Композиции селеноорганических соединений и способы их применения

Авторы патента:

ЛАНЬ Цзы-Цзянь (US)

ПАУЭР Ронан (US)

A61P3/10 - для лечения гипергликемии, например антидиабетические средства

A61K38/28 - инсулины

A61K31/7076 - содержащие пурины, например аденозин, адениловая кислота

Владельцы патента RU 2731383:

ОЛТЕК, ИНК. (US)

Группа изобретений относится к способу лечения диабета и композиции для лечения диабета. Способ лечения диабета включает введение композиции, содержащей комбинацию 5’-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина и Гамма-глутамил-метилселеноцистеина и фармацевтически приемлемый носитель, взятые в определенных концентрациях. Композиция для лечения диабета содержит комбинацию 5’-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина и Гамма-глутамил-метилселеноцистеина и фармацевтически приемлемый носитель, взятые в определенных концентрациях. Группа изобретений обеспечивает создание комбинации соединений селена, эффективной в качестве инсулин-заместительной терапии и в качестве средства, усиливающего действие инсулина, для лечения диабета типа I или типа II. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 38 ил., 1 табл., 7 пр.

Настоящая заявка относится к композициям селеноорганических композиций и соединений и способам их применения для замещения инсулина, увеличения активности инсулина, ингибирования продуцирования глюкозы или модулирования метаболизма глюкозы в различных биологических путях.

Уровень техники

Селен (Se) является одним из важнейших микроэлементов, который играет важную роль во многих биологических процессах, таких как репродукция, метаболизм гормонов щитовидной железы, синтез ДНК и защита от окислительного повреждения и инфекции. Селен включен в каталитический участок различных селенозависимых ферментов, таких как глутатионпероксидаза (GPx), тиоредоксинредуктазы и метионинсульфоксидредуктаза. Эти селеноферменты способствуют регуляции метаболической активности, иммунной функции, антиоксидантной защиты, внутриклеточной окислительно-восстановительной регуляции и митохондриальной функции.

Кроме того, результаты, приведенные в литературе, показывают, что различные химические формы селена имеют разную биологическую активность. Например, селенозолидин был более эффективен в снижении количества опухолей легких, чем селенометионин. (Poerschke et al., J Biochem Molecular Toxicology 2012 26:344). Barger и др. показали, что у мышей, которых кормили различными источниками селена, например, селенометионином, селенитом натрия и селенизированными дрожжами, наблюдали различное действие на экспрессию генов и на специфические функциональные пути митохондриальной структуры и функции. (Barger et al., Genes and Nutrition 2012 7:155). Селенизированные дрожжи содержат много соединений селена и серы, но не все из соединений селена в селенизированных дрожжах влияют на биологические процессы. Кроме того, смесь соединений селена и серы в селенизированных дрожжах, как было показано, является ингибирующей по отношению друг к другу, оказывает негативное воздействие на биологические процессы или является токсичной для клеток.

Инсулиннезависимый (тип II) сахарный диабет (СД) представляет собой заболевание, которое характеризуется резистентностью к инсулину в скелетных мышцах, печени и жировой ткани в сочетании с дефектами в секреции инсулина, вызванными функцией β-клеток поджелудочной железы. Устойчивость к инсулину является основной особенностью диабета II типа. В печени, члены семейства факторов транскрипции генов Forkhead Box класса O (FOXO) активируются в их нефосфорилированном состоянии, и они находятся в ядре клетки. В ядре факторы транскрипции FOXO связываются с промоторным участком генов, таких, как глюкозо-6-фосфатаза (G6PC). Совместно с другими факторами транскрипции, такими как PGC-1α, возникает повышенная транскрипция G6PC, тем самым увеличивая скорость продуцирования глюкозы. Глюкозо-6-фосфатаза также катализирует последнюю стадию глюконеогенеза и гликогенолиза, вызывая высвобождение глюкозы из печени. Поэтому G6PC играет важную роль в контроле гомеостаза глюкозы, особенно у субъектов с диабетом.

Очевидное различие в биоактивности и доступности различных химических форм селена требует идентификации соединений, содержащих селен, которые положительно влияют на биологические процессы. В частности, существует потребность характеризации действия селена в замещении инсулина, повышении активности инсулина, ингибировании продуцирования глюкозы или модулировании метаболизма глюкозы в различных биологических путях. Кроме того, существует потребность в определении действия соединений селена и их эффективности в качестве инсулин-заместительной терапии для индивидуумов, страдающих диабетом типа I или типа II.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем описании предложен способ замещения инсулина у субъекта. Указанный способ замещения инсулина включает введение композиции субъекту, при этом композиция содержит по меньшей мере три различных соединения, выбранных из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций. Указанная композиция в способе также может содержать носитель.

В настоящем описании также предложен способ увеличения активности инсулина у субъекта. Указанный способ увеличения активности инсулина включает введение композиции субъекту, при этом композиция содержит по меньшей мере три различных соединения, выбранных из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций. Указанная композиция в способе также может содержать носитель. Указанный способ увеличения активности инсулина может дополнительно включать введение инсулина или его аналога или производного.

В настоящем описании также предложен способ ингибирования продуцирования глюкозы у субъекта. Указанный способ ингибирования продуцирования глюкозы включает: введение композиции субъекту, при этом композиция содержит по меньшей мере три различных соединения, выбранных из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций. Указанная композиция в способе также может содержать носитель.

В настоящем описании также предложен способ модулирования метаболизма глюкозы у субъекта. Указанный способ модулирования метаболизма глюкозы включает: введение композиции субъекту, при этом композиция содержит по меньшей мере три различных соединения, выбранных из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций. Указанная композиция в способе также может содержать носитель.

В любом одном из способов замещения инсулина, повышения активности инсулина, ингибирования продуцирования глюкозы или модулирования метаболизма глюкозы у субъекта композиция может содержать 5'-Метилселеноаденозин, Se-Аденозил-L-гомоцистеин и Гамма-глутамил-метилселеноцистеин. В любом одном из способов замещения инсулина, повышения активности инсулина, ингибирования продуцирования глюкозы или модулирования метаболизма глюкозы у субъекта композиция может содержать по меньшей мере 0,1% (масс./об.) 5'-Метилселеноаденозина. В любом одном из способов замещения инсулина, повышения активности инсулина, ингибирования продуцирования глюкозы или модулирования метаболизма глюкозы у субъекта композиция может находиться в высушенной или капсулированной форме.

В любом одном из способов замещения инсулина, повышения активности инсулина, ингибирования продуцирования глюкозы, или модулирования метаболизма глюкозы у субъекта композиция может дополнительно содержать инсулин или его аналог или производное. В любом одном из способов замещения инсулина, повышения активности инсулина, ингибирования продуцирования глюкозы или модулирования метаболизма глюкозы у субъекта композиция может дополнительно содержать усилитель чувствительности рецепторов к инсулину, средство, стимулирующее секрецию инсулина или инкретиновый миметик. В любом одном из способов замещения инсулина, повышения активности инсулина, ингибирования продуцирования глюкозы или модулирования метаболизма глюкозы у субъекта композиция может не включать одно или более из 5'-Метилтиоаденозина, S-Аденозил-L-гомоцистеина и Гамма-глутамил-метил-цистеина.

В любом одном из способов замещения инсулина, повышения активности инсулина, ингибирования продуцирования глюкозы или модулирования метаболизма глюкозы у субъекта композицию можно вводить перорально. В любом одном из способов замещения инсулина, повышения активности инсулина, ингибирования продуцирования глюкозы или модулирования метаболизма глюкозы у субъекта 5'-Метилселеноаденозин или соединение формулы (I) представляет собой селеногликозид. В любом одном из способов замещения инсулина, повышения активности инсулина, ингибирования продуцирования глюкозы или модулирования метаболизма глюкозы у субъекта композицию можно вводить в клетки печени субъекта.

В настоящем описании предложена композиция, содержащая по меньшей мере два различных соединения, выбранных из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций. Указанная композиция также может содержать носитель.

В настоящем описании также предложена композиция, содержащая по меньшей мере три различных соединения, выбранных из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина и Гамма-глутамил-метилселеноцистеина. Указанная композиция также может содержать носитель.

В настоящем описании предложена композиция, содержащая по меньшей мере 0,1% (масс./об.) соединения формулы (I):

или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или пролекарства.

R₁ представляет собой H, ацил, алкил, алкенил, алкинил, аралкил, карбоксил, циклоалкил, C(O)R', C(O)OR', где R' представляет собой алкил, алкенил, алкинил, циклоалкил, арил, аралкил или гетероциклил; или R₁ совместно с R₂ образуют гетероциклическое кольцо, содержащее от 4 до 8 членов в кольце, по меньшей мере с одним гетероатомом, выбранным из кислорода или азота.

R₂ представляет собой H, ацил, алкил, алкенил, алкинил, аралкил, карбоксил, циклоалкил, C(O)R', C(O)OR', где R' выбран из алкила, циклоалкила, арила, аралкила или гетероциклила; или R₁ совместно с R₂ образуют гетероциклическое кольцо, содержащее от 4 до 8 членов в кольце, по меньшей мере с одним гетероатомом, выбранным из кислорода или азота.

R₃ представляет собой H, ацил, алкил, алкенил, алкинил, аралкил, циклоалкил, карбоксил или C-амидо; или R₃ совместно с R₄ и атомами, к которым они присоединены, образуют гетероциклическое кольцо, содержащее от 4 до 8 членов в кольце, по меньшей мере с одним гетероатомом, выбранным из кислорода или азота.

R₄ представляет собой H, ацил, алкил, алкенил, алкинил, аралкил, циклоалкил, карбоксил или C-амидо; или R₃ совместно с R₄ и атомами, к которым они присоединены, образуют гетероциклическое кольцо, содержащее от 4 до 8 членов в кольце, по меньшей мере с одним гетероатомом, выбранным из кислорода или азота.

R₅ представляет собой оксо, гидроксил, алкил, алкенил, алкинил, OR' или отсутствует; где R' выбран из алкила, алкенила, алкинила, циклоалкила, арила или аралкила.

R₆ представляет собой оксо, гидроксил, алкил, алкенил, алкинил, OR' или отсутствует; где R' выбран из алкила, алкенила, алкинила, циклоалкила, арила или аралкила.

R₇ представляет собой C₃-C₁₆ алкил, где C₃-C₁₆ алкил представляет собой незамещенный алкил, содержащий и карбоксильную группу и аминогруппу, алкенил, алкинил, кетон, аминоспирт, аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из аргинина, гистидина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, серина, треонина, аспарагина, глутамина, цистеина, селеноцистеина, глицина, пролина, аланина, валина, изолецина, лейцина, метионина, фенилаланина, тирозина и триптофана, OR', Se-R', S-R', где R' в OR' выбран из группы, состоящей из H, алкила, циклоалкила, арила, аралкила и гетероциклила, где R' в Se-R' выбран из группы, состоящей из H, C₃-C₁₆ алкила, циклоалкила, арила, аралкила и гетероциклила, где R' в S-R' выбран из группы, состоящей из H, C₃-C₁₆ алкила, циклоалкила, арила, аралкила и гетероциклила.

R₈ представляет собой водород, азидо, алкил, алкенил, алкинил. Композиция формулы (I) также может содержать носитель. Кроме того, 5'-Метилселеноаденозин или соединение формулы (I) указанной композиции может представлять собой селеногликозид. Композицию формулы (I) можно вводить в клетки печени субъекта.

В настоящем описании также предложена композиция, содержащая по меньшей мере 0,1% (масс./об.) соединения формулы (II):

или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или пролекарства.

R₁ представляет собой Н, ацил, алкил, алкенил, алкинил, аралкил, карбоксил, циклоалкил, C(O)R', C(O)OR', где R' представляет собой алкил, алкенил, алкинил, циклоалкил, арил, аралкил или гетероциклил; или R₁ совместно с R₂ образуют гетероциклическое кольцо, содержащее от 4 до 8 членов в кольце, по меньшей мере с одним гетероатомом, выбранным из кислорода или азота.

R₈ представляет собой водород, азидо, алкил, алкенил, алкинил.

R₉ представляет собой H, ацил, алкил, алкенил, алкинил, аралкил, карбоксил, циклоалкил, C(O)R', C(O)OR', где R' представляет собой алкил, циклоалкил, арил, аралкил или гетероциклил; или R₉ совместно с R₁₀ образуют гетероциклическое кольцо, содержащее от 4 до 8 членов в кольце, по меньшей мере с одним гетероатомом, выбранным из кислорода или азота.

R₁₀ представляет собой H, ацил, алкил, алкенил, алкинил, аралкил, карбоксил, циклоалкил, C(O)R', C(O)OR', где R' выбран из алкила, циклоалкила, арила, аралкила или гетероциклила; или R₉ совместно с R₁₀ образуют гетероциклическое кольцо, содержащее от 4 до 8 членов в кольце, по меньшей мере с одним гетероатомом, выбранным из кислорода или азота.

R₁₁ представляет собой OR, алкокси, аралкокси или амино, где R выбран из алкила, циклоалкила, арила, аралкила, гетероциклила, или фармацевтически приемлемой соли или внутренней соли.

Композиция формулы (II) может содержать носитель. Композицию формулы (II) можно вводить в клетки печени субъекта.

В конечном итоге, в настоящем описании также предложена композиция, содержащая по меньшей мере 0,1% (масс./об.) соединения формулы (III):

или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или пролекарства.

R₃ представляет собой OH, OR, алкокси, аралкокси или амино, где R выбран из алкила, циклоалкила, арила, аралкила, гетероциклила или фармацевтически приемлемой соли или внутренней соли.

R₄ представляет собой алкил, алкенил, алкинил, циклоалкил, арил, аралкил, гетероциклил или фармацевтически приемлемую соль или внутреннюю соль.

R₇ представляет собой C₃-C₁₆ алкил, где C₃-C₁₆ алкил представляет собой незамещенный алкил, содержащий и карбоксильную группу и аминогруппу, алкенил, алкинил, кетон, аминоспирт, аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из аргинина, гистидина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, серина, треонина, аспарагина, глутамина, цистеина, селеноцистеина, глицина, пролина, аланина, валина, изолецина, лейцина, метионина, фенилаланина, тирозина и триптофана, OR', Se-R', S-R', где R' в OR' выбран из группы, состоящей из Н, алкила, циклоалкила, арила, аралкила и гетероциклила, где R' в Se-R' выбран из группы, состоящей из H, C₃-C₁₆ алкила, циклоалкила, арила, аралкила и гетероциклила, где R' в S-R' выбран из группы, состоящей из H, C₃-C₁₆ алкила, циклоалкила, арила, аралкила и гетероциклила.

Композиция формулы (III) может содержать носитель. Композицию формулы (III) можно также вводить в клетки печени субъекта.

Композиция, описанная в настоящем документе, может содержать по меньшей мере примерно 0,033% (масс./об.) композиции каждого из двух соединений или по меньшей мере примерно 0,033% (масс./об.) композиции каждого из трех соединений.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Краткое описание чертежей приведено далее. Когда указана смесь соединений селена, количество в ppb указывает количество ppb селена в каждом соединении селена в смеси. Когда указана смесь соединений серы, количество в ppb указывает количество ppb серы в каждом соединении серы в смеси. Например, 150 ppb соединений CDE содержит 150 ppb селена в соединении C, 150 ppb селена в соединении D и 150 ppb селена в соединении E в комбинации с общей концентрацией селена 450 ppb. Например, 150 ppb соединений HIJ содержит 150 ppb серы в соединении H, 150 ppb серы в соединении I и 150 ppb серы в соединении J в комбинации с общей концентрацией серы 450 ppb.

Фиг. 1 представляет собой график, показывающий действие 150 ppb каждого из отдельных соединений и различных комбинаций соединения C, соединения D, соединения E, соединения H, соединения I и соединения J на жизнеспособность клеток на AML-12 клетках печени, что показано посредством OD490.

Фиг. 2 показывает действие различных комбинаций соединения C, соединения D, соединения E, соединения H, соединения I и соединения J на уровни экспрессии мРНК гена G6pc в клетках печени AML-12.

Фиг. 2A представляет собой гистограмму, которая показывает относительные уровни мРНК G6pc в клетках Клетки AML-12, обработанных контролем и 150 ppb соединений CDE и соединений HIJ в течение 48 часов.

Фиг. 2B представляет собой гистограмму, которая показывает относительную экспрессию мРНК G6pc в клетках AML-12, обработанных отдельным соединением C, соединением D, соединением E, соединением H, соединением I и соединением J в течение 48 часов.

Фиг. 3 представляет собой гистограмму, которая показывает действие инсулина, соединений CDE и комбинаций инсулина и соединений CDE на относительные уровни экспрессии мРНК G6pc в клетках AML-12. *, P<0,05, ** P<0,01 при сравнении с контрольной группой (группы без обработки инсулином и соединениями CDE).

Фиг. 4 представляет собой гистограмму, которая показывает действие инсулина, соединений CDE и комбинаций инсулина и соединений CDE на относительные уровни экспрессии мРНК G6pc в клетках AML-12, совместно обработанных посредством 8-CPT/Dex. Вложенная фигура представляет собой диаграмму с высоким увеличением, которая показывает относительные уровни экспрессии мРНК G6pc в клетках AML-12, обработанных только водой (контроль), комбинацией 8-CPT/Dex и инсулина и комбинациями 8-CPT/Dex, инсулина и соединений CDE.

Фиг. 5 показывает действие соединений CDE и соединений HIJ на относительные уровни экспрессии мРНК генов Insr и в клетках печени AML-12.

Фиг. 5A представляет собой гистограмму, которая показывает относительные уровни экспрессии мРНК Insr в клетках AML-12, обработанных 150 ppb соединений CDE и 150 ppb соединений HIJ в течение 24 часов. ** P<0,01 при сравнении с контрольной группой (обработанной носителем-водой).

Фиг. 5B представляет собой гистограмму, которая показывает относительные уровни экспрессии мРНК в клетках AML-12, обработанных 150 ppb соединений CDE и 150 ppb соединений HIJ в течение 24 часов. ** Р<0,01 при сравнении с контрольной группой (обработанной носителем-водой).

Фиг. 5C представляет собой гистограмму, которая показывает относительные уровни экспрессии мРНК Insr в клетках AML-12, обработанных контролем, 10 или 100 нМ инсулина, 150 ppb или 300 ppb соединений CDE или совместно обработанных посредством 8-CPT/Dex, инсулином и соединениями CDE. *, P<0,05, ** P<0,01 при сравнении с контрольной группой (не обработанной посредством 8-CPT/Dex/инсулин/Соединение CDE).

Фиг. 5D представляет собой гистограмму, которая показывает относительные уровни экспрессии мРНК в клетках AML-12, обработанных контролем, 10 или 100 нМ инсулина, 150 ppb или 300 ppb соединений CDE или совместно обработанных посредством 8-CPT/Dex, инсулином и соединениями CDE. *, P<0,05, ** P<0,01 при сравнении с контрольной группой (не обработанной посредством 8-СРТ/Dex/инсулин/Соединение CDE).

Фиг. 6 показывает действие соединений CDE и соединений HIJ на уровни белка Foxo3, фосфорилированного по треонину 32 (pFoxo3T32), и Foxo4, фосфорилированного по треонину 28 (pFoxo4T28), в клетках AML-12, культивированных в среде, не содержащей сыворотку.

Фиг. 6A представляет собой Вестерн-блот, показывающий экспрессию белков различных сигнальных молекул, включая pFoxo3T32 и pFoxo4T28, в ответ на обработку клеток AML-12 водным контролем или 150 ppb соединений CDE и 150 ppb of соединений HIJ в течение 6 часов.

Фиг. 6B представляет собой гистограмму, которая показывает количественный анализ уровней белка pFoxo3T32 в геле фиг. 6A.

Фиг. 6C представляет собой гистограмму, которая показывает количественный анализ уровней белка pFoxo4T28 в геле фиг. 6A.

Фиг. 7 показывает действие соединений CDE, соединений CE и соединений DE на уровни белка pFoxo3T32 и pFoxo4T28 в клетках AML-12, культивированных в среде, не содержащей сыворотку.

Фиг. 7A представляет собой Вестерн-блот, показывающий экспрессию белков различных сигнальных молекул, включая pFoxo3T32 и pFoxo4T28, в ответ на обработку клеток AML-12 водным контролем или 150 ppb соединений CDE, 150 ppb соединений CE и 150 ppb соединений DE в течение 6 часов.

Фиг. 7B представляет собой гистограмму, которая показывает количественный анализ уровней белка pFoxo3T32 в геле фиг. 7A.

Фиг. 7C представляет собой график, который показывает количественный анализ уровней белка pFoxo4T28 в геле фиг. 7A.

Фиг. 8 представляет собой Вестерн-блот, показывающий действие контроля или 150 ppb соединений CDE и 150 ppb соединений HIJ на уровни белка pFOXO4T28, pFOXO4S193 и других сигнальных молекул в нейрональных клетках человека IMR-32.

Фиг. 9 показывает действие соединений CDE на продуцирование глюкозы, экспрессию мРНК G6pc и активность внеклеточной лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в первичных гепатоцитах мышей.

Фиг. 9A представляет собой гистограмму, которая показывает относительные уровни глюкозы в культуральной среде клеток гепатоцитов мышей, обработанных контролем, 8-CPT/Dex, 10 или 100 нМ инсулина, 150 ppb или 300 ppb соединений CDE и комбинациями инсулина и соединений CDE. * P<0,05 относительно группы, обработанной носителем (первый столбец на гистограммах).

Фиг. 9B представляет собой гистограмму, которая показывает относительные уровни мРНК G6pc в клетках гепатоцитов мышей, обработанных контролем, 10 или 100 нМ инсулина, 150 ppb или 300 ppb соединений CDE и комбинациями инсулина и соединений CDE. * P<0,05 относительно группы, обработанной носителем (первый столбец на гистограммах).

Фиг. 9C представляет собой гистограмму, которая показывает относительные уровни ЛДГ в культуральной среде клеток гепатоцитов мышей, обработанных контролем, 10 или 100 нМ инсулина, 150 ppb или 300 ppb соединений CDE и комбинациями инсулина и соединений CDE.

Фиг. 10 показывает действие соединений CDE на продуцирование глюкозы, экспрессию мРНК G6pc и активность внеклеточной ЛДГ в первичных гепатоцитах мышей, стимулированных посредством 8-CPT/Dex.

Фиг. 10A представляет собой гистограмму, которая показывает относительные уровни глюкозы в культуральной среде клеток гепатоцитов мышей, обработанных контролем, 8-CPT/Dex, комбинациями 8-CPT/Dex и инсулина или соединений CDE и комбинациями 8-CPT/Dex, инсулина и соединений CDE.

Фиг. 10B представляет собой гистограмму, которая показывает относительные уровни мРНК G6pc в клетках гепатоцитов мышей, обработанных контролем, 8-CPT/Dex, комбинациями 8-CPT/Dex и инсулина или соединениями CDE и комбинациями 8-CPT/Dex, инсулина и соединений CDE.

Фиг. 10C представляет собой гистограмму, которая показывает относительные уровни ЛДГ в культуральной среде клеток гепатоцитов мышей, обработанных контролем, 8-CPT/Dex, комбинациями 8-CPT/Dex и инсулина или соединениями CDE и комбинациями 8-CPT/Dex, инсулина и соединений CDE. * P<0,05 относительно группы, обработанной носителем (первый столбец на гистограммах).

Фиг. 11 показывает действие соединений CDE на продуцирование глюкозы и активность внеклеточной ЛДГ в первичных гепатоцитах мышей, культивированных в среде, не содержащей сыворотку.

Фиг. 11A представляет собой гистограмму, которая показывает относительные уровни глюкозы в культуральной среде гепатоцитов мышей, обработанных основным контролем (носитель вода), 10 или 100 нМ инсулина (Ins), 150 ppb или 300 ppb соединений CDE и комбинациями инсулина и соединений CDE в присутствии или в отсутствие 8-CPT/Dex в течение 6 часов. ^# P<0,05 относительно основной контрольной группы (первый столбец на гистограмме). * P<0,05 относительно группы, обработанной 8-CPT/Dex (первый закрашенный столбец на гистограмме).

Фиг. 11B представляет собой гистограмму, которая показывает относительные уровни ЛДГ в культуральной среде клеток гепатоцитов мышей, обработанных основным контролем (носитель вода), 10 или 100 нм инсулина (Ins), 150 ppb или 300 ppb соединений CDE и комбинациями инсулина и соединений CDE в присутствии или в отсутствие 8-CPT/Dex в течение 6 часов.

Фиг. 12 показывает действие соединений CDE на уровни экспрессии фосфорилированных белков Pdk1 (pPdk1), Akt по серину 473 (pAktS473), Foxo1 по треонину 24 (pFoxo1T24), Foxo3 по треонину 32 (pFoxo3T32), Foxo4 по треонину 28 (pFoxo4T28) и Gsk3b по серину 9 (pGsk3bS9) в первичных гепатоцитах мышей.

Фиг. 12A представляет собой Вестерн-блот, показывающий действие контроля, инсулина или 150 ppb или 300 ppb соединений CDE на уровни белка pPdk1, pAktS473, pFoxo1T24, pFoxo3T32, pFoxo4T28 и pGsk3bS9 в первичных гепатоцитах мышей.

Фиг. 12B представляет собой гистограмму, которая показывает относительные уровни белка pPdk1 в гепатоцитах мышей, обработанных контролем, 100 нМ инсулина или 150 ppb или 300 ppb соединений CDE.

Фиг. 12C представляет собой гистограмму, которая показывает относительные уровни белка pAktS473 в гепатоцитах мышей, обработанных контролем, 100 нМ инсулина или 150 ppb или 300 ppb соединений CDE.

Фиг. 12D представляет собой гистограмму, которая показывает относительные уровни белка pFoxo1T24 в гепатоцитах мышей, обработанных контролем, 100 нМ инсулина или 150 ppb или 300 ppb соединений CDE.

Фиг. 12E представляет собой гистограмму, которая показывает относительные уровни белка pFoxo3T32 в гепатоцитах мышей, обработанных контролем, 100 нМ инсулина или 150 ppb или 300 ppb соединений CDE.

Фиг. 12F представляет собой гистограмму, которая показывает относительные уровни белка pGsk3bS9 в гепатоцитах мышей, обработанных контролем, 100 нМ инсулина или 150 ppb или 300 ppb соединений CDE.

Фиг. 13 показывает время-эффект обработки соединениями CDE на уровни экспрессии белка фосфорилированного Pdk1, Akt, Foxo1 и Foxo3 в первичных гепатоцитах мышей, культивированных в условиях, не содержащих сыворотку.

Фиг. 13A представляет собой Вестерн-блот, показывающий действие обработки соединениями CDE в течение 0 минут, 5 минут, 30 минут, 1 часа, 2 часов и 3 часов на уровни белка pPdk1, pAktT308, pFoxo1T24, pFoxo3T32, Akt и Actb в первичных гепатоцитах мышей.

Фиг. 13B представляет собой гистограмму, которая показывает относительные уровни белка pPdk1 после обработки гепатоцитов мышей соединениями CDE в течение 0 минут, 5 минут, 30 минут, 1 часа, 2 часов и 3 часов. * Р по меньшей мере <0,05 при сравнении с отсутствием обработки соединениями CDE (группа 0 минут).

Фиг. 13C представляет собой гистограмму, которая показывает относительные уровни белка pAktT308 после обработки гепатоцитов мышей соединениями CDE в течение 0 минут, 5 минут, 30 минут, 1 часа, 2 часов и 3 часов. #P<0,15, * Р по меньшей мере <0,05 при сравнении с отсутствием обработки соединениями CDE (группа 0 минут).

Фиг. 13D представляет собой гистограмму, которая показывает объединенные уровни белков pFoxo1T24 и pFoxo3T32 после обработки гепатоцитов мышей соединениями CDE в течение 0 минут, 5 минут, 30 минут, 1 часа, 2 часов и 3 часов. #P<0,15, * Р по меньшей мере <0,05 при сравнении с отсутствием обработки соединениями CDE (группа 0 минут).

Фиг. 14 показывает действие соединений CDE на уровни глюкозы в крови у мышей Lepr^db/db.

Фиг. 14A представляет собой гистограмму, которая показывает уровни глюкозы в крови у мышей Lepr^db/db после внутрибрюшинной инъекции физиологического солевого раствора или соединений CDE через день, начиная с возраста мышей 27 дней до 3,5 месяцев.

Фиг. 14B представляет собой гистограмму, которая показывает уровни глюкозы в крови у мышей Lepr^db/db после внутрибрюшинной инъекции физиологического солевого раствора или соединений CDE ежедневно, начиная с возраста мышей 38 дней до 66 дней.

Фиг. 15 показывает действие соединений CDE на толерантность к глюкозе у мышей Lepr^db/db после внутрибрюшинной инъекции физиологического солевого раствора или соединений CDE через день, начиная с возраста мышей 27 дней до 3,5 месяцев.

Фиг. 15A представляет собой график, который показывает действие соединений CDE на уровни глюкозы в крови у мышей Lepr^db/db, обработанных солевым раствором и соединениями CDE, в нулевой момент времени (определяли немедленно перед инъекцией глюкозы) и в различные моменты времени (0,25 часа, 0,5 часа, 1 час и 2 часа) после инъекций глюкозы. * Р составляет по меньшей мере <0,05 при сравнении с группой, обработанной солевым раствором, в тот же момент времени.

Фиг. 15B представляет собой график, который показывает количественный анализ области под кривой (AUC) графика на фиг. 15A.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Определения

В настоящем документе термины "введение" и "вводимый" относится к действию введения лекарственного средства, пролекарства или другого агента или терапевтического лечения (например, композиций согласно настоящей заявке) субъекту in vivo, in vitro или ex vivo клеткам, тканям и органам. Соединения или композиции согласно настоящему описанию можно вводить субъекту посредством любого пути введения, известного в данной области. Примерные пути введения в организм человека могут представлять собой пути через глаза (офтальмологический), рот (пероральный), кожу (местный или трансдермальный), нос (назальный), легкие (ингаляционный), слизистую оболочку полости рта (буккальный), головной мозг, ухо, ректальный, вагинальный или путем инъекции. Пути введения инъекций могут представлять собой внутривенный, подкожный, интратуморальный, внутрибрюшинный и тому подобное.

Термин "алкил" относится к разветвленной или неразветвленной насыщенной углеводородной группе, содержащей от 1 до 24 атомов углерода, и предпочтительно по меньшей мере три атома углерода. В некоторых вариантах реализации "алкильная" группа содержит от 1 до 16 атомов углерода (т.е. C_1-16 алкил), в частности, в других вариантах реализации алкил содержит от 3 до 16 атомов (т.е. C_3-16 алкил). Алкильная группа может быть необязательно замещена посредством ацила, амино, амидо, азидо, карбоксила, алкила, арила, галогена, гуанидинила, оксо, сульфанила, сульфенила, сульфонила, гетероциклила или гидроксильной группы. Дополнительные примеры алкильной группы включают, но не ограничиваются ими, метил, этил, пропил, изо-пропил, бутил, изо-бутил, вторичный-бутил, третичный-бутил, пентил, изо-пентил, нео-пентил, гексил, изо-гексил, 3-метилпентил, 2,3-диметилбутил, нео-гексил, гептил, октил, нонил, децил, ундецил, додецил, тридецил, тетрадецил, пентадецил и гексадецил.

В одном варианте реализации C_3-16 алкила, алкил представляет собой незамещенный алкил. В других вариантах реализации замещенный алкил не содержит карбоксильную группу и аминогруппу. В дополнительных вариантах реализации C_3-16 алкил представляет собой незамещенный алкил, содержащий карбоксильную группу и аминогруппу.

Термин "щелочной металл" относится к солям металлов, которые включают, но не ограничиваются ими, подходящие соли щелочных металлов (например, группы IA), соли щелочноземельных металлов (например, группы IIA) и других физиологически приемлемых металлов. Соли металлов могут быть получены из алюминия, кальция, лития, магния, калия, натрия и цинка или их комбинаций.

Термин "алкенил" относится к прямой или разветвленной углеводородной цепи, содержащей по меньшей мере одну двойную связь углерод-углерод. В некоторых вариантах реализации "алкенил" относится к углеводороду, содержащему 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 атомов углерода (т.е. C_1-10 алкенил). Примеры алкенильной группы включают, но не ограничиваются ими, этен, пропен, бутен, пентен, гексен, гептен, октен, нонен и децен. Алкенильная группа может быть необязательно замещена посредством амино, алкила, галогена или гидроксильной группы.

Термин "амидо" относится или к C-амидо группе, такой как фрагмент --CONR'Rʺ, или к N-амидо группе, такой как фрагмент --NR'CORʺ, при этом R' и Rʺ может независимо представлять собой водород, алкил, алкенил, алкинил, алкокси, карбоцикл, гетероцикл, арил или аралкил. "Сульфамидо" группа включает фрагмент --NR'--SO₂--Rʺ, где R' и Rʺ могут представлять собой водород, алкил, арил или аралкил.

Термин "алкинил" относится к прямой или разветвленной углеводородной цепи, содержащей по меньшей мере одну тройную связь углерод-углерод. В примерных вариантах реализации "алкинил" относится к углеводороду, содержащему 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 атомов углерода (т.е. C_2-10 алкинил). Примеры алкинильной группы включают, но не ограничиваются ими, этин, пропин, бутан, пентин, гексин, гептан, октин, нонин и децин. Алкинильная группа может быть необязательно замещена посредством амино, алкила, галогена или гидроксильной группы.

Термин "арил" относится к карбоциклической ароматической системе, содержащей одно, два или три кольца. Данные кольца могут быть соединены вместе в форме боковых ответвлений или могут быть конденсированы. Термин "арил" охватывает ароматические группы, такие как фенил, нафтил, тетрагидронафтил, тетралин, индан, инден и бифенил.

Арильная группа может необязательно быть замещена посредством амино, алкила, галогена, гидроксила, карбоцикла, гетероцикла или другой арильной группы.

"Комбинация" в настоящем документе относится к множеству компонентов. Комбинация может содержать, по существу состоять, или состоять из атомов, соединений, композиций, компонентов, составляющих, элементов, фрагментов, молекул или смесей. Комбинация включает в себя, но не ограничивается этим, смесь.

Термин "конденсированный" обозначает, что второе присутствующее кольцо имеет (т.е. присоединено или образовано) два смежных общих атома (т.е. сопряженных) с первым кольцом. Термин "конденсированный" (fused) является эквивалентным термину "конденсированный" (condensed), "присоединенный" или "связанный", которые могут быть использованы взаимозаменяемым образом.

Термин "циклоалкил" относится к моноциклическому насыщенному или частично насыщенному углеводородному кольцу, содержащему некоторое количество атомов в кольце. В некоторых вариантах реализации "циклоалкил" относится к углеводородному кольцу, содержащему 3-12 атомов в кольце (т.е. C_3-12 циклоалкил). В настоящем документе, циклоалкил охватывает моноцикло, мостиковые, спиро, конденсированные, бицикло и трицикло кольцевые структуры. Примеры циклоалкильных групп включают, но не ограничиваются ими, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклопентенил, циклогексил, циклогексенил, циклогептил, циклогептенил, норборнил, декалин, адамантил и циклооктил. Циклоалкильная группа может быть необязательно замещена посредством амино, алкила, галогена или гидроксильной группы.

Термин "аралкил" относится к арилзамещенным алкильным фрагментам. Аралкильные группы могут представлять собой "низшие аралкильные" группы, где арильные группы присоединены к алкильным группам, содержащим от одного до шести атомов углерода. Примеры аралкильных групп включают бензил, дифенилметил, трифенилметил, фенилэтил и дифенилэтил. Термины "бензил" и "фенилметил" являются взаимозаменяемыми. В некоторых вариантах реализации алкил представляет собой C₃-C₁₆ алкил. В других вариантах реализации указанный алкил представляет собой незамещенный алкил, содержащий и карбоксильную группу и аминогруппу.

Термин "арилокси" относится к арильным группам, присоединенным к атому кислорода. Арилоксигруппа может необязательно быть замещена галогеном, гидроксилом или алкильной группой. Примеры таких групп включают, но не ограничиваются ими, фенокси, 4-хлор-3-этилфенокси, 4-хлор-3-метилфенокси, 3-хлор-4-этилфенокси, 3,4-дихлорфенокси, 4-метилфенокси, 3-трифторметоксифенокси, 3-трифторметилфенокси, 4-фторфенокси, 3,4-диметилфенокси, 5-бром-2-фторфенокси, 4-бром-3-фторфенокси, 4-фтор-3-метилфенокси, 5,6,7,8-тетрагидронафтилокси, 3-изопропилфенокси, 3-циклопропилфенокси, 3-этилфенокси, 4-трет-бутилфенокси, 3-пентафторэтилфенокси и 3-(1,1,2,2-тетрафторэтокси)фенокси.

Термин "алкокси" относится к окси-содержащей группе, замещенной алкильной или циклоалкильной группой. Примеры алкоксигруппы включают, не ограничиваются ими, метокси, этокси, трет-бутокси и циклогексилокси. "Низшие алкокси" группы содержат от одного до шести атомов углерода и включают, но не ограничиваются ими, метокси, этокси, пропокси, бутокси, изопропокси и трет-бутокси группы.

Термин "аралкокси" относится к окси-содержащей аралкильной группе, присоединенной через атом кислорода к другим группам. "Низшие аралкокси" группы представляют собой фенильные группы, присоединенные к низшей алкоксигруппе. Примеры низшей аралкоксигруппы включают, но не ограничиваются ими, бензилокси, 1-фенилэтокси, 3-трифторметоксибензилокси, 3-трифторметилбензилокси, 3,5-дифторбензилокси, 3-бромбензилокси, 4-пропилбензилокси, 2-фтор-3-трифторметилбензилокси и 2-фенилэтокси.

Термин "ацил" относится к фрагменту -C(=O)R, при этом R представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, карбоцикл, гетероцикл, арил или аралкил. Предпочтительно, R представляет собой водород, алкил, арил или аралкил.

Термин "карбоксил" относится к фрагменту --R'C(=O)ORʺ, где R' и Rʺ независимо представляют собой водород, алкил, алкенил, алкинил, карбоцикл, гетероцикл, гетероциклоалкил, арил, эфир или аралкил. R', кроме того, может быть присоединен ковалентной связью. "Карбоксил" включает и карбоновые кислоты и сложные эфиры карбоновых кислот.

Термин "карбоновая кислота" относится к карбоксильной группе, в которой Rʺ представляет собой водород или соль. Карбоновые кислоты включают, но не ограничиваются ими, муравьиную кислоту, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, масляную кислоту, валериановую кислоту, 2-метилпропионовую кислоту, оксиранкарбоновую кислоту и циклопропанкарбоновую кислоту.

Термин "сложный эфир карбоновой кислоты" или "сложный эфир" относится к карбоксильной группе, в которой Rʺ представляет собой алкил, алкенил, алкинил, карбоцикл, гетероцикл, арил или аралкил. Примеры карбоновых кислот включают, но не ограничиваются ими, муравьиную кислоту, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, бутановую кислоту, пентановую кислоту, гексановую кислоту, гептановую кислоту, октановую кислоту, нонановую кислоту, декановую кислоту, циклопропанкарбоновую кислоту, циклобутанкарбоновую кислоту, циклопентанкарбоновую кислоту, циклогексанкарбоновую кислоту, циклогептанкарбоновую кислоту, циклооктанкарбоновую кислоту или циклононанкарбоновую кислоту.

Термин "карбонил" относится к C=O фрагменту, также известному как "оксо" группа.

Термин "гетероцикл" или "гетероциклил" или "гетероциклическое кольцо" относится к ароматическому или неароматическому циклическому углеводороду, содержащему от 3 до 12 атомов углерода. В примерных вариантах реализации "гетероциклил" относится к циклическому углеводороду, содержащему 3, 4, 5 или 6 атомов в кольце (т.е. C_3-6 гетероциклил). Гетероцикл необязательно может быть замещенным, насыщенным или ненасыщенным. Обычно, по меньшей мере один из атомов в кольце представляет собой кислород (O), азот (N), серу (S), фосфор (P) или селен (Se). Например, в некоторых вариантах реализации кольцевой N атом из гетероциклила представляет собой атом, связующий с фрагментом -C(O), с образованием амида, карбамата или мочевины. Примеры гетероциклической группы включают, но не ограничиваются ими, азиридин, оксиран, тииран, азетидин, оксетан, тиетан, пирролидин, имидазол, тетрагидрофуран, пиран, тиопиран, тиоморфолин, тиоморфолин S-оксид, оксазолин, тетрагидротиофен, пиперидин, тетрагидропиран, тиан, имидазолидин, оксодиоксоленил, оксазолидин, тиазолидин, диоксолан, дитиолан, пиперазин, оксазин, дитиан, диоксан, пиридинил, фуранил, бензофуранил, изобензофуранил, пирролил, тиенил, 1,2,3-триазолил, 1,2,4-триазолил, индолил, имидазолил, тиазолил, тиадиазолил, пиримидинил, оксазолил, триазинил и tetrastyla. Примерные гетероциклы включают бензимидазол, дигидротиофен, диоксин, диоксан, диоксолан, дитиан, дитиазин, дитиазол, дитиолан, фуран, индол, 3-H индазол, 3-H-индол, индолизин, изоиндол, изотиазол, изоксазол, морфолин, оксазол, оксадиазол, оксатиазол, оксатиазолидин, оксазин, оксадиазин, пиперазин, пиперидин, пурин, пиран, пиразин, пиразол, пиридин, пиримидин, пиримидин, пиридазин, пиррол, пирролидин, тетрагидрофуран, тетразин, тиадиазин, тиадиазол, тиатриазол, тиазин, тиазол, тиофен, триазин и триазол. Гетероцикл может быть необязательно замещен посредством амино, алкила, алкенила, алкинила, галогена, гидроксила, карбоцикла, тио, других гетероциклических или арильных групп.

Термин "гетероарил" относится к циклическому углеводороду, в котором по меньшей мере один из множества атомов в кольце представляет собой O, N, S, P или Se. Кольцо гетероарила характеризуется делокализованными [p] электронами (ароматичность), разделенными среди членов кольца. Гетероарильные фрагменты, как определено в настоящем документе, могут содержать связывающие атомы углерода (C), N, S, P или Se. Например, в некоторых вариантах реализации кольцевой N атом из гетероарила представляет собой атом, связывающий с фрагментом -C(O), с образованием амида, карбамата или мочевины. В примерных вариантах реализации "гетероарил" относится к циклическому, содержащему 5 или 6 кольцевых атомов (т.е. C_5-6 гетероарил). Примеры гетероарильной группы включают, но не ограничиваются ими, пиррол, фуран, тиен, оксазол, тиазол, изоксазол, изотиазол, имидазол, пиразол, оксадиазол, тиадиазол, триазол, тетразол, пиридин, пиримидин, пиразин, пиридазин и триазин.

Термин "гидрокси" или "гидроксил" относится к заместителю -OH.

Термин "оксо" относится к заместителю =O.

Термин "нитро" относится к NO₂.

Термин "азидо" относится к N₃.

Термин "серосодержащий аналог(и)" относится к аналогу соединения, в котором один или более атомов селена замещены одним или более атомами серы.

Термин "сульфанил" относится к фрагменту --SR', в котором R' представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, карбоцикл, гетероцикл, арил или аралкил.

Термин "сульфенил" относится к фрагменту --SOR', где R' представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, карбоцикл, гетероцикл, арил или аралкил.

Термин "сульфонил" относится к фрагменту --SOR', где R' представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, карбоцикл, гетероцикл, арил или аралкил.

Термин "кетон" относится к фрагменту, содержащему по меньшей мере одну карбонильную группу, где углерод карбонильной группы связан с двумя другими атомами углерода. В примерных вариантах реализации "кетон" относится к карбонилсодержащему фрагменту, содержащему 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 атомов углерода (т.е. C_3-10 кетон). Примеры кетоновых групп включают, но не ограничиваются ими, ацетон, бутанон, пентанон, гексанон, гептанон, октанон, нонанон, деканон, циклобутанон, циклопентанон, циклогексанон, циклогептанон, циклооктанон, циклононанон и циклодеканон.

Термин "амино" относится к первичной, вторичной или третичной группе формулы --NR'Rʺ, где R' и Rʺ независимо представляют собой водород, ацил, алкил, алкенил, алкинил, аралкил, арил, карбоксил, циклоалкил, гетероцикл или другую аминогруппу (как в случае гидразида). R' и Rʺ совместно с атомом азота, к которому они присоединены, образуют кольцо, содержащее от 4 до 8 атомов. Таким образом, термин "амино" включает незамещенные, монозамещеные (например, моноалкиламино или моноариламино) и дизамещенные (например, диалкиламино или аралкиламино) аминогруппы. Аминогруппы включают фрагмент --NH₂, метиламино, этиламино, диметиламино, диэтиламино, метилэтиламино, пирролидин-1-ил или пиперидино, морфолино и т.д. Другие примерные "амино" группы, образующие кольцо, включают пирролил, имидазолил, пиразолил, изотиазолил, изоксазолил, пиридил, пиразинил, пиримидинил, пиридазинил, индолизинил, имидазолил, изоиндолил, индолил, индазолил, пуринил, хинолизинил. Кольцо, содержащее аминогруппу, может быть необязательно замещено другим амино, алкилом, алкенилом, алкинилом, галогеном или гидроксильной группой.

Термин "амин" относится к первичной, вторичной или третичной аминогруппе формулы --NR'Rʺ, где R' и Rʺ в настоящем определении независимо представляют собой водород, ацил, алкил, алкенил, алкинил, аралкил, арил, карбоксил, циклоалкил, гетероцикл или другой амино (в случае гидразида), или R' и Rʺ совместно с атомом азота, к которому они присоединены, образуют кольцо, содержащее 4-8 атомов. Таким образом, термин "амино" в настоящем документе включает незамещенные, монозамещеные (например, моноалкиламино или моноариламино) и дизамещенные (например, диалкиламино или аралкиламино) аминогруппы. Аминогруппы включают --NH₂, метиламино, этиламино, диметиламино, диэтиламино, метилэтиламино, пирролидин-1-ил или пиперидино, морфолино и т.д. Другие примерные "амино" группы, образующие кольцо, включают, но не ограничиваются ими, пирролил, имидазолил, пиразолил, изотиазолил, изоксазолил, пиридил, пиразинил, пиримидинил, пиридазинил, индолизинил, имидазолил, изоиндолил, индолил, индазолил, пуринил, хинолизинил. Кольцо, содержащее аминогруппу, может быть необязательно замещено другим амино, алкилом, алкенилом, алкинилом, галогеном или гидроксильной группой.

Термин "спирт" относится к "гидрокси", "гидроксилу" или любому заместителю, содержащему фрагмент -OH.

Термин "аминоспирт" относится к функциональной группе, содержащей и спирт и аминогруппу. "Аминоспирты" также относятся к аминокислотам, содержащим углерод, связанный со спиртом вместо карбоксильной кислотной группы. В примерных вариантах реализации "аминоспирт" включает амин, связанный с углеродом, соседним с углеродом, несущим спирт. В примерных вариантах реализации "аминоспирт" относится к амин- и спиртосодержащему фрагменту, содержащему 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 атомов углерода (т.е. C_1-12 аминоспирт). Примеры аминоспиртов включают, но не ограничиваются ими, этаноламин, гептаминол, изоэтарин, норэпинефрин, пропаноламин, сфингозин, метаноламин, 2-амино-4-меркаптобутан-1-ол, 2-амино-4-(метилтио)бутан-1-ол, цистеинол, фенилглицинол, пролинол, 2-амино-3-фенил-1-пропанол, 2-амино-1-пропанол, циклогексилглицинол, 4-гидрокси-пролинол, лейцинол, трет-лейцинол, фенилаланинол, а-фенилглицинол, 2-пирролидинметанол, тирозинол, валинол, серинол, 2-диметиламиноэтанол, гистидинол, изолейцинол, лейцинол, метионинол, 1-метил-2-пирролидинметанол, треонинол, триптофанол, аланинол, аргининол, глицинол, глутаминол, 4-амино-5-гидроксипентанамид, 4-амино-5-гидроксипентановую кислоту, 3-амино-4-гидроксибутановую кислоту, лизинол, 3-амино-4-гидроксибутанамид и 4-гидрокси-пролинол.

Термин "аминокислота" относится к группе, содержащей карбоновую кислоту и амин, связанный с атомом углерода, соседним непосредственно с карбоксилатной группой, и включает и природные и синтетические аминокислоты. Примеры аминокислот включают, но не ограничиваются ими, аргинин, гистидин, лизин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, серии, треонин, аспарагин, глутамин, цистеин, селеноцистеин, глицин, пролин, аланин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, тирозин и триптофан. В некоторых вариантах реализации карбоксил замещен посредством H, солью, сложным эфиром, алкилом или аралкилом. Аминогруппа также может быть замещена H, ацилом, алкилом, алкенилом, алкинилом, карбоксилом, циклоалкилом, аралкилом или гетероциклилом.

Термин "эфир" относится к фрагменту --R'--O--Rʺ, в котором R' и Rʺ независимо представляют собой водород, алкил, алкенил, алкинил, карбоцикл, гетероцикл, арил или аралкил. R' дополнительно может быть присоединен к атому углерода ковалентной связью.

Термин "галоген" относится к атому фтора, хлора, брома или йода.

Термин "галид" относится к функциональной группе, содержащей атом, присоединенный к атому фтора, хлора, брома или йода. Примерные варианты реализации, описанные в настоящем документе, могут включать "алкилгалидную", "алкенилгалидную", "алкинилгалидную", "циклоалкилгалидную", "гетероциклилгалидную" или "гетероарилгалидную" группы. В примерных вариантах реализации "алкилгалид" относится к фрагменту, содержащему связь углерод-галоген, содержащему 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 атомов углерода (т.е. C_1-10 алкилгалид). Примеры алкилгалидных групп включают, но не ограничиваются ими, фторметильную, фторэтильную, хлорметильную, хлорэтильную, бромметильную, бромэтильную, йодметильную и йодэтильную группы. Если не обозначено иное, любая углеродсодержащая группа, упомянутая в настоящем документе, может содержать одну или более связей углерод-галоген. В качестве неограничивающего примера, C₁ алкильная группа может представлять собой, но не ограничиваться ими, метил, фторметил, дифторметил, трифторметил, хлорметил, дихлорметил, трихлорметил, бромметил, дибромметил, трибромметил, йодметил, дийодметил, трийодметил, хлорфторметил, дихлорфторметил и дифторхлорметил.

В соединениях, описанных в настоящем документе, гетероатомы способны иметь несколько различных валентностей. В качестве неограничивающего примера, S, Se и N могут быть нейтральными или иметь положительный заряд. Кроме того, O может быть нейтральным или иметь положительный или отрицательный заряд.

В примерных вариантах реализации соединения и композиции согласно настоящему описанию включают формулы (I), (II) и (III), которые могут охватывать диастереомеры и энантиомеры примерных соединений. Энантиомеры определены как один из пары молекулярных единиц, которые являются зеркальным отображением друг друга и являются несовмещаемыми. Диастереомеры или диастереоизомеры определяются как стереоизомеры, отличные от энантиомеров. Диастереомеры или диастереоизомеры представляют собой стереоизомеры, не связанные с зеркальным изображением. Диастереоизомеры характеризуются различиями в физических свойствах.

Один вариант реализации настоящего описания может включать соединение формулы (I):

или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или пролекарство. R₁ представляет собой H, ацил, алкил, алкенил, алкинил, аралкил, карбоксил, циклоалкил, C(O)R', C(O)OR', где R' представляет собой алкил, алкенил, алкинил, циклоалкил, арил, аралкил или гетероциклил; или R₁ совместно с R₂ образуют гетероциклическое кольцо, содержащее от 4 до 8 членов в кольце, по меньшей мере с одним гетероатомом, выбранным из кислорода или азота.

R₈ представляет собой водород, азидо, алкил, алкенил, алкинил.

Термин "соединение C" относится к 5'-Метилселеноаденозину; также известному как (2R,4S,5S)-2-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-5-((метилселанил)метил)тетрагидрофуран-3,4-диол, (регистрационный номер CAS 5135-40-0), и включает любые его фармацевтически приемлемые соли.

Другой вариант реализации настоящего описания может включать соединение формулы (II):

или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или пролекарство, где

R₅ представляет собой оксо, гидроксил, алкил, алкенил, алкинил, OR' или отсутствует; где R' выбран из алкила, алкенила, алкинила, циклоалкила, арила или аралкила;

R₆ представляет собой оксо, гидроксил, алкил, алкенил, алкинил, OR' или отсутствует; где R' выбран из алкила, алкенила, алкинила, циклоалкила, арила или аралкила;

R₈ представляет собой водород, азидо, алкил, алкенил, алкинил;

R₁₁ представляет собой OR, алкокси, аралкокси или амино, где R выбран из алкила, циклоалкила, арила, аралкила, гетероциклила или фармацевтически приемлемой соли или внутренней соли.

Термин "соединение D" относится к 5'-Селеноаденозилгомоцистеину; (2R)-2-амино-4-((((2S,3S,5R)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-3,4-дигидрокситетрагидрофуран-2-ил)метил)селанил)бутановой кислоте (регистрационный номер CAS 4053-91-2), и включают любые его фармацевтически приемлемые соли.

Другой вариант реализации настоящего описания может включать соединение формулы (III):

или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или пролекарство, где

R₃ представляет собой OH, OR, алкокси, аралкокси или амино, где R выбран из алкила, циклоалкила, арила, аралкила, гетероциклила, или фармацевтически приемлемой соли или внутренней соли;

R₄ представляет собой алкил, алкенил, алкинил, циклоалкил, арил, аралкил, гетероциклил или фармацевтически приемлемую соль или внутреннюю соль;

R₆ представляет собой оксо, гидроксил, алкил, алкенил, алкинил, OR' или отсутствует; где R' выбран из алкила, алкенила, алкинила, циклоалкила, арила или аралкила; и

Термин "соединение E" относится к γ-L-глутамил-Se-метил-L-селеноцистеину; также известному как N5-(1-карбокси-2-(метилселанил)этил)-L-глутамин, или любым его фармацевтически приемлемым солям.

Термины "соединение CDE", "соединения CDE", "комбинация соединений CDE" или "соединения CDE в комбинации" относятся к комбинации или смеси соединения C, соединения D и соединения E или их фармацевтически приемлемых солей.

Термин "соединение H" относится к 5'-Метилтиоаденозину; 5'-S-Метил-5'-тиоаденозину, (регистрационный номер CAS No. 2457-80-9), или его фармацевтически приемлемой соли.

Термин "соединение I" относится к S-Аденозил-L-гомоцистеину, также известному как (S)-5'-(S)-(3-Амино-3-карбоксипропил)-5'-тиоаденозин (регистрационный номер CAS No. 979-92-0), или его фармацевтически приемлемой соли.

Термин "соединение J" относятся к γ-L-глутамил-метил-L-цистеину, также известному как Гамма-глутамил-метил-цистеин, или его фармацевтически приемлемой соли.

Термин "соединения HIJ" относится к смеси соединения H, соединения I и соединения J или их фармацевтически приемлемых солей.

Термины "аналог" и "производное" являются взаимозаменяемыми и относятся к природной или неприродной модификации по меньшей мере одного положения данной молекулы. Например, производное данного соединения или молекулы может быть модифицировано либо путем добавления функциональной группы или атома, удаления функциональной группы или атома или изменения функциональной группы или атома на другую функциональную группу или атом (в том числе, но не ограничиваясь ими, изотопы).

Термин "содержащий" относится к композиции, соединению, составу или способу, который включает и не исключает дополнительные элементы или стадии способа. Термин "содержащий" также относится к вариантам реализации композиции, соединения, состава или способа согласно настоящему описанию, которые включают и не исключают дополнительные элементы или стадии способа.

Термин "состоящий из" относится к соединению, композиции, составу или способу, который исключает наличие каких-либо дополнительных компонентов или стадий способа. Термин "состоящий из" также относится к соединению, композиции, составу или способу согласно настоящему описанию, который исключает наличие каких-либо дополнительных компонентов или стадий способа.

Термин "состоящий по существу из" относится к композиции, соединению, составу или способу, который включает дополнительные элементы или стадии способа, которые не оказывают существенного влияния на характеристику(и) композиции, соединения, состава или способа. Термин "состоящий по существу из" также относится к композиции, соединению, составу или способу согласно настоящему описанию, который включает дополнительные элементы или стадии способа, которые не оказывают существенного влияния на характеристику(и) композиции, соединения, состава или способа.

Термин "соединение(я)" относится к любой одной или более химическим единицам, фрагментам, фармацевтическому средству, лекарственному средству и тому подобным, которые можно применять для лечения, диагностики или предотвращения заболевания, болезни, расстройства или нарушения функций организма. Соединение может быть определено как терапевтическое с применением способов скрининга согласно настоящей заявке.

Термин "композиция(и)" относится к комбинации одного или более соединений с другим агентом или без него, таким как, но не ограничиваясь им, агент-носитель (например, одного или более селеносодержащих соединений с носителем, инертным или активным, получая композицию, особенно подходящую для диагностики или терапевтического применения in vitro, in vivo или ex vivo).

Термин "соединение" относится к составной части соединения или композиции. Например, компоненты композиции могут включать соединение, носитель и любой другой агент, присутствующий в композиции.

Термин "эффективное количество" относится к количеству композиции или соединения, достаточному для благотворного влияния или необходимых результатов. Эффективное количество можно вводить в виде одного или более введений или дозировок, и оно не предназначено для ограничения определенной композиции или способа введения.

Термин "гидрат" относится к соединению, которое ассоциировано с водой в молекулярной форме, (т.е. в которой H-OH связи не разрушены), и которое может быть представлено, например, формулой R×H₂O, где R представляет собой соединение, описанное в настоящем документе. Данное соединение может образовывать более одного гидрата, включая, например, моногидраты (R×H₂O), дигидраты (R₂×H₂O), тригидраты (R₃×H₂O) и подобные.

Термин "ингибирующий" или "антагонистический" относится к свойству соединения, которое снижает, ограничивает, ингибирует или блокирует действие или функцию другого соединения.

Термин "выделенный" относится к отделению материала от по меньшей мере одного другого материала в смеси или от материалов, которые естественным образом связаны с материалом. Например, соединение, полученное синтетическим путем, отделяют от исходного материала или промежуточного соединения.

"Известное терапевтическое соединение" относится к терапевтическому соединению, которое, как было показано (например, с помощью испытаний на животных или предшествующего опыта введения человеку) является эффективным в таком лечении. Другими словами, известное терапевтическое соединение не ограничивается соединением, известным или проявляющим эффективность в лечении заболевания (например, нейродегенеративного заболевания).

Термин "митохондриальный потенциал" относится к разности потенциалов на внутренней митохондриальной мембране, поддерживаемой суммарным движением положительных зарядов через мембрану.

Термин "модулирует метаболизм глюкозы" относится к изменению состояния биохимического пути (например, активности или количества) от известного или определенного состояния в клетке или живом организме, который формирует, преобразует или разрушает глюкозу или ее компонент.

"Необязательный" или "необязательно" относится к обстоятельству, при котором впоследствии описанное событие или обстоятельство может или не может произойти, и что описание включает случаи, когда указанное событие или обстоятельство имеет место, и случаи, в которых оно не происходит. "Необязательно" включает варианты реализации, в которых описанное условие присутствует, и варианты реализации, в которых описанное условие не присутствует. Например, "необязательно замещенный фенил" означает, что фенил может быть или может не быть замещен, и что описание включает и незамещенный фенил и фенил, где присутствует замещение.

Термин "органический селен" или "селеноорганическое соединение" относится к любым органическим соединениям, где селен замещает серу. Таким образом, термин органический селен может относиться к любому такому соединению, которое синтезируют биологическим путем с помощью дрожжей, или к свободным органическим селеносодержащим соединениям, которые синтезированы химическим путем, например, селенометионин.

Термины "пациент" или "субъект" используются взаимозаменяемо и относятся к любому члену царства животных. Субъект может представлять собой млекопитающее, такое как человек, домашнее млекопитающее (например, собака или кошка) или млекопитающее домашнее сельскохозяйственное животное (например, корова/крупный рогатый скот или свинья/поросенок).

Термин "ppb", используемый в данном описании, относится к частям на миллиард в расчете на селен для селеносодержащих соединений или в расчете на серу для серосодержащих соединений. Примерами селеносодержащих соединений являются соединение C, соединение D, и соединение E. Примерами серосодержащих соединений являются соединение H, соединение I и соединение J. Для того чтобы преобразовать ppb в расчете на селен в ppb соединения, содержащего селен, нужно умножить указанный ppb на следующие коэффициенты: 4,35 для соединения C, 5,46 для соединения D и 3,94 для соединения E. Для того чтобы преобразовать ppb в расчете на серу в ppb соединения, содержащего серу, нужно умножить указанный ppb на следующие коэффициенты: 9,28 для соединения H, 12,00 для соединения I и 8,25 для соединения J.

Фраза "фармацевтически приемлемый" относится к тем соединениям, материалам, композициям и/или лекарственным формам, которые, в пределах медицинских показаний, подходят для применения в контакте с тканями человека и животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергического ответа или других проблем или осложнений, сопоставимых с разумным соотношением польза/риск.

Термин "носитель" относится к фармацевтически приемлемому носителю. Фраза "фармацевтически приемлемый носитель" относится к фармацевтически приемлемому материалу, композиции или контролю, такому как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, вспомогательное вещество, растворитель или инкапсулирующий материал, участвующий в переносе или транспортировке селеносодержащего соединения или его аналога или производного от одного органа или части тела к другому органу или части тела. Носитель должен быть приемлемым в смысле совместимости с другими ингредиентами состава и не вредным для пациента или субъекта.

Некоторые примеры материалов, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей, включают, но не ограничиваются ими: (1) сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; (2) крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; (3) целлюлозу и ее производные, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы; (4) порошок трагакантовой камеди; (5) солод; (6) желатин; (7) тальк; (8) вспомогательные вещества, такие как масло какао и воски для изготовления суппозиториев; (9) масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; (10) гликоли, такие как пропиленгликоль; (11) многоатомные спирты, такие как глицерин, сорбитол, маннитол и полиэтиленгликоль; (12) сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; (13) агар; (14) буферные агенты, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; (15) альгиновую кислоту; (16) апирогенную воду; (17) изотонический солевой раствор; (18) раствор Рингера; (19) этиловый спирт; (20) фосфатные буферные растворы; и (21) другие нетоксичные совместимые вещества, применяемые в фармацевтических составах.

Термин "пролекарство" относится к фармакологически активному соединению. Обычно "пролекарство" относится к неактивному соединению, которое превращается в фармакологически активный агент с помощью метаболической трансформации. Пролекарство соединения или композиции, описанной в настоящем документе, получают путем модификации функциональных групп, присутствующих в соединении любой из формул выше, таким образом, что модификации могут быть расщеплены in vivo с высвобождением исходного соединения. Пролекарство может легко подвергаться химическим изменениям in vivo в физиологических условиях (например, гидролизу или ферментативному катализу), что приводит к высвобождению фармакологически активного агента). Пролекарства включают соединения любой из вышеуказанных формул, описанных в настоящем документе, в которых гидрокси, амино или карбокси группа связана с любой группой, которая может быть отщеплена in vivo для регенерации свободной гидроксильной, амино или карбокси группы, соответственно. Примеры пролекарств включают, но не ограничиваются ими, сложные эфиры (например, производные ацетата, формиата и бензоата) соединений любой из указанных выше формул или любого другого производного, которое после доведения до физиологического pH или через действие фермента превращается в активное исходное лекарственное средство. Традиционные процедуры выбора и получения подходящих производных пролекарств описаны в данной области (см., например, Bundgaard. Design of Prodrugs. Elsevier, 1985).

Термин "очищенный" или "по существу очищенный" относится к удалению неактивных или ингибирующих компонентов (например, контаминантов) из композиции до той степени, что 10% или менее (например, 10% или менее, 9% или менее, 8% или менее, 7% или менее, 6% или менее, 5% или менее, 4% или менее, 3% или менее, 2% или менее или 1% или менее) композиции содержит неактивные компоненты, соединения или фармацевтически приемлемые носители.

Термин "соли" может включать фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли или соли присоединения свободных оснований. Примеры кислот, которые можно применять для получения фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей, включают, но не ограничиваются ими, соли, полученные из нетоксичных неорганических кислот, таких как азотная, фосфорная, серная или бромоводородная, йодоводородная, фтороводородная, фосфористая, а также соли, полученные из нетоксичных органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксилалкановые кислоты, алкандиовые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и уксусная, малеиновая, янтарная или лимонная кислоты. Неограничивающие примеры таких солей включают нападисилат, бесилат, сульфат, пиросульфат, бисульфат, сульфит, бисульфит, нитрат, фосфат, моногидрофосфат, дигидрофосфат, метафосфат, пирофосфат, хлорид, бромид, иодид, ацетат, трифторацетат, пропионат, каприлат, изобутират, оксалат, малонат, сукцинат, суберат, себацат, фумарат, малеат, манделат, бензоат, хлорбензоат, метилбензоат, динитробензоат, фталат, бензолсульфонат, толуолсульфонат, фенилацетат, цитрат, лактат, малеат, тартрат, метансульфонат и подобные. Также рассмотрены соли аминокислот, такие как, но не ограничиваясь ими, аргинат, глюконат, галактуронат и другие соли, такие как, но не ограничиваясь ими, описанные в Berge, et al. ("Pharmaceutical Salts", J. Pharma. Sci. 1977; 66:1-19.)

Фраза "фармацевтически приемлемые соли" включает, но не ограничивается ими, соли, хорошо известные специалистам в данной области. Например, моносоли (например, соли щелочных металлов и аммония) и полисоли (например, ди- или три-соли) согласно настоящему изобретению. Фармацевтически приемлемые соли соединений настоящего описания получают, например, когда замещаемая группа, такая как водород в фрагментах --OH, --NH-- или --P(=O)(OH)--, замещена на фармацевтически приемлемый катион (например, натрия, калия или ион аммония), и могут быть удобно получены из соответствующего соединения, описанного в настоящем документе, путем, например, взаимодействия с подходящим основанием.

В тех случаях, когда соединения являются достаточно основными или кислотными для образования стабильных нетоксичных солей кислот или оснований, введение соединений в форме солей может быть целесообразно. Примерами фармацевтически приемлемых солей являются органические аддитивные соли кислот, образуемые с кислотами, которые образуют физиологически приемлемый анион, например, тозилат, метансульфонат, ацетат, цитрат, малонат, тартрат, сукцинат, бензоат, аскорбат, альфа-кетоглутарат и альфа-глицерофосфат. Также могут быть образованы подходящие неорганические соли, в том числе соли гидрохлориды, сульфаты, нитраты, бикарбонаты и карбонаты. Фармацевтически приемлемые соли могут быть получены с применением стандартных методик, хорошо известных в данной области, например, посредством взаимодействия достаточно основного соединения, такого как амин, с подходящей кислотой, обеспечивающей физиологически приемлемый анион. Соли карбоновых кислот и щелочных металлов (например, натрия, калия или лития) или щелочноземельных металлов (например, кальция) также могут быть получены.

Термины "обогащенные селеном дрожжи" и "селенизированные дрожжи» относятся к любым дрожжам (например, Saccharomyces cerevisiae), которые культивируют в среде, содержащей источник селена, такой как неорганические соли селена. Количество остаточной неорганической соли селена в готовом продукте в целом достаточно низкое (например, менее чем 2%).

Термин "замещенный" в связи с фрагментом относится к дополнительному заместителю, который присоединен в любом приемлемом месте на фрагменте. Если не обозначено иное, фрагменты могут связываться через углерод, азот, кислород, серу или любой другой приемлемый атом. Примеры заместителей включают, но не ограничиваются ими, амины, спирты, тиолы, простые эфиры, алкены, алкины, эпоксиды, азиридины, оксираны, азетидины, дигидрофураны, пирролидины, пираны, пиперидины, альдегиды, кетоны, сложные эфиры, карбоновые кислоты, карбоксилаты, имины, имиды, азиды, азогруппы, енамины, алкилгалиды, алкенилгалиды, алкинилгалиды, арилгалиды, фосфины, оксиды фосфинов, фосфиниты, фосфониты, фосфиты, фосфонаты, фосфаты, сульфаты, сульфоксиды, сульфонильные группы, сульфоксильные группы, сульфонаты, нитраты, нитриты, нитрилы, нитрогруппы, нитрозогруппы, цианаты, тиоцианаты, изотиоцианаты, карбонаты, ацилгалиды, пероксиды, гидропероксиды, полуацетали, полукетали, ацетали, кетали, ортоэфиры, ортокарбонатные сложные эфиры, сульфиды, дисульфиды, сульфоновые кислоты, сульфоновые кислоты, тионы, тиали, фосфодиэфиры, бороновые кислоты, сложные эфиры бороновых кислот, бороновые кислоты и сложные эфиры бороновых кислот.

Термины "обработка", "лечить" или "лечение" относятся к терапевтическому лечению, где целью является замедлить (например, уменьшить или отсрочить начало) нежелательное физиологическое состояние для уменьшения симптомов присутствующего расстройства или заболевания, или получить благотворные или желаемые результаты, такие как частичное или полное восстановление или ингибирование ухудшения параметра, величины, функции, критерия или результата, который был или стал аномальным. Благотворный или желаемый результаты включают, но не ограничиваются ими, ослабление симптомов; снижение степени или силы или скорости развития состояния, расстройства или заболевания; стабилизацию (т.е. отсутствие ухудшения) статуса состояния, расстройства или заболевания; задерживание начала или замедление прогрессирования состояния, расстройства или заболевания; улучшение состояния, расстройства или болезненного состояния; и ремиссию (частичную или полную), приводящую или не приводящую к немедленному уменьшению фактических клинических симптомов или укреплению или улучшению состояния, расстройства или заболевания.

Термин "реагент(ы), способный специфически обнаруживать экспрессию гена" относится к реагентам, способным или достаточным для определения экспрессии различных генов, описанных в настоящей заявке. Примеры подходящих реагентов включают, но не ограничиваются ими, праймеры или зонды нуклеиновых кислот, способные к специфической гибридизации с мРНК или кДНК, и антитела (например, моноклональные или поликлональные антитела).

Термин "токсичный" относится к любым пагубным или вредным воздействиям на субъект, клетку или ткань по сравнению с той же клеткой или тканью до введения токсиканта.

Соединения и композиции

Настоящее изобретение относится к селеноорганическим соединениям, композициям и способам применения соединений и композиций. Соединения и композиции, описанные в настоящем документе, могут заменять инсулин, повышать активность инсулина, ингибировать продуцирование глюкозы или модулировать метаболизм глюкозы в различных биологических путях. Оказалось, что композиции, соединения и способы согласно настоящему описанию не оказывают негативного влияния на метаболизм глюкозы в клетках печени, таким образом, их также можно применять для лечения или предотвращения инсулиннезависимого (тип II) сахарного диабета.

Один вариант реализации настоящего изобретения относится к композиции, содержащей, состоящей по существу из или состоящей из соединения формулы (I):

или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или пролекарства.

R₈ представляет собой водород, азидо, алкил, алкенил, алкинил.

Дополнительный вариант реализации композиций, описанных в настоящем документе, может содержать, состоять по существу из или состоять из 5'-Метилселеноаденозина ("соединение C") и любых его аналогов, производных и/или фармацевтически приемлемых солей. Соединение C представляет собой (2R,4S,5S)-2-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-5-((метилселанил)метил)тетрагидрофуран-3,4-диол, (регистрационный номер CAS 5135-40-0), и включает любые его аналоги, производные и/или фармацевтически приемлемые соли.

Композиция согласно настоящему описанию может содержать, состоять по существу из или состоять из соединения формулы (I), соединения C и их комбинаций. Например, в одном аспекте настоящей заявки предложены композиции, содержащие соединение, выбранное из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, соединения формулы (I) и их комбинаций. В дополнительных вариантах реализации одно или более из этих соединений может быть синтезировано, выделено и/или очищено.

В некоторых вариантах реализации композиция содержит, состоит по существу из или состоит по меньшей мере из 5'-Метилселеноаденозина и одного другого соединения. В других вариантах реализации другое соединение представляет собой селеносодержащее соединение. В дополнительных вариантах реализации композиция содержит соотношение 5'-Метилселеноаденозина к другому соединению (например, селеносодержащему соединению) по меньшей мере от 1:1 до 100:1, от 1:1 до 50:1, от 1:1 до 10:1, от 1:1 до 6:1 или от 1:1 до 3:1.

В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая, состоящая по существу из или состоящая из соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или пролекарства, где R₁, R₃, R₄ и R₈ каждый представляет собой H; R₂ представляет собой H, ацил, алкил, алкенил, алкинил, аралкил, карбоксил, циклоалкил, C(O)R', C(O)OR', где R' выбран из алкила, циклоалкила, арила, аралкила или гетероциклила; R₅ и R₆ каждый отсутствует; и R₇ представляет собой C₃-C₁₆ алкил, где C₃-C₁₆ алкил представляет собой незамещенный алкил, содержащий и карбоксильную группу и аминогруппу, алкенил, алкинил, кетон, аминоспирт, аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из аргинина, гистидина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, серина, треонина, аспарагина, глутамина, цистеина, селеноцистеина, глицина, пролина, аланина, валина, изолецина, лейцина, метионина, фенилаланина, тирозина и триптофана, OR', Se-R', S-R', где R' в OR' выбран из группы, состоящей из H, алкила, циклоалкила, арила, аралкила и гетероциклила, где R' в Se-R' выбран из группы, состоящей из H, C₃-C₁₆ алкила, циклоалкила, арила, аралкила и гетероциклила, где R' в S-R' выбран из группы, состоящей из H, C₃-C₁₆ алкила, циклоалкила, арила, аралкила и гетероциклила.

В конкретном варианте реализации предложена композиция, содержащая, состоящая по существу из или состоящая из по меньшей мере от примерно 0,033% (масс./об.) до по меньшей мере примерно 0,1% (масс./об.) соединения или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или пролекарства согласно формулы (I) или 5'-Метилселеноаденозина ("соединение C"). В другом варианте реализации композиция не включает 5'-Селеноаденозилгомоцистеин и/или Гамма-L-глутамил-Se-метил-L-селеноцистеин. В дополнительных вариантах реализации композиция не включает один или более из 5'-Метилтиоаденозина, S-аденозил-L-гомоцистеина, и Гамма-глутамил-метил-цистеина. В некоторых вариантах реализации композиции включают соединение согласно формуле (I) или 5'-Метилселеноаденозин ("Соединение C") или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или пролекарство, при условии, что один или более из 5'-Метилтиоаденозина, Гамма-глутамил-метил-цистеина или аденозилгомоцистеина, гомоцистеина или метионина не включены.

В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или пролекарство, где R₁, R₃, R₄ и R₈ каждый представляет собой H; R₂ представляет собой H, ацил, алкил, алкенил, алкинил, аралкил, карбоксил, циклоалкил, C(O)R' или C(O)OR', где R' выбран из алкила, циклоалкила, арила, аралкила или гетероциклила; R₅ и R₆ каждый отсутствует; и R₇ представляет собой алкил, выбранный из группы, состоящей из изо-пропила, бутила, изо-бутила, вторичного бутила, третичного бутила, пентила, изо-пентила, нео-пентила, гексила, изо-гексила, 3-метилпентила, 2,3-диметилбутила, нео-гексила, гептила, октила, нонила, децила, ундецила, додецила, тридецила, тетрадецила, пентадецила и гексадецила или аминокислоты.

В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая, состоящая по существу из или состоящая из соединения формулы (I) или 5'-Метилселеноаденозина ("соединение C") или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или пролекарства, где R₁, R₃, R₄ и R₈ каждый представляет собой H; R₂ представляет собой H, ацил, алкил, алкенил, алкинил, аралкил, карбоксил, циклоалкил, C(O)R', C(O)OR', где R' выбран из алкила, циклоалкила, арила, аралкила или гетероциклила; R₅ и R₆ каждый отсутствует; и R₇ представляет собой алкил или аминокислоту; при условии, что 5'-селеноаденозил-метионин, дегидрокси-5'-метилселеноаденозин, этилселеноаденозин, селено(гидроксил)-селенофен-(3'-дезокси-аденозин), аллилселеноаденозил-гомоцистеин, селено-аденозил-гомоцистеин, селено-гидрокси-аденозил-гомоцистеин, селеноаденозин, селено-аденозил-Se(метил)-селеноксид, аденозил-гидрокси-селеноксид, этил-селеноаденозин, селено-(гидрокси)-селенофен-(3'-дезокси-аденозин), аденозил-гидрокси-селеноксид и селено-аденозил-Se(метил)-селеноксид каждый может быть исключен из композиции.

В некоторых вариантах реализации настоящего описания предложена композиция, содержащая, состоящая по существу из или состоящая из соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или пролекарства, где R₇ представляет собой алкил, выбранный из группы, состоящей из изо-пропила, бутила, изо-бутила, вторичного бутила, третичного бутила, пентила, изо-пентила, нео-пентила, гексила, изо-гексила, 3-метилпентила, 2,3-диметилбутила, нео-гексила, гептила, октила, нонила, децила, ундецила, додецила, тридецила, тетрадецила, пентадецила и гексадецила, алкенила, алкинила, кетона, аминоспирта, аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из аргинина, гистидина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, серина, треонина, аспарагина, глутамина, цистеина, селеноцистеина, глицина, пролина, аланина, валина, изолецина, лейцина, метионина, фенилаланина, тирозина и триптофана, OR', Se-R', где R' выбран из алкила, выбранного из группы, состоящей из изо-пропила, бутила, изо-бутила, вторичного бутила, третичного бутила, пентила, изо-пентила, нео-пентила, гексила, изо-гексила, 3-метилпентила, 2,3-диметилбутила, нео-гексила, гептила, октила, нонила, децила, ундецила, додецила, тридецила, тетрадецила, пентадецила и гексадецила, циклоалкила, арила, аралкила или гетероциклила; и R₈ представляет собой водород, азидо, алкил, алкенил, алкинил.

В некоторых вариантах реализации композиции согласно настоящему описанию содержат, состоят из или состоят по существу из соединения согласно формуле (I), 5'-Метилселеноаденозина ("Соединение C") или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или пролекарства, при условии, что 5'-селеноаденозил-метионин, дегидрокси-5'-метилселеноаденозин, этилселеноаденозин, селено(гидроксил)-селенофен-(3'-дезокси-аденозин), аллилселеноаденозил-гомоцистеин, селено-аденозил-гомоцистеин, селено-гидрокси-аденозил-гомоцистеин, селеноаденозин, селено-аденозил-Se(метил)-селеноксид, аденозил-гидрокси-селеноксид, этил-селеноаденозин, селено-(гидрокси)-селенофен-(3'-дезокси-аденозин), аденозил-гидрокси-селеноксид и селено-аденозил-Se(метил)-селеноксид каждый может быть не включен в композицию.

В других вариантах реализации предложена композиция, содержащая, состоящая по существу из или состоящая из одного или более соединений согласно одной или более формулы (I) или 5'-Метилселеноаденозина ("Соединение C"), при этом каждое из следующих соединений не включают в композицию, чтобы минимизировать токсичность селена, удалить неактивные или ингибирующие соединения и/или максимально повысить терапевтический индекс композиции, при этом исключенные соединения представляют собой γ-глутамоилселеноцистеин-γ-глутамоилцистеин, γ-глутамоилцистеин-2,3-DHP-селеноцистеин, ди-γ-глутамоилселеноцистеин, селеноглутатион-γ-глутамоилцистеин, γ-глутамоилселеноцистеин-γ-глутамоилцистеин, γ-глутамоилцистеин-2,3-DHP-селеноцистеин, ди-γ-глутамоилселеноцистеин, селеноглутатион-γ-глутамоилцистеин, дегидрокси-5'-метилселеноаденозин, этилселеноаденозин, селено(гидроксил)-селенофен-(3'-дезокси-аденозин), аллилселеноаденозил-гомоцистеин, селено-аденозил-гомоцистеин, селено-гидрокси-аденозил-гомоцистеин, селеноаденозин, селено-аденозил-Se(метил)-селеноксид, аденозил-гидрокси-селеноксид, этил-селеноаденозин, селено-(гидрокси)-селенофен-(3'-дезокси-аденозин), аденозил-гидрокси-селеноксид и селено-аденозил-Se(метил)-селеноксид.

Другой вариант реализации композиции согласно настоящему описанию содержит, состоит по существу из или состоит из соединения формулы (II):

или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или пролекарства, где

R₈ представляет собой водород, азидо, алкил, алкенил, алкинил;

Дополнительный вариант реализации композиций, описанных в настоящем документе, содержит, состоит по существу из или состоит из 5'-Селеноаденозил-гомоцистеина ("соединение D") и включает любые его аналоги, производные и/или фармацевтически приемлемые соли. Соединение D представляет собой (2R)-2-амино-4-((((2S,3S,5R)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-3,4-дигидрокситетрагидрофуран-2-ил)метил)селанил)бутановую кислоту (регистрационный номер CAS 4053-91-2), и включает любые его аналоги, производные и/или фармацевтически приемлемые соли.

Композиция согласно настоящему описанию может содержать, состоять по существу из или состоять из соединения формулы (II), соединения D и их комбинаций. Например, в одном аспекте настоящей заявки предложены композиции, содержащие соединение, выбранное из группы, состоящей из 5'-селеноаденозил-гомоцистеина, соединения формулы (II) и их комбинаций. В дополнительных вариантах реализации одно или более из этих соединений может быть синтезировано, выделено и/или очищено.

В некоторых вариантах реализации формулы (II) композиция содержит, состоит по существу из или состоит по меньшей мере из 5'-селеноаденозил-гомоцистеина ("соединение D") и одного другого соединения. В некоторых вариантах реализации композиция содержит соотношение 5'-селеноаденозил-гомоцистеина к другому селеносодержащему соединению по меньшей мере от 1:1 до 100:1, от 1:1 до 50:1, от 1:1 до 10:1, от 1:1 до 6:1 или от 1:1 до 3:1. В вариантах реализации указанное другое соединение представляет собой 5'-метилселеноаденозин. В вариантах реализации указанное другое соединение представляет собой γ-L-глутамил-Se-метил-L-селеноцистеин.

В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая, состоящая по существу из или состоящая из соединения формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или пролекарства, где R₁, R₃, R₄, R₈ и R₉ каждый представляет собой H; R₂ представляет собой H, ацил, алкил, карбоксил, C(O)R' или C(O)OR', где R' выбран из алкила, циклоалкила, арила, аралкила или гетероциклила; R₅ и R₆ отсутствуют; и R₁₀ представляет собой H, ацил, алкил, алкенил, алкинил, аралкил, карбоксил, циклоалкил, C(O)R', C(O)OR', где R' выбран из алкила, циклоалкила, арила, аралкила или гетероциклила; и R₁₁ представляет собой OR, алкокси, аралкокси или амино, где R выбран из алкила, циклоалкила, арила, аралкила, гетероциклила или фармацевтически приемлемой соли или внутренней соли.

В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая, состоящая по существу из или состоящая из соединения формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или пролекарства, где R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₀ определены выше, и где R₁₁ представляет собой OR, где R выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила.

В определенном аспекте предложена композиция, содержащая, состоящая по существу из или состоящая из соединения формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или пролекарства, 5'-селеноаденозил-гомоцистеина ("Соединение D") или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или пролекарства.

В некоторых вариантах реализации композиции содержат, состоят по существу из или состоят из соединения формулы (II), селеноаденозил-гомоцистеина или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или пролекарства, при условии, что одно или более из аденозил-гомоцистеина, 5'-селеноаденозил-метионина, аллилселеноаденозил-гомоцистеина и селено-гидрокси-аденозил-гомоцистеина может быть не включен в композицию. В вариантах реализации композиция не включает одно или более из соединений одного или более из 5'-Метилтиоаденозина, Гамма-глутамил-метил-цистеина или аденозил-гомоцистеина, гомоцистеина или метионина.

В дополнительном варианте реализации композиция согласно настоящему описанию может содержать, состоять по существу из или состоять из соединения формулы (III):

или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или пролекарства, где

В дополнительном варианте реализации композиции, описанные в настоящем документе, могут содержать, состоять по существу из или состоять из Гамма-(γ)-L-глутамил-Se-метил-L-селеноцистеина ("соединение E"), и включать любые его аналоги, производные и/или фармацевтически приемлемые соли. Соединение E представляет собой N-5-(1-карбокси-2-(метилселанил)этил)-L-глутамин, и включает любые его аналоги, производные и/или фармацевтически приемлемые соли.

Композиция согласно настоящему описанию может содержать, состоять по существу из или состоять из соединения формулы (III), соединения E и их комбинаций. Например, в одном аспекте настоящей заявки предложены композиции, содержащие соединение, выбранное из группы, состоящей из Гамма-(γ)-L-глутамил-Se-метил-L-селеноцистеина, соединения формулы (III) и их комбинаций. В дополнительных вариантах реализации одно или более из этих соединений может быть синтезировано, выделено и/или очищено.

В одном аспекте настоящей заявки предложены композиции, содержащие соединение, выбранное из группы, состоящей из Гамма-L-глутамил-Se-метил-L-селеноцистеина, соединения формулы (III) и их комбинаций. В дополнительных вариантах реализации одно или более из этих соединений может быть выделено и/или очищено. В вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере 0,033% (масс./об.) одного из указанных соединений.

В вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере Гамма-L-глутамил-Se-метил-L-селеноцистеин и другое соединение. В некоторых вариантах реализации композиция содержит соотношение Гамма-L-глутамил-Se-метил-L-селеноцистеина к другому селеносодержащему соединению по меньшей мере от 1:1 до 100:1, от 1:1 до 50:1, от 1:1 до 10:1, от 1:1 до 6:1 или от 1:1 до 3:1. В вариантах реализации другое соединение представляет собой 5'-метилселеноаденозин. В вариантах реализации другое соединение представляет собой Гамма-(γ)-L-глутамил-метил-L-цистеин.

В определенном аспекте предложена композиция, содержащая соединение формулы (III) или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или пролекарство, Гамма-L-глутамил-Se-метил-L-селеноцистеин ("соединение E") или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или пролекарство в соотношении к другому селеносодержащему соединению в композиции по меньшей мере 1:1.

В некоторых вариантах реализации композиция содержит соединение согласно формуле (III), Гамма-L-глутамил-Se-метил-L-селеноцистеин или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или пролекарство, при условии, что один или более из γ-глутамоилселеноцистеин-γ-глутамоилцистеина, γ-глутамоилцистеин-2,3-DHP-селеноцистеина, ди-γ-глутамоилселеноцистеина, селеноглутатион-γ-глутамоилцистеина, γ-глутамоилселеноцистеин-γ-глутамоилцистеина, γ-глутамоилцистеин-2,3-DHP-селеноцистеина, ди-γ-глутамоилселеноцистеина и селеноглутатион-γ-глутамоилцистеина каждый может быть не включен в композицию.

В другом аспекте настоящей заявки предложены аналоги или производные биологически активных селеносодержащих соединений, описанных в настоящем документе, например, формул (I), (II) и (III). Аналоги и/или производные селеносодержащих соединений могут быть получены посредством синтеза. Например, один вариант реализации формул (I), (II) и (III) включает любой их аналог, производное или фармацевтически приемлемую соль. Другой вариант реализации настоящей композиции включает соединение формул (I), (II) и (III) и их комбинации.

Дополнительные варианты реализации композиции согласно настоящему описанию могут содержать, состоять по существу из или состоять из смесей соединений, описанных в настоящем документе. Например, один вариант реализации настоящей заявки представляет собой "соединения CDE". Соединения CDE включают смесь соединения C, соединения D и соединения E и любых их аналогов, производных и/или фармацевтически приемлемых солей. Соединения CE включают смесь соединения C и соединения E и любых их аналогов, производных и/или фармацевтически приемлемых солей. Соединения DE включают смесь соединения D и соединения E и любых их аналогов, производных и/или фармацевтически приемлемых солей.

В некоторых вариантах реализации композиция согласно настоящей заявке содержит, состоит по существу из или состоит из по меньшей мере примерно от 0,033% (масс./об.) до по меньшей мере примерно 0,1% (масс./об.) одного из соединений: соединение C, соединение D, соединение E, соединения CDE, формулы (I), формулы (II), формулы (III) и их смеси. Например, композиция может содержать по меньшей мере 0,033% (масс./об.) по меньшей мере 0,05% (масс./об.), по меньшей мере 0,1% (масс./об.), по меньшей мере примерно 0,033% (масс./об.), по меньшей мере примерно 0,05% (масс./об.), по меньшей мере примерно 0,1% (масс./об.), от по меньшей мере примерно 0,033% (масс./об.) до по меньшей мере примерно 0,1% (масс./об.) или от по меньшей мере примерно 0,05% (масс./об.) до по меньшей мере примерно 0,1% (масс./об.) соединения C, соединения D, соединения E, соединения формулы (I), формулы (II), формулы (III), соединений CDE или их смесей.

Например, в некоторых вариантах реализации указанная композиция содержит от по меньшей мере примерно 0,033% (масс./об.) до по меньшей мере примерно 0,035% (масс./об.), от по меньшей мере примерно 0,033% до по меньшей мере примерно 0,040% (масс./об.), от по меньшей мере примерно 0,033% до по меньшей мере примерно 0,045% (масс./об.), от по меньшей мере примерно 0,033% до по меньшей мере примерно 0,050% (масс./об.), от по меньшей мере примерно 0,033% до по меньшей мере примерно 0,055% (масс./об.), от по меньшей мере примерно 0,033% до по меньшей мере примерно 0,060% (масс./об.), от по меньшей мере примерно 0,033% до по меньшей мере примерно 0,065% (масс./об.), от по меньшей мере примерно 0,033% до по меньшей мере примерно 0,070% (масс./об.), от по меньшей мере примерно 0,033% до по меньшей мере примерно 0,075% (масс./об.), от по меньшей мере примерно 0,033% до по меньшей мере примерно 0,080% (масс./об.), от по меньшей мере примерно 0,033% до по меньшей мере примерно 0,085% (масс./об.), от по меньшей мере примерно 0,033% до по меньшей мере примерно 0,090% (масс./об.), от по меньшей мере примерно 0,033% до по меньшей мере примерно 0,095% (масс./об.) или от по меньшей мере примерно 0,033% до по меньшей мере примерно 0,1% (масс./об.) одного соединения формулы (I), формулы (II), формулы (III), соединения C, соединения D, соединения E, соединений CDE или их смесей и все значения в диапазоне процентов.

Например, в некоторых вариантах реализации указанная композиция содержит от по меньшей мере примерно 0,05% до по меньшей мере примерно 0,060% (масс./об.), от по меньшей мере примерно 0,05% до по меньшей мере примерно 0,065% (масс./об.), от по меньшей мере примерно 0,05% до по меньшей мере примерно 0,070% (масс./об.), от по меньшей мере примерно 0,05% до по меньшей мере примерно 0,075% (масс./об.), от по меньшей мере примерно 0,05% до по меньшей мере примерно 0,080% (масс./об.), от по меньшей мере примерно 0,05% до по меньшей мере примерно 0,085% (масс./об.), от по меньшей мере примерно 0,05% до по меньшей мере примерно 0,090% (масс./об.), от по меньшей мере примерно 0,05% до по меньшей мере примерно 0,095% (масс./об.) или от по меньшей мере примерно 0,05% до по меньшей мере примерно 0,1% (масс./об.) одного соединения формулы (I), формулы (II), формулы (III), соединения C, соединения D, соединения E, соединений CDE или их смесей и все значения в диапазоне процентов.

В других вариантах реализации указанная композиция содержит от примерно 0,033% (масс./об.) до примерно 99,9% (масс./об.), от примерно 0,033% до примерно 90% (масс./об.), от примерно 0,033% до примерно 80% (масс./об.), от примерно 0,033% до примерно 70% (масс./об.), от примерно 0,033% до примерно 60% (масс./об.), от примерно 0,033% до примерно 50% (масс./об.), от примерно 0,033% до примерно 40% (масс./об.), от примерно 0,033% до примерно 30% (масс./об.), от примерно 0,033% до примерно 20% (масс./об.), от примерно 0,033% до примерно 10% (масс./об.), от примерно 0,033% до примерно 5% (масс./об.) или от примерно 0,033% до примерно 1% (масс./об.) одного соединения формулы (I), формулы (II), формулы (III), соединения C, соединения D, соединения E, соединений CDE или их смесей и все значения в диапазоне процентов.

В других вариантах реализации указанная композиция содержит от примерно 0,05% (масс./об.) до примерно 99,9% (масс./об.), от примерно 0,05% до примерно 90% (масс./об.), от примерно 0,05% до примерно 80% (масс./об.), от примерно 0,05% до примерно 70% (масс./об.), от примерно 0,05% до примерно 60% (масс./об.), от примерно 0,05% до примерно 50% (масс./об.), от примерно 0,05% до примерно 40% (масс./об.), от примерно 0,05% до примерно 30% (масс./об.), от примерно 0,05% до примерно 20% (масс./об.), от примерно 0,05% до примерно 10% (масс./об.), от примерно 0,05% до примерно 5% (масс./об.) или от примерно 0,05% до примерно 1% (масс./об.) одного соединения формулы (I), формулы (II), формулы (III), соединения C, соединения D, соединения E, соединений CDE или их смесей и все значения в диапазоне процентов.

В других вариантах реализации указанная композиция содержит от примерно 0,1% (масс./об.) до примерно 99,9% (масс./об.), от примерно 0,1% до примерно 90% (масс./об.), от примерно 0,1% до примерно 80% (масс./об.), от примерно 0,1% до примерно 70% (масс./об.), от примерно 0,1% до примерно 60% (масс./об.), от примерно 0,1% до примерно 50% (масс./об.), от примерно 0,1% до примерно 40% (масс./об.), от примерно 0,1% до примерно 30% (масс./об.), от примерно 0,1% до примерно 20% (масс./об.), от примерно 0,1% до примерно 10% (масс./об.), от примерно 0,1% до примерно 5% (масс./об.) или от примерно 0,1% до примерно 1% (масс./об.) одного соединения формулы (I), формулы (II), формулы (III), соединения C, соединения D, соединения E, соединений CDE или их смесей и все значения в диапазоне процентов.

В других вариантах реализации композиция содержит от по меньшей мере примерно 0,033% (масс./об.) до по меньшей мере примерно 0,1% (масс./об.) или от по меньшей мере примерно 0,05% (масс./об.) до по меньшей мере примерно 0,1% (масс./об.) соединения формулы (I), формулы (II), формулы (III), соединения C, соединения D, соединения E, соединений CDE или их смесей.

В вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере 5'-Метилселеноаденозин и одно другое соединение. В некоторых вариантах реализации указанная композиция содержит соотношение 5'-Метилселеноаденозина к другому селеносодержащему соединению по меньшей мере от 1:1 до 100:1, от 1:1 до 50:1, от 1:1 до 10:1, от 1:1 до 6:1 или от 1:1 до 3:1. В вариантах реализации указанное другое соединение представляет собой 5'-селеноаденозил-гомоцистеин. В других вариантах реализации указанное другое соединение представляет собой L-глутамил-Se-метил-L-селеноцистеин.

В других вариантах реализации композиции могут не включать одно или более из 5'-Метилтиоаденозина ("соединение H"), S-Аденозил-L-гомоцистеина ("соединение I"), Гамма-глутамил-метил-цистеина ("соединение J"), Гамма-L-глутамил-Se-метил-L-селеноцистеина, Se-аденозилгомоцистеина или глутамил-селеноцистеина, так как одно или более из этих соединений может быть нежелательным или ингибирующим для других соединений в композиции.

В одном аспекте настоящей заявки предложены композиции, содержащие по меньшей мере два соединения, выбранных из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций. В дополнительных вариантах реализации одно или более из этих соединений может быть синтезировано, выделено и/или очищено.

Один аспект настоящей заявки относится к 5'-Метилселеноаденозину ("соединение C"), Se-Аденозил-L-гомоцистеину ("соединение D"), L-глутамил-Se-метил-L-селеноцистеину ("соединение E") и их аналогам. Некоторые варианты реализации включают композицию, содержащую соединение формулы (I), формулы (II) и/или формулы (III) и их смеси и носитель.

В других вариантах реализации указанная композиция содержит по меньшей мере три различных соединения, выбранных из группы, состоящей из: 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II) и соединения формулы (III) и их смесей. В дополнительных вариантах реализации указанная композиция содержит по меньшей мере примерно 0,033% (масс./об.) по меньшей мере одного из этих соединений. В других вариантах реализации указанная композиция содержит по меньшей мере примерно 0,05% (масс./об.) каждого из двух из этих соединений. В других вариантах реализации указанная композиция содержит по меньшей мере примерно 0,033% (масс./об.) каждого из трех из этих соединений.

В дополнительных вариантах реализации одно или более из этих соединений формулы (I), формулы (II) и формулы (III) могут быть синтезированы, выделены и/или очищены. В вариантах реализации композиции, содержащие соединения формулы (I), формулы (II) и формулы (III), дополнительно содержат носитель, такой как вода, физиологический солевой раствор, физиологический буфер, включая поверхностно-активные вещества и стабилизирующие аминокислоты.

В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая одно или более соединений согласно одной или более формулы (I), формулы (II) формулы (III), соединение C, соединение D, соединение E, соединения CDE или их смеси, где одно или более из каждого из следующих соединений не включены в композицию, чтобы минимизировать токсичность селена, удалить неактивные или ингибирующие соединения и/или максимально повысить терапевтический индекс композиции, при этом исключенные соединения представляют собой γ-глутамоилселеноцистеин-γ-глутамоилцистеин, γ-глутамоилцистеин-2,3-DHP-селеноцистеин, ди-γ-глутамоилселеноцистеин, селеноглутатион-γ-глутамоилцистеин, γ-глутамоилселеноцистеин-γ-глутамоилцистеин, γ-глутамоилцистеин-2,3-DHP-селеноцистеин, ди-γ-глутамоилселеноцистеин, селеноглутатион-γ-глутамоилцистеин, дегидрокси-5'-метилселеноаденозин, этилселеноаденозин, селено(гидроксил)-селенофен-(3'-дезокси-аденозин), аллилселеноаденозил-гомоцистеин, селено-аденозил-гомоцистеин, селено-гидрокси-аденозил-гомоцистеин, селеноаденозин, селено-аденозил-Se(метил)-селеноксид, аденозил-гидрокси-селеноксид, этил-селеноаденозин, селено-(гидрокси)-селенофен-(3'-дезокси-аденозин), аденозил-гидрокси-селеноксид и селено-аденозил-Se(метил)-селеноксид.

В некоторых вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере два различных соединения, выбранных из группы, состоящей из: 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II) и соединения формулы (III) и их смесей; и носителя. В других вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере два различных соединения, выбранных из группы, состоящей из: 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина; и носителя. В вариантах реализации композиция содержит 5'-Метилселеноаденозин и Гамма-глутамил-метилселеноцистеин. В вариантах реализации каждое из двух соединений присутствует в композиции по меньшей мере примерно в 0,033% (масс./об.).

В других вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере три различных соединения, выбранных из группы, состоящей из: 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II) и соединения формулы (III) и их смесей; и носителя. В других вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере три различных соединения, выбранных из группы, состоящей из: 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина; и носителя. В вариантах реализации каждое из трех соединений присутствует в композиции по меньшей мере примерно в 0,033% (масс./об.).

В некоторых вариантах реализации любое из соединений, описанных в настоящей заявке, может быть модифицировано пролекарством для продления периода полураспада. Пролекарство также может способствовать защите соединения от окисления, направлению соединения к ткани и обеспечению прохождения соединением гематоэнцефалического барьера.

В некоторых вариантах реализации пролекарство содержит селеногликозид. Гликозиды включают моносахариды, дисахариды и олигосахариды. Сахариды могут включать рибозу, глюкозу, галактозу или маннозу. Например, галактоза, конъюгированная с селеносодержащим фрагментом, может направлять соединение к печени.

В других вариантах реализации пролекарство содержит селеназолидин. Эти соединения обеспечивают медленное высвобождение соединения.

В дополнительном варианте реализации пролекарство содержит конъюгацию селеноорганического соединения с витамином, таким как витамин C или витамин W. Эти конъюгаты пролекарства обладают улучшенным защитным действием.

В других вариантах реализации пролекарство может представлять собой пролекарство, активированное цитохромом Р450, такое как циклические фосфаты или фосфонаты. Другие варианты реализации пролекарств, активированных цитохромом Р450, улучшают биодоступность. В частности, нуклеозиды модифицированы этими молекулами и предложены для направления молекул к печени. Примерные пролекарства включают пролекарства HepDirect. Другие варианты реализации пролекарства, активированного цитохромом Р450, улучшают биодоступность и описаны в Huttunen et al, Current Medicinal Chemistry 2008 15:2346.

В вариантах реализации любое из соединений формулы (I), формулы (II), формулы (III), соединение C, соединение D, соединение E или соединения CDE могут быть модифицированы для снижения окисления селена. В вариантах реализации соединение может образовывать димер посредством связи между атомами селена.

В вариантах реализации любое из соединений формулы (I), формулы (II), формулы (III), соединения C, соединения D, соединения E или соединений CDE может быть модифицировано посредством связи с агентом, ориентированным к ткани, или другим агентом для увеличения периода полураспада соединения. Агенты, нацеленные к ткани, могут включать любой агент, известный в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, антитела, специфичные для связывания тканеспецифическим антигеном, трансферриновым рецептором или пролекарством, как описано в настоящем документе.

В некоторых вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению приготовлена, чтобы проходить гематоэнцефалический барьер. Композиции согласно настоящему изобретению могут комбинированы с имплантируемым материалом, подходящим для доставки к головному мозгу, например, полимерным биоразлагаемым имплантом или носителем. Такие полимерные носители включают, но не ограничиваются ими, полиэтиленгликоль, полилактиды, полигликолиды, полиортоэфиры, поливинилпирролидон и поливиниловые спирты и этиленвинилацетат.

В других вариантах реализации соединения могут быть связаны или скомбинированы с носителем наночастиц для доставки композиций к головному мозгу и предложены для ориентирования к другим тканям. Другие наночастицы включают фосфолипиды, хитозан, молочную кислоту и декстран.

Микросферы и липосомы представляют собой дополнительные носители, которые можно применять в настоящем изобретении. Например, микросферы и липосомы могут включать, но не ограничиваются ими, сополимер молочной и гликолевой кислоты или PLGA носители. В других вариантах реализации доставка носителя композиций в головной мозг или другие ткани тела может быть ориентирована с применением липосом или микросфер, содержащих антитело, рецептор трансферрина или пролекарство в качестве нацеливающего агента. Нацеливание к ткани может также включать рецептор-опосредованный транспорт, например, рецептором инсулина или рецептором трансферрина. Эти рецепторы могут быть интегрированы в липосомы или микросферы, которые также включают композиции, как описано в настоящем документе.

Липидные пролекарства также подходят для применения с соединениями согласно настоящему изобретению. В качестве неограничивающего примера некоторые липидные пролекарства описаны в Hostetler et al., (1997 Biochem. Pharm. 53:1815-1822) и Hostetler et al., 1996 Antiviral Research 31:59-67), каждая из которых включена в настоящую заявку посредством ссылки. Дополнительные примеры подходящих технологий пролекарств описаны в WO 90/00555; WO 96/39831; WO 03/095665 A2; патентах США №5411947; 5463092; 6312662; 6716825; и опубликованных заявках на патенты США №2003/0229225 и 2003/0225277, каждая из которых полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки. Такие пролекарства могут также обладать способностью нацеливать лекарственное соединение к определенной ткани пациента, например, печени, как описано в Erion et al., (2004 J. Am. Chem. Soc. 126:5154-5163; Erion et al., Am. Soc. Pharm. & Exper. Ther. DOI:10,1124/jept.104.75903 (2004); WO 01/18013 A1; патент США No. 6752981), каждая из которых полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки.

Такие пролекарства также могут обладать способностью нацеливать лекарственное соединение к определенной ткани пациента, например, печени, как описано Erion и др., (2004 J. Am. Chem. Soc. 126:5154-5163; Erion et al., Am. Soc. Pharm. & Exper. Ther. DOI:10.1124/jept.104.75903 (2004); WO 01/18013 A1; патент США №6752981), каждый из которых полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки. В качестве неограничивающего примера, другие пролекарства, пригодные для применения с соединениями согласно настоящему изобретению, описаны в WO 03/090690; патенте США №6903081; заявке на патент США №2005/0171060 А1; заявке на патент США №2002/0004594 А1; и Harris et al., (2002 Antiviral Chem & Chemo. 12: 293-300; Knaggs et al., 2000 Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 2075-2078) каждая из которых полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки.

В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая одно или более соединений, каждое согласно формуле (I). В некоторых аспектах указанная композиция содержит 5'-метилселеноаденозин или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или пролекарство; и 5'-селеноаденозил-гомоцистеин или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или пролекарство.

В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая одно или более соединений, каждое согласно формуле (I) и формуле (III). В некоторых аспектах указанная композиция содержит 5'-метилселеноаденозин или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или пролекарство; 5'-селеноаденозил-гомоцистеин или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или пролекарство; и гамма-L-глутамил-Se-метил-L-селеноцистеин или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или пролекарство.

В некоторых вариантах реализации композиция содержит 5'-метилселеноаденозин или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или пролекарство; и гамма-L-глутамил-Se-метил-L-цистеин или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или пролекарство.

В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая одно или более соединений, каждое согласно формуле (I) и формуле (II). В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая одно или более соединений, каждое согласно формуле (II) и (III).

В вариантах реализации любая из композиций, описанных в настоящем документе, может дополнительно содержать другой терапевтический агент для модулирования метаболизма глюкозы или лечения диабета.

В некоторых вариантах реализации другой терапевтический агент представляет собой инсулин или его аналог. Аналоги инсулина включают быстродействующие аналоги инсулина и долгодействующие аналоги инсулина. Аналоги инсулина могут иметь одну или несколько аминокислотных замен. Быстродействующие аналоги инсулина включают Аспарт, Глулизин и LisPro. Долгодействующие аналоги инсулина включают NPH инсулин, Инсулин детемир, Инсулин деглудек или Инсулин гларгин.

В одном варианте реализации композиция дополнительно содержит другой терапевтический агент для модулирования метаболизма глюкозы или лечения диабета. В некоторых вариантах реализации другой терапевтический агент представляет собой инсулин или его аналог. В некоторых вариантах реализации другой терапевтический агент представляет собой усилитель чувствительности рецепторов к инсулину, средство, стимулирующее секрецию инсулина или инкретиновый миметик. Другие примерные терапевтические агенты, эффективные в настоящей композиции, можно применять для лечения диабета, включая метформины, сульфонилмочевины, меглитиниды, производные D-фенилаланина, тиазолидиндионы, ингибиторы DPP-4, ингибиторы альфа-глюкозидазы, вещества, усиливающие экскрецию желчных кислот, и их комбинации.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество одного или более соединений согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль, сложный эфир или пролекарство, совместно с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем. Примерные разбавители и носители согласно настоящему изобретению подробно описаны в части Определения настоящей заявки. Например, в некоторых вариантах реализации носители могут включать воду, физиологический солевой раствор и водные буферные растворы, содержащие поверхностно-активные вещества или стабилизирующие аминокислоты, такие как гистидин или глицин. В одном варианте реализации настоящей заявки фармацевтически приемлемый носитель является фармацевтически инертным.

В некоторых вариантах реализации настоящей заявки композиции и/или составы, содержащие селен, можно вводить субъекту отдельно или в комбинации с другими формами селена, лекарственными средствами, малыми молекулами или в фармацевтических композициях, в которых они смешаны с вспомогательным веществом(ами) или другими фармацевтически приемлемыми носителями. В других вариантах реализации композиции согласно настоящей заявке могут быть приготовлены с применением фармацевтически приемлемых носителей, хорошо известных в данной области, в дозировках, подходящих для перорального введения. Носители могут давать возможность получать фармацевтические композиции в форме таблеток пилюль, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и подобных для перорального или назального употребления пациентом, подлежащим лечению. Кроме того, композиции, содержащие одно или более соединений, включая, но не ограничиваясь ими, 5'-Метилселеноаденозин, соединение формулы (I) и их комбинации, можно вводить субъекту (например, пациенту) внутривенно в фармацевтически приемлемом носителе, таком как физиологический солевой раствор.

Композиции могут быть приготовлены для любого способа введения, в частности для перорального, ректального, трансдермального, подкожного, внутривенного, внутримышечного или интраназального введения. Композиции могут быть приготовлены в любой традиционной форме, например, в форме таблеток, капсул, каплет, растворов, суспензий, дисперсий, сиропов, спреев, гелей, суппозиториев, пластырей и эмульсий.

Как хорошо известно в области медицины, дозировки для любого субъекта могут зависеть от многих факторов, включая размер пациента, площадь поверхности тела, возраст, определенное соединение для введения, пол, время и путь введения, общее состояние здоровья и взаимодействие с другими лекарственными средствами, которые вводят одновременно. В зависимости от цели, которую стремятся изменить посредством лечения, фармацевтические композиции можно приготовить и вводить системно или местно.

Способы, известные в данной области для приготовления и введения терапевтических соединений, являются достаточными для введения соединений и композиций согласно настоящему изобретению и могут быть найдены в последнем издании "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Publishing Co, Easton Pa.). Композиции согласно настоящему описанию могут быть приготовлены для любого пути введения, в частности, для перорального, ректального, трансдермального, подкожного, внутривенного, внутримышечного или интраназального введения. Подходящие пути могут, например, включать пероральное или трансмукозальное введение; а также парентеральную доставку, включая внутримышечное, подкожное, интрамедуллярное, интратекальное, интравентрикулярное, внутривенное, внутрибрюшинное или интраназальное введение.

Для инъекции композиция согласно настоящей заявке (например, селеносодержащая композиция) может быть приготовлена в водных растворах, например, в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнкса, раствор Рингера или забуференный физиологический раствор. Для введения в ткань, орган или клетки в составе применяют проникающие вещества, подходящие для прохождения определенного барьера. Такие проникающие вещества, как правило, известны в данной области.

Фармацевтические композиции, подходящие для применения в настоящей заявке, включают композиции, в которых активные ингредиенты (например, 5'-Метилселеноаденозин, Se-Аденозил-L-гомоцистеин, Гамма-глутамил-метилселеноцистеин, соединение формулы I, соединение формулы II, соединение формулы III и их смеси) содержатся в эффективном количестве для достижения заданной цели. Например, в предпочтительном варианте реализации эффективное количество фармацевтической композиции содержит количество соединения, выбранного из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы I, соединения формулы II, соединения формулы III и их смесей. Определение эффективных количеств находится в пределах возможностей специалиста в данной области, особенно в свете описания, представленного в настоящем документе.

Некоторые селеносодержащие соединения получали путем синтеза, очищали и подвергали скринингу в анализе биологической активности. Не все компоненты и соединения, обнаруженные в селенизированных дрожжах или их водном экстракте, обладают биологической активностью, когда получены из таких дрожжей, и на самом деле могут быть токсичными для клеток.

Композиции согласно настоящему описанию могут быть приготовлены для любого пути введения, в частности, для перорального, ректального, транс дермального, подкожного, внутривенного, внутримышечного или интраназального введения. Подходящие пути введения могут, например, включать трансмукозальное введение, а также парентеральную доставку, включая внутримышечное, подкожное, интрамедуллярное, интратекальное, интравентрикулярное, внутривенное, внутрибрюшинное или интраназальное введение.

Для инъекции композиция согласно настоящей заявке (например, селеносодержащая композиция) может быть приготовлена в водных растворах, например, в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнкса, раствор Рингера или забуференный физиологический раствор. Для тканевого или клеточного введения в составе применяют проникающие вещества, подходящие для прохождения определенного барьера. Такие проникающие вещества, как правило, известны в данной области.

В вариантах реализации композиции, содержащие соединения, приготовленные путем синтеза, могут содержать равное количество каждого селеносодержащего компонента, например, соотношение, составляющее по меньшей мере 1:1:1 Гамма-глутамил-метилселеноцистеина к 5'-Метилселеноаденозину к Se-Аденозил-L-гомоцистеину. В других вариантах реализации композиция может содержать по меньшей мере два компонента в соотношениях от 1:1 до 100:1, от 1:1 до 50:1, от 1:1 до 10:1, от 1:1 до 6:1 или от 1:1 до 3:1.

Композиции, содержащие одно или более соединений, включая 5'-Метилселеноаденозин, Se-Аденозил-L-гомоцистеин, Гамма-глутамил-метилселеноцистеин, соединение формулы (I), соединение формулы (II), соединение формулы (III) и их комбинации, можно вводить субъекту (например, пациенту) внутривенно в фармацевтически приемлемом носителе, таком как физиологический солевой раствор. Можно применять стандартные способы внутриклеточной доставки соединений (например, доставку с помощью липосом). Такие способы хорошо известны специалистам в данной области.

Композиции, содержащие селен, подходят для внутривенного введения, а также парентерального введения, такого как внутривенное, внутримышечное, подкожное и внутрибрюшинное. Для инъекций композицию, содержащую селен (например, фармацевтическую композицию), согласно настоящей заявке можно приготовить в форме водных растворов, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнкса, раствор Рингера или забуференный физиологический раствор. Для тканевого или клеточного введения в составе применяют проникающие вещества, подходящие для прохождения определенного барьера. Такие проникающие вещества, как правило, известны в данной области.

В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции могут содержать разрыхлитель, желатинизированный крахмал и оболочку. В вариантах реализации разрыхлители включают поперечно сшитый поливинилпирролидон, камеди, крахмалы, включая желатинизированный крахмал и продукты целлюлозы. В вариантах реализации оболочки включают поливиниловый спирт, производные целлюлозы и производные метакриловой кислоты.

В некоторых вариантах реализации настоящей заявки композиции и/или составы, содержащие селен, можно вводить субъекту отдельно или в сочетании с другими формами селена, лекарственными средствами, малыми молекулами или в форме фармацевтических композиций, где они смешаны со вспомогательным веществом(ами) или другими фармацевтически приемлемыми носителями. В вариантах реализации композиции могут включать одну или несколько аминокислот или селеносодержащих аминокислот, таких как метионин, цистеин или селеноцистеин, чтобы минимизировать токсичность. В одном из вариантов реализации настоящей заявки фармацевтически приемлемый носитель является фармацевтически инертным. В другом варианте реализации настоящей заявки композиции, содержащие селен, можно вводить отдельно индивидуумам с риском развития или страдающим заболеванием или состоянием, связанным с метаболизмом глюкозы.

Композиции также могут быть приготовлены в любой традиционной форме, например, в форме таблеток, капсул, каплет, растворов, суспензий, дисперсий, сиропов, спреев, гелей, суппозиториев, пластырей и эмульсий. Композиции согласно настоящей заявке, в частности, композиции, содержащие 5'-Метилселеноаденозин, соединение формулы (I) и их комбинации, также можно добавлять к питательным напиткам или пищевым продуктам (например, ENSURE, POWERBAR или подобным), мультивитаминам, питательным продуктам и т.д. для ежедневного употребления.

Способы применения соединений и композиций

Соединения и композиции согласно настоящему описанию проявляют тканевую специфичность в отношении генной экспрессии генов, связанных с биологическими процессами и транскрипционной активацией/инактивацией. Например, настоящая заявка относится к способам применения соединений и композиций, описанных в настоящем документе, для замещения инсулина, повышения активности инсулина, повышения чувствительности к глюкозе, ингибирования продуцирования глюкозы или модулирования метаболизма глюкозы в различных биологических путях субъекта. Таким образом, композиции и соединения, содержащие селен, можно вводить отдельно или в комбинации отдельному субъекту, подверженному риску или страдающему от заболевания или состояния, связанного с аберрацией генов, описанных в настоящем документе. Например, способы настоящей заявки могут найти применение в диагностике или лечении (например, профилактически или терапевтически) субъекта с состоянием, связанным с инсулиннезависимым (тип II), сахарным диабетом (СД).

В одном варианте реализации настоящего изобретения предложен способ замены инсулина у субъекта, включающий введение композиции субъекту, причем композиция содержит по меньшей мере три различных соединения, выбранных из группы, состоящей из: 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций. В другом варианте реализации эффективное количество композиции заменяет инсулин в клетках печени субъекта по сравнению с клетками печени субъекта, не получавшего лечение композицией. В некоторых вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере три различных соединения, выбранных из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций. В вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере 0,05% (масс./об.) каждого из двух соединений. В других вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере 0,033% (масс./об.) каждого из трех соединений.

В другом варианте реализации способ увеличения активности инсулина у субъекта включает введение композиции субъекту, при этом композиция содержит по меньшей мере три различных соединения, выбранных из группы, состоящей из: 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций. В другом варианте реализации эффективное количество композиции увеличивает активность инсулина в клетках печени субъекта по сравнению с клетками печени субъекта, не получавшего лечение указанной композицией. В некоторых вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере три различных соединения, выбранных из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций. В вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере 0,05% (масс./об.) каждого из двух соединений. В других вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере 0,033% (масс./об.) каждого из трех соединений. Дополнительный вариант реализации способа увеличения активности инсулина у субъекта дополнительно включает введение инсулина или его аналога или производного.

В других вариантах реализации способ ингибирования продуцирования глюкозы у субъекта включает введение композиции субъекту, при этом композиция содержит по меньшей мере три различных соединения, выбранных из группы, состоящей из: 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций. В другом варианте реализации эффективное количество композиции ингибирует продуцирование глюкозы в клетках печени субъекта по сравнению с клетками печени субъекта, не получавшего лечение указанной композицией. В некоторых вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере три различных соединения, выбранных из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций. В вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере 0,05% (масс./об.) каждого из двух соединений. В других вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере 0,033% (масс./об.) каждого из трех соединений.

В другом варианте реализации способ увеличения фосфорилирования FOXO3 и/или FOXO4 у субъекта включает введение композиции субъекту, содержащей по меньшей мере два соединения, выбранных из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций. В другом варианте реализации эффективное количество композиции увеличивает фосфорилирование FOXO3 и FOXO4 в клетках печени субъекта по сравнению с клетками печени субъекта, не получавшего лечение указанной композицией. В некоторых вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере три различных соединения, выбранных из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций. В вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере 0,05% (масс./об.) каждого из двух соединений. В других вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере 0,033% (масс./об.) каждого из трех соединений.

В вариантах реализации способ модулирования метаболизма глюкозы у субъекта включает: введение эффективного количества композиции субъекту, при этом композиция содержит по меньшей мере два различных соединения, выбранных из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III). В другом варианте реализации эффективное количество композиции модулирует метаболизм глюкозы в клетках печени субъекта по сравнению с клетками печени субъекта, не получавшего лечение указанной композицией. В некоторых вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере три различных соединения, выбранных из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций. В вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере 0,05% (масс./об.) каждого из двух соединений. В других вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере 0,033% (масс./об.) каждого из трех соединений.

В вариантах реализации способ увеличения чувствительности к глюкозе у субъекта включает введение композиции субъекту, при этом композиция содержит по меньшей мере два различных соединения, выбранных из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций. В другом варианте реализации эффективное количество композиции увеличивает чувствительность к глюкозе в клетках печени субъекта по сравнению с клетками печени субъекта, не получавшего лечение указанной композицией. В некоторых вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере три различных соединения, выбранных из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций. В вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере 0,05% (масс./об.) каждого из двух соединений. В других вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере 0,033% (масс./об.) каждого из трех соединений.

В вариантах реализации способ лечения диабета у субъекта включает введение композиции субъекту, при этом композиция содержит по меньшей мере два различных соединения, выбранных из группы, состоящей из: 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций. В другом варианте реализации эффективное количество композиции лечит диабет в клетках печени субъекта по сравнению с клетками печени субъекта, не получавшего лечение указанной композицией. В некоторых вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере три различных соединения, выбранных из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций. В вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере 0,05% (масс./об.) каждого из двух соединений. В других вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере 0,033% (масс./об.) каждого из трех соединений.

В некоторых вариантах реализации предложен способ или применение для ингибирования экспрессии G6PC у субъекта, включающий введение композиции субъекту, при этом композиция содержит по меньшей мере два соединения, выбранных из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций. В другом варианте реализации эффективное количество композиции ингибирует генную экспрессию G6PC в клетках печени субъекта по сравнению с клетками печени субъекта, не получавшего лечение указанной композицией. В некоторых вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере три различных соединения, выбранных из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций. В вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере 0,05% (масс./об.) каждого из двух соединений. В других вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере 0,033% (масс./об.) каждого из трех соединений.

В некоторых вариантах реализации способа снижение G6PC варьируется от приблизительно 50% увеличения или уменьшения до 500% увеличения или уменьшения по сравнению с клетками идентичного типа, не обработанными соединением. Величина ответа G6PC зависит от типа клеток, определенного соединения и времени контакта с клеткой.

В других вариантах реализации предложен способ или применение для увеличения экспрессии рецептора инсулина (INSR) у субъекта, включающий введение композиции субъекту, при этом композиция содержит по меньшей мере два соединения, выбранных из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций. В другом варианте реализации эффективное количество композиции увеличивает экспрессию рецептора инсулина в клетках печени субъекта по сравнению с клетками печени субъекта, не получавшего лечение указанной композицией. В некоторых вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере три различных соединения, выбранных из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций. В вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере 0,05% (масс./об.) каждого из двух соединений. В других вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере 0,033% (масс./об.) каждого из трех соединений.

В вариантах реализации предложен способ или применение увеличения экспрессии рецептора инсулиноподобного фактора роста (IGF1R) у субъекта, включающий введение композиции субъекту, при этом композиция содержит по меньшей мере два соединения, выбранных из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций. В другом варианте реализации эффективное количество композиции увеличивает экспрессию рецептора инсулиноподобного фактора роста в клетках печени субъекта по сравнению с клетками печени субъекта, не получавшего лечение указанной композицией. В некоторых вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере три различных соединения, выбранных из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций. В вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере 0,05% (масс./об.) каждого из двух соединений. В других вариантах реализации композиция содержит по меньшей мере 0,033% (масс./об.) каждого из трех соединений.

В любом одном из способов, описанных в настоящем документе, композиция может содержать 5'-Метилселеноаденозин, Se-Аденозил-L-гомоцистеин, Гамма-глутамил-метилселеноцистеин или их смеси. В любом одном из способов, описанных в настоящем документе, композиция может содержать по меньшей мере примерно 0,1% (масс./об.) 5'-Метилселеноаденозина.

В любом одном из способов, описанных в настоящем документе, композиция может быть в высушенной или капсулированной форме. В любом одном из способов, описанных в настоящем документе, композиция может дополнительно содержать инсулин или его аналог или производное. В любом одном из способов, описанных в настоящем документе, композиция может дополнительно содержать усилитель чувствительности рецепторов к инсулину, средство, стимулирующее секрецию инсулина или инкретиновый миметик.

В любом одном из способов, описанных в настоящем документе, композиция может не включать одно или более из 5'-Метилтиоаденозина, S-Аденозил-L-гомоцистеина или Гамма-глутамил-метил-цистеина. В любом одном из способов, описанных в настоящем документе, композицию можно вводить перорально.

В любом одном из способов, описанных в настоящем документе, композицию можно вводить в одну или более клетки печени субъекта. В некоторых вариантах реализации любой из способов, как описано в настоящем документе, дополнительно включает введение инсулина или его аналога или дополнительно включает введение другого терапевтического агента для модулирования метаболизма глюкозы или лечения диабета.

В вариантах реализации способов согласно настоящей заявке предложено применение композиции, содержащей по меньшей мере три различных соединения, выбранных из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II) и соединения формулы (III) для замещения инсулина или увеличения активности инсулина у субъекта. В вариантах реализации применение дополнительно включает инсулин или его аналог. В вариантах реализации применение дополнительно включает другой терапевтический агент для модулирования метаболизма глюкозы или лечения диабета. В других вариантах реализации настоящей заявки предложено применение композиции, содержащей по меньшей мере три соединения, выбранных из группы, состоящей из 5'-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина, Гамма-глутамил-метилселеноцистеина, соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и их комбинаций, для ингибирования G6PC в печени.

Селеносодержащие соединения влияют на экспрессию генов в клетках печени иным образом, чем в нейронных клетках. В отличие от действия, которое соединения и композиции оказывают в клетках печени, как описано в настоящем документе, такая же или аналогичная композиция может повлиять на нервные клетки противоположным образом. Например, композиция, как описано в настоящем документе, уменьшает фосфорилирование FOXO3 и/или FOXO4 в нейрональных клетках, а не увеличивает экспрессию FOXO3 или FOXO4, как указано в способах согласно настоящему изобретению.

В дополнительных вариантах реализации способа согласно настоящему изобретению эффективное количество соединений и композиций, как описано в настоящем документе, представляет собой количество, эффективное для ингибирования экспрессии G6PC, снижения продукции глюкозы в клетках печени или увеличения фосфорилирования FOXO в клетках печени, не будучи токсичным для клетки. Эффективные количества выбранных соединений не проявляют токсичности для любых из приведенных в качестве примера клеток, включая клетки скелетной мускулатуры мышей, нейрональные человеческие или клетки печени мышей. Кроме того, композиция, содержащая соединения, описанные в настоящем документе, не оказывает отрицательного влияния на метаболизм глюкозы в клетках печени.

Способы определения генной экспрессии в клетке субъекта известны специалистам в данной области и могут включать гибридизацию с праймерами и/или зондами, например, на матрице или посредством способов ПЦР. Матрицы и/или праймеры для определения генной экспрессии являются коммерчески доступными. Праймеры и матрицы или микрочипы могут быть легко сконструированы с применением общедоступных последовательностей для генов, описанных в настоящем документе, таких как G6PC, FOXO3, FOXO4, INSR, и IGF1R. Например, примерные последовательности для G6PC можно найти в NM_000151.3, GI:393537030, Gene ID: 2538; FOXO3 можно найти в NM_001455.3, GI:146260266, Gene ID: 2309; FOXO4 можно найти в NM_001170931.1, GI:283436082, Gene ID: 4303; INSR можно найти в NM_000208.2, GI:119395735, Gene ID: 3643,; и IGF1R можно найти в XM_011521513.1, GI:767983996, Gene ID: 3480. Модулирование генной экспрессии в клетках печени можно определить, как описано в настоящем документе, с применением ряда анализов на образце, взятом у субъекта, получавшего лечение композициями, описанными в настоящем документе.

Как хорошо известно в области медицины, дозировки для любого субъекта могут зависеть от многих факторов, включая, но не ограничиваясь ими, размер пациента, площадь поверхности тела, возраст, определенное соединение для введения, пол, время и путь введения, общее состояние здоровья и взаимодействие с другими лекарственными средствами, которые вводят одновременно. В вариантах реализации дозировка настоящей композиции может быть скорректирована в зависимости от эффективности или наличия явных признаков селенового токсикоза, наблюдаемого у субъекта. На селеновый токсикоз могут указывать симптомы, включая, но не ограничиваясь ими, чесночный запах изо рта, выпадение волос или слоящиеся ногти.

В некоторых вариантах реализации дозировку композиции согласно настоящему изобретению вводят по меньшей мере один раз в день в течение периода времени, чтобы достичь устойчивого состояния элементарного селена в крови. В других вариантах реализации настоящего изобретения дозировку композиции согласно настоящему изобретению можно вводить в то время как субъект испытывает симптомы заболевания или расстройства.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры обеспечивают иллюстративные примеры или варианты реализации композиций, соединений и способов согласно настоящему описанию. Иллюстративные варианты реализации соединений, композиций и способов согласно настоящему изобретению представлены в настоящем описании в качестве примеров. Хотя концепции и технологии настоящего описания подвержены различным модификациям и альтернативным формам, определенные варианты их реализации были показаны в качестве примера на фигурах и подробно описаны в настоящем документе. Следует понимать, однако, что в настоящем документе нет намерения ограничить концепции настоящего описания определенными раскрытыми формами, но, напротив, настоящее изобретение должно охватывать все модификации, эквиваленты и альтернативные варианты в соответствии с настоящим описанием и прилагаемой формулой изобретения.

Следует принять во внимание, что технология, описанная в настоящем документе, имеет широкое применение. Вышеописанные варианты реализации были выбраны и описаны для того, чтобы проиллюстрировать принципы технологии, а также некоторые формы практического применения. В то время как в настоящем документе некоторые варианты реализации настоящего изобретения описаны и/или приведены в качестве примеров, подразумевается, что возможны из значительные вариации и модификации.

Пример 1: Синтез и характеризация 5'-Метилселеноаденозина ("Соединение C")

Схема синтеза и методология получения соединения C представляла собой:

Борогидрид натрия (227 мг, 6,0 мМ, в атмосфере Ar) помещали в 200 мл круглодонную колбу, содержащую 20 мл безводного этилового спирта, оснащенную магнитной мешалкой, и помещали в ледяную охлаждающую баню. Диметилдиселенид (190 мкл, 376 мг, 2,0 мМ), добавляли в колбу с охлаждением, перемешиванием и в потоке Ar. После образования желтоватого раствора добавляли твердый 5'-хлор-5'-дезоксиаденозин (1,143 г, 4,0 мМ). 100 мл этилового спирта добавляли для растворения осадка. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение следующих четырех суток. Масс-спектрометрию применяли для отслеживания приблизительно 75% превращения, которое завершалось после пяти суток. Растворители выпаривали, и 3,22 г продукта (с приблизительно 20% исходного материала) собирали и очищали посредством обратнофазной (С-8) препаративной хроматографии. Выход 1,1 г чистого продукта собирали, молекулярную массу которого подтверждали посредством масс-спектрометрии.

Пример 2: Синтез и характеризация Se-Аденозил-L-гомоцистеина ("Соединение D")

Схема синтеза и методология получения соединения D представлена ниже в стадиях 1-6:

5'-Хлор-5'-дезоксиаденозин (639-62)

Восемьдесят девять (89) граммов (0,366 моль, 1 экв.) аденозина, 59,3 мл (58 г, 1,833 моль, 2 экв.) безводного пиридина и 1 л безводного ацетонитрила помещали в высушенную в печи, 2 л, 4-горлую колбу, оснащенную капельной воронкой, мешалкой, подводом/отводом газа и термометром. Реакционную смесь помещали в ледяную/солевую баню и начинали перемешивание. Когда температура раствора опускалась ниже 3°C, медленно добавляли тионилхлорид. Температуру реакционной смеси поддерживали ниже 5°C в процессе добавления тионилхлорида и в течение еще 4 ч (в это время указанный раствор становился желтым, с бело-желтым осадком на дне). Реакционную смесь оставляли в течение ночи при температуре окружающей среды.

На следующее утро объемный осадок отфильтровывали с применением фильтра из пористого стекла и промывали на фильтре посредством 300 мл сухого ацетонитрила. В течение этого времени цвет осадка изменялся на белый. Влажный осадок затем обратно помещали в 2 л реакционную колбу, содержащую смесь 800 мл метанола и 160 мл воды. Восемьдесят миллилитров (80 мл) концентрированного раствора гидроксида аммония по каплям добавляли в реакционную колбу при механическом перемешивании и охлаждении на водяной бане. Смесь перемешивали в течение 45 мин при температуре окружающей среды, и образовывался белый осадок, который отделяли от жидкости посредством вакуум-фильтрации.

Фильтрат концентрировали досуха с применением вакуумного роторного испарителя, в то время как осадок кристаллизовали из приблизительно 560 мл горячей воды. Осадок охлаждали на ледяной водяной бане, и первую партию кристаллов отфильтровывали и лиофилизировали. Данный фильтрат применяли в качестве растворителя при кристаллизации твердых веществ, полученных после роторного выпаривания первого фильтрата, с получением второй партии продукта. Вторую партию продукта также лиофилизировали (в течение 2 дней). Обе партии кристаллов в конце высушивали в течение двух суток над пятиокисью фосфора в вакуумном эксикаторе. Получали восемьдесят четыре (84 г) грамма белых кристаллов, с выходом 80,5%. MS (286-М+Н), mp. 187°C. Селеноаденозилгомоцистеин (655-40)

L-селенометионин (9,806 г, 50 мМ, 1экв.) загружали в 2 л трехгорлую колбу, оснащенную термометром, большим погружным холодильником (с барботажным измерителем на выходе), подводом газа аммиака (достигающим дна колбы) и магнитной мешалкой, и помещали в 2,5 л сосуд Дьюара, содержащий охлаждающую баню CO₂-ацетон. Ar° пропускали через колбу перед добавлением твердого CO₂ к ацетоновой бане и погружному холодильнику. Когда температура внутри колбы падала ниже -35°C, пропускали поток безводного аммиака (газ), и когда уровень жидкого аммиака достигал объема 800 мл, поток газа прекращали.

В хорошо перемешанный раствор добавляли маленькие кусочки металлического натрия до сохранения фиолетово-голубого окрашивания раствора в течение приблизительно 30 сек. Всего в течение 45 мин добавляли 2,645 граммов (115 мМ, 2,3 экв.) натрия. Перемешивание и охлаждение поддерживали в течение еще 30 мин. В это время все компоненты находились в растворе. Добавляли безводный 5'-хлор-5'-дезоксиаденозин (14,856 г, 52 мМ, 1,04 экв.) одной частью, и реакционную смесь оставляли с перемешиванием и очень низким потоком Ar° на ночь.

На следующее утро 350 мл безводного метанола добавляли к белому твердому веществу, которое присутствовало в колбе. Колбу помещали на масляную баню, устанавливали обратный холодильник, поддерживали поток газа Ar°, и нагревали на масляной бане до 50°C в течение следующих 24 часов. Один миллилитр (1 мл) раствора подкисляли до pH 3,5 несколькими каплями 0,1 н. HCl, и образец анализировали на присутствие субстратов с применением масс-спектрометрии.

Если они составляли ниже 5%, смесь можно подкислять посредством 1 н. HCl до pH 3,5, фильтровать от солей, концентрировать досуха с применением вакуумного ротационного испарителя, и неочищенный продукт можно очищать посредством кристаллизации из смеси вода-этанол. Первую партию кристаллов селеноаденозилгомоцистеина получали в количестве 15,98 г продукта с выходом 74%. Тем не менее, приблизительно 95% продукта было чистым, и его можно применять в биологических исследованиях без дополнительной очистки.

Пример 3: Синтез и характеризация Гамма-глутамил-метилселеноцистеина ("Соединение E")

Схема синтеза и методология для получения Соединения E представлена ниже на стадиях 1-4:

Синтез N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-OSe (655-90)

N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-OH (303 мг, 1,0 Ммоль), N-гидроксисукцинимид (121 мг, 1,05 Ммоль) и дициклогексил карбодиимид (227 мг, 1,1 Ммоль) суспендировали/растворяли в 15 мл безводного этилового эфира, и в реакционную смесь добавляли 10 мкл диметилэтилбензиламина из шприца. Перемешивание при температуре окружающей среды (22°C) поддерживали в течение 48 ч. Смесь фильтровали, и осадок промывали 10×10 мл этилового эфира. Фильтрат концентрировали и сушили под глубоким вакуумом с получением белого кристаллического продукта (570 мг, ~90% выход). MS (M+Na⁺)=423,17;

Синтез N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-MeSe-Cys-OH (655-90)

N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-OSe (570 мг, 0,9 Ммоль), метилселеноцистеин (175 мг, 0,8 Ммоль), триэтиламин (152 мг, 209 мкл, 1,5 Ммоль) добавляли к смеси 6 мл 1,4-диоксана и 2 мл воды. Перемешивание реакционной смеси с помощью магнитной мешалки поддерживали в течение 100 ч. После этого времени добавляли 1,21 М HCl (1,65 мл), и постреакционную смесь экстрагировали тремя объемами (3x) по 20 мл этилового эфира. Экстракт концентрировали досуха с применением вакуумного ротационного испарителя с получением 649 мг воскообразного продукта, который подвергали анализу посредством препаративной ВЭЖХ. Собирали двести восемьдесят три миллиграмма (283 мг) продукта с выходом 75,6%. Молекулярную массу продукта и присутствие одного атома Se в нем подтверждали посредством масс-спектра. Расчетная масса для C₁₈H₃₂N₂O₇Se=468,42; Эти результаты обнаруживают 469,4 m/e (M+H⁺) и 491,24 m/e (M+Na⁺).

Синтез Гамма-Глутамил-метилселеноцистеина (655-92)

Смесь 283 мг (0,6 Ммоль) N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-MeSe-Cys-OH, 2 мл тиоанизола и 5 мл трифторуксусной кислоты нагревали на масляной бане с перемешиванием на магнитной мешалке в течение 6 часов и при 63°C. Смесь оставляли на ночь при температуре окружающей среды (22°C). Реакционную смесь добавляли по каплям в интенсивно перемешанный этиловый эфир. Осадок, который образуется, промывали двумя объемами (2х) по 20 мл этилового эфира. Получали 138,3 мг кремового осадка продукта, который затем очищали посредством препаративной ВЭЖХ.

Пример 4:

Индивидуальные синтетические селеноорганические соединения, комбинации индивидуальных селеноорганических соединений и их серосодержащие аналоги испытывали на клеточной культуре (in vitro) для воздействия на выживаемость или жизнеспособность клеток и экспрессию генов в примерах, описанных в настоящем документе. В частности, тестируемые клетки представляли собой клетки печени мышей AML-12.

Материалы и способы

Клеточные линии и соединения

Клеточная линия печени мышей AML-12 и клетки нейробластов человека IMR-32 были приобретены из Американской коллекции типовых культур (ATCC, Manassas, Вирджиния). Клетки AML-12 амплифицировали в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко, и среде Хема F12 (DMEM/F12), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 40 нг/мл дексаметазона (Dex, Sigma) и раствора 1X ITS (содержащего 0,01 мг/мл бычьего инсулина, 0,0055 мг/мл человеческого трансферрина, 5 нг/мл селенита натрия) (Sigma). Клетки IMR-32 культивировали в минимальной питательной среде Игла (EMEM), дополненной 10% FBS.

Соединение C (5'-Метилселеноаденозин), соединение D (Se-Аденозил-L-гомоцистеин) и соединение E (Гамма-глутамил-метилселеноцистеин) и их серосодержащие аналоги, соединение H (5'-Метилтиоаденозин), соединение I (S-Аденозил-L-гомоцистеин) и соединение J (Гамма-глутамил-метил-цистеин) либо синтезировали, либо получали из коммерческих источников (в случае доступности). Чистота всех тестируемых соединений была подтверждена, как составляющая ≥99%, что определяли посредством масс-спектрометрии. Три партии вышеуказанных синтезированных соединений применяли в следующих экспериментах.

Значения ppb, показанные в примерах в настоящем документе, относятся к ppb селена в селеносодержащих соединениях или ppb серы в серосодержащих соединениях, чтобы обеспечить эквивалентное количество селена или серы, тестируемое в экспериментах.

Для того чтобы преобразовать ppb на основе селена в ppb соединения, % Se в соединении рассчитывали посредством деления атомной массы селена на молекулярную массу соединения и умножения полученной величины на 100. Для того чтобы преобразовать ppb на основе серы в ppb соединения, % S в соединении рассчитывали посредством деления атомной массы серы на молекулярную массу соединения и умножения полученной величины на 100.

Например, деление атомной массы селена, составляющей 78,96, на молекулярную массу соединения C, составляющую 344, и умножение результата на 100, представляет собой % селена в соединении C, составляющий 23%. Аналогичным образом, для соединения D, деление атомной массы селена, составляющей 78,96, на молекулярную массу соединения D, составляющую 432, и умножение результата на 100, представляет собой % селена в соединении D, составляющий 18%. Для соединения E, деление атомной массы селена, составляющей 78,96, на молекулярную массу соединения E, составляющую 311, и умножение результата на 100, представляет собой % селена в соединении E, составляющий 25%.

Данные величины % Se применяли для получения факторов для преобразования ppb селена в ppb соединения. Эти факторы составляют: 4,35 для соединения C, 5,46 для соединения D и 3,94 для соединения E. Для того чтобы преобразовать ppb на основе селена в ppb соединения умножают указанный ppb селена на фактор для каждого соединения, как показано в таблице ниже. Например, 150 ppb соединения C, как описано в экспериментах ниже, относится к 150 ppb селена и эквивалентно 653 ppb соединения C.

Для соединений серы, деление атомной массы серы, составляющей 32, на молекулярную массу соединения H, составляющую 297, и умножение результата на 100, представляет собой % серы в соединении H, составляющий 11%. Аналогичным образом, для соединения I, деление атомной массы серы, составляющей 32, на молекулярную массу соединения I, составляющую 384, и умножение результата на 100, представляет собой % серы в соединении I, составляющий 8%. Для соединения J, деление атомной массы серы, составляющей 32, на молекулярную массу соединения J, составляющую 264, и умножение результата на 100, представляет собой % серы в соединении J, составляющий 12%.

Данные величины % S применяют для получения факторов для преобразования ppb серы в ppb соединения. Эти факторы составляют: 9,28 для соединения H, 12,00 для соединения I и 8,25 для соединения J. Для того чтобы преобразовать ppb на основе серы в ppb соединения умножают указанный ppb серы на фактор для каждого соединения, как показано в таблице ниже. Например, 150 ppb соединения H как описано в экспериментах ниже, относится к 150 ppb серы и эквивалентно 1392 ppb соединения H.

Анализ жизнеспособности клеток

Жизнеспособность клеток у культивированных клеток AML-12 определяли с применением наборов для анализа Promega's CellTiter96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay в соответствии с протоколом и инструкциями производителя. Вкратце, AML-12 (1×10⁴ клеток/лунку), высевали на 96-луночные прозрачные планшеты (VWR) и культивировали в среде DMEM/F12, содержащей 10% FBS, 1X ITS и 40 нг/мл Dex, в течение ночи. Затем клетки обрабатывали контролем (вода) или соединениями в среде DMEM/F12, свободной от ITS, содержащей 10% FBS и 40 нг/мл Dex, в течение 48 час.

Культивированные клетки инкубировали с раствором AQueous One solution (100 мкл/лунку) при 37°C в течение 1 часа, и поглощение при OD490 нм в каждом образце определяли с помощью спектрофотометра для микропланшетов Bio-Tek. Жизнеспособность клеток у культивированных клеток определяли путем вычитания OD490 нм культивируемых клеток от OD490 нм в пустой культуральной среде (без засева клеток). Восемь образцов для каждой обработки изучали для приведенного выше анализа. Данные представляли как среднее значение ± CO из восьми образцов.

Обработка клеток для анализа РНК и белка

Для анализа РНК рецептора инсулина (Insr), инсулиноподобного фактора роста и глюкозо-6-фосфатазы (G6pc), клетки AML-12 амплифицировали в ITS, Dex и FBS-содержащей DMEM/F12 среде, и культивировали в 24-луночных (по 6,7×10⁴ клеток/лунка) планшетах в 10% FBS ITS-свободной DMEM/F12 среде с добавлением или без добавления Dex в течение ночи. Эти клетки обрабатывали контролем (вода) или различными соединениями (разбавленными в 10% FBS ITS-свободной DMEM/F12 среде с добавлением или без добавления Dex) в течение 6 часов, 24 часов или 48 часов.

В некоторых экспериментах клетки AML-12 дважды промывали PBS после обработки соединениями в течение 24 часов, и затем инкубировали с соединениями селена (150 или 300 ppb каждого соединения) в присутствии или в отсутствие инсулина (10 или 100 нМ), 0,1 мМ 8-СРТ (Sigma) или 0,5 мкМ Dex в бессывороточной, не содержащей глюкозу/фенол красный DMEM среде, дополненной 20 мМ лактозы и 2 мМ пирувата и 15 мМ HEPES (среда для продуцирования глюкозы) в течение дополнительных 6 часов. После обработки, клеточную среду собирали и подвергали анализу на глюкозу с применением набора Abcam glucose assay kit согласно протоколу производителя. Клетки лизировали и собирали для выделения РНК и ПЦР-анализа G6pc, Insr и .

Для исследования экспрессии белка клетки AML-12 амплифицировали в ITS, Dex и FBS-содержащей DMEM/F12 среде и культивировали в 6-луночных (по 3,33×10⁵ клеток/лунка) планшетах в 10% FBS ITS-свободной DMEM/F12 среде добавлением или без добавления Dex в течение ночи. Эти клетки обрабатывали контролем (вода) или различными соединениями или в среде, содержащей сыворотку (10% FBS ITS-свободной DMEM/F12 среде, дополненной Dex), или в свободной от сыворотки среде (ITS/Dex-свободной DMEM/F12 среде) в течение 6 часов и 24 часов. Кроме того, клетки нейробластов человека IMR-32 культивировали в 10% FBS ЕМЕМ среде и затем обрабатывали контролем (вода), соединениями селена и их серосодержащими аналогами в той же среде, содержащей сыворотку, в течение 6 часов и 24 часов.

Выделение РНК и анализ ПЦР в реальном времени

Общую РНК из клеток выделяли с применением Тризола (Invitrogen) согласно протоколу производителя, и затем инкубировали с ДНКазой I для удаления любой потенциальной загрязняющей геномной ДНК. Образцы РНК подвергали анализу ПЦР в реальном времени с применением набора Applied-Bioscience's RT kit и предварительно сконструированных зондов Taqman (Invitrogen), как было описано ранее (Lan et al EMBO J 2003). В каждой группе обработки анализировали от трех до шести образцов. Данные нормализовали по уровням мРНК Актина B (Actb) в каждом образце и представляли, как среднее значение ± CO 3-6 образцов.

Подготовка белка и Вестерн-блот-анализ

Клетки печени AML-12 или нейрональные клетки IMR-32 высевали на 6-луночные планшеты, и затем обрабатывали носителем и различными соединениями в течение 6 часов и 24 часов, как описано в настоящем документе. После обработки, клетки промывали ледяным PBS и лизировали в ледяном буфере RIPA, содержащем полные ингибиторы протеазы и фосфатазы (Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA) на льду в течение 30 мин. Клеточные лизаты собирали с применением клеточного скребка и пипетки для переноса, и затем центрифугировали при 12000х g в течение 30 мин при 4°C для удаления осадка ДНК и получения белкового экстракта. Уровни белка в супернатанте этих клеточных лизатов определяли с применением набора Pierce Micro-BCA protein assay kit (Thermo Scientific-Piece Biotechnology, Rockford, IL) согласно протоколу производителя.

Для Вестерн-блот-анализа, пять микрограммов общих белков из клеток, обработанных контролем и соединением(ями), подвергали SDS-PAGE разделению на геле, и затем переносили на PVDF мембраны, как описывали ранее (Reddy, Liu et al. 2008 Science). Мембраны блокировали в фосфатном буферном солевом растворе (PBS), содержащем 5% (масс./об.) бычьего сывороточного альбумина (Sigma, St. Louis, MO), и инкубировали со специфическими первичными антителами. Затем мембраны инкубировали с HRP-коньюгированными вторичными антителами к мыши или кролику (разведение 1:5000, Cell Signaling, Inc.).

Все первичные антитела, кроме Actb (Li-COR, Линкольн, Небраска), Elf2bε и pElf2bε (Abcam, Cambridge, MA) приобретали у Cell Signaling Inc. Положительные сигналы на мембранных блотах детектировали с помощью реагентов усиления хемилюминесценции для Вестерн-блоттинга Amersham's enhanced chemiluminescence Western Blotting Prime Detection reagents (GE Healthcare LifeScience, Питтсбург, Пенсильвания). Изображения сигналов люминесценции на мембранных блотах получали с помощью системы LI-COR Odyssey Fc Image system (Линкольн, Небраска). Тот же мембранный блот размечали, и повторно наносили другое антитело, как описано в протоколе первичного детектирования GE WB ECL (GE Healthcare Lifescience, Питтсбург, Пенсильвания). Плотности полос белка в Вестерн-блотах определяли с применением программного обеспечения Li-COR Image studio или программного обеспечения NIH ImageJ, и затем нормализовали по уровню Actb в каждом образце. Данные представляли как среднее значение ± СО (среднеквадратическое отклонение) для трех образцов на каждую группу.

Статистический анализ

Если это применимо, t-критерий Стьюдента применяли с целью определения статистической значимости разницы между обработанной солевым раствором и обработанной соединениями CDE группами со значением p менее 0,05.

Результаты и обсуждение:

Действие соединений CDE на жизнеспособность клеток AML-12

Для того чтобы исследовать, обладают ли соединения селена токсическим действием на выживаемость клеток AML-12, проводили анализы на жизнеспособность клеток на клетках печени. Клетки AML-12 обрабатывали водным контролем или 150 ppb отдельного соединения C, соединения D, соединения E, соединения H, соединения I и соединения J; комбинациями соединений I и J ("соединения IJ"); комбинациями соединения D и соединения E ("соединения DE"); и комбинациями соединения C, соединения D и соединения E ("соединения CDE") в течение 48 часов.

Ни одна обработка соединениями, включая и отдельные соединения и комбинации соединений, не вызывала значительного снижения жизнеспособности клеток (показано посредством OD490 нм) в клетках AML-12 при сравнении с контрольной группой (фиг. 1). Эти данные демонстрируют, что соединения селена CDE не оказывают негативного действия на выживаемость или жизнеспособность клеток AML-12.

Ингибирование экспрессии мРНК G6pc соединениями CDE в клетках AML-12, культивируемых в FBS- и Dex-содержащей среде без ITS

Печень является основным органом для продуцирования глюкозы для поддержания нормальных уровней глюкозы в потоке крови. Каталитическая субъединица глюкозо-6-фосфатазы (G6pc) является ключевым ферментом глюконеогенеза в печени. Чтобы исследовать потенциальную функцию соединений CDE в печени, экспрессию G6pc исследовали посредством анализа количественной ПЦР (полимеразной цепной реакции) в реальном времени (QRT-PCR) в клетках AML-12, культивируемых в различных условиях, описанных в настоящем документе.

Рекомендовано, что клетки AML-12 следует культивировать или амплифицировать в среде, содержащей сыворотку, добавки инсулин-трансферрин-селенит натрия (ITS) и дексаметазон (Dex). Чтобы исключить возможность того, что инсулин и селенит натрия в ITS могли бы помешать действию тестируемых соединений селена в клетках AML-12, исследовали экспрессию G6pc в клетках AML-12, культивируемых в среде, свободной от ITS, но содержащей FBS и Dex. Вкратце, клетки AML-12 культивировали/амплифицировали в полной среде амплификации (10% FBS, ITS- и Dex-содержащей DMEM/F12), высевали на планшеты для культивирования и культивировали в среде, свободной от ITS, но содержащей FBS и Dex, в течение ночи. Эти клетки обрабатывали контролем (водой), индивидуальными селеносодержащими соединениями: соединением C, соединением D, соединением E в дозировке 150 ppb каждого из соединений, и серосодержащими индивидуальными соединениями: соединением H, соединением I, соединением J. Комбинацию соединений CDE и комбинацию соединений HIJ также тестировали на клетках в течение 48 часов. После этих обработок клетки собирали и подвергали анализу количественной ПЦР в реальном времени.

Как показано на фиг. 2A, обработка клеток печени AML-12 комбинацией соединений CDE, но не комбинацией серосодержащих аналогов соединений HIJ, вызывала очень значительное (приблизительно 50%) снижение экспрессии G6pc в клетках печени в экспериментальных условиях. Кроме того, экспрессию G6pc дополнительно исследовали в клетках AML-12 после обработки всеми индивидуальными соединениями (см. фиг. 2B). Не наблюдалось никакого существенного изменения (например, увеличения или уменьшения) в экспрессии G6pc. Данные представлены как среднее значение ± СО 4 образцов.

Действие снижения экспрессии G6pc в ответ на комбинацию соединений CDE наблюдали в трех повторных экспериментах с применением разных партий клеток (данные не показаны). Это действие не было обусловлено потенциальным токсическим эффектом соединений селена на выживаемость клеток, так как соединения CDE не влияют на жизнеспособность клеток AML-12 при тех же экспериментальных условиях (см. фиг. 1). Эти результаты показывают, что соединения CDE в комбинации, но не в форме отдельных соединений или их серосодержащих аналогов, могут ингибировать экспрессию G6pc в клетках AML-12 в присутствии FBS и Dex в культуральной среде.

Комбинация соединений CDE ингибирует экспрессию G6pc в клетках AML12 в среде, свободной от ITS и Dex, с FBS в течение 24 часов, после чего в среде, не содержащей сыворотку, в течение 6 часов

Сообщалось, что Dex может регулировать экспрессию G6pc в печени. Исследовали действие соединений CDE на клетки AML-12 в условиях культивирования при отсутствии ITS/Dex. Клетки печени AML-12, культивированные в условиях отсутствия сыворотки в течение 24 часов и 48 часов, показали в некоторой степени аномальную клеточную морфологию. Тем не менее, грубых морфологических изменений в клетках AML-12 после культивирования в бессывороточной среде в течение 6 часов (данные не показаны) не наблюдалось. Таким образом, клетки AML-12 предварительно обрабатывали соединениями CDE в среде, содержащей сыворотку, но не содержащей ITS/Dex, в течение 24 часов с последующей повторной обработкой этими соединениями в среде, не содержащей сыворотку/ITS/Dex, в течение 6 часов для дальнейшего изучения влияния соединений CDE на экспрессию G6pc.

Вкратце, клетки AML-12 обрабатывали либо 150 или 300 ppb комбинации соединений CDE (разведенной в 10% FBS, но не содержащей ITS/Dex, среде) в течение 24 часов. Затем клетки дважды промывали PBS для удаления остаточной FBS и инкубировали с теми же дозами этих соединений селена в присутствии или в отсутствие 10 или 100 нм инсулина (разбавленного в среде, не содержащей FBS/ITS/Dex) в течение 6 часов. Обработку только инсулином включали для сравнения эффективности воздействия соединений CDE и потенциального кумулятивного или синергического действия между соединениями CDE и инсулином.

Как показано на фиг. 3, обработка обеими дозами инсулина (10 и 100 нМ) значительно ингибирует экспрессию G6pc, которую ожидали. Обработка только соединениями CDE в дозировке 150 ppb вызывала тенденцию к снижению экспрессии G6pc (фиг. 3). Более существенно, обработка соединениями CDE в дозировке 300 ppb вызывала устойчивое и значительное снижение экспрессии G6pc в этих AML12 клетках печени, с эффективностью, по меньшей мере сравнимой с 100 нМ инсулина (фиг. 3). Кроме того, обработка тестируемой комбинацией инсулина с 150 или 300 ppb соединений CDE также приводила к значительному снижению экспрессии мРНК G6pc по сравнению с контролем (фиг. 3). Результаты ясно демонстрируют, что соединения CDE могут имитировать инсулин, чтобы ингибировать экспрессию G6pc в клетках AML-12, и эффективная дозировка 300 ppb соединений CDE сравнима со 100 нМ инсулина.

Ингибирование экспрессии G6pc и улучшение действия инсулина в регуляции экспрессии G6pc посредством соединений CDE в клетках AML-12, культивируемых в условиях смоделированного диабета (стимулированного посредством цАМФ и Dex)

Для дальнейшего изучения влияния соединений CDE на экспрессию G6pc изучали экспрессию мРНК G6pc в клетках AML-12, совместно обработанных проницаемым в клетку 8-(4-хлорфенилтио)цАМФ (8-СРТ) и дексаметазоном (Dex). Циклический АМФ (8-СРТ) и Dex являются хорошо известными стимуляторами экспрессии G6pc и продукции глюкозы в печени, имитирующими диабетические состояния in vivo. Вкратце, клетки печени AML-12 предварительно обрабатывали водой (контроль) или 150 ppb или 300 ppb комбинации соединений CDE в среде, содержащей 10% FBS, но не содержащей ITS/Dex, в течение 24 часов. После этой начальной обработки следовала повторная обработка этими соединениями селена в присутствии или в отсутствие 10 нМ или 100 нМ инсулина, 0,1 мМ 8-СРТ и 0,5 мкМ Dex в не содержащей сыворотки среде в течение 6 часов. После этих обработок, клетки собирали и подвергали анализу посредством количественной ПЦР в реальном времени. Данные представлены на фиг. 4 как среднее значение ± СО четырех образцов на каждую группу. Различные буквы (a против b, a' против b' против c', aʺ против bʺ против cʺ) на фиг. 4 означают существенное различие между этими двумя группами.

Как показано на фиг. 4, клетки печени AML-12, обработанные 8-СРТ/Dex, показали значительное увеличение экспрессии мРНК G6pc. Обработка обеими дозировками инсулина значительно снизила 8-СРТ/Dex-индуцированную экспрессию G6pc в клетках AML-12 (по сравнению с 8-CPT/Dex группой на гистограмме на фигуре 4). Что еще более важно, соединения CDE в дозировке 150 ppb также значительно снижали 8-CPT/Dex-индуцированную экспрессию G6pc. Средние уровни экспрессии G6pc дополнительно снизились в клетках AML-12 после обработки 8-CPT/Dex и комбинацией соединений CDE в более высокой дозе (300 ppb), даже при том, что величина P была больше, чем 0,05 (по сравнению с группой 8-СРТ/Dex) из-за высокой вариации экспрессии G6pc в этой группе обработки. Независимо от этого, данные исследования показали, что, подобно инсулину, соединения CDE отдельно в испытанных дозировках могут ингибировать 8-CPT/Dex-индуцированную экспрессию G6pc (снижение примерно на 40-48% по сравнению с группой 8-CPT/Dex).

Кроме того, обработка соединениями CDE в дозировке 150 ppb в комбинации с 10 нМ инсулина, наряду с 8-CPT/Dex, дополнительно ингибировала экспрессию G6pc в клетках AML-12 по сравнению с 10 нМ инсулина и 8-CPT/Dex группой (обозначено как a' против b' на гистограмме на фиг. 4). Кроме того, средние уровни мРНК G6pc были ниже в клетках AML-12 после обработки посредством 10 нМ инсулина, 8-СРТ/Dec и более высокой дозировки соединений CDE (группа 10 нМ инсулина/8-СРТ/Dex/300 ppb соединений CDE относительно группы 10 нМ инсулина/8-CPT/Dex/150 ppb соединений CDE). Тем не менее, между этими двумя группами не было никакой статистической разницы.

Более существенно, как это показано на вложенной гистограмме, обработка соединениями CDE при 300 ppb в комбинации с 100 нМ инсулина совместно с 8-CPT/Dex дополнительно значительно ингибировала экспрессию G6pc в клетках AML-12 по сравнению с группой, обработанной 100 нМ инсулина и 8-CPT/Dex (обозначено как аʺ против bʺ против cʺ на гистограмме на фиг. 4). Более того, уровни мРНК G6pc в клетках AML-12 после обработки 100 нМ инсулина, 8-CPT/Dex и 300 ppb соединений CDE были значительно ниже, чем в группе, обработанной 100 нМ инсулина/8-СРТ/Dex/150 ppb соединений CDE (см. вложенную гистограмму на фиг. 4).

В совокупности эти результаты показывают, что комбинация инсулина и соединений CDE была еще более эффективной, чем отдельно инсулин или отдельно соединения CDE, в ингибировании повышенной экспрессии G6pc из-за обработки 8-CPT/Dex.

Анализ на глюкозу также проводили на среде культивирования клеток AML-12 после вышеуказанной обработки. К сожалению, уровни глюкозы, продуцированные клетками AML-12, даже после стимуляции посредством 8-CPT/Dex, были слишком малы, чтобы быть обнаруженными с помощью анализа чувствительной флуоресценции на глюкозу (Abcam) (данные не представлены).

В целом, эти результаты на клетках AML-12, культивированных при описанных выше условиях культивирования, показали, что соединения CDE могут имитировать инсулин, чтобы ингибировать экспрессию G6pc как в нормальных условиях, так в условиях модели патологического или диабетического состояния in vitro (например, обработка клеток 8-CPT/Dex). Кроме того, соединения CDE могут улучшать действие инсулина для ингибирования экспрессии G6pc в клетках AML-12, культивированных в смоделированных диабетических условиях. Эти результаты обеспечивают молекулярно-биологическое доказательство, что соединения CDE обладают потенциалом ингибировать избыточное продуцирование глюкозы при диабете I типа и/или II типа.

Повышающая регуляция экспрессии Insr и в клетках AML-12 после обработки соединениями CDE

Инсулиновый рецептор (Insr) и рецептор 1 инсулиноподобного фактора роста 1 имеют важное значение для действия инсулина и IGF1 по контролю экспрессии G6pc и впоследствии продуцированию глюкозы в печени. Чтобы исследовать, может ли комбинация соединений CDE модулировать чувствительность к инсулину или IGF1 в клетках печени рецептор-зависимым образом, определяли экспрессию инсулиновых и IGF1 рецепторов посредством анализа количественной ПЦР в реальном времени.

Клетки AML-12 сначала обрабатывали водным контролем (контроль, n=4), соединениями селена CDE и их серосодержащими соединениями-аналогами HIJ (n=4) в FBS-/Dex-содержащей, но не содержащей ITS среде в течение 24 часов, и затем подвергали анализу количественной ПЦР в реальном времени на Insr и . Как показано на фиг. 5A, уровень мРНК Insr сильно увеличился в 2,78 раз после обработки соединениями CDE. Аналогичным образом, экспрессия также значительно стимулировалась соединениями CDE до увеличения примерно в 2,2-раза (см. фиг. 5B). Тем не менее, серосодержащие соединения-аналоги HIJ не влияли на экспрессию Insr и в клетках AML-12 (см. фиг. 5A и 5B).

Для дальнейшего подтверждения того, что соединения CDE могут увеличивать экспрессию Insr и , клетки AML-12 обрабатывали двумя дозами соединений CDE в FBS-содержащей, но не содержащей ITS/Dex среде, в течение 24 часов. Клетки затем повторно обрабатывали теми же дозировками соединений CDE в присутствии или в отсутствие 8-CPT/Dex в среде, не содержащей FBS/ITS/Dex, в течение 6 часов. Кроме того, эти клетки обрабатывали инсулином в течение 6 часов, чтобы увидеть, существует ли различие между инсулином и соединениями CDE в контролировании экспрессии Insr и .

Как показано на фиг. 5C и 5D, обработка соединениями CDE в обеих дозировках, 150 ppb и 300 ppb, значительно усиливала экспрессию Insr и в клетках AML-12 без совместной обработки 8-CPT/Dex, в сравнении с контролем (т.е. группами 0 ppb CDE/отсутствие инсулина и отсутствие 8-СРТ/Dex). Тем не менее, только инсулин не увеличивал экспрессию Insr и в клетках AML-12 (см. фиг. 5B и 5C). Аналогичным образом, обработка соединениями CDE в дозировке 300 м, но не инсулином, также значительно повышала экспрессию Insr и в клетках AML-12, совместно обработанных 8-CPT/Dex (см. черные столбцы на фиг. 5C и 5D).

Эти результаты показывают, что соединения CDE могут стимулировать экспрессию Insr и в клетках AML-12 при тестируемых условиях. Кроме того, эти данные показывают, что существует различие между действием инсулина и соединений CDE в регуляции экспрессии генов в клетках AML-12. Также, результаты показывают, что соединения CDE могут быть полезны для лечения диабета типа I и типа II путем повышения чувствительности к инсулину.

Совместно вышеуказанные исследования генной экспрессии (фиг. 2-4) показывают, что соединения CDE, но не отдельные соединения или их серосодержащие аналоги, могут имитировать инсулин, чтобы значительно снизить экспрессию G6pc, таким образом представляя новый способ снижения высвобождения глюкозы в печени. Эти данные также обеспечивают молекулярное доказательство того, что соединения CDE могут действовать таким же образом, как инсулин, в ингибировании экспрессии G6pc в клетках печени мышей даже в присутствии стимулятора продукции глюкозы, такого как 8-CPT/Dex (фиг. 3-4).

Кроме того, соединения CDE в комбинации также улучшают действие инсулина для дополнительного ингибирования экспрессии G6pc в 8-СРТ/Dex-стимулированных клетках AML-12 (фиг. 4). Соединения CDE в комбинации могут стимулировать экспрессию Insr и (фиг. 5), что также способствует снижению экспрессии G6pc для продуцирования глюкозы в печени совместно с повышенной чувствительностью к инсулину/Igfl и перемещения глюкозы. Более того, соединения CDE в комбинации не оказывали токсического воздействия на жизнеспособность клеток печени (фиг. 1). Вкратце, эти результаты показывают, что соединения CDE в комбинации имитируют инсулин для ингибирования экспрессии G6pc, а также улучшают действие инсулина в этом процессе, вероятно, путем стимуляции экспрессии Insr и/или в клетках печени мышей AML-12 без каких-либо токсических эффектов на выживаемость или жизнеспособность клеток.

Пример 5: Соединения CDE направляют фосфорилирование Foxo3 и Foxo4 в клетках AML-12

Семейство факторов транскрипции генов Forkhead подкласса O (FOXO) играет важную роль в обмене веществ, глюконеогенезе и чувствительности к инсулину в печени. Внутриклеточная активность генов FOXO жестко регулируется посттрансляционной модификацией. В частности, фосфорилирование FOXO обеспечивает исключение его из ядра, тем самым блокируя его доступ к его генам-мишеням. У инсулинорезистентных или индивидуумов, страдающих диабетом, не существует никакого сигнала, чтобы исключить FOXO из ядра, таким образом, он остается в ядре и стимулирует транскрипцию G6pc. Повышенная экспрессия G6pc включает глюконеогенез, что приводит к гипергликемии. Инсулиноподобные факторы роста (ИФР), также могут модулировать действие инсулина, чтобы контролировать FOXO-опосредованную экспрессию G6pc для продуцирования глюкозы в печени.

Как было описано ранее, клетки печени AML-12 показали, что соединения CDE в комбинации могут имитировать действие инсулина, чтобы ингибировать экспрессию G6pc, и могут улучшать действие инсулина в этом процессе. Поскольку FOXO являются основными сигнальными молекулами глюконеогенеза и чувствительности к инсулину в печени, был рассмотрен вопрос о том, будут ли соединения CDE, как и инсулин, направлять FOXO и другие связанные с этим сигнальные молекулы в клетках AML-12.

Соединения CDE направляют фосфорилирование Foxo3 и Foxo4 в клетках AML-12, культивированных в среде, содержащей сыворотку

Чтобы определить, может ли комбинация соединений CDE регулировать фосфорилирование FOXO в печени, клетки AML-12 обрабатывали контролем и 150 ppb соединений селена CDE и их серосодержащими аналогами, 150 ppb соединений HIJ, в среде, содержащей сыворотку и Dex, но не содержащей ITS, в течение 6 часов. Обработанные клетки подвергали Вестерн-блот-анализу. Количественные данные экспрессии белка в Вестерн-блотах представлены как среднее значение ± СО 3 образцов. Различные буквы в гистограммах означают существенное различие между этими двумя группами (P<0,05).

На фиг. 6A показана экспрессия белков различных сигнальных молекул, включая фосфорилированный Foxo3T32 (треонин 32; pFoxo3T32), фосфорилированный Foxo Т28 (треонин 28; pFoxo4T28), фосфорилированный PDK1 (pPDK1), фосфорилированный AKT Т308 (треонин 308; pAKTT308), фосфорилированный AKT S473 (серии 473; pAKTS473), AKT, фосфорилированный Gsk3a S21 (серии 21; pGsk3bS21), фосфорилированный Gsk3b S9 (серии 9; pGsk3bS9), Gsk3a, Gsk3b, фосфорилированный 4ЕВР1 Т37/46 (треонин 37 и треонин 46; р4ЕВР1Т37Т46), фосфорилированный Elf2bεS539 (серии 530; pElf2bεS530) и Elf2bε, в клетках AML-12 после обработки водой и 150 ppb соединений HIJ и 150 ppb соединений CDE, разбавленных в среде, содержащей сыворотку и Dex (но не содержащей ITS) в течение 6 часов. Было обнаружено, что фосфорилированные формы белков Foxo3 (например, pFoxo3 по треонину 32, pFoxo3T32) и Foxo4 (например, pFoxo4 по треонину 28, pFoxo4T28) были обнаружены заметно повышенными в клетках AML-12 после обработки соединениями CDE, но не соединениями HIJ, в течение 6 часов (фиг. 6A). Количественный анализ показал приблизительно 2,5-кратное увеличение pFoxo3T32 и примерно 3,2-кратное увеличение pFoxo4T28 в клетках AML-12, обработанных CD (фиг. 6B и 6C). Мы также протестировали несколько антител к фосфорилированному Foxo1 (pFoxo1), но не смогли обнаружить специфическую pFoxo1 полосу белка в Вестерн-блотах с помощью этих антител (данные не показаны). Полученные результаты позволяют предположить, что экспрессия pFoxo1 в клетках AML-12, скорее всего, очень низкая.

Выполняли анализ уровней белка Foxo1, Foxo3 и Foxo4 в клетках AML-12 посредством количественной ПЦР в реальном времени после аналогичной обработки, описанной выше. Значительного изменения экспрессии мРНК Foxo1, 3 или 4 (данные не показаны) не наблюдали, и наблюдаемое увеличение фосфорилированного Foxo3 и Foxo4 (см. фиг. 6) не связано с потенциальным увеличением экспрессии белка Foxo3/4 соединениями CDE в клетках AML-12. На самом деле, соединения CDE не влияли на уровни общего белка Foxo3 и Foxo4 в клетках AML-12, культивированных в условиях отсутствия сыворотки (см. фиг. 7A).

Кроме того, соединение C, соединение D и соединение E отдельно, каждое в дозировке 150 ppb, тестировали в клетках AML-12 с целью определения влияния на фосфорилирование Foxo3/4 в тех же условиях культивирования (в среде, содержащей сыворотку) в течение 6 часов и 24 часов. Изменения уровней белка pFoxo3T32 и pFoxo4T28 после обработки отдельным соединением C, соединением D, или соединением E не наблюдали (данные не показаны), что указывает на то, что существует синергическое действие между соединением C, соединением D и соединением E в комбинации, что приводит к фосфорилированию Foxo3 и Foxo4 в клетках AML-12.

В совокупности эти результаты показывают, что соединения CDE, но не отдельные соединения или их серосодержащие аналоги, могут повысить фосфорилирование Foxo3 и Foxo4 в клетках AML-12 при культивировании в среде, содержащей сыворотку. Так как фосфорилирование FOXO приводит к исключению из ядра этих факторов транскрипции, эти результаты свидетельствуют о том, что соединения CDE будут функционировать как инактиваторы Foxo3 и Foxo4 в клетках печени AML-12.

Так как фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K)/фосфоинозитид-зависимая протеинкиназа 1 (PDK1)/протеинкиназа B (АКТ) является основным сигнальным путем в обратном направлении сигнального каскада FOXO для инсулин-опосредованного контроля продуцирования глюкозы в печени, оценивали наличие каких-либо изменений в уровнях фосфорилированной PDK1 (pPDK1) и АКТ (PAKT) в клетках AML-12, обработанных этим соединением. Неожиданно, при изученной 6 часовой обработке соединения CDE не влияли на фосфорилирование PDK1 и общие уровни AKT (фиг. 6A). Это может происходить из-за возможных переходных эффектов соединений CDE при активации PDK1 и AKT, что происходит в клетках AML-12 в более ранние моменты времени (до изучения исследуемого момента времени через 6 часов).

Кроме того, не наблюдали изменения уровней белка двух других нижестоящих сигнальных молекул, фосфорилированного GSk3a и GSK3b, которые контролируются непосредственно AKT (фиг. 6A). Уровни фосфорилированного 4ЕВР1 (ниже расположенная молекулярная мишень AKT/mTOR сигнального каскада) и pelf2Bε S539 (ниже расположенная молекулярная мишень Gsk3), которые являются ключевыми для инсулин-управляемого синтеза белка или трансляции, также не были затронуты (см. фиг. 6A). Эти результаты обеспечивают дополнительное прямое молекулярное доказательство того, что соединения CDE не оказывают токсического действия на пролиферацию клеток AML-12 или выживаемость, как описано ранее (фиг. 1).

Совместно эти результаты свидетельствуют о том, что соединения CDE не влияли на некоторые АКТ-прямые или -непрямые нижестоящие сигнальные молекулы, такие как Gsk3a, Gsk3b, р4ЕВР1 и pElf2bε S539, за исключением описанных выше Foxo3 и Foxo4 в клетках AML-12 в присутствии сыворотки в культуральной среде. Другими словами, соединения CDE могут избирательно инактивировать FOXO путем повышения их фосфорилирования в клетках печени AML-12.

Соединения CDE направляют фосфорилирование Foxo3/4 в клетках AML-12, культивированных в условиях отсутствия сыворотки

Как упоминалось ранее, клетки AML-12 можно культивировать в среде, не содержащей сыворотку, в течение короткого периода времени (например, 6 часов) без очевидных морфологических дефектов (данные не представлены). Таким образом, изучали уровни белков фосфорилированного Foxo3 и Foxo4 в клетках AML-12, культивированных в условиях отсутствия сыворотки.

Вкратце, клетки AML-12 обрабатывали контролем (вода), соединениями CDE (150 ppb селена для каждого соединения), соединениями СЕ (150 ppb селена для каждого соединения) или соединениями DE (150 ppb селена для каждого соединения) в среде, не содержащей сыворотку, не содержащей ITS и не содержащей Dex, в течение 6 часов, и подвергали Вестерн-блот-анализу и количественному анализу. Количественные данные нормализовали по уровню белка Actb, и представляли, как среднее значение ± CO 3 образцов. Различные буквы в гистограммах на фиг. 7B и 7C означают существенное различие между этими двумя группами (P<0,05).

Как показано на фиг. 7A, было обнаружено, что уровни фосфорилированного белка Foxo3 (pFoxo3 по треонину 32) и Foxo4 (pFoxo4 по треонину 28) повысились в клетках AML-12 после обработки соединениями CDE и соединениями CE, но не соединениями DE, в течение 6 часов в среде, не содержащей сыворотку. Очевидного изменения уровня общего белка Foxo3 и Foxo4 после обработки соединениями селена (фиг. 7A) не было. Не обнаружено определенной полосы pFoxo1 с помощью нескольких специфических pFoxo1 антител на этих образцах белка (данные не показаны).

Количественный анализ показал, что существует приблизительно 1,8-кратное увеличение уровней pFoxo3T32 (фиг. 7B), а также примерно 6-кратное увеличение pFoxo4T28 (фиг. 7C) в клетках AML-12, обработанных соединениями CDE и соединениями CE. Все остальные протестированные молекулы, такие как pPdk1, pAkt, pGsk3a, pGsk3b и p4ebp1, очевидно не изменились посредством соединений CDE (см. фиг. 7A). Приведенные выше результаты, полученные от клеток AML-12, культивированных в условиях отсутствия сыворотки с помощью соединений CDE согласуются с результатами клеток AML-12, культивированных в содержащей сыворотку среде (фиг. 6). Увеличение Foxo3 и Foxo4 фосфорилирования соединениями CDE в клетках AML-12 является полностью независимым от FBS, факторов роста или инсулина, так как инсулин или FBS не добавляли в среду культивирования клеток в этом эксперименте. Другими словами, соединения CDE могут обойти инсулин или факторы роста, чтобы инактивировать Foxo3 и Foxo4 в клетках печени.

Вкратце, эти результаты показывают, что соединения CDE могут быть специфически нацелены на фосфорилирование Foxo3 и Foxo4 в клетках AML-12, культивированных и в среде, содержащей сыворотку (фиг. 6), и в среде, не содержащей сыворотку (фиг. 7). Таким образом, из этих исследований можно сделать вывод, что соединения CDE являются новыми инактиваторами FOXO, и инактивация этих FOXO-молекул соединениями CDE является независимой от инсулина, FBS и других факторов роста в клетках печени мышей.

Чтобы проверить, является ли наблюдаемое увеличение FOXO4 фосфорилирования в клетках печени AML-12 общим эффектом комбинации соединений CDE в клетках млекопитающих, мы исследовали уровни pFOXO4 в клеточной линии нейрональных клеток IMR-32, не относящихся к печени, в том, что испытания проводили в то же самое время и в тех же экспериментальных условиях, что для клеток печени AML-12. Как показано на фиг. 8, увеличение фосфорилирования FOXO4 не наблюдали в нейрональных клетках IMR-32, обработанных соединениями CDE. Также исследовали уровни белка фосфорилированного FOXO1 и FOXO3 и обнаружили, что фосфорилированный FOXO3 едва детектировали, и фосфорилированный FOXO1 не детектировали в клетках IMR-32 с помощью их специфических антител (данные не показаны). Независимо от этого, отсутствие повышенного фосфорилирования FOXO4 в клетках IMR-32 соединениями CDE (фиг. 8) указывает на то, что соединения CDE в комбинации, вероятно, не имеют токсического действия на нервные клетки. Таким образом, можно сделать вывод, что увеличенное фосфорилирования FOXO соединениями CDE, вероятно, специфично к клеткам печени.

В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что соединения CDE, но не отдельные соединения или их серосодержащие аналоги, будут функционировать в качестве новых специфичных к клеткам печени инактиваторов FOXO, и что инактивация этих молекул FOXO в клетках печени мышей соединениями CDE не зависит от инсулина и любых других факторов роста.

Предыдущие данные, описанные в настоящем документе, показали, что соединения CDE могут имитировать действие инсулина для ингибирования экспрессии G6pc и улучшать действие инсулина для дальнейшего подавления экспрессии G6PC в клетках AML-12 (фиг. 3-4). Последнее (фиг. 4), как обсуждалось ранее, можно было бы также отнести к усилению экспрессии Insr и (фиг. 5). Все эти события, вероятно, связаны с инсулин/фактор роста/FBS-независимой инактивацией Foxo3 и Foxo4 соединениями CDE (фиг. 6-7), так как G6pc является хорошо известным геном-мишенью FOXO в печени человека, в то время как Insr и являются двумя потенциальными Foxo3/4 генами-мишенями в связи с наличием многих Foxo связывающих мотивов в промоторах их генов (данные не показаны). Увеличенная экспрессия Insr и соединениями CDE (фиг. 5) будет в дальнейшем усиливать действие инсулина или улучшать чувствительности к инсулину для дальнейшего стимулирования Foxo3/4 фосфорилирования для ингибирования экспрессии G6pc.

Независимо от этого, эти результаты свидетельствуют о том, что комбинация соединений CDE может специфически действовать как мощный независимый от инсулина или другого фактора роста FOXO-инактиватор в клетках печени AML-12, чтобы снизить экспрессию G6pc и, вероятно, понизить выход глюкозы в печени. Кроме того, введение соединений CDE вероятно уменьшает физиологические последствия в клетках печени, которые становятся инсулинрезистентными, в контексте контроля экспрессии G6pc для снижения продуцирования глюкозы в печени. Обход инсулина для повышения Foxo фосфорилирования соединениями CDE, в то же время будучи в состоянии контролировать гомеостаз глюкозы посредством регуляции FOXO-опосредованной экспрессии G6pc, открывает множество терапевтических возможностей для лечения сахарного диабета в целом. Как следствие, лечение диабета становится менее зависимым от одностороннего введения экзогенного инсулина или правильного функционирования рецепторов инсулина.

Пример 6

Соединения CDE в комбинации улучшают действие инсулина в ингибировании экспрессии G6pc и продуцирования глюкозы, и обходят инсулин для регулирования сигнального пути Pdk1/Akt/Foxo1/3/4 в первичных гепатоцитах мышей, не будучи токсичными для клеток

Комбинацию трех синтетических селеноорганических соединений, соединений CDE, тестировали в комбинации в клеточной культуре первичных гепатоцитов мышей для изучения действия на продуцирование глюкозы, экспрессию G6pc и Foxo1/3/4 фосфорилирование.

Материалы и способы

Выделение первичных гепатоцитов мышей и соединений

Первичные гепатоциты мышей приобретали от Triangle Research Labs, LLC (Research Triangle Park, North Carolina). Эти первичные гепатоциты мышей выделяли из здоровых нормальных взрослых мышей C57BL6, культивируемых на покрытых коллагеном 12-луночных или 24-луночных планшетах в течение 24 часов в Triangle Research Labs (TRL), а затем отправляли в лабораторию для экспериментов.

Соединение C (5'-Метилселеноаденозин), D (Se-Аденозил-L-гомоцистеин) и E (Гамма-глутамил-метилселеноцистеин) синтезировали в химической лаборатории Alltech, Inc. Чистоту всех тестируемых соединений подтверждали ≥99%, что определяли посредством масс-спектрометрии.

Культура клеток и обработки

Первичные гепатоциты мыши, выращенные на 12- или 24-луночных планшетах для культивирования, покрытых коллагеном, получали от Triangle Research Lab (TRL) на 3-й день после выделения гепатоцитов мышей и культивировали в поддерживающей среде для гепатоцитов (TRL) в 5% CO2 инкубаторе при 37°C, чтобы позволить гепатоцитам акклиматизироваться в течение 8 часов или в течение ночи, в соответствии с процедурой, рекомендуемой TRL (Research Triangle Park, NC).

Акклиматизированные в течение ночи гепатоциты дважды промывали PBS (чтобы удалить любую остаточную FBS и другие добавки в поддерживающей среде для гепатоцитов TRL, предварительно обработанных контролем (вода) или соединениями селена CDE (150 или 300 ppb каждого соединения селена) в среде DMEM/F12, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), в течение 24 ч. Затем эти клетки дважды промывали PBS и инкубировали с такой же дозой соединений селена CDE (150 или 300 ppb) в присутствии или в отсутствие инсулина (10 или 100 нМ, Sigma), 0,1 мМ 8-СРТ (Sigma), или 0,5 мкМ Dex (Sigma), в среде DMEM, не содержащей сыворотку и глюкозу (Invitrogen), с добавлением 20 мМ лактозы (Sigma) и 2 мМ пирувата (Sigma) и 15 мМ HEPES (Sigma), в течение еще 6 часов. После обработки, клеточную среду собирали и подвергали анализу на глюкозу и токсикологическим исследованиям лактатдегидрогеназы (ЛДГ), и клетки собирали для анализа РНК и белка.

Для исследований соединений CDE на первичных гепатоцитах мышей в условиях культивирования при абсолютном отсутствии сыворотки гепатоциты акклиматизировали в поддерживающей среде для гепатоцитов (TRL) в течение 8 ч, дважды промывали PBS (чтобы удалить остатки FBS и другие добавки в чашке для культивирования), а затем выдерживали в бессывороточной среде DMEM/F12 в течение ночи. Некоторые из этих испытывающих недостаток сыворотки гепатоцитов обрабатывали контролем (водой), соединениями селена (150 или 300 ppb каждого соединения) в присутствии или в отсутствие инсулина (10 или 100 нм), 0,1 мМ 8-СРТ (Sigma) или 0,5 мкМ Dex (Sigma), в среде DMEM, не содержащей сыворотки и глюкозы/фенолового красного, дополненной 20 мМ лактозы и 2 мМ пирувата и 15 мМ HEPES в течение 6 часов. После обработки в течение 6 часов культуральную среду собирали для анализа на глюкозу и токсикологических исследований мониторинга активности ЛДГ, и культивируемые клетки выделяли для анализа белков. Кроме того, некоторые гепатоциты, испытывающие недостаток сыворотки, обрабатывали соединениями CDE (300 ppb каждого соединения) в простой среде DMEM/F12 в течение 0, 5, 30, 60, 120 и 180 мин, и клетки собирали для анализа динамики белков различных сигнальных молекул.

Выделение РНК и анализ ПЦР в реальном времени

Суммарную РНК из этих клеток выделяли с применением тризола (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя, и затем инкубировали с ДНКазой I, чтобы удалить любую потенциальную загрязняющую геномную ДНК. Затем образцы РНК подвергали анализу посредством ПЦР в реальном времени с применением набора Applied-Bioscience's RT kit и предварительно разработанных зондов Taqman (Invitrogen), как описано ранее (Lan et al EMBO J 2003). От трех до четырех образцов анализировали для каждой обработанной группы. Данные нормализовали по уровням мРНК Actb в каждом образце, и представляли как среднее значение ± СО для 3-4 образцов.

Подготовка белка и Вестерн-блот-анализ

После вышеописанной обработки первичные гепатоциты мышей промывали ледяным PBS и лизировали в ледяном RIPA буфере, содержащем полные ингибиторы протеиназы и фосфатазы (Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA) на льду в течение 30 мин. Клеточные лизаты собирали с помощью скребка для клеток и пипетки для переноса, и затем центрифугировали при 12000 х g в течение 30 мин при 4°C для удаления осадка ДНК и получения белкового экстракта. Уровни белка в супернатанте этих клеточных лизатов определяли с помощью набора для анализа белка Pierce Micro-BCA protein assay kit (Thermo Scientific-Piece Biotechnology, Rockford, IL) в соответствии с протоколом производителя.

Для Вестерн-блот-анализа пять микрограммов общего белка из клеток, обработанных контролем и соединением(ями), подвергали разделению на геле SDS-PAGE, и затем переносили на мембраны PVDF, как описано ранее (Reddy et al. 2008 Science). Мембраны блокировали в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем 5% (масс./об.) бычьего сывороточного альбумина (Sigma, St. Louis, MO), и инкубировали с определенными первичными антителами с последующей инкубацией с HRP-коньюгированными вторичными антителами к мыши или кролику (разведение 1:5000, Cell Signaling Inc.). Все первичные антитела, за исключением Actb (Li-COR, Линкольн, Небраска), приобретали у Cell Signaling Inc. Положительные сигналы на мембранных блотах детектировали с помощью реагентов усиления хемилюминесценции для Вестерн-блоттинга Amersham's enhanced chemiluminescence Western Blotting Prime Detection reagents (GE Healthcare LifeScience, Питтсбург, Пенсильвания). Изображения этих сигналов люминесценции на мембранных блотах получали с помощью системы LI-COR Odyssey Fc Image system (Линкольн, Небраска). Тот же мембранный блот размечали и повторно наносили другое антитело, как описано в протоколе первичного детектирования GE WB ECL (GE Healthcare Lifescience, Питтсбург, Пенсильвания). Плотности полос белка в Вестерн-блотах определяли с применением программного обеспечения NIH ImageJ, и затем нормализовали по уровню Actb в каждом образце. Данные представлены как среднее значение ± СО для трех образцов на каждую группу.

Анализ продуцирования глюкозы

Культуральные среды клеток из описанных выше процедур собирали и центрифугировали при 300 х g в течение 5 минут, чтобы удалить любые потенциальные смещенные гепатоциты, и подвергали анализу на глюкозу с применением набора для колориметрического анализа глюкозы (Abcam) в соответствии с протоколом производителя. Поглощение при OD570 нм в образцах и стандартах глюкозы различных концентраций определяли с помощью планшет-ридера Bio-Tek, и концентрацию глюкозы в среде каждого образца получали по стандартной кривой глюкозы, и затем нормализовали по уровню белка в прикрепленных клетках, который определяли с применением набора Pierce Micro-BCA protein assay (Thermo Scientific-Piece Biotechnology, Rockford, IL) согласно протоколу производителя. Уровни глюкозы в каждой группе обработки делили на средний уровень в контрольной группе (без обработок соединениями CDE, инсулином, 8-СРТ и Dex), чтобы получить относительный уровень глюкозы. Данные представлены как среднее значение ± СО 3-4 образцов.

Токсикологические исследования посредством определения уровня ЛДГ в культуральной среде

По аналогии с вышеописанным анализом на глюкозу, среду для культивирования клеток из описанных выше процедур собирали и центрифугировали при 300 х g в течение 5 минут, чтобы удалить любые потенциальные смещенные гепатоциты, и подвергали анализу ЛДГ с применением набора для колориметрического анализа глюкозы (Abcam) в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, поглощение при OD450 нм в стандартах ЛДГ и образцах культуральной среды после инкубирования с субстратами ЛДГ через каждые две минуты до 40 минут определяли с помощью планшет-ридера Bio-Tek. Концентрацию ЛДГ в среде каждого образца получали путем вычитания показания OD450 в линейном диапазоне поглощения с последующим применением стандартной кривой ЛДГ в соответствии с протоколом производителя. Полученный уровень ЛДГ в среде каждого образца затем нормализовали по уровню белка в прикрепленных клетках. Уровни ЛДГ в каждой группе обработки дополнительно нормализовали по среднему значению контрольной группы (без обработок соединениями CDE, инсулином, 8-СРТ и Dex), чтобы получить относительный уровень ЛДГ в каждой группе. Данные представлены как среднее значение ± СО 3-4 образцов.

Статистический анализ

Если это применимо, t-критерий Стьюдента приводили с целью определения статистической разницы между этими двумя группами. Значение P менее 0,05 считали значимым.

Результаты и обсуждение:

Соединения CDE в комбинации ингибируют продуцирование глюкозы и экспрессию G6pc в первичных гепатоцитах мышей

Предыдущие исследования, описанные в настоящем документе, в клетках AML-12 показали, что соединения CDE могут имитировать инсулин для ингибирования экспрессии G6pc (фиг. 3-4), но не имеют токсического действия на жизнеспособность клеток AML-12 (фиг. 1). Тем не менее, не было установлено, могут ли соединения CDE контролировать продуцирование глюкозы в клетках AML-12, так как уровни глюкозы в культуральной среде, производимой клетками AML-12, были слишком малы, чтобы быть обнаруженными с помощью набора для анализа чувствительной флуоресценции на глюкозу (Abcam, данные не показаны). Таким образом, первичные гепатоциты мыши применяли для исследования, могут ли соединения CDE имитировать инсулин, чтобы ингибировать продуцирование глюкозы, и дополнительно подтверждали ингибирующее действие соединений CDE на экспрессию G6pc, но при отсутствии токсического воздействия на выживаемость клеток, наблюдаемого в клетках AML-12.

Аналогично исследованиям на клетках AML-12, первичные гепатоциты мышей подвергали предварительной обработке контролем (водой) или 150 ppb и 300 ppb дозировками соединений селена CDE в среде DMEM/F12, содержащей сыворотку, в течение 24 часов. После этой обработки следовала повторная обработка этими соединениями селена в присутствии или в отсутствие инсулина (10 и 100 нМ) или только инсулином в течение 6 часов. Кроме того, проходящий в клетку цАМФ, 8-СРТ и Dex также добавляли к некоторым гепатоцитам, предварительно обработанным контролем, в течение 6 часов, чтобы подтвердить, функционируют ли первичные гепатоциты мыши в ответ на эти хорошо известные стимуляторы продуцирования глюкозы в клетках печени. После описанной выше обработки среды для культивирования клеток собирали для анализа на глюкозу и токсикологического анализа (посредством измерения уровней ЛДГ). Прикрепленные клетки подвергали анализу белков, чтобы определить уровни белка в каждой лунке, отражающие общее количество клеток в образце. Затем уровни глюкозы, полученные в культуральной среде, нормализовали по уровням белка в каждом образце. Данные представлены как среднее значение ± CO 4 образцов. На фиг. 9, * P<0,05 в сравнении с группой обработки носителем (первый столбец на гистограммах). На фиг. 9C значительного увеличения во всех группах обработки относительно группы обработки контролем не выявлено (первый столбец на гистограмме).

Как показано на фиг. 9A, обработка 8-CPT/Dex вызывала значительное увеличение продуцирования глюкозы в первичных гепатоцитах, что указывает, что эти первичные гепатоциты биологически функционировали даже после обработки, перемещения и культивирования в течение 5 дней с момента их первоначального выделения из печени мышей. Для дальнейшего подтверждения этого открытия, обработка одним инсулином в дозировках 10 нМ и 100 нМ вызывала значительное снижение продуцирования глюкозы (примерно на 25-30% по сравнению с контрольной группой, обработанной водой; см. фиг. 9A).

Еще более важно, что обработка соединениями CDE в обеих дозировках (150 ppb и 300 ppb) значительно снижала продуцирование глюкозы примерно на 20-28% по сравнению с контрольной группой, обработанной водой (см. фиг. 9A). Совместная обработка соединениями CDE с инсулином также значительно ингибировала продуцирование глюкозы примерно на 32-38% для протестированной обработки в сравнении с контрольной группой (см. фиг. 9A).

Следует подчеркнуть, что степень снижения продуцирования глюкозы соединениями CDE при обеих тестируемых дозировках была сравнима с инсулином (10 или 100 нм), из чего можно предположить, что соединения CDE в тестируемых дозировках столь же эффективны, как и инсулин в концентрации 100 нмоль, для ингибирования продуцирования глюкозы. Наши данные также свидетельствуют о том, что максимально достижимое снижение продуцирования глюкозы инсулином, соединениями CDE или обоими в этих гепатоцитах составляло примерно 20-38%. Независимо от этого, наши данные показывают, что соединения CDE могут имитировать инсулин для ингибирования продуцирования глюкозы в первичных гепатоцитах мышей.

G6pc имеет важное значение для продуцирования глюкозы в печени. Таким образом, мы исследовали экспрессию G6pc в той же партии гепатоцитов после тех же обработок. Вкратце, двойной набор первичных гепатоцитов предварительно обрабатывали контролем (водой) или соединениями селена CDE в дозировках 150 и 300 ppb в среде DMEM/F12, содержащей сыворотку, а затем повторно обрабатывали этими соединениями селена в присутствии или в отсутствие инсулина (10 и 100 нМ) в течение 6 часов. После этих обработок гепатоциты собирали и подвергали выделению РНК с последующим анализом G6pc и Actb посредством количественной ПЦР в реальном времени.

Как показано на фиг. 9B, инсулин отдельно или в присутствии обеих дозировок соединений CDE значительно ингибировал экспрессию G6pc. Соединения CDE при 150 ppb также вызывали снижение экспрессии G6pc (снижение примерно на 31%, фиг. 9B), хотя оно не было статистически значимым, вероятно, из-за ограниченного количества образцов. Тем не менее, наблюдалось значительное снижение (снижение на 42%) уровней мРНК G6pc в гепатоцитах после обработки отдельно соединениями CDE при 300 ppb (фиг. 9B). Эти результаты показывают, что соединения CDE также могут имитировать инсулин, хотя и немного менее эффективно, чем инсулин в дозировке 100 нМ, чтобы ингибировать экспрессию G6pc в первичных гепатоцитах мышей. Эти данные согласуются с ингибированием экспрессии G6pc в клетках AML12 (фиг. 3) и снижением продуцирования глюкозы посредством соединений CDE в первичных гепатоцитах мышей, описанных выше (рис. 9A).

Лактатдегидрогеназу (ЛДГ) широко применяют в разработке лекарственных средств для изучения токсичности соединения в клетках печени. Повышение уровня ЛДГ в культуральной среде (после нормализации по уровню белка в культивируемых клетках) посредством обработки соединением позволяет предположить, что соединение будет токсичным по отношению к клеткам печени, поскольку повреждение клеток или вытекание через клеточную мембрану высвобождает цитозольную ЛДГ в культуральную среду. Чтобы исследовать, являются ли соединения CDE токсичными для первичных гепатоцитов мышей и вызвано ли наблюдаемое уменьшение продуцирования глюкозы и экспрессии G6pc соединениями CDE (фиг. 9А и 9Б) их токсичностью, исследовали уровни ЛДГ в среде первичных гепатоцитов мышей после обработки соединениями CDE, как это описано в приведенном выше анализе глюкозы.

Вкратце, первичные гепатоциты мышей предварительно обрабатывали контролем (водой) или соединениями селена CDE в дозировках 150 и 300 ppb в содержащей сыворотку среде DMEM/F12, после чего повторно обрабатывали этими соединениями селена в присутствии или в отсутствие инсулина (10 и 100 нМ) в течение 6 часов. Среду для культивирования клеток затем собирали для токсикологического анализа ЛДГ, и прикрепленные клетки подвергали анализу белка для определения содержания белка в каждой из них. Уровень ЛДГ, полученный в культуральной среде, нормализовали по уровню белка в каждом образце.

Как показано на фиг. 9C, обработка соединениями CDE, инсулином или обоими не приводила к значительному увеличению уровней ЛДГ в среде. Вместо этого, оказалось, что уровни ЛДГ в гепатоцитах незначительно снизились после обработки соединениями CDE в дозировке 300 ppb либо в присутствии или в отсутствие инсулина, указывая, что соединения CDE в более высокой дозе даже могут обеспечивать защитный эффект против повреждения клеток.

Таким образом, эти результаты показывают, что соединения CDE не являются токсичными для первичных гепатоцитов мышей, что согласуется с нетоксичным действием соединений CDE на жизнеспособность клеток AML-12 (фиг. 1). Кроме того, эти результаты также исключают возможность того, что выше наблюдаемое снижение продуцирования глюкозы и экспрессии G6pc (фиг. 9A и 9B) вызвано менее здоровыми гепатоцитами в первичных гепатоцитах мышей после обработки соединениями CDE.

В совокупности вышеуказанные исследования показывают, что соединения CDE могут имитировать инсулин для ингибирования экспрессии G6pc и, что более важно, продуцирования глюкозы в первичных гепатоцитах мышей, не будучи токсичным для клеток. Эти результаты согласуются с инсулинонезависимым ингибированием экспрессии G6pc и отсутствием токсичности относительно выживаемости клеток, наблюдаемой в стабильных клетках печени мышей AML-12 (фиг. 1 и фиг. 3).

Ингибирование продуцирования глюкозы и экспрессии G6pc и усиление действия инсулина в этих способах в первичных гепатоцитах мышей в смоделированных условиях диабета (смоделированных посредством 8-СРТ и Dex) посредством соединений CDE

Исследования, описанные в настоящем документе, показывают, что соединения CDE в комбинации могут имитировать инсулин для ингибирования экспрессии G6pc и улучшать действие инсулина в клетках AML-12 при стимуляции 8-CPT/Dex (фиг. 4). Для дальнейшего изучения влияния соединений CDE, изучали продуцирование глюкозы и экспрессию мРНК G6pc в первичных гепатоцитах мышей, совместно обработанных цАМФ и Dex, двумя хорошо известными стимуляторами продуцирования глюкозы и экспрессии G6pc в печени.

Вкратце, первичные гепатоциты мышей предварительно обрабатывали контролем (водой) или 150 или 300 ppb комбинации соединений CDE в 10% FBS DMEM/F12 среде в течение 24 часов, после чего повторно обрабатывали этими соединениями селена в присутствии или в отсутствие 10 или 100 нм инсулина, 0,1 мМ 8-СРТ и 0,5 мкМ Dex в бессывороточной среде в течение 6 часов. После этих обработок культуральные среды собирали для анализов на глюкозу и ЛДГ, как описано ранее. Также двойной набор первичных гепатоцитов мышей (из одной и той же партии гепатоцитов) после одной и той же обработки, как описано выше, подвергали анализу экспрессии G6pc посредством количественной ПЦР в реальном времени. Данные представлены как среднее значение ± CO 3-4 образцов. На фиг. 10A-10B, разные буквы (a против b, a' против b' против c', aʺ против bʺ против cʺ) означают существенное различие между этими двумя группами. На фиг. 10C, * P<0,05 относительно группы обработки носителем (первый столбец на гистограмме).

Как показано на фиг. 10A, обработка посредством 8-CPT/Dex вызывала значительное увеличение продуцирования глюкозы по сравнению с контролем только в группе обработки. Эти данные показали, что культивируемые первичные гепатоциты мышей функционировали. Обработка обеими дозировками инсулина значительно снижала 8-СРТ/Dex-индуцированное продуцирование глюкозы в гепатоцитах по сравнению с группой 8-CPT/Dex (см. фиг. 10A). Важно отметить, что обработка соединениями CDE в дозировке 150 ppb имеет тенденцию к ингибированию 8-СРТ/Dex-стимулированного продуцирования глюкозы в гепатоцитах. Более существенно, соединения CDE в дозировке 300 ppb значительно ингибировали 8-СРТ/Dex-стимулированное продуцирование глюкозы в гепатоцитах, и степень снижения уровня продуцирования глюкозы была почти идентична воздействию 100 нМ инсулина. Эти результаты свидетельствуют о том, что соединения CDE при 300 ppb являются столь же эффективными, как и инсулин в концентрации 100 нМ для ингибирования продуцирования глюкозы в первичных гепатоцитах даже в условиях, аналогичных диабетическому состоянию. Эти результаты согласуются с результатами, наблюдаемыми для первичных гепатоцитов мышей, не обработанных совместно 8-CPT/Dex (фиг. 9A), далее позволяя предположить, что соединения CDE в комбинации будут имитировать инсулин, но инсулинонезависимым образом, чтобы ингибировать продуцирование глюкозы.

Кроме того, соединения CDE в обеих тестируемых дозировках в комбинации с 10 нМ или 100 нМ инсулина не только значительно ингибировали 8-CPT/Dex-индуцированное продуцирование глюкозы в первичных гепатоцитах мышей по сравнению с группой обработки 8-CPT/Dex, но также показали более высокую эффективность в способе, чем отдельно соединения CDE или инсулин в тестируемых дозировках (фиг. 10A). Например, степень снижения 8-СРТ/Dex-индуцированного продуцирования глюкозы в гепатоцитах после обработки комбинацией 150 ppb соединений CDE и 10 нМ инсулина была более выраженной, чем после обработки только 150 ppb соединений CDE или 10 нМ инсулина. Более очевидно, продуцирование глюкозы дополнительно снижалось в гепатоцитах после обработки посредством 300 ppb соединений CDE и 100 нМ инсулина (снижение до уровня ниже группы клеток, обработанной контролем), даже если отдельно соединения CDE при 300 ppb или 100 нМ инсулина были очень эффективны в ингибировании 8-CPT/Dex-индуцированного продуцирования глюкозы (фиг. 10A). Комбинации 10 нМ инсулина и соединений CDE при 150 ppb или 300 ppb и комбинация 100 нМ инсулина и соединений CDE при 150 ppb почти полностью ингибировали 8-CPT/Dex-индуцированное продуцирование глюкозы (снижение до уровня, близкого к уровням контрольных клеток без обработки 8-CPT/Dex). Эти результаты показывают, что соединения CDE могут или заменять или улучшать действие инсулина для ингибирования 8-СРТ/Dex-индуцированного продуцирования глюкозы в первичных гепатоцитах мышей.

Как было описано ранее, было обнаружено, что соединения CDE в комбинации могут имитировать инсулин для ингибирования 8-СРТ/Dex-индуцированной экспрессии G6pc и улучшать действие инсулина в способе в клетках AML-12 (см. фиг. 4). Ингибирование экспрессии G6pc может приводить к ингибированию продуцирования глюкозы в первичных гепатоцитах мышей. Таким образом, гепатоциты мышей предварительно обрабатывали водой (контроль) или 150 или 300 ppb комбинации соединений CDE в 10% FBS DMEM/F12 среде в течение 24 часов, после чего повторно обрабатывали этими соединениями селена в присутствии или в отсутствие 10 или 100 нм инсулина, 0,1 мМ 8-СРТ и 0,5 мкМ Dex в бессывороточной среде в течение 6 часов. После этих обработок клетки собирали и подвергали анализу экспрессии G6pc посредством количественной ПЦР в реальном времени.

Как показано на фиг. 10B, 8-CPT/Dex вызывали значительное увеличение (примерно 130-кратное увеличение) экспрессии мРНК G6pc. Эти данные дополнительно подтверждают, что гепатоциты функционировали надлежащим образом. Обработка обеими дозировками инсулина значительно снижала 8-СРТ/Dex-индуцированную экспрессию G6pc в первичных гепатоцитах мышей по сравнению с группой 8-CPT/Dex (по сравнению с 8-CPT/Dex группой на гистограмме на фиг. 10B). Аналогично вышеуказанным исследованиям глюкозы, обработка соединениями CDE в дозировке 150 ppb показала тенденцию, хотя и недостоверную, к ингибированию 8-СРТ/Dex-стимулированной G6pc в гепатоцитах (см. фиг. 10B). Тем не менее, соединения CDE в дозировке 300 ppb значительно ингибировали 8-CPT/Dex-индуцированную экспрессию мРНК G6pc, но это не было столь же сильным, как при тестируемых дозировках инсулина (см. фиг. 10B). Эти результаты ясно показывают, что соединения могут ингибировать 8-СРТ/Dex-индуцированную экспрессию G6pc инсулинонезависимым способом, аналогично результатам, полученным для клеток AML-12 (фиг. 4).

Обработка соединениями CDE при 300 ppb в комбинации с 10 нМ или 100 нМ инсулина дополнительно значительно ингибировала 8-CPT/Dex-стимулированную экспрессию G6pc в гепатоцитах при сравнении с обработкой 10 или 100 нм инсулина или 300 ppb соединений CDE. Эти результаты показаны на фиг. 10B символом a' против b' или aʺ против bʺ на гистограмме. Эти результаты указывают на то, что комбинация инсулина и соединений CDE при 300 ppb была еще более эффективной в ингибировании повышенной экспрессии G6pc посредством 8-CPT/Dex.

Приведенные выше исследования показывают, что соединения CDE, особенно в дозировке 300 ppb, могут имитировать инсулин, хотя и менее эффективно, чем инсулин, для ингибирования CPT/Dex-индуцированной экспрессии G6pc, и улучшать действие инсулина в способе в первичных гепатоцитах мышей. Эти результаты частично согласуются с результатами, наблюдаемыми в клетках AML-12 (фиг. 4). Так как G6pc необходима для продуцирования глюкозы, вышеуказанное наблюдаемое ингибирование 8-CPT/Dex-стимулированного продуцирования глюкозы соединениями CDE (фиг. 10A) по меньшей мере частично обеспечено понижающей регуляцией экспрессии G6pc в первичных гепатоцитах мышей (фиг. 10B).

Уровни ЛДГ в культуральной среде вышеуказанных обработанных гепатоцитов исследовали, чтобы дополнительно изучить, являются ли соединения CDE токсичными для первичных гепатоцитов, культивируемых в присутствии 8-CPT/Dex, и обеспечено ли наблюдаемое выше снижение продуцирования глюкозы и экспрессии G6pc соединениями CDE (фиг. 10A-B) потенциальной токсичностью (что показывали повышенные уровни ЛДГ в среде) соединений CDE в гепатоцитах.

Как показано на фиг. 10C, обработки 8-CPT/Dex или в отсутствии или в присутствии инсулина слегка повышали уровни ЛДГ по сравнению с контролем носителем. Тем не менее, значительного повышения уровней ЛДГ в гепатоцитах после обработки 8-CPT/Dex совместно с соединениями CDE в обеих тестируемых дозировках в отсутствие или в присутствии инсулина (см. фиг. 10C) не наблюдали. Кроме того, немного повышенных уровней ЛДГ в гепатоцитах после обработки посредством 8-CPT/Dex и инсулином не наблюдали при совместной обработке соединениями CDE в обеих тестируемых дозировках (см. 10C).

Эти результаты дополнительно показывают, что соединения CDE не являются токсичными для первичных гепатоцитов, культивируемых в присутствии 8-CPT/Dex. Кроме того, эти результаты исключают возможность того, что наблюдаемое выше снижение 8-CPT/Dex-стимулированного продуцирования глюкозы и экспрессии G6pc (см. фиг. 10A и 10B) вызвано менее здоровыми гепатоцитами среди первичных гепатоцитов мышей после обработки соединениями CDE.

Таким образом, приведенные выше исследования показывают, что соединения CDE могут имитировать инсулин для ингибирования продуцирования глюкозы и экспрессии G6pc и усиливать действие инсулина в этих способах, не будучи токсичными, в первичных гепатоцитах мышей даже в условиях, аналогичных диабетическому состоянию (стимулированному посредством 8-CPT/Dex).

Ингибирование продуцирования глюкозы соединениями CDE (описанными выше) характеризовали в первичных гепатоцитах мышей, предварительно обработанных соединениями согласно настоящему изобретению в содержащей сыворотку среде. Для дальнейшего подтверждения того, что соединения CDE могут имитировать инсулин для ингибирования продуцирования глюкозы независимым от инсулина и другого фактора роста образом, выбирали условия культивирования при полном отсутствии сыворотки, чтобы удалить любые возможные следы инсулина или других факторов роста в FBS. Изучали действие соединений CDE на продуцирование глюкозы, а также их потенциальный токсический эффект (т.е. уровень ЛДГ в культуральной среде) в первичных гепатоцитах мышей, культивированных в бессывороточных условиях.

Вкратце, первичные гепатоциты мышей помещали в условия недостатка сыворотки в течение ночи. Затем клетки обрабатывали контролем (водой) или 150 ppb или 300 ppb соединений CDE в присутствии или в отсутствие инсулина, 8-СРТ и Dex в полностью не содержащей сыворотки среде в течение короткого периода времени (например, 6 часов). Затем среду собирали и подвергали анализу на глюкозу и ЛДГ, и культивируемые клетки подвергали анализу белков для нормализации продуцирования глюкозы и уровня ЛДГ. Данные представлены как среднее значение ± CO 3 образцов. На фиг. 11A, ^# P<0,05 по сравнению с основной контрольной группой (первый столбец на гистограмме) и * P<0,05 по сравнению с группой, обработанной 8-CPT/Dex (первый закрашенный столбец на гистограмме).

Исследовали действие соединений CDE на продуцирование глюкозы в гепатоцитах мышей без совместной обработки 8-CPT/Dex (см. фиг. 11). Как показано на фиг. 11A, обработка только инсулином в обеих дозировках значительно ингибировала продуцирование глюкозы примерно на 40-47% в первичных гепатоцитах мышей. Эти результаты указывают на то, что эта партия первичных гепатоцитов мышей биологически функционировала.

Еще более важно, обработка соединениями CDE при 150 ppb вызывала значительное снижение продуцирования глюкозы в первичных гепатоцитах мышей так же эффективно, как 100 нМ инсулина, в то время как соединения CDE при 300 ppb были еще более эффективными, чем 100 нМ инсулина в ингибировании продуцирования глюкозы (см. фиг. 11A). Совместная обработка и соединениями CDE и инсулином также значительно ингибировала продуцирование глюкозы, хотя аддитивное или синергическое действие между инсулином и соединениями CDE в этих первичных гепатоцитах отсутствовало. Эти результаты согласуются с результатами, полученными на гепатоцитах, предварительно обработанных соединениями CDE в FBS-содержащей среде (см. фиг. 9A). В совокупности эти результаты четко показывают, что соединения CDE могут имитировать инсулин так же эффективно и даже более эффективно, чем инсулин в концентрации 100 нМ, чтобы ингибировать продуцирование глюкозы независимым от инсулина или фактора способом. Также можно сделать вывод о том, что соединения CDE эффективны при ингибировании продуцирования глюкозы в первичных гепатоцитах мышей после относительно короткого времени обработки (например, 6 часов), подобно инсулину.

Соединения CDE также тестировали, чтобы увидеть, ингибировалось ли 8-CPT/Dex-стимулированное продуцирование глюкозы в гепатоцитах мыши в условиях культивирования без сыворотки. Как показано на фиг. 11A, обработка посредством 8-CPT/Dex вызывала значительное увеличение продуцирования глюкозы по сравнению с основной контрольной группой (обработанной носителем), что говорит о том, что эта партия первичных гепатоцитов мышей биологически функционировала. Обработка посредством 10 нМ инсулина значительно ингибировала продуцирование глюкозы, хотя в данном случае наблюдали только тенденцию снижения продуцирования глюкозы в гепатоцитах после обработки посредством 100 нМ инсулина. Последний результат может быть связан с небольшим числом тестируемых образцов (n=3), в которых продуцирование глюкозы в одном образце было довольно большим по сравнению с другими двумя образцами в той же группе (данные не показаны).

Более важно, обработка соединениями CDE при 150 ppb показала тенденцию к ингибированию 8-СРТ/Dex-стимулированного продуцирования глюкозы, в то время как соединения CDE при концентрации 300 ppb были столь же эффективными, как и инсулин при 10 нМ, чтобы значительно ингибировать 8-СРТ/Dex-стимулированное продуцирование глюкозы независимым от инсулина или другого фактора роста способом (фиг. 11A). Следует отметить, что соединения CDE в концентрации 300 ppb почти полностью устранили стимулирующее действие 8-CPT/Dex, так как уровень глюкозы в этой группе обработки был сравним с основной контрольной группой без стимулирования посредством 8-CPT/Dex.

Аналогичным образом, совместная обработка и соединениями CDE и инсулином также значительно ингибировала 8-СРТ/Dex-стимулированное продуцирование глюкозы (см. фиг. 11A). Кроме того, наблюдали более выраженное снижение 8-CPT/Dex-стимулированного продуцирования глюкозы комбинацией 150 ppb соединений CDE и 100 нМ инсулина, чем посредством отдельно 150 ppb соединений CDE или 100 нМ инсулина. Эти результаты показывают, что в способе существует аддитивное действие между соединениями CDE и инсулином (фиг. 11A).

Действие соединений CDE для ингибирования 8-CPT/Dex-стимулированного продуцирования глюкозы в вышеуказанной бессывороточной культуре первичных гепатоцитов мышей согласуется с результатами, наблюдаемыми в гепатоцитах, предварительно обработанных соединениями CDE в среде, содержащей сыворотку (фиг. 10A). Так как гепатоциты испытывали недостаток сыворотки и были обработаны соединениями CDE в полностью бессывороточных условиях, эти данные четко показывают, что соединения CDE могут имитировать инсулин, по меньшей мере столь же эффективно, как 10 нМ инсулина, чтобы ингибировать 8-CPT/Dex-стимулированное продуцирование глюкозы независимым от инсулина и фактора роста образом. Кроме того, можно сделать вывод о том, что соединения, описанные в настоящем документе, действуют быстро после относительно короткого времени обработки, для ингибирования 8-CPT/Dex-стимулированного продуцирования глюкозы в этой бессывороточной культуре первичных гепатоцитов мышей, аналогично действию инсулина. В данном случае также существует аддитивное или синергическое действие между соединениями CDE и инсулином, по меньшей мере при дозировках 150 ppb соединений CDE и 100 нМ инсулина, на ингибирование 8-CPT/Dex-стимулированного продуцирования глюкозы в этой бессывороточной культуре первичных гепатоцитов мышей (см. фиг. 11A).

Наконец, соединения CDE тестировали, чтобы определить какую-либо токсичность по отношению к первичным гепатоцитам мышей, которые культивировали в бессывороточных условиях. Уровни ЛДГ в культуральной среде в первичных гепатоцитах мышей после изучения вышеуказанных способов обработки затем нормализовали по их уровням белка. Как показано на фиг. 11B, никакого существенного увеличения уровней ЛДГ в гепатоцитах после всех вышеперечисленных обработок по сравнению с основной контрольной группой, содержащей группу, обработанную носителем водой, обнаружено не было (т.е. первый столбец на фиг. 11B). Эти результаты показали, что не было никаких повреждений клеток или протечек клеточных мембран в гепатоцитах после воздействия соединений CDE. Вместо этого, наблюдалось значительное снижение уровня ЛДГ в гепатоцитах после обработки высокой дозировкой 300 ppb соединений CDE (см. фиг. 11B). Таким образом, результаты позволяют предположить, что соединения CDE не являются токсичными для первичных гепатоцитов и, вместо этого, в более высокой дозе могут иметь некоторый защитный эффект против протечки через клеточную мембрану в этих клетках. Кроме того, эти результаты исключают возможность того, что наблюдаемое выше ингибирование основного и 8-СРТ/Dex-стимулированного продуцирования глюкозы (см. фиг. 11A) вызвано менее здоровыми гепатоцитами в первичных гепатоцитах мышей после обработки соединениями CDE.

В заключение, упомянутые выше исследования на бессывороточной культуре первичных гепатоцитов мышей показывают, что соединения CDE могут имитировать инсулин, чтобы ингибировать основное и 8-CPT/Dex-стимулированное продуцирование глюкозы независимым от FBS, более конкретно от инсулина и фактора роста образом. Кроме того, эти результаты также предполагают, что соединения CDE не являются токсичными для клеток печени.

Соединения CDE: инсулинонезависимая активация PI3K/Pdk1/Akt передачи сигнала для увеличения Foxo1/3/4 фосфорилирования в первичных гепатоцитах мышей

Наши более ранние исследования на клетках AML-12 позволяют предположить, что соединения CDE могут имитировать инсулин для повышения Foxo3 и Foxo4 фосфорилирования, что приводит к ингибированию экспрессии G6pc для продуцирования глюкозы (фиг. 6-7). Хорошо известно, что инсулин быстро действует в клетках печени, чтобы активировать PI3K/PDK1/AKT передачу сигнала для инактивации транскрипционных факторов Foxo1, Foxo3 и Foxo4, которые очень быстро снижают продуцирование глюкозы.

Для дальнейшего исследования, будут ли соединения CDE имитировать инсулин, но действовать инсулинонезависимым образом, чтобы активировать Pdk1/Akt сигнальный путь для последующего повышения FOXO фосфорилирования для ингибирования продуцирования глюкозы, исследовали статус фосфорилирования этих сигнальных молекул, ключ для глюконеогенеза, в первичных гепатоцитах мышей в двух различных культурах/условиях обработки.

Соединения CDE направляют Foxo1/3/4 фосфорилирование в первичных гепатоцитах мышей, предварительно обработанных соединениями CDE в среде, содержащей сыворотку, в течение 24 часов с последующей обработкой в бессывороточной среде в течение 6 часов

Чтобы определить, может ли комбинация соединений CDE имитировать инсулин для регулирования PI3k/Pdk1/Akt/Foxo1/3/4 передачи сигналов, первичные гепатоциты мышей предварительно обрабатывали контролем (вода) или соединениями селена CDE в дозировках 150 и 300 ppb в среде DMEM/F12, содержащей сыворотку в течение 24 часов. После этой обработки осуществляли повторную обработку этими соединениями селена в среде, не содержащей сыворотку, в течение 6 часов. Предварительно обработанные контролем гепатоциты также инкубировали с 100 нМ инсулина в течение 6 часов. После этой обработки культуральную среду собраны для анализа на глюкозу и ЛДГ, как описано на фиг. 9. Клетки собирали и подвергали анализу белка, чтобы определить уровни общего белка для Вестерн-блот-анализа различных PI3k/Pdk1/Akt/Foxo1/3/4 сигнальных молекул. Уровни экспрессии белка этих сигнальных молекул нормализовали по уровням белков Actb и представляли как среднее значение ± CO по трем образцам на фиг. 12B-F. Разные буквы на гистограммах на фиг. 12B-F означают существенное различие между этими двумя группами (P<0,05).

Как показано на фигуре 12A, обработка инсулином вызывала значительное увеличение фосфорилированных форм Pdk1, Akt по остатку серина 473, Foxo1 по треонину 24 (pFoxo1T24), Foxo3 по треонину 32 (pFoxo3T32), но не Gsk3b по серину 9 (pGsk3bS9), в то время как уровни фосфорилированного Foxo4 по треонину 28 (pFoxo4T28) в этих клетках после обработки инсулином были едва детектируемыми. Эти результаты свидетельствуют о том, что инсулин может действительно регулировать PI3k/Pdk1/Akt сигналы, чтобы инактивировать Foxo1 и Foxo3 в этих гепатоцитах при описанных выше условиях эксперимента. Что еще более важно, уровни белка pPdk1, pAktS473, pFoxo1T24 и pFoxo3T32, но не pGsk3bS9, были заметно повышены в этих гепатоцитах после обработки обеими дозировками соединений CDE (фиг. 12A). Кроме того, уровни pFoxo4T28 также сильно увеличились в гепатоцитах после обработки соединениями CDE при 300 ppb (фиг. 12A).

Количественный анализ показал, что наблюдали примерно 1,5-кратное увеличение pPdk1, 2,2-3-кратное увеличение pAktS473, 3-4-кратное увеличение pFoxo1T24, примерно 3-х кратное увеличение pFoxo3T32, но не увеличение pGsk3bS9 в первичных гепатоцитах мышей, обработанных соединениями CDE (фиг. 12B-F). Повышенная экспрессия pFoxo3T32 и pFoxo4T28 соединениями CDE в первичных гепатоцитах мышей согласуется с нашим более ранним наблюдением в клетках AML-12 (фиг. 6-7), хотя увеличения pPdk1 и pAkt в клетках AML-12 при 6 часовой обработке соединениями CDE не наблюдалось (фиг. 6-7).

Повышенные уровни белка pPdk1 и pAktS473 в этих гепатоцитах, вызванные инсулином и соединениями CDE в обеих испытанных дозировках, показывали, что соединения CDE, как инсулин, могут активировать передачу сигналов Pdk1/Akt. Хотя степень увеличения фосфорилирования pAkt/Foxo1/3 соединениями CDE не была такой же сильной, как при 100 нМ инсулина, соединения CDE в обеих испытанных дозах были также эффективны, как 100 нМ инсулина для ингибирования продуцирования глюкозы в первичных гепатоцитах мышей в тех же экспериментальных условиях (фиг. 9A). Таким образом, оказалось, что приблизительно 3-4-кратного увеличения pFoxo1T24 и pFoxo3T32 соединениями CDE (фиг. 12D-E) было достаточно, чтобы инактивировать Foxo1 и Foxo3, что приводило к ингибированию экспрессии G6pc и продуцирования глюкозы в этих первичных гепатоцитах мышей. Наши результаты ясно показывают, что соединения CDE могут имитировать инсулин, чтобы активировать PI3K/Pdk1/Akt сигналы для повышения Foxo1/3/4 фосфорилирования в первичных гепатоцитах мышей при описанных выше условиях культивирования и обработки.

Соединения CDE быстро действуют для последовательной активации Pdk1/Akt передачи сигналов для увеличения Foxo1/3 фосфорилирования в первичных гепатоцитах мышей в бессывороточных условиях

Для дальнейшего исследования, могут ли соединения CDE имитировать инсулин, чтобы активировать передачу сигналов PI3K для увеличения Foxo1/3 фосфорилирования, проводили исследования динамики экспрессии этих сигнальных молекул в первичных гепатоцитах мышей в бессывороточных условиях. Вкратце, первичные гепатоциты мыши выдерживали, испытывая необходимость в сыворотке в течение ночи, и затем инкубировали с соединениями селена CDE в дозировке 300 ppb в бессывороточной DMEM/F12 среде в течение 0 минут, 5 минут, 30 минут, 1 час, 2 часов и 3 часов. После обработки гепатоциты собирали и подвергали Вестерн-блот-анализу.

Как показано на фиг. 13A-B, уровни фосфорилированного Pdk1, имели тенденцию к увеличению в такой бессывороточной культуре гепатоцитов через 5 минут после обработки соединениями CDE. После 30 минутной обработки соединениями CDE наблюдали сильное и значительное увеличение уровней pPdk1 в этих гепатоцитах (фиг. 13A-B). Эти результаты свидетельствуют о том, что соединения CDE могут быстро активировать передачу сигналов PI3k/Pdk1 в этих гепатоцитах. После активации Pdk1 наблюдали тенденцию к увеличению уровней pAktT308 в гепатоцитах через 30 минут обработки соединениями CDE и, что более важно, сильное и значительное увеличение pAktT308 после 1 часа обработки соединениями CDE (фиг. 13A, C). Эти результаты свидетельствуют о том, что соединения CDE могут впоследствии активировать Akt.

Уровни и pFoxo1T24 и pFoxo3T32, следующей цели активированной передачи сигнала PI3k/Pdk1/Akt, не были затронуты соединениями CDE в гепатоцитах до 30 минутной инкубации (фиг. 13А, D). При 1-часовой обработке соединениями CDE отмечали тенденцию к повышению фосфорилирования Foxo1 и Foxo3 в гепатоцитах (фиг. 13D). При 2-х и 3-х часовой обработке соединения CDE существенно повысили уровень фосфорилирования и Foxo1 и Foxo3 в этих первичных гепатоцитах мыши, культивируемых в бессывороточной условиях (фиг. 13A, D). Таким образом, наблюдали последовательную активацию Pdk1 и Akt с последующим увеличением фосфорилирования Foxo1 и Foxo3 соединениями CDE в этих гепатоцитах, и эти события происходят менее чем через два часа после обработки соединениями CDE очень похожим на действие инсулина образом. Принимая во внимание, что инсулин или факторы роста в простую среду DMEM/F12 и FBS в культуральную среду в этих экспериментах не добавляли, увеличение фосфорилирования Pdk1, Akt, Foxo1 и Foxo3 соединениями CDE в этих гепатоцитах не зависит от FBS, факторов роста или инсулина. Другими словами, соединения CDE могут обойти действие инсулина или факторов роста, чтобы быстро активировать передачу сигналов PI3k/Pdk1/Akt, а затем инактивировать Foxo1 и Foxo3 (увеличенное фосфорилирование Foxo1/3) в первичных гепатоцитах мышей.

Краткие выводы

Наши исследования показывают, что соединения CDE могут имитировать инсулин для ингибирования продуцирования глюкозы в первичных гепатоцитах мышей инсулинонезависимым способом, не будучи токсичными для клеток печени. Эти выводы были четко определены из исследований на первичных гепатоцитах мышей, которые культивировали при трех различных условиях. Во-первых, было обнаружено, что продуцирование глюкозы заметно снизилось за счет предварительной обработки соединениями CDE в среде, содержащей сыворотку, в течение 24 ч, после которой следовала повторная обработка этими соединениями в среде, не содержащей сыворотку, в течение 6 часов, с эффективностью, сравнимой с инсулином в дозировке 100 нМ (фиг. 9A). Далее, также было обнаружено, что продуцирование глюкозы значительно ингибировалось в первичных гепатоцитах мышей посредством предварительной обработки соединениями CDE в содержащей сыворотку среде в течение 24 ч, после которой следовала повторная обработка этими соединениями в бессывороточной среде в присутствии 8-CPT/Dex (стимулирование продуцирования глюкозы для имитирования диабетического состояния) в течение 6 часов, и что эффективность 300 ppb соединений CDE в способе была сравнима с инсулином в концентрации 100 нМ (фиг. 10A). Наконец, мы приняли методику культивирования без содержания сыворотки и показали, что соединения CDE могут имитировать инсулин для ингибирования и основного и 8-CPT/Dex-стимулированного продуцирования глюкозы независимым от FBS или, более конкретно, независимым от инсулина и фактора роста способом после короткого времени обработки (6-часовой обработки) (фиг. 11A). Также, эффективность соединений CDE в ингибировании продуцирования глюкозы была сравнима с инсулином по меньшей мере в дозировке 10 нМ (фиг. 11A). Кроме того, обработка соединениями CDE не оказывала токсического действия (например, элиситорной протечки через клеточную мембрану) на здоровье первичных гепатоцитов мышей, культивируемых в вышеописанных трех различных условиях, так как не было никакого существенного увеличения ЛДГ в культуральной среде после обработки соединениями CDE (фиг. 9C, 10C, 11B).

Сниженное продуцирование глюкозы, наблюдаемое в этих исследованиях, по меньшей мере частично обусловлено ингибированием экспрессии G6pc в первичных гепатоцитах мышей соединениями CDE. Было обнаружено, что соединения CDE при 300 ppb вызывали значительное снижение (снижение на 42%) уровня мРНК G6pc в гепатоцитах, в то время как тенденцию к снижению экспрессии G6pc (снижение примерно на 31%, хотя и не являющееся статистически значимыми) также наблюдали в гепатоцитах после обработки 150 ppb соединений CDE (фиг. 9B). Аналогичные результаты также были получены на первичных гепатоцитах мышей, стимулированных посредством 8-CPT/Dex (фиг. 10B). Таким образом, эти результаты четко показывают, что соединения CDE могут имитировать инсулин, чтобы ингибировать экспрессию G6pc в первичных гепатоцитах мышей даже в присутствии 8-CPT/Dex инсулинонезависимым образом. Эти результаты согласуются с результатами, наблюдаемыми на клетках AML-12 (фиг. 3-4).

Следует отметить, что степень снижения экспрессии G6pc соединениями CDE при более высокой тестируемой дозе была меньше, чем для инсулина (10 нМ), в первичных гепатоцитах мышей при двух описанных выше условиях культивирования (то есть, с применением или без совместной обработки посредством 8-CPT/Dex), в то время как соединения CDE были столь же эффективными, как и инсулин, по меньшей мере в дозировке 10 нМ для ингибирования основного и 8-СРТ/Dex-стимулированного продуцирования глюкозы в гепатоцитах (фиг. 9A, 10A, 11B). Таким образом, возможно, что помимо G6pc, соединения CDE могут регулировать другие молекулы, чтобы понизить уровень глюкозы в культуре гепатоцитов мыши. Независимо от этого, наши результаты позволяют предположить, что ингибирование продуцирования глюкозы в первичных гепатоцитах мышей соединениями CDE вызвано по меньшей мере частично ингибированием экспрессии G6pc.

Кроме того, результаты также показывают, что соединения CDE могут улучшить или усилить действие инсулина для ингибирования продуцирования глюкозы и экспрессии G6pc в первичных гепатоцитах мышей в смоделированных диабетических условиях (с применением 8-CPT/Dex) (фиг. 10A-B, 11A). Они поддерживаются следующими наблюдениями:

(1) более выраженное снижение 8-CPT/Dex-индуцированного продуцирования глюкозы в гепатоцитах с помощью комбинации 150 ppb соединений CDE и 10 нМ инсулина, чем только 150 ppb соединений CDE или 10 нМ инсулина (фиг. 10A.);

(2) дальнейшее снижение 8-СРТ/Dex-индуцированного продуцирования глюкозы в гепатоцитах с помощью комбинации 300 ppb соединений CDE и 100 нМ инсулина, чем отдельно 300 ppb соединений CDE или 100 нМ инсулина (фиг. 10A.);

(3) более выраженное снижение 8-СРТ/Dex-стимулированного продуцирования глюкозы с помощью комбинации 150 ppb соединений CDE и 10 нМ инсулина, чем только 150 ppb соединений CDE или 10 нМ инсулина в гепатоцитах в бессывороточных условиях (фиг. 11A); и

(4) более выраженное снижение 8-СРТ/Dex-индуцированной экспрессии G6pc комбинацией 300 ppb соединений CDE и инсулина (10 и 100 нМ), чем 300 ppb соединений CDE, 10 или 100 нМ инсулина отдельно (фиг. 10B).

Более выраженное ингибирование 8-СРТ/Dex-индуцированной экспрессии G6pc комбинацией соединений CDE и инсулина, чем отдельно соединениями CDE или только инсулином, также наблюдали в клетках AML-12 (фиг. 4). Вместе наши результаты показывают, что соединения CDE могут усиливать действие инсулина для ингибирования 8-CPT/Dex-индуцированного продуцирования глюкозы и экспрессии G6pc в первичных гепатоцитах мышей.

Более того, анализ сигнальных молекул показывает, что соединения CDE могут имитировать инсулин, чтобы быстро активировать PI3K/Pdk1/Akt передачу сигнала для увеличения фосфорилирования Foxo1, 3 и 4 в первичных гепатоцитах мышей. Вестерн-блот-анализ фосфорилированных белков этих молекул в гепатоцитах мышей, либо предварительно обработанных соединениями CDE в содержащей сыворотку среде в течение 24 часов с последующей повторной обработкой этими соединениями в среде, не содержащей сыворотку, в течение 6 часов (фиг. 12), либо обработанных этими соединениями в полностью бессывороточных условиях в течение короткого промежутка времени от 5 до 180 мин (фиг. 13), подтверждает этот вывод.

В клетках AML-12 мы также обнаружили, что соединения CDE могут нацеливаться на Foxo3/4 для повышения их фосфорилирования, хотя увеличенного фосфорилирования Pdk1 и Akt в клетках AML-12 в исследуемый период времени не наблюдалось (6 часов после обработки соединениями CDE) (фиг. 6-7). Последний результат может быть связан с потенциальной транзиторной активацией Pdk1/Akt соединениями CDE, которую можно наблюдать в более ранний момент времени (до 6 часов).

Несмотря на это, исследования на первичных гепатоцитах мышей ясно показывают, что соединения CDE могут обойти инсулин или любые факторы роста, чтобы быстро активировать PI3k/Pdk1/Akt передачу сигнала и повысить Foxo1/3/4 фосфорилирование. Так как FOXO белки, особенно Foxo1, в печени имеют важное значение для регуляции экспрессии G6pc и продуцирования глюкозы, ингибированное продуцирование глюкозы и экспрессия G6pc, наблюдаемые выше в первичных гепатоцитах мышей, соединениями CDE, скорее всего, вызваны инактивацией of Foxo1/3/4 в результате инсулинонезависимой активации Pdk1/Akt передачи сигнала и последовательного увеличения фосфорилирования Foxo1/3/4. Кроме того, улучшение действия инсулина в указанном выше способе, вероятно, также связано с аддитивным эффектом повышения Foxo1/3/4 фосфорилирования соединениями CDE и инсулином.

Вкратце, мы обнаружили комбинацию соединений селена, которая может обойти действие инсулина для ингибирования продуцирования глюкозы и экспрессии G6pc в первичных гепатоцитах мышей даже в присутствии диабетических стимуляторов для продуцирования глюкозы и не токсичную к клеткам печени. Кроме того, эта комбинация соединений, соединения CDE, может улучшить действие инсулина для дальнейшего ингибирования продуцирования глюкозы, вызванного диабетическими стимуляторами, и экспрессии G6pc в первичных гепатоцитах мышей. Кроме того, эта комбинация соединений может также имитировать, но обойти инсулин, чтобы быстро активировать PI3k/Pdk1/Akt передачу сигнала и впоследствии, повысить Foxo1/3/4 фосфорилирование в гепатоцитах. Таким образом, эту комбинацию соединений можно применять не только в качестве мощного инсулинозамещающего лекарственного средства, но и в качестве средства, усиливающего действие инсулина для лечения диабета обоих типов I и II. Соединения CDE в комбинации можно применять при лечении ожирения, обходя инсулин, чтобы уменьшить продуцирование глюкозы в печени посредством инсулинонезависимой инактивации Foxo1/3/4, ингибирования Foxo-опосредованной экспрессии G6pc и/или улучшения действия инсулина в этих процессах в печени, или вводить, чтобы предотвратить инсулинорезистентность клеток печени.

Пример 7: Снижение уровней глюкозы в потоке крови и улучшенная толерантность к глюкозе в ответ на комбинированную обработку соединениями CDE у инсулинорезистентных и диабетических мышей со спонтанной нулевой мутацией лептинового рецептора (Lepr) мышей

Материалы и способы

Соединения

Соединение C (5'-Метилселеноаденозин), соединение D (Se-Аденозил-L-гомоцистеин) и соединение E (Гамма-глутамил-метилселеноцистеин) синтезировали в химической лаборатории Alltech, Inc. Чистоту всех тестируемых соединений подтверждали ≥99%, что определяли посредством масс-спектрометрии.

Животные и обработка

Взрослых гетерозиготных диабетических мышей со спонтанной мутацией в Lepr^db/+ (мутация лептинового рецептора) (C57BL/6J штамм) приобретали в The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine), а затем скрещивали для получения гомозиготных Lepr^db/db мышей (определяли посредством генотипирования мышей). Проводили генотипирование мышей по материалу хвоста в период отъема от самки (на 21 день после рождения) согласно протоколу лаборатории The Jackson Laboratory. Этим Lepr^db/db мышам на 27 день после рождения внутрибрюшинно вводили физиологический раствор (0,09% NaCl) или соединения CDE. Соединения CDE включали соединение C, соединение D и соединение E в комбинации (5 мкг селена каждого соединения на килограмм массы тела эквивалентно 5 ppb каждого соединения селена на инъекцию), через день до возраста 3,5 месяцев, и затем подвергали анализам на глюкозу и толерантность к глюкозе. Массу тела вышеуказанных обработанных мышей записывали с применением весов каждую неделю, и любую видимую аномальную макроскопическую морфологию животных и поведение при движении контролировали ежедневно.

Дополнительных 5-недельных самцов мышей Lepr^db/db приобретали у лаборатории Jackson Laboratory, и им внутрибрюшинно ежедневно вводили физиологический раствор (0,09% NaCl) или соединения CDE. Соединения CDE включают соединение C, соединение D и соединение E в комбинации (5 мкг селена каждого соединения на килограмм массы тела, разведенные в стерильном физиологическом растворе), начиная с 38-го дня после рождения в течение 28 дней. Этот эксперимент был разработан, чтобы протестировать возможность применения этих соединений в качестве лечения острого сахарного диабета (у Lepr^db/db мышей возрастом >35 дней присутствует или будет в ближайшее время развиваться гипергликемия). Тестирование более молодых мышей, которым вводили инъекции в течение более длительного периода, было предназначено для оценки соединений скорее в качестве профилактического средства для преддиабетических субъектов или субъектов группы риска. Кроме того, массу тела вышеуказанных обработанных мышей записывали с применением весов каждую неделю, и любую видимую аномальную макроскопическую морфологию животных и поведение при движении контролировали ежедневно.

Анализ глюкозы в крови

После последней инъекции физиологического раствора или соединения CDE мышей не кормили в течение ночи. Затем собирали небольшую каплю крови от этих мышей, отрезая кончик хвоста мыши, и определяли уровень глюкозы в крови с помощью глюкометра с максимальными возможностями для измерения глюкозы 600 мг/дл.

Тест на толерантность к глюкозе и количественное определение площади под кривой (AUC)

Тесты на толерантность к глюкозе проводили, как описано ранее (Li et al., Int J Biol Sci 2008; 4:29-36). Вкратце, мышам Lepr^db/db, которых не кормили в течение ночи, после обработки физиологическим раствором или соединениями CDE внутрибрюшинно вводили 2 г/кг массы тела 20% D-глюкозы. Уровни глюкозы в крови в момент времени 0 (непосредственно перед введением глюкозы), 0,25, 0,5, 1 и 2 ч после инъекции глюкозы определяли с помощью глюкометра с максимальными возможностями для измерения глюкозы 600 мг/дл. Из-за этого, уровень глюкозы в крови более 600 мг/дл считали как 600 мг/дл в анализе наших данных. Количественное определение площади под кривой (AUC) для каждой мыши в приведенном выше анализе на глюкозу рассчитывали с применением Microsoft Excel.

Статистический анализ

Если это применимо, t-критерий Стьюдента применяли с целью определения статистической значимости разницы между группами, обработанными солевым раствором и соединениями CDE, с P величиной менее 0,05. Данные представляли как среднее значение ± CO указанного количества мышей на фигурах.

Результаты и обсуждение

Мыши Lepr^db/db лишены всех известных изоформ гена лептинового рецептора (Lepr). Эта гомозиготная мышиная модель представляет собой агрессивную мышиную модель диабета II типа с нарушенной толерантностью к глюкозе, сниженной чувствительностью к инсулину, гипергликемией и гиперинсулинемией. Эти мыши обнаруживают выраженное ожирение в возрасте около от 3-х до 4-недель, повышение уровня инсулина в плазме крови, начиная с 10 по 14 день, и гипергликемию (то есть, высокий уровень сахара в крови) в возрасте от 4 до восьми 8 (Coleman DL. 1978 Diabetologia 14:141-8).

Исследования на клетках AML-12 и первичных гепатоцитах мышей, описанные в настоящем документе, показывают, что соединения CDE могут имитировать инсулин, но обходить инсулин чтобы инактивировать Foxo1, Foxo3 и Foxo4 в клетках печени. Кроме того, соединения CDE могут ингибировать Foxo-опосредованную экспрессию G6pc для снижения продуцирования глюкозы, не будучи токсичными для этих клеток печени (фиг. 1-4, 6-7 и 9-13). Кроме того, эти исследования in vitro показывают, что соединения CDE могут улучшать действие инсулина для понижения продуцирования глюкозы и экспрессии G6pc в клетках печени в смоделированных диабетических условиях (фиг. 4, 10-11). Таким образом, модель мышей Lepr^db/db является идеальной моделью для изучения применения этой новой комбинации соединений для потенциального снижения уровня глюкозы в потоке крови и увеличения чувствительности к инсулину и толерантности к глюкозе против диабета.

Снижение уровня глюкозы в крови у мышей Lepr^db/db после введения соединений CDE до или после возникновения гипергликемии

Два режима введения соединений CDE были приняты для исследования потенциальной роли соединений CDE в предотвращении и лечении гипергликемии, как показано у мышей Lepr^db/db. Описанные в настоящем документе соединения исследовали, чтобы определить, обладают ли они каким-либо действием по предотвращению развития гипергликемии, которая развивается в возрасте от 4 до 8 недель у мышей Lepr^db/db. Мышам вводили обработку посредством внутрибрюшинной инъекции соединений CDE непосредственно перед возникновением гипергликемии.

Вкратце, молодым мышам Lepr^db/db в возрасте 27 дней внутрибрюшинно вводили соединения CDE (5 мкг селена каждого соединения на килограмм массы тела, что эквивалентно 5 ppb каждого соединения на инъекцию для каждой мыши) или физиологический раствор через день до достижения мышами возраста 3,5 месяцев. По окончанию обработки мышей не кормили в течение ночи и подвергали анализу на глюкозу. Массу тела этих обработанных мышей регистрировали с применением весов через день, чтобы проверить наличие эффекта от этих соединений по увеличению массы тела в течение периода обработки. Данные представлены как среднее значение ± CO из указанного количества мышей под гистограммой на фиг. 14A.

Было установлено, что обработка соединениями CDE не влияла на прирост массы тела у этих мутантных мышей (данные не показаны), что указывает, что соединения CDE вероятно обладают слабым или не обладают ингибирующим действием на аномально повышенный аппетит к потреблению пищи, обнаруженный у мышей Lepr^db/db. Кроме того, не было видимых различий в макроскопической морфологии животных и поведении при движении между обработанными солевым раствором (контроль) и обработанными соединениями CDE мышами Lepr^db/db в течение периода обработки (данные не показаны). Эти результаты указывают на то, что соединения CDE в тестируемых дозировках не имели никакого влияния на поведение или активность животных.

Тем не менее, обработка соединениями CDE вызывала значительное снижение, уменьшение примерно на 40% по сравнению с контрольной группой, уровня глюкозы в потоке крови мышей Lepr^db/db (см. фиг. 14A), даже несмотря на то, уровни глюкозы в крови у мышей Lepr^db/db, обработанных соединениями CDE, были все еще выше, чем у нормальных мышей дикого типа в эквивалентном возрасте (около 100 мг/дл, данные не показаны). Хотя соединения CDE в тестируемой дозировке не полностью предотвращали развитие гипергликемии у мышей Lepr^db/db, эти результаты четко показывают, что соединения CDE могут значительно снижать уровень глюкозы в крови у мышиной модели диабета типа II тяжелой степени, что указывает на потенциал соединений CDE для профилактики гипергликемии.

Для дальнейшего исследования роли соединений CDE в снижении выработки глюкозы у этих диабетических мышей Lepr^db/db, принимали другой режим введения, в котором соединения CDE вводили внутрибрюшинно после или во время возникновения гипергликемии у мышей Lepr^db/db, чтобы исследовать уровни глюкозы в крови у этих мышей. Вкратце, самцам мышей Lepr^db/db в возрасте 38 дней внутрибрюшинно вводили физиологический раствор или соединения CDE (5 мкг селена каждого соединения на килограмм массы тела) ежедневно в течение 28 дней. Массу тела мышей и любые аномальные морфологии или поведение при движении регистрировали или контролировали ежедневно.

После вышеуказанных процедур животных не кормили в течение ночи, и затем подвергали анализу на содержание глюкозы в крови. Аналогично вышеуказанным исследованиям на животных, обработка соединениями CDE не влияла на прирост массы тела, макроскопическую морфологию животных и поведение при движении у мышей Lepr^db/db в течение периода обработки (данные не показаны). Тем не менее, обработка соединениями CDE вызывала значительное снижение (снижение примерно на 25%) уровня глюкозы в крови у этих мышей Lepr^db/db по сравнению с мышами, которым вводили физиологический раствор (см. фиг. 14B). Эти исследования дополнительно демонстрируют, что соединения CDE могут снижать выработку глюкозы у этих мышей с диабетом типа II тяжелой степени, что указывает на потенциал соединений CDE для лечения гипергликемии.

В целом, эти результаты показывают, что соединения CDE могут понизить выработку глюкозы у мышей Lepr^db/db посредством внутрибрюшинной инъекции этих соединений как до, так и после или во время возникновения гипергликемии у этих мутантных животных.

Кроме того, никаких видимых морфологических изменений или изменений в поведении при движении у мышей Lepr^db/db после обработки этими соединениями при вышеуказанных описанных режимах инъекции обнаружено не было. На самом деле, рассматривали острое действие соединений CDE на здоровье животных у нормальных мышей дикого типа C57BL/6, но никаких наблюдений аномальных грубых морфологических нарушений и нарушений в поведении при движении в течение одной недели после внутрибрюшинного введения высокой дозы соединений CDE не произошло (500 мкг селена каждого соединения на килограмм массы тела, данные не показаны). Таким образом, соединения CDE вероятно обладают слабым или не обладают токсическим действием на этих мышей.

В совокупности эти результаты показывают, что соединения CDE могут значительно снизить уровни глюкозы в крови в мышиной модели агрессивного диабета типа II. Эти результаты указывают на потенциал соединений CDE и для предотвращения и для лечения гипергликемии у субъектов с диабетом.

Увеличенная толерантность к глюкозе у мышей с диабетом Lepr^db/db после введения соединений CDE до возникновения гипергликемии

Тестирование на толерантность к глюкозе выявляет аномалии в том, как организм перерабатывает глюкозу после возникновения высокого и быстро растущего уровня сахара в крови (например, обычно после еды). Инсулин играет важную роль не только в ингибировании продукции глюкозы в печени, но также в поглощении глюкозы, хранении и метаболизме в мышцах, печени и жировых клетках, приводя к более низким уровням глюкозы в крови.

Пациенты с сахарным диабетом имеют очень низкую толерантность к глюкозе из-за их неспособности вырабатывать инсулин или реагировать на инсулин эффективно для поддержания гомеостаза глюкозы. Исследования in vitro, описанные в настоящем документе, показывают, что соединения CDE не только могут имитировать инсулин, но также могут обойти инсулин и усилить действие инсулина для ингибирования продуцирования глюкозы и/или экспрессии G6pc, ключевого гена для продуцирования глюкозы в клетках печени (фиг. 2-4, 9-11). Мыши Lepr^db/db являются идеальной мышиной моделью для диабета типа II для изучения роли соединений CDE в поддержании гомеостаза глюкозы, принимая во внимание, что эти мутантные мыши проявляют нарушенную толерантность к глюкозе и резистентность к инсулину Таким образом, было исследовано влияние соединений CDE на улучшение толерантности к глюкозе у мышей Lepr^db/db после внутрибрюшинного введения соединений CDE мышам в возрасте от 27 дней до 3,5 месяцев.

Аналогично исследованиям, описанным выше, мышам Lepr^db/db в возрасте 27 дней внутрибрюшинно вводили физиологический раствор или соединения CDE в комбинации (5 мкг селена каждого соединения на килограмм массы тела эквивалентно 5 ppb каждого соединения на инъекцию для каждой мыши) через день до достижения мышами возраста 3,5 месяцев. В конце обработки этих мышей не кормили в течение ночи, посредством инъекции вводили глюкозу (2 г/кг массы тела) и измеряли уровень глюкозы в крови через 0,25 часа (15 минут), 0,5 часа (30 минут), 1 час (60 минут) и 2 часа (120 минут) после инъекции глюкозы. Уровень глюкозы в крови непосредственно перед инъекцией глюкозы (упоминаемый как нулевой момент времени) также регистрировали. Среднее значение ± CO. * На фиг. 15 указывает на то, что P обозначает по меньшей мере <0,05 при сравнении с группой, обработанной солевым раствором в тот же момент времени.

Как показано на фиг. 15A, значительное увеличение уровней глюкозы в крови наблюдали у обработанных солевым раствором мышей Lepr^db/db после инъекции глюкозы, начиная с 0,25 ч и при всех последующих тестируемых моментах времени. Как было указано, предел измерения глюкозы глюкометром, используемым для этих анализов, составлял 600 мг/дл. Таким образом, уровни глюкозы сверх этого предела все еще следовало регистрировать как 600 мг/дл. Причиной этого замечания является то, чтобы отметить, что измерения, в частности, для обработанных солевым раствором животных, могут также недооценивать истинную концентрацию глюкозы в крови.

У мышей Lepr^db/db, обработанных соединениями CDE, уровни глюкозы в крови были значительно ниже, чем у обработанных солевым раствором мышей до инъекции глюкозы. Подобно обработанным солевым раствором мышам, пять из шести испытуемых мышей, обработанных соединениями CDE, имели уровень глюкозы в крови около или выше, чем 600 мг/дл в течение 0,5 ч и 1 ч после инъекции глюкозы (см. фиг. 15A). Тем не менее, уровни глюкозы в крови у всех шести испытуемых Lepr^db/db мышей, обработанных соединениями CDE, были значительно ниже, чем у обработанных солевым раствором однопометных животных через 2 часа после инъекции глюкозы (см. фиг. 15A).

Количественный анализ площади под кривой (AUC) из приведенного графика, показанного на фиг. 15A, показывает, что существует также значительное снижение уровня глюкозы в крови во время испытанного периода времени после инъекции глюкозы у мышей Lepr^db/db, обработанных соединениями CDE, по сравнению с мышами, обработанными физиологическим раствором (см. фиг. 15B). Еще раз, однако, из-за предела измерения глюкометра, вполне вероятно, что это снижение было более резким, чем показано на фиг. 15B. Тем не менее, следует подчеркнуть, что снижение все еще значительно отличалось.

Было отмечено, что уровни глюкозы у мышей Lepr^db/db, обработанных соединениями CDE, через 2 часа после инъекции глюкозы были все еще выше, чем уровни глюкозы до инъекции глюкозы (см. фиг. 15a). Эти результаты свидетельствуют о том, что полное очищение от введенной глюкозы в потоке крови Lepr^db/db мышей соединениями CDE, вероятно, займет больше времени, чем период контроля в течение 2 часов, используемый в этом эксперименте.

Вкратце, вышеуказанные исследования показывают, что соединения CDE в изученной дозировке могут значительно повысить толерантность к глюкозе у мышей Lepr^db/db. Действие этих соединений, вероятно, опосредовано увеличением чувствительности к инсулину в клиренсе глюкозы в печени, а также других органах, таких как мышечная и жировая ткани.

Краткие выводы

Эти результаты впервые демонстрируют, что соединения CDE могут не только снижать уровни глюкозы натощак (фиг. 14), но также могут повысить толерантность к глюкозе (фиг. 15) у мышиной модели агрессивного диабета II типа. На основании обширной работы с клеточными культурами, вероятный механизм действия соединений CDE в этих животных представляет собой (1) обойти инсулин, чтобы инактивировать Foxo1, Foxo3, Foxo4, что приводит к снижению экспрессии G6pc и продуцирования глюкозы в клетках печени, как показано на первичных гепатоцитах мышей и клетках печени AML-12 (см. фиг. 2-4, 6-7, 9-13.); (2) улучшить чувствительность к инсулину путем ингибирования Foxo1, Foxo3, Рохо4-опосредованной экспрессии G6pc и продуцирования глюкозы в печени, на что также указывают исследования на культивированных клетках печени (фиг 4, 10-11.); и/или (3) усилить действие инсулина или обойти инсулин для повышения поглощения и/или метаболизма глюкозы в печени, мышцах и жировых клетках, как это было предложено на фиг. 15. Кроме того, улучшение чувствительности к инсулину может быть обусловлено увеличением экспрессии Insr и соединениями CDE, как показано в исследованиях на клетках печени мышей AML-12 (фиг. 5).

Независимо от этого, наши исследования показывают, что соединения CDE могут ингибировать выработку глюкозы и повышать толерантность к глюкозе у инсулинорезистентной мышиной модели диабета. Эти результаты свидетельствуют о том, что соединения CDE могут быть разработаны для лечения гипергликемии и нечувствительности к инсулину у пациентов с диабетом. Кроме того, соединения CDE также можно применять для предотвращения развития гипергликемии у субъектов с преддиабетом посредством их способности снижать выработку глюкозы в поток крови при введении до возникновения гипергликемии у пациентов с риском. Кроме того, соединения CDE также могут быть полезны для лечения ожирения из-за их способности к снижению уровня глюкозы в крови.

Все публикации и патенты, упомянутые в настоящей заявке, включены в настоящий документ посредством ссылки. Различные модификации и вариации описанных способов и композиций согласно настоящей заявке будут очевидны специалистам в данной области техники, не выходя за рамки объема и сущности настоящей заявки. Хотя настоящая заявка была описана в связи с конкретными предпочтительными вариантами реализации, следует понимать, что настоящая заявка, как заявлено, не должна быть чрезмерно ограничена такими определенными вариантами реализации. Действительно, различные модификации описанных способов реализации настоящей заявки, которые очевидны для специалистов в соответствующих областях, предназначены, чтобы находиться в пределах объема нижеследующей формулы изобретения.

1. Способ лечения диабета у субъекта, включающий:

введение композиции субъекту, при этом композиция содержит комбинацию 5’-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина и Гамма-глутамил-метилселеноцистеина и фармацевтически приемлемый носитель, при этом композиция содержит от 0,033% до 5% масс./об. указанной комбинации 5’-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина и Гамма-глутамил-метилселеноцистеина.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что композиция дополнительно содержит инсулин или его аналог или производное.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная композиция находится в высушенной или капсулированной форме.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный фармацевтически приемлемый носитель включает по меньшей мере одно из лактозы, глюкозы, сахарозы, кукурузного крахмала, картофельного крахмала, натрийкарбоксиметилцеллюлозы, этилцеллюлозы, ацетата целлюлозы, порошка трагакантовой камеди, солода, желатина, талька, масла какао, воска для изготовления суппозиториев, арахисового масла, хлопкового масла, сафлорового масла, кунжутного масла, оливкового масла, кукурузного масла, соевого масла, пропиленгликоля, глицерина, сорбитола, маннитола, полиэтиленгликоля, этилолеата, этиллаурата, агара, гидроксида магния, гидроксида алюминия, альгиновой кислоты, апирогенной воды, изотонического солевого раствора, раствора Рингера, этилового спирта и фосфатного буферного раствора.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная композиция содержит от 0,033% до 0,1% масс./об. указанной комбинации 5’-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина и Гамма-глутамил-метилселеноцистеина.

6. Композиция для лечения диабета, содержащая комбинацию 5’-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина и Гамма-глутамил-метилселеноцистеина и фармацевтически приемлемый носитель, при этом указанная композиция содержит от 0,033% до 5% масс./об. указанной комбинации 5’-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина и Гамма-глутамил-метилселеноцистеина .

7. Композиция по п. 6, отличающаяся тем, что указанная композиция находится в высушенной или капсулированной форме.

8. Композиция по п. 6, отличающаяся тем, что указанный фармацевтически приемлемый носитель включает по меньшей мере одно из лактозы, глюкозы, сахарозы, кукурузного крахмала, картофельного крахмала, натрийкарбоксиметилцеллюлозы, этилцеллюлозы, ацетата целлюлозы, порошка трагакантовой камеди, солода, желатина, талька, масла какао, воска для изготовления суппозиториев, арахисового масла, хлопкового масла, сафлорового масла, кунжутного масла, оливкового масла, кукурузного масла, соевого масла, пропиленгликоля, глицерина, сорбитола, маннитола, полиэтиленгликоля, этилолеата, этиллаурата, агара, гидроксида магния, гидроксида алюминия, альгиновой кислоты, апирогенной воды, изотонического солевого раствора, раствора Рингера, этилового спирта и фосфатного буферного раствора.

9. Композиция по п. 6, отличающаяся тем, что указанная композиция содержит от 0,033% до 0,1% масс./об. указанной комбинации 5’-Метилселеноаденозина, Se-Аденозил-L-гомоцистеина и Гамма-глутамил-метилселеноцистеина.

Изобретение относится к соединению формулы (I), которое представляет собой 5-этил-4-метил-N-[4-[(2S)морфолин-2-ил]фенил]-1Н-пиразол-3-карбоксамид, или к его фармацевтически приемлемой соли присоединения кислоты.

Азотсодержащее гетероциклическое ароматическое соединение, способ его получения, фармацевтическая композиция на его основе и его применение // 2729999

Изобретение относится к азотсодержащему ароматическому гетероциклическому соединению, представленному формулой I, или к его фармацевтически приемлемой соли. В формуле I кольцо Z представляет собой 5-6-членное гетероароматическое кольцо, содержащее 1-3 гетероатома, причем гетероатом представляет собой N или выбран из группы, состоящей из N и O, или группы, состоящей из N и S; кольцо Q представляет собой бензольное кольцо или 5-6-членное гетероароматическое кольцо; кольцо A представляет собой незамещенное бензольное кольцо или незамещенное 6-членное гетероароматическое кольцо; кольцо B представляет собой замещенное или незамещенное 5-6-членное гетероароматическое кольцо; при этом в определении кольца B замещенное или незамещенное 5-6-членное гетероароматическое кольцо представляет собой замещенное или незамещенное имидазольное кольцо, замещенное пиримидиновое кольцо, замещенное пиразиновое кольцо, замещенное или незамещенное пиразольное кольцо, замещенное или незамещенное триазольное кольцо или замещенное фурановое кольцо; Z1 представляет собой N или C; Z2 представляет собой S, O, N или CR2’; Z3 представляет собой S, N или CR3’; Z4 представляет собой N, NRa3 или CR4’; Z5 представляет собой N, CR5’ или одинарную связь; Y1 представляет собой S, N или CR4; Y2 представляет собой N, NR5y1, CR5 или одинарную связь; A1 представляет собой C, каждый из A3 и A4 независимо представляет собой N или C; A2 представляет собой N или CRa4; значения остальных радикалов указаны в формуле изобретения.

Мета-азациклические производные аминобензойной кислоты в качестве антагонистов пан-интегрина // 2729518

Изобретение относится к соединению формулы (I), в которой А представляет собой C-OH или N; R′ представляет собой водород или алкил(C1-8); и каждый из X и Y независимо представляет собой галоген, фторалкокси(С1-2), алкил(С1-2) или фторалкил(С1-2) при условии, что X и Y одновременно не представляют собой алкил(С1-2); или к фармацевтически приемлемой соли вышеуказанного соединения.

Препарат активатора глюкокиназы для перорального введения и способ его получения // 2728824

Группа изобретений относится к области фармацевтики и медицины. Первое изобретение - твердая дисперсия для лечения или предотвращения диабета I типа, диабета II типа, нарушения толерантности к глюкозе, нарушения гликемии натощак и гипергликемии, которая содержит полимерный носитель и активатор глюкокиназы HMS5552, его изотопно-меченые аналоги или фармацевтически приемлемые соли, Также группа изобретений относится к композиции, таблетке и капсуле, включающим указанную твердую дисперсию, и к применению указанных дисперсий, композиций, таблеток и капсул для получения лекарственного средства для лечения или предотвращения диабета I типа, диабета II типа, нарушения толерантности к глюкозе, нарушения гликемии натощак и гипергликемии.

Фармацевтическая композиция на основе действующего вещества, ингибитора дипептидилпептидазы-4, для предупреждения развития и лечения сахарного диабета 2 типа // 2727898

Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности, а именно к композициям, предназначенным для перорального приема, в целях предупреждения развития и лечения сахарного диабета 2 типа.

Виды комбинированной терапии для лечения рака // 2727474

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована для лечения рака. Для этого предложена комбинация соединений, описываемых структурными формулами II и IV, а также применения: соединения II одновременно или последовательно с соединением IV, соединения IV одновременно или последовательно с соединением II, и соединения I одновременно или последовательно с соединениями II и IV.

Селективные соединения пептида yy и их применения // 2726777

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к модифицированному производному пептиду YY (PYY), и может быть использовано в медицине. Соединение по настоящему изобретению представляет собой PYY с аминокислотными модификациями Lys7/10, Trp30 и Leu31 и, в дополнение к ним, Ile22 и/или Tyr28 относительно нативного белка, к которому по ε-аминогруппе Lys7/10 присоединена модифицирующая группа липидной природы.

Способ профилактики и снижения инсулинорезистентности у лабораторных животных // 2726315

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной эндокринологии, и касается профилактики или снижения инсулинорезистентности. Для этого лабораторным животным (крысам линии Wistar) вводят тритерпеноид растительного происхождения – милиацин в комплексе с раствором нейтральных жиров триацилглицеринов, содержащих 32% по массе олеиновой и 59% по массе линолевой кислот.

Производное бисамидов дикарбоновых кислот, его применение, фармацевтическая композиция на его основе, способы его получения // 2725881

Изобретение относится к производному бисамидов дикарбоновых кислот указанной ниже формулы 2 или его фармацевтически приемлемой соли, которые обладают способностью к комплексообразованию или хелатированию ионов металлов.

Производное бисамидов дикарбоновых кислот, его применение, фармацевтическая композиция на его основе, способы его получения // 2725770

Изобретение относится к производному бисамидов дикарбоновых кислот указанной ниже формулы 1, которое обладает способностью к комплексообразованию или хелатированию ионов металлов.

Способы пэгилирования по аминогруппе для получения сайт-специфичных конъюгатов белков // 2730848

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к способу получения конъюгата белок-полиэтиленгликоль. Способ включает в себя приготовление водного раствора белка, содержащего белок, буферный раствор, обеспечивающий нужный рН, и хелатирующий агент, где указанный белок является инсулином, указанный буферный раствор, обеспечивающий нужный рН, является ацетатным или цитратным, и указанный хелатирующий агент выбирают из группы, состоящей из аминополикарбоновой кислоты, гидроксиаминокарбоновой кислоты, N-замещенного глицина, 2-(2-aминo-2-oксоэтил)aминoэтансульфоновой кислоты (BES) и дефероксамина (DEF); добавление в водный белковый раствор борсодержащего восстанавливающего агента и метоксиполиэтиленгликоля альдегида, причем борсодержащий восстанавливающий агент и метоксиполиэтиленгликоля альдегид берут в молярном соотношении от 25:1 до 1,5:1; и взаимодействие метоксиполиэтиленгликоля альдегида и белка с образованием конъюгата белок-полиэтиленгликоль, причем буферный раствор в процессе реакции обеспечивает рН водного белкового раствора от 3,88 до 4,27, и в результате указанного взаимодействия метоксиполиэтиленгликоля альдегида с указанным белком образуется конъюгат ПЭГ и белка, пэгилированного в одном положении.