Способ определения концентрации клеток в суспензии микроводорослей

Авторы патента:

Трофимчук Оксана Анатольевна (RU)

Яговкин Александр Юрьевич (RU)

G01N33/48735 - Исследование или анализ материалов особыми способами, не отнесенными к предыдущим группам

G01N33/487 - жидких биологических материалов

G01N21/59 - коэффициент пропускания (G01N 21/25 имеет преимущество)

Владельцы патента RU 2732203:

федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Национальный исследовательский Томский политехнический университет» (RU)

Изобретение относится к области анализа материалов путем определения их физических свойств с помощью оптических средств. Способ определения концентрации клеток в суспензии микроводорослей включает пропускание через слой суспензии светового потока с длиной волны от 510 до 580 нм, фиксацию величины светового потока после прохождения этого слоя и определение концентрации клеток в суспензии микроводорослей по калибровочной кривой. При этом пропускают световой поток от помещенного в объем суспензии светодиода с максимальной длиной волны излучения 550 нм, фиксируют величину светового потока после прохождения слоя суспензии фотоприемником, расположенным в объеме суспензии на расстоянии 1 см от светодиода, измеряют напряжение, возникающее при попадании на фотоприемник светового потока, прошедшего через слой суспензии, и определяют концентрацию клеток в суспензии микроводорослей по калибровочной кривой, отображающей зависимость концентрации клеток от напряжения. Технический результат заключается в упрощении, в уменьшении продолжительности и снижении трудоемкости анализа. 1 табл., 1 ил.

Изобретение относится к области анализа материалов путем определения их физических свойств, в частности с помощью оптических средств с использованием видимых лучей и может быть использовано в биотехнологическом производстве для контроля процесса выращивания микроводорослей.

Известен способ определения концентрации клеток в суспензии микроорганизмов [1. Государственная Фармакопея Российской Федерации, XIII издание, М., 2015. –Т. 2. – С. 624-627], включающий подсчет клеток в 1 мл суспензии микроорганизмов под микроскопом с использованием счетной камеры Горяева. Микроскоп настраивают таким образом, чтобы была видна нанесенная на камеру сетка и клетки, равномерно распределенные на ней. Считают число клеток в 5 горизонтальных и 15 диагональных ячейках, после чего по формуле определяют число клеток в 1 мл исследуемой суспензии:

где x – число клеток в 1 мл исследуемой суспензии;

а – число клеток в 20 квадратах;

b – разведение исходной суспензии микроорганизма.

Недостатком данного способа является его невысокая точность и большая трудоемкость.

Известен способ оптической оценки концентрации микробных клеток в суспензии [2. RU 2636620 С1, МПК G01N33/483 (2006.01), опубл. 24.11.2017], включающий в себя определение значения волнового экспонента (n) для суспензии микроорганизмов в двух дисперсионных средах с различными показателями преломления, на основе полученных его значений вычисляют для данного штамма микроорганизмов в данных конкретных условиях показатель преломления бактерий (μ_b) и средний радиус (Rcp) микробных тел. Затем, применяя асимптотическое приближение, находят коэффициент светорассеяния (К_s), с использованием которого по измеренной оптической плотности суспензии определяют концентрацию микроорганизмов (N).

Недостатком этого способа является использование дорогостоящего оборудования, большое количество определяемых параметров и значительные трудозатраты.

Известен способ определения концентрации клеток в суспензии микроводорослей [3. WO 2015120144 А1, МПК G01N21/3577 (2014.01), G01N21/17 (2006.01), G01N21/27 (2006.01), опубл. 13.08.2015], выбранный в качестве прототипа, включающий использование первой платформы формирования изображения, содержащей первую оптическую опорную поверхность, и второй платформы формирования изображения, содержащей вторую оптическую опорную поверхность; позиционирование первой платформы формирования изображения и второй платформы формирования изображения относительно жидкого образца так, что первая оптическая опорная поверхность не погружена в жидкий образец, а вторая оптическая опорная поверхность погружена в жидкий образец; захват оптического сигнала от первой оптической опорной поверхности и второй оптической опорной поверхности; обработку оптического сигнала, чтобы определить первую зону анализа и вторую область анализа, в котором область первого анализа содержит часть первой оптической опорной поверхности, а область второго анализа содержит часть второй оптической опорной поверхности. Первая оптическая поверхность и вторая оптическая поверхность обладают высокой отражательной способностью, обращены в одном направлении, параллельны поверхности жидкого образца и находятся на разных глубинах в жидком образце. В качестве источника света, освещающего первую оптическую опорную поверхность и вторую оптическую базовую поверхность используют искусственный источник света, который излучает одну или несколько длин волн от 300 до 2500 нм. Используют камеру, которая одновременно захватывает изображение оптического сигнала от первой оптической опорной поверхности и второй оптической базовой поверхности.

В качестве показателя концентрации биомассы используют прямое измерение монохроматической оптической плотности на конкретной длине волны в спектрофотометре, значение которой коррелируется с концентрацией биомассы с использованием опубликованных калибровочных кривых. Однако точность указанных корреляций зависит от спецификаций измерения, таких как спектральная ширина полосы и угол приема измерительного прибора, а также спектральное распределение источника света. Кроме того, оптическая плотность образца зависит от местоположения образца.

Для анализа изображений культур водорослей используют специальный компьютерный код, где каждый пиксель цифрового изображения, полученного камерой, представлен цветным вектором [rP, gP, bp], что соответствует интенсивностям красного (от 560 до 700 нм), зеленого (от 490 до 590 нм) и синего 153 (от 410 до 500 нм) пикселей соответственно. Каждый элемент вектора имеет целочисленное значение от 0 до 255 включительно.

Спектральную характеристику обратного рассеянного света используют для диагностики культур, таких как количественное определение концентрации биомассы, обнаружение инвазивных видов и мониторинг здоровья культуры.

Получены корреляции между интенсивностью обратного рассеяния красного, зеленого и синего и концентрациями биомассы зеленой водоросли хлорелла.

Таким образом, для осуществления этого способа необходим мультиспектральный метод визуализации для мониторинга рассеянного света от водорослевых культур и сложный анализ полученных изображений и использованием вычислительного устройства, содержащего процессор и системную память.

Техническим результатом заявленного решения является создание простого способа определения концентрации клеток в суспензии микроводорослей.

Способ определения концентрации клеток в суспензии микроводорослей, также как в прототипе, включает пропускание светового потока через слой суспензии и фиксацию величины светового потока после прохождения этого слоя, причем через слой суспензии микроводорослей пропускают световой поток с длиной волны от 510 до 580 нм и определяют концентрацию клеток в суспензии по калибровочной кривой.

Согласно изобретению пропускают световой поток от помещенного в объем суспензии светодиода с максимальной длиной волны излучения 550 нм, фиксируют величину светового потока после прохождения слоя суспензии фотоприемником, расположенным в объеме суспензии на расстоянии 1 см от светодиода, измеряют напряжение, возникающее при попадании на фотоприемник светового потока, прошедшего через слой суспензии и определяют концентрацию клеток в суспензии микроводорослей по калибровочной кривой, отображающей зависимость концентрации клеток от напряжения.

Использование светового потока с длиной волны от 510 до 580 нм обусловлено тем, что все микроводоросли содержат пигмент хлорофилл, который в этой области не поглощает, поэтому при пропускании светового потока через слой суспензии микроводорослей он поглощается только органеллами клеток, и степень поглощения светового потока пропорциональна концентрации клеток микроводорослей.

По сравнению с прототипом предложенный способ прост в исполнении, продолжительность проведения анализов и его трудоемкость существенно уменьшена. Для выполнения одного анализа требуется не более 2 мин.

В таблице 1 представлены данные для построения калибровочной кривой, полученной при разбавлении суспензии микроводорослей с известной концентрацией клеток.

На фиг. 1 представлена зависимость концентрации клеток от напряжения на выходе фотоприемника.

Для осуществления способа использовали датчик, содержащий штангу, на которой закреплен фотоприемник, например, BPW 21 (OSRAM), с длиной волны в точке максимальной чувствительности 550 нм. На расстоянии 1 см от фотоприемника на штанге закреплен светодиод с максимальной длиной волны излучения 550 нм. Световой поток светодиода сфокусирован на окно фотоприемника. Выводы светодиода подключены к источнику постоянного тока 12 В. Выводы фотоприемника подключены к милливольтметру.

Перед началом измерений построили калибровочный график. Для этого в емкость, содержащую 1000 мл суспензии хлореллы, выращенной на питательной среде Тамия, с концентрацией клеток 52 млн кл/мл, определенной микроскопическим методом [1], поместили указанный датчик. Подавали напряжение питания на светодиод и регистрировали показание милливольтметра.

Затем последовательно осуществляли добавки питательной среды Тамия в начальный объем суспензии и регистрировали показания миливольтметра, которые представлены в таблице 1. Пересчитали концентрацию клеток в разбавленных объемах с учетом добавленных объемов и исходной концентрации. По полученным данным построили калибровочный график в единицах напряжение/концентрация (фиг. 1).

Для определения концентрации клеток в объем суспензии микроводорослей помещали датчик, подавали напряжение на светодиод и измеряли выходное напряжение фотоприемника. Например, если показания милливольтметра составили 490 мВ, то по калибровочному графику концентрация клеток в суспензии микроводорослей составляет 23 млн кл/мл.

Таблица 1

Добавка, питательной среды, л	Полученный объем суспензии, л	Расчетная концентрация клеток, млнкл	Показания милливольтметра, U, мВ
0	1	52	456
0,2	1,2	43,33	463
0,2	1,4	37,14	471
0,2	1,6	32,50	477
0,2	1,8	28,89	481
0,2	2	26,00	487
1	3	17,33	497
1	4	13,00	504
1	5	10,40	508

Способ определения концентрации клеток в суспензии микроводорослей, включающий пропускание через слой суспензии светового потока с длиной волны от 510 до 580 нм, фиксацию величины светового потока после прохождения этого слоя, определение концентрации клеток в суспензии микроводорослей по калибровочной кривой, отличающийся тем, что пропускают световой поток от помещенного в объем суспензии светодиода с максимальной длиной волны излучения 550 нм, фиксируют величину светового потока после прохождения слоя суспензии фотоприемником, расположенным в объеме суспензии на расстоянии 1 см от светодиода, измеряют напряжение, возникающее при попадании на фотоприемник светового потока, прошедшего через слой суспензии, и определяют концентрацию клеток в суспензии микроводорослей по калибровочной кривой, отображающей зависимость концентрации клеток от напряжения.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана библиотека, по существу состоящая из множества антигенсвязывающих молекул, отличающихся друг от друга последовательностью, где антигенсвязывающий домен в каждой из антигенсвязывающих молекул содержит по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от условий концентрации ионов.

Антитела против тау-белка и способы их применения // 2732122

Изобретение относится к области биохимии, в частности к выделенному антителу, которое специфично связывается с тау-белком человека, к способу его получения, а также к его применению для лечения заболевания, ассоциированного с тау-белком.

Способ прогнозирования исхода острого периода ишемического инсульта у больных сахарным диабетом 2 типа // 2731911

Изобретение относится к медицине, а именно неврологии, и может быть использовано для прогноза исхода острого периода ишемического инсульта у больных, страдающих сахарным диабетом 2 типа.

Тест-система для анализа функциональной активности антител против pd-1 и антител против pd-l1 // 2731896

Изобретение относится к области биотехнологии. Заявлена группа изобретений, включающая тест-систему для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1 (варианты), набор, содержащий вышеуказанную тест-систему, применение тест-системы для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, применение набора для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, способ анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1.

Устройство для измерения газа, встроенное в часы // 2731859

Устройство для измерения концентрации газа, входящего в состав окружающего воздуха, включает в себя наручные часы (13), содержащие часовой механизм, индикаторы (1, 3, 9) времени, видные через стекло корпуса (13) часов.

Способ повышения концентрации белка ирисина в плазме крови, в эксперименте // 2731815

Изобретение относится к медицине, а именно к нормальной физиологии, геронтологии, и может быть использовано для повышения концентрации белка ирисина в плазме крови, в эксперименте, заключающемся в физических тренировках.

Способ оценки степени влияния экспериментальной ишемии на нервную ткань головного мозга белых крыс при окрашивании препаратов гематоксилином и эозином // 2731649

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной нейроморфологии, и может быть использовано для оценки степени влияния экспериментальной ишемии на нервную ткань головного мозга белых крыс при окрашивании препаратов гематоксилином и эозином.

Электрод с поперечно-сшитым ферментом для непрерывного контроля аналита // 2731646

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен электрод для электрохимического сенсора, электрохимический сенсор для измерения концентрации аналита, способ изготовления электрода и способ измерения аналита в среде.

Способ комплексной оценки природных и антропогенных экосистем алмазодобывающих предприятий // 2731388

Изобретение относится к области охраны окружающей среды и может быть использовано для оценки экологического состояния природной и антропогенной экосистем. Способ комплексной оценки природных и антропогенных экосистем алмазодобывающих предприятий включает сбор информационных потоков, получаемых от различных источников проведения мониторинга окружающей среды мобильными и стационарными пунктами контроля, дистанционными методами зондирования Земли, съемками с беспилотных летательных аппаратов, лазерного сканирования, и передачу их в единый информационный Центр оценки и прогнозирования состояния природной и антропогенной экосистем (ЦОиППиАЭ) в режиме on-line на основе непрерывного и периодического обновления с применением современных программ статистической обработки и современных ГИС-технологий с последующей визуализацией в виде различных картографо-графических документов и формированием комплексной системы репрезентативных и специфических показателей для исследований и мониторингов, которые формируют на территории алмазодобывающего предприятия для кимберлитовой трубки, карьеров, выемки грунта, отвалов вскрышных и отработанных пород, отстойников, хвостохранилищ, территории растительности и водных объектов, отличается от прототипов тем, что обработка собранной комплексной информации осуществляется с использованием программных продуктов обработки «Big Data» в два этапа: 1) отбор статистически значимых показателей состояния компонентов природной и антропогенной экосистем по факторам воздействия на них алмазодобывающего предприятия; 2) построение байесовских сетей с учетом выбранных на момент статистической обработки информации, причем программные комплексы формируют базу актуализированных данных, отслеживают достоверность информации по оценке состояния природной и антропогенной экосистем с привязкой к реальному пространственно-временному положению всех факторов воздействия.

Способ динамического регулирования процесса производства термообработанного стального листа // 2731116

Изобретение относится к области металлургии. Для обеспечения равномерных механических свойств стального листа и повышения качества получают лист из стали с заданным химическим составом и микроструктурой mtarget, содержащей по меньшей мере одну фазу из феррита, мартенсита, бейнита, перлита, цементита и аустенита.

Способ оценки стабильности композиции на основе белка // 2732109

Группа изобретений относится к медицине и касается способа оценки стабильности композиции на основе белка, включающей белок, пептид и/или производное белка и буфер, по отношению к смазывающему веществу смазанного контейнера, который предназначен для хранения указанной композиции, включающего а) оценку уменьшения с течением времени межфазного натяжения между буфером и смазывающим веществом, б) оценку уменьшения с течением времени межфазного натяжения между композицией на основе белка и смазывающим веществом, в) определение по меньшей мере одного компонента композиции на основе белка, взаимодействующего со смазывающим веществом, посредством сравнения уменьшения, оцененного на стадии б), с уменьшением, оцененным на стадии а), г) на основании указанного определения по меньшей мере одного компонента, взаимодействующего со смазывающим веществом, определение риска нестабильности, связанного с буфером или белком, пептидом и/или производным белка, композиции на основе белка.