680

gggtacagtt ctcagttgct ccttctgtat gaactcaatg tgctgccagt ggtgacgcca 10740

ggactcgaag gatgtggtca ccaggtcccg cagggtgtgg tcacctctaa agactgtcac 10800

cagctggtgt ccaagcctgc aacctgtcag cctcatggtc tggctcccca gactgtccag 10860

tgactgaggc catttgcaga tggttttcag ttcccttgcc actgatttga acaggattcc 10920

catgattttg acttcaaagc atttttatgt tggatttgct taagaaatcc ccatttctct 10980

tttctttttc aggttactgt ggactttgtg aagccatcga aagttgggac tttcaaaaaa 11040

ttgaaaagtt agaggaacac agattacttt taagacgttt agaaccagaa tttaaggcca 11100

cagttgatcc aaatgatatc ctttctgaac tatccgaatg tttgattaat caggaatgtg 11160

aagaaatcag acaggtaaac caatgccagg tactaaattt gaagaaaaat gcagagacat 11220

tggaaatgcc catttttctg tcttgtttta ggcccaagga taattgaaac ccataaaagc 11280

tctcatctag cagatataat gactagaata gaatttttaa agtgaatggg gtaatttttg 11340

tgctagacta ttagaaaatt atttaaccta tttgcagtta aagttgcccc cttactttaa 11400

aaaaaatagt ggtttatgca taatgcaaat cacaccaaac agtgcaacaa ttaaaaggaa 11460

aaatatgtca ggctcttggg catagataca tttattacag tctcgcagtc acttaactag 11520

tgatgtgatg ccaggcagtt ctctaagcat ctgtggggtt tttgttgttg ttgttgttgt 11580

tgtttgtttg tttgtttttc atgtctaaag taagaaaatt tatcttttgt tttttgtttt 11640

tttgtttttt tagatttctt tattttattt tattatatgt gagtacactg tagctgtctt 11700

cagacactcc agaagagggc gtcagatctt gttacggatg gttgtgagcc actatgtggt 11760

tgctgggatt tgaactcagg accttcggaa gaacagtcgg tgctctcaac ccctgagcca 11820

tctctccagc ccccttttgt ttttgttttt gtttttgttt ttgttttttt gtttgtttgg 11880

tttttttgtc gttgttgttg tttgtttgtt ttgttttttc gagatagggt ttctctgtgt 11940

agccctggct gtcctggaac tcactctgta gaccaggctg gccttgaact cagaaatccg 12000

cctgcctctg cctcccgagt actgggatta aaggcatgca ccaccacgcc cgacgaaaat 12060

gtaccttatt agcactcttt tagggctaaa tgagaggtca tgcacaaaat gtgtatgtca 12120

gcttgatgca tagcagtcta tgcacaatgc atttcagtta tcattagaaa gaaaagtcat 12180

agaacatctg cttagaaaag agacctgctg ctgtgctgtt aggcatttcc aaatggctct 12240

gtgtgccgat acatccttag ggtgaatggt tagcgtctgg gttaacgctt ttaccccagg 12300

attgctcttg gtcagggata taaggattca gaagatgaga acatttgcct tggcatattg 12360

ataacacatt ataaaggaca aaggtgaaga aaggaatatc ttaaaagcta gtgctggaca 12420

gggcaaaaag atgatgctaa ctaagcccta ctcaactata cttcacagtg atttcaatca 12480

gataccgctt ccacaaaagc ttgccagagg aaaggctgag ctgcctgatc agtgtgctgc 12540

atttgtctcc cccagatccg agacactaaa gggagaatgg caggtgcgga gaagatggcc 12600

gaatgtctta tcagatccga caaggaaaac tggccaaagg tcttgcaact tgctttggag 12660

aaagacaaca gcaagtttag tgaattgtgg attgttgata aaggtggggt gctccaagaa 12720

agaaccctgg accctgctgc gctcctccca gttctcccca ctttactttc catcagaggc 12780

gctgttcact tcagatacca aaggctatat ccctaggata caagcagtgg aaagctgaat 12840

tctgggagga agggaactac atggcatgga attaacccga ccaggtcaaa gaatctaggg 12900

aaggcttcca gccccaattt gttatcagag aaatagcttg agaattctag acctaaaggt 12960

tcaaactgca agacttacct ccctatcaga gcagaggctg agtgttgggg gtgatagcta 13020

tggactggtg ctcttgcccg gaagccatct ggactccgac agagcaagag taaacgaaga 13080

ttttctgtgt ttaagccaac ctcatttggc ttccggaaac tcacttcttg ctttaaacag 13140

accttgataa atacctgagt ttctagtttc ctttctcacc tagatttcct tagaacataa 13200

attattccag aaactctcta catcgttggt cagagatgga atcctgtctc tttagtgtgc 13260

tcaggaatga cgcccctgcg ttattggcgt gagttccgga gtggggaggg gctccggatg 13320

caaactgctg agagccccgg gttccacact tggagtcgcg tagttccaga tgaaactgga 13380

attcaattgc caagttgagc ttcaaactca gaataatcct tgcagttgtt ttaagccgtc 13440

aaagtggggc tctctagatg gctcagtgga taaggttcct gccactgatc ctgaagaccc 13500

aaattcaacg tccagggcct acatgataga accaatcccc aaacagtgtc ctcatccctc 13560

ggcacactca ctgtgtcgtg tgtgacacac acagtaaaca aatccatttc aaaaataaat 13620

aaaatgttaa gaaagtgcaa gaccgtgatt gtaagagctc aacggaaatt tagatgttta 13680

gtgttagtgt taggactttt tgggacttcc ccaaccaaaa ccataatcac attgcgcatg 13740

cttttaatcc cagcactcag gaggcagagg caggtggatt tctgagttcg aggccagcct 13800

ggtctacaga gtgagttcca ggacagccag ggctatacag agaaaccctg cctcgaccac 13860

cacccccttc caaaaaaaaa aaaaaaagat tctaagctgt aagctgttat ttgtgtttat 13920

gattgtttgc ttgcctgttt atcacaaagg tttcaaaagg gctgaaagca aggctgatga 13980

ggatgatgga gcggaggcgt ccagcatcca gattttcatt caggaagagc cagagtgtca 14040

gaatctcagt cagaatcccg ggcctccttc aggtaccaag catcgtttgc tctcatccat 14100

gatggtgtcc cccagcactt tgatgccctt tgaaaaaaag tctttttaaa ggatgattaa 14160

gaaaagaaag aatttgtggg gcaataggga cttcataatt agaatccctg ctcctgtctt 14220

ccatggcctc tgcatggcct tcaaccctcc ccctcctctc ccctcccctc cccctccctc 14280

cagtatgtat gccttcatct gtaccgtgtt cccagaactt cagtgtccat gacttctcaa 14340

agcagccttg ctctctaaag aacacttctg ctcactaagc aatggctttg agaatctggg 14400

ctgacagctg gttttcctcg gctgtttttg atgatctgtt cttactttgt tccaagtggc 14460

tttgttttga attaggccat tcttgctgtc ctttttcttg ataaagtttc cacgattaag 14520

aaagaattca tggggctgga gagatagatg gttcagcgtt taagagcacc gactgttctt 14580

tcagagatcc cgagttcaat tcctagcaac cacatagtga ctccagcgtc tgggttaatg 14640

tttttacccc atctgtaatg ggctctggtg tactcttctg gtgtgtcaga ggacagcgac 14700

aatgtgtata ttcatataca ttaaataata aataaatctt caaagagaaa agaaggaagg 14760

aagaagtaac agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag 14820

agagaacaca ctttggccaa gatcccaaac ctcaaacagg ggcattgttg ctagagtcag 14880

aactcatgtc cactgaatgg cagttgcacc atgattcctt gtagcatgaa cccttcgata 14940

actttgtccc ctctatatta cagaagcgtc ttctaataat ttacacagcc cattgaaacc 15000

aagaaattac caactggagc ttgccctgcc tgccaagaaa gggaaaaata caataatatg 15060

tgcccctact ggtaagtcag ttgctgtcac tcacagaact ctctggcttc gctttttctt 15120

ccccctttgg gggctgtaaa aggaggagtt ttccccgtgg cccatgctgc ccatgggaga 15180

gctggtctag cagcttaagg aacctggaca gcgataagga gggagataag tgtcttcttt 15240

agtttgcttt tggttcttgc tacctgagtg cacgttactt aggaagtagc ttggcacttt 15300

tcagccattg tttaaactgt cattgttagt gcggaggagg gattattagt ttatttgtat 15360

cccagtggtc atagagaagc caaaataagt accattctgg aaaaacagct aacacaggtt 15420

atctgttggt ttttttttct tttctttttt tttctttttt cttccctact aaaaggttgt 15480

ggaaaaacct ttgtgtcgct tcttatatgt gaacaccatc ttaaaaaatt cccatgtgga 15540

caaaaaggga aagtggtctt cttcgctaac caaattcctg tctatgagca gcaggcaact 15600

gtgttctcac gatattttga aagacttggg tatgtactac tacaatcaat ctaactgctt 15660

tgatttttgg tttttgtttt gtttatgttt gtattttaaa ttctagcccc tttggctggt 15720

tttgggggct ttgttgtgtc tggttttggg ggctttgttg tgtctggttt tgggggcttt 15780

gttgtgtctg gttttggggg ctttgttgtg tgttttctga gacagtgtat cacgtagcct 15840

tgagttgtct ccaacccact gtgtagctga ggttggccta gaagagatga tcttcttgct 15900

tctacaagtg ctgagattac agtgtgcact ggcatgcctg gctgttctct gattttcttt 15960

cttttttttt tttttaagat ttatttattt attatatgta agtacactgt agctgtcttc 16020

agacactcca gaagagggca tcagatctca ttatgggtgg ttgtgagcca ccatgtggtt 16080

gctgggattt gaacttcgga ccttcggaag agcagtcagg tgctcttacc cactgagcca 16140

tctcaccagc cctctctgat tttcaaagct atgattaaag gaaaatcgcc atggacttaa 16200

cttttagagg tagttccttt gtgcaataac atttttggtt taactttacc agaaatgcta 16260

agccctcatg tcatgctctg acagttaatg aacttggtgg ccaaatttaa catgtaggcg 16320

atacacaggt catccttaat gatgttatac ttgattggct attactcttt tcaaaatcat 16380

ttctctctta atgacttgaa agaataaata cactgtgatc agctataacc tcttgcattt 16440

cctgactccc cggctttgtg tcaggcctgt gagaaagttc aaggtactac ccagttgtac 16500

tcttttgggc ttgggctgac ttctttaatt gctgctctga cctagacttc tactttgtct 16560

ccttgttcat tcacatcaag gttgatgata agggatttct gtcattcccc aggtacaaca 16620

ttgcgagcat ttctggggca acatctgata gcgtctcagt gcagcacatc attgaagaca 16680

atgatatcat catcctgaca ccccagattc ttgtgaacaa tctcaacaac ggagccatcc 16740

cctcgttgtc tgtcttcact ctgatgatat ttgatgagtg tcataacact agcaaaaacc 16800

acccatacaa tcagatcatg ttcagatacc tagaccacaa acttggagag tcacgggacc 16860

cactgcctca ggtatttcca atcttctaag aagaaccaca gtttttcaga gtcccactta 16920

gttgctcttt tgtagccaca tttgagcttg ccctcctcgg ggtctcagtc catcggtaca 16980

actcagtggt caatgttggt tcattcattt gaccaacagt tgtcccttgg tgtccagggt 17040

agatgccctt cacaaaaaac aaaatctagg ctgcttaagt ctcttgtatg agatgacatt 17100

gcatttatat ataatctaca cactttcctc ttgcatactt taaatcttct ctagattact 17160

gatattgtac agtatgatga aaattttata taaatagttc tagtactgta atttttaggg 17220

aataaaggtg ggaaattcat acatgtttag tacttatgaa gttttaaaaa atatttttga 17280

tccatggttg tatgaattca catttatata acctctggat ttggagggcc agctgtataa 17340

accatgggct tccatggacc ttgtgcattg ttctaggctc tgggacacca atacagaaga 17400

tatagtcctg gctctcatac agttaagttt gcagggagcc aggaacatag tagtcacagc 17460

ttatcatgag gtatgctgca gagacaggta aagggtgttg tcagaacata aggggtaata 17520

aggcatagaa atgaagggaa ctgacagggg cttgccaggt agatagcttc tggtttctag 17580

taagagggtg ctgtgtgtcc aggggctcag ggaaatggaa gggcctgaca tgccccagaa 17640

ccttaaaact ctacagtatc acttgagggt agagtgtgaa gcagggaaca acagtcaagc 17700

tgattgttat gacagatgac ccagagacac caggagggca gagcgtcagt gggcaagtgg 17760

atggcttagc acagggaaca agcagcagcc ttctgatgtc atatgagaag agtcacttca 17820

gagtcattct tacatgtgac aagaggagta caaattctcc ttctgtctat cataggagag 17880

ggggtgcttt gctgaaagtc aacgatatag aaacaggagg gggctagaga ggatgaggac 17940

ggtttgactc aggcactgat agatgcaata aagaatgacg gtagtgtatc tatcaggggc 18000

cccaagaagc tgtaaaccat gaattatata caattctttt gctccaacaa taaccttttt 18060

aggacgtgca ggttaaagga catttagtac aggacccaca gtttgttatt ctcgagtatc 18120

gttgctagga agcagatttc ttaccgtcca gctaatcatt taggtgaatg cttactgaag 18180

ggtgttatca tactgaatct acacagctct cttgtacacg actcactgat tgttgaaggt 18240

atttgtccag gcgcacaaaa tgcatgtgat atgaatgagc ctggaatgga ctttttcttc 18300

ccattgtgat gtttagtaag agactggggg ataaaaaaaa cagggtagcc ctgcctggaa 18360

aggtttcctc tctgttctgg atgacacgct agatttattt ccgagctttg ctccaggggg 18420

gtctttgtgc tggagaatgt cagagagcca gtggtggggt gctccttaca ggtcgttggg 18480

ctgactgcct ccgtcggcgt tggagatgct aagaccgcgg aggaagccat gcaacatatc 18540

tgtaaactct gtgccgccct ggatgcctcc gtgattgcca cagtcagaga caacgttgca 18600

gaactggaac aggtcgttta taagccccag aaaagtaagt ggaggtcagc agcccacacc 18660

tcgcgacttt gtaaccttct gtcccctctg cgtcagagac agtggatgaa gtttgatgct 18720

gtatttgttt ggtaaaagca tagtggttac attgcctatc tttctcccta gtcaacctct 18780

tctccctagc gacgcatgag tctcaaaggt agccagaaag ggacaaacat ccctactctt 18840

taccagcagc tgagtgaagg aggcagtggg aagattcaag cattttgaaa gcctcaatag 18900

ctagtggcgg aatcaggtct ctgtgctccg ggccctaggc aggggctatg tggccatctt 18960

gttcttgtat gtatctgatc attgtagtgg catgacccga atcatgacag ttcaaaaggc 19020

cagaacatgt ttttaaaatg agcttcatta gaagatggtt attacttatt aactacctgt 19080

gtaagcaggg aggtaccgta gttacccacg gctggatctt ggcctgagca ctcgttctgt 19140

gagttgacag caggatcaat ggcagggtca atggcaggat gagcaatggg ggggtggggg 19200

ttgggatggc acaaccctgg ttctttctga gagtcccccg tggagagtgt gaagaaggtg 19260

cctccccacc cacgcccacc ccttagcaac actcaagggt ttttctacag tttgagccct 19320

tggagcttag tctacttcaa agtcattttg tgtcactttc tccgtctatg caaaccctct 19380

acgagctatt ctgagggtgt gtcccagctc ctgcgcgcct tcctttttcc cttattattc 19440

atcttgcggc agcttccccg gagagaatga ggtttcctcc cctctttgag agatgccttc 19500

ctggcctgca cctgcttccc agggctctga tgggcgggtt taggagcaca cctttgtttc 19560

ctttaaggag tgggtgggtt ggggagcagg gggagggggg agggagggga tagggggttt 19620

ttggagggga aaccaggaaa gggaataaca tttgaaatgt aaataacgaa aatatcttta 19680

aagaaaagaa aagaaaagga aagaaagaaa gaacctgcct tctgtgcagc atagggtagc 19740

tcttgtcagc tctctgtcac tgaaacagga catgtgacag gcagttcttt ttctgccaaa 19800

agtacacaaa tgtgaacgat aagctcaatg ggggcactct tgggggctcg gaggtgcgca 19860

ggagaatagg aaatcaggaa aacggggctg gagtatggta tttgccgaaa ccagaaggct 19920

gccagacctg ccacagtaga ggcaccagga aagctgactg agacgctggc ttagactaga 19980

ccaggagaga cactagaatc agaagcagtt ccgaggtcag aggcttctga ccgcctgctg 20040

tgatttgggc cacgtgagct tggagcctgt ggctttaaag gacttaccca ggatggagca 20100

gcttcgggaa atggctgcat aggacctggg tttccttcag cttactcaca tgcctttgac 20160

cccagtttcc aggaaagtgg catcccggac ttcgaacacg tttaaatgca tcatctctca 20220

gctgatgaag gagacagaga agctagccaa ggatgtctcc gaggaacttg gtaagcctgt 20280

gccaagtcct ggagagagaa atctcatgtt tcctgtccct tccatttaga ggtactcatg 20340

gattgctcgt tagtgtcttc agttttgggt gagattatac tcagaggtgg actgacttat 20400

ttattcacac atatttcttt ctgtctctgt atcttcttta tctcttcatt cttttttgcc 20460

atcatttttt tctccattcc tttttaaaaa gatttatttt tatttgatat gtgtagatgt 20520

ttttgtctgc atgtatgtat gtatatcaca tgtatcagat acccgggaac tggagttaca 20580

gacagttgtg agctaccaca tctgctggga atcgaaccca tgtcctctag aagggtagct 20640

ggtgcgcata accactgagg agcccccatt tctctagctg tttttaagac aaggtttttt 20700

tccctgtgtc cctggttggc ctgaaacttg ctatgaagac aaggctggct ttgaacttgc 20760

aggggtcccc ttgcttcagc ttctgagtcc tggggtctct ggcaagcgcc accatacctg 20820

gctcagatat agactttctt aatcctaggt tgtttaggaa ccttatagga gttctttaat 20880

tctctcttgc ctttttcttt ttaaatacaa aacacatcca cctggacata catacctgag 20940

aaatactgtc tttaaatcat cttctaaatt tcctttcttc ctttttttcc cctcttgaga 21000

tagaatctct gtgttcagtg taggctggcc ttgaactggg aactctgccc ctcctcctcc 21060

tcctcctcct cccaagatgt gcatcatcac tgagctgcca ttagagtgcc attgtccctt 21120

ccaagagcag ttcccccagt gacctaacac tctctcactg tcctcagctc ttgaaagtgt 21180

caccacctcc taacctcaca cactgaggac caaccagcct tttgccacat gagcatccag 21240

aaggcactta gacagtagct aaggcacagc actgggggag gagtttgaat aatgaatcca 21300

ctatgggtcc taaagtagta gggtagcaag catgctctct cctctagagt tttggaaact 21360

ctctgtaagg taaagagtaa agagaccagg tagtcagtac atggctcacc taggaacaag 21420

ataacatggt ctgactaaag tggtggatgg acagacggac aggaatagag ttgtatgact 21480

tacttttttg ttttgttttt gtttttaaaa cagtctgtct gtatagctct gactgtcctg 21540

gaactctctt tgctggcctc aaactcacag agatctgcct gcctctgcct ccggaggcat 21600

tcacacttta gaatcttttc ccacctcctc acattgagta tctgtcaata gctgcctcac 21660

ttcttctgga acttggacgt ttttcattgt gaactgggtg tggtggcacc atctctactc 21720

ccagcagctg ggagcctgag tctgaggcca gcttaggcta catactgagc tcctgtcctt 21780

ggggcggagg ctgggaagaa cttgtcactg tttcttgttg gtacccgtcc tgtgttctgt 21840

tattgcaaat gtgagggaag ccatttaaca cacaaatgca tttcacttct ttgaactgta 21900

ctgtgcttgt ctcaagaagc ccaggacaca aaacaataga gcaagcatct ggggctgttc 21960

ccacttcgcc tttccccccc tacccacacc aatcttcccc tgagtctgaa tcgctgtgaa 22020

tcccacagta gaaccaagca gtcaagacat gcacatgcgc acacagatgc ttccgggata 22080

actgtgtttg actccgcctt gtggttggtg ctgcaagtgc tgctctgaga tcaggtgttt 22140

gggcttcata gcaacataga gcatgctggg aagggtcctg gtgctcccat ttttatataa 22200

ctgtctccga tgaagctctt gagacgtgct actctaatgg tatcttcatt ttgaaaggca 22260

aagtgtgtcc ctccttctct tcctcctcct ccttcttcct tacccctctt cttcgttctc 22320

tgttatttct gaactacttt ggctgtcagc cccttaagcc tgcagagcat agacaccaca 22380

gagctaggct tgaattcttg cctcacccac acaatatgag ctttatgaca ttgggggtaa 22440

attagttttc cttttataga agatttattt acttaaaaaa aaattatgtg catgtgcatg 22500

tgcgggatgg tgttgttgcc tccaggggtc agaagagggc gctgaatgcc ctggaactgg 22560

atttacaggt cgttggaagc cacccaatgt gagtgcaggg aactgaactt gggtcctcta 22620

caagggccta actattgagc caccacttct gctccttact caatctttct gaatctgttt 22680

cctctttttt ttttttaaag atttatttat ttattatatg taagtacact gtagctaagc 22740

tatcttcaga cactccagaa gagggagtcg gatcttgtta cggatggttg tgaaccacca 22800

tgtggttgct gggacttgaa ctcaggacct ttggaagaac agtcggtgtt cttatccact 22860

gagccatctc tccagcctgt ttcctcttta aaaaaaaaaa ttaaataatg acctcatgaa 22920

attagaaaat ttcaatgcaa ttatgaagct tgattttggg tcatttagta aatagttatt 22980

ttacacactc ctccccccca ccccccgcgc acgcacacag gcacacacac acacacacac 23040

acacacacac acacacacac acatagctta agacccagtc tacttcagga taaacatctt 23100

tcttataatg aataagaaag aaaatcagag gaccggtgct tgcaaatctt ttatttatct 23160

atttatgttc ttaccctgta ggaaagcttt ttcaaattca aaacagagaa ttcggcaccc 23220

agaaatatga acagtggatt gtcggcgtcc acaaagcgtg ctcagtgttt cagatggcag 23280

acaaagagga ggagagccgg gtctgcaaag cgctcttcct gtacacatca catttgcggg 23340

tacattgctg ctctccaggg cttattctca tcaccgcgcc tcctgggatc tgtactgagg 23400

cagctgagag aacatcagcg tctcaagtct aagagcttag tgaggaactt ttcccgaaag 23460

tcatcactaa ccttatttgt tttctgaaac ttatcatcaa gtctccaaaa actggattaa 23520

aggctcagag tctatgccac acctccctcc agcttgtgac tggtgaccac catctaactg 23580

agctcaaaaa agtggctcct gtggccatat cctgaagctt tcgtggtctt aattttgtta 23640

taaagtcata tattagaatc tcaggggctc tggttaacac agagggaagg agtaactgta 23700

agagccctca gctctgtttg ctatgctctg ggaactattt aaagacttac tccacaccat 23760

gggattgtgg gatctaacgc ttaatggact ttcagcatag gtggtaaggg ccatcgttat 23820

gcaaggccca tgtacacttt aagtatgact tggaatttaa ggggaatgtc aaagctaact 23880

tgcttttgtt attgtttctc aagatatgct gtttctcctc tcccaaggtg gagttttata 23940

atccaaagtg aatctacttt taattttcta gctgagccaa aaatagaagc cagcttttgg 24000

ttcagaggtt tttattgtag acccactaag ggccattcgc cattaaaccc tcagctgtac 24060

tgtatgagaa agattttctg caaaccagtt ttgtgctaaa tacagcgagt tgaacttgag 24120

tgtagtgacc atatgcgacc tcagaaatgt attgagaatc acttttcatt tcaaacagaa 24180

atacaacgat gcactcatca tcagtgagga tgcacagatg acagacgctc taaattacct 24240

caaagccttc ttccacgatg tccgagaagc agcattcgat gagaccgagc gagagcttac 24300

tcggaggttt gaaggtgagg gagatttctg aagtcaggag tccctggggt ctggtggctt 24360

ttgtggcagt gtgcacatcg tagttagcat acgtagccat catgttgggt ttaaggtgag 24420

atttgtaggg gctgtgacgg agcatgacct tagcatggct gaaatcccca gcactaaaaa 24480

acgaacctat gctgaaactt tagagccaac caaccgacaa caggagggtt tggcttcaga 24540

gaaatctaat gcctgtggat ggatctgatg cttgccccac ttttcacttg ggaaaatggg 24600

aaacagtggg atttggaaag ggtgcttcct ctaggtggta ggtagtgcta ttctgattaa 24660

ctcagtaatt cagaaggttt aataacaaca gctcgtgtct gatggtgtca agattgtgct 24720

gtatgtatgt ccttccttcc ttccttcctt ccttccttcc ttccttcctt ccttccttcc 24780

ttccttcctt cctccctccc tccctccctc cctcccccct ttctcttctc ttctcttctc 24840

ttctcttctc ttctcttctc ttctcttctc ttctcttctc ttctcttctc ttctcttctc 24900

cttctcttct tcctcctcct tcatcttctt ctttcttcct cctcttcctt ctccttcttc 24960

ttcaaaacac agtctgtata gccccggctg tcctgaaact cactttgtac accaggctgg 25020

cctcgaactc agaaatctgc ctgcctctgc ctcctgagtg ctgggattaa aggcgtgtgc 25080

caccatgccc agtttgtgca catatatgtg catatgttta ttataaattt tactgataca 25140

ggagatggca tagcacaaaa cacacaaata ataaacacgg agttcatgtt ccacagaatg 25200

cctttggagg tcttttcagt acccttgtgt ccagagccaa ccagagacag caattaccca 25260

atatggagtt ctgaaatgaa agtcagtttt atttcctgtt aatggcagaa ataagaacaa 25320

aacgaaacag cagaagcatt ttggaagctt gcttgtttct cagtgatggg agcaacattt 25380

ttctgagcca gataatagtt tttcaaacac gggtgggaca tttctgcatt tttacgtgat 25440

gcataaacag tagctaaatt taatccccat tatatactta gcactttaca aagtctagcc 25500

agacaataaa ggatgaagca agtgctatct tcatttccat ggtatgggta cttctaggat 25560

caccaatctc caaccatcac catgttgctg aacttgtgta aaattgagca gtaacacaca 25620

ctgacatttc taccattcat acactacagg taagtacaca ctcaagagcg tagataatag 25680

taaactgtaa taaaatgagt taggaaatta ataagcgtgg ctatttgtta catttgtttt 25740

tagtcattga gctgcaagca taaagagttg aaattttaat aatagttata tttaaaacca 25800

ggtccacaag tctgaagaac ttaataactg accataatct ggtttgatct ggttctatct 25860

agtacaccac cagtgtgtgt gtgcgtgtgt gctcctatgc atacttatac attaaaaaaa 25920

aaaaagatat cctatgcttc aatttttaac ataaaataac cttctgacag ctgggtggtg 25980

gtggtggtgc atgtctttaa ttgcagcact caggaggcag gggcaggtgg gtctctgggt 26040

tcaaggccag tctggtttac agagccagtt ctaggacagc cagggctaca cagagaaacc 26100

ttgtttcaag acaaaacgaa acaaaacaac cacaaataaa aaatatatct ttttgatgtt 26160

tccaaatcag caggtgtata taactcttta actttaatag taacagtgta tttacctcag 26220

tttggtagcc tgggatccat tgagctgttt ctcactaagc agtgttttgg ttgttggttt 26280

tttttttttt tttttttttt ttttgtattt agttcatagt ttcaacactg attgtccttg 26340

gaatcttctt cagagttttt tttttttttt ttttttaaag atttatttat ttattatttt 26400

atttaagtac actttagctg acttcagaca caccagaaga gggtgtcaga tctcattacg 26460

gatgttagtg agccaccatg tggttgctgg gatttgaact ctggaccttc ggaagaacag 26520

tcggtgctct taaccactga gccatctctc cagccccaga gttttctaaa tagaactatg 26580

agtcaattcc tatctgtgga ttgctgtatc aaagaacatg tgagttttgt attgctgcgc 26640

tgcttttcta aaggggattc ctgatgaaac gagtgtttac tgctctgatc tctggtgaac 26700

agtggaaagg ttaaccgaaa tagaaggcca ctgtttgttc taaagcttta acatttgtaa 26760

gccttttgca aaatgctctc tatttgcaga aaaactagag gaattagaaa aagtttccag 26820

ggatcccagc aatgagaatc ctaaactaag agacctctac ttggtcttac aagaagagta 26880

ccacttaaag ccagagacca agaccattct cttcgtgaag accagagcac tcgtggatgt 26940

aagtgtgtgt gtttacagat tagctctagt ttattgaaaa ggttgcccgt tcttcactgc 27000

cttataatca agtatccata catgtgtgga cctgttctga tgatttgttc ttacaccaat 27060

tgtcattgtt tgtattgacc cacagttata agtcttggtc ctatagagga agccctgcat 27120

cctttttaaa aatttaaaat ttccacttcc agtcatcctg taggttttga ttaatgacta 27180

atgtgtctta tatacctcac agttatcttc atatcatctt ttaaaaataa tttactcaga 27240

ttttaaaaac cagttttaaa attgggcaat gggctggaga tacagctcaa tggtcaaatg 27300

cttgttcagc atgcatgact ttaatcccca gttctggaaa aagatagata tctctctgtt 27360

tatgtagaat gccttgagtc tggccacagc gcctccctct gtttatgtag aatgcctgca 27420

ttgtttctgc tgagtagtag attacccata gagccagagg cagaaaaagt caagctttat 27480

tattttatga gatccgtgga tcaggatctg gaaaggactg gatacttatg cctcaaggtc 27540

tcctgaggcc acagtcagct cggcactcaa ggctgacctc tcggctcctt ttgcaggttg 27600

ttggcaggct tgtgaagatg agcctccaac atggcagctg cccctgccta cagtgagatg 27660

agagactgag gagaagaggg cctagtagac agacactgcc attttataaa gtccatcttg 27720

gacctgatgt cccaccacat ctcccatatt tcagagataa actacagatt atttttagaa 27780

tataggatgt agaagtcatt aagggtcgct tgtcatgtga tctttgctgt cttcttttgt 27840

taatgaatgt gggtgtttac catgtgcgtg tcgtgcccac agagtccagg aagggggcat 27900

gacatgccct ggaactggag ttaacagaca gttgtaagtt gccatgtagg tgctgggaat 27960

tgaactcagg tcctctggaa gaacaaccag tgctcttaac caccgagcca tctctccagc 28020

cccctttgct gtgttttatt agcattttgt catttttagt atagaggtcc tgcatacatt 28080

ttgttagatt catacctagg tattaatttt agtgttgtca ttccgaaatt gtactttcaa 28140

atatttctca ctgtgggcta ggaagacatc tcagtaaagt gtctaaagta caggcatcag 28200

gacctggctt ccagcaacct ggtaaaaaag ccgagtacag tagagtactc ttgtaatccc 28260

agccctgggg acagagataa gcacaaccct aactggcaat gcccaggtcc cagggagtta 28320

ctcattactc agtcttaggc agaacgaagg tgggtggctg ttaagaaatg atacctaggg 28380

ctggtgagat ggctcagtgg gtaagagcac ctgactgctc ttccgaaggt ccagagttca 28440

aatcccagca accacatggt ggctcacaac catccgtaac gagatctgac tccctcttct 28500

ggtgtgtctg aagacagcta cagtgtactt acatataata aataaataaa tctttaaaaa 28560

aaaaaaaaaa aaaaaagaaa tgatacctga ggttgacctc cacatgcatg tacacacaca 28620

cacacacaca cacatgcgtg cgtggacata ctcccctcca acacagtcag ccatgtacac 28680

ctccacacaa cacacagttc ttccaattgc agctgtctgc tgatatttac tgtgtaatta 28740

atttacatgg attgatcttt caccttaaag ccttgctaaa tttcacttac tctatgtctg 28800

aagcttgtct ttttaatcac ttaaaatatc tcctacatta agccataatg aggcagagtt 28860

ctatatcact agcatcaatt gttgtttgga atttaggatt tgccagtctg aaatccattt 28920

ttatctttag ttgtattctc tttttgcata tacatccatt atatcaaatt gatgtgaggt 28980

ttaaagttta caagtggtgt ctaactggcc gttgcttttc acttttaggc tctgaagaaa 29040

tggattgaag aaaatcctgc actaagcttt ctaaagcctg gcatactgac tgggcgtggc 29100

agaacaaacc gggcaacagg tatttatgtc tattgaatta gatttagtat actatgtata 29160

taaaatgtat aaacactaca ttgttttagt gtttctatca gtcagagctc aaccagagaa 29220

ataaagctac tagattatgc atatgtatgt ggtatatatg taagtatgta tgcttatttg 29280

tttgtttgtt tatttatgta cttagagata gggtttctct gtgtaaccct tgctctcctg 29340

gaactcactc tgtggaccag gctggccttg aattcagaaa tccgcctgcc tctgcctccc 29400

gagtgctggg attaaaggtg tgcgccacca ctgcctggcc tatactgtta ttctttaccc 29460

agtagatttt ttttccccat ctactgcctc tttaatagtt ttaaaaaaac agtccaggca 29520

atcctgaact ctagctagtg tggtctaggg aggaaggtta tcatttccca taagaaccct 29580

atgtggctag ctctcatcac agctacgtcc caagtcatat ctcacgactg tatgacctgc 29640

cctcgctgtt cttcctgcca gtgttgttta cactaaacaa gtctccaccc cttctctctc 29700

cgtcctcagg cattgctctt gtacttttcc attgtggaat ttcccgatct cataaacata 29760

gaatggactc aagtgttgaa tgtgtggttt cgagtctaac actaccctaa tgtggctgga 29820

ttttcaaagt tctttgccat ctctccaaca tgaatccaac ttgattttca agctttgcta 29880

ctgacatata aatcgagcct tgaataatat tttgtgtgct catccatgca tgcatggatc 29940

catggatcca atcatgtgtc caaccactca tccacccatc cgtgcatgca tccatctttc 30000

cgtcatgcat ttagacctta ctcagctcct gcttctgtga agaagcagcc atccctgtca 30060

tctaacaccc gaggtgcccc tccccccgcc acgttcccat cttacagatc tcaccccact 30120

tcctccacaa tggcttcctg ctcatcatcc ttatagataa agatggaatc tttaagcgtc 30180

atatttctac ctgctcagcc ataacccata attgctgacc gagtgttgga tggatgaatg 30240

aattggttag gatgattctg ctattgttgt tttctggatg attctttctt gttttatagc 30300

taacctggga aaaaaggtgg acttttacaa aaagccacag gttgcttggt gtttggacat 30360

tttcagattc ccttatctgt agcattttta cttcctactt tgagacacat gttgtaatgt 30420

ttatgcctta ctatcttcat ctgtcaaatg gaacaataaa tagttgtccc cagctcatag 30480

gttaacgaga atggtgaaac ctgagctttt tttttttttt tttttttttt tgtgaaaatg 30540

actttggcac ttttagatgg ttcaaaatta gtagccagtt tatgagtgag ttgtacagtg 30600

acctctttat ccaacacagg aatgacgctc ccggcacaga agtgtgtgct ggaggcattc 30660

agagccagcg gagataacaa tattctgatt gctacctcgg tcgctgatga aggcattgac 30720

attgctgagt gcaatctcgt cattctctat gagtacgtgg gcaacgtcat caagatgatc 30780

caaaccagag gtgagagcgg ctgatgtcat tcccgccccg cacccgcttt tctcctttcc 30840

tcagctgtac catgtgattg acagcacagc tgactctggt actcgaaatc taaaagctga 30900

ctgccttggt caggattggg tggttatagg tttacccata atactccatt gcaactctcc 30960

acaatggtac tgcaatttta cccagcgttc aatggcatag tcgtgaaaat atcatatcca 31020

ctaggccaga ggctttgcca gtcggcaagt agacctttga tgggtgtggt gagtagctct 31080

ctgtactcca gagtctggtc ccacctgaac cagagtctga cttcctttcc ctttcttgtt 31140

tccccaagaa cagcccccac attccctttc cggaataacg tctctgtgcc tgtcactcat 31200

cagtcacatc catttttcgt cctcctccac cgcttactgt gcggttcagc cagccagact 31260

ccgcttcctg ctcgtccagt ttctcagata ctgtcgctct acatgttagg tcctatctct 31320

gtctctgcca cacacaacct aattcttcta cctagaacaa gcactccttt aaatgcccac 31380

taccgtttat atctgtctct gcaagagcat gacaattgca ttcctttctc cgcattgcag 31440

aagggtcagg tgcgcgtgca cggtgccact gctgcgggct catgccagat tatctgtaaa 31500

ttagtgttgc tggcagtgca gagcaatcag actatgccat tggagacccc atgaaaactg 31560

ccagagatgg cttatctgtg tgctgagcac actggctaga acctgcattt gagtctactc 31620

ttcggttcag cttccctaga aagtaggatg cagtgaatca aagttgaact cgagaaatac 31680

tcctcacatc tctttccagt aacctcagag tttgacatta acacacaaag aaaacgtttt 31740

ctgcaggccg aggaagagca cgagatagca agtgcttcct cctgaccagc agcgctgacg 31800

tgattgaaaa agaaaaggcg aacatgatca aggaaaaaat aatgaatgaa tccatcttaa 31860

gactgcagac atgggatgaa atgaaatttg gaaagacggt aagtctcttt ttctgtgcta 31920

ctcttatgga atctgactag aaataacaaa tgaccatggt tggtcctgag tgtgtgtgtg 31980

tgtgtgtgtg tggtatgtgt ttgtggccat gtgcatttat ttatctttgt gtgctagttt 32040

tggccattca aataaccttt ctgttcgcat gtaggttcac cgcatacagg tgaatgaaaa 32100

actcctcaga gacagtcagc acaaaccaca acctgttcct gacaaagaaa acaagaaact 32160

gctgtgtgga aagtgcaaga attttgcgtg ctacacagct gacattcgag tggttgaggt 32220

gagtggccct ggtgatttag caccggttaa atcttaccat cttccggaga aatggttgta 32280

gcaagaacac tatgttgtgg ggtttcgagt gttgaccatg gtcctgtatt aagaaataaa 32340

atcctgctag gtggtggtgg cacacgcctt taatcccagt acttgggagg cagaggcagg 32400

cggatttctg agttcgaggc cagcctggtc tacagggtga gttccaggac agccagggct 32460

acacagagaa accctgtctt ggaaaaacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaag aaataaaatc 32520

ctgcttctat gtgggaacca gaaaggctga tgttatttaa gtccaaaaca gaaaatggtg 32580

cttaacggcg agaagaggag gggggtctaa ttgtagctgc cccagacagt caggcaggat 32640

ggataaggtt tcccgttcca ctgcacagca gggtgaatac tgcttatagt ttctgattca 32700

ttacaactct tacaaagaat tagacgagag gaattcatag cttcagacat aaagagatga 32760

aaactgtcca ggcagaaggg aatgctaatt actctggcga gatcattaga tacttagaaa 32820

ttatcacact gcacacccta agtgaggaca actgtgtgct ttgaaagaca gtctcactca 32880

gaccaggctg gcttcaactt gagattcttc tgtgactcag cctccccagt gcagggactc 32940

taggcatgca ccaccactct ctccaaagag atagtttttc ccagtgcagg gatagaaaat 33000

gaaggctctg ctagatacag tgttatgtcc ttggttagtt ccagggagga ggaagggcta 33060

ggcataaaaa tctgtcattg atttcttagt tttaacaaat gtgcaactgc attcaaaatg 33120

gaactgggct aaaggcattt gcaaatcttc tgaggcatct ctgtaacttt actgtatgtc 33180

aaagattatg ccaaagaaat gttaaggctc tgattttgaa gtgtacatgg ttctagtata 33240

aacctgccag caaatgaatg gtaaagtggg aaaatactat gaatatgaaa ttataaagat 33300

gcttttgtta tggctacata caacatgagc agtgatatct ttgtcatgac caatgtgggt 33360

ccacctttcc taaaggggaa aaaaggctaa tatataaaaa tgacatattc tgctagtgaa 33420

ttctctcttc ctgttttgtt ttctaaactt ccttattgga acagagaatg cttttataat 33480

gaaaacaaaa cacctcattt taaaaaatat aacacttgta ggttagcttt ctactttttc 33540

accccttaaa cttttttttt ttttttttga gacaggatct ctctctatag cactgggtat 33600

cttgaaactc attatatgga gattcccttg tccctgcctc ccaaacgctg ggacgtaaag 33660

gcatgtacca ttacacaagg tcttcttaaa acttttaact aaggcaaaaa acctccagag 33720

acgaatcttg cagtcatcat tcctgctacc gatggcgggg gcagatggct gtgctagcta 33780

ggggaggggt acagtcctta ttatgagtga catccacttt ctgagtctga ttctttagat 33840

gcagaaggtc ctttcagctc caaattcaag gcttctcctt cccagtggcc tggagaacga 33900

gatgcttggt ctgcgcttgc gtctgtaggg tacactcttt tttttttaat tggatatttt 33960

ctttatttac ataaagaaca ccttcagttc ccctacactg gggcatctaa gccttcatag 34020

gaccaaggac ctctcttccc attgatgcat gacaaggcca tcctctgcaa cgcacgcagc 34080

tggagccatg tgtactcctt tgtggatggc ttagtcgctg ggagctcttg ggggactggt 34140

tggttgatat tgtttttctc cctgtggggt tccttcagtt gtagggtact ctcttaagtc 34200

aagtctaagt ggggtctgtg gacagcatgg ctcctgagcc tgttcacaca cataccctgt 34260

gacccctggg tgtcaccagc cctgtgcttt ggtgccttcc tggcctctgg tgaacttgaa 34320

ctttgtatgt gaactcctct ttgcttctga gttggaaagc tgggtttcct cctttctcag 34380

gtgccagacg cccaggaaat gggtcctaat cggcctgggg aagactgtct atatagtttt 34440

tttttcttcc aacttgtaaa ataaatggga tcccactcat tcctgacttt tagctactga 34500

gtggcttcta agtcattttc agacccgttt ctaacattgt gcgctccatc tcttcctcct 34560

agacgtccca ctacactgtc cttggagacg cttttaagga gcgctttgtg tgtaagccac 34620

accctaaacc aaagatctat gacaattttg agaagaaagc aaagatattc tgcgccaaac 34680

agaactgtag ccacgactgg ggaatttttg tgagatacaa gacgttcgag attccagtca 34740

taaaaattga aagtttcgtc gtggaagata ttgtgagcgg agttcagaac cggcactcaa 34800

agtggaagga ctttcatttt gaaaggatac agttcgatcc tgcagaaatg tccgtatgac 34860

ctcaggcttc tccgtctcgt gccgcaggga gccgtgcctt aagcatggag ttgatgagcc 34920

aatgctttct tacccaagct tgcacaatcc tttcttacac aagcctgcac tgtgttgaat 34980

gccagataac ctgactggtt ggtttcaagc tggtgctgtc cacacaaagc acacacgcct 35040

gaactgcggc gccgaatagt ttcttcacca ataactcata gcgtagccct tggccatggt 35100

ggggaggggt taaacttgtc ccttttacac ttttcagaac tgcccgacag ggaacgtgca 35160

gccactcggt acaccgagac gcatgatggc tggcgtgctg gaagggttcc cgttctctgt 35220

ctgctcgatc tgctgtaagc tgcctttgcc cttaatgaca gtgcccttaa gaacagtgac 35280

ttagttcttt ttcaggccac cagactgact gccagatccc ttctgtccct tctgtccctt 35340

gcactgattc ctttccggat ttgaccctgc caccctgtca ccctctgcag agtctcctgg 35400

tttctgtctc ttccttggtt tctttgctga ctcaaatttg gtagttgcaa ggttcagtat 35460

gcacacatat atatttaaaa tgacatataa tttaaaatgt aaaagactat agttgacagc 35520

tatgcttact gagatggtat ttctgttctg ttcattacta tacatcttac ccttgctctc 35580

atctgttctt ttaacttggg ccatttcccg tctttgaata gacatctcaa accctgtctg 35640

tatgtctgtc tgtttcccac ctgtttgaga cagggtctct ctgtagacca gaaactccat 35700

atgtagacta tgctggcctt gaactcacag atccccctgc ctctcaagtg ttgaaattaa 35760

aatctttcac catgcctggc tctagctatt ttcaataaag gctcatgttt aaagtttgaa 35820

ctacttccaa ttcattccct gacgtggctt gttgttgttg tttacttttg gagacactgt 35880

tcctctctgt agccctggct gtgtagacca ggctgccctt ggtcacagag atctgccagc 35940

ttctgcctcc ggagcactga gattgaaggc ctgcatcacc atgcctggct tgccctttct 36000

tcttaaacat tatatattca aatggcattt ccgtgtttct tctcaaggtg tgccagtgct 36060

tcagagagct tagtttgggg ttcttcagat caagagacaa gtgtctgagc gctgttactg 36120

ccaacagagc aaagtactct tcagttcagg gaaggaacag tgctggtttt gtaggcagta 36180

cagtggtttt aacaccttcc tagaacttac ttgtaattca tcagttgtag accatcaatg 36240

gcctaaacca aactgcagag atcatctgac cacataactc cccttccagg acatttacat 36300

ttgaagacta tcccaagccc acccagagca cagtgggtta cccaaactcc ccaggtcaac 36360

cctggaggtc aacagtatga catgggatag cacaccactt ctcacagatg cctagagaaa 36420

ttacccagca acataactct ttggggaaaa aacacctata gggattaggc ttttaattga 36480

tagaataggt agaaaaaaag atatgtagta gttcttgata gtggttactg gtaaaattct 36540

tagtgcaata aaatgaattt gccgagagct gactttcttt tttttcttgt ttttttgaga 36600

cagggtttct ctgtatagct ttggctgtcc tggaatgcac tctgtagtcc aggctggcct 36660

tcgaactcag aaatccgcct tcctctgcct cccaagtgtt gggattaaag gcgtgcgcca 36720

ccacgcctgg ctgagagctg actttcattt atgtctttta gtctatgttg cctttctttg 36780

ctgctacagt ttaagaactc tacagcttgt ataagatacc tactggaaat tatttgagaa 36840

aaaaaacttg taaacattac aataatttaa ttaattaaaa atttatgtat tttatgtata 36900

tgggtgtttt tttctgcaag tctgtgtgca cattagaaga gggcattgga tcctctctat 36960

tgttatagtt ttatgctgct gctgttgttg ctgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgctatg 37020

aattgaactc aggacctctg gaagagcagt cagtgctctt aactgctgag ctatctctcc 37080

agtcctggca atgataaatc agttgaagtg aaatagtcct cccccccctt tttttttttt 37140

gccaatgggg aaaagcagac taaatctgag accaaatgaa gttttgagtt gtacactgac 37200

ttaagccact gccaagcata ccctggaatg gagcaaaccc tgggttacta agtactgaat 37260

gaatacaaca ggaaggtttt gagagatggg aaaatgcttg tctttggact tccctgatgg 37320

aagttgcatc tggactctcc catgagcaca tcaccagtcc ccactagagt cctcacaggt 37380

tgccatccat gtgtcctttt tgaggctgag atacaacttg ttctgcaacc acagaccttg 37440

ctgttttgtg gtcagtattg gtatcatagc attttcatcc tgacctggag ccttcagtca 37500

aaggcctcat tgtgcagtaa ggacgctgga ctcctgactc ctatacttaa aacagacttg 37560

gtaatttcaa acaagtcaac cagatgccag tatttctgca tgcatgtctt gtgggatggt 37620

gttgtgaggt cccctgacag atgcactgag tggccaggga gacttttgta cccttttcca 37680

ttttaacagc ccacgggtca ctgtgttgct tccatcatat taacatcaac ttgaaccagt 37740

ggttcctgaa acacttcagt tcattggacc ttgctaatta gcatcctgta aaaacccacc 37800

aacaaatatc aactagacag gtagaatcca agtgaactgt acactcctgg atcatgccag 37860

taactgtttt aataatacac cataaaatat aactacgact tcattttaca aatctgtgtt 37920

taataaacag gtacaggctt gttgggtgcg aacttttaaa actcctaata aaaatgccag 37980

ctatgattat ctttgtttat g 38001

<210> 12

<211> 3435

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<222> (370)..(1815)

<400> 12

cgtttgtagt gtcagccatc ccaattgcct gttccttctc tgtgggagtg gtgtctagac 60

agtccaggca gggtatgcta ggcaggtgcg ttttggttgc ctcagatcgc aacttgactc 120

cataacggtg accaaagaca aaagaaggaa accagattaa aaagaaccgg acacagaccc 180

ctgcagaatc tggagcggcc gtggttgggg gcggggctac gacggggcgg actcgggggc 240

gtgggagggc ggggccgggg cggggcccgg agccggctgc ggttgcggtc cctgcgccgg 300

cggtgaaggc gcagcggcgg cgagtggcta ttgcaagcgt ttggataatg tgagacctgg 360

gatgcaggg atg tcg act atc tgc ccc cca cca tct cct gct gtt gcc aag 411

Met Ser Thr Ile Cys Pro Pro Pro Ser Pro Ala Val Ala Lys

1 5 10

aca gag att gct tta agt ggt gaa tca ccc ttg ttg gcg gct acc ttt 459

Thr Glu Ile Ala Leu Ser Gly Glu Ser Pro Leu Leu Ala Ala Thr Phe

15 20 25 30

gct tac tgg gat aat att ctt ggt cct aga gta agg cac att tgg gct 507

Ala Tyr Trp Asp Asn Ile Leu Gly Pro Arg Val Arg His Ile Trp Ala

35 40 45

cca aag aca gac caa gta ctc ctc agt gat gga gaa atc act ttt ctt 555

Pro Lys Thr Asp Gln Val Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ile Thr Phe Leu

50 55 60

gcc aac cac act ctg aat gga gaa att ctt cgg aat gcg gag agt ggg 603

Ala Asn His Thr Leu Asn Gly Glu Ile Leu Arg Asn Ala Glu Ser Gly

65 70 75

gca ata gat gta aag ttt ttt gtc tta tct gaa aag ggc gtc att att 651

Ala Ile Asp Val Lys Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys Gly Val Ile Ile

80 85 90

gtt tca tta atc ttc gac ggg aac tgg aac gga gat cgg agc act tac 699

Val Ser Leu Ile Phe Asp Gly Asn Trp Asn Gly Asp Arg Ser Thr Tyr

95 100 105 110

gga cta tca att ata ctg ccg cag acg gag ctg agt ttc tac ctc cca 747

Gly Leu Ser Ile Ile Leu Pro Gln Thr Glu Leu Ser Phe Tyr Leu Pro

115 120 125

ctg cac aga gtg tgt gtt gac agg cta acg cac atc att cga aaa gga 795

Leu His Arg Val Cys Val Asp Arg Leu Thr His Ile Ile Arg Lys Gly

130 135 140

agg ata tgg atg cac aag gaa aga caa gaa aat gtc cag aaa att gtc 843

Arg Ile Trp Met His Lys Glu Arg Gln Glu Asn Val Gln Lys Ile Val

145 150 155

ttg gaa ggc acc gag agg atg gaa gat cag ggt cag agt atc atc cct 891

Leu Glu Gly Thr Glu Arg Met Glu Asp Gln Gly Gln Ser Ile Ile Pro

160 165 170

atg ctt act ggg gag gtc atc cct gtg atg gag ctg ctt gcg tct atg 939

Met Leu Thr Gly Glu Val Ile Pro Val Met Glu Leu Leu Ala Ser Met

175 180 185 190

aga tca cac agt gtt cct gaa gac ctc gat ata gct gat aca gta ctc 987

Arg Ser His Ser Val Pro Glu Asp Leu Asp Ile Ala Asp Thr Val Leu

195 200 205

aat gat gat gac att ggt gac agc tgt cat gaa ggc ttt ctt ctc aat 1035

Asn Asp Asp Asp Ile Gly Asp Ser Cys His Glu Gly Phe Leu Leu Asn

210 215 220

gcc atc agc tca cat ctg cag acc tgc ggc tgt tct gtg gtg gta ggc 1083

Ala Ile Ser Ser His Leu Gln Thr Cys Gly Cys Ser Val Val Val Gly

225 230 235

agc agt gca gag aaa gta aat aag ata gta aga aca ctg tgc ctt ttt 1131

Ser Ser Ala Glu Lys Val Asn Lys Ile Val Arg Thr Leu Cys Leu Phe

240 245 250

ctg aca cca gca gag agg aag tgc tcc agg ctg tgt gaa gcc gaa tcg 1179

Leu Thr Pro Ala Glu Arg Lys Cys Ser Arg Leu Cys Glu Ala Glu Ser

255 260 265 270

tcc ttt aaa tac gaa tct gga ctc ttt gta caa ggc ttg cta aag gat 1227

Ser Phe Lys Tyr Glu Ser Gly Leu Phe Val Gln Gly Leu Leu Lys Asp

275 280 285

gcg act ggc agt ttt gta cta cct ttc cgg caa gtt atg tat gcc cct 1275

Ala Thr Gly Ser Phe Val Leu Pro Phe Arg Gln Val Met Tyr Ala Pro

290 295 300

tat ccc acc aca cac atc gat gtg gat gtc aac act gtc aag cag atg 1323

Tyr Pro Thr Thr His Ile Asp Val Asp Val Asn Thr Val Lys Gln Met

305 310 315

cca ccg tgt cat gaa cat att tat aat caa cgc aga tac atg agg tca 1371

Pro Pro Cys His Glu His Ile Tyr Asn Gln Arg Arg Tyr Met Arg Ser

320 325 330

gag ctg aca gcc ttc tgg agg gca act tca gaa gag gac atg gct cag 1419

Glu Leu Thr Ala Phe Trp Arg Ala Thr Ser Glu Glu Asp Met Ala Gln

335 340 345 350

gac acc atc atc tac aca gat gag agc ttc act cct gat ttg aat att 1467

Asp Thr Ile Ile Tyr Thr Asp Glu Ser Phe Thr Pro Asp Leu Asn Ile

355 360 365

ttc caa gat gtc tta cac aga gac act cta gtg aaa gcc ttt ctg gat 1515

Phe Gln Asp Val Leu His Arg Asp Thr Leu Val Lys Ala Phe Leu Asp

370 375 380

cag gtc ttc cat ttg aag cct ggc ctg tct ctc agg agt act ttc ctt 1563

Gln Val Phe His Leu Lys Pro Gly Leu Ser Leu Arg Ser Thr Phe Leu

385 390 395

gca cag ttc ctc ctc att ctt cac aga aaa gcc ttg aca cta atc aag 1611

Ala Gln Phe Leu Leu Ile Leu His Arg Lys Ala Leu Thr Leu Ile Lys

400 405 410

tac ata gag gat gac acg cag aag ggg aaa aag ccc ttt aag tct ctt 1659

Tyr Ile Glu Asp Asp Thr Gln Lys Gly Lys Lys Pro Phe Lys Ser Leu

415 420 425 430

cgg aac ctg aag ata gat ctt gat tta aca gca gag ggc gac ctt aac 1707

Arg Asn Leu Lys Ile Asp Leu Asp Leu Thr Ala Glu Gly Asp Leu Asn

435 440 445

ata ata atg gct cta gct gag aaa att aag cca ggc cta cac tct ttc 1755

Ile Ile Met Ala Leu Ala Glu Lys Ile Lys Pro Gly Leu His Ser Phe

450 455 460

atc ttc ggg aga cct ttc tac act agt gtc caa gaa cgt gat gtt cta 1803

Ile Phe Gly Arg Pro Phe Tyr Thr Ser Val Gln Glu Arg Asp Val Leu

465 470 475

atg act ttt taa acatgtggtt tgctccgtgt gtctcatgac agtcacactt 1855

Met Thr Phe

480

gctgttacag tgtctcagcg ctttggacac atccttcctc cagggtcctg ccgcaggaca 1915

cgttacacta cacttgtcag tagaggtctg taccagatgt caggtacatc gttgtagtga 1975

atgtctcttt tcctagacta gatgtaccct cgtagggact tatgtttaca accctcctaa 2035

gtactagtgc tgtcttgtaa ggatacgaat gaagggatgt aaacttcacc acaactgctg 2095

gttggttttg ttgtttttgt tttttgaaac ttataattca tggtttacat gcatcacact 2155

gaaaccctag ttagcttttt acaggtaagc tgtgagttga ctgcctgtcc ctgtgttctc 2215

tggcctgtac gatctgtggc gtgtaggatc acttttgcaa caactaaaaa ctaaagcact 2275

ttgtttgcag ttctacagaa agcaacttag tctgtctgca gattcgtttt tgaaagaaga 2335

catgagaaag cggagtttta ggtgaagtca gttgttggat cttcctttat agacttagtc 2395

ctttagatgt ggtctgtata gacatgccca accatcatgc atgggcactg aatatcgtga 2455

actgtggtat gctttttgtt ggtttattgt acttctgtca aagaaagtgg cattggtttt 2515

tataattgtt gccaagtttt aaggttaatt ttcattattt ttgagccaaa ttaaaatgtg 2575

cacctcctgt gcctttccca atcttggaaa atataatttc ttggcagaag gtcagatttc 2635

agggcccagt cactttcgtc tgacttccct ttgcacagtc cgccatgggc ctggcttaga 2695

agttcttgta aactatgcca gagagtacat tcgctgataa aatcttcttt gcagagcagg 2755

agagcttctt gcctctttcc tttcatttct gcctggactt tggtgttctc cacgttccct 2815

gcatcctaag gacagcagga gaactctgac cccagtgcta tttctctagg tgctattgtg 2875

gcaaactcaa gcggtccgtc tctgtccctg taacgttcgt accttgctgg ctgtgaagta 2935

ctgactggta aagctccgtg ctacagcagt gtagggtata cacaaacaca agtaagtgtt 2995

ttatttaaaa ctgtggactt agcataaaaa gggagactat atttattttt tacaaaaggg 3055

ataaaaatgg aaccctttcc tcacccacca gatttagtca gaaaaaaaca ttctattctg 3115

aaaggtcaca gtggttttga catgacacat cagaacaacg cacactgtcc atgatggctt 3175

atgaactcca agtcactcca tcatggtaaa tgggtagatc cctccttcta gtgtgccaca 3235

ccattgcttc ccacagtaga atcttattta agtgctaagt gttgtctctg ctggtttact 3295

ctgttgtttt agagaatgta agttgtatag tgaataagtt attgaagcat gtgtaaacac 3355

tgttatacat cttttctcct agatggggaa tttggaataa aataccttta aaattcaaaa 3415

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3435

<210> 13

<211> 36

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 13

ggggccgggg ccggggccgg ggccggggcc ggggcc 36

<210> 14

<400> 14

000

<210> 15

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 15

tgtgacagtt ggaatgcagt ga 22

<210> 16

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 16

gccacttaaa gcaatctctg tcttg 25

<210> 17

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 17

tcgactcttt gcccaccgcc a 21

<210> 18

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 18

gggtctagca agagcaggtg 20

<210> 19

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 19

gtcttggcaa cagctggaga t 21

<210> 20

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 20

tgatgtcgac tctttgccca ccgc 24

<210> 21

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 21

tcctgtaatg gaactgcttt ca 22

<210> 22

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 22

ggtatctgct tcatccagct tt 22

<210> 23

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 23

ccccggcccc ggcccc 16

<210> 24

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 24

caagccaccg tctcactcaa 20

<210> 25

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 25

gtagtgctgt ctactccaga gagttacc 28

<210> 26

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 26

gtagtgctgt ctactccaga gagttacc 28

<210> 27

<400> 27

000

<210> 28

<400> 28

000

<210> 29

<400> 29

000

<210> 30

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 30

agcgggacac cgtaggttac 20

<210> 31

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 31

gtgggcggaa cttgtcgctg 20

<210> 32

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 32

gtcacattat ccaaatgctc 20

<210> 33

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 33

ggtgggcaaa gagtcgacat 20

<210> 34

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 34

atctctgtct tggcaacagc 20

<210> 35

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 35

aagcaatctc tgtcttggca 20

<210> 36

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 36

acttaaagca atctctgtct 20

<210> 37

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 37

ttgccactta aagcaatctc 20

<210> 38

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 38

cccagtaagc aaaagtagct 20

<210> 39

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 39

actctaggac caagaatatt 20

<210> 40

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 40

gccttactct aggaccaaga 20

<210> 41

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 41

ccaaatgtgc cttactctag 20

<210> 42

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 42

tggagcccaa atgtgcctta 20

<210> 43

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 43

tctgtctttg gagcccaaat 20

<210> 44

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 44

ccatcactga gaagtacctg 20

<210> 45

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 45

atttctccat cactgagaag 20

<210> 46

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 46

aaaagttatt tctccatcac 20

<210> 47

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 47

tggcaagaaa agttatttct 20

<210> 48

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 48

gtgtggttgg caagaaaagt 20

<210> 49

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 49

ctccatttag agtgtggttg 20

<210> 50

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 50

tgcatttcga aggatttctc 20

<210> 51

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 51

ccactctctg catttcgaag 20

<210> 52

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 52

acaaaaaact ttacatctat 20

<210> 53

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 53

ccttttcaga caagacaaaa 20

<210> 54

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 54

aagattaatg aaacaataat 20

<210> 55

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 55

gtttccatca aagattaatg 20

<210> 56

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 56

attgatagtc catatgtgct 20

<210> 57

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 57

agtataattg atagtccata 20

<210> 58

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 58

ggaggtagaa actaagttct 20

<210> 59

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 59

atgtgttaat ctatcaacac 20

<210> 60

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 60

tgcatccata ttcttccttt 20

<210> 61

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 61

ttccttatgc atccatattc 20

<210> 62

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 62

cttgtctttc cttatgcatc 20

<210> 63

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 63

acattttctt gtctttcctt 20

<210> 64

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 64

tctggacatt ttcttgtctt 20

<210> 65

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 65

ataatcttct ggacattttc 20

<210> 66

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 66

ctctgaccct gatcttccat 20

<210> 67

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 67

ttggaataat actctgaccc 20

<210> 68

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 68

cagttccatt acaggaatca 20

<210> 69

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 69

cttcaggaac actgtgtgat 20

<210> 70

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 70

atctatttct tcaggaacac 20

<210> 71

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 71

agtactgtat cagctatatc 20

<210> 72

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 72

tcattgagta ctgtatcagc 20

<210> 73

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 73

tcatcatcat tgagtactgt 20

<210> 74

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 74

ccaatatcat catcattgag 20

<210> 75

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 75

tcatgacagc tgtcaccaat 20

<210> 76

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 76

aagccttcat gacagctgtc 20

<210> 77

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 77

agaagaaagc cttcatgaca 20

<210> 78

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 78

tacttgagaa gaaagccttc 20

<210> 79

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 79

attcttactt gagaagaaag 20

<210> 80

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 80

aaaaattctt acttgagaag 20

<210> 81

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 81

agatggtatc tgcttcatcc 20

<210> 82

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 82

caatctaagt agacagtctg 20

<210> 83

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 83

ttaagcaaca gttcaaatac 20

<210> 84

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 84

ctttaaatag caaatggaat 20

<210> 85

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 85

gccatgattt cttgtctggg 20

<210> 86

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 86

gctttaatga gaagtaaaac 20

<210> 87

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 87

tctacagtac aacttaatat 20

<210> 88

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 88

ataattttgt tctacgccta 20

<210> 89

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 89

cactgctgga tggaaaaaga 20

<210> 90

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 90

tggtttaagg gcacaaactc 20

<210> 91

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 91

ttgcccacgg gtacacagca 20

<210> 92

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 92

cagatgagga aataggtgta 20

<210> 93

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 93

acacattagg tactattact 20

<210> 94

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 94

tttttatgtt ccaggcactg 20

<210> 95

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 95

aataggaaat gttagctatg 20

<210> 96

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 96

ggcactcaac aaatactggc 20

<210> 97

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 97

tacatgtaaa gcaactagta 20

<210> 98

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 98

taaaatttca tgaaaatctg 20

<210> 99

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 99

aagtgaatac tttatacttt 20

<210> 100

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 100

catcatgagc ctaaaggaaa 20

<210> 101

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 101

ggctcttagg ttaaacacac 20

<210> 102

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 102

tgcttctgat tcaagccatt 20

<210> 103

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 103

atacaggact aaagtgcttc 20

<210> 104

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 104

caaatgggat ttaaaatgat 20

<210> 105

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 105

tgacatgtag agagattaag 20

<210> 106

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 106

ttattgaaat accatcattt 20

<210> 107

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 107

tagtcagtat aatatcattt 20

<210> 108

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 108

gcattgagaa gaaagccttc 20

<210> 109

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 109

aagacctgat ccaggaaggc 20

<210> 110

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 110

tgagctgatg gcattgagaa 20

<210> 111

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 111

acaacggaac agccacaggt 20

<210> 112

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 112

ttagtgtcaa ggcttttctg 20

<210> 113

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 113

gacggctgac acaccaagcg 20

<210> 114

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 114

tgatggcatt gagaagaaag 20

<210> 115

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 115

tttactttct ctgcactgct 20

<210> 116

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 116

tcttatttac tttctctgca 20

<210> 117

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 117

ggcataatgt tctgactatc 20

<210> 118

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 118

ataacctgga gcattttctc 20

<210> 119

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 119

ccctgactca tatttaaatg 20

<210> 120

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 120

ccagttgaat cctttagcag 20

<210> 121

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 121

catacatgac ttgccggaaa 20

<210> 122

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 122

gacatccaca tctatgtgtg 20

<210> 123

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 123

tgttcatgac agggtggcat 20

<210> 124

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 124

ttataaatat gttcatgaca 20

<210> 125

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 125

cagctcggat ctcatgtatc 20

<210> 126

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 126

ctccagaagg ctgtcagctc 20

<210> 127

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 127

gtatcctgag ccatgtcttc 20

<210> 128

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 128

aatcaggagt aaagctttcg 20

<210> 129

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 129

aaaatattca aatcaggagt 20

<210> 130

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 130

tctctgtgta agacatcttg 20

<210> 131

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 131

gagtgtctct gtgtaagaca 20

<210> 132

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 132

cactagagtg tctctgtgta 20

<210> 133

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 133

gctttcacta gagtgtctct 20

<210> 134

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 134

gatccaggaa ggctttcact 20

<210> 135

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 135

aaagtacttc tgagagataa 20

<210> 136

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 136

aactgtgcaa ggaaagtact 20

<210> 137

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 137

gtcaaggctt ttctgtgaag 20

<210> 138

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 138

agagatttaa agggcttttt 20

<210> 139

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 139

atcttcaggt tccgaagaga 20

<210> 140

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 140

ccctctgctg ttaaatcaag 20

<210> 141

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 141

tgttaagatc gccctctgct 20

<210> 142

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 142

attattatgt taagatcgcc 20

<210> 143

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 143

agagccatta ttatgttaag 20

<210> 144

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 144

ataaaagagt gtaggcctgg 20

<210> 145

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 145

acactagtgt agaaaggtct 20

<210> 146

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 146

gttcttgcac actagtgtag 20

<210> 147

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 147

taaaaagtca ttagaacatc 20

<210> 148

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 148

tattaagtta cacatttaaa 20

<210> 149

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 149

ctttaccagc gatcatgatt 20

<210> 150

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 150

ttctggagta tgatccaggg 20

<210> 151

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 151

acttaactgc aattgctgag 20

<210> 152

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 152

tgtagtgtaa cttacttaac 20

<210> 153

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 153

atgcacctga catcccctca 20

<210> 154

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 154

cccaaaagca taaatctagg 20

<210> 155

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 155

atatttatta tattgtaaac 20

<210> 156

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 156

agcaataata tttattatat 20

<210> 157

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 157

agatagcaat aatatttatt 20

<210> 158

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 158

aaagatagca ataatattta 20

<210> 159

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 159

ttaaaagata gcaataatat 20

<210> 160

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 160

atctttaaaa gatagcaata 20

<210> 161

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 161

atatctttaa aagatagcaa 20

<210> 162

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 162

attatatctt taaaagatag 20

<210> 163

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 163

tattattata tctttaaaag 20

<210> 164

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 164

caagtttaca tcctattatt 20

<210> 165

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 165

aaaacagtag ttgtggtcaa 20

<210> 166

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 166

aaaaaacagt agttgtggtc 20

<210> 167

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 167

tgaatcatgt atttcaaaaa 20

<210> 168

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 168

gccaactcag atttcacctt 20

<210> 169

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 169

ctacacacca aagaatgcca 20

<210> 170

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 170

agttttcagt tgattgcaga 20

<210> 171

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 171

catcctatgt tcaagctcac 20

<210> 172

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 172

taaacatctg cttgatcaat 20

<210> 173

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 173

aatccacaaa gtaggatcta 20

<210> 174

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 174

attagacatt tctacagact 20

<210> 175

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 175

ctcaactaca tagaatatca 20

<210> 176

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 176

ttggcaacaa ttactaaaac 20

<210> 177

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 177

tcaaaaataa tgaaaattaa 20

<210> 178

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 178

caatttggct caaaaataat 20

<210> 179

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 179

ggcacaggag gtgcacattt 20

<210> 180

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 180

tagattttct aaggagaaaa 20

<210> 181

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 181

actgaccagt gaaatctgaa 20

<210> 182

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 182

ggtaagactt agcaagaaga 20

<210> 183

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 183

tctcagagtt gcaatgattg 20

<210> 184

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 184

agatcttatt agttagtata 20

<210> 185

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 185

agtactcaag gaactatttt 20

<210> 186

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 186

ggcaaacagc aacaacttca 20

<210> 187

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 187

gcacttcagt aaaatttctc 20

<210> 188

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 188

ggtccaaacg cattaagaaa 20

<210> 189

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 189

gaattatatt aatcagttat 20

<210> 190

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 190

tgtgtttgtg taactacaat 20

<210> 191

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 191

atattacttc cagaatttta 20

<210> 192

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 192

ggcagaaggg ctctattacc 20

<210> 193

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 193

cattcgaaca tgtcattttg 20

<210> 194

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 194

ctgattcatg atgggaaagc 20

<210> 195

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 195

gtggttgtct aaaacatcaa 20

<210> 196

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 196

atgactgagc tacagtacaa 20

<210> 197

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 197

gggacactac aaggtagtat 20

<210> 198

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 198

ttaaataaga atctaccatg 20

<210> 199

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 199

gctttaataa cttatttcac 20

<210> 200

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 200

aggagaaaag atatataaca 20

<210> 201

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 201

ccatttagga gaaaagatat 20

<210> 202

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 202

ttcaccctca gcgagtactg 20

<210> 203

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 203

aggctgcggt tgtttccctc 20

<210> 204

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 204

gccagatccc catcccttgt 20

<210> 205

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 205

tcacttcctt taagcaagtc 20

<210> 206

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 206

agtgatgccc aagtcacaat 20

<210> 207

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 207

agtcaagtga tgcccaagtc 20

<210> 208

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 208

ccatcagtca agtgatgccc 20

<210> 209

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 209

gattaccatc agtcaagtga 20

<210> 210

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 210

caactgatta ccatcagtca 20

<210> 211

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 211

gcagtttcca actgattcag 20

<210> 212

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 212

cgttcttgtt tcagatgtac 20

<210> 213

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 213

gccaaacaaa atattttatc 20

<210> 214

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 214

taggtaggct aacctagtcc 20

<210> 215

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 215

tcccagccca aagagaagca 20

<210> 216

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 216

ggatcatagc tctcggtaac 20

<210> 217

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 217

aatcataaag ccctcacttc 20

<210> 218

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 218

ctgattggta tttagaaagg 20

<210> 219

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 219

atgcagacat gattacatta 20

<210> 220

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 220

ttcatcatta aactgaaaat 20

<210> 221

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 221

cttttaggtt aaaaaggtgg 20

<210> 222

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 222

atacagagcc tggcaaaaca 20

<210> 223

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 223

ttctatttac agagcattag 20

<210> 224

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 224

gccttcacat taattcacca 20

<210> 225

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 225

tgtgttattg cccctaaaaa 20

<210> 226

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 226

tgtattcact atactatgcc 20

<210> 227

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 227

aagttattta aagtatagca 20

<210> 228

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 228

gacattgaag tatcaagaca 20

<210> 229

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 229

tgttaagtaa tcttagaaaa 20

<210> 230

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 230

ggcatacatt tagaaattca 20

<210> 231

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 231

accttatgca tccatattct 20

<210> 232

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 232

gaattctctt gggaaccatt 20

<210> 233

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 233

atattcaact acaggattta 20

<210> 234

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 234

atgtgttctt tagatacatc 20

<210> 235

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 235

ccttatacag atacatgctg 20

<210> 236

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 236

tagatgcaat tactattttc 20

<210> 237

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 237

tgtacttccc aaacttgaac 20

<210> 238

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 238

ctgaagctca acaacaccaa 20

<210> 239

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 239

gtctatagaa tcaaactgaa 20

<210> 240

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 240

ttgaatcaat acctaacctc 20

<210> 241

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 241

tgcctctttt agaaaagatc 20

<210> 242

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 242

atggaatcat tggtttatcg 20

<210> 243

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 243

aaagctcact tttattcttt 20

<210> 244

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 244

ggtgccgcca ccatgcccgg 20

<210> 245

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 245

gagagaagct gggcaataaa 20

<210> 246

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 246

tctgaccctg cacaataaag 20

<210> 247

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 247

atagtgtgtg attcaaaacg 20

<210> 248

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 248

actgtatcag ctatctaaaa 20

<210> 249

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 249

ttatttgtat aggaacctac 20

<210> 250

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 250

tgtgagctga tggcactgta 20

<210> 251

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 251

ccttatttac tttctctgca 20

<210> 252

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 252

ggaataaggt cactagttcg 20

<210> 253

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 253

atttgcaaca atttttaaat 20

<210> 254

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 254

ataaactacc aatgatatcc 20

<210> 255

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 255

tacctgatcc aggaaggctt 20

<210> 256

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 256

ttcccgaagc ataaatctag 20

<210> 257

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 257

ttgagaagca tgaaattcca 20

<210> 258

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 258

gcgggacacc gtaggttacg 20

<210> 259

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 259

ctttcctagc gggacaccgt 20

<210> 260

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 260

gcacctctct ttcctagcgg 20

<210> 261

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 261

tgtttgacgc acctctcttt 20

<210> 262

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 262

cttgtcgctg tttgacgcac 20

<210> 263

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 263

gggcggaact tgtcgctgtt 20

<210> 264

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 264

gcagcaggga cggctgacac 20

<210> 265

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 265

agaagcaacc gggcagcagg 20

<210> 266

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 266

cccaaaagag aagcaaccgg 20

<210> 267

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 267

accccgcccc caaaagagaa 20

<210> 268

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 268

cttgctagac cccgccccca 20

<210> 269

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 269

cacctgctct tgctagaccc 20

<210> 270

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 270

taaacccaca cctgctcttg 20

<210> 271

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 271

ctcctaaacc cacacctgct 20

<210> 272

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 272

acacacacct cctaaaccca 20

<210> 273

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 273

aaacaaaaac acacacctcc 20

<210> 274

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 274

ggtgggaaaa acaaaaacac 20

<210> 275

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 275

ctgtgagagc aagtagtggg 20

<210> 276

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 276

agcgagtact gtgagagcaa 20

<210> 277

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 277

tcaccctcag cgagtactgt 20

<210> 278

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 278

tcaggtcttt tcttgttcac 20

<210> 279

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 279

aatctttatc aggtcttttc 20

<210> 280

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 280

ttctggttaa tctttatcag 20

<210> 281

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 281

ttgttttctt ctggttaatc 20

<210> 282

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 282

ttccctcctt gttttcttct 20

<210> 283

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 283

gcggttgttt ccctccttgt 20

<210> 284

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 284

tacaggctgc ggttgtttcc 20

<210> 285

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 285

gagcttgcta caggctgcgg 20

<210> 286

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 286

gagttccaga gcttgctaca 20

<210> 287

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 287

cgactcctga gttccagagc 20

<210> 288

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 288

cccggcccct agcgcgcgac 20

<210> 289

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 289

gccccggccc cggcccctag 20

<210> 290

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 290

accacgcccc ggccccggcc 20

<210> 291

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 291

ccgccccgac cacgccccgg 20

<210> 292

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 292

ccccgggccc gccccgacca 20

<210> 293

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 293

cgccccgggc ccgcccccgg 20

<210> 294

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 294

cgcagccccg ccccgggccc 20

<210> 295

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 295

accgcaaccg cagccccgcc 20

<210> 296

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 296

gcgcaggcac cgcaaccgca 20

<210> 297

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 297

ggcgcaggca ccgcaaccgc 20

<210> 298

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 298

cgcctccgcc gccgcgggcg 20

<210> 299

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 299

accgcctgcg cctccgccgc 20

<210> 300

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 300

cactcgccac cgcctgcgcc 20

<210> 301

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 301

ccactcgcca ccgcctgcgc 20

<210> 302

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 302

ggtccccggg aaggagacag 20

<210> 303

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 303

aacaactggt gcatggcaac 20

<210> 304

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 304

gtttcagatg tactatcagc 20

<210> 305

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 305

aaggtgaagt tcatatcact 20

<210> 306

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 306

ggtaacttca aactcttggg 20

<210> 307

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 307

ggttcatgag aggtttccca 20

<210> 308

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 308

tactgaattg cttagtttta 20

<210> 309

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 309

ctaacagaat aagaaaaaaa 20

<210> 310

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 310

gagcattaga tgagtgcttt 20

<210> 311

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 311

tgcattccta agcaatgtgt 20

<210> 312

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 312

tctaggcctt cacattaatt 20

<210> 313

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 313

cctgtctatg cctaggtgaa 20

<210> 314

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 314

tagcacatac aattattaca 20

<210> 315

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 315

gaggagaaga acataaacgc 20

<210> 316

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 316

taccacaagt ctggagccat 20

<210> 317

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 317

gatactggat tgttgaaact 20

<210> 318

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 318

tagtatgact ggagatttgg 20

<210> 319

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 319

atcaaaaccc caaatgattt 20

<210> 320

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 320

atccaaatgc tccggagata 20

<210> 321

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 321

tcgacatcac tgcattccaa 20

<210> 322

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 322

caacagctgg agatggcggt 20

<210> 323

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 323

atttgccact taaagcaatc 20

<210> 324

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 324

gtacctgttc tgtctttgga 20

<210> 325

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 325

caagaaaagt tatttctcca 20

<210> 326

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 326

gaaggatttc tccatttaga 20

<210> 327

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 327

ttacatctat agcaccactc 20

<210> 328

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 328

tcactccctt ttcagacaag 20

<210> 329

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 329

agtttccatc aaagattaat 20

<210> 330

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 330

atagtccata tgtgctgcga 20

<210> 331

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 331

aactaagttc tgtctgtgga 20

<210> 332

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 332

caacacacac tctatgaagt 20

<210> 333

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 333

ttcctttccg gattatatgt 20

<210> 334

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 334

tttccattac aggaatcact 20

<210> 335

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 335

atcagcctat atctatttcc 20

<210> 336

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 336

tcaatgacca ggcggtcccc 20

<210> 337

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 337

ctttttatgg aaaaggaaaa 20

<210> 338

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 338

tgtttcccca aaaatttctg 20

<210> 339

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 339

agatatccac tcgccaccgc 20

<210> 340

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 340

ccggccccgg ccccggcccc 20

<210> 341

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 341

cccggccccg gccccggccc 20

<210> 342

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 342

ccccggcccc ggccccggcc 20

<210> 343

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 343

gccccggccc cggccccggc 20

<210> 344

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 344

ggccccggcc ccggccccgg 20

<210> 345

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 345

cggccccggc cccggccccg 20

<210> 346

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 346

cggccccggc cccggcccc 19

<210> 347

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 347

ccggccccgg ccccggccc 19

<210> 348

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 348

cccggccccg gccccggcc 19

<210> 349

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 349

ccccggcccc ggccccggc 19

<210> 350

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 350

gccccggccc cggccccgg 19

<210> 351

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 351

ggccccggcc ccggccccg 19

<210> 352

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 352

ggccccggcc ccggcccc 18

<210> 353

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 353

cggccccggc cccggccc 18

<210> 354

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 354

ccggccccgg ccccggcc 18

<210> 355

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 355

cccggccccg gccccggc 18

<210> 356

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 356

ccccggcccc ggccccgg 18

<210> 357

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 357

gccccggccc cggccccg 18

<210> 358

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 358

gccccggccc cggcccc 17

<210> 359

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 359

ggccccggcc ccggccc 17

<210> 360

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 360

cggccccggc cccggcc 17

<210> 361

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 361

ccggccccgg ccccggc 17

<210> 362

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 362

cccggccccg gccccgg 17

<210> 363

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 363

ccccggcccc ggccccg 17

<210> 364

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 364

ccccggcccc ggcccc 16

<210> 365

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 365

gccccggccc cggccc 16

<210> 366

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 366

ggccccggcc ccggcc 16

<210> 367

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 367

cggccccggc cccggc 16

<210> 368

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 368

ccggccccgg ccccgg 16

<210> 369

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический нуклеотид

<400> 369

cccggccccg gccccg 16

<---

1. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16-20 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеотидных оснований, содержащую по меньшей мере 12 последовательных нуклеотидных оснований, которые на 100% комплементарны части равной длины из нуклеотидных оснований 1446-1479 SEQ ID NO: 2, причем модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модификацию, выбранную из модифицированного сахара и модифицированной межнуклеозидной связи, и причем соединение способно снижать уровень экспрессии мРНК и/или белка C9ORF72, содержащих экспансию гексануклеотидного повтора.

2. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16-20 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеотидных оснований, содержащую по меньшей мере 12 последовательных нуклеотидных оснований из любой из SEQ ID NO: 288, 340-343, 346-349, 352, 355-358, 361-367 и 369, причем модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модификацию, выбранную из модифицированного сахара и модифицированной межнуклеозидной связи, и причем соединение способно снижать уровень экспрессии мРНК и/или белка C9ORF72, содержащих экспансию гексануклеотидного повтора.

3. Соединение по п. 2, отличающееся тем, что последовательность нуклеотидных оснований содержит по меньшей мере 12 последовательных нуклеотидных оснований из SEQ ID NO: 288.

4. Соединение по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что последовательность нуклеотидных оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 90% комплементарна части равной длины SEQ ID NO: 2.

5. Соединение по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что последовательность нуклеотидных оснований модифицированного олигонуклеотида на 100% комплементарна части равной длины SEQ ID NO: 2.

6. Соединение по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что модифицированный олигонуклеотид является одноцепочечным модифицированным олигонуклеотидом.

7. Соединение по п. 6, отличающееся тем, что одноцепочечный модифицированный олигонуклеотид является гэпмером.

8. Соединение по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что по меньшей мере одна межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида является модифицированной межнуклеозидной связью.

9. Соединение по п. 8, отличающееся тем, что каждая межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида является модифицированной межнуклеозидной связью.

10. Соединение по п. 8, отличающееся тем, что модифицированная межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной межнуклеозидной связью.

11. Соединение по п. 9, отличающееся тем, что модифицированная межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной межнуклеозидной связью.

12. Соединение по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что по меньшей мере одно нуклеотидное основание модифицированного олигонуклеотида является модифицированным нуклеотидным основанием.

13. Соединение по п. 12, отличающееся тем, что модифицированное нуклеотидное основание является 5'-метилцитозином.

14. Соединение по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что по меньшей мере один нуклеозид модифицированного олигонуклеотида содержит модифицированный сахар.

15. Соединение по п. 14, отличающееся тем, что каждый нуклеозид модифицированного олигонуклеотида содержит модифицированный сахар.

16. Соединение по п. 14, отличающееся тем, что модифицированный сахар является бициклическим сахаром.

17. Соединение по п. 16, отличающееся тем, что бициклический сахар содержит химический мостик между положениями 4' и 2' сахара, причем химический мостик независимо выбран из 4'-CH(R)-O-2' и 4'-(СН₂)₂-O-2', где R независимо выбран из Н, С₁-С₆-алкила и C₁-С₆-алкокси.

18. Соединение по п. 17, отличающееся тем, что химический мостик представляет собой 4'-CH(R)-O-2', и где R является метилом, Н или -СН₂-О-СН₃.

19. Соединение по п. 15, отличающееся тем, что модифицированный сахар является бициклическим сахаром.

20. Соединение по п. 19, отличающееся тем, что бициклический сахар содержит химический мостик между положениями 4' и 2' сахара, причем химический мостик независимо выбран из 4'-CH(R)-O-2' и 4'-(СН₂)₂-O-2', где R независимо выбран из Н, C₁-С₆-алкила и C₁-С₆-алкокси.

21. Соединение по п. 20, отличающееся тем, что химический мостик представляет собой 4'-CH(R)-O-2', и где R является метилом, Н или -СН₂-О-СН₃.

22. Соединение по п. 14, отличающееся тем, что модифицированный сахар содержит 2'-O-метоксиэтильную группу.

23. Соединение по п. 14, отличающееся тем, что модифицированный сахар содержит 2'-O-метильную группу.

24. Соединение по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеотидных оснований, которая комплементарна участку C9ORF72, отличному от экспансии гексануклеотидного повтора, причем экспансия гексануклеотидного повтора содержит любую из GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG и GGGGGC.

25. Соединение по п. 15, отличающееся тем, что модифицированный сахар содержит 2'-О-метоксиэтильную группу или 2'-O-метильную группу.

26. Соединение по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что по меньшей мере один нуклеозид модифицированного олигонуклеотида содержит заместитель сахара.

27. Соединение по п. 26, отличающееся тем, что заместитель сахара является морфолином или пептид-нуклеиновой кислотой.

28. Конъюгированное антисмысловое соединение, содержащее соединение по любому из пп. 1-3 конъюгированное с любым из холестеринового фрагмента, липидного фрагмента, углевода, фосфолипида, биотина, феназина, фолата, фенантридина, антрахинона, акридина, флуоресцеина, родамина, кумарина и красителя, причем соединение способно снижать уровень экспрессии мРНК и/или белка C9ORF72, содержащих экспансию гексануклеотидного повтора.

29. Композиция, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по любому из пп. 1-3 и фармацевтически приемлемый растворитель или носитель, причем композиция предназначена для лечения нейродегенеративного заболевания.

30. Композиция по п. 29, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемый растворитель является фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБР), и/или модифицированный олигонуклеотид соединения является натриевой солью.

31. Композиция, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по п. 28 и фармацевтически приемлемый растворитель или носитель, причем композиция предназначена для лечения нейродегенеративного заболевания.

32. Композиция по п. 31, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемый растворитель является фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБР), и/или модифицированный олигонуклеотид соединения является натриевой солью.

33. Модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16-20 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеотидных оснований, содержащую по меньшей мере 12 последовательных нуклеотидных оснований, которые на 100% комплементарны части равной длины из нуклеотидных оснований 1446-1479 SEQ ID NO: 2, и причем модифицированный олигонуклеотид способен снижать уровень экспрессии мРНК и/или белка C9ORF72, содержащих экспансию гексануклеотидного повтора.

34. Модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16-20 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеотидных оснований, содержащую по меньшей мере 12 последовательных нуклеотидных оснований из любой из SEQ ID NO: 288, 340-343, 346-349, 352, 355-358, 361-367 и 369, и причем модифицированный олигонуклеотид способен снижать уровень экспрессии мРНК и/или белка C9ORF72, содержащих экспансию гексануклеотидного повтора.

35. Модифицированный олигонуклеотид по п. 34, отличающийся тем, что последовательность нуклеотидных оснований содержит по меньшей мере 12 последовательных нуклеотидных оснований из SEQ ID NO: 288.

36. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп. 33-35, отличающийся тем, что последовательность нуклеотидных оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 90% комплементарна части равной длины SEQ ID NO: 2.

37. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп. 33-35, отличающийся тем, что последовательность нуклеотидных оснований модифицированного олигонуклеотида на 100% комплементарна части равной длины SEQ ID NO: 2.

38. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп. 33-35, отличающийся тем, что по меньшей мере одна межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида является модифицированной межнуклеозидной связью.

39. Модифицированный олигонуклеотид по п. 38, отличающийся тем, что каждая межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида является модифицированной межнуклеозидной связью.

40. Модифицированный олигонуклеотид по п. 38, отличающийся тем, что модифицированная межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной межнуклеозидной связью.

41. Модифицированный олигонуклеотид по п. 39, отличающийся тем, что модифицированная межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной межнуклеозидной связью.

42. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп. 33-35, отличающийся тем, что по меньшей мере один нуклеозид модифицированного олигонуклеотида содержит модифицированный сахар.

43. Модифицированный олигонуклеотид по п. 42, отличающийся тем, что каждый нуклеозид модифицированного олигонуклеотида содержит модифицированный сахар.

44. Модифицированный олигонуклеотид по п. 42, отличающийся тем, что модифицированный сахар является бициклическим сахаром.

45. Модифицированный олигонуклеотид по п. 44, отличающийся тем, что бициклический сахар содержит химический мостик между положениями 4' и 2' сахара, причем химический мостик независимо выбран из 4'-CH(R)-O-2' и 4'-(СН₂)₂-O-2', где R независимо выбран из Н, C₁-С₆-алкила и C₁-С₆-алкокси.

46. Модифицированный олигонуклеотид по п. 45, отличающийся тем, что химический мостик представляет собой 4'-CH(R)-O-2', и где R является метилом, Н или -СН₂-О-СН₃.

47. Модифицированный олигонуклеотид по п. 43, отличающийся тем, что модифицированный сахар является бициклическим сахаром.

48. Модифицированный олигонуклеотид по п. 47, отличающийся тем, что бициклический сахар содержит химический мостик между положениями 4' и 2' сахара, причем химический мостик независимо выбран из 4'-CH(R)-O-2' и 4'-(СН₂)₂-O-2', где R независимо выбран из Н, С₁-С₆-алкила и C₁-С₆-алкокси.

49. Модифицированный олигонуклеотид по п. 48, отличающийся тем, что химический мостик представляет собой 4'-CH(R)-O-2', и где R является метилом, Н или -СН₂-О-СН₃.

50. Модифицированный олигонуклеотид по п. 42, отличающийся тем, что модифицированный сахар содержит 2'-О-метоксиэтильную группу.

51. Модифицированный олигонуклеотид по п. 42, отличающийся тем, что модифицированный сахар содержит 2'-О-метильную группу.

52. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп. 33-35, отличающийся тем, что модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеотидных оснований, которая комплементарна участку C9ORF72, отличному от экспансии гексануклеотидного повтора, причем экспансия гексануклеотидного повтора содержит любую из GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG и GGGGGC.

53. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп. 33-35, отличающийся тем, что модифицированный олигонуклеотид содержит:

сегмент 5'-крыла, имеющий от 1 до 6 нуклеозидов, и причем каждый нуклеозид 5'-крыла содержит модифицированный сахар;

сегмент 3'-крыла, имеющий от 1 до 6 нуклеозидов, и причем каждый нуклеозид 3'-крыла содержит модифицированный сахар; и

гэп-сегмент, имеющий от 8 до 15 нуклеозидов, и причем каждый нуклеозид гэп-сегмента является дезоксинуклеозидом; при этом данный гэп-сегмент расположен непосредственно соседствующим с и между сегментом 5'-крыла и сегментом 3'-крыла.

54. Композиция, содержащая терапевтически эффективное количество модифицированного олигонуклеотид по любому из пп. 33-35 и фармацевтически приемлемый носитель или растворитель, причем композиция предназначена для лечения нейродегенеративного заболевания.

55. Композиция по п. 54, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемый растворитель является фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБР), и/или модифицированный олигонуклеотид соединения является натриевой солью.