Способ оценки семян сои и кукурузы на наличие генно-инженерных трансформаций
Владельцы патента RU 2732914:
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Орловский государственный аграрный университет имени Н.В. Парахина" (RU)
Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии, а именно к способам идентификации ГМО. Определяют химотрипсинингибирующую активность (ХИА), трипсинингибирующую (ТИА) или гемагглютинирующую активность (ГАЕ), при этом если ХИА>ТИА или ГАЕ для семян сои больше 58 [мг/мл]-1, а для семян кукурузы больше 5 [мг/мл]-1, то семена генномодифицированные. Изобретение позволяет снизить время оценки до двух часов. 4 табл., 4 пр.
Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии, а именно к способам идентификации генно-инженерных трансформаций.
Известен список генномодифицированных семян растений и имеются наборы для выявления генно-инженерных модификаций в них. Значительная часть выполняемых операций и реакций является трудоемкой и затратной. Вместе с тем на сегодняшний день требуется быстро и дешево выявлять генные модификации в посевном материале и пищевой продукции.
В качестве метода определения генно-инженерных трансформаций известен метод идентификации и количественного определения новых линий ГМО (МУК 4.2.3309-15 Методы идентификации и количественного определения новых линий ГМО 2-го поколения в пищевых продуктах) [1].
Известен также ГОСТ на методы анализа для обнаружения ГМО (ГОСТ Р 53214-2008 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Общие требования и определения) [2].
Недостатком описанных выше методов является их высокая трудоемкость и высокая стоимость расходных материалов.
Задачей изобретения является снижение трудоемкости и стоимости расходных материалов при выявлении в семенах сельскохозяйственных культур сои и кукурузы генно-инженерных трансформаций.
Поставленная задача решается благодаря тому, что в известном способе оценки семян сои и кукурузы на наличие генно-инженерных трансформаций согласно изобретению, определяют химотрипсинингибирующую активность (ХИА), трипсинингибирующую (ТИА) или гемагглютинирующую активность (ГАЕ), при этом если ХИА>ТИА или ГАЕ для семян сои больше 58 [мг/мл]-1, а для семян кукурузы больше 5 [мг/мл]-1, то семена генномодифицированные.
Испытания проводили на 15-и сортах сои: 1 - Аннушка, 2 - Свапа, 3 - Хпп, 4 - Августа, 5 - Амандина, 6 - Абелина, 7 - Парадис, 8 - ПР 1134501, 9 - НС Катя, 10 - Пруденс, 11 - Максус, 12 - Оресса, 13 - Ланцетная, 14 - Красная мега, 15 - Линия ТГС-40-3-2; и 5-и сортах кукурузы: 1 - Pioner Hi-Bred ПР-РВ-511, 2 - Pioner, 3 - LG2195, 4 - Марлиз 470, 5 - Grizzly.
Показания химотрипсинингибирующей активности (ХИА), трипсинингибирующей (ТИА) и гемагглютинирующей активности (ГАЕ) измеряли в семенах сои и кукурузы.
Химотрипсинингибирующую и трипсинингибирующую активность определяли казеинолитическим методом М.Л. Какейда в модификации И.И. Бенкен. Метод основан на спектрофотометрическом измерении при 280 нм. величины оптической плотности продуктов распада белкового субстрата (казеина) под действием фермента (трипсина, химотрипсина). Добавление ингибиторов, которые связывают трипсин или химотрипсин в неактивные комплексы, сопровождается уменьшением экстинции. Ингибирующую активность вычисляли по формуле и выражали в мкг заторможенных трипсиновых (химотрипсиновых) единицах на 1 г муки.
Гемагглютинирующую активность в семенах сои и кукурузы определяли по методу Э.И. Выскребенцевой титрованием на планшетах c U-образными лунками.
За величину гемагглютинирующей активности принимали минимальную концентрацию белка, при которой происходит реакция гемагглютинации. Концентрацию белка определяли по методу Лоури фотоэлектроколориметрически.
Пример 1
Трипсинингибирующая активность в образце Августа составляет 5,96 мг/г, Максус - 5,42 мг/г, Оресса - 5,83 мг/г, Линия ТГС-40-3-2 - 5,44 мг/г. У негенномодифицированных образцов данный показатель составляет: Аннушка - 9,96 мг/г, Свапа - 7,12 мг/г, Хпп - 9,59 мг/г, Амандина - 7,22 мг/г, Абелина - 6,22 мг/г, Парадис - 6,35 мг/г, ПР 1134501 (Канада) - 6,06 мг/г, Ланцетная - 7,64 мг/г, Красная мега - 6,12 мг/г.
Химотрипсинингибирующая активность в образце Августа составляет 12,24 мг/г, Максус - 10,80 мг/г, Оресса - 11,01 мг/г, Линия ТГС-40-3-2 - 12,89 мг/г. У негенномодифицированных образцов актвность ХИА ниже составляет: Аннушка - 5,43 мг/г, Свапа - 3,50 мг/г, Хпп - 6,86 мг/г, Амандина - 6,92 мг/г, Абелина - 4,81 мг/г, Парадис - 6,74 мг/г, ПР 1134501 - 4,94 мг/г, Ланцетная - 3,79 мг/г, Красная мега (Россия) - 5,87 мг/г. (табл. 1).
Таким образом, изучение химотрипсинингибирующей и трипсинингибирующей активности семян сои показало что, ТИА в генномодифицированных образцах ниже, примерно в 2 раза, по сравнению с ХИА в этих же образцах.
Пример 2
При исследовании химотрипсинингибирующей и трипсинингибирующей активности в образцах семян кукурузы выявлена такая же тенденция повышения ХИА в генномодифицированных образцах практически в 2 раза. Так ХИА в образцах составляет: Кукуруза ПР-РВ-511 - 12,75 мг/г, Pioner - 14,78 мг/г, при этом в этих же образцах ТИА составляет: образец Кукуруза ПР-РВ-511 - 6,78 мг/г, Кукуруза Pioner - 6,44 мг/г.
В не генномодифицированных образцах эти показатели составляют: Кукуруза LG2195: ТИА-10,27 мг/г, ХИА - 6,53 мг/г; Кукуруза Марлиз 470: ТИА - 5,64 мг/г, ХИА - 4,08 мг/г; Кукуруза Grizzly: ТИА - 4,38 мг/г, ХИА - 3,89 мг/г (табл. 2).
В исследованных образцах кукурузы трипсинингибирующая активность в генномодифицированных образцах ниже, также приблизительно в 2 раза, в сравнении с ХИА.
Таким образом, химотрипсинингибирующая и трипсинингибирующая активность семян кукурузы в генномодифицированных образцах ниже, примерно в 2 раза, по сравнению с активностью химотрипсина в этих же образцах.
Пример 3
Изучение гемааглютинирующей активности показало, что активность по сортам сои варьирует в пределах от 37,03 до 68,20 [мг/мл]-1, причем повышение активности наблюдается у сортов сои генномодифицированной. Так активность лектинов у сои сорта Августа - 68,20 [мг/мл]-1, Максус - 58,80 [мг/мл]-1, Оресса - 64,40 [мг/мл]-1, Линия ТГС - 40-3-2 - 58,80 [мг/мл]-1, что выше на 10-30% по сравнению с другими сортами (табл. 3).
Гемааглютинирующая активность в генномодифицированных семенах сои составляет у сорта Августа - 68,20 [мг/мл]-1, Максус - 58,80 [мг/мл]-1, Оресса - 64,40 [мг/мл]-1, Линия ТГС - 40-3-2 - 58,80 [мг/мл]-1, что выше на 10-30% по сравнению с другими сортами.
Пример 4
При изучении гемааглютинирующей активности в семенах кукурузы обнаружена аналогичная картина. Гемааглютинирующая активность в генномодифицированных семенах несколько выше по сравнению с другими семенами и составляют 7,43 [мг/мл]-1 и 5,90 [мг/мл]-1, при том, что по другим образцам активность варьирует в пределах от 3,50 [мг/мл]-1 до 4,44 [мг/мл]-1, что на 20-30% ниже генномодифицированных (табл. 4).
Гемааглютинирующая активность в генномодифицированных семенах кукурузы составляет 7,43 [мг/мл]-1 и 5,90 [мг/мл]-1, что на 20-30% выше, чем у других семян кукурузы.
Изучение химотрипсинингибирующей, трипсинингибирующей активности и гемааглютинирующей активности проводится в течение 2-х часов, и имеет низкую стоимость расходных материалов. Для оценки наличия генноинженерных трансформаций другими способами требуется не менее 6 часов.
При наличии генно-инженерных трансформаций в семенах ХИА>ТИА или гемааглютинирующая активность для семян сои больше 58 [мг/мл]-1, а для семян кукурузы больше 5 [мг/мл]-1, что указывает на возможность маркирования генных модификаций по химотрипсинингибирующей и трипсинингибирующей активности, а так же гемааглютинирующей активности у семян сои и кукурузы, т.к. при создании новых линий сои и кукурузы применяются гены кодирующие синтез ингибиторов протеиназ и лектинов.
Способ оценки семян сои и кукурузы на наличие генно-инженерных трансформаций, заключающийся в определении в семенах сои и кукурузы химотрипсинингибирующей активности (ХИА), трипсин ингибирующей (ТИА) или гемааглютинирующей активности (ГАЕ), при этом если ХИА>ТИА для семян сои и кукурузы или ГАЕ для семян сои больше 58 [мг/мл]-1, а для семян кукурузы больше 5 [мг/мл]-1, то семена генномодифицированные.
