Инсектицидные белки и способы их применения

Авторы патента:

РАЙС Джанет А. (US)

ОНГ Азалеа (US)

ШЕПЕРС Эрик Дж. (US)

ЦИ Джули (US)

ИНГЛИШ Джеймс Дж. (US)

КЛАРК Дэбора У. (US)

БАРРИ Дженнифер К. (US)

C12N15/82 - для клеток растений

C07K14/415 - из растений

C07K14/145 - Phabdoviridae, например вирус бешенства, вирус Duvenhage, вирус Mokda, вирус везикулярного стоматита

A01N65/00 - Биоциды, репелленты или аттрактанты или регуляторы роста растений, содержащие растительный материал, например грибы, корни деррис или экстракты из него (содержащие соединения определенного строения A01N 27/00-A01N 59/00)

A01N37/46 - их N-ацильные производные

Владельцы патента RU 2733898:

Е.И.ДЮПОН ДЕ НЕМУР ЭНД КОМПАНИ (US)
ПАЙОНИР ХАЙ-БРЕД ИНТЕРНЭШНЛ, ИНК. (US)

Изобретение относится к области биохимии, в частности к рекомбинантному полипептиду PtIP-96, обладающему инсектицидной активностью против совки кукурузной (Helicoverpa zea). Также раскрыты полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид, композиция, ДНК-конструкция, трансгенное растение, содержащие указанный полипептид. Раскрыты способы контроля, подавления роста или уничтожения совки кукурузной (CEW) (Helicoverpa zea) с помощью указанного полипептида. Изобретение позволяет эффективно бороться с совкой кукурузной (Helicoverpa zea). 14 н. и 6 з.п. ф-лы, 24 ил., 9 пр., 5 табл.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПРЕДСТАВЛЕННЫЙ В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ

Официальная копия данного перечня последовательностей отправлена в электронном виде с помощью EFS-Web как отформатированный под ASCII перечень последовательностей в файле с названием "6584WOPCT_sequence_listing", созданном 14 сентября 2015 года и имеющем размер 255 килобайтов, и подана одновременно с описанием. Перечень последовательностей, содержащийся в данном отформатированном под ASCII документе, является частью описания и включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее раскрытие относится к области молекулярной биологии. Представлены новые гены, которые кодируют пестицидные белки. Эти пестицидные белки и последовательности нуклеиновой кислоты, которые их кодируют, применимы в приготовлении пестицидных составов и в получении трансгенных растений, устойчивых к вредителям.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Биологический контроль насекомых-вредителей, имеющих сельскохозяйственное значение, с применением микробного агента, такого как грибы, бактерии или другие виды насекомых, представляет не оказывающую негативного влияния на окружающую среду и коммерчески привлекательную альтернативу синтетическим химическим пестицидам. В целом можно сказать, что применение биопестицидов приводит к меньшему риску загрязнения и неблагоприятных воздействий на окружающую среду, и биопестициды обеспечивают большую специфичность по отношению к мишени, по сравнению со специфичностью, характерной для традиционных химических инсектицидов широкого спектра действия. Кроме того, зачастую производство биопестицидов стоит дешевле и, вследствие этого, улучшается экономически эффективный выход продукции для широкого спектра сельскохозяйственных культур.

Определенные виды микроорганизмов из рода Bacillus, как известно, обладают пестицидной активностью против ряда насекомых-вредителей, в том числе Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hemiptera и других. Bacillus thuringiensis (Bt) и Bacillus popilliae входят в число наиболее успешных средств биологического контроля, обнаруженных на сегодняшний день. Патогенность в отношении насекомых также приписывалась штаммам B. larvae, B. lentimorbus, B. sphaericus и B. cereus. Микробные инсектициды, в частности, полученные из штаммов Bacillus, сыграли важную роль в сельском хозяйстве как альтернатива химическому контролю вредителей.

Были разработаны культурные растения с улучшенной устойчивостью к насекомым при помощи генной инженерии культурных растений с тем, чтобы они вырабатывали пестицидные белки, происходящие из Bacillus. Например, с помощью генной инженерии были созданы растения кукурузы и хлопчатника для выработки пестицидных белков, выделенных из штаммов Bt. Эти сельскохозяйственные культуры, созданные при помощи генной инженерии, на сегодняшний день широко применяются в сельском хозяйстве и предоставляют фермеру не оказывающую негативного влияния на окружающую среду альтернативу традиционным способам контроля насекомых. Несмотря на то, что они были признаны очень успешными с коммерческой точки зрения, эти созданные при помощи генной инженерии устойчивые к насекомым культурные растения предусматривают устойчивость только к узкому диапазону важных в экономическом отношении насекомых-вредителей. В некоторых случаях, насекомые могут развивать устойчивость к различным инсектицидным соединениям, что повышает необходимость в идентификации альтернативных средств биологического контроля для контроля вредителей.

Соответственно, остается потребность в новых пестицидных белках с различными диапазонами инсектицидной активности против насекомых-вредителей, например, инсектицидных белках, которые активны против ряда насекомых из отряда Lepidoptera и отряда Coleoptera, в том числе без ограничения насекомых-вредителей, которые развили устойчивость к существующим инсектицидам.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

Представлены композиции и способы обеспечения пестицидной активности у бактерий, растений, растительных клеток, тканей и семян. Композиции включают молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие последовательности пестицидных и инсектицидных полипептидов, векторы, содержащие такие молекулы нуклеиновой кислоты, и клетки-хозяева, содержащие векторы. Композиции также включают последовательности пестицидных полипептидов и антитела к таким полипептидам. Последовательности нуклеиновой кислоты можно применять в ДНК-конструкциях или кассетах экспрессии для трансформации и экспрессии в организмах, в том числе микроорганизмах и растениях. Нуклеотидные или аминокислотные последовательности могут представлять собой синтетические последовательности, которые были сконструированы для экспрессии в организме, в том числе без ограничения микроорганизме или растении. Композиции также включают трансформированные бактерии, растения, растительные клетки, ткани и семена.

В частности, предусмотрены выделенные или рекомбинантные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды инсектицидного белка-96 Pteridophyta и Lycopodiophyta (PtIP-96), включающие аминокислотные замены, делеции, вставки, его фрагменты. Дополнительно охватываются аминокислотные последовательности, соответствующие полипептидам PtIP-96. Представлены выделенные или рекомбинантные молекулы нуклеиновой кислоты, способные кодировать полипептиды PtIP-96 под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108, а также аминокислотные замены, делеции, вставки, его фрагменты, и их комбинации. Также охватываются последовательности нуклеиновой кислоты, которые комплементарны последовательности нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления или которые гибридизуются с последовательностью согласно вариантам осуществления. Также представлены выделенные или рекомбинантные полипептиды PtIP-96 под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108, а также аминокислотные замены, делеции, вставки, его фрагменты, и их комбинации.

Представлены способы получения полипептидов и применения данных полипептидов для контроля или уничтожения вредителей из группы чешуекрылых, жесткокрылых, нематод, грибков и/или двукрылых. Трансгенные растения согласно вариантам осуществления экспрессируют одну или несколько пестицидных последовательностей, раскрытых в данном документе. В различных вариантах осуществления трансгенное растение дополнительно содержит один или несколько дополнительных генов устойчивости к насекомым, например, один или несколько дополнительных генов для контроля вредителей из группы жесткокрылых, чешуекрылых, полужесткокрылых или нематод. Специалисту в данной области будет понятно, что трансгенное растение может содержать какой-либо ген, обеспечивающий агрономический признак, представляющий интерес.

Также включены способы выявления нуклеиновых кислот и полипептидов согласно вариантам осуществления в образце. Представлен набор для выявления присутствия полипептида PtIP-96 или выявления присутствия полинуклеотида, кодирующего полипептид PtIP-96, в образце. Набор может быть представлен вместе со всеми реагентами и контрольными образцами, необходимыми для осуществления способа выявления предполагаемого средства, а также с инструкциями по применению.

Композиции и способы согласно вариантам осуществления применимы для получения организмов с улучшенной устойчивостью к вредителям или переносимостью вредителей. Эти организмы и композиции, содержащие организмы, подходят для сельскохозяйственных целей. Композиции согласно вариантам осуществления также применимы для получения измененных или улучшенных белков, которые обладают пестицидной активностью, или для выявления присутствия полипептидов PtIP-96.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фигуре 1A-1K показано выравнивание аминокислотных последовательностей с применение модуля ALIGNX® пакета Vector NTI® полипептидов PtIP-96: PtIP-96Aa (SEQ ID NO: 9); PtIP-96Ab (SEQ ID NO: 12); PtIP-96Ac (SEQ ID NO: 14); PtIP-96Ad (SEQ ID NO: 16); PtIP-96Ae (SEQ ID NO: 18); PtIP-96Af (SEQ ID NO: 20); PtIP-96Ag (SEQ ID NO: 22); PtIP-96Ah (SEQ ID NO: 24); PtIP-96Ca (SEQ ID NO: 26); PtIP-96Cb (SEQ ID NO: 28); PtIP-96Cc (SEQ ID NO: 30); PtIP-96Cd (SEQ ID NO: 32); PtIP-96Ce (SEQ ID NO: 34); PtIP-96Cf (SEQ ID NO: 36); PtIP-96Cg (SEQ ID NO: 38); PtIP-96Ch (SEQ ID NO: 40); PtIP-96Da (SEQ ID NO: 42); PtIP-96Db (SEQ ID NO: 44); PtIP-96Dc (SEQ ID NO: 46); PtIP-96Dd (SEQ ID NO: 52); PtIP-96De (SEQ ID NO: 48); PtIP-96Df (SEQ ID NO: 50); PtIP-96Ea (SEQ ID NO: 7); PtIP-96Eb (SEQ ID NO: 8); PtIP-96Ec (SEQ ID NO: 6); PtIP-96Ed (SEQ ID NO: 54); PtIP-96Ee (SEQ ID NO: 56); PtIP-96Ef (SEQ ID NO: 58); PtIP-96Eg (SEQ ID NO: 60); PtIP-96Eh (SEQ ID NO: 62); PtIP-96Ei (SEQ ID NO: 64); PtIP-96Ej (SEQ ID NO: 66); PtIP-96Ek (SEQ ID NO: 68); PtIP-96El (SEQ ID NO: 70); PtIP-96Em (SEQ ID NO: 72); PtIP-96En (SEQ ID NO: 74); PtIP-96Eo (SEQ ID NO: 76); PtIP-96Ep (SEQ ID NO: 78); PtIP-96Eq (SEQ ID NO: 80); PtIP-96Er (SEQ ID NO: 82); PtIP-96Es (SEQ ID NO: 84); PtIP-96Et (SEQ ID NO: 86); PtIP-96Eu (SEQ ID NO: 88); PtIP-96Ev (SEQ ID NO: 90); PtIP-96Ha (SEQ ID NO: 10); PtIP-96Hd (SEQ ID NO: 96); PtIP-96He (SEQ ID NO: 98); PtIP-96Hf (SEQ ID NO: 100); PtIP-96Hg (SEQ ID NO: 102); PtIP-96Hh (SEQ ID NO: 104); PtIP-96Hi (SEQ ID NO: 106); PtIP-96Hj (SEQ ID NO: 108). Положения консервативной аминокислоты между гомологами полипептида PtIP-96 выделены (A). Неконсервативные различия аминокислот между гомологами полипептида выделены PtIP-96 (A).

На фигуре 2A-1B показано выравнивание аминокислотных последовательностей с применение модуля ALIGNX® пакета Vector NTI® полипептидов PtIP-96: PtIP-96Aa (SEQ ID NO: 9); PtIP-96Ab (SEQ ID NO: 12); PtIP-96Ac (SEQ ID NO: 14); PtIP-96Ad (SEQ ID NO: 16); PtIP-96Ae (SEQ ID NO: 18); PtIP-96Af (SEQ ID NO: 20); PtIP-96Ag (SEQ ID NO: 22) и PtIP-96Ah (SEQ ID NO: 24). Отличие аминокислотной последовательности между гомологами полипептида PtIP-96 выделено.

На фигуре 3A-1B показано выравнивание аминокислотных последовательностей с применение модуля ALIGNX® пакета Vector NTI® полипептидов PtIP-96: PtIP-96Ca (SEQ ID NO: 26); PtIP-96Cb (SEQ ID NO: 28); PtIP-96Cc (SEQ ID NO: 30); PtIP-96Cd (SEQ ID NO: 32); PtIP-96Ce (SEQ ID NO: 34); PtIP-96Cf (SEQ ID NO: 36); PtIP-96Cg (SEQ ID NO: 38) и PtIP-96Ch (SEQ ID NO: 40). Отличие аминокислотной последовательности между гомологами полипептида PtIP-96 выделено.

На фигуре 4A-4D показано выравнивание аминокислотных последовательностей с применение модуля ALIGNX® пакета Vector NTI® полипептидов PtIP-96: PtIP-96Ea (SEQ ID NO: 7); PtIP-96Eb (SEQ ID NO: 8); PtIP-96Ec (SEQ ID NO: 6); PtIP-96Ed (SEQ ID NO: 54); PtIP-96Ee (SEQ ID NO: 56); PtIP-96Ef (SEQ ID NO: 58); PtIP-96Eg (SEQ ID NO: 60); PtIP-96Eh (SEQ ID NO: 62); PtIP-96Ei (SEQ ID NO: 64); PtIP-96Ej (SEQ ID NO: 66); PtIP-96Ek (SEQ ID NO: 68); PtIP-96El (SEQ ID NO: 70); PtIP-96Em (SEQ ID NO: 72); PtIP-96En (SEQ ID NO: 74); PtIP-96Er (SEQ ID NO: 82); PtIP-96Es (SEQ ID NO: 84); PtIP-96Et (SEQ ID NO: 86); PtIP-96Eu (SEQ ID NO: 88) и PtIP-96Ev (SEQ ID NO: 90). Отличие аминокислотной последовательности между гомологами полипептида PtIP-96 выделено.

На фигуре 5 оказано выравнивание аминокислотных последовательностей с применение модуля ALIGNX® пакета Vector NTI® полипептидов PtIP-96: PtIP-96Eo (SEQ ID NO: 76); PtIP-96Ep (SEQ ID NO: 78) и PtIP-96Eq (SEQ ID NO: 80). Отличие аминокислотной последовательности между гомологами полипептида PtIP-96 выделено.

На фигуре 6A-6B показано выравнивание аминокислотных последовательностей с применение модуля ALIGNX® пакета Vector NTI® полипептидов PtIP-96: PtIP-96Ha (SEQ ID NO: 10); PtIP-96Hb (SEQ ID NO: 92); PtIP-96Hc (SEQ ID NO: 94); PtIP-96Hd (SEQ ID NO: 96); PtIP-96He (SEQ ID NO: 98); PtIP-96Hf (SEQ ID NO: 100); PtIP-96Hg (SEQ ID NO: 102); PtIP-96Hh (SEQ ID NO: 104); PtIP-96Hi (SEQ ID NO: 106) и PtIP-96Hj (SEQ ID NO: 108). Отличие аминокислотной последовательности между гомологами полипептида PtIP-96 выделено.

На фигуре 7A-7B показано выравнивание аминокислотных последовательностей с применение модуля ALIGNX® пакета Vector NTI® полипептидов PtIP-96: PtIP-96Da (SEQ ID NO: 42); PtIP-96Db (SEQ ID NO: 44); PtIP-96Dc (SEQ ID NO: 46); PtIP-96Dd (SEQ ID NO: 52); PtIP-96De (SEQ ID NO: 48) и PtIP-96Df (SEQ ID NO: 50). Отличие аминокислотной последовательности между гомологами полипептида PtIP-96 выделено.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следует понимать, что настоящее раскрытие не ограничивается конкретными описанными методиками, протоколами, клеточными линиями, родами и реагентами, в связи с этим они могут варьировать. Также следует понимать, что терминология, используемая в данном документе, предназначена лишь для описания конкретных вариантов осуществления и не подразумевается как ограничивающая объем настоящего раскрытия.

Используемые в данном документе формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если в контексте явно не указано иное. Так, например, ссылка на "клетку" включает множество таких клеток, а ссылка на "белок" включает ссылку на один или несколько белков и их эквивалентов, известных специалистам в данной области, и т. д. Все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же самое значение, как обычно понимается специалистом в области техники, к которой принадлежит настоящее раскрытие, если явно не указано иное.

Настоящее раскрытие относится к композициям и способам контроля вредителей. Способы включают трансформацию организмов последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими полипептиды PtIP-96. В частности, последовательности нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления применимы для получения растений и микроорганизмов, которые обладают пестицидной активностью. Таким образом, предусматриваются трансформированные бактерии, растения, растительные клетки, растительные ткани и семена. Композиции представляют собой пестицидные нуклеиновые кислоты и белки из видов бактерий. Последовательности нуклеиновой кислоты находят применение в конструировании векторов экспрессии для последующей трансформации организмов, представляющих интерес, в качестве зондов для выделения других гомологичных (или частично гомологичных) генов и для получения измененных полипептидов PtIP-96 при помощи способов, известных из уровня техники, таких как сайт-направленный мутагенез, замена доменов или ДНК-шаффлинг. PtIP-96 находят применение при контроле или уничтожении популяций вредителей из группы чешуекрылых, жесткокрылых, двукрылых, грибков, полужесткокрылых и нематод и для получения композиций с пестицидной активностью. Насекомые-вредители, представляющие интерес, включают без ограничения виды из отряда Lepidoptera, в том числе без ограничения: совку кукурузную (CEW) (Helicoverpa zea), огневку кукурузную (ECB) (Ostrinia nubilalis), моль капустную, например Helicoverpa zea Boddie; совку соевую, например Pseudoplusia includens Walker; и совку бархатных бобов например Anticarsia gemmatalis Hübner, а также виды из отряда Coleoptera, в том числе без ограничения западного кукурузного жука (Diabrotica virgifera) - WCRW, южного кукурузного жука (Diabrotica undecimpunctata howardi) -SCRW и северного кукурузного жука (Diabrotica barberi) - NCRW.

Под "пестицидным токсином" или "пестицидным белком", как используется в настоящем документе, подразумевают токсин, который обладает токсической активностью в отношении одного или нескольких вредителей, в том числе без ограничения представителей отряда Lepidoptera, Diptera, Hemiptera и Coleoptera или типа Nematoda, или белок, который характеризуется гомологией с таким белком. Пестицидные белки были выделены из организмов, в том числе, например, Bacillus sp., Pseudomonas sp., Photorhabdus sp., Xenorhabdus sp., Clostridium bifermentans и Paenibacillus popilliae. Пестицидные белки включают без ограничения инсектицидные белки из Pseudomonas sp., такие как PSEEN3174 (Monalysin; (2011) PLoS Pathogens 7:1-13); из штамма CHA0 и Pf-5 Pseudomonas protegens (ранее fluorescens) (Pechy-Tarr, (2008) Environmental Microbiology 10:2368-2386; № доступа в GenBank EU400157); из Pseudomonas Taiwanensis (Liu, et al., (2010) J. Agric. Food Chem., 58:12343-12349) и из Pseudomonas pseudoalcligenes (Zhang, et al., (2009) Annals of Microbiology 59:45-50 и Li, et al., (2007) Plant Cell Tiss. Organ Cult. 89:159-168); инсектицидные белки из Photorhabdus sp. и Xenorhabdus sp. (Hinchliffe, et al., (2010) The Open Toxicology Journal, 3:101-118 и Morgan, et al., (2001) Applied and Envir. Micro. 67:2062-2069); патент США № 6048838 и патент США № 6379946; полипептид PIP-1 из публикации заявки на патент США US20140007292; полипептид AfIP-1A и/или AfIP-1B из публикации заявки на патент США US20140033361; полипептид PHI-4 из публикации заявки на патент США с серийным номером 13/839702; полипептид PIP-47 из патентной публикации согласно PCT с серийным номером PCT/US14/51063, полипептид PIP-72 из патентной публикации согласно PCT с серийным номером PCT/US14/55128, и δ-эндотоксины, в том числе без ограничения классы Cry1, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry10, Cry11, Cry12, Cry13, Cry14, Cry15, Cry16, Cry17, Cry18, Cry19, Cry20, Cry21, Cry22, Cry23, Cry24, Cry25, Cry26, Cry27, Cry 28, Cry 29, Cry 30, Cry31, Cry32, Cry33, Cry34, Cry35,Cry36, Cry37, Cry38, Cry39, Cry40, Cry41, Cry42, Cry43, Cry44, Cry45, Cry 46, Cry47, Cry49, Cry50, Cry51, Cry52, Cry53, Cry 54, Cry55, Cry56, Cry57, Cry58, Cry59, Cry60, Cry61, Cry62, Cry63, Cry64, Cry65, Cry66, Cry67, Cry68, Cry69, Cry70, Cry71 и Cry 72 генов δ-эндотоксинов и гены цитолитических токсинов cyt1 и cyt2 B. thuringiensis. Члены этих классов инсектицидных белков из B. thuringiensis хорошо известны специалисту в данной области техники (см., Crickmore, et al., "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature" (2011), на сайте lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/, доступ к которому можно получить во всемирной сети Интернет с помощью префикса "www").

Примеры δ-эндотоксинов также включают без ограничения белки Cry1A из патентов США №№ 5880275 и 7858849; токсин DIG-3 или DIG-11 (варианты с N-терминальной делецией α-спирали 1 и/или α-спирали 2 белков cry, таких как Cry1A, Cry3A) из патентов США №№ 8304604, 8304605 и 8476226; Cry1B из публикации заявки на патент США с серийным номером 10/525318; Cry1C из патента США № 6033874; Cry1F из патентов США №№ 5188960 и 6218188; химеры Cry1A/F из патентов США №№ 7070982; 6962705 и 6713063); белок Cry2, такой как белок Cry2Ab из патента США № 7064249); белок Cry3A, в том числе без ограничения созданный с помощью генной инженерии гибридный инсектицидный белок (eHIP), полученный путем слияния уникальных комбинаций вариабельных участков и консервативных блоков по меньшей мере двух различных белков Cry (публикация заявки на патент США № 2010/0017914); белок Cry4; белок Cry5; белок Cry6; белки Cry8 из патентов США №№ 7329736, 7449552, 7803943, 7476781, 7105332, 7378499 и 7462760; белок Cry9, такой как представители семейств Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E и Cry9F; белок Cry15 из Naimov, et al., (2008) Applied and Environmental Microbiology, 74:7145-7151; Cry22, белок Cry34Ab1 из патентов США №№ 6127180, 6624145 и 6340593; белок CryET33 и cryET34 из патентов США №№ 6248535, 6326351, 6399330, 6949626, 7385107 и 7504229; гомологи CryET33 и CryET34 из публикации заявок на патент США №№ 2006/0191034, 2012/0278954 и публикации согласно PCT № WO 2012/139004; белок Cry35Ab1 из патентов США №№ 6083499, 6548291 и 6340593; белок Cry46, белок Cry51, бинарный токсин Cry; TIC901 или родственный токсин; TIC807 из публикации заявки на патент США № 2008/0295207; ET29, ET37, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127, TIC128 из заявки согласно PCT US 2006/033867; AXMI-027, AXMI-036 и AXMI-038 из патента США № 8236757; AXMI-031, AXMI-039, AXMI-040, AXMI-049 из патента США № 7923602; AXMI-018, AXMI-020 и AXMI-021 из WO 2006/083891; AXMI-010 из WO 2005/038032; AXMI-003 из WO 2005/021585; AXMI-008 из публикации заявки на патент США № 2004/0250311; AXMI-006 из публикации заявки на патент США № 2004/0216186; AXMI-007 из публикации заявки на патент США № 2004/0210965; AXMI-009 из публикации заявки на патент США № 2004/0210964; AXMI-014 из публикации заявки на патент США № 2004/0197917; AXMI-004 из публикации заявки на патент США № 2004/0197916; AXMI-028 и AXMI-029 из WO 2006/119457; AXMI-007, AXMI-008, AXMI-0080rf2, AXMI-009, AXMI-014 и AXMI-004 из WO 2004/074462; AXMI-150 из патента США № 8084416; AXMI-205 из публикации заявки на патент США № 2011/0023184; AXMI-011, AXMI-012, AXMI-013, AXMI-015, AXMI-019, AXMI-044, AXMI-037, AXMI-043, AXMI-033, AXMI-034, AXMI-022, AXMI-023, AXMI-041, AXMI-063 и AXMI-064 из публикации заявки на патент США № 2011/0263488; AXMI-R1 и родственные белки из публикации заявки на патент США № 2010/0197592; AXMI221Z, AXMI222z, AXMI223z, AXMI224z и AXMI225z из WO 2011/103248; AXMI218, AXMI219, AXMI220, AXMI226, AXMI227, AXMI228, AXMI229, AXMI230 и AXMI231 из WO 2011/103247; AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005, AXMI-163 и AXMI-184 из патента США № 8334431; AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035 и AXMI-045 из публикации заявки на патент США № 2010/0298211; AXMI-066 и AXMI-076 из публикации заявки на патент США № 2009/0144852; AXMI128, AXMI130, AXMI131, AXMI133, AXMI140, AXMI141, AXMI142, AXMI143, AXMI144, AXMI146, AXMI148, AXMI149, AXMI152, AXMI153, AXMI154, AXMI155, AXMI156, AXMI157, AXMI158, AXMI162, AXMI165, AXMI166, AXMI167, AXMI168, AXMI169, AXMI170, AXMI171, AXMI172, AXMI173, AXMI174, AXMI175, AXMI176, AXMI177, AXMI178, AXMI179, AXMI180, AXMI181, AXMI182, AXMI185, AXMI186, AXMI187, AXMI188, AXMI189 из патента США № 8318900; AXMI079, AXMI080, AXMI081, AXMI082, AXMI091, AXMI092, AXMI096, AXMI097, AXMI098, AXMI099, AXMI100, AXMI101, AXMI102, AXMI103, AXMI104, AXMI107, AXMI108, AXMI109, AXMI110, AXMI111, AXMI112, AXMI114, AXMI116, AXMI117, AXMI118, AXMI119, AXMI120, AXMI121, AXMI122, AXMI123, AXMI124, AXMI1257, AXMI1268, AXMI127, AXMI129, AXMI164, AXMI151, AXMI161, AXMI183, AXMI132, AXMI138, AXMI137 из публикации заявки на патент США № 2010/0005543, белки cry, такие как Cry1A и Cry3A с модифицированными сайтами протеолитического расщепления, из патента США № 8319019; белок-токсин Cry1Ac, Cry2Aa и Cry1Ca из штамма VBTS 2528 Bacillus thuringiensis из публикации заявки на патент США № 2011/0064710. Инсектицидная активность белков Cry хорошо известна специалисту в данной области техники (обзор см. в van Frannkenhuyzen, (2009) J. Invert. Path. 101:1-16). Применение белков Cry в качестве признаков трансгенного растения хорошо известно специалисту в данной области, и трансгенные растения с Cry, в том числе без ограничения растения, экспрессирующие Cry1Ac, Cry1Ac+Cry2Ab, Cry1Ab, Cry1A.105, Cry1F, Cry1Fa2, Cry1F+Cry1Ac, Cry2Ab, Cry3A, mCry3A, Cry3Bb1, Cry34Ab1, Cry35Ab1, Vip3A, mCry3A, Cry9c и CBI-Bt, были разрешены контролирующими органами (см. Sanahuja, (2011) Plant Biotech Journal 9:283-300 и CERA. (2010) GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment (CERA), ILSI Research Foundation, Washington D.C. на сайте cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database, доступ к которым можно получить во всемирной сети Интернет с применением префикса "www"). В растениях также может экспрессироваться два и более пестицидных белков, хорошо известных специалисту в данной области, например, Vip3Ab и Cry1Fa (US2012/0317682); Cry1BE и Cry1F (US2012/0311746); Cry1CA и Cry1AB (US2012/0311745); Cry1F и CryCa (US2012/0317681); Cry1DA и Cry1BE (US2012/0331590); Cry1DA и Cry1Fa (US2012/0331589); Cry1AB и Cry1BE (US2012/0324606); Cry1Fa и Cry2Aa, и Cry1I и Cry1E (US2012/0324605); Cry34Ab/35Ab и Cry6Aa (US20130167269); Cry34Ab/VCry35Ab и Cry3Aa (US20130167268), а также Cry3A и Cry1Ab или Vip3Aa (US20130116170). Пестицидные белки также включают инсектицидные липазы, в том числе гидролазы омыляемых липидов из патента США № 7491869 и холестериноксидазы, например, из Streptomyces (Purcell et al. (1993) Biochem Biophys Res Commun 15:1406-1413). Пестицидные белки также включают токсины VIP ( инсектицидные белки вегетативной фазы) из патентов США №№ 5877012, 6107279, 6137033, 7244820, 7615686 и 8237020 и т. п. Другие белки VIP хорошо известны специалисту в данной области техники (см. lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html, доступ к которому можно получить во всемирной сети Интернет с применением префикса "www"). Пестицидные белки также включают белки токсинового комплекса (TC), которые можно получить из организмов, таких как Xenorhabdus, Photorhabdus и Paenibacillus (см. патенты США №№ 7491698 и 8084418). Некоторые TC-белки обладают "самостоятельной" инсектицидной активностью, а другие TC-белки повышают активность самостоятельных токсинов, производимых тем же данным организмом. Токсичность "самостоятельного" TC-белка (от Photorhabdus, Xenorhabdus или Paenibacillus, например) может повышаться при помощи одного или нескольких TC-белков, "усилителей", полученных от организма-источника из другого рода. Существуют три основных типа TC-белков. Как изложено в данном документе, белки класса A ("белок A") представляют собой самостоятельные токсины. Белки класса B ("белок B") и белки класса C ("белок C") усиливают токсичность белков класса A. Примеры белков класса A представляют собой TcbA, TcdA, XptA1 и XptA2. Примеры белков класса B представляют собой TcaC, TcdB, XptB1Xb и XptC1Wi. Примеры белков класса C представляют собой TccC, XptC1Xb и XptB1Wi. Пестицидные белки также включают белки яда пауков, змей и скорпионов. Примеры пептидов яда пауков включают без ограничения пептиды ликотоксина-1 и его мутантные формы (патент США № 8334366).

В некоторых аспектах полипептид PtIP-96 включает аминокислотные последовательности, выведенные из последовательностей нуклеиновой кислоты полной длины, раскрытых в данном документе, и аминокислотные последовательности, которые короче, чем последовательности полной длины, либо полученные в результате применения альтернативного сайта инициации, расположенного ниже, либо в результате процессинга, дающего более короткий белок с пестицидной активностью. Процессинг может происходить в организме, в котором экспрессируется белок, или во вредителе после поглощения белка.

Таким образом, в данном документе представлены новые выделенные или рекомбинантные последовательности нуклеиновой кислоты, которые обеспечивают пестицидную активность. Также представлены аминокислотные последовательности полипептидов PtIP-96. Белок, полученный в результате трансляции генов этих полипептидов PtIP-96 в клетках, обеспечивает возможность контроля или уничтожения вредителей, которые поглощают их.

Молекулы нуклеиновой кислоты, а также их варианты и фрагменты

Один аспект относится к выделенным или рекомбинантным молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды PtIP-96 или их биологически активные части, а также к молекулам нуклеиновой кислоты, подходящим для применения в качестве гибридизационных зондов для идентификации молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих белки с участками гомологии последовательностей. Применяемый в данном документе термин "молекула нуклеиновой кислоты" относится к молекулам ДНК (например, рекомбинантной ДНК, кДНК, геномной ДНК, пластидной ДНК, митохондриальной ДНК) или молекулам РНК (например, мРНК) и аналогам ДНК или РНК, полученным с применением аналогов нуклеотидов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно представляет собой двухцепочечную ДНК.

"Выделенная" молекула нуклеиновой кислоты (или ДНК) применяется в данном документе для обозначения последовательности нуклеиновой кислоты (или ДНК), которая больше не находится в своей естественной среде, например, находится in vitro. "Рекомбинантная" молекула нуклеиновой кислоты (или ДНК) применяется в данном документе для обозначения последовательности нуклеиновой кислоты (или ДНК), которая находится в рекомбинантной бактериальной или растительной клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления "выделенная" или "рекомбинантная" нуклеиновая кислота не содержит последовательности (предпочтительно, последовательности, кодирующие белок), которые в естественных условиях фланкируют нуклеиновую кислоту (т. е., последовательности, расположенные на 5′- и 3′-концах нуклеиновой кислоты) в геномной ДНК организма, из которого получена нуклеиновая кислота. Для целей настоящего раскрытия "выделенные" или "рекомбинантные" при применении для обозначения молекул нуклеиновой кислоты исключает выделенные хромосомы. Например, в различных вариантах осуществления рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид PtIP-96, может содержать менее приблизительно 5 т. н., 4 т. н., 3 т. н., 2 т. н., 1 т. н., 0,5 т. н. или 0,1 т. н. последовательностей нуклеиновой кислоты, которые в естественных условиях фланкируют молекулу нуклеиновой кислоты в геномной ДНК клетки, из которой получена нуклеиновая кислота.

Выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептиды PtIP-96, рассматривают как имеющую одно или несколько изменений в последовательности нуклеиновой кислоты относительно нативной или геномной последовательности нуклеиновой кислоты. Изменение в нативной или геномной последовательности нуклеиновой кислоты включает без ограничения изменения в последовательности нуклеиновой кислоты вследствие вырожденности генетического кода; изменения в последовательности нуклеиновой кислоты вследствие аминокислотной замены, вставки, делеции и/или добавления относительно нативной или геномной последовательности; удаление одного или нескольких интронов; делецию одного или нескольких регуляторных участков, расположенных выше или ниже; и делецию 5'- и/или 3'-нетранслируемого участка, ассоциированного с геномной последовательностью нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид PtIP-96, представляет собой последовательность, отличающуюся от геномной.

Предполагается ряд полинуклеотидов, которые кодируют полипептиды PtIP-96 или родственные белки. Такие полинуклеотиды применимы для получения полипептидов PtIP-96 в клетках-хозяевах, если они функционально связаны с подходящим промотором, терминатором транскрипции и/или последовательностями полиаденилирования. Такие полинуклеотиды также применимы в качестве зондов для выделения гомологичных или фактически гомологичных полинуклеотидов, которые кодируют полипептиды PtIP-96 или родственные белки.

Полинуклеотиды, кодирующие полипептиды PtIP-96

Одним источником полинуклеотидов, которые кодируют полипептиды PtIP-96 или родственные белки, является вид папоротников или других примитивных растений, который содержит полинуклеотид PtIP-96 под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107 или SEQ ID NO: 109, кодирующий полипептид PtIP-96 под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108. Полинуклеотиды под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107 или SEQ ID NO: 109 можно применять для экспрессии полипептидов PtIP-96 в бактериях-хозяевах, которые включают без ограничения бактериальные клетки-хозяева Agrobacterium, Bacillus, Escherichia, Salmonella, Pseudomonas и Rhizobium. Полинуклеотиды также применимы в качестве зондов для выделения гомологичных или фактически гомологичных полинуклеотидов, которые кодируют полипептиды PtIP-96 или родственные белки. Такие зонды можно применять для идентификации гомологичных или фактически гомологичных полинуклеотидов, полученных из видов Pteridophyta и Lycopodiophyta.

Полинуклеотиды, которые кодируют полипептиды PtIP-96, также можно синтезировать de novo исходя из последовательности полипептида PtIP-96. Полинуклеотидную последовательность гена можно вывести на основании последовательности полипептида PtIP-96 с применением генетического кода. Компьютерные программы, такие как "BackTranslate" (GCG™ Package, Acclerys, Inc., Сан-Диего, Калифорния), можно применять для перевода пептидной последовательности в соответствующую нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид. Примеры последовательностей полипептида PtIP-96, которые можно применять для получения соответствующих нуклеотидных кодирующих последовательностей, включают без ограничения полипептиды PtIP-96 под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108. Кроме того, можно сконструировать синтетические последовательности полинуклеотида PtIP-96 согласно настоящему раскрытию таким образом, что они будут экспрессироваться в растениях. В патенте США № 5500365 описан способ синтеза генов растения для повышения уровня экспрессии белка, кодируемого синтезированным геном. Этот способ относится к модификации последовательностей структурных генов экзогенного трансгена, что приводит к их более эффективной транскрипции, процессингу, трансляции и экспрессии в растении. Характерные особенности генов, которые хорошо экспрессируются в растениях, предусматривают удаление последовательностей, которые могут вызывать нежелательный сплайсинг интронов или полиаденилирование в пределах кодирующего участка генного транскрипта, при этом в существенной мере сохраняется аминокислотная последовательность токсичной части инсектицидного белка. Аналогичный способ для получения повышенной экспрессии трансгенов в однодольных растениях раскрыт в патенте США № 5689052.

Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид PtIP-96, представляет собой полинуклеотид с последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107 или SEQ ID NO: 109, и его варианты, фрагменты и комплементарные ему последовательности. "Комплементарная последовательность" применяется в данном документе для обозначения последовательности нуклеиновой кислоты, которая в достаточной степени комплементарна данной последовательности нуклеиновой кислоты, так что она может гибридизоваться с данной последовательностью нуклеиновой кислоты с образованием, тем самым, стабильного дуплекса. "Варианты полинуклеотидной последовательности" применяется в данном документе для обозначения последовательности нуклеиновой кислоты, которая без учета отличий, связанных с вырожденностью генетического кода, кодирует тот же полипептид.

Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид PtIP-96, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, отличающуюся от геномной. Применяемые в данном документе "последовательность нуклеиновой кислоты, отличающаяся от геномной", или "молекула нуклеиновой кислоты, отличающаяся от геномной", или "полинуклеотид, отличающийся от геномного" относятся к молекуле нуклеиновой кислоты, которая имеет одно или несколько изменений в последовательности нуклеиновой кислоты по сравнению с нативной или геномной последовательностью нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления изменение по отношению к нативной или геномной молекуле нуклеиновой кислоты включает без ограничения: изменения в последовательности нуклеиновой кислоты, обусловленные вырожденностью генетического кода; оптимизацию кодонов последовательности нуклеиновой кислоты для экспрессии в растениях; изменения в последовательности нуклеиновой кислоты для введения по меньшей мере одной аминокислотной замены, вставки, делеции и/или добавления по сравнению с нативной или геномной последовательностью; удаление одного или нескольких интронов, ассоциированных с геномной последовательностью нуклеиновой кислоты; вставку одного или нескольких гетерологичных интронов; делецию одного или нескольких регуляторных участков, расположенных выше или ниже, которые ассоциированы с геномной последовательностью нуклеиновой кислоты; вставку одного или нескольких гетерологичных регуляторных участков, расположенных выше или ниже; делецию 5'- и/или 3'-нетранслируемого участка, ассоциированного с геномной последовательностью нуклеиновой кислоты; вставку гетерологичного 5'- и/или 3'-нетранслируемого участка и модификацию сайта полиаденилирования. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, отличающаяся от геномной, представляет собой кДНК. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, отличающаяся от геномной, представляет собой синтетическую последовательность нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид PtIP-96, представляет собой отличающуюся от геномной нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107 или SEQ ID NO: 109, где полипептид PtIP-96 обладает инсектицидной активностью.

В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид PtIP-96, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108 с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 или более аминокислотными заменами по сравнению с нативной аминокислотой в соответствующем положении SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108.

В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, получают из вида папоротников отдела Pteridophyta или другого примитивного растения отдела Lycopodiophyta. Филогения папоротников, применяемая в данном документе, основана на классификации современных папоротников по A. R. Smith et al, TAXON, 55:705-731 (2006). Консенсусная филогения, основанная на классификации по A. R. Smith, показана на фигуре 1. Другие филогенетические классификации современных папоротников известны специалисту в данной области. Дополнительную информацию, касающуюся филогении папоротников, можно найти на сайте mobot.org/MOBOT/research/APweb/ (доступ к которому можно получить с применением префикса "www") и в работе Schuettpelz E. and Pryer K. M., TAXON 56: 1037-1050 (2007), и она основана на трех пластидных генах. Дополнительные виды папоротников и других примитивных растений можно найти на сайте homepages.caverock.net.nz/~bj/fern/list.htm (доступ к которому можно получить с применением префикса http://).

В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, получают из вида папоротников класса Psilotopsida. В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, получают из вида папоротников класса Psilotopsida, порядка Psilotales. В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, получают из вида папоротников класса Psilotopsida, порядка Ophioglossales. В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, получают из вида папоротников класса Psilotopsida, порядка Ophioglossales, семейства Psilotaceae. В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, получают из вида папоротников класса Psilotopsida, порядка Ophioglossales, семейства Ophioglossaceae. В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, получают из вида папоротников рода Ophioglossum L., Botrychium, Botrypus, Helminthostachys, Ophioderma, Cheiroglossa, Sceptridium или Mankyua. В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, получают из вида папоротников Ophioglossum L. Род выбирают без ограничения из Ophioglossum californicum, Ophioglossum coriaceum, Ophioglossum costatum, Ophioglossum crotalophoroides, Ophioglossum engelmannii, Ophioglossum falcatum, Ophioglossum gomezianum, Ophioglossum gramineum, Ophioglossum kawamurae, Ophioglossum lusitanicum, Ophioglossum namegatae, Ophioglossum nudicaule, Ophioglossum palmatum, Ophioglossum parvum, Ophioglossum pedunculosum, Ophioglossum pendulum, Ophioglossum petiolatum, Ophioglossum pusillum, Ophioglossum reticulatum, Ophioglossum richardsiae, Ophioglossum thermale и Ophioglossum vulgatum.

В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, получают из вида папоротников порядка Polypodiales, семейства Polypodiaceae, рода Campyloneurum, рода Drynaria, рода Lepisorus, рода Microgramma, рода Microsorum, рода Neurodium, рода Niphidium, рода Pecluma M.G., рода Phlebodium, рода Phymatosorus, рода Platycerium, рода Pleopeltis, рода Polypodium L или рода Colysis.

В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, получают из вида папоротников рода Colysis, выбранного без ограничения из Colysis ampla, Colysis digitata, Colysis diversifolia, Colysis elegans Colysis elliptica, Colysis flexiloba, Colysis hemionitidea, Colysis hemitoma, Colysis henryi, Colysis insignis, Colysis intermedia, Colysis leveillei, Colysis longipes, Colysis pedunculata, Colysis pentaphylla, Colysis pothifolia, Colysis pteropus, Colysis shintenensis, Colysis simplicifrons, Colysis triphylla, Colysis wrightii и Colysis ×shintenensis.

В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, получают из вида папоротников порядка Polypodiales, семейства Pteridaceae, рода Adiantaceae, выбранного без ограничения из Adiantum aethiopicum, Adiantum aleuticum, Adiantum bonatianum, Adiantum cajennense, Adiantum capillus-junonis, Adiantum capillus-veneris, Adiantum caudatum, Adiantum chienii, Adiantum chilense, Adiantum cuneatum, Adiantum cunninghamii, Adiantum davidii, Adiantum diaphanum, Adiantum edentulum, Adiantum edgeworthii, Adiantum excisum, Adiantum fengianum, Adiantum fimbriatum, Adiantum flabellulatum, Adiantum formosanum, Adiantum formosum, Adiantum fulvum, Adiantum gravesii, Adiantum hispidulum, Adiantum induratum, Adiantum jordanii, Adiantum juxtapositum, Adiantum latifolium, Adiantum leveillei, Adiantum lianxianense, Adiantum malesianum, Adiantum mariesii, Adiantum monochlamys, Adiantum myriosorum, Adiantum obliquum, Adiantum ogasawarense, Adiantum pedatum, Adiantum pentadactylon, Adiantum peruvianum, Adiantum philippense, Adiantum princeps, Adiantum pubescens, Adiantum raddianum, Adiantum raddianum, Adiantum reniforme, Adiantum roborowskii, Adiantum serratodentatum, Adiantum sinicum, Adiantum soboliferum, Adiantum subcordatum, Adiantum tenerum, Adiantum terminatum, Adiantum tetraphyllum, Adiantum venustum, Adiantum viridescens и Adiantum viridimontanum.

В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, получают из вида папоротников порядка Polypodiales, семейства Dryopteridaceae, рода Polystichum, выбранного без ограничения из Polystichum acanthophyllum, Polystichum acrostichoides, Polystichum aculeatum, Polystichum acutidens, Polystichum acutipinnulum, Polystichum alcicorne, Polystichum aleuticum, Polystichum andersonii, Polystichum atkinsonii, Polystichum australiense, Polystichum bakerianum, Polystichum biaristatum, Polystichum bomiense, Polystichum bonseyi, Polystichum brachypterum, Polystichum braunii, Polystichum brachypterum, Polystichum calderonense, Polystichum californicum, Polystichum capillipes, Polystichum castaneum, Polystichum chilense, Polystichum christii, Polystichum chunii, Polystichum craspedosorum, Polystichum cyclolobum, Polystichum cystostegia, Polystichum deltodon, Polystichum dielsii, Polystichum discretum, Polystichum drepanum, Polystichum dudleyi, Polystichum duthiei, Polystichum echinatum, Polystichum erosum, Polystichum excellens, Polystichum eximium, Polystichum falcatipinnum, Polystichum falcinellum, Polystichum fallax, Polystichum formosanum, Polystichum glandulosum, Polystichum gongboense, Polystichum grandifrons, Polystichum gymnocarpium, Polystichum haleakalense, Polystichum hancockii, Polystichum hecatopteron, Polystichum herbaceum, Polystichum imbricans, Polystichum incongruum, Polystichum kruckebergii/, Polystichum kwakiutlii, Polystichum lachenense, Polystichum lanceolatum, Polystichum lemmonii, Polystichum lentum, Polystichum lonchitis, Polystichum longidens, Polystichum longipaleatum, Polystichum longipes, Polystichum luctuosum, Polystichum macleae, Polystichum macrochlaenum, Polystichum makinoi, Polystichum martini, Polystichum mayebarae, Polystichum mediocre, Polystichum medogense, Polystichum microchlamys, Polystichum mohrioides, Polystichum mollissimum, Polystichum monticola, Polystichum moorei, Polystichum morii, Polystichum moupinense, Polystichum munitum, Polystichum muricatum, Polystichum nakenense, Polystichum neolobatum, Polystichum nepalense, Polystichum ningshenense, Polystichum obliquum, Polystichum omeiense, Polystichum ordinatum, Polystichum orientalitibeticum, Polystichum paramoupinense, Polystichum parvipinnulum, Polystichum piceopaleaceum, Polystichum polyblepharum, Polystichum prescottianum, Polystichum prionolepis, Polystichum proliferum, Polystichum pseudocastaneum, Polystichum pseudomakinoi, Polystichum punctiferum, Polystichum pungens, Polystichum qamdoense, Polystichum retrosopaleaceum, Polystichum rhombiforme, Polystichum rhomboidea, Polystichum richardii, Polystichum rigens, Polystichum rotundilobum, Polystichum scopulinum, Polystichum semifertile, Polystichum setiferum, Polystichum setigerum, Polystichum shensiense, Polystichum silvaticum, Polystichum simplicipinnum, Polystichum sinense, Polystichum squarrosum, Polystichum stenophyllum, Polystichum stimulans, Polystichum submite, Polystichum tacticopterum, Polystichum thomsoni, Polystichum tibeticum, Polystichum transvaalense, Polystichum tripteron, Polystichum tsus-simense, Polystichum vestitum, Polystichum wattii, Polystichum whiteleggei, Polystichum xiphophyllum, Polystichum yadongense и Polystichum yunnanense.

В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, получают из вида папоротников порядка Polypodiales, семейства Dryopteridaceae, рода Cyrtomium, выбранного без ограничения из Cyrtomium aequibasis, Cyrtomium balansae, Cyrtomium brevicuneatum, Cyrtomium calcicola, Cyrtomium caryotideum, Cyrtomium caudatum, Cyrtomium confertifolium, Cyrtomium conforme, Cyrtomium coriaceum, Cyrtomium cuneatum, Cyrtomium devexiscapulae, Cyrtomium dubium, Cyrtomium falcatum, Cyrtomium falcipinnum, Cyrtomium fengianum, Cyrtomium fortunei, Cyrtomium fraxinellum, Cyrtomium houi, Cyrtomium integrum, Cyrtomium laetevirens, Cyrtomium latifalcatum, Cyrtomium lonchitoides, Cyrtomium longipes, Cyrtomium macrophyllum, Cyrtomium maximum, Cyrtomium mediocre, Cyrtomium megaphyllum, Cyrtomium micropterum, Cyrtomium moupingense, Cyrtomium neocaryotideum, Cyrtomium nephrolepioides, Cyrtomium nervosum, Cyrtomium obliquum, Cyrtomium omeiense, Cyrtomium ovale, Cyrtomium pseudocaudipinnum, Cyrtomium recurvum, Cyrtomium retrosopaleaceum, Cyrtomium salicipinnum, Cyrtomium serratum, Cyrtomium shandongense, Cyrtomium simile, Cyrtomium sinicum, Cyrtomium sinningense, Cyrtomium spectabile, Cyrtomium taiwanianum, Cyrtomium takusicola, Cyrtomium tengii, Cyrtomium trapezoideum, Cyrtomium tsinglingense, Cyrtomium uniseriale, Cyrtomium urophyllum, Cyrtomium vittatum, Cyrtomium wangianum, Cyrtomium yiangshanense, Cyrtomium yuanum и Cyrtomium yunnanense.

В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, получают из вида папоротников порядка Polypodiales, семейства Polypodiaceae, рода Platycerium, выбранного без ограничения из Platycerium andinum, Platycerium alcicorne, Platycerium bifurcatum, Platycerium coronarium, Platycerium elephantotis, Platycerium ellisii, Platycerium grande, Platycerium hillii, Platycerium holttumii, Platycerium madagascariense, Platycerium quadridichotomum, Platycerium ridleyi, Platycerium stemaria, Platycerium superbum, Platycerium veitchii, Platycerium wallichii, Platycerium wandae, Platycerium wilhelminae-reginae и Platycerium willinkii.

В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, получают из вида папоротников порядка Polypodiales, семейства Polypodiaceae, рода Aglaomorpha, выбранного без ограничения из Aglaomorpha acuminata, Aglaomorpha brooksii, Aglaomorpha cornucopia, Aglaomorpha coronans, Aglaomorpha drynarioides, Aglaomorpha heraclea, Aglaomorpha hieronymi, Aglaomorpha latipinna, Aglaomorpha meyeniana, Aglaomorpha nectarifera, Aglaomorpha novoguineensis, Aglaomorpha parkinsoni, Aglaomorpha pilosa и Aglaomorpha splendens.

В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, получают из вида папоротников порядка Cyatheales, семейства Cyatheaceae, рода Cyathea, подрода Cyathea, выбранных без ограничения из Cyathea acutidens, Cyathea aemula, Cyathea alata, Cyathea albomarginata, Cyathea alphonsiana, Cyathea alstonii, Cyathea amazonica, Cyathea andina, Cyathea arborea, Cyathea armata, Cyathea ars, Cyathea aspera, Cyathea atahuallpa, Cyathea aterrima, Cyathea atrovirens, Cyathea australis Cyathea barringtonii, Cyathea × bernardii, Cyathea bettinae, Cyathea bicrenata, Cyathea bipinnata, Cyathea boliviana, Cyathea borinquena, Cyathea bradei, Cyathea brevistipes, Cyathea brunnescens, Cyathea × calolepis, Cyathea caracasana, Cyathea cicatricosa, Cyathea concordia, Cyathea conformis, Cyathea conjugata, Cyathea corallifera, Cyathea costaricensis, Cyathea cranhamii, Cyathea cyatheoides, Cyathea cyclodium, Cyathea cystolepis, Cyathea darienensis, Cyathea decomposita, Cyathea decorata, Cyathea decurrens, Cyathea delgadii, Cyathea demissa, Cyathea dichromatolepis, Cyathea dissimilis, Cyathea dissoluta, Cyathea divergens, Cyathea dombeyi, Cyathea dudleyi, Cyathea ebenina, Cyathea estelae, Cyathea falcata, Cyathea frigida, Cyathea fulva, Cyathea furfuracea, Cyathea gardneri, Cyathea gibbosa, Cyathea glauca, Cyathea gracilis, Cyathea halonata, Cyathea harrisii, Cyathea haughtii, Cyathea hemiepiphytica, Cyathea hirsuta, Cyathea hodgeana, Cyathea holdridgeana, Cyathea howeana, Cyathea impar, Cyathea intramarginalis, Cyathea jamaicensis, Cyathea kalbreyeri, Cyathea lasiosora, Cyathea latevagens, Cyathea lechleri, Cyathea leucofolis, Cyathea × lewisii, Cyathea lockwoodiana, Cyathea macrocarpa, Cyathea macrosora, Cyathea marginalis, Cyathea microdonta, Cyathea microphylla, Cyathea microphylla, Cyathea mucilagina, Cyathea multiflora, Cyathea multisegmenta, Cyathea myosuroides, Cyathea nanna, Cyathea nesiotica, Cyathea nigripes, Cyathea nodulifera, Cyathea notabilis, Cyathea onusta, Cyathea palaciosii, Cyathea paladensis, Cyathea pallescens, Cyathea parianensis, Cyathea parva, Cyathea parvula, Cyathea pauciflora, Cyathea petiolata, Cyathea phalaenolepis, Cyathea phalerata, Cyathea phegopteroides, Cyathea pilosissima, Cyathea pinnula, Cyathea platylepis, Cyathea poeppigii, Cyathea praecincta, Cyathea pseudonanna, Cyathea pubens, Cyathea punctata, Cyathea pungens, Cyathea robertsiana, Cyathea rufa, Cyathea ruiziana, Cyathea sagittifolia, Cyathea schiedeana, Cyathea schlimii, Cyathea senilis, Cyathea simplex, Cyathea sipapoensis, Cyathea speciosa, Cyathea squamulosa, Cyathea steyermarkii, Cyathea stipularis, Cyathea stokesii, Cyathea stolzei, Cyathea straminea, Cyathea subtropica, Cyathea suprastrigosa, Cyathea surinamensis, Cyathea tenera, Cyathea tortuosa, Cyathea trichiata, Cyathea tryonorum, Cyathea ursina, Cyathea valdecrenata, Cyathea venezuelensis, Cyathea villosa, Cyathea weatherbyana, Cyathea wendlandii, Cyathea werffii, Cyathea williamsii.

В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, получают из вида папоротников порядка Polypodiales, семейства Davalliaceae, рода Davallia, выбранного без ограничения из Davallia angustata, Davallia assamica, Davallia brassii, Davallia brevipes, Davallia canariensis, Davallia corniculata, Davallia denticulata, Davallia embolostegia, Davallia falcinella, Davallia graeffei, Davallia griffithiana, Davallia heterophylla, Davallia leptocarpa, Davallia parvula, Davallia pectinata, Davallia pentaphylla, Davallia repens, Davallia rouffaeriensis, Davallia seramensis, Davallia sessilifolia, Davallia sessilifolioides, Davallia solida, Davallia speciosa, Davallia tasmanii, Davallia trichomanoides, Davallia triphylla, Davallia undulata, Davallia wagneriana и Davallia yunnanensis.

В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, получают из вида папоротников порядка Schizaeales, семейства Lygodiaceae, рода Lygodium, выбранного без ограничения из Lygodium altum, Lygodium articulatum, Lygodium boivini Kuhn, Lygodium borneense Alderw., Lygodium circinnatum, Lygodium colaniae, Lygodium conforme, Lygodium cubense, Lygodium dimorphum, Lygodium flexuosum, Lygodium giganteum, Lygodium heterodoxum, Lygodium hians, Lygodium japonicum, Lygodium kerstenii, Lygodium lanceolatum, Lygodium longifolium, Lygodium merrillii, Lygodium microphyllum, Lygodium oligostachyum, Lygodium palmatum, Lygodium pedicellatum, Lygodium polystachyum, Lygodium radiatum, Lygodium reticulatum, Lygodium salicifolium, Lygodium smithianum, Lygodium subareolatum, Lygodium trifurcatum, Lygodium venustum, Lygodium versteegii, Lygodium volubile, Lygodium x fayae, Lygodium x lancetillanum и Lygodium yunnanense.

В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, получают из вида класса Isoetopsida или класса Lycopodiopsida.

В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, получают из вида класса Isoetopsida, порядка Selaginales. В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, получают из вида класса Isoetopsida, порядка Selaginales, семейства Selaginellaceae. В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, получают из вида плаунов рода Selaginella. В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, получают из вида Selaginella, выбранного без ограничения из Selaginella acanthonota, Selaginella apoda, Selaginella arbuscula, Selaginella arenicola, Selaginella arizonica, Selaginella armata, Selaginella asprella, Selaginella biformis, Selaginella bigelovii, Selaginella braunii, Selaginella cinerascens, Selaginella cordifolia, Selaginella deflexa, Selaginella delicatula, Selaginella densa, Selaginella douglasii, Selaginella eatonii, Selaginella eclipes, Selaginella eremophila, Selaginella erythropus, Selaginella flabellata, Selaginella hansenii, Selaginella heterodonta, Selaginella kraussiana, Selaginella krugii, Selaginella laxifolia, Selaginella lepidophylla, Selaginella leucobryoides, Selaginella ludoviciana, Selaginella mutica, Selaginella oregana, Selaginella ovifolia, Selaginella pallescens, Selaginella peruviana, Selaginella pilifera, Selaginella plana, Selaginella plumosa, Selaginella pulcherrima, Selaginella rupestris, Selaginella rupincola, Selaginella scopulorum, Selaginella selaginoides, Selaginella sibirica, Selaginella standleyi, Selaginella stellata, Selaginella subcaulescens, Selaginella substipitata, Selaginella tenella, Selaginella tortipila, Selaginella uliginosa, Selaginella umbrosa, Selaginella uncinata, Selaginella underwoodii, Selaginella utahensis, Selaginella victoriae, Selaginella viridissima, Selaginella wallacei, Selaginella watsonii, Selaginella weatherbiana, Selaginella willdenowii, Selaginella wrightii и Selaginella X neomexicana.

В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, получают из вида класса Lycopodiopsida, порядка Lycopodiales, семейства Huperziaceae, рода Huperzia, выбранного без ограничения из Huperzia acerosa, Huperzia appressa, Huperzia arctica, Huperzia attenuata, Huperzia australiana, Huperzia balansae, Huperzia billardieri, Huperzia brachiata, Huperzia bradeorum, Huperzia brevifolia, Huperzia campiana, Huperzia capellae, Huperzia capillaris, Huperzia carinata, Huperzia chamaeleon, Huperzia compacta, Huperzia crassa, Huperzia cumingii, Huperzia cuneifolia, Huperzia curvifolia, Huperzia dacrydioides, Huperzia dentata, Huperzia dichaeoides, Huperzia dichotoma, Huperzia ericifolia, Huperzia eversa, Huperzia filiformis, Huperzia foliacea, Huperzia fordii, Huperzia funiformis, Huperzia hastata, Huperzia heteroclita, Huperzia hippuridea, Huperzia hippuris, Huperzia hoffmannii, Huperzia holstii, Huperzia homocarpa, Huperzia horizontalis, Huperzia hystrix, Huperzia lancifolia, Huperzia lindenii, Huperzia linifolia, Huperzia lockyeri, Huperzia lucidula, Huperzia mannii, Huperzia megastachya, Huperzia mesoamericana, Huperzia mingcheensis, Huperzia mollicoma, Huperzia myrsinites, Huperzia nummularifolia, Huperzia nutans, Huperzia ophioglossoides, Huperzia pflanzii, Huperzia phlegmaria, Huperzia phlegmarioides, Huperzia pithyodes, Huperzia pittieri, Huperzia polycarpos, Huperzia polydactyla, Huperzia porophila, Huperzia prolifera, Huperzia reflexa, Huperzia rosenstockiana, Huperzia rufescens, Huperzia salvinioides, Huperzia sarmentosa, Huperzia selago, Huperzia serrata, Huperzia sieboldii, Huperzia squarrosa, Huperzia subulata, Huperzia talamancana, Huperzia tauri, Huperzia taxifolia, Huperzia tenuis, Huperzia tetragona, Huperzia tetrasticha, Huperzia tubulosa, Huperzia unguiculata, Huperzia varia, Huperzia verticillata и Huperzia wilson.

В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, получают из вида класса Lycopodiopsida, порядка Lycopodiales, семейства Lycopodiaceae, рода Lycopodium, выбранного без ограничения из Lycopodium alpinum L., Lycopodium annotinum L., Lycopodium clavatum L., Lycopodium complanatum L., Lycopodium dendroideum Michx., Lycopodium digitatum, Lycopodium ×habereri, Lycopodium hickeyi, Lycopodium ×issleri, Lycopodium lagopus, Lycopodium obscurum L., Lycopodium phlegmaria L., Lycopodium sabinifolium, Lycopodium sitchense, Lycopodium tristachyum, Lycopodium venustulum, Lycopodium venustulum var. venustulum, Lycopodium venustulum var. verticale, Lycopodium volubile и Lycopodium ×zeilleri.

Также представлены молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют продукты транскрипции и/или трансляции, которые впоследствии подвергаются сплайсингу с образованием, в конечном итоге, функциональных полипептидов PtIP-96. Сплайсинг может осуществляться in vitro или in vivo, и он может включать цис- или транс-сплайсинг. Субстратом для сплайсинга могут быть полинуклеотиды (например, РНК-транскрипты) или полипептиды. Примером цис-сплайсинга полинуклеотида является ситуация, когда интрон, вставленный в кодирующую последовательность, удаляется и два фланкирующих экзонных участка соединяются с образованием последовательности, кодирующей полипептид PtIP-96. Примером транс-сплайсинга будет ситуация, когда полинуклеотид кодируется с разделением кодирующей последовательности на два или более фрагментов, которые могут транскрибироваться раздельно, а затем соединяться с образованием пестицидной кодирующей последовательности полной длины. Применение последовательности энхансера сплайсинга, которую можно вводить в конструкцию, может облегчать сплайсинг, как при цис-, так и при транс-сплайсинге полипептидов (патенты США №№ 6365377 и 6531316). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды напрямую не кодируют полипептид PtIP-96 полной длины, а кодируют фрагмент или фрагменты полипептида PtIP-96. Эти полинуклеотиды можно применять для экспрессии функционального полипептида PtIP-96 посредством механизма, включающего сплайсинг, при этом сплайсинг может происходить на уровне полинуклеотида (например, интрон/экзон) и/или полипептида (например, интеин/экстеин). Это может быть применимо, например, при регуляции экспрессии пестицидной активности, поскольку функциональный пестицидный полипептид будет экспрессироваться только в том случае, если все требуемые фрагменты экспрессируются в среде, которая обеспечивает возможность процессов сплайсинга с образованием функционального продукта. В другом примере введение одной или нескольких последовательностей вставок в полинуклеотид может облегчать рекомбинацию с полинуклеотидом с низкой гомологией; применение интрона или интеина для последовательности вставки облегчает удаление встроенной последовательности, что тем самым восстанавливает функцию кодируемого варианта.

Молекулы нуклеиновой кислоты, которые являются фрагментами этих последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептиды PIP-96, также охватываются вариантами осуществления. Используемый в данном документе "фрагмент" относится к части последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид PtIP-96. Фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты может кодировать биологически активную часть полипептида PtIP-96, или он может представлять собой фрагмент, который можно применять в качестве гибридизационного зонда или ПЦР-праймера с применением раскрытых ниже способов. Молекулы нуклеиновой кислоты, которые являются фрагментами последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид PtIP-96, содержат по меньшей мере приблизительно 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330 или 360 смежных нуклеотидов или вплоть до количества нуклеотидов, присутствующих в последовательности нуклеиновой кислоты полной длины, кодирующей полипептид PtIP-96, раскрытый в данном документе, в зависимости от предполагаемого применения. "Смежные нуклеотиды" применяется в данном документе для обозначения нуклеотидных остатков, которые непосредственно прилегают друг к другу. Фрагменты последовательностей нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления будут кодировать фрагменты белка, которые сохраняют биологическую активность полипептида PtIP-96Aa и, вследствие этого, сохраняют инсектицидную активность. "Сохраняет инсектицидную активность" применяют в данном документе для обозначения полипептида, обладающего по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 70%, 80%, 90%, 95% или большей инсектицидной активностью полипептида PtIP-96Aa полной длины (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах осуществления инсектицидная активность представляет собой активность в отношении Lepidoptera. В одном варианте осуществления инсектицидная активность представляет собой активность против видов жесткокрылых. В некоторых вариантах осуществления инсектицидная активность представляет собой активность против одного или нескольких насекомых вредителей из группы кукурузного жука: западного кукурузного жука, Diabrotica virgifera; северного кукурузного жука, D. barberi: блошки одиннадцатиточечной Говарда или жука-блошки одиннадцатиточечной; Diabrotica undecimpunctata howardi и мексиканского кукурузного жука, D. virgifera zeae. В одном варианте осуществления инсектицидная активность представляет собой активность против вида Diabrotica.

В некоторых вариантах осуществления фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид PtIP-96, кодирующий биологически активную часть белка, будет кодировать по меньшей мере приблизительно 15, 20, 30, 50, 75, 100, 125 смежных аминокислот или вплоть до общего количества аминокислот, присутствующих в полипептиде PtIP-96 полной длины согласно вариантам осуществления. В некоторых вариантах осуществления фрагмент представляет собой N-терминальное и/или C-терминальное усечение по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или более аминокислот с N-конца и/или C-конца относительно SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108 или их вариантов, например, путем протеолиза, вставки старт-кодона, делеции кодонов, кодирующих удаляемые аминокислоты, с одновременной вставкой стоп-кодона или путем вставки стоп-кодона в кодирующую последовательность.

В некоторых вариантах осуществления полипептид PtIP-96 кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, достаточно гомологичной последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107 или SEQ ID NO: 109. "Достаточно гомологичный" применяется в данном документе для обозначения аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты, последовательность которой по меньшей мере приблизительно на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологична эталонной последовательности при применении одной из программ выравнивания, описанных в данном документе, с применением стандартных параметров. Специалисту в данной области техники будет понятно, что эти значения можно соответствующим образом скорректировать для определения соответствующей гомологии белков, кодируемых двумя последовательностями нуклеиновой кислоты, принимая во внимание вырожденность кодонов, аминокислотное сходство, расположение рамки считывания и т. п. В некоторых вариантах осуществления гомология последовательностей определяется в отношении последовательности полной длины полинуклеотида, кодирующего полипептид PtIP-96, или в отношении последовательности полной длины полипептида PtIP-96.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид PtIP-96, выбрана из последовательности с любым из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107 или SEQ ID NO: 109.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует полипептид PtIP-96, последовательность которого по меньшей мере на приблизительно 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична последовательности под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108.

В некоторых вариантах осуществления идентичность последовательностей рассчитывают с применением алгоритма ClustalW в модуле ALIGNX® пакета программ Vector NTI® Program Suite (Invitrogen Corporation, Карлсбад, Калифорния) со всеми параметрами по умолчанию. В некоторых вариантах осуществления идентичность последовательностей рассчитывают по всей длине полипептида с применением алгоритма ClustalW в модуле ALIGNX пакета программ Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Карлсбад, Калифорния) со всеми параметрами по умолчанию.

Для определения процентной идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновой кислоты осуществляют выравнивание последовательностей для целей оптимального сравнения. Процентная идентичность двух последовательностей является функцией количества идентичных положений, имеющихся в последовательностях (т. е. процентная идентичность=количество идентичных положений/общее количество положений (например, перекрывающихся положений)×100). В одном варианте осуществления две последовательности имеют одинаковую длину. В другом варианте осуществления сравнение проводят по всей протяженности эталонной последовательности (например, по всей протяженности SEQ ID NO: 1). Процентную идентичность двух последовательностей можно определить с применением методик, аналогичных описанным ниже, которые допускают присутствие гэпов или не допускают присутствия гэпов. При расчете процентной идентичности, как правило, подсчитывают точные совпадения.

Другим неограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм Needleman и Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453, использующий программное обеспечение GAP версии 10 для определения идентичности и сходства последовательностей с применением следующих параметров по умолчанию: % идентичности и % сходства для последовательности нуклеиновой кислоты с применением штрафа за открытие гэпа 50, и штрафа за продолжение гэпа 3, и матрицы замен nwsgapdna.cmpii; % идентичности или % сходства для аминокислотной последовательности с применением штрафа за открытие гэпа 8, и штрафа за продолжение гэпа 2, и матрицы замен BLOSUM62. Также можно применять эквивалентные программы. "Эквивалентная программа" применяется в данном документе для обозначения любой программы для сравнения последовательностей, которая для любых двух исследуемых последовательностей генерирует выравнивание, характеризующееся идентичными совпадениями нуклеотидов и идентичной процентной идентичностью последовательности при сравнении с соответствующим выравниванием, сгенерированным с помощью GAP версии 10.

Варианты осуществления также охватывают молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты полипептида PtIP-96. "Варианты" последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептид PtIP-96, включают последовательности, которые кодируют полипептиды PtIP-96, раскрытые в данном документе, но которые отличаются консервативными заменами, обусловленными вырожденностью генетического кода, а также последовательности, которые являются достаточно идентичными, как обсуждалось выше. Встречающиеся в природе аллельные варианты можно идентифицировать с применением хорошо известных методик молекулярной биологии, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и методики гибридизации, изложенные ниже. Вариантные последовательности нуклеиновой кислоты также включают синтетически полученные последовательности нуклеиновой кислоты, которые были получены, например, с применением сайт-направленного мутагенеза, но которые все еще кодируют раскрытые полипептиды PtIP-96, обсуждаемые ниже.

Настоящее раскрытие предусматривает выделенные или рекомбинантные полинуклеотиды, которые кодируют любые из полипептидов PtIP-96, раскрытых в данном документе. Специалисты в данной области техники легко поймут, что вследствие вырожденности генетического кода существует множество нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептиды PtIP-96 согласно настоящему раскрытию.

Также специалисту в данной области техники будет понятно, что изменения можно вводить путем внесения мутаций в последовательности нуклеиновой кислоты, что ведет к изменениям в аминокислотной последовательности кодируемых полипептидов PtIP-96 без изменения биологической активности белка. Таким образом, вариантные молекулы нуклеиновой кислоты можно создавать путем введения одной или нескольких нуклеотидных замен, добавлений и/или делеций в соответствующую последовательность нуклеиновой кислоты, раскрытую в данном документе, так что одна или несколько аминокислотных замен, добавлений или делеций вводятся в кодируемый белок. Мутации можно вводить при помощи стандартных методик, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Такие вариантные последовательности нуклеиновой кислоты также охватываются настоящим раскрытием.

В качестве альтернативы, вариантные последовательности нуклеиновой кислоты можно получать путем введения мутаций случайным образом по всей или части кодирующей последовательности, как, например, путем сайт-насыщающего мутагенеза, и полученных мутантов можно подвергать скринингу в отношении способности обеспечивать пестицидную активность для идентификации мутантов, которые сохраняют активность. После мутагенеза кодируемый белок можно экспрессировать рекомбинантным способом, и активность белка можно определять с применением стандартных методик анализа.

Полинуклеотиды согласно настоящему раскрытию и их фрагменты необязательно применяют в качестве субстратов для ряда реакций рекомбинации и рекуррентной рекомбинации, в дополнение к стандартным способам клонирования, изложенным, например, в Ausubel, Berger и Sambrook, т. е. для получения дополнительных гомологов пестицидных полипептидов и их фрагментов с требуемыми свойствами. Известен ряд таких реакций, в том числе разработанные авторами настоящего изобретения и их сотрудниками. Способы получения варианта любой нуклеиновой кислоты, приведенной в данном документе, включают рекуррентную рекомбинацию такого полинуклеотида со вторым (или большим количеством) полинуклеотидом, таким образом, получение библиотеки вариантных полинуклеотидов также представляет собой варианты осуществления согласно настоящему раскрытию, также как и полученные библиотеки, клетки, содержащие библиотеки, и любой рекомбинантный полинуклеотид, полученный такими способами. Дополнительно, такие способы необязательно включают отбор вариантного полинуклеотида из таких библиотек на основе пестицидной активности, как есть, где такую рекуррентную рекомбинацию осуществляют in vitro или in vivo.

Ряд протоколов создания разнообразия, в том числе протоколы рекуррентной рекомбинации нуклеиновых кислот, доступны и полностью описаны в уровне техники. Методики можно применять отдельно и/или в комбинации для получения одного или нескольких вариантов нуклеиновой кислоты или набора нуклеиновых кислот, а также вариантов кодируемых белков. По отдельности и вместе эти методики обеспечивают надежные, широко используемые способы создания диверсифицированных нуклеиновых кислот и наборов нуклеиновых кислот (в том числе, например, библиотек нуклеиновых кислот), применимых, например, для конструирования или быстрой эволюции нуклеиновых кислот, белков, метаболических путей, клеток и/или организмов с новыми и/или улучшенными характеристиками.

Хотя в ходе следующего обсуждения для ясности проводят разграничение и классификацию, будет принято во внимание, что методики часто не являются взаимоисключающими. Более того, различные способы можно применять по отдельности или в комбинации, одновременно или последовательно, для достижения различных вариантов последовательностей.

Результатом осуществления любой из методик создания разнообразия, описанных в данном документе, может быть создание одной или нескольких нуклеиновых кислот, которые можно подвергнуть отбору или скринингу в отношении нуклеиновых кислот, имеющих требуемые свойства или обеспечивающих их, или нуклеиновых кислот, которые кодируют белки, имеющие требуемые свойства или обеспечивающие их. После диверсификации с помощью одного или нескольких способов, описанных в данном документе или иным образом доступных специалисту в данной области, любые получаемые нуклеиновые кислоты можно подвергать отбору в отношении требуемой активности или свойства, например, пестицидной активности или такой активности при требуемом pH и т. д. Это может включать идентификацию любой активности, которую можно выявить, например, в автоматизированном или автоматизируемом формате, посредством любого из анализов, известных из уровня техники, см., например, обсуждение скрининга в отношении инсектицидной активности, ниже. Можно оценивать ряд связанных (или даже несвязанных) свойств последовательно или одновременно, на усмотрение специалиста-практика.

Описания ряда методик создания разнообразия для создания модифицированных последовательностей нуклеиновой кислоты, например, последовательностей, кодирующих полипептиды с пестицидной активностью или их фрагменты, можно найти в следующих публикациях и литературе, процитированной в них: Soong, et al., (2000) Nat Genet 25(4):436-439; Stemmer, et al., (1999) Tumor Targeting 4:1-4; Ness, et al., (1999) Nat Biotechnol 17:893-896; Chang, et al., (1999) Nat Biotechnol 17:793-797; Minshull and Stemmer, (1999) Curr Opin Chem Biol 3:284-290; Christians, et al., (1999) Nat Biotechnol 17:259-264; Crameri, et al., (1998) Nature 391:288-291; Crameri, et al., (1997) Nat Biotechnol 15:436-438; Zhang, et al., (1997) PNAS USA 94:4504-4509; Patten, et al., (1997) Curr Opin Biotechnol 8:724-733; Crameri, et al., (1996) Nat Med 2:100-103; Crameri, et al., (1996) Nat Biotechnol 14:315-319; Gates, et al., (1996) J Mol Biol 255:373-386; Stemmer, (1996) "Sexual PCR and Assembly PCR" в: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, New York. pp. 447-457; Crameri and Stemmer, (1995) BioTechniques 18:194-195; Stemmer, et al., (1995) Gene, 164:49-53; Stemmer, (1995) Science 270: 1510; Stemmer, (1995) Bio/Technology 13:549-553; Stemmer, (1994) Nature 370:389-391 и Stemmer, (1994) PNAS USA 91:10747-10751.

Мутационные способы создания разнообразия включают, например, сайт-направленный мутагенез (Ling, et al., (1997) Anal Biochem 254(2):157-178; Dale, et al., (1996) Methods Mol Biol 57:369-374; Smith, (1985) Ann Rev Genet 19:423-462; Botstein and Shortle, (1985) Science 229:1193-1201; Carter, (1986) Biochem J 237:1-7 и Kunkel, (1987) "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis" в Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein and Lilley, eds., Springer Verlag, Berlin)); мутагенез с применением урацил-содержащих матриц (Kunkel, (1985) PNAS USA 82:488-492; Kunkel, et al., (1987) Methods Enzymol 154:367-382 и Bass, et al., (1988) Science 242:240-245); олигонуклеотид-направленный мутагенез (Zoller and Smith, (1983) Methods Enzymol 100:468-500; Zoller and Smith, (1987) Methods Enzymol 154:329-350 (1987); Zoller and Smith, (1982) Nucleic Acids Res 10:6487-6500), мутагенез фосфоротиоат-модифицированной ДНК (Taylor, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:8749-8764; Taylor, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:8765-8787 (1985); Nakamaye and Eckstein, (1986) Nucl Acids Res 14:9679-9698; Sayers, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:791-802 и Sayers, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:803-814); мутагенез с применением дуплексной ДНК с брешью (Kramer, et al., (1984) Nucl Acids Res 12:9441-9456; Kramer and Fritz, (1987) Methods Enzymol 154:350-367; Kramer, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:7207 и Fritz, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:6987-6999).

Дополнительные подходящие способы включают точечную репарацию ошибочно спаренных оснований (Kramer, et al., (1984) Cell 38:879-887), мутагенез с применением штаммов-хозяев с недостаточностью репарации (Carter, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:4431-4443 и Carter, (1987) Methods in Enzymol 154:382-403), делеционный мутагенез (Eghtedarzadeh and Henikoff, (1986) Nucl Acids Res 14:5115), рестрикцию-отбор и рестрикцию-очистку (Wells, et al., (1986) Phil Trans R Soc Lond A 317:415-423), мутагенез посредством синтеза полного гена (Nambiar, et al., (1984) Science 223:1299-1301; Sakamar and Khorana, (1988) Nucl Acids Res 14:6361-6372; Wells, et al., (1985) Gene 34:315-323 и Grundström, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:3305-3316), репарацию двухцепочечных разрывов (Mandecki, (1986) PNAS USA, 83:7177-7181, и Arnold, (1993) Curr Opin Biotech 4:450-455). Дополнительные сведения по многим из вышеуказанных способов можно найти в Methods Enzymol, том 154, в котором также описаны полезные руководства по поиску и устранению проблем в случае различных способов мутагенеза.

Дополнительные сведения, касающиеся различных способов создания разнообразия, можно найти в следующих патентах США, публикациях и заявках согласно PCT и публикациях EPO: патент США № 5723323, патент США № 5763192, патент США № 5814476, патент США № 5817483, патент США № 5824514, патент США № 5976862, патент США № 5605793, патент США № 5811238, патент США № 5830721, патент США № 5834252, патент США № 5837458, WO 1995/22625, WO 1996/33207, WO 1997/20078, WO 1997/35966, WO 1999/41402, WO 1999/41383, WO 1999/41369, WO 1999/41368, EP 752008, EP 0932670, WO 1999/23107, WO 1999/21979, WO 1998/31837, WO 1998/27230, WO 1998/27230, WO 2000/00632, WO 2000/09679, WO 1998/42832, WO 1999/29902, WO 1998/41653, WO 1998/41622, WO 1998/42727, WO 2000/18906, WO 2000/04190, WO 2000/42561, WO 2000/42559, WO 2000/42560, WO 2001/23401 и PCT/US01/06775.

Нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления также можно применять для выделения соответствующих последовательностей из вида папоротников отдела Pteridophyta или вида плаунов рода Selaginella. Таким образом, такие способы как ПЦР, гибридизация и т. п., можно применять для идентификации таких последовательностей исходя из их гомологии с последовательностями, изложенными в данном документе. Вариантами осуществления охватываются последовательности, выбранные на основе идентичности последовательности с полными последовательностями, изложенными в данном документе, или их фрагментами. Такие последовательности включают последовательности, которые являются ортологами раскрытых последовательностей. Термин "ортологи" относится к генам, происходящим от общего предкового гена и выявляемым у различных видов вследствие видообразования. Гены, обнаруживаемые у различных видов, считаются ортологами, если их нуклеотидные последовательности и/или кодируемые ими белковые последовательности имеют существенную степень идентичности, как определено в других разделах в данном документе. Функции ортологов часто являются высококонсервативными у разных видов.

В случае подхода, основанного на ПЦР, можно сконструировать олигонуклеотидные праймеры для применения в ПЦР-реакциях для амплификации соответствующих последовательностей ДНК на основании кДНК или геномной ДНК, извлеченных из какого-либо организма, представляющего интерес. Способы конструирования ПЦР-праймеров и ПЦР-клонирования в целом известны из уровня техники и раскрыты в Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York), в дальнейшем "Sambrook". См. также, Innis, et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); и Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Известные способы ПЦР включают без ограничения способы с применением парных праймеров, гнездовых праймеров, одиночных специфичных праймеров, вырожденных праймеров, ген-специфических праймеров, вектор-специфических праймеров, праймеров, в которых часть нуклеотидов являются ошибочно спаренными и т. п.

Для идентификации потенциальных полипептидов PtIP-96 из коллекций папоротников или мхов, лизаты клеток папоротников или мхов можно подвергнуть скринингу с помощью антител, вырабатываемых против полипептидов PtIP-96 и/или полипептидов PtIP-96, с применением способов вестерн-блоттинга и/или ELISA. Этот тип анализов можно проводить высокопроизводительным образом. Положительные образцы можно дополнительно анализировать при помощи различных методик, таких как очистка и идентификация белков при помощи антител. Способы получения антител хорошо известны из уровня техники, как обсуждается ниже.

В качестве альтернативы, для идентификации гомологов полипептидов PtIP-96 можно применять способ идентификации белков на основе масс-спектрометрии с применением протоколов из литературных источников (Scott Patterson, (1998), 10.22, 1-24, Current Protocol in Molecular Biology, опубликованный John Wiley & Son Inc). Точнее говоря, способ идентификации белков на основе LC-MS/MS применяют для установления связи MS-данных указанных клеточных лизатов или образцов, обогащенных молекулами с требуемым молекулярным весом (вырезанных из геля SDS-PAGE полосок с молекулярным весом, соответствующим полипептидам PtIP-96), с информацией о последовательности полипептидов PtIP-96 под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108 и их гомологов. Любое совпадение в пептидных последовательностях указывает на возможность наличия гомологичных белков в образцах. Дополнительные методики (способы очистки белка и методики молекулярной биологии) можно применять для выделения белка и идентификации последовательностей гомологов.

В способах гибридизации для скрининга кДНК или геномных библиотек можно применять всю или часть последовательности пестицидной нуклеиновой кислоты. Способы для конструирования таких кДНК и геномных библиотек в целом известны из уровня техники и раскрыты в Sambrook и Russell, (2001), выше. Так называемые гибридизационные зонды могут представлять собой фрагменты геномной ДНК, фрагменты кДНК, фрагменты РНК или другие олигонуклеотиды, и они могут быть помечены детектируемой группой, такой как 32P, или любым другим детектируемым маркером, таким как другие радиоактивные изотопы, флуоресцентным соединением, ферментом или кофактором фермента. Зонды для гибридизации можно создавать путем мечения синтетических олигонуклеотидов, основанных на известной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид PtIP-96, раскрытой в данном документе. Дополнительно можно применять вырожденные праймеры, сконструированные на основе консервативных нуклеотидов или аминокислотных остатков в последовательности нуклеиновой кислоты или кодируемой аминокислотной последовательности. Зонд, как правило, содержит участок последовательности нуклеиновой кислоты, который гибридизуется при жестких условиях по меньшей мере с приблизительно 12, по меньшей мере с приблизительно 25, по меньшей мере с приблизительно 50, 75, 100, 125, 150, 175 или 200 смежными нуклеотидами последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид PtIP-96 согласно настоящему раскрытию или его фрагмент или вариант. Способы получения зондов для гибридизации, в целом, известны из уровня техники и раскрыты в Sambrook и Russell (2001), выше, включенном в данный документ посредством ссылки.

Например, полную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид PtIP-96, раскрытую в данном документе, или одну или несколько ее частей можно применять в качестве зонда, способного специфично гибридизоваться с соответствующими последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими последовательности, подобные полипептиду PtIP-96, и матричными РНК. Для достижения специфической гибридизации при различных условиях такие зонды включают последовательности, которые являются уникальными, и предпочтительно имеют длину по меньшей мере приблизительно 10 нуклеотидов или по меньшей мере приблизительно 20 нуклеотидов. Такие зонды можно применять для амплификации соответствующих пестицидных последовательностей из выбранного организма с помощью ПЦР. Эту методику можно применять для выделения дополнительных кодирующих последовательностей из требуемого организма или в качестве диагностического анализа для определения присутствия кодирующих последовательностей в организме. Методики гибридизации включают гибридизационный скрининг высеянных ДНК-библиотек (либо бляшек, либо колоний; см., например, Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Гибридизацию таких последовательностей можно проводить в жестких условиях. "Жесткие условия" или "жесткие условия гибридизации" применяются в данном документе для обозначения условий, при которых зонд будет гибридизоваться со своей целевой последовательностью в явно большей степени, чем с другими последовательностями (например, по меньшей мере в 2 раза больше по сравнению с фоном). Жесткие условия являются зависимыми от последовательности и будут отличаться при различных обстоятельствах. Путем регулирования жесткости условий гибридизации и/или отмывки можно идентифицировать целевые последовательности, которые на 100% комплементарны зонду (гибридизация с гомологичным зондом). В качестве альтернативы, условия жесткости можно скорректировать для обеспечения некоторого ошибочного спаривания в последовательностях с тем, чтобы выявлять более низкие степени сходства (гибридизация с гетерологичным зондом). В целом, длина зонда составляет менее приблизительно 1000 нуклеотидов, предпочтительно он имеет менее 500 нуклеотидов в длину.

Белки, а также их варианты и фрагменты

В другом аспекте полипептиды PtIP-96 охвачены настоящим раскрытием. Термины "инсектицидный белок-96 Pteridophyta" "полипептид PtIP-96" и "белок PtIP-96" применяются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения полипептида с инсектицидной активностью, в том числе без ограничения инсектицидной активностью против одного или более насекомых-вредителей из отрядов Lepidoptera и/или Coleoptera, и достаточно гомологичен белку под SEQ ID NO: 10. Подразумевается целый ряд полипептидов PtIP-96. Источниками полипептидов PtIP-96 или родственных белков являются виды папоротника или другие примитивные растения, выбранные без ограничения из вида папоротников отдела Pteridophyta или видов плауна рода Selaginella.

"Достаточно гомологична" применяется в данном документе для обозначения аминокислотной последовательности, последовательность которой по меньшей мере на приблизительно 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологична эталонной последовательности с применением одной из программ выравнивания, описанных в данном документе, с применением стандартных параметров. В некоторых вариантах осуществления гомологию последовательности определяют относительно последовательности полной длины полипептида PtIP-96. В некоторых вариантах осуществления последовательность полипептида PtIP-96 по меньшей мере на приблизительно 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична последовательности под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108. Специалисту в данной области техники будет понятно, что эти значения можно соответствующим образом скорректировать для определения соответствующей гомологии белков, принимая во внимание аминокислотное сходство и т. п. В некоторых вариантах осуществления идентичность последовательностей рассчитывают с применением алгоритма ClustalW в модуле ALIGNX® пакета программ Vector NTI® Program Suite (Invitrogen Corporation, Карлсбад, Калифорния) со всеми параметрами по умолчанию. В некоторых вариантах осуществления идентичность последовательностей рассчитывают по всей длине полипептида с применением алгоритма ClustalW в модуле ALIGNX® пакета программ Vector NTI® Program Suite (Invitrogen Corporation, Карлсбад, Калифорния) со всеми параметрами по умолчанию.

Применяемые в данном документе термины "белок", "пептидная молекула" или "полипептид" включают любую молекулу, которая содержит пять или более аминокислот. Из уровня техники хорошо известно, что белок, пептид или полипептидные молекулы могут подвергаться модификации, в том числе посттрансляционным модификациям, таким как без ограничения, образование дисульфидных связей, гликозилирование, фосфорилирование или олигомеризация. Таким образом, применяемые в данном документе термины "белок", "пептидная молекула" или "полипептид" включают любой белок, который модифицирован посредством какого-либо биологического или небиологического процесса. Термины "аминокислота" и "аминокислоты" относятся к встречающимся в природе L-аминокислотам.

Термин "рекомбинантный белок" применяют в данном документе для обозначения белка, который более не находится в своей естественной среде, а например, in vitro или в рекомбинантной бактериальной или растительной клетке-хозяине. Полипептид PtIP-96, который фактически не содержит клеточный материал, включает препараты белка, имеющие менее приблизительно 30%, 20%, 10% или 5% (по сухому весу) белка, не относящегося к пестицидному (также называемого в данном документе "загрязняющий белок").

"Фрагменты" или "биологически активные части" включают фрагменты полипептида, содержащие аминокислотные последовательности достаточно идентичные полипептиду PtIP-96 и проявляющие инсектицидную активность. "Фрагменты" или "биологически активные части" полипептидов PtIP-96 включают фрагменты, содержащие аминокислотные последовательности достаточно идентичные аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108, где полипептид PtIP-96 обладает инсектицидной активностью. Такие биологически активные части можно получать при помощи рекомбинантных методик и оценивать в отношении инсектицидной активности. В некоторых вариантах осуществления фрагмент полипептида PtIP-96 представляет собой N-терминальное и/или C-терминальное усечение по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или более аминокислот с N-конца и/или C-конца относительно SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108, например, путем протеолиза, путем вставки старт-кодона, путем делеции кодонов, кодирующих удаляемые аминокислоты, и одновременной вставки старт-кодона и/или вставки стоп-кодона.

Применяемые в данном документе "варианты" относятся к белкам или полипептидам с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на приблизительно 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична исходной аминокислотной последовательности.

Полипептиды PtIP-96

В некоторых вариантах осуществления полипептид PtIP-96 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108, где полипептид PtIP-96 обладает инсектицидной активностью.

В некоторых вариантах осуществления PtIP-96 полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична по всей длине аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108.

В некоторых вариантах осуществления полипептид PtIP-96 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108, имеющую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 или больше аминокислотных замен по сравнению с нативной аминокислотой в соответствующем положении полипептида под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108.

В некоторых вариантах осуществления полипептид PtIP-96 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 24, имеющую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 или больше аминокислотных замен по сравнению с нативной аминокислотой в соответствующем положении полипептида под SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 24.

В некоторых вариантах осуществления полипептид PtIP-96 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 40, имеющую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 или больше аминокислотных замен по сравнению с нативной аминокислотой в соответствующем положении полипептида под SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 40.

В некоторых вариантах осуществления полипептид PtIP-96 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 или SEQ ID NO: 52, имеющую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 или больше аминокислотных замен по сравнению с нативной аминокислотой в соответствующем положении полипептида под SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 или SEQ ID NO: 52.

В некоторых вариантах осуществления полипептид PtIP-96 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88 или SEQ ID NO: 90, имеющую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 или больше аминокислотных замен по сравнению с нативной аминокислотой в соответствующем положении полипептида под SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88 или SEQ ID NO: 90.

В некоторых вариантах осуществления полипептид PtIP-96 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88 или SEQ ID NO: 90, имеющую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 или больше аминокислотных замен по сравнению с нативной аминокислотой в соответствующем положении полипептида под SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88 или SEQ ID NO: 90.

В некоторых вариантах осуществления полипептид PtIP-96 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78 или SEQ ID NO: 80, имеющую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 или больше аминокислотных замен по сравнению с нативной аминокислотой в соответствующем положении полипептида под SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78 или SEQ ID NO: 80.

В некоторых вариантах осуществления полипептид PtIP-96 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108, имеющую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 или больше аминокислотных замен по сравнению с нативной аминокислотой в соответствующем положении полипептида под SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108.

В некоторых вариантах осуществления идентичность последовательностей рассчитывают по всей длине полипептида с применением алгоритма ClustalW в модуле ALIGNX® пакета программ Vector NTI® Program Suite (Invitrogen Corporation, Карлсбад, Калифорния) со всеми параметрами по умолчанию.

Филогенетический анализ, анализ мотивов последовательности и структурный анализ семейств инсектицидных белков

Используемый способ анализа последовательности и структуры состоит из четырех компонентов: построение филогенетического дерева, обнаружение мотивов белковой последовательности, прогнозирование вторичной структуры и выравнивание белковых последовательностей и вторичных структур. Детали о каждом компоненте проиллюстрированы ниже.

1) Построение филогенетического дерева

Филогенетический анализ может быть осуществлен с применением программного обеспечения MEGA5. Белковые последовательности подвергали анализу ClustalW версия 2 (Larkin M.A et al (2007) Bioinformatics 23(21): 2947-2948) для множественного выравнивания последовательностей. Затем определяют эволюционную историю с помощью способа максимального правдоподобия, исходя из модели на основе JTT-матрицы. Получают дерево с самым высоким логарифмическим правдоподобием, экспортируют его в формат Newick, и дополнительно обрабатывают для извлечения ID последовательностей в том же порядке, как они появляются на дереве. Некоторые клады, представляющие подсемейства можно идентифицировать вручную для каждого семейства инсектицидных белков.

2) Обнаружение мотивов белковой последовательности

Белковые последовательности перегруппировуют согласно ранее построенному филогенетическому дереву и передают в инструмент для анализа МОТИВОВ MEME (Multiple EM for MOTIF Elicitation) (Bailey T.L., and Elkan C., Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp. 28-36, AAAI Press, Menlo Park, California, 1994.) для идентификации ключевых мотивов последовательности. Начальные установки MEME являются следующими: минимальное количество сайтов 2, минимальный размер мотива 5 и максимальное количество мотивов 30. Мотивы последовательности, уникальные для каждого подсемейства, идентифицировали с помощью визуального осмотра. Распределение МОТИВОВ по всему семейству генов можно визуализировать на HTML-вебстранице. МОТИВЫ пронумеровали согласно расположению E-значения для каждого МОТИВА.

3) Прогнозирование вторичной структуры

PSIPRED, ведущий способ прогнозирования вторичной структуры (Jones DT. (1999) J. Mol. Biol. 292: 195-202), можно инсталлировать на локальном Linux-сервере, и применять для прогнозирования вторичной структуры белка. Инструмент обеспечивает точное прогнозирование структуры с применением двух нейронных цепей прямой связи, исходя из результата PSI-BLAST. Базу данных для PSI-BLAST создают путем удаления участков низкой сложности, трансмембранного участка и участков суперспирали в Uniref100. Результаты PSIPRED содержат прогнозированную вторичную структуру (альфа-спираль: H, бета-тяж: E и клубок: C) и соответствующую степень уверенности для каждой аминокислоты в данной белковой последовательности.

4) Выравнивание белковых последовательностей и вторичных структур

Разрабатывали индивидуальный скрипт для создания выравнивания вторичных структур с гэпами согласно множественному выравниванию белковых последовательностей из стадии 1 для всех белков. Все подвергшиеся выравниванию белковые последовательности и структуры комбинируют в единый FASTA-файл, и затем импортировуют в MEGA для визуализации и идентификации консервативных структур.

В некоторых вариантах осуществления полипептид PtIP-96 характеризуется модифицированным физическим свойством. Применяемый в данном документе термин "физическое свойство" относится к какому-либо параметру, который подходит для описания физико-химических характеристик белка. Применяемые в данном документе термины "физическое свойство, представляющее интерес" и "свойство, представляющее интерес" применяются взаимозаменяемо для обозначения физических свойств белков, которые исследуются и/или модифицируются. Примеры физических свойств включают без ограничения суммарный поверхностный заряд и распределение зарядов на поверхности белка, суммарную гидрофобность и распределение гидрофобных остатков на поверхности белка, плотность поверхностного заряда, плотность гидрофобности поверхности, общее число поверхностных ионизируемых групп, поверхностное натяжение, размер белка и его распределение в растворе, температуру плавления, теплоемкость и второй вириальный коэффициент. Примеры физических свойств также включают без ограничения растворимость, фолдинг, стабильность и усвояемость. В некоторых вариантах осуществления полипептид PtIP-96 характеризуется повышенной перевариваемостью фрагментов, полученных в результате протеолитического расщепления, в кишечнике насекомого. Модели для переваривания при помощи искусственного желудочного сока известны специалисту в данной области техники (Fuchs, R.L. and J.D. Astwood. Food Technology 50: 83-88, 1996; Astwood, J.D., et al Nature Biotechnology 14: 1269-1273, 1996; Fu TJ et al J. Agric Food Chem. 50: 7154-7160, 2002).

В некоторых вариантах осуществления варианты включают полипептиды, которые отличаются аминокислотной последовательностью вследствие мутагенеза. Вариантные белки, охваченные настоящим раскрытием, являются биологически активными, то есть они по-прежнему обладают требуемой биологической активностью (т. е. пестицидной активностью) нативного белка. В некоторых вариантах осуществления вариант будет обладать по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80% или более инсектицидной активности нативного белка. В некоторых вариантах осуществления варианты могут обладать усиленной активностью по сравнению с нативным белком.

Бактериальные гены довольно часто имеют несколько метиониновых кодонов инициации трансляции вблизи стартового сайта открытой рамки считывания. Зачастую, инициация трансляции по одному или нескольким из этих старт-кодонов будет приводить к образованию функционального белка. Эти старт-кодоны могут включать кодоны ATG. Однако бактерии, такие как Bacillus sp., также распознают кодон GTG в качестве старт-кодона, и белки, трансляция которых инициируется по кодонам GTG, в качестве первой аминокислоты содержат метионин. В редких случаях, трансляция в бактериальных системах может инициироваться по кодону TTG, хотя в этом случае TTG кодирует метионин. Кроме того, зачастую a priori не определено, какой из этих кодонов естественным образом используется в бактерии. Таким образом, понятно, что применение одного из альтернативных метиониновых кодонов может также приводить к образованию пестицидных белков. Эти пестицидные белки охватываются настоящим раскрытием и могут применяться в способах согласно настоящему раскрытию. Будет понятно, что при экспрессии в растениях будет необходимо изменить альтернативный старт-кодон на ATG для полноценной трансляции.

В другом аспекте полипептид PtIP-96 может экспрессироваться в виде белка-предшественника с вставочной последовательностью, которая катализирует многостадийный, посттрансляционный сплайсинг белка. Сплайсинг белка включает вырезание вставочной последовательности из полипептида с одновременным соединением фланкирующих последовательностей с получением нового полипептида (Chong, et al., (1996) J. Biol. Chem., 271:22159-22168). Эта вставочная последовательность или элемент сплайсинга белка, называемые интеинами, катализируют свое собственное вырезание посредством трех согласованных реакций на N-терминальной и C-терминальной границах сплайсинга: ацильной перестройки N-терминального цистеина или серина; реакции переэтерификации между двумя концами с образованием разветвленного сложноэфирного или тиоэфирного промежуточного соединения и расщепления пептидной связи, сопряженного с образованием кольца c участием C-терминального аспарагина интеина с высвобождением интеина (Evans, et al., (2000) J. Biol. Chem., 275:9091-9094. Выяснение механизма сплайсинга белка привело к возникновению ряда применений, связанных с интеинами (Comb et al., патент США № 5496714; Comb et al., патент США № 5834247; Camarero and Muir, (1999) J. Amer. Chem. Soc. 121:5597-5598; Chong, et al., (1997) Gene 192:271-281, Chong, et al., (1998) Nucleic Acids Res. 26:5109-5115; Chong, et al., (1998) J. Biol. Chem. 273:10567-10577; Cotton, et al., (1999) J. Am. Chem. Soc. 121:1100-1101; Evans, et al., (1999) J. Biol. Chem. 274:18359-18363; Evans, et al., (1999) J. Biol. Chem. 274:3923-3926; Evans, et al., (1998) Protein Sci. 7:2256-2264; Evans, et al., (2000) J. Biol. Chem. 275:9091-9094; Iwai and Pluckthun, (1999) FEBS Lett. 459:166-172; Mathys, et al., (1999) Gene 231:1-13; Mills, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3543-3548; Muir, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6705-6710; Otomo, et al., (1999) Biochemistry 38:16040-16044; Otomo, et al., (1999) J. Biolmol. NMR 14:105-114; Scott, et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13638-13643; Severinov and Muir, (1998) J. Biol. Chem. 273:16205-16209; Shingledecker, et al., (1998) Gene 207:187-195; Southworth, et al., (1998) EMBO J. 17:918-926; Southworth, et al., (1999) Biotechniques 27:110-120; Wood, et al., (1999) Nat. Biotechnol. 17:889-892; Wu, et al., (1998a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9226-9231; Wu, et al., (1998b) Biochim Biophys Acta 1387:422-432; Xu, et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:388-393; Yamazaki, et al., (1998) J. Am. Chem. Soc., 120:5591-5592). Относительно применения интеинов в растительных трансгенах, см. Yang, et al., (Transgene Res 15:583-593 (2006)) и Evans, et al., (Annu. Rev. Plant Biol. 56:375-392 (2005)).

В другом аспекте полипептид PtIP-96 может кодироваться двумя отдельными генами, при этом интеин белка-предшественника берет начало от двух генов, он называется сплит-интеин, и две части предшественника соединяются при образовании пептидной связи. Это образование пептидной связи осуществляется при помощи транс-сплайсинга, опосредованного интеином. Для этой цели, первая и вторая кассета экспрессии, содержащие два отдельных гена, дополнительно кодируют интеины, способные опосредовать транс-сплайсинг белков. При помощи транс-сплайсинга белки и полипептиды, кодируемые первым и вторым фрагментами, могут быть соединены посредством образования пептидной связи. Интеины для транс-сплайсинга можно выбирать из ядерного генома или генома органелл различных организмов, в том числе эукариот, архебактерий и эубактерий. Интеины, которые можно применять, перечислены на сайте neb.com/neb/inteins.html, доступ к которому можно получить во всемирной сети Интернет с применением префикса "www"). Нуклеотидную последовательность, кодирующую интеин, можно расщеплять на 5′- и 3′-часть, которые кодируют 5′- и 3′-часть интеина соответственно. Части последовательности, которые не являются необходимыми для интеин-сплайсинга (например, домен хоминг-эндонуклеазы), могут быть удалены. Интеин-кодирующая последовательность расщепляют, так что 5′- и 3′-части способны к транс-сплайсингу. Для выбора подходящего сайта расщепления интеин-кодирующей последовательности можно следовать рекомендациям, опубликованным Southworth, et al., (1998) EMBO J. 17:918-926. При конструировании первой и второй кассеты экспрессии 5′ интеин-кодирующую последовательность соединяют с 3′-концом первого фрагмента, кодирующего N-концевую часть полипептида PtIP-96, а 3′ интеин-кодирующую последовательность соединяют с 5′-концом второго фрагмента, кодирующего C-концевую часть полипептида PtIP-96.

В целом, партнеров для транс-сплайсинга можно конструировать с применением любого сплит-интеина, в том числе любых встречающихся в природе или искусственно расщепленных сплит-интеинов. Известны несколько встречающихся в природе сплит-интеинов, например: сплит-интеин гена DnaE PCC6803 Synechocystis sp. (см. Wu, et al., (1998) Proc Natl Acad Sci USA. 95(16):9226-31 и Evans, et al., (2000) J Biol Chem. 275(13):9091-4 и гена DnaE из Nostoc punctiforme (см., Iwai, et al., (2006) FEBS Lett. 580(7):1853-8). Интеины, не относящиеся к сплит-интеинам, были искусственно расщеплены в лаборатории с созданием новых сплит-интеинов, например, искусственно расщепленный интеин Ssp DnaB (см. Wu, et al., (1998) Biochim Biophys Acta. 1387:422-32), и расщепленный интеин Sce VMA (см. Brenzel, et al., (2006) Biochemistry. 45(6):1571-8), и искусственно расщепленный мини-интеин грибкового происхождения (см. Elleuche, et al., (2007) Biochem Biophys Res Commun. 355(3):830-4). Также доступны базы данных по интеинам, в которых перечислены известные интеины (см., например, базу данных, доступную в режиме реального времени на сайте bioinformatics.weizmann.ac.il/˜pietro/inteins/Inteinstable.html, доступ к которому можно получить во всемирной сети Интернет с применением префикса "www").

Встречающиеся в природе интеины, не относящиеся к сплит-интеинам, могут обладать эндонуклеазной или другой ферментативной активностью, которую, как правило, можно устранять при конструировании искусственно расщепленного сплит-интеина. Такие мини-интеины или минимизированные сплит-интеины хорошо известны из уровня техники и, как правило, они состоят из менее 200 аминокислотных остатков (см. Wu, et al., (1998) Biochim Biophys Acta. 1387:422-32). Подходящие сплит-интеины могут иметь другие обеспечивающие очистку элементы полипептида, добавляемые к их структуре, при условии, что такие элементы не ингибируют сплайсинг сплит-интеина, или они добавлены так, что обеспечивается возможность их удаления до сплайсинга. Сообщалось о сплайсинге белка с применением белков, которые включают бактериальные интеин-подобные (BIL) домены (см. Amitai, et al., (2003) Mol Microbiol. 47:61-73) и самопроцессирующиеся домены hedgehog (Hog) (последние при объединении с интеинами называют суперсемейством Hog/интеин или семейством HINT (см. Dassa, et al., (2004) J Biol Chem. 279:32001-7), и такие домены, которые можно также применять для получения искусственно расщепленных интеинов. В частности, не подвергающихся сплайсингу представителей таких семейств можно модифицировать при помощи методик молекулярной биологии для введения или восстановления активности сплайсинга в таких родственных разновидностях. Последние исследования показывают, что сплайсинг можно наблюдать при обеспечении реакции N-терминального компонента сплит-интеина с C-терминальным компонентом сплит-интеина, при этом в естественных условиях он не является его "партнером"; например, сплайсинг наблюдали при использовании партнеров, которые всего на 30-50% гомологичны "естественному" сплайсинг-партнеру (см. Dassa, et al., (2007) Biochemistry. 46(1):322-30). Было показано, что другие такие смеси несовместимых партнеров сплит-интеинов не реагируют друг с другом (см. Brenzel, et al., (2006) Biochemistry. 45(6):1571-8). Однако специалист в соответствующей области техники может определить, сможет ли конкретная пара полипептидов связываться друг с другом с обеспечением функционального интеина, с применением стандартных способов и без использования изобретательских навыков.

В другом аспекте полипептид PtIP-96 представляет собой вариант с круговыми перестановками. В определенных вариантах осуществления полипептид PtIP-96 представляет собой вариант с круговыми перестановками полипептида под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108.

Разработка способов с применением рекомбинантной ДНК обеспечила возможность исследовать эффекты транспозиции последовательностей на фолдинг, структуру и функцию белка. Подход, применяемый при создании новых последовательностей, походит на ситуацию, что происходит со встречающимися в природе парами белков, которые связываются посредством линейной реорганизации их аминокислотных последовательностей (Cunningham, et al., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:3218-3222; Teather and Erfle, (1990) J. Bacteriol. 172:3837-3841; Schimming, et al., (1992) Eur. J. Biochem. 204:13-19; Yamiuchi and Minamikawa, (1991) FEBS Lett. 260:127-130; MacGregor, et al., (1996) FEBS Lett. 378:263-266). Первое in vitro применение данного типа перестановки у белков описали Goldenberg и Creighton (J. Mol. Biol. 165:407-413, 1983). При создании варианта с круговыми перестановками новый N-конец выбирают во внутреннем сайте (точечный разрыв) оригинальной последовательности, при этом новая последовательность имеет такой же порядок аминокислот, что и оригинальная, начиная от точечного разрыва до тех пор, пока она не достигает аминокислоты, которая находится на оригинальном C-конце или вблизи него. В этой точке новая последовательность соединяется, либо напрямую, либо через дополнительную часть последовательности (линкер), с аминокислотой, которая находится на оригинальном N-конце или вблизи него, и новая последовательность продолжается с такой же последовательностью, что и оригинальная до тех пор, пока она не достигнет точки, которая находится в месте аминокислоты, которая была N-терминальной по отношению к сайту точечного разрыва оригинальной последовательности или вблизи него, причем этот остаток образует новый C-конец цепи. Длину аминокислотной последовательности линкера можно выбирать эмпирически, или исходя из информации о структуре, или путем применения комбинации двух этих подходов. Если информация о структуре является недоступной, можно получить небольшие серии линкеров для тестирования с применением конструкции, длина которой варьирует, чтобы охватить диапазон от 0 Å до 50 Å, и последовательность которой выбрана таким образом, чтобы соответствовать доступности поверхностных групп (гидрофильность, Hopp and Woods, (1983) Mol. Immunol. 20:483-489; Kyte and Doolittle, (1982) J. Mol. Biol. 157:105-132; площади поверхности, доступной воздействию растворителя, Lee and Richards, (1971) J. Mol. Biol. 55:379-400) и способности принимать необходимую конформацию без нарушения конфигурации пестицидного полипептида (конформационно подвижного; Karplus and Schulz, (1985) Naturwissenschaften 72:212-213). При условии, что при трансляции средняя длина остатка составляет 2,0-3,8 Å, это будет означать, что длина, подлежащая тестированию, будет составлять от 0 до 30 остатков, при этом предпочтительным диапазоном является 0-15 остатков. Примером такой эмпирической серии будет конструирование линкеров с применением кассетной последовательности, такой как Gly-Gly-Gly-Ser, повторяемой n раз, где n равно 1, 2, 3 или 4. Специалистам в данной области техники будет понятно, что существует множество таких последовательностей, варьирующих в длину или по составу, которые могут служить в качестве линкеров, исходя из таких первичных соображений, что они не являются ни чрезмерно длинными, ни чрезмерно короткими (см. также, Sandhu, (1992) Critical Rev. Biotech. 12:437-462); причем если они являются слишком длинными, энтропийные эффекты, вероятно, будут дестабилизировать трехмерную укладку и также могут делать фолдинг кинетически невыполнимым, а если они являются слишком короткими, они, вероятно, будут дестабилизировать молекулу вследствие скручивающей или стерической деформации. Специалистам, разбирающимся в анализе информации о структуре белка, будет понятно, что расстояние между концами цепей, определяемое как расстояние между c-альфа атомами углерода, можно применять для определения длины применяемой последовательности или по меньшей мере для ограничения числа возможностей, которые требуется протестировать при эмпирическом отборе линкеров. Им также будет понятно, что иногда встречается случай, когда положения концов полипептидной цепи являются нечеткими в структурных моделях, полученных с помощью данных рентгеноструктурного анализа или ядерной магнитно-резонансной спектроскопии, и при такой ситуации, следовательно, ее необходимо принимать во внимание для правильной оценки длины требуемого линкера. На основании остатков, положение которых четко определено, выбирают два остатка, которые близки по последовательности к концам цепи, и расстояние между их c-альфа атомами углерода применяют для расчета приблизительной длины линкера между ними. С применением расчетной длины в качестве предварительных данных, далее отбирают линкеры в пределах диапазона количества остатков (из расчета длины остатка 2-3,8 Å). Эти линкеры можно составлять из оригинальной последовательности, укороченной или удлиненной, в случае необходимости, и, в случае удлинения, можно выбирать дополнительные остатки, которые являются гибкими и гидрофильными, как описано выше; или, необязательно, оригинальная последовательность может быть замещена с применением серии линкеров, причем одним примером является упомянутый выше подход с применением кассеты Gly-Gly-Gly-Ser; или, необязательно, можно применять комбинацию оригинальной последовательности и новой последовательности, имеющих подходящую общую длину. Последовательности пестицидных полипептидов, способных к фолдингу с образованием биологически активных состояний, можно получать путем соответствующего отбора начальных (амино-конец) и концевых (карбоксильный конец) положений внутри оригинальной полипептидной цепи, при этом с применением линкерной последовательности, как описано выше. Амино- и карбоксильные концы выбирают из общего отрезка последовательности, называемого участком точечного разрыва, с применением рекомендаций, описанных ниже. Новую аминокислотную последовательность, таким образом, получают путем отбора амино- и карбоксильных концов из такого же участка точечного разрыва. Во многих случаях выбор новых концов будет таким, что оригинальное положение карбоксильного конца непосредственно предшествует положению амино-конца. Однако специалистам в данной области техники будет понятно, что выбор концов в каком-либо месте в пределах участка может оказывать действие, и что он, фактически, будет приводить либо к делециям, либо к добавлениям к амино- или карбоксильным частям новой последовательности. Основным положением молекулярной биологии является то, что первичная аминокислотная последовательность белка обуславливает фолдинг в трехмерную структуру, необходимую для проявления его биологической функции. Специалистам в данной области техники известны способы получения и интерпретации информации о трехмерной структуре с применением рентгеноструктурного анализа одиночных кристаллов белка или ядерной магнитно-резонансной спектроскопии растворов белка. Примеры информации о структуре, которая подходит для идентификации участков точечного разрыва, включают расположение и тип вторичной структуры белка (альфа- и 3-10 спирали, параллельные и антипараллельные бета-складчатые слои, обращения или повороты цепи и петли; Kabsch and Sander, (1983) Biopolymers 22:2577-2637; степень доступности аминокислотных остатков для растворителя, масштаб и тип взаимодействий остатков друг с другом (Chothia, (1984) Ann. Rev. Biochem. 53:537-572) и статическое и динамическое распределение конформаций на протяжении полипептидной цепи (Alber and Mathews, (1987) Methods Enzymol. 154:511-533). В некоторых случаях известна дополнительная информация о доступности остатков для растворителя; причем одним примером является сайт посттрансляционного присоединения углеводов, который обязательно находится на поверхности белка. Если экспериментальная информация о структуре не доступна или ее невозможно получить, также доступны способы для анализа первичной аминокислотной последовательности для того, чтобы делать прогнозы о третичной и вторичной структуре белка, доступности для растворителя и наличия поворотов и петель. Если прямые способы определения структуры не применимы, для эмпирического определения доступности поверхностных групп также иногда применяют биохимические способы; например, с использованием идентификации сайтов деполимеризации после ограниченного протеолиза, чтобы делать заключение о доступности поверхностных групп (Gentile and Salvatore, (1993) Eur. J. Biochem. 218:603-621). Таким образом, путем применения либо информации о структуре, полученной экспериментальным путем, либо прогностических способов (например, Srinivisan and Rose, (1995) Proteins: Struct., Funct. & Genetics 22:81-99) проводят исследование исходной аминокислотной последовательности для классификации участков в отношении того, важны ли они для поддержания вторичной и третичной структуры. Наличия последовательностей в участках, которые, как известно, вовлечены в периодическую вторичную структуру (альфа- и 3-10 спирали, параллельные и антипараллельные бета-складчатые слои), следует избегать. Аналогично, участки аминокислотной последовательности, которые, как наблюдается или прогнозируется, обладают низкой степенью доступности для действия растворителя, наиболее вероятно, являются частью так называемого гидрофобного ядра белка, и их следует также избегать при выборе амино- или карбоксильных концов. В отличие от этого, участки, которые, как известно или прогнозируется, находятся в поверхностных поворотах или петлях, и, в частности, участки, о которых известно, что они не требуются для биологической активности, являются предпочтительными сайтами для расположения противоположных концов полипептидной цепи. Непрерывные нити аминокислотной последовательности, которые являются предпочтительными на основании вышеприведенных критериев, называют участком точечного разрыва. Полинуклеотиды, кодирующие полипептиды PtIP-96 с круговыми перестановками с новым N-концом/C-концом, которые содержат линкерный участок, отделяющий оригинальный C-конец и N-конец, фактически, можно получать по способу, описанному в Mullins, et al., (1994) J. Am. Chem. Soc. 116:5529-5533. Несколько стадий амплификации посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) применяют для перестройки последовательности ДНК, кодирующей первичную аминокислотную последовательность белка. Полинуклеотиды, кодирующие полипептиды PtIP-96 с круговыми перестановками с новым N-концом/C-концом, которые содержат линкерный участок, отделяющий оригинальный C-конец и N-конец, можно создавать на основе способа тандемных повторов, описанного в Horlick, et al., (1992) Protein Eng. 5:427-431. Амплификацию посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) генов с новыми N-концом/C-концом проводят с применением ДНК-матрицы с тандемными повторами.

В другом аспекте представлены белки слияния, в аминокислотную последовательность которых включена аминокислотная последовательность, содержащая полипептид PtIP-96, в том числе без ограничения полипептид под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108 и его активные фрагменты.

Способы разработки и конструирования белков слияния (и кодирующих их полинуклеотидов) известны специалистам в данной области техники. Полинуклеотиды, кодирующие полипептид PtIP-96, могут быть слиты с сигнальными последовательностями, которые будут управлять локализацией полипептида PtIP-96 в конкретных компартментах прокариотической или эукариотической клетки и/или управлять секрецией полипептида PtIP-96 согласно вариантам осуществления из прокариотической или эукариотической клетки. Например, в E. coli, может потребоваться направить экспрессию белка в периплазматическое пространство. Примеры сигнальных последовательностей или белков (или их фрагментов), с которыми можно сливать полипептид PtIP-96 с тем, чтобы направлять экспрессию полипептида в периплазматическое пространство бактерий, включают без ограничения сигнальную последовательность pelB, сигнальную последовательность белка, связывающего мальтозу (MBP), MBP, сигнальную последовательность ompA, сигнальную последовательность B-субъединицы периплазматического неустойчивого к нагреванию энтеротоксина E. coli и сигнальную последовательность щелочной фосфатазы. Для конструирования белков слияния коммерчески доступны несколько векторов, которые будут управлять локализацией белка, такие как серия векторов pMAL (в частности, серия pMAL-p), доступная от New England Biolabs. В конкретном варианте осуществления полипептид PtIP-96 можно сливать с сигнальной последовательностью пектатлиазы the pelB для повышения эффективности экспрессии и очистки таких полипептидов у грамотрицательных бактерий (см. патенты США №№ 5576195 и 5846818). Слияния пластидный транзитный пептид растения/полипептид хорошо известны из уровня техники (см. патент США № 7193133). Апопластные транзитные пептиды, такие как сигнальная последовательность для секреции альфа-амилазы риса или ячменя, также хорошо известны из уровня техники. Пластидный транзитный пептид, как правило, сливают со стороны N-конца с полипептидом, подлежащим нацеливанию (например, партнером слияния). В одном варианте осуществления белок слияния фактически состоит из пластидного транзитного пептида и полипептида PtIP-96, подлежащего нацеливанию. В другом варианте осуществления белок слияния состоит из пластидного транзитного пептида и полипептида, подлежащего нацеливанию. В таких вариантах осуществления пластидный транзитный пептид, предпочтительно, находится на N-конце белка слияния. Однако дополнительные аминокислотные остатки могут находиться на N-конце относительно пластидного транзитного пептида при условии, что белок слияния по меньшей мере частично нацеливается на пластиду. В конкретном варианте осуществления пластидный транзитный пептид находится на N-терминальной половине, N-терминальной трети или N-терминальной четверти белка слияния. Большая часть или весь пластидный транзитный пептид, как правило, отщепляется от белка слияния после попадания в пластиду. Положение сайта отщепления может незначительно варьировать у разных видов растений, на различных стадиях развития растения, в результате специфических внутриклеточных условий или конкретной комбинации применяемого транзитного пептида/партнера слияния. В одном варианте осуществления сайт отщепления пластидного транзитного пептида является гомогенным, так что сайт отщепления является идентичным в группе белков слияния. В другом варианте осуществления сайт отщепления пластидного транзитного пептида не является гомогенным, так что сайт отщепления варьирует в пределах 1-10 аминокислот в группе белков слияния. Пластидный транзитный пептид можно рекомбинантно сливать со вторым белком с применением одного из нескольких путей. Например, сайт распознавания рестрикционной эндонуклеазы можно вводить в нуклеотидную последовательность транзитного пептида в положении, соответствующем его C-терминальному концу, и такой же или совместимый сайт можно вводить с помощью методик генной инженерии в нуклеотидную последовательность белка, подлежащего нацеливанию, по его N-терминальному концу. При конструировании этих сайтов нужно заботиться о том, чтобы кодирующие последовательности транзитного пептида и второго белка содержались "в рамке" для обеспечения синтеза требуемого белка слияния. В некоторых случаях предпочтительным может быть удаление инициаторного метионинового кодона второго белка при введении нового сайта рестрикции. Введение сайтов распознавания рестрикционной эндонуклеазы в обе исходные молекулы и их последующее связывание с помощью методик с применением рекомбинантной ДНК может приводить к добавлению одной или нескольких дополнительных аминокислот между транзитным пептидом и вторым белком. Это, как правило, не влияет на активность в отношении нацеливания, поскольку сайт отщепления транзитного пептида остается доступным и функционирование второго белка не изменится при добавлении этих дополнительных аминокислот по его N-концу. В качестве альтернативы, специалист в данной области техники может создать точный сайт отщепления между транзитным пептидом и вторым белком (с наличием инициаторного метионина или без него) с применением синтеза генов (Stemmer, et al., (1995) Gene 164:49-53) или аналогичных способов. В дополнение, слияние транзитного пептида может целенаправленно включать аминокислоты ниже сайта отщепления. Аминокислоты на N-конце зрелого белка могут воздействовать на способность транзитного пептида нацеливать белки в пластиды и/или на эффективность отщепления после импорта белков. Это может зависеть от белка, подлежащего нацеливанию. См. например, Comai, et al., (1988) J. Biol. Chem. 263(29):15104-9.

В некоторых вариантах осуществления представлены белки слияния, содержащие полипептид PtIP-96 и инсектицидный полипептид, соединенные аминокислотным линкером. В некоторых вариантах осуществления представлены белки слияния, представленные формулой, выбранной из группы, состоящей из:

R¹-L-R², R²-L- R¹, R¹- R² или R²- R¹,

где R¹ представляет собой полипептид PtIP-96, R² представляет собой белок, представляющий интерес. Полипептид R¹ слит либо непосредственно, либо через линкерный (L) сегмент с полипептидом R². Термин "непосредственно" обозначает слияния, в которых полипептиды соединены без пептидного линкера. Таким образом, "L" представляет собой химическую связь или полипептидный сегмент, с которым оба R¹ и R² слиты в рамке, при этом наиболее часто L представляет собой линейный пептид, с которым R¹ и R² связаны посредством амидных связей, связывающих карбоксильный конец R¹ с амино-концом L и карбоксильный конец L с амино-концом R². Под "слиты в рамке" подразумевается, что между рамками считывания R¹ и R² отсутствуют сайты терминации трансляции или разрыв. Связывающая группа (L) обычно представляет собой полипептид от 1 до 500 аминокислот в длину. Линкеры, соединяющие две молекулы, предпочтительно, конструируют так, (1) чтобы они давали возможность двум молекулам сворачиваться и действовать независимо друг от друга, (2) чтобы они не характеризовались склонностью к развитию упорядоченной вторичной структуры, которая может негативно воздействовать на функциональные домены двух белков, (3) чтобы они имели минимальную гидрофобную или характеристику в отношении зарядов, которые влияют на функциональные домены белка, и (4) чтобы они обеспечивали стерическое разделение R¹ и R², так что R¹ и R² могли одновременно взаимодействовать со своими соответствующими рецепторами на одной клетке. Как правило, поверхностные аминокислоты в гибких участках белка включают Gly, Asn и Ser. По сути, любое сочетание аминокислотных последовательностей, содержащих Gly, Asn и Ser, как ожидается, будет удовлетворять вышеуказанным критериям для линкерной последовательности. Другие нейтральные аминокислоты, такие как Thr и Ala, также можно применять в линкерной последовательности. Дополнительные аминокислоты также можно включать в линкеры, поскольку добавление уникальных сайтов рестрикции в линкерную последовательность облегчает конструирование слияний.

В некоторых вариантах осуществления линкеры содержат последовательности, выбранные из группы формул: (Gly₃Ser)_n, (Gly₄Ser)_n, (Gly₅Ser)_n, (Gly_nSer)_n или (AlaGlySer)_n, где n представляет собой целое число. Одним примером очень гибкого линкера является спейсерный участок, богатый (GlySer), присутствующий в белке pIII нитевидных бактериофагов, например, бактериофагов M13 или fd (Schaller, et al., 1975). Этот участок обеспечивает длинный гибкий спейсерный участок между двумя доменами поверхностного белка pIII. Также включены линкеры, в состав которых входит последовательность распознавания эндопептидазы. Такой сайт расщепления может быть необходимым для разделения индивидуальных компонентов слияния для определения того, являются ли они правильным образом свернутыми и активными in vitro. Примеры различных эндопептидаз включают без ограничения плазмин, энтерокиназу, калликреин, урокиназу, тканевой активатор плазминогена, клострипаин, химозин, коллагеназу, протеазу яда гадюки Рассела, фермент расщепления постпролина, протеазу V8, тромбин и фактор Xa. В некоторых вариантах осуществления линкер состоит из мультигенного экспрессионного "проводника" (MGEV), который расщепляется протеазами вакуолей, как раскрыто в публикации заявки на патент США № 2007/0277263. В других вариантах осуществления пептидные линкерные сегменты из шарнирного участка тяжелой цепи иммуноглобулинов IgG, IgA, IgM, IgD или IgE обеспечивают угловое взаимодействие между прикрепленными полипептидами. В частности, применимыми являются такие шарнирные участки, в которых цистеины замещены на серины. Линкеры согласно настоящему раскрытию включают последовательности, полученные из шарнирного участка IgG гамма 2b мыши, в котором цистеины были заменены на серины. Белки слияния не ограничиваются формой, размером или количеством применяемых линкерных последовательностей, а единственным требованием для линкера является то, что функционально он не влияет негативным образом на фолдинг и функционирование отдельных молекул слияния.

В другом аспекте представлены химерные полипептиды PtIP-96, которые создают путем соединения двух или более частей генов PtIP-96, изначально кодирующих отдельные белки PtIP-96, с созданием химерного гена. Трансляция химерного гена приводит к единому химерному полипептиду PtIP-96 с участками, мотивами или доменами, полученными из каждого из исходных полипептидов. В определенных вариантах осуществления химерный белок содержит части, мотивы или домены полипептидов PtIP-96 под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108 в любой комбинации.

Понятно, что последовательности ДНК можно изменять различными способами, и что эти изменения могут приводить к образованию последовательностей ДНК, кодирующих белки с аминокислотными последовательностями, отличающимися от тех, которые кодируют пестицидный белок дикого типа (или нативный). В некоторых вариантах осуществления полипептид PtIP-96 можно изменять различными способами, в том числе с помощью аминокислотных замен, делеций, усечений и вставок одной или нескольких аминокислот, включая до 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 или более аминокислотных замен, делеций и/или вставок или их комбинаций по сравнению с последовательностью под любым из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108.

Способы осуществления таких манипуляций, как правило, известны из уровня техники. Например, варианты аминокислотной последовательности полипептида PtIP-96 можно получать при помощи мутаций в ДНК. Это также можно осуществлять при помощи одной из нескольких форм мутагенеза и/или путем направленной эволюции. В некоторых аспектах изменения, закодированные в аминокислотной последовательности, не будут существенно влиять на функцию белка. Такие варианты будут обладать требуемой пестицидной активностью. Однако, понятно, что способность полипептида PtIP-96 обеспечивать пестицидную активность можно повышать путем применения таких методик в композициях согласно настоящему раскрытию.

Например, можно делать консервативные аминокислотные замены по одному или нескольким несущественным аминокислотным остаткам PtIP. "Несущественный" аминокислотный остаток представляет собой остаток, который можно изменять относительно последовательности дикого типа полипептида PtIP-96 без изменения биологической активности. "Консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток замещен на аминокислотный остаток, имеющий аналогичную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющие аналогичные боковые цепи, были определены в уровне техники. Эти семейства включают: аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин); кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту); полярными отрицательно заряженными остатками и их амидами (например, аспарагиновую кислоту, аспарагин, глутаминовую кислоту, глутамин); незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин); небольшими алифатическими неполярными или слабополярными остатками (например, аланин, серин, треонин, пролин, глицин); неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан); крупными алифатическими неполярными остатками (например, метионин, лейцин, изолейцин, валин, цистин); бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин); ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин); крупными ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан).

Аминокислотные замены можно проводить в неконсервативных участках, которые сохраняют функцию. В целом, такие замены не следует проводить для консервативных аминокислотных остатков или для аминокислотных остатков, находящихся в консервативном мотиве, где такие остатки являются существенными для активности белка. Примеры остатков, которые являются консервативными и которые могут быть существенными для активности белка, включают, например, остатки, которые идентичны у всех белков, содержащихся в выравнивании аналогичных или родственных токсинов с последовательностями согласно вариантам осуществления (например, остатки, которые идентичны при выравнивании гомологичных белков). Примеры остатков, которые являются консервативными, но которые могут позволять консервативные аминокислотные замены и все еще сохранять активность, включают, например, остатки, которые характеризуются только консервативными заменами у всех белков, содержащихся в выравнивании аналогичных или родственных токсинов с последовательностями согласно вариантам осуществления (например, остатки, которые характеризуются только консервативными заменами у всех белков, содержащихся в выравнивании гомологичных белков). Однако, специалисту в данной области будет понятно, что функциональные варианты могут иметь незначительные консервативные или неконсервативные изменения по консервативным остаткам. Указания в отношении подходящих аминокислотных замен, которые не влияют на биологическую активность белка, представляющего интерес, можно найти в модели Dayhoff, et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), включенной в данный документ посредством ссылки.

При осуществлении таких изменений можно учитывать индекс гидропатичности аминокислот. Важность индекса гидропатичности аминокислот для обеспечения согласованной биологической функции белка, в целом, понятна из уровня техники (Kyte and Doolittle, (1982) J Mol Biol. 157(1):105-32). Принято считать, что относительная гидропатичность аминокислоты вносит вклад во вторичную структуру полученного в результате белка, что, в свою очередь, определяет взаимодействие белка с другими молекулами, например, ферментами, субстратами, рецепторами, ДНК, антителами, антигенами и т. п.

Из уровня техники известно, что определенные аминокислоты можно замещать другими аминокислотами, имеющими аналогичный индекс или показатель гидропатичности, и в результате это все еще приводит к белку с аналогичной биологической активностью, т. е. по-прежнему получают белок с эквивалентной биологической функцией. Каждой аминокислоте был присвоен индекс гидропатичности на основании ее гидрофобности и характеристик в отношении заряда (Kyte and Doolittle, там же). Они являются следующими: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамин (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3,9) и аргинин (-4,5). При осуществлении таких изменений предпочтительной является замена аминокислот, индексы гидропатичности которых находятся в пределах до +2, особенно предпочтительной с индексами в пределах до +1 и наиболее предпочтительной с индексами в пределах до +0,5.

Из уровня техники также понятно, что замену подобных аминокислот можно эффективно проводить на основании гидрофильности. В патенте США № 4554101 заявляется, что наибольшая локальная средняя гидрофильность белка, определяемая гидрофильностью смежных аминокислот, коррелирует с биологическим свойством белка.

Как подробно описано в патенте США № 4554101, аминокислотным остаткам были присвоены следующие значения гидрофильности: аргинин (+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,0.+0,1); глутамат (+3,0.+0,1); серин (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); треонин (-0,4); пролин (-0,5.+0,1); аланин (-0,5); гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5); триптофан (-3,4).

В качестве альтернативы, изменения можно производить в белковой последовательности многих белков на амино- или карбокси-конце без существенного воздействия на активность. Они могут включать вставки, делеции или изменения, введенные при помощи современных молекулярных способов, таких как ПЦР, в том числе амплификации посредством ПЦР, которые изменяют или удлиняют последовательность, кодирующую белок, посредством включения последовательностей, кодирующих аминокислоты, в олигонуклеотиды, используемые при амплификации посредством ПЦР. В качестве альтернативы, добавленные белковые последовательности могут включать последовательности, кодирующие весь белок, например, такие, которые обычно применяются в уровне техники для получения белковых слияний. Такие белки слияния часто применяют для (1) усиления экспрессии белка, представляющего интерес, (2) введения связывающего домена, ферментативной активности или эпитопа для облегчения либо очистки белка, либо выявления белка или других экспериментальных применений, известных из уровня техники, (3) нацеливания секреции или трансляции белка во внутриклеточную органеллу, такую как периплазматическое пространство грамотрицательных бактерий, митохондрии или хлоропласты растений или эндоплазматический ретикулум эукариотических клеток, причем последнее зачастую приводит к гликозилированию белка.

Вариантные нуклеотидные и аминокислотные последовательности согласно настоящему раскрытию также охватывают последовательности, полученные с помощью процедур, приводящих к мутациям и рекомбинациям, таких как ДНК-шаффлинг. С помощью такой процедуры один или несколько различных кодирующих участков полипептида PtIP-96 можно применять для создания нового полипептида PtIP-96, обладающего требуемыми свойствами. Таким образом, библиотеки рекомбинантных полинуклеотидов создают из группы родственных по последовательностям полинуклеотидов, содержащих участки последовательностей, которые характеризуются значительной идентичностью последовательности и могут подвергаться гомологичной рекомбинации in vitro или in vivo. Например, с применением этого подхода, мотивы с последовательностями, кодирующими домен, представляющий интерес, можно подвергать шаффлингу между пестицидным геном и другими известными пестицидными генами с получением нового гена, кодирующего белок с улучшенным свойством, представляющим интерес, таким как повышенная инсектицидная активность. Стратегии для такого ДНК-шаффлинга известны из уровня техники. См., например, Stemmer, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer, (1994) Nature 370:389-391; Crameri, et al., (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore, et al., (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang, et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri, et al., (1998) Nature 391:288-291; и патенты США №№ 5605793 и 5837458.

Замена доменов или шаффлинг представляет собой другой механизм получения измененных полипептидов PtIP-96. Можно проводить замену доменов между полипептидами PtIP-96, что дает гибридные или химерные токсины с повышенной пестицидной активностью или расширенным спектром мишеней. Способы получения рекомбинантных белков и тестирования их в отношении пестицидной активности хорошо известны из уровня техники (см., например, Naimov, et al., (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd, et al., (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge, et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf, et al., (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang, et al., 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925).

Выравнивание гомологов PtIP-96 (фигура 1) обеспечивает возможность идентификации остатков, которые являются высококонсервативными среди естественных гомологов в данном семействе.

Композиции

Также охвачены композиции, содержащие полипептид PtIP-96 согласно настоящему раскрытию. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит полипептид PtIP-96 под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит белок слияния PtIP-96.

Антитела

Также охвачены антитела к полипептиду PtIP-96 согласно вариантам осуществления или к его вариантам или фрагментам. Антитела согласно настоящему раскрытию включают поликлональные и моноклональные антитела, а также их фрагменты, которые сохраняют свою способность связываться с полипептидом PtIP-96, обнаруженным в кишечнике насекомого. Считается, что антитело, моноклональное антитело или его фрагмент способны связывать молекулу, если они способны специфично взаимодействовать с молекулой, тем самым, связывать молекулу с антителом, моноклональным антителом или его фрагментом. Как подразумевается, термин "антитело" (Ab) или "моноклональное антитело" (Mab) включает интактные молекулы, а также их фрагменты, или связывающие участки, или домены (такие как, например, фрагменты Fab и F(ab)₂), которые способны связывать гаптен. Такие фрагменты, как правило, получают при помощи протеолитического расщепления, например, с помощью папаина или пепсина. В качестве альтернативы, гаптен-связывающие фрагменты можно получать посредством применения технологии рекомбинантной ДНК или при помощи синтетической химии. Способы получения антител согласно настоящему раскрытию, как правило, известны из уровня техники. Например, см., Antibodies, A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane (eds.) Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1988), а также процитированные в нем литературные источники. Стандартные справочные издания, излагающие общие принципы иммунологии, включают: Klein, J. Immunology: The Science of Cell-Noncell Discrimination, John Wiley & Sons, N.Y. (1982); Dennett, et al., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, N.Y. (1980) и Campbell, "Monoclonal Antibody Technology," в Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Burdon, et al., (eds.), Elsevier, Amsterdam (1984). См. также, патенты США №№ 4196265; 4609893; 4713325; 4714681; 4716111; 4716117 и 4720459. Антитела к полипептиду PtIP-96 или их антиген-связывающие части можно получать при помощи ряда методик, в том числе традиционных методик получения моноклональных антител, например, стандартной методики гибридизации соматических клеток согласно Kohler and Milstein, (1975) Nature 256:495. Также можно использовать другие методики получения моноклонального антитела, такие как вирусная или онкогенная трансформация B-лимфоцитов. Система для получения гибридом с применением животных представляет собой систему с применением мышей. Из уровня техники известны протоколы и методики выделения спленоцитов иммунизированных животных для слияния. Также известны партнеры для слияния (например, клетки миеломы мыши) и процедуры слияния. Антитело и моноклональные антитела согласно настоящему раскрытию можно получить путем использования полипептида PtIP-96 в качестве антигенов.

Представлен набор для выявления присутствия полипептида PtIP-96 или выявления присутствия нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид PtIP-96, в образце. В одном варианте осуществления в наборе имеются реагенты на основе антитела для выявления присутствия полипептида PtIP-96 в образце ткани. В другом варианте осуществления в наборе имеются меченые зонды из нуклеиновой кислоты, применяемые для выявления присутствия одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих полипептид PtIP-96. В наборе также имеются соответствующие реагенты и контрольные образцы для проведения способа выявления, а также инструкции для применения набора.

Идентификация и выделение рецепторов

Также охвачены рецепторы к полипептиду PtIP-96 согласно вариантам осуществления или к его вариантам или фрагментам. Способы идентификации рецепторов, хорошо известные из уровня техники (см. Hofmann, et. al., (1988) Eur. J. Biochem. 173:85-91; Gill, et al., (1995) J. Biol. Chem. 27277-27282), можно использовать для идентификации и выделения рецептора, который распознает полипептид PtIP-96 с применением мембранных везикул щеточной каемки от восприимчивых насекомых. В дополнение к способу радиоактивного мечения, приведенному в процитированных литературных источниках, полипептид PtIP-96 можно метить с помощью флуоресцентного красителя и других общепринятых меток, таких как стрептавидин. Мембранные везикулы щеточной каемки (BBMV) восприимчивых насекомых, таких как соевая совка и щитники, можно получать в соответствии с протоколами, приведенными в ссылочных документах, и разделять в геле SDS-PAGE, и переносить на подходящую мембрану. Меченный полипептид PtIP-96 полипептид можно инкубировать с мембраной, на которой находятся подвергнутые блоттингу BBMV, и при этом меченый полипептид PtIP-96 можно идентифицировать при помощи меченых репортеров. Идентификацию белковой полоски(полосок), которая взаимодействуют с полипептидами PtIP-96, можно проводить при помощи секвенирования N-терминальных аминокислотных остатков в газовой фазе или способа идентификации белков на основе масс-спектрометрии (Patterson, (1998) 10.22, 1-24, Current Protocol in Molecular Biology published by John Wiley & Son Inc). После идентификации белка соответствующий ген можно клонировать из библиотеки геномной ДНК или кДНК восприимчивых насекомых, и сродство связывания можно оценивать непосредственно при помощи полипептидов PtIP-96. Рецепторную функцию в осуществлении инсектицидной активности полипептида PtIP-96 можно подтвердить путем осуществления способа нокаута гена при помощи RNAi (Rajagopal, et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:46849-46851).

Нуклеотидные конструкции, кассеты экспрессии и векторы

Применение термина "нуклеотидные конструкции" в данном документе не предназначено ограничивать варианты осуществления нуклеотидными конструкциями, содержащими ДНК. Специалистам в данной области будет понятно, что нуклеотидные конструкции, в частности полинуклеотиды и олигонуклеотиды, состоящие из рибонуклеотидов и комбинаций рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов, также можно использовать в способах, раскрытых в данном документе. Нуклеотидные конструкции, нуклеиновые кислоты и нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления дополнительно охватывают все комплементарные формы таких конструкций, молекул и последовательностей. Кроме того, нуклеотидные конструкции, нуклеотидные молекулы и нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления охватывают все нуклеотидные конструкции, молекулы и последовательности, которые можно использовать в способах согласно вариантам осуществления для трансформации растений, в том числе без ограничения состоящие из дезоксирибонуклеотидов, рибонуклеотидов и их комбинаций. Такие дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды предусматривают как встречающиеся в природе молекулы, так и синтетические аналоги. Нуклеотидные конструкции, нуклеиновые кислоты и нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления также охватывают все формы нуклеотидных конструкций, в том числе без ограничения одноцепочечные формы, двухцепочечные формы, шпильки, структуры "стебель-и-петля" и т. п.

Дополнительный вариант осуществления относится к трансформированному организму, такому как организм, выбранный из растительных клеток или клеток насекомых, бактерий, дрожжей, бакуловируса, простейших, нематод и водорослей. Трансформированный организм содержит молекулу ДНК согласно вариантам осуществления, кассету экспрессии, содержащую молекулу ДНК, или вектор, содержащий кассету экспрессии, которые могут быть стабильно встроенными в геном трансформированного организма.

Последовательности согласно вариантам осуществления представлены в составе ДНК-конструкций для экспрессии в организме, представляющем интерес. Конструкции будут включать 5' и 3' регуляторные последовательности, функционально связанные с последовательностью согласно вариантам осуществления. Используемое в данном документе выражение "функционально связанные" относится к функциональной связи между промотором и второй последовательностью, где промоторная последовательность инициирует и опосредует транскрипцию последовательности ДНК, соответствующей второй последовательности. Как правило, функционально связанные означает, что последовательности нуклеиновой кислоты, подлежащие связыванию, являются смежными и, при необходимости, два кодирующих белок участка соединяют в одной рамке считывания. Конструкция может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный ген, подлежащий введению в организм путем котрансформации. В качестве альтернативы, дополнительный(дополнительные) ген(гены) могут быть представлены во множественных ДНК-конструкциях.

Такая ДНК-конструкция снабжена несколькими сайтами рестрикции для вставки последовательности гена полипептида PtIP-96, транскрипция которой будет регулироваться регуляторными участками. ДНК-конструкция может дополнительно содержать гены селектируемых маркеров.

В направлении транскрипции 5' - 3' ДНК-конструкция, как правило, будет включать: участок инициации транскрипции и трансляции (т. е. промотор), последовательность ДНК согласно вариантам осуществления и участок терминации транскрипции и трансляции (т. е. участок терминации), функционирующие в организме, выступающем в качестве хозяина. Участок инициации транскрипции (т. е. промотор) может быть нативным, аналогичным, чужеродным или гетерологичным относительно организма-хозяина и/или последовательности согласно вариантам осуществления. Кроме того, промотор может быть природной последовательностью или, в качестве альтернативы, синтетической последовательностью. Применяемый в данном документе термин "чужеродный" указывает на то, что промотор не найден в нативном организме, в который введен промотор. Если промотор является "чужеродным" или "гетерологичным" относительно последовательности согласно вариантам осуществления, предполагается, что промотор не является нативным или встречающимся в природе промотором для функционально связанной последовательности согласно вариантам осуществления. Применяемый в данном документе химерный ген содержит кодирующую последовательность, функционально связанную с участком инициации транскрипции, который является гетерологичным для кодирующей последовательности. Если промотор является нативной или природной последовательностью, экспрессия функционально связанной последовательности изменена по сравнению с экспрессией дикого типа, что приводит к изменению фенотипа.

В некоторых вариантах осуществления ДНК-конструкция может также включать последовательность транскрипционного энхансера. Применяемый в данном документе термин "энхансер" относится к последовательности ДНК, которая может стимулировать активность промотора и которая может представлять собой характерный элемент промотора или гетерологичный элемент, вставленный для повышения уровня активности или тканевой специфичности промотора. Из уровня техники известны различные энхансеры, например, также могут применяться интроны со свойствами улучшения генной экспрессии в растениях (публикация заявки на патент США № 2009/0144863, интрон убиквитина (т. е. интрон 1 убиквитина маиса (см., например, последовательность NCBI S94464)), омега-энхансер или омега-штрих-энхансер (Gallie, et al., (1989) Molecular Biology of RNA ed. Cech (Liss, New York) 237-256 и Gallie, et al., (1987) Gene 60:217-25), энхансер CaMV 35S (см., например, Benfey, et al., (1990) EMBO J. 9:1685-96) и энхансеры из патента США № 7803992, каждый из которых включен посредством ссылки. Приведенный выше перечень транскрипционных энхансеров не предназначен для ограничения. В вариантах осуществления можно применять любой подходящий транскрипционный энхансер.

Участок терминации может быть нативным относительно участка инициации транскрипции, может быть нативным относительно функционально связанной последовательности ДНК, представляющей интерес, может быть нативным относительно растения-хозяина или может быть получен из другого источника (т. е. чужеродный или гетерологичный для промотора, последовательности, представляющей интерес, растения-хозяина или какой-либо их комбинации).

Подходящие участки терминации доступны из Ti-плазмиды A. tumefaciens, такие как участки терминации генов октопинсинтазы и нопалинсинтазы. См. также Guerineau, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot, (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon, et al., (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen, et al., (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe, et al., (1990) Gene 91:151-158; Ballas, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 и Joshi, et al., (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

При необходимости нуклеиновую кислоту можно оптимизировать для усиления экспрессии в организме-хозяине. Таким образом, если организм-хозяин представляет собой растение, то для усиления экспрессии можно синтезировать синтетические нуклеиновые кислоты с применением кодонов, предпочтительных для растений. См., например, Campbell и Gowri, (1990) Plant Physiol. 92:1-11, где обсуждается применение кодонов, предпочтительных для хозяина. Например, хотя последовательности нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления могут экспрессироваться у видов как однодольных, так и двудольных растений, последовательности можно модифицировать с учетом специфических предпочтений кодонов и предпочтений по содержанию GC у однодольных или двудольных, если было показано, что предпочтения отличаются (Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498). Таким образом, кодон конкретной аминокислоты, предпочтительный для маиса, можно установить из известных последовательностей генов маиса. Данные о частоте использования кодонов в маисе для 28 генов из растений маиса приведены в таблице 4 из Murray, et al., выше. Из уровня техники доступны способы синтеза генов, предпочтительных для растений. См., например, патенты США №№ 5380831 и 5436391, и Murray, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, и Liu H et al. Mol Bio Rep 37:677-684, 2010, включенные в данный документ посредством ссылки. Таблицу частоты использования кодонов Zea maize также можно найти на сайте kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=4577, доступ к которому можно получить с применением префикса www.

Таблица частоты использования кодонов Glycine max показана в виде таблицы 4, и ее также можно найти на сайте kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=3847&aa=1&style=N, доступ к которому можно получить с применением префикса www.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид PtIP-96, имеет кодоны, оптимизированные для маиса.

Известны дополнительные модификации последовательности для усиления экспрессии гена у клетки-хозяина. Они включают устранение последовательностей, кодирующих ложные сигналы полиаденилирования, сигналы сайта сплайсинга экзонов и интронов, транспозон-подобные повторы и другие хорошо изученные последовательности, которые могут быть вредны для экспрессии гена. Содержание GC в последовательности можно скорректировать до уровней, средних для данного клеточного хозяина, рассчитываемых с учетом известных генов, экспрессируемых в клетке-хозяине. Применяемый в данном документе термин "клетка-хозяин" относится к клетке, которая содержит вектор и поддерживает репликацию и/или экспрессию предполагаемых векторов экспрессии. Клетки-хозяева могут быть прокариотическими клетками, такими как E. coli, или эукариотическими клетками, такими как клетки дрожжей, насекомых, амфибий или млекопитающих, или клетками однодольных или двудольных растений. Примером клетки-хозяина, относящейся к однодольному растению, является клетка-хозяин маиса. Если возможно, последовательность модифицируют для того, чтобы избежать образования прогнозируемых шпилечных вторичных структур мРНК.

Кассеты экспрессии могут дополнительно содержать 5'-лидерные последовательности. Такие лидерные последовательности могут способствовать усилению трансляции. Из уровня техники известны трансляционные лидерные последовательности, и они включают лидерные последовательности пикорнавирусов, например, лидерную последовательность EMCV (5'-некодирующий участок генома вируса энцефаломиокардита) (Elroy-Stein et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); лидерные последовательности потивирусов, например, лидерную последовательность TEV (вирус гравировки табака) (Gallie, et al., (1995) Gene 165(2):233-238), лидерную последовательность MDMV (вирус карликовой мозаики кукурузы) и белок, связывающий тяжелую цепь иммуноглобулина человека (BiP) (Macejak, et al., (1991) Nature 353:90-94); нетранслируемую лидерную последовательность мРНК белка оболочки вируса мозаики люцерны (AMV RNA 4) (Jobling, et al., (1987) Nature 325:622-625); лидерную последовательность вируса табачной мозаики (TMV) (Gallie, et al., (1989) в Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256) и лидерную последовательность вируса хлорозной мозаичности маиса (MCMV) (Lommel, et al., (1991) Virology 81:382-385). См. также Della-Cioppa, et al., (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Такие конструкции могут также содержать "сигнальную последовательность" или "лидерную последовательность" для облегчения сопряженного с трансляцией или посттрансляционного транспорта пептида в определенные внутриклеточные структуры, такие как хлоропласт (или другая пластида), эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи.

Применяемая в данном документе "сигнальная последовательность" относится к последовательности, которая, как известно или как ожидается, приводит к сопряженному с трансляцией или посттрансляционному транспорту пептида через клеточную мембрану. У эукариот это, как правило, подразумевает секрецию в пузырьках аппарата Гольджи, при этом происходит определенное гликолизирование. Инсектицидные токсины бактерий зачастую синтезируются в виде протоксинов, которые активируются под действием протеолиза в кишечнике целевого вредителя (Chang, (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). В некоторых вариантах осуществления сигнальная последовательность расположена в нативной последовательности или может быть получена из последовательности согласно вариантам осуществления. Применяемая в данном документе "лидерная последовательность" относится к любой последовательности, которая при трансляции приводит к аминокислотной последовательности, способной запускать сопряженный с трансляцией транспорт пептидной цепи во внутриклеточную органеллу. Таким образом, этот термин включает лидерные последовательности, нацеливающие транспорт и/или гликозилирование путем перехода в эндоплазматический ретикулум, перехода в вакуоли, пластиды, в том числе хлоропласты, митохондрии и т. п. Кодируемые в ядре белки, нацеленные в компартмент полости тилакоида хлоропластов, имеют характерный двойной транзитный пептид, состоящий из сигнального пептида, нацеливающего на строму, и сигнального пептида, нацеливающего на полость. Информация для нацеливания на строму находится в ближайшей к амино-концу части транзитного пептида. Сигнальный пептид, нацеливающий на полость, находится в ближайшей к карбоксильному концу части транзитного пептида и содержит всю информацию для нацеливания на полость. Последние исследования по протеомике хлоропластов высших растений добились успеха в идентификации многочисленных кодируемых в ядре белков полости (Kieselbach et al. FEBS LETT 480:271-276, 2000; Peltier et al. Plant Cell 12:319-341, 2000; Bricker et al. Biochim. Biophys Acta 1503:350-356, 2001), при этом их сигнальный пептид, нацеливающий на полость, можно потенциально применять в соответствии с настоящим раскрытием. О приблизительно 80 белках из Arabidopsis, а также гомологичных белках из шпината и гороха огородного сообщается в Kieselbach et al., Photosynthesis Research, 78:249-264, 2003. В частности, в таблице 2 этой публикации, которая включена в настоящее описание посредством ссылки, раскрыто 85 белков из полости хлоропласта, идентифицированных по их № доступа (см. также публикацию заявки на патент США 2009/09044298). В дополнение, опубликованная недавно предварительная версия генома риса (Goff et al, Science 296:92-100, 2002) является подходящим источником для информации о сигнальном пептиде, нацеливающим на полость, который можно применять в соответствии с настоящим раскрытием.

Подходящие транзитные пептиды хлоропластов (CTP), хорошо известные специалисту в данной области, также включают химерные CTP, содержащие без ограничения N-терминальный домен, центральный домен или C-терминальный домен CTP из 1-дезокси-D ксилоза-5-фосфатсинтазы Oryza sativa, супероксиддисмутазы Oryza sativa, синтазы растворимого крахмала Oryza sativa, NADP-зависимого фермента, действующего на яблочную кислоту, Oryza sativa, фосфо-2-дегидро-3-дезоксигептонатальдолазы 2 Oryza sativa, L-аскорбатпероксидазы 5 Oryza sativa, фосфоглюкан-вода-дикиназы Oryza sativa, ssRUBISCO Zea Mays, бета-глюкозидазы Zea Mays, малатдегидрогеназы Zea Mays, тиоредоксина M-типа Zea Mays из патентной публикации США 2012/0304336).

Ген полипептида PtIP-96, подлежащего нацеливанию в хлоропласт, можно оптимизировать для экспрессии в хлоропласте с учетом отличий по использованию кодонов между растительным ядром и этой органеллой. Таким образом, нуклеиновые кислоты, представляющие интерес, можно синтезировать с применением кодонов, предпочтительных для хлоропласта. См., например, патент США № 5380831, включенный в данный документ посредством ссылки.

При получении кассеты экспрессии с различными фрагментами ДНК можно проводить манипуляции так, чтобы получить последовательности ДНК в надлежащей ориентации и, при необходимости, в надлежащей рамке считывания. С этой целью, для соединения фрагментов ДНК можно использовать адаптеры или линкеры, или можно задействовать другие манипуляции для обеспечения подходящих сайтов рестрикции, удаления избыточной ДНК, удаления сайтов рестрикции и т. п. С этой целью можно задействовать мутагенез in vitro, репарацию с помощью праймеров, рестрикцию, отжиг, повторные замены, например, транзиции и трансверсии.

При практическом осуществлении вариантов осуществления можно применять ряд промоторов. Промоторы можно выбирать, исходя из требуемого результата. Нуклеиновые кислоты можно комбинировать с конститутивными, предпочтительными для ткани, индуцируемыми или другими промоторами для экспрессии в организме-хозяине. Подходящие конститутивные промоторы для применения в растительной клетке-хозяине включают, например, коровый промотор промотора Rsyn7 и другие конститутивные промоторы, раскрытые в WO 1999/43838 и патенте США № 6072050; коровый промотор CaMV 35S (Odell, et al., (1985) Nature 313:810-812); промотор актина риса (McElroy, et al., (1990) Plant Cell 2:163-171); убиквитина (Christensen, et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 и Christensen, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last, et al., (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten, et al., (1984) EMBO J. 3:2723-2730); промотор гена ALS (патент США № 5659026) и т. п. Другие конститутивные промоторы включают, например, раскрытые в патентах США №№ 5608149; 5608144; 5604121; 5569597; 5466785; 5399680; 5268463; 5608142 и 6177611.

В зависимости от требуемого результата, может быть полезно экспрессировать ген при помощи индуцируемого промотора. Особый интерес для регуляции экспрессии нуклеотидных последовательностей согласно вариантам осуществления у растений представляют индуцируемые ранением промоторы. Такие индуцируемые ранением промоторы могут реагировать на повреждение, вызванное питанием насекомого, и они включают ген ингибитора протеиназы картофеля (pin II) (Ryan, (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duan, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wun1 и wun2, патент США № 5428148; win1 и win2 (Stanford, et al., (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200-208); системин (McGurl, et al., (1992) Science 225:1570-1573); WIP1 (Rohmeier, et al., (1993) Plant Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp, et al., (1993) FEBS Letters 323:73-76); ген MPI (Corderok, et al., (1994) Plant J. 6(2):141-150) и т. п., включенные в данный документ посредством ссылки.

Кроме того, в способах и нуклеотидных конструкциях согласно вариантам осуществления можно использовать индуцируемые патогеном промоторы. Такие индуцируемые патогеном промоторы включают промоторы из генов связанных с патогенезом белков (PR-белков), которые индуцируются после заражения патогеном; например, PR-белков, SAR-белков, бета-1,3-глюканазы, хитиназы и т. д. См., например, Redolfi, et al., (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes, et al., (1992) Plant Cell 4: 645-656 и Van Loon, (1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116. См. также WO 1999/43819, включенную в данный документ посредством ссылки.

Представляют интерес промоторы, которые экспрессируются локально в месте заражения патогеном или рядом с ним. См., например, Marineau, et al., (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton, et al., (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331; Somsisch, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2427-2430; Somsisch, et al., (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93-98 и Yang, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14972-14977. См. также Chen, et al., (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2507-2511; Warner, et al., (1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz, et al., (1989) Plant Cell 1:961-968; патент США № 5750386 (индуцируемый нематодами), а также источники, цитируемые в этих документах. Особый интерес представляет индуцируемый промотор для гена маиса PRms, экспрессия которого индуцируется патогеном Fusarium moniliforme (см., например, Cordero et al., (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189-200).

Регулируемые химическими веществами промоторы можно применять для модуляции экспрессии гена в растении посредством применения экзогенного химического регулятора. В зависимости от цели промотор может представлять собой индуцируемый химическим веществом промотор, при этом применение химического вещества индуцирует экспрессию гена, или репрессируемый химическим веществом промотор, при этом применение химического вещества подавляет экспрессию гена. Индуцируемые химическими веществами промоторы известны из уровня техники и включают без ограничения промотор In2-2 маиса, который активируется антидотами к бензолсульфонамидным гербицидам, промотор GST маиса, который активируется гидрофобными электрофильными соединениями, которые применяются в качестве предвсходовых гербицидов, и промотор PR-1a табака, который активируется салициловой кислотой. Другие регулируемые химическими веществами промоторы, представляющие интерес, включают чувствительные к стероидам промоторы (см., например, индуцируемый глюкокортикоидом промотор в Schena, et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 и McNellis, et al., (1998) Plant J. 14(2):247-257), а также индуцируемые тетрациклинами и репрессируемые тетрациклинами промоторы (см., например, Gatz, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237 и патенты США №№ 5814618 и 5789156), включенные в данный документ посредством ссылки.

Для целенаправленного воздействия на усиленную экспрессию полипептида PtIP-96 в конкретной ткани растения можно использовать предпочтительные для ткани промоторы. Предпочтительные для ткани промоторы, включают промоторы, обсуждаемые в Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata, et al., (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen, et al., (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell, et al., (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart, et al., (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp, et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini, et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto, et al., (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam, (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco, et al., (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka, et al., (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590 и Guevara-Garcia, et al., (1993) Plant J. 4(3):495-505. При необходимости такие промоторы можно модифицировать для слабой экспрессии.

Из уровня техники известны предпочтительные для листьев промоторы. См., например, Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon, et al., (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto, et al., (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Gotor, et al., (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco, et al., (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138 и Matsuoka, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590.

Известны промоторы, предпочтительные для корней или специфические в отношении корней, и их можно выбирать из многих доступных из литературы или выделенных de novo из различных совместимых видов. См., например, Hire, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (специфический в отношении корней сои ген глутаминсинтетазы); Keller and Baumgartner, (1991) Plant Cell 3(10):1051-1061 (специфический в отношении корней регуляторный элемент в гене GRP 1.8 фасоли); Sanger, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (специфический в отношении корней ген маннопинсинтазы (MAS) Agrobacterium tumefaciens) и Miao, et al., (1991) Plant Cell 3(1):11-22 (клон кДНК полной длины, кодирующий цитозольную глутаминсинтазу (GS), которая экспрессируется в корнях и корневых клубеньках сои). См. также Bogusz, et al., (1990) Plant Cell 2(7):633-641, где описаны два специфические в отношении корней промотора, выделенные из генов гемоглобина из азотфиксирующего растения Parasponia andersonii, не относящегося к бобовым, и родственного растения Trema tomentosa, не относящегося к бобовым и не являющегося азотфиксирующим. Промоторы этих генов были связаны с репортерным геном β-глюкуронидазы и введены как в Nicotiana tabacum, не относящееся к бобовым, так и в бобовое Lotus corniculatus, и при этом в обоих случаях специфическая в отношении корней промоторная активность сохранялась. Leach and Aoyagi (1991) описывают свой анализ промоторов, обеспечивающих высокий уровень экспрессии генов roIC и roID Agrobacterium rhizogenes, индуцирующих разрастание корней (см. Plant Science (Limerick) 79(1):69-76). Авторы пришли к выводу, что в этих промоторах энхансер и предпочтительные для определенной ткани ДНК-детерминанты разделены. Teeri et al. (1989) применяли слияние гена с lacZ для того, чтобы показать, что ген из T-ДНК Agrobacterium, кодирующий октопинсинтазу, является особенно активным в эпидермисе кончика корня, и что ген TR2' является специфическим в отношении корней в интактном растении и стимулируется при ранении в ткани листа, что является особенно целесообразной комбинацией характеристик для применения с инсектицидным или ларвицидным геном (смотрите EMBO J. 8(2):343-350). Ген TR1', слитый с nptII (неомицинфосфотрансфераза II), продемонстрировал аналогичные характеристики. Дополнительные предпочтительные для корней промоторы включают промотор гена VfENOD-GRP3 (Kuster, et al., (1995) Plant Mol. Biol. 29(4):759-772) и промотор rolB (Capana, et al., (1994) Plant Mol. Biol. 25(4):681-691. См. также патенты США №№ 5837876; 5750386; 5633363; 5459252; 5401836; 5110732 и 5023179. Предпочтительные для корней регуляторные последовательности Arabidopsis thaliana раскрыты в US20130117883.

"Предпочтительные для семени" промоторы включают как промоторы, "специфические в отношении семени" (промоторы, которые активны во время развития семени, такие как промоторы запасных белков семени), так и промоторы "прорастания семени" (промоторы, которые активны во время прорастания семени). См. Thompson, et al., (1989) BioEssays 10:108, включенную в настоящий документ посредством ссылки. Такие предпочтительные для семени промоторы включают без ограничения Cim1 (индуцируемый цитокинином транскрипт); cZ19B1 (19 кДа зеин маиса) и milps (мио-инозитол-1-фосфатсинтаза); (см. патент США № 6225529, включенный в настоящий документ посредством ссылки). Гамма-зеин и Glb-1 представляют собой промоторы, специфические в отношении эндосперма. В случае двудольных растений, промоторы, специфические в отношении семени, включают без ограничения промотор гена ингибитора трипсина Кунитца 3 (KTi3) (Jofuku and Goldberg, (1989) Plant Cell 1:1079-1093), β-фазеолина бобов, напина, β-конглицинина, глицинина 1, лектина сои, круциферина и т. п. В случае однодольных растений промоторы, специфические в отношении семени, включают без ограничения промоторы из генов 15 кДа зеина, 22 кДа зеина, 27 кДа зеина, g-зеина, waxy, shrunken 1, shrunken 2, глобулина 1 маиса и т. д. См. также WO 2000/12733, где раскрыты предпочтительные для семени промоторы из генов end1 и end2, включенную в данный документ посредством ссылки. У двудольных растений, промоторы, специфические в отношении семени, включают без ограничения промотор гена белков семенной оболочки из Arabidopsis, pBAN; а также промоторы генов раннего развития семян из Arabidopsis, p26, p63 и p63tr (патенты США №№ 7294760 и 7847153). Промотор, характеризующийся "предпочтительной" экспрессией в конкретной ткани, экспрессируется в такой ткани в большей степени, чем по меньшей мере в одной другой растительной ткани. Для некоторых предпочтительных для ткани промоторов показана экспрессия почти исключительно в конкретной ткани.

Если требуется низкий уровень экспрессии, будут применяться слабые промоторы. Как правило, применяемый в данном документе термин "слабый промотор" относится к промотору, который управляет экспрессией кодирующей последовательности на низком уровне. Под низким уровнем экспрессии подразумевают уровни от приблизительно 1/1000 транскриптов до приблизительно 1/100000 транскриптов, до приблизительно 1/500000 транскриптов. В качестве альтернативы, понятно, что термин "слабые промоторы" также охватывает промоторы, которые управляют экспрессией только в небольшом количестве клеток и не управляют в других, при этом обеспечивается общий низкий уровень экспрессии. Если промотор управляет экспрессией с неприемлемо высокими уровнями, части промоторной последовательности можно удалить или модифицировать для снижения уровней экспрессии.

Такие слабые конститутивные промоторы включают, например, коровый промотор промотора Rsyn7 (WO 1999/43838 и патент США № 6072050), коровый промотор 35S CaMV и т. п. Другие конститутивные промоторы включают, например, раскрытые в патентах США №№ 5608149; 5608144; 5604121; 5569597; 5466785; 5399680; 5268463; 5608142 и 6177611, включенных в данный документ посредством ссылки.

Приведенный выше перечень промоторов не предназначен для ограничения. В вариантах осуществления можно применять любой подходящий промотор.

Как правило, кассета экспрессии будет содержать ген селектируемого маркера для отбора трансформированных клеток. Гены селектируемых маркеров используют для отбора трансформированных клеток или тканей. Гены маркеров включают гены, кодирующие устойчивость к антибиотику, такие как гены, кодирующие неомицинфосфотрансферазу II (NEO) и гигромицинфосфотрансферазу (HPT), а также гены, обеспечивающие устойчивость к гербицидным соединениям, таким как глуфосинат аммония, бромоксинил, имидазолиноны и 2,4-дихлорфеноксиацетат (2,4-D). Дополнительные примеры генов подходящих селектируемых маркеров включают без ограничения гены, кодирующие устойчивость к хлорамфениколу (Herrera Estrella, et al., (1983) EMBO J. 2:987-992); метотрексату (Herrera Estrella, et al., (1983) Nature 303:209-213 и Meijer, et al., (1991) Plant Mol. Biol. 16:807-820); стрептомицину (Jones, et al., (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86-91); спектиномицину (Bretagne-Sagnard, et al., (1996) Transgenic Res. 5:131-137); блеомицину (Hille, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176); сульфонамиду (Guerineau, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15:127-136); бромоксинилу (Stalker, et al., (1988) Science 242:419-423); глифосату (Shaw, et al., (1986) Science 233:478-481 и заявки на патент США с серийными №№ 10/004357 и 10/427692); фосфинотрицину (DeBlock, et al., (1987) EMBO J. 6:2513-2518). См., в общих чертах, Yarranton, (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao, et al., (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff, (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley, et al., (1980) в The Operon, pp. 177-220; Hu, et al., (1987) Cell 48:555-566; Brown, et al., (1987) Cell 49:603-612; Figge, et al., (1988) Cell 52:713-722; Deuschle, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400-5404; Fuerst, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle, et al., (1990) Science 248:480-483; Gossen, (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow, et al., (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim, et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski, et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman, (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb, et al., (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt, et al., (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin, (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva, et al., (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka, et al., (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin) и Gill, et al., (1988) Nature 334:721-724. Такие раскрытия включены в данный документ посредством ссылки.

Приведенный выше перечень генов селектируемых маркеров не предназначен для ограничения. Любой ген селектируемого маркера можно применять в вариантах осуществления.

Трансформация растений

Способы согласно вариантам осуществления включают введение полипептида или полинуклеотида в растение. Применяемый в данном документе термин "введение" означает представление растению полинуклеотида или полипептида таким образом, что последовательность попадает внутрь клетки растения. Способы согласно вариантам осуществления не зависят от конкретного способа введения полинуклеотида или полипептида в растение, необходимо только, чтобы полинуклеотид или полипептиды получили доступ внутрь по меньшей мере одной клетки растения. Из уровня техники известны способы введения полинуклеотида или полипептидов в растения, в том числе без ограничений способы стабильной трансформации, способы временной трансформации и способы трансформации, опосредованной вирусами.

Применяемый в данном документе термин "стабильная трансформация" означает, что нуклеотидная конструкция, введенная в растение, интегрируется в геном растения и может наследоваться его потомством. Применяемый в данном документе термин "временная трансформация" означает, что полинуклеотид вводится в растение и не интегрируется в геном растения, или в растение вводится полипептид. Применяемый в данном документе термин "растение" относится к целым растениям, органам растения (например, листьям, стеблям, корням и т. д.), семенам, растительным клеткам, частям растения для вегетативного размножения, зародышам и их потомству. Растительные клетки могут быть дифференцированными или недифференцированными (например, клетками каллюса, клетками суспензионных культур, протопластами, клетками листьев, клетками корней, клетками флоэмы и пыльцой).

Протоколы трансформации, а также протоколы для введения нуклеотидных последовательностей в растения могут варьироваться в зависимости от типа растения или растительной клетки, т. е. однодольного или двудольного растения, которые планируется подвергнуть трансформации. Подходящие способы введения нуклеотидных последовательностей в клетки растений и последующей вставки в геном растения включают микроинъекцию (Crossway, et al., (1986) Biotechniques 4:320-334), электропорацию (Riggs, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606), трансформацию, опосредованную Agrobacterium (патенты США №№ 5563055 и 5981840), прямой перенос гена (Paszkowski, et al., (1984) EMBO J. 3:2717-2722) и баллистическое ускорение частиц (см., например, патенты США №№ 4945050; 5879918; 5886244 и 5932782; Tomes, et al., (1995) в Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips, (Springer-Verlag, Berlin) и McCabe, et al., (1988) Biotechnology 6:923-926) и трансформацию гена Lecl (WO 00/28058). Что касается трансформации картофеля, см. Tu, et al., (1998) Plant Molecular Biology 37:829-838 и Chong, et al., (2000) Transgenic Research 9:71-78. Дополнительные процедуры трансформации можно найти у Weissinger, et al., (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford, et al., (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (лук); Christou, et al., (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (соя); McCabe, et al., (1988) Bio/Technology 6:923-926 (соя); Finer and McMullen, (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (соя); Singh, et al., (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (соя); Datta, et al., (1990) Biotechnology 8:736-740 (рис); Klein, et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (маис); Klein, et al., (1988) Biotechnology 6:559-563 (маис); патенты США №№ 5240855; 5322783 и 5324646; Klein, et al., (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (маис); Fromm, et al., (1990) Biotechnology 8:833-839 (маис); Hooykaas-Van Slogteren, et al., (1984) Nature (London) 311:763-764; патент США № 5736369 (злаки); Bytebier, et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet, et al., (1985) в The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman, et al., (Longman, New York), pp. 197-209 (пыльца); Kaeppler, et al., (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 и Kaeppler, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (трансформация, опосредованная вискерами); D'Halluin, et al., (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (электропорация); Li, et al., (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 и Christou and Ford, (1995) Annals of Botany 75:407-413 (рис); Osjoda, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (трансформация маиса с помощью Agrobacterium tumefaciens); все из которых включены в данный документ посредством ссылки.

В конкретных вариантах осуществления последовательности согласно вариантам осуществления можно вводить в растение с применением ряда способов временной трансформации. Такие способы временной трансформации включают без ограничения введение полинуклеотида PtIP-96 или его вариантов и фрагментов непосредственно в растение или введение транскрипта полипептида PtIP-96 в растение. Такие способы включают, например, микроинъекцию или бомбардировку частицами. См., например, Crossway, et al., (1986) Mol Gen. Genet. 202:179-185; Nomura, et al., (1986) Plant Sci. 44:53-58; Hepler, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:2176-2180 и Hush, et al., (1994) The Journal of Cell Science 107:775-784, все из которых включены в данный документ посредством ссылки. В качестве альтернативы, растение можно временно трансформировать с помощью полинуклеотида для полипептида PtIP-96 с применением методик, известных из уровня техники. Такие методики включают применение вирусной векторной системы и осаждение полинуклеотида таким способом, который исключает последующее высвобождение ДНК. Таким образом, может происходить транскрипция ДНК, связанной с частицами, но частота, с которой она высвобождается для интеграции в геном, в значительной степени снижена. Такие способы включают применение частиц, покрытых полиэтиленимином (PEI; Sigma, кат. № P3143).

Из уровня техники известны способы нацеленной вставки полинуклеотида в конкретное местоположение в геноме растения. В одном варианте осуществления вставку полинуклеотида в требуемое местоположение в геноме выполняют с использованием системы сайт-специфической рекомбинации. См., например, WO 1999/25821, WO 1999/25854, WO 1999/25840, WO 1999/25855 и WO 1999/25853, все из которых включены в данный документ посредством ссылки. Вкратце, полинуклеотид согласно вариантам осуществления может содержаться в кассете для переноса, фланкированной двумя неидентичными сайтами рекомбинации. Кассету для переноса вводят в растение, имеющее в своем геноме стабильно встроенный целевой сайт, который фланкирован двумя неидентичными сайтами рекомбинации, которые соответствуют сайтам кассеты для переноса. Обеспечивают подходящую рекомбиназу, и кассета для переноса интегрируется в целевой сайт. Полинуклеотид, представляющий интерес, таким образом интегрируется в определенное хромосомное положение в геноме растения.

Векторы для трансформации растений могут состоять из одного или нескольких ДНК-векторов, необходимых для достижения трансформации растения. Например, общепринятой практикой в уровне техники является использование векторов для трансформации растений, которые состоят из двух и более смежных сегментов ДНК. В уровне техники эти векторы зачастую называют "бинарными векторами". Бинарные векторы, а также векторы с плазмидами-помощниками наиболее часто применяются при трансформации, опосредованной Agrobacterium, при этом размер и сложность сегментов ДНК, необходимых для достижения эффективной трансформации, являются очень большими, и предпочтительным является разделение функций на отдельных молекулах ДНК. Бинарные векторы, как правило, содержат плазмидный вектор, который содержит действующие в цис-положении последовательности, требуемые для переноса Т-ДНК (как, например, левой границы и правой границы), селектируемый маркер, который разрабатывают таким образом, что он может экспрессироваться в растительной клетке, и "ген, представляющий интерес" (ген, разработанный таким образом, что он может экспрессироваться в растительной клетке, из которой требуется получить трансгенные растения). Также в этом плазмидном векторе присутствуют последовательности, требуемые для репликации в бактериях. Действующие в цис-положении последовательности расположены так, чтобы обеспечить возможность эффективного переноса в растительные клетки и экспрессии в них. Например, ген селектируемого маркера и пестицидный ген расположены между левой и правой границами. Часто второй плазмидный вектор содержит действующие в транс-положении факторы, которые опосредуют перенос T-ДНК из Agrobacterium в растительные клетки. Эта плазмида часто содержит функции вирулентности (гены Vir), что обеспечивает возможность заражения растительных клеток Agrobacterium и перенос ДНК путем расщепления по граничным последовательностям и переноса ДНК, опосредованного vir, как понятно из уровня техники (Hellens and Mullineaux, (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Несколько типов штаммов Agrobacterium (например, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105 и т. п.) можно применять для трансформации растений. Второй плазмидный вектор не является необходимым для трансформации растений другими способами, такими как бомбардировка микрочастицами, микроинъекция, электропорация, с помощью полиэтиленгликоля и т. д.

В целом, способы трансформации растений включают перенос гетерологичной ДНК в целевые растительные клетки (например, незрелые или зрелые зародыши, суспензионные культуры, недифференцированный каллюс, протопласты и т. д.) с последующим применением соответствующего отбора с максимальным пороговым значением (в зависимости от гена селектируемого маркера) для выделения трансформированных растительных клеток из группы нетрансформированной клеточной массы. После интеграции гетерологичной чужеродной ДНК в растительные клетки затем применяют соответствующий отбор с максимальным пороговым значением в среде для уничтожения нетрансформированных клеток и отделения и размножения предположительно трансформированных клеток, которые переживают эту обработку с отбором, посредством регулярного переноса на свежую среду. При помощи продолжающегося пассирования и проверки при помощи соответствующего отбора идентифицируют и размножают клетки, которые трансформированы плазмидным вектором. Затем можно применять молекулярные и биохимические способы для подтверждения присутствия интегрированного гетерологичного гена, представляющего интерес, в геноме трансгенного растения.

Эксплантаты, как правило, переносят на свежую порцию той же среды и культивируют обычным способом. Впоследствии трансформированные клетки дифференцируются в побеги после помещения в среду для регенерации, дополненную средством отбора с максимальным пороговым значением. Побеги затем переносят на селективную среду для выращивания растений с получением укоренившихся побегов или саженцев. Затем трансгенный саженец выращивают до зрелого растения и получают фертильные семена (например, Hiei, et al., (1994) Plant Journal 6:271-282; Ishida, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Эксплантаты, как правило, переносят на свежую порцию той же среды и культивируют обычным способом. Общее описание методик и способов получения трансгенных растений приведены в Ayres and Park, (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 и Bommineni and Jauhar, (1997) Maydica 42:107-120. Поскольку трансформированный материал содержит множество клеток, как трансформированные, так и нетрансформированные клетки присутствуют в любой части подвергнутого воздействию целевого каллюса, или ткани, или группы клеток. Возможность уничтожать нетрансформированные клетки и обеспечивать размножение трансформированных клеток приводит в результате к трансформированным растительным культурам. Зачастую, возможность удаления нетрансформированных клеток является ограничивающим фактором для быстрого выделения трансформированных растительных клеток и успешного выращивания трансгенных растений.

Из клеток, которые были трансформированы, можно вырастить растения в соответствии с традиционными способами. См., например, McCormick, et al., (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Эти растения затем можно выращивать и опылять либо с использованием такого же трансформированного штамма, либо другого штамма и идентифицировать полученный гибрид с конститутивной или индуцируемой экспрессией требуемой фенотипической характеристики. Можно вырастить два или более поколений для того, чтобы убедиться в том, что экспрессия требуемой фенотипической характеристики стабильно поддерживается и наследуется, а затем собрать семена, чтобы убедиться в том, что экспрессия требуемой фенотипической характеристики была достигнута.

Нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления можно вводить в растение путем приведения в растения контакт с вирусом или вирусными нуклеиновыми кислотами. Как правило, такие способы включают встраивание нуклеотидной конструкции, представляющей интерес, в молекулу вирусной ДНК или РНК. Понятно, что рекомбинантные белки согласно вариантам осуществления можно первоначально синтезировать как часть вирусного полипротеина, который позже может быть процессирован путем протеолиза in vivo или in vitro с получением требуемого полипептида PtIP-96. Также понятно, что такой вирусный полипротеин, содержащий по меньшей мере часть аминокислотной последовательности PtIP-96 согласно вариантам осуществления, может обладать требуемой пестицидной активностью. Такие вирусные полипротеины и нуклеотидные последовательности, которые их кодируют, охватываются вариантами осуществления. Способы введения в растения нуклеотидных конструкций и получения кодируемых белков в растениях, которые включают молекулы вирусной ДНК или РНК, известны из уровня техники. См., например, патенты США №№ 5889191; 5889190; 5866785; 5589367 и 5316931; включенные в данный документ посредством ссылки.

Способы трансформации хлоропластов известны из уровня техники. См., например, Svab, et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga, (1993) EMBO J. 12:601-606. Способ основан на доставке генной пушкой ДНК, содержащей селектируемый маркер, и нацеливании ДНК на геном пластид с помощью гомологичной рекомбинации. Кроме того, трансформацию пластид можно осуществлять трансактивацией молчащего трансгена, находящегося в пластидах, путем осуществляемой преимущественно в определенной ткани экспрессии РНК-полимеразы, кодируемой ядерным геномом и функционирующей в пластиде. О такой системе сообщали в McBride, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.

Варианты осуществления дополнительно относятся к материалу для размножения трансформированного растения согласно вариантам осуществления, в том числе без ограничения семенам, клубням, клубнелуковицам, луковицам, листьям и черенкам корней и побегов.

Варианты осуществления можно применять для трансформации любых видов растений, в том числе без ограничения однодольных и двудольных. Примеры растений, представляющих интерес, включают без ограничений кукурузу (Zea mays), Brassica sp. (например, B. napus, B. rapa, B. juncea), в частности виды Brassica, пригодные в качестве источников масла из семян растений, люцерну (Medicago sativa), рис (Oryza sativa), рожь (Secale cereale), сорго (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), просо (например, пеннисетум рогозовидный (Pennisetum glaucum), просо культурное (Panicum miliaceum), щетинник итальянский (Setaria italica), просо пальчатое (Eleusine coracana)), подсолнечник (Helianthus annuus), сафлор (Carthamus tinctorius), пшеницу (Triticum aestivum), сою (Glycine max), табак (Nicotiana tabacum), картофель (Solanum tuberosum), разновидности арахиса (Arachis hypogaea), хлопчатник (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), сладкий картофель (Ipomoea batatus), маниок (Manihot esculenta), кофейное дерево (Coffea spp.), кокосовую пальму (Cocos nucifera), ананас (Ananas comosus), цитрусовые деревья (Citrus spp.), шоколадное дерево (Theobroma cacao), чайный куст (Camellia sinensis), банан (Musa spp.), авокадо (Persea americana), инжир (Ficus casica), гуаву (Psidium guajava), манго (Mangifera indica), маслину (Olea europaea), папайю (Carica papaya), кешью (Anacardium occidentale), макадамию (Macadamia integrifolia), миндаль (Prunus amygdalus), разновидности сахарной свеклы (Beta vulgaris), сахарный тростник (Saccharum spp.), разновидности овса, ячмень, овощи, декоративные растения и хвойные деревья.

Овощи включают томаты (Lycopersicon esculentum), латук (например, Lactuca sativa), зеленую фасоль (Phaseolus vulgaris), лимскую фасоль (Phaseolus limensis), горох (Lathyrus spp.) и представителей рода Cucumis, таких как огурец (C. sativus), канталупа (C. cantalupensis) и дыня мускусная (C. melo). Декоративные растения включают азалию (Rhododendron spp.), гортензию (Macrophylla hydrangea), гибискус (Hibiscus rosasanensis), розы (Rosa spp.), тюльпаны (Tulipa spp.), нарциссы (Narcissus spp.), петунии (Petunia hybrida), гвоздику (Dianthus caryophyllus), пуансеттию (Euphorbia pulcherrima) и хризантему. Хвойные растения, которые можно использовать при практическом осуществлении вариантов осуществления, включают, например, виды сосны, такие как сосна ладанная (Pinus taeda), сосна Эллиота (Pinus elliotii), сосна желтая (Pinus ponderosa), сосна скрученная широкохвойная (Pinus contorta) и сосна лучистая (Pinus radiata); псевдотсугу Мензиса (Pseudotsuga menziesii); тсугу канадскую (Tsuga canadensis); ель сизую (Picea glauca); секвойю вечнозеленую (Sequoia sempervirens); виды пихты, такие как пихта миловидная (Abies amabilis) и пихта бальзамическая (Abies balsamea); и виды туи, такие как туя гигантская (Thuja plicata) и каллитропсис нутканский (Chamaecyparis nootkatensis). Растения согласно вариантам осуществления включают культурные растения (например, кукурузу, люцерну, подсолнечник, Brassica, сою, хлопчатник, сафлор, арахис, сорго, пшеницу, просо, табак и т. д.), такие как растения кукурузы и сои.

Разновидности газонной травы включают без ограничения: мятлик однолетний (Poa annua); райграс однолетний (Lolium multiflorum); мятлик сплюснутый (Poa compressa); овсяницу красную Чуинга (Festuca rubra); полевицу тонкую (Agrostis tenuis); полевицу болотную (Agrostis palustris); житняк пустынный (Agropyron desertorum); житняк гребенчатый (Agropyron cristatum); овсяницу длиннолистную (Festuca longifolia); мятлик луговой (Poa pratensis); ежу сборную (Dactylis glomerata); плевел многолетний (Lolium perenne); овсяницу красную (Festuca rubra); полевицу белую (Agrostis alba); мятлик обыкновенный (Poa trivialis); овсяницу овечью (Festuca ovina); костер безостый (Bromus inermis); овсяницу тростниковую (Festuca arundinacea); тимофеевку луговую (Phleum pratense); полевицу собачью (Agrostis canina); бескильницу расставленную (Puccinellia distans); пырей Смита (Agropyron smithii); свинорой пальчатый (Cynodon spp.); узкобороздник однобокий (Stenotaphrum secundatum); зойсию (Zoysia spp.); гречку заметную (Paspalum notatum); аксонопус афинский (Axonopus affinis); эремохлою змеехвостую (Eremochloa ophiuroides); кикуйю (Pennisetum clandesinum); паспалум влагалищный (Paspalum vaginatum); москитную траву (Bouteloua gracilis); бизонову траву (Buchloe dactyloids); боковой овес (Bouteloua curtipendula).

Растения, представляющие интерес, включают зерновые растения, которые дают семена, представляющие интерес, масличные растения и бобовые растения. Семена, представляющие интерес, включают семена зерновых культур, таких как кукуруза, пшеница, ячмень, рис, сорго, рожь, просо и т. д. Масличные растения включают хлопчатник, сою, сафлор, подсолнечник, Brassica, маис, люцерну, пальму, кокосовую пальму, лен, клещевину, маслину и т. д. Бобовые растения включают разновидности бобов и разновидности гороха. Бобы включают гуар, рожковое дерево, пажитник, сою, разновидности обыкновенной фасоли, вигну китайскую, золотистую фасоль, лимскую фасоль, стручковую фасоль, разновидности чечевицы, турецкий горох и т. д.

Оценка трансформации растений

После введения гетерологичной чужеродной ДНК в растительные клетки трансформацию или интеграцию гетерологичного гена в геном растения подтверждают при помощи различных способов, таких как анализ нуклеиновых кислот, белков и метаболитов, связанных с интегрированным геном.

ПЦР-анализ представляет собой быстрый способ скрининга трансформированных клеток, ткани или побегов в отношении присутствия встроенного гена на ранней стадии перед высаживанием в почву (Sambrook and Russell, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). ПЦР проводят с применением олигонуклеотидных праймеров, специфических в отношении гена, представляющего интерес, или в отношении исходных последовательностей вектора на основе Agrobacterium и т. д.

Трансформацию растений можно подтвердить с помощью Саузерн-блот анализа геномной ДНК (Sambrook и Russell, (2001) выше). В целом, общую ДНК экстрагируют из трансформанта, разрезают соответствующими ферментами рестрикции, фракционируют в агарозном геле и переносят на нитроцеллюлозную или найлоновую мембрану. Затем мембрану или "блот" анализируют с помощью зонда, например, целевого фрагмента ДНК с радиоактивной меткой 32P для подтверждения интеграции внедренного гена в геном растения в соответствии со стандартными методиками (Sambrook and Russell, (2001) выше).

При нозерн-блот анализе РНК выделяют из специфических тканей трансформанта, фракционируют в агарозном геле, содержащем формальдегид, и переносят на найлоновый фильтр в соответствии со стандартными методиками, которые обычно применяются в уровне техники (Sambrook и Russell, (2001) выше). Экспрессию РНК, кодируемой пестицидным геном, затем тестируют при помощи гибридизации фильтра с радиоактивным зондом, полученным из пестицидного гена, посредством способов, известных из уровня техники (Sambrook и Russell, (2001) выше).

Вестерн-блот, биохимические анализы и подобные можно проводить в отношении трансгенных растений для подтверждения присутствия белка, кодируемого пестицидным геном, при помощи стандартных процедур (Sambrook и Russell, 2001, выше) с применением антител, которые связываются с одним или несколькими эпитопами, присутствующими на полипептиде PtIP-96.

Пакетирование признаков в трансгенном растении

Трансгенные растения могут содержать пакет из одного или нескольких инсектицидных полинуклеотидов, раскрытых в данном документе, с одним или несколькими дополнительными полинуклеотидами, приводящими к продукции или подавлению нескольких полипептидных последовательностей. Трансгенные растения, содержащие пакеты из последовательностей полинуклеотидов, можно получить либо при помощи традиционных способов скрещивания, либо посредством способов генной инженерии, либо применяя и то, и другое. Эти способы включают без ограничения скрещивание индивидуальных линий, при этом каждая содержит полинуклеотид, представляющий интерес, трансформацию трансгенного растения, содержащего ген, раскрытый в данном документе, дополнительным геном и котрансформацию генами одной растительной клетки. Применяемый в данном документе термин "пакетированный" включает состояние, при котором в одном растении присутствуют несколько признаков (т.е. оба признака внедрены в ядерный геном, один признак внедрен в ядерный геном и один признак внедрен в геном пластиды или оба признака внедрены в геном пластиды). В одном неограничивающем примере "пакетированные признаки" включают в себя молекулярный пакет, в котором последовательности физически граничат друг с другом. Применяемый в данном документе термин "признак" относится к фенотипу, обусловленному конкретной последовательностью или группами последовательностей. Котрансформацию генов можно проводить с применением единичных векторов для трансформации, содержащих несколько генов, или нескольких векторов, которые несут отдельные гены. Если последовательности пакетированы с помощью генетической трансформации растений, то представляющие интерес полинуклеотидные последовательности можно комбинировать в любое время и в любом порядке. Признаки можно вводить одновременно в протоколе котрансформации с представляющими интерес полинуклеотидами, представленными любой комбинацией кассет для трансформации. Например, если будут вводиться две последовательности, то эти две последовательности могут содержаться в отдельных кассетах для трансформации (транс) или содержаться в одной кассете для трансформации (цис). Экспрессия этих последовательностей может управляться одним и тем же промотором или различными промоторами. В определенных случаях может потребоваться введение кассеты для трансформации, которая будет подавлять экспрессию полинуклеотида, представляющего интерес. Ее можно комбинировать с любой комбинацией других кассет для супрессии или кассет для сверхэкспрессии с целью получения требуемой комбинации признаков в растении. Кроме того, считается, что полинуклеотидные последовательности можно пакетировать в требуемом местоположении в геноме с применением системы для сайт-специфической рекомбинации. См., например, WO 1999/25821, WO 1999/25854, WO 1999/25840, WO 1999/25855 и WO 1999/25853, все из которых включены в данный документ посредством ссылки.

В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды, кодирующие полипептид PtIP-96, раскрытые в данном документе, отдельно или пакетированные с одним или несколькими дополнительными признаками устойчивости к насекомым, можно пакетировать с одним или несколькими дополнительными вводимыми признаками, влияющими на затраты (например, устойчивость к гербициду, устойчивость к грибам, устойчивость к вирусам, переносимость стрессов, устойчивость к заболеваниям, мужская стерильность, сила стебля и т. п.), или признаками, влияющими на выход (например, повышенная урожайность, модифицированные разновидности крахмала, улучшенный профиль масел, сбалансированные аминокислоты, высокое содержание лизина или метионина, повышенная усвояемость, улучшенное качество волокон, устойчивость к засухе и т. п.). Таким образом, варианты осуществления полинуклеотида можно применять для обеспечения полного комплекса агротехнических признаков, обеспечивающих улучшенное качество сельскохозяйственной культуры, с возможностью гибкого и экономически эффективного контроля любого числа сельскохозяйственных вредителей.

Трансгены, пригодные для пакетирования, без ограничения включают следующие.

1. Трансгены, которые обеспечивают устойчивость к насекомым или заболеваниям и которые кодируют следующее.

(A) Гены устойчивости растения к заболеваниям. Защитные механизмы растений зачастую активируются посредством специфического взаимодействия между продуктом гена устойчивости к заболеваниям (R) в растении и продуктом соответствующего гена авирулентности (Avr) в патогене. Разновидность растений можно трансформировать с помощью клонированного гена устойчивости для разработки растений, которые устойчивы к специфическим штаммам патогена. См., например, Jones, et al., (1994) Science 266:789 (клонирование гена Cf-9 томата, обеспечивающего устойчивость к Cladosporium fulvum); Martin, et al., (1993) Science 262:1432 (ген Pto томата, обеспечивающий устойчивость к Pseudomonas syringae pv. томата, кодирует протеинкиназу); Mindrinos, et al., (1994) Cell 78:1089 (ген RSP2 Arabidopsis, обеспечивающий устойчивость к Pseudomonas syringae), McDowell and Woffenden, (2003) Trends Biotechnol. 21(4):178-83 и Toyoda, et al., (2002) Transgenic Res. 11(6):567-82. Растение, устойчивое к заболеванию, представляет собой растение, которое более устойчиво к патогену в сравнении с растением дикого типа.

(B) Гены, кодирующие белок Bacillus thuringiensis, его производное или синтетический полипептид, смоделированный на его основе. См., например, Geiser, et al., (1986) Gene 48:109, которые раскрывают клонирование и нуклеотидную последовательность гена дельта-эндотоксина Bt. Кроме того, молекулы ДНК, кодирующие гены дельта-эндотоксина, можно приобрести в Американской коллекции типовых культур (Роквилл, Мэриленд), например, под номерами доступа ATCC^® 40098, 67136, 31995 и 31998. Другие неограничивающие примеры трансгенов Bacillus thuringiensis, разработанных c помощью методик генной инженерии, приведены в следующих патентах и заявках на патент и, тем самым, включены посредством ссылки для этой цели: патенты США №№ 5188960; 5689052; 5880275; 5986177; 6023013, 6060594, 6063597, 6077824, 6620988, 6642030, 6713259, 6893826, 7105332; 7179965, 7208474; 7227056, 7288643, 7323556, 7329736, 7449552, 7468278, 7510878, 7521235, 7544862, 7605304, 7696412, 7629504, 7705216, 7772465, 7790846, 7858849 и WO 1991/14778; WO 1999/31248; WO 2001/12731; WO 1999/24581 и WO 1997/40162.

Гены, кодирующие пестицидные белки, можно также пакетировать в том числе без ограничения: с инсектицидными белками из Pseudomonas sp., такими как PSEEN3174 (Monalysin, (2011) PLoS Pathogens, 7:1-13), из штамма CHA0 и Pf-5 Pseudomonas protegens (ранее fluorescens) (Pechy-Tarr, (2008) Environmental Microbiology 10:2368-2386: № доступа в GenBank EU400157); из Pseudomonas Taiwanensis (Liu, et al., (2010) J. Agric. Food Chem. 58:12343-12349) и из Pseudomonas pseudoalcligenes (Zhang, et al., (2009) Annals of Microbiology 59:45-50 и Li, et al., (2007) Plant Cell Tiss. Organ Cult. 89:159-168); инсектицидными белками из Photorhabdus sp. и Xenorhabdus sp. (Hinchliffe, et al., (2010) The Open Toxinology Journal 3:101-118 и Morgan, et al., (2001) Applied and Envir. Micro. 67:2062-2069); патент США № 6048838 и патент США № 6379946; полипептидом PIP-1 из публикации заявки на патент США US20140007292 ; полипептидом AfIP-1A и/или AfIP-1B из публикации заявки на патент США US20140033361; полипептидом PHI-4 из публикации заявки на патент США с серийным номером 13/839702; полипептидом PIP-47 из патентной публикации согласно PCT с серийным номером PCT/US14/51063, полипептидом PIP-72 из патентной публикации согласно PCT с серийным номером PCT/US14/55128, и δ-эндотоксины, в том числе без ограничения классы Cry1, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry10, Cry11, Cry12, Cry13, Cry14, Cry15, Cry16, Cry17, Cry18, Cry19, Cry20, Cry21, Cry22, Cry23, Cry24, Cry25, Cry26, Cry27, Cry 28, Cry 29, Cry 30, Cry31, Cry32, Cry33, Cry34, Cry35,Cry36, Cry37, Cry38, Cry39, Cry40, Cry41, Cry42, Cry43, Cry44, Cry45, Cry 46, Cry47, Cry49, Cry50, Cry51, Cry52, Cry53, Cry 54, Cry55, Cry56, Cry57, Cry58, Cry59, Cry60, Cry61, Cry62, Cry63, Cry64, Cry65, Cry66, Cry67, Cry68, Cry69, Cry70, Cry71 и Cry 72 генов δ-эндотоксинов и гены цитолитических токсинов Сyt1 и Сyt2 B. thuringiensis. Члены этих классов инсектицидных белков из B. thuringiensis хорошо известны специалисту в данной области техники (см., Crickmore, et al., "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature" (2011), на сайте lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/, доступ к которому можно получить во всемирной сети Интернет с помощью префикса "www").

Примеры δ-эндотоксинов также включают без ограничения белки Cry1A из патентов США №№ 5880275 и 7858849; токсин DIG-3 или DIG-11 (варианты с N-терминальной делецией α-спирали 1 и/или α-спирали 2 белков Cry, таких как Cry1A) из патентов США №№ 8304604 и 8304605, Cry1B из заявки на патент США с серийным номером 10/525318; Cry1C из патента США № 6033874; Cry1F из патентов США №№ 5188960, 6218188; химеры Cry1A/F из патентов США №№ 7070982; 6962705 и 6713063); белок Cry2, такой как белок Cry2Ab из патента США № 7064249); белок Cry3A, в том числе без ограничения созданный с помощью генной инженерии гибридный инсектицидный белок (eHIP), полученный путем слияния уникальных комбинаций вариабельных участков и консервативных блоков по меньшей мере двух различных белков Cry (публикация заявки на патент США №2010/0017914); белок Cry4; белок Cry5; белок Cry6; белки Cry8 из патентов США №№ 7329736, 7449552, 7803943, 7476781, 7105332, 7378499 и 7462760; белок Cry9, например представители семейств Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E и Cry9F; белок Cry15 из Naimov, et al., (2008) Applied and Environmental Microbiology 74:7145-7151; белок Cry22, белок Cry34Ab1 из патентов США №№ 6127180, 6624145 и 6340593; белок CryET33 и CryET34 из патентов США №№ 6248535, 6326351, 6399330, 6949626, 7385107 и 7504229; гомологи CryET33 и CryET34 из публикации заявок на патент США №№ 2006/0191034, 2012/0278954 и публикации согласно PCT № WO 2012/139004; белок Cry35Ab1 из патентов США №№ 6083499, 6548291 и 6340593; белок Cry46, белок Cry 51, бинарный токсин Cry; TIC901 или родственный токсин; TIC807 из US 2008/0295207; ET29, ET37, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127, TIC128 из PCT US 2006/033867; AXMI-027, AXMI-036 и AXMI-038 из патента США № 8236757; AXMI-031, AXMI-039, AXMI-040, AXMI-049 из US7923602; AXMI-018, AXMI-020 и AXMI-021 из WO 2006/083891; AXMI-010 из WO 2005/038032; AXMI-003 из WO 2005/021585; AXMI-008 из US 2004/0250311; AXMI-006 из US 2004/0216186; AXMI-007 из US 2004/0210965; AXMI-009 из US 2004/0210964; AXMI-014 из US 2004/0197917; AXMI-004 из US 2004/0197916; AXMI-028 и AXMI-029 из WO 2006/119457; AXMI-007, AXMI-008, AXMI-0080rf2, AXMI-009, AXMI-014 и AXMI-004 из WO 2004/074462; AXMI-150 из патента США № 8084416; AXMI-205 из US20110023184; AXMI-011, AXMI-012, AXMI-013, AXMI-015, AXMI-019, AXMI-044, AXMI-037, AXMI-043, AXMI-033, AXMI-034, AXMI-022, AXMI-023, AXMI-041, AXMI-063 и AXMI-064 из US 2011/0263488; AXMI-R1 и родственные белки из US 2010/0197592; AXMI221Z, AXMI222z, AXMI223z, AXMI224z и AXMI225z из WO 2011/103248; AXMI218, AXMI219, AXMI220, AXMI226, AXMI227, AXMI228, AXMI229, AXMI230 и AXMI231 из WO11/103247; AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005, AXMI-163 и AXMI-184 из патента США № 8334431; AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035 и AXMI-045 из US 2010/0298211; AXMI-066 и AXMI-076 из US20090144852; AXMI128, AXMI130, AXMI131, AXMI133, AXMI140, AXMI141, AXMI142, AXMI143, AXMI144, AXMI146, AXMI148, AXMI149, AXMI152, AXMI153, AXMI154, AXMI155, AXMI156, AXMI157, AXMI158, AXMI162, AXMI165, AXMI166, AXMI167, AXMI168, AXMI169, AXMI170, AXMI171, AXMI172, AXMI173, AXMI174, AXMI175, AXMI176, AXMI177, AXMI178, AXMI179, AXMI180, AXMI181, AXMI182, AXMI185, AXMI186, AXMI187, AXMI188, AXMI189 из патента США № 8318900; AXMI079, AXMI080, AXMI081, AXMI082, AXMI091, AXMI092, AXMI096, AXMI097, AXMI098, AXMI099, AXMI100, AXMI101, AXMI102, AXMI103, AXMI104, AXMI107, AXMI108, AXMI109, AXMI110, AXMI111, AXMI112, AXMI114, AXMI116, AXMI117, AXMI118, AXMI119, AXMI120, AXMI121, AXMI122, AXMI123, AXMI124, AXMI1257, AXMI1268, AXMI127, AXMI129, AXMI164, AXMI151, AXMI161, AXMI183, AXMI132, AXMI138, AXMI137 из US 2010/0005543; и белки Cry, такие как Cry1A и Cry3A с модифицированными сайтами протеолитического расщепления из патента США № 8319019; а также белок-токсин Cry1Ac, Cry2Aa и Cry1Ca из штамма VBTS 2528 Bacillus thuringiensis из публикации заявки на патент США № 2011/0064710. Другие белки Cry хорошо известны специалисту в данной области техники (см. Crickmore, et al., "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature" (2011), на сайте lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/, доступ к которому можно получить во всемирной сети Интернет с применением префикса "www"). Инсектицидная активность белков Cry хорошо известна специалисту в данной области техники (обзор см. в van Frannkenhuyzen, (2009) J. Invert. Path. 101:1-16). Применение белков Cry в качестве признаков трансгенного растения хорошо известно специалисту в данной области техники, и трансгенные растения с Cry, в том числе без ограничения Cry1Ac, Cry1Ac+Cry2Ab, Cry1Ab, Cry1A.105, Cry1F, Cry1Fa2, Cry1F+Cry1Ac, Cry2Ab, Cry3A, mCry3A, Cry3Bb1, Cry34Ab1, Cry35Ab1, Vip3A, mCry3A, Cry9c и CBI-Bt были разрешены контролирующими органами (см. Sanahuja, (2011) Plant Biotech Journal 9:283-300 и CERA (2010) GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment (CERA), ILSI Research Foundation, Washington D.C. на сайте cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database, доступ к которому можно получить во всемирной сети Интернет с применением префикса "www"). В растениях также может экспрессироваться два и более пестицидных белков, хорошо известных специалисту в данной области, например, Vip3Ab и Cry1Fa (US2012/0317682), Cry1BE и Cry1F (US2012/0311746), Cry1CA и Cry1AB (US2012/0311745), Cry1F и CryCa (US2012/0317681), Cry1DA и Cry1BE (US2012/0331590), Cry1DA и Cry1Fa (US2012/0331589), Cry1AB и Cry1BE (US2012/0324606) и Cry1Fa и Cry2Aa, Cry1I или Cry1E (US2012/0324605). Пестицидные белки также включают инсектицидные липазы, в том числе гидролазы омыляемых липидов из патента США № 7491869 и холестериноксидазы, например, из Streptomyces (Purcell et al. (1993) Biochem Biophys Res Commun 15:1406-1413). Пестицидные белки также включают токсины VIP ( инсектицидные белки вегетативной фазы) из патентов США №№ 5877012, 6107279, 6137033, 7244820, 7615686 и 8237020 и т. п. Другие белки VIP хорошо известны специалисту в данной области техники (см. lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html, доступ к которому можно получить во всемирной сети Интернет с помощью префикса "www"). Пестицидные белки также включают белки токсинового комплекса (TC), которые можно получить из организмов, таких как Xenorhabdus, Photorhabdus и Paenibacillus (см. патенты США №№ 7491698 и 8084418). Некоторые TC-белки обладают "самостоятельной" инсектицидной активностью, а другие TC-белки повышают активность самостоятельных токсинов, производимых тем же данным организмом. Токсичность "самостоятельного" TC-белка (из Photorhabdus, Xenorhabdus или Paenibacillus, например) может повышаться при помощи одного или нескольких TC-белков, "усилителей", полученных из организма-источника из другого рода. Существуют три основных типа TC-белков. Как изложено в данном документе, белки класса A ("белок A") представляют собой самостоятельные токсины. Белки класса B ("белок B") и белки класса C ("белок C") усиливают токсичность белков класса A. Примеры белков класса A представляют собой TcbA, TcdA, XptA1 и XptA2. Примеры белков класса B представляют собой TcaC, TcdB, XptB1Xb и XptC1Wi. Примеры белков класса C представляют собой TccC, XptC1Xb и XptB1Wi. Пестицидные белки также включают белки яда пауков, змей и скорпионов. Примеры пептидов яда пауков включают без ограничения пептиды ликотоксина-1 и его мутантные формы (патент США № 8334366).

(C) Полинуклеотид, кодирующий специфический для насекомых гормон или феромон, такой как экдистероид и ювенильный гормон, его вариант, миметик на его основе, или его антагонист или агонист. См., например, раскрытие Hammock, et al., (1990) Nature 344:458, качающееся бакуловирусной системы экспрессии клонированной эстеразы ювенильного гормона, деактиватора ювенильного гормона.

(D) Полинуклеотид, кодирующий специфический для насекомых пептид, который при экспрессии нарушает физиологию насекомого, на которого оказывают воздействие. Например, см. раскрытия Regan, (1994) J. Biol. Chem. 269:9 (экспрессионное клонирование приводит к получению ДНК, кодирующей рецептор диуретического гормона насекомых); Pratt, et al., (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1243 (аллостатин, обнаруженный у Diploptera puntata); Chattopadhyay, et al., (2004) Critical Reviews in Microbiology 30(1):33-54; Zjawiony, (2004) J Nat Prod 67(2):300-310; Carlini and Grossi-de-Sa, (2002) Toxicon 40(11):1515-1539; Ussuf, et al., (2001) Curr Sci. 80(7):847-853 и Vasconcelos and Oliveira, (2004) Toxicon 44(4):385-403. См. также патент США № 5266317, Tomalski, et al., в котором раскрываются гены, кодирующие специфические для насекомых токсины.

(E) Полинуклеотид, кодирующий фермент, ответственный за гипернакопление монотерпена, сесквитерпена, стероида, гидроксамовой кислоты, производного фенилпропаноида или другой небелковой молекулы с инсектицидной активностью.

(F) Полинуклеотид, кодирующий фермент, вовлеченный в модификацию, в том числе посттрансляционную модификацию, биологически активной молекулы; например, гликолитический фермент, протеолитический фермент, липолитический фермент, нуклеаза, циклаза, трансаминаза, эстераза, гидролаза, фосфатаза, киназа, фосфорилаза, полимераза, эластаза, хитиназа и глюканаза, либо натуральные, либо синтетические. См. заявку согласно PCT WO 1993/02197 от имени Scott, et al., в которой раскрыта нуклеотидная последовательность гена каллазы. Молекулы ДНК, которые содержат последовательности, кодирующие хитиназу, можно получить, например, из ATCC^® под номерами доступа 39637 и 67152. См. также Kramer, et al., (1993) Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691, в которой содержатся сведения о нуклеотидной последовательности кДНК, кодирующей хитиназу табачного бражника, и Kawalleck, et al., (1993) Plant Molec. Biol. 21:673, в которой предложена нуклеотидная последовательность гена полиубиквитина ubi4-2 петрушки, и патенты США №№ 6563020; 7145060 и 7087810.

(G) Полинуклеотид, кодирующий молекулу, которая стимулирует сигнальную трансдукцию. Например, см. раскрытие в Botella, et al., (1994) Plant Molec. Biol. 24:757, каcающееся нуклеотидных последовательностей клонов кДНК кальмодулина из маша и Griess, et al., (1994) Plant Physiol. 104:1467, в которой представлена нуклеотидная последовательность клона кДНК кальмодулина маиса.

(H) Полинуклеотид, кодирующий пептид с гидрофобным моментом. См. заявку согласно PCT WO 1995/16776 и патент США № 5580852, раскрывающие пептидные производные тахиплезина, которые ингибируют грибные патогены растений, и заявку согласно PCT WO 1995/18855, а также патент США № 5607914 (в котором раскрыты синтетические противомикробные пептиды, которые придают устойчивость к заболеваниям).

(I) Полинуклеотид, кодирующий мембранную пермеазу, каналообразователь или блокатор каналов. Например, см. раскрытие в Jaynes, et al., (1993) Plant Sci. 89:43, касающееся гетерологичной экспрессии аналога цекропин-бета литического пептида для придания трансгенным растениям табака устойчивости к Pseudomonas solanacearum.

(J) Ген, кодирующий вирусный инвазивный белок или сложный токсин, полученный из него. Например, накопление белков вирусной оболочки в трансформированных растительных клетках придает устойчивость к вирусной инфекции и/или развитию заболевания, вызванного вирусом, из которого получен ген белка оболочки, а также родственными вирусами. См. Beachy, et al., (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451. Устойчивость, опосредованная белком оболочки, была обеспечена у трансформированных растений в отношении вируса мозаики люцерны, вируса мозаики огурца, вируса полосчатости табака, вируса X картофеля, вируса Y картофеля, вируса гравировки табака, вируса погремковости табака и вируса табачной мозаики. Там же.

(K) Ген, кодирующий антитело, специфическое в отношении насекомого, или иммунотоксин, полученный из него. Таким образом, антитело, нацеленное на критическую метаболическую функцию в кишке насекомого, будет инактивировать фермент, на который оказывается воздействие, с уничтожением насекомого. Ср. Taylor, et al., Abstract #497, SEVENTH INT′L SYMPOSIUM ON MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS (Edinburgh, Scotland, 1994) (ферментативная инактивация в трансгенном табаке посредством выработки одноцепочечных фрагментов антител).

(L) Ген, кодирующий антитело, специфическое в отношении вируса. См., например, Tavladoraki, et al., (1993) Nature 366:469, где показано, что трансгенные растения, экспрессирующие гены рекомбинантного антитела, защищены от нападения вируса.

(M) Полинуклеотид, кодирующий останавливающий развитие белок, вырабатываемый в природе патогеном или паразитом. Таким образом, грибные эндо-альфа-1,4-D-полигалактуроназы облегчают грибную колонизацию и высвобождение питательных веществ растения путем солюбилизации гомо-альфа-1,4-D-галактуроназы клеточной стенки растения. См. Lamb, et al., (1992) Bio/Technology 10:1436. Клонирование и определение характеристик гена, который кодирует белок, ингибирующий эндополигалактуроназу бобов, описан в Toubart, et al., (1992) Plant J. 2:367.

(N) Полинуклеотид, кодирующий останавливающий развитие белок, вырабатываемый в природе растением. Например, Logemann, et al., (1992) Bio/Technology 10:305 показали, что трансгенные растения, экспрессирующие ген ячменя, инактивирующий рибосомы, обладали повышенной устойчивостью к грибковым заболеваниям.

(O) Гены, вовлеченные в реакцию системной приобретенной устойчивости (SAR) и/или гены, связанные с патогенезом. Briggs, (1995) Current Biology 5(2), Pieterse and Van Loon, (2004) Curr. Opin. Plant Bio. 7(4):456-64 и Somssich, (2003) Cell 113(7):815-6.

(P) Противогрибковые гены (Cornelissen and Melchers, (1993) Pl. Physiol. 101:709-712 и Parijs, et al., (1991) Planta 183:258-264, а также Bushnell, et al., (1998) Can. J. of Plant Path. 20(2):137-149. Также см. заявки на патенты США №№ 09/950933; 11/619645; 11/657710; 11/748994; 11/774121 и патенты США №№ 6891085 и 7306946. Киназы, подобные рецептору LysM, для распознавания фрагментов хитина, как первая стадия в защитной реакции растения против грибов-патогенов (US 2012/0110696).

(Q) Гены системы детоксикации, такие как кодирующие фумонизин, беауверицин, монилиформин и зеараленон и их структурно родственные производные. Например, см. патенты США №№ 5716820; 5792931; 5798255; 5846812; 6083736; 6538177; 6388171 и 6812380.

(R) Полинуклеотид, кодирующий цистатин и ингибиторы цистеиновой протеиназы. См. патент США № 7205453.

(S) Гены дефензинов. См. WO 2003/000863 и патенты США №№ 6911577; 6855865; 6777592 и 7238781.

(T) Гены, обеспечивающие устойчивость к нематодам. См., например, заявку согласно PCT WO 1996/30517; заявку согласно PCT WO 1993/19181, WO 2003/033651 и Urwin, et al., (1998) Planta 204:472-479, Williamson, (1999) Curr Opin Plant Bio. 2(4):327-31; патенты США №№ 6284948 и 7301069 и гены miR164 (WO 2012/058266).

(U) Гены, которые обеспечивают устойчивость к корневой гнили, вызываемой Phytophthora, такие как Rps 1, Rps 1-a, Rps 1-b, Rps 1-c, Rps 1-d, Rps 1-e, Rps 1-k, Rps 2, Rps 3-a, Rps 3-b, Rps 3-c, Rps 4, Rps 5, Rps 6, Rps 7 и другие гены Rps. См., например, Shoemaker, et al., Phytophthora Root Rot Resistance Gene Mapping in Soybean, Plant Genome IV Conference, San Diego, Calif. (1995).

(V) Гены, которые обеспечивают устойчивость к бурой стеблевой гнили, такие как описаны в патенте США № 5689035, включенном посредством ссылки для этой цели.

(W) Гены, которые обеспечивают устойчивость к Colletotrichum, такие как описанные в публикации заявки на патент США US 2009/0035765, включенной посредством ссылки для этой цели. Они включают локус Rcg, который можно использовать как конверсию одного локуса.

2. Трансгены, которые обеспечивают устойчивость к гербициду, например.

(A) Полинуклеотид, кодирующий устойчивость к гербициду, который ингибирует конус нарастания или меристему, такому как имидазолинон или сульфонилмочевина. Иллюстративные гены в этой категории кодируют мутантный фермент ALS и AHAS, как описано, например, у Lee, et al., (1988) EMBO J. 7:1241 и Miki, et al., (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449, соответственно. См. также патенты США №№ 5605011; 5013659; 5141870; 5767361; 5731180; 5304732; 4761373; 5331107; 5928937 и 5378824; заявку на патент США № 11/683737 и публикацию международной заявки WO 1996/33270.

(B) Полинуклеотид, кодирующий белок для устойчивости к глифосату (устойчивость придают мутантные гены 5-енолприрувил-3-фосфошикиматсинтазы (EPSP) и aroA, соответственно) и другим соединениям с фосфоновыми группами, таким как глуфосинат (гены фосфинотрицин-ацетилтрансферазы (PAT) и фосфинотрицин-ацетилтрансферазы (bar) Streptomyces hygroscopicus), и пиридинокси- или феноксипропионовым кислотам и циклогексонам (гены, кодирующие ингибитор ACCазы). См., например, патент США № 4940835, Shah, et al., в котором раскрыта нуклеотидная последовательность формы EPSPS, которая может придавать устойчивость к глифосату. В патенте США № 5627061, Barry, et al., также описаны гены, кодирующие ферменты EPSPS. См. также патенты США №№ 6566587; 6338961; 6248876; 6040497; 5804425; 5633435; 5145783; 4971908; 5312910; 5188642; 5094945, 4940835; 5866775; 6225114; 6130366; 5310667; 4535060; 4769061; 5633448; 5510471; Re. 36449; RE 37287 E и 5491288, а также публикации международных заявок EP 1173580; WO 2001/66704; EP 1173581 и EP 1173582, которые включены в данный документ посредством ссылки для этой цели. Устойчивость к глифосату также придается растениям, которые экспрессируют ген, кодирующий фермент глифосат-оксидоредуктазу, как более подробно описано в патентах США №№ 5776760 и 5463175, которые включены в данный документ посредством ссылки для этой цели. Кроме того, устойчивость к глифосату может придаваться растениям посредством сверхэкспрессии генов, кодирующих глифосат-N-ацетилтрансферазу. См., например, патенты США №№ 7462481; 7405074 и публикацию заявки на патент США № US 2008/0234130. Молекулу ДНК, кодирующую мутантный ген aroA, можно получить под номером доступа ATCC^® 39256, а нуклеотидная последовательность мутантного гена раскрыта в патенте США № 4769061, выданном Comai. В заявке EP № 0333033, Kumada, et al., и патенте США № 4975374, выданном Goodman, et al., раскрыты нуклеотидные последовательности генов глутаминсинтетазы, придающие устойчивость к гербицидам, таким как L-фосфинотрицин. Нуклеотидная последовательность гена фосфинотрицин-ацетилтрансферазы представлена в заявках EP №№ 0242246 и 0242236, Leemans, et al.; De Greef, et al., (1989) Bio/Technology 7:61, где описано получение трансгенных растений, которые экспрессируют химерные гены bar, кодирующие фосфинотрицин-ацетилтрансферазную активность. См. также патенты США №№ 5969213; 5489520; 5550318; 5874265; 5919675; 5561236; 5648477; 5646024; 6177616 и 5879903, которые включены в данный документ посредством ссылки с этой целью. Иллюстративные гены, придающие устойчивость к феноксипропионовым кислотам и циклогексонам, таким как сетоксидим и галоксифоп, представляют собой гены Acc1-S1, Acc1-S2 и Acc1-S3, описанные у Marshall, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435.

(C) Полинуклеотид, кодирующий белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, который ингибирует фотосинтез, такому как триазин (гены psbA и gs+) и бензонитрил (ген нитрилазы). Przibilla, et al., (1991) Plant Cell 3:169 описывают трансформацию Chlamydomonas с помощью плазмид, кодирующих мутантные гены psbA. Нуклеотидные последовательности генов нитрилазы раскрыты в патенте США № 4810648, выданном Stalker, и молекулы ДНК, содержащие эти гены, доступны под номерами доступа ATCC^® 53435, 67441 и 67442. Клонирование и экспрессия ДНК, кодирующей глутатион-S-трансферазу, описаны у Hayes, et al., (1992) Biochem. J. 285:173.

(D) В ряд растений был введен полинуклеотид, кодирующий белок, обеспечивающий устойчивость к синтазе ацетогидроксикислот, которая, как было обнаружено, делает растения, которые экспрессируют этот фермент, устойчивыми к нескольким типам гербицидов (см., например, Hattori, et al., (1995) Mol Gen Genet. 246:419). Другие гены, которые придают устойчивость к гербицидам, включают ген, кодирующий химерный белок цитохрома P4507A1 крысы и NADPH-цитохром P450-оксидоредуктазу дрожжей (Shiota, et al., (1994) Plant Physiol 106:17), гены, кодирующие глутатионредуктазу и супероксиддисмутазу (Aono, et al., (1995) Plant Cell Physiol 36:1687), и гены, кодирующие различные фосфотрансферазы (Datta, et al., (1992) Plant Mol Biol 20:619).

(E) Полинуклеотид, кодирующий устойчивость к гербициду, целенаправленно воздействующему на протопорфириноген-оксидазу (protox), которая необходима для выработки хлорофилла. Фермент protox служит в качестве мишени для целого ряда гербицидных соединений. Эти гербициды также подавляют рост всех различных присутствующих видов растений, вызывая их полное разрушение. Разработка растений, характеризующихся измененной protox-активностью, которые устойчивы к этим гербицидам, описана в патентах США №№ 6288306; 6282837 и 5767373, и публикации международной заявки WO 2001/12825.

(F) Ген aad-1 (изначально из Sphingobium herbicidovorans) кодирует белок арилоксиалканоат-диоксигеназу (AAD-1). Признак обеспечивает переносимость гербицидов на основе 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и арилоксифеноксипропионата (обычно называемых "фоп"-гербициды, таких как квизалофоп). Ген aad-1, как таковой, обеспечивающий переносимость гербицида у растений, впервые был раскрыт в WO 2005/107437 (см. также US 2009/0093366). Ген aad-12, полученный из Delftia acidovorans, который кодирует белок арилоксиалканоат-диоксигеназу (AAD-12), обеспечивающий переносимость гербицидов на основе 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и пиридилоксиацетата посредством инактивации некоторых гербицидов с арилоксиалканоатным фрагментом, в том числе фенокси-ауксина (например, 2,4-D, MCPA), а также видов пиридилокси-ауксина (например, флуроксипира, триклопира).

(G) Полинуклеотид, кодирующий монооксигеназу, устойчивую к гербициду дикамба, раскрытый в публикации заявки на патент США 2003/0135879, для придания переносимости дикамбы.

(H) Полинуклеотидная молекула, кодирующая бромоксинилнитрилазу (Bxn), раскрытая в патенте США № 4810648, для придания переносимости бромоксинила.

(I) Полинуклеотидная молекула, кодирующая фитоен (crtl), описанный у Misawa, et al., (1993) Plant J. 4:833-840 и у Misawa, et al., (1994) Plant J. 6:481-489, для переносимости норфлуразона.

3. Трансгены, которые обеспечивают измененные характеристики зерна или вносят в них вклад

Такие как представленные ниже.

(A) Измененные жирные кислоты, например, посредством следующего.

(1) Подавления стеароил-ACP для повышения содержания стеариновой кислоты в растении. См. Knultzon, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2624 и WO 1999/64579 (Гены для изменения липидных профилей в кукурузе).

(2) Повышения содержания олеиновой кислоты посредством модификации гена FAD-2 и/или снижения содержания линоленовой кислоты посредством модификации гена FAD-3 (см. патенты США №№ 6063947; 6323392; 6372965 и WO 1993/11245).

(3) Изменения содержания конъюгированных линоленовой или линолевой кислоты, например, как в WO 2001/12800.

(4) Изменения LEC1, AGP, Dek1, Superal1, mi1 ps, различных генов Ipa, таких как Ipa1, Ipa3, hpt или hggt. Например, см. WO 2002/42424, WO 1998/22604, WO 2003/011015, WO 2002/057439, WO 2003/011015, патенты США №№ 6423886, 6197561, 6825397 и публикации заявок на патенты США №№ US 2003/0079247, US 2003/0204870 и Rivera-Madrid, et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:5620-5624.

(5) Генов, кодирующих дельта-8-десатуразу для получения длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот (патенты США №№ 8058571 и 8338152), дельта-9 десатуразу для снижения содержания насыщенных жиров (патент США № 8063269), Δ6-десатуразу примулы для улучшения профилей омега-3-жирных кислот.

(6) Выделенных нуклеиновых кислот и белков, ассоциированных с регуляцией метаболизма липидов и сахаров, в частности, белка липидного метаболизма (LMP), применяемых в способах получения трансгенных растений и модуляции уровней запасных веществ семени, в том числе липидов, жирных кислот, видов крахмала или запасных белков семени, и их применения в способах модуляции размера семени, количества семян, веса семян, длины корней и размера листьев растений (EP 2404499).

(7) Изменения экспрессии белка, индуцируемого сахарами 2 (HSI2), с высоким уровнем экспрессии в растении для повышения или снижения экспрессии HSI2 в растении. Повышение экспрессии HSI2 повышает содержание масла, тогда как понижение экспрессии HSI2 снижает восприимчивость к абсцизовой кислоте и/или повышает устойчивость к засухе (публикация заявки на патент США № 2012/0066794).

(8) Экспрессии цитохрома b5 (Cb5) отдельно или вместе с FAD2 для модуляции содержания масла в семени растения, в частности, для повышения уровней омега-3-жирных кислот и улучшения соотношения омега-6- к омега-3-жирным кислотам (публикация заявки на патент США № 2011/0191904).

(9) Молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих wrinkled1-подобные полипептиды для модуляции метаболизма сахаров (патент США № 8217223).

(B) Измененное содержание фосфора, например, посредством следующего.

(1) Введения гена, кодирующего фитазу, при этом будет улучшаться распад фитата, что приводит к большему количеству свободного фосфата в трансформированном растении. Например, см. Van Hartingsveldt, et al., (1993) Gene 127:87, касательно раскрытия нуклеотидной последовательности гена фитазы Aspergillus niger.

(2) Модуляции гена, который снижает содержание фитата. Например, в случае маиса это можно осуществлять при помощи клонирования, а затем повторного введения ДНК, ассоциированной с одним или несколькими аллелями, такими как аллели LPA, идентифицированные у мутантов маиса, характеризующихся низкими уровнями фитиновой кислоты, как, например, в WO 2005/113778, и/или посредством изменения активности инозитолкиназы, как в WO 2002/059324, публикации заявки на патент США № 2003/0009011, WO 2003/027243, публикации заявки на патент США № 2003/0079247, WO 1999/05298, патенте США № 6197561, патенте США № 6291224, патенте США № 6391348, WO 2002/059324, публикации заявки на патент США № 2003/0079247, WO 1998/45448, WO 1999/55882, WO 2001/04147.

(C) Измененные углеводы, на которые воздействовали, например, посредством изменения гена, кодирующего фермент, который воздействует на паттерн ветвления крахмала, или гена, изменяющего тиоредоксин, такого как NTR и/или TRX (см. патент США № 6531648, который включен посредством ссылки с этой целью), и/или нокаута гамма-зеина, или использования мутанта, такого как cs27, или TUSC27, или en27 (см. патент США № 6858778 и публикацию заявки на патент США № 2005/0160488, публикацию заявки на патент США № 2005/0204418, которые включены посредством ссылки для этой цели). См., Shiroza, et al., (1988) J. Bacteriol. 170:810 (нуклеотидная последовательность мутантного гена фруктозилтрансферазы Streptococcus), Steinmetz, et al., (1985) Mol. Gen. Genet. 200:220 (нуклеотидная последовательность гена левансахаразы Bacillus subtilis), Pen, et al., (1992) Bio/Technology 10:292 (получение трансгенных растений, которые экспрессируют альфа-амилазу Bacillus licheniformis), Elliot, et al., (1993) Plant Molec. Biol. 21:515 (нуклеотидные последовательности генов инвертазы томата), Søgaard, et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:22480 (сайт-направленный мутагенез гена альфа-амилазы ячменя) и Fisher, et al., (1993) Plant Physiol. 102:1045 (фермент ветвления крахмала II эндосперма маиса), WO 1999/10498 (улучшенная усвояемость и/или извлечение крахмала путем модификации UDP-D-ксилоза-4-эпимеразы, Fragile 1 и 2, Ref1, HCHL, C4H), патент США № 6232529 (способ получения семян с высоким содержанием масла путем модификации уровней крахмала (AGP)). Гены модификации жирных кислот, упомянутые в данном документе, также можно применять для воздействия на содержание и/или состав крахмала благодаря взаимосвязи путей метаболизма крахмала и масла.

(D) Измененное содержание или состав антиоксидантов, как, например, изменение токоферола или токотриенолов. Например, см. патент США № 6787683, публикацию заявки на патент США № 2004/0034886 и WO 2000/68393, предусматривающие манипуляцию с уровнями антиоксидантов, и WO 2003/082899, благодаря изменению гомогентизатгеранил-геранилтрансферазы (hggt).

(E) Измененные незаменимые аминокислоты семян. Например, см. патент США № 6127600 (способ повышения накопления незаменимых аминокислот в семенах), патент США № 6080913 (бинарные способы повышения накопления незаменимых аминокислот в семенах), патент США № 5990389 (высокое содержание лизина), WO 1999/40209 (изменение аминокислотного состава семян), WO 1999/29882 (способы изменения аминокислотного состава белков), патент США № 5850016 (изменение аминокислотного состава семян), WO 1998/20133 (белки с повышенными уровнями незаменимых аминокислот), патент США № 5885802 (высокое содержание метионина), патент США № 5885801 (высокое содержание треонина), патент США № 6664445 (растительные ферменты биосинтеза аминокислот), патент США № 6459019 (повышенное содержание лизина и треонина), патент США № 6441274 (бета-субъединица растительной триптофансинтазы), патент США № 6346403 (ферменты метаболизма метионина), патент США № 5939599 (высокое содержание серы), патент США № 5912414 (повышенное содержание метионина), WO 1998/56935 (растительные ферменты биосинтеза аминокислот), WO 1998/45458 (разработанный с помощью генной инженерии белок семени, имеющий более высокую процентную долю незаменимых аминокислот), WO 1998/42831 (повышенное содержание лизина), патент США № 5633436 (повышение содержания серосодержащих аминокислот), патент США № 5559223 (синтетические запасные белки с определенной структурой, содержащие программируемые уровни незаменимых аминокислот для улучшения питательной ценности растений), WO 1996/01905 (повышенное содержание треонина), WO 1995/15392 (повышенное содержание лизина), публикацию заявки на патент США № 2003/0163838, публикацию заявки на патент США № 2003/0150014, публикацию заявки на патент США № 2004/0068767, патент США № 6803498, WO 2001/79516.

4. Гены, контролирующие мужскую стерильность

Доступно несколько способов обеспечения генетической мужской стерильности, как, например, несколько мутантных генов в отдельных положениях в пределах генома, которые придают мужскую стерильность, как раскрыто в патентах США №№ 4654465 и 4727219, Brar, et al., и хромосомные транслокации, как описано Patterson в патентах США №№ 3861709 и 3710511. В дополнение к этим способам Albertsen, et al. в патенте США № 5432068 описывают систему ядерной мужской стерильности, которая включает: идентификацию гена, который крайне важен для мужской фертильности; сайленсинг этого нативного гена, который крайне важен для мужской фертильности; удаление нативного промотора из гена, важного для мужской фертильности, и замещение его на индуцируемый промотор; вставку этого полученного с помощью методик генной инженерии гена обратно в растение и, таким образом, создание растения, которое характеризуется мужской стерильностью, поскольку индуцируемый промотор не "включен", в результате чего ген мужской фертильности не транскрибируется. Фертильность восстанавливают посредством индуцирования или "включения" промотора, который, в свою очередь, осуществляет транскрипцию гена, который обеспечивает мужскую фертильность.

(A) Введение гена деацетилазы под управлением промотора, специфического в отношении тапетума, и с применением химического N-Ac-PPT (WO 2001/29237).

(B) Введение различных промоторов, специфических в отношении тычинок (WO 1992/13956, WO 1992/13957).

Дополнительные примеры систем и генов ядерной мужской и женской стерильности см. также в патентах США №№ 5859341; 6297426; 5478369; 5824524; 5850014 и 6265640, все из которых, тем самым, включены посредством ссылки.

5. Гены, которые создают сайт для сайт-специфической интеграции ДНК

Подразумевается введение сайтов FRT, которые можно применять в системе FLP/FRT, и/или сайтов Lox, которые можно применять в системе Cre/Loxp. Например, см. Lyznik, et al., (2003) Plant Cell Rep 21:925-932 и WO 1999/25821, которые включены в данный документ посредством ссылки. Другие системы, которые можно применять, включают рекомбиназу Gin из фага Mu (Maeser, et al., (1991) Vicki Chandler, The Maize Handbook ch. 118 (Springer-Verlag 1994), рекомбиназу Pin из E. coli (Enomoto, et al., 1983) и систему R/RS из плазмиды pSRi (Araki, et al., 1992).

6. Гены, которые воздействуют на устойчивость к абиотическому стрессу

В том числе без ограничений на цветение, развитие початка и семени, улучшение эффективности использования азота, измененную реактивность в отношении азота, устойчивость к засухе или ее переносимость, устойчивость к холоду или его переносимость, а также устойчивость к засолению или его переносимость и повышенную урожайность при стрессе.

(A) Например, см. WO 2000/73475, где эффективность использования воды изменена благодаря изменению малата; патенты США №№ 5892009, 5965705, 5929305, 5891859, 6417428, 6664446, 6706866, 6717034, 6801104, WO 2000/060089, WO 2001/026459, WO 2001/035725, WO 2001/034726, WO 2001/035727, WO 2001/036444, WO 2001/036597, WO 2001/036598, WO 2002/015675, WO 2002/017430, WO 2002/077185, WO 2002/079403, WO 2003/013227, WO 2003/013228, WO 2003/014327, WO 2004/031349, WO 2004/076638, WO 199809521.

(B) WO 199938977, в которой описаны гены, в том числе гены CBF, и факторы транскрипции, эффективные в ослаблении негативных эффектов замораживания, высокого содержания солей и засухи на растения, а также обеспечивающие другие положительные эффекты в отношении фенотипа растения.

(C) Публикация заявки на патент США № 2004/0148654 и WO 2001/36596, где в растениях изменяется содержание абсцизовой кислоты, что приводит к улучшенному фенотипу растения, такому как повышенная урожайность и/или повышенная переносимость абиотического стресса.

(D) WO 2000/006341, WO 2004/090143, патенты США №№ 7531723 и 6992237, где экспрессия цитокинина модифицируется, что приводит к растениям с повышенной переносимостью стрессов, как, например, переносимостью засухи, и/или повышенной урожайностью. Также см. WO 2002/02776, WO 2003/052063, JP 2002/281975, патент США № 6084153, WO 2001/64898, патент США № 6177275 и патент США № 6107547 (улучшение использования азота и измененная реактивность в отношении азота).

(E) Что касается изменения содержания этилена, см. публикацию заявки на патент США № 2004/0128719, публикацию заявки на патент США № 2003/0166197 и WO 2000/32761.

(F) Что касается растительных факторов транскрипции или транскрипционных регуляторов, связанных с реакцией на абиотический стресс, см., например, публикацию заявки на патент США № 2004/0098764 или публикацию заявки на патент США № 2004/0078852.

(G) Гены, которые повышают экспрессию вакуолярной пирофосфатазы, такие как AVP1 (патент США № 8058515), для повышенного урожая; нуклеиновая кислота, кодирующая полипептиды HSFA4 или HSFA5 (фактор теплового шока класса A4 или A5), полипептид, подобный белку транспортера олигопептидов, (OPT4-подобный); пластохрон-2-подобный (PLA2-подобный) полипептид или Wuschel-родственный гомеобокс 1-подобный (WOX1-подобный) полипептид (публикация заявки на патент США № US 2011/0283420).

(H) Подавление полинуклеотидов, кодирующих белки поли-(АДФ-рибоза)-полимеразы (PARP), с целью модуляции запрограммированной гибели клеток (патент США № 8058510) для повышения мощности.

(I) Полинуклеотид, кодирующий полипептиды DTP21, для обеспечения устойчивости к засухе (публикация заявки на патент США № US 2011/0277181).

(J) Нуклеотидные последовательности, кодирующие белки ACC синтазы 3 (ACS3) для модуляции развития, модуляции реакции на стресс и модуляции переносимости стрессов (публикация заявки на патент США № US 2010/0287669).

(K) Полинуклеотиды, которые кодируют белки, которые обеспечивают фенотип переносимости засухи (DTP), для обеспечения устойчивости к засухе (WO 2012/058528).

(L) Гены токоферолциклазы (TC) для обеспечения переносимости засухи и засоления (публикация заявки на патент США № 2012/0272352).

(M) Белки семейства протеаз, нацеленные на CAAX-концевые аминокислоты, для придания переносимости стрессов (патент США № 8338661).

(N) Мутации в гене, кодирующем SAL1, характеризовались повышенной переносимостью стрессов, в том числе характеризовались повышенной устойчивостью к засухе (публикация заявки на патент США № 2010/0257633).

(O) Экспрессия последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, выбранный из группы, состоящей из: полипептида GRF, RAA1-подобного полипептида, полипептида SYR, полипептида ARKL и полипептида YTP, усиливающих признаки, связанные с урожайностью (публикация заявки на патент США № 2011/0061133).

(P) Модуляция экспрессии в растении нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид трегалозо-фосфатфосфатазу (TPP) класса III для улучшения признаков, связанных с урожайностью, у растений, в частности, повышения урожайности семян (публикация заявки на патент США № 2010/0024067).

Другие гены и факторы транскрипции, которые воздействуют на рост и агротехнические признаки растений, такие как урожайность, цветение, рост растения и/или структура растения, можно вводить или интрогрессировать в растения, см., например, WO 1997/49811 (LHY), WO 1998/56918 (ESD4), WO 1997/10339 и патент США № 6573430 (TFL), патент США № 6713663 (FT), WO 1996/14414 (CON), WO 1996/38560, WO 2001/21822 (VRN1), WO 2000/44918 (VRN2), WO 1999/49064 (GI), WO 2000/46358 (FR1), WO 1997/29123, патент США № 6794560, патент США № 6307126 (GAI), WO 1999/09174 (D8 и Rht), и WO 2004/076638, и WO 2004/031349 (факторы транскрипции).

7. Гены, которые обеспечивают повышенную урожайность

(A) Трансгенное культурное растение, трансформированное при помощи нуклеиновой кислоты, кодирующей 1-аминоциклопропан-1-карбоксилатдезаминаза-подобный полипептид (ACCDP), где экспрессия последовательности нуклеиновой кислоты в культурном растении приводит к повышенному росту корней, и/или повышенной урожайности, и/или повышенной переносимости стрессов под влиянием факторов окружающей среды у растения по сравнению с разновидностью дикого типа растения (патент США № 8097769).

(B) Сверхэкспрессия гена белков "цинковых пальцев" маиса (Zm-ZFP1) с применением промотора, предпочтительного для семян, как было показано, усиливает рост растения, увеличивает количество зерен и общий вес зерен на растение (публикация заявки на патент США № 2012/0079623).

(C) Конститутивная сверхэкспрессия белка с доменом границ латеральных органов (LOB) (Zm-LOBDP1) маиса, как было показано, увеличивает количество зерен и общий вес зерен на растение (публикация заявки на патент США № 2012/0079622).

(D) Улучшение признаков, связанных с урожайностью, у растений посредством модуляции экспрессии у растения нуклеиновой кислоты, кодирующей VIM1- (вариант с метилированием 1) подобный полипептид или VTC2-подобный (GDP-L-галактоза-фосфорилаза) полипептид, или полипептид DUF1685, или ARF6-подобный (восприимчивый к ауксину фактор) полипептид (WO 2012/038893).

(E) Модуляция экспрессии в растении нуклеиновой кислоты, кодирующей Ste20-подобный полипептид или его гомолог, позволяет растениям производить повышенный урожай относительно контрольных растений (EP 2431472).

(F) Гены, кодирующие полипептиды нуклеозиддифосфаткиназы (NDK) и их гомологи для модификации строения корня растения (публикация заявки на патент США № 2009/0064373).

8. Гены, которые обеспечивают усвояемость растения

(A) Изменение уровня ксилана, присутствующего в клеточной стенке растения, посредством модуляции экспрессии ксилансинтазы (патент США № 8173866).

В некотором варианте осуществления пакетированный признак может представлять собой признак или трансгенный объект, который получил разрешение контролирующих органов, в том числе без ограничения трансгенные объекты, разрешенные контролирующими органами, которые хорошо известны специалисту в данной области техники, и их можно найти на сайте Центра оценки риска для окружающей среды (cera-gmc.org/?action=gm_crop_database, доступ к которому можно получить с применением префикса www) и на сайте Международной службы по приобретению агробиотехнологических приложений (isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp, доступ к которому можно получить с применением префикса www).

Сайленсинг генов

В некоторых вариантах осуществления пакетированный признак может представлять собой форму, применяемую для сайленсинга одного или нескольких полинуклеотидов, представляющих интерес, что приводит к супрессии одного или нескольких целевых полипептидов вредителя. В некоторых вариантах осуществления сайленсинг достигается благодаря применению супрессионной ДНК-конструкции.

В некоторых вариантах осуществления один или несколько полинуклеотидов, кодирующих полипептиды из полипептида PtIP-96 или их фрагментов или вариантов, могут быть пакетированы с одним или несколькими полинуклеотидами, кодирующими один или несколько полипептидов с инсектицидной активностью или агрономическими признаками, изложенными выше, и необязательно может дополнительно предусматривать один или несколько полинуклеотидов, предусмотренных для сайленсинга генов одного или нескольких целевых полинуклеотидов, как обсуждается ниже.

"Супрессионная ДНК-конструкция" представляет собой рекомбинантную ДНК-конструкцию, которая при трансформации или стабильной интеграции в геном растения приводит к "сайленсингу" целевого гена в растении. Целевой ген может быть эндогенным или трансгенным по отношению к растению. "Сайленсинг", применяемый в данном документе по отношению к целевому гену, обычно относится к супрессии уровней мРНК или белка/фермента, экспрессируемых целевым геном, и/или уровня активности фермента или функционирования белка. Термин "супрессия" предусматривает понижение, снижение, ухудшение, уменьшение, ингибирование, устранение и предотвращение. "Сайленсинг" или "сайленсинг генов" определяет на механизм, а включает без ограничения супрессию, опосредованную антисмысловыми олигонуклеотидами, косупрессию, супрессию, опосредованную вирусами, супрессию, опосредованную шпильками, супрессию, опосредованную структурами типа "стебель-петля", подходы на основе RNAi и подходы на основе малых РНК.

Супрессионная ДНК-конструкция может содержать участок, полученный из целевого гена, представляющего интерес, и может содержать всю последовательность нуклеиновой кислоты смысловой нити (или антисмысловой нити) целевого гена, представляющего интерес, или ее часть. В зависимости от подхода, который будет использоваться, участок может быть на 100% идентичным или менее чем на 100% идентичным (например, по меньшей мере на 50% или на любое целое число от 51% до 100% идентичным) всей смысловой нити (или антисмысловой нити) гена, представляющего интерес, или ее части.

Супрессионные ДНК-конструкции хорошо известны из уровня техники, легко конструируются сразу после выбора целевого гена, представляющего интерес, и включают без ограничения косупрессионные конструкции, антисмысловые конструкции, вирусные супрессионные конструкции, шпильковые супрессионные конструкции, супрессионные конструкции типа "стебель-петля", конструкции, вырабатывающие двухнитевые РНК, и, в более общем смысле, конструкции для RNAi (РНК-интерференции) и конструкции на основе малых РНК, такие как конструкции на основе siRNA (коротких интерферирующих РНК) и miRNA (микроРНК).

"Антисмысловое ингибирование" относится к продуцированию антисмысловых РНК-транскриптов, способных супрессировать экспрессию целевого белка.

"Антисмысловая РНК" относится к РНК-транскрипту, который комплементарен всему или части целевого первичного транскрипта или мРНК и который блокирует экспрессию фрагмента целевой выделенной нуклеиновой кислоты (патент США № 5107065). Комплементарность антисмысловой РНК может быть с любой частью конкретного генного транскрипта, т.е. с 5'-некодирующей последовательностью, 3'-некодирующей последовательностью, интронами или кодирующей последовательностью.

"Косупрессия" относится к выработке смысловых РНК-транскриптов, способных супрессировать экспрессию целевого белка. "Смысловая" РНК относится к РНК-транскрипту, который включает мРНК, и она может быть транслирована с образованием белка в клетке или in vitro. Конструкции для косупрессии у растений ранее разрабатывались с основным вниманием к сверхэкспрессии последовательностей нуклеиновой кислоты, имеющих гомологию с нативной мРНК, в смысловой ориентации, что приводит к снижению уровней всех РНК, имеющих гомологию со сверхэкспрессированной последовательностью (см., Vaucheret, et al., (1998) Plant J. 16:651-659 и Gura, (2000) Nature 404:804-808).

В другом варианте описывается применение последовательностей растительных вирусов для управления супрессией проксимальных элементов мРНК-кодирующих последовательностей (публикация согласно PCT WO 1998/36083).

В недавней работе было описано применение "шпильковых" структур, которые включают всю или часть мРНК-кодирующей последовательности, комплементарной ориентации, что приводит к потенциальной структуре "стебель-петля" у экспрессированной РНК (публикация согласно PCT WO 1999/53050). В данном случае стебель формируется полинуклеотидами, соответствующими гену, представляющему интерес, в смысловой или в антисмысловой ориентации по отношению к промотору, а петля формируется несколькими полинуклеотидами гена, представляющего интерес, которые не имеют комплементарной последовательности в конструкции. Это повышает частоту косупрессии или сайленсинга в регенерированных трансгенных растениях. Обзор шпильковой супрессии см. в Wesley, et al., (2003) Methods in Molecular Biology, Plant Functional Genomics: Methods and Protocols 236:273-286.

Конструкция, в которой стебель образован по меньшей мере 30 нуклеотидами из гена, который подлежит супрессии, и петля образована случайной нуклеотидной последовательностью, также эффективно применялась для супрессии (публикация согласно PCT WO 1999/61632).

Также было описано применение последовательностей поли-T и поли-A для получения стебля в структуре "стебель-петля" (публикация согласно PCT WO 2002/00894).

Еще один вариант включает применение синтетических повторов, способствующих образованию стебля в структуре "стебель-петля". Было показано, что трансгенные организмы, полученные с такими фрагментами рекомбинантной ДНК, характеризуются сниженными уровнями белка, кодируемого нуклеотидным фрагментом, который образует петлю, как описано в публикации согласно РСТ WO 2002/00904.

РНК-интерференция относится к процессу специфичного в отношении последовательности посттранскрипционного сайленсинга генов у животных, который опосредован короткими интерферирующими РНК (siRNA) (Fire, et al., (1998) Nature 391:806). Соответствующий процесс у растений обычно называют посттранскрипционным сайленсингом генов (PTGS) или РНК-опосредованным сайленсингом, и также называют подавлением в случае грибов. Процесс посттранскрипционного сайленсинга генов считается эволюционно-консервативным механизмом клеточной защиты, применяющимся для предотвращения экспрессии чужеродных генов, и он широко распространен среди различных представителей растительного мира и таксономических групп растений (Fire, et al., (1999) Trends Genet. 15:358). Такая защита от экспрессии чужеродных генов могла развиться в ответ на выработку двухцепочечных РНК (dsRNA) в результате вирусной инфекции или в результате случайной интеграции транспозонных элементов в геном хозяина, путем клеточного ответа, который приводит к специфическому разрушению гомологичной одноцепочечной РНК вирусной геномной РНК. Присутствие dsRNA в клетках вызывает RNAi-ответ через механизм, который полностью еще не охарактеризован.

Присутствие длинных dsRNA в клетках стимулирует активность фермента рибонуклеазы III, называемого дайсер. Дайсер вовлечен в процессинг dsRNA с образованием коротких фрагментов dsRNA, называемых короткими интерферирующими РНК (siRNA) (Berstein et al., Nature 409:363, 2001). Короткие интерферирующие РНК, полученные в результате активности дайсера, как правило, имеют длину от приблизительно 21 до приблизительно 23 нуклеотидов и содержат дуплексы приблизительно из 19 пар оснований (Elbashir et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Кроме того, дайсер вовлечен в вырезание 21- и 22-нуклеотидных малых временных РНК (stRNA) из РНК-предшественника консервативной структуры, которые вовлечены в контроль на уровне трансляции (Hutvagner, et al., (2001) Science 293:834). Для RNAi-ответа также характерен эндонуклеазный комплекс, обычно называемый комплексом РНК-индуцированного сайленсинга (RISC), который опосредует расщепление одноцепочечной РНК, последовательность которой комплементарна антисмысловой цепи дуплекса siRNA. Расщепление целевой РНК происходит в середине участка, комплементарного антисмысловой цепи дуплекса siRNA (Elbashir et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Кроме того, РНК-интерференция также может включать сайленсинг генов, опосредованный малыми РНК (например, miRNA), предположительно посредством клеточных механизмов, которые регулируют структуру хроматина, и, тем самым, предотвращают транскрипцию последовательностей целевых генов (см., например, Allshire, (2002) Science 297:1818-1819; Volpe, et al., (2002) Science 297:1833-1837; Jenuwein, (2002) Science 297:2215-2218 и Hall, et al., (2002) Science 297:2232-2237). Таким образом, молекулы miRNA согласно настоящему раскрытию можно применять для опосредования сайленсинга генов путем взаимодействия с РНК-транскриптами или, в качестве альтернативы, взаимодействия с конкретными генными последовательностями, где такое взаимодействие приводит к сайленсингу генов либо на транскрипционном, либо на посттранскрипционном уровне.

Дополнительно представлены способы и композиции, которые обеспечивают возможность увеличения количества RNAi, полученной с помощью элемента сайленсинга. В таких вариантах осуществления в способах и композициях используется первый полинуклеотид, содержащий элемент сайленсинга для целевой последовательности вредителя, функционально связанный с промотором, активным в растительной клетке; и второй полинуклеотид, содержащий усиливающий супрессию элемент, содержащий целевую последовательность вредителя или ее активный вариант или фрагмент, функционально связанные с промотором, активным в растительной клетке. Комбинированная экспрессия элемента сайленсинга с усиливающим супрессию элементом ведет к увеличению амплификации ингибиторных РНК, вырабатываемых на основе элемента сайленсинга сверх того уровня, который достигается при экспрессии только элемента сайленсинга самого по себе. В дополнение к увеличенной амплификации специфических видов RNAi самих по себе, способы и композиции дополнительно обеспечивают возможность выработки отличной группы видов RNAi, которые могут повышать эффективность нарушения экспрессии целевого гена. Таким образом, когда усиливающий супрессию элемент экспрессируется в растительной клетке в комбинации с элементом сайленсинга, способы и композиции могут обеспечивать возможность системной выработки RNAi в растении; выработку больших количеств RNAi, чем можно было бы наблюдать в случае только конструкции с элементом сайленсинга отдельно; и повышенную нагрузку RNAi во флоэме растения, таким образом, обеспечивается лучший контроль насекомых, питающихся флоэмой, при помощи подхода с RNAi. Таким образом, различные способы и композиции обеспечивают улучшенные способы доставки ингибиторных РНК в целевой организм. См., например, публикацию заявки на патент США 2009/0188008.

Применяемый в данном документе "усиливающий супрессию элемент" включает полинуклеотид, содержащий целевую последовательность, подлежащую супрессии, или ее активный фрагмент или вариант. Понятно, что усиливающий супрессию элемент не должен быть идентичным целевой последовательности, а скорее, усиливающий супрессию элемент может содержать вариант целевой последовательности, при условии, что последовательность усиливающего супрессию элемента в достаточной степени идентична целевой последовательности, чтобы обеспечить возможность увеличенного уровня RNAi, вырабатываемых на основе элемента сайленсинга, сверх того уровня, который достигается при экспрессии только элемента сайленсинга. Аналогично, усиливающий супрессию элемент может содержать фрагмент целевой последовательности, где фрагмент имеет достаточную длину, чтобы обеспечить возможность увеличенного уровня RNAi, вырабатываемых на основе элемента сайленсинга, сверх того уровня, который достигается при экспрессии только элемента сайленсинга.

Понятно, что можно использовать несколько усиливающих супрессию элементов из одной целевой последовательности, или из различных целевых последовательностей, или из различных участков одной целевой последовательности. Например, используемые усиливающие супрессию элементы могут содержать фрагменты целевой последовательности, полученные из другого участка целевой последовательности (т. е., из 3′UTR, кодирующей последовательности, интрона и/или 5′UTR). Кроме того, усиливающий супрессию элемент может содержаться в кассете экспрессии, как описано в другой части данного документа, и в определенных вариантах осуществления усиливающий супрессию элемент находится в том же самом или в другом ДНК-векторе или конструкции по отношению к элементу сайленсинга. Усиливающий супрессию элемент может быть функционально связан с промотором, раскрытым в данном документе. Понятно, что усиливающий супрессию элемент может экспрессироваться конститутивно, или, в качестве альтернативы, он может вырабатываться специфичным в отношении стадии образом, с использованием различных индуцируемых, или предпочтительных для определенной ткани, или регулируемых в процессе развития промоторов, которые рассмотрены в другой части данного документа.

В конкретных вариантах осуществления при использовании как элемента сайленсинга, так и усиливающего супрессию элемента системная выработка RNAi происходит по всему растению. В дополнительных вариантах осуществления растение или части растения согласно настоящему раскрытию имеют повышенную нагрузку RNAi во флоэме растения, по сравнению с той, которую можно было бы наблюдать при экспрессии конструкции элемента сайленсинга отдельно, и, таким образом, обеспечивается лучший контроль насекомых, питающихся за счет флоэмы, при помощи подхода с RNAi. В определенных вариантах осуществления растения, части растения и растительные клетки согласно настоящему раскрытию можно дополнительно охарактеризовать, как обеспечивающие возможность выработки разнообразных видов RNAi, которые могут повышать эффективность нарушения экспрессии целевого гена.

В конкретных вариантах осуществления комбинированная экспрессия элемента сайленсинга и усиливающего супрессию элемента повышает концентрацию ингибиторных РНК в растительной клетке, растении, части растения, растительной ткани или флоэме сверх того уровня, который достигается при экспрессии элемента сайленсинга отдельно.

Применяемый в данном документе "повышенный уровень ингибиторных РНК" включает какое-либо статистически значимое повышение уровня RNAi, вырабатываемых в растении, обладающем комбинированной экспрессией при сравнении с подходящим контрольным растением. Например, повышение уровня RNAi в растении, части растения или растительной клетке может включать по меньшей мере приблизительно 1%, приблизительно 1%-5%, приблизительно 5%-10%, приблизительно 10%-20%, приблизительно 20%-30%, приблизительно 30%-40%, приблизительно 40%-50%, приблизительно 50%-60%, приблизительно 60-70%, приблизительно 70%-80%, приблизительно 80%-90%, приблизительно 90%-100% или большее повышение уровня RNAi в растении, части растения, растительной клетке или флоэме при сравнении с подходящим контролем. В других вариантах осуществления повышение уровня RNAi в растении, части растения, растительной клетке или флоэме может включать по меньшей мере приблизительно 1-кратное, приблизительно 1-кратное - 5-кратное, приблизительно 5-кратное - 10-кратное, приблизительно 10-кратное - 20-кратное, приблизительно 20-кратное - 30-кратное, приблизительно 30-кратное - 40-кратное, приблизительно 40-кратное - 50-кратное, приблизительно 50-кратное - 60-кратное, приблизительно 60-кратное - 70-кратное, приблизительно 70-кратное - 80-кратное, приблизительно 80-кратное - 90-кратное, приблизительно 90-кратное - 100-кратное или большее повышение уровня RNAi в растении, части растения, растительной клетке или флоэме при сравнении с подходящим контролем. Примеры комбинированной экспрессии элемента сайленсинга с усиливающим супрессию элементом для контроля щитников и представителей рода Lygus можно найти в публикации заявки на патент США 2011/0301223 и публикации заявки на патент США 2009/0192117.

Некоторые варианты осуществления относятся к подавлению экспрессии целевых генов у видов насекомых-вредителей при помощи молекул интерферирующей рибонуклеиновой кислоты (РНК). В публикации согласно PCT WO 2007/074405 описаны способы ингибирования экспрессии целевых генов у беспозвоночных вредителей, в том числе колорадского жука. В публикации согласно PCT WO 2005/110068 описаны способы ингибирования экспрессии целевых генов у беспозвоночных вредителей, в том числе, в частности, у западного кукурузного жука, в качестве средства контроля заражения насекомыми. Кроме того, в публикации согласно PCT WO 2009/091864 описаны композиции и способы супрессии целевых генов из видов насекомых-вредителей, в том числе вредителей из рода Lygus. Молекулы нуклеиновой кислоты, в том числе RNAi для нацеливания на H-субъединицу вакуолярной АТФазы, применимы для контроля популяции вредителей из группы жесткокрылых и заражения ими, как описано в публикации заявки на патент США 2012/0198586. В публикации согласно PCT WO 2012/055982 описана рибонуклеиновая кислота (РНК или двухцепочечная РНК), которая ингибирует или обеспечивает подавление экспрессии целевого гена, который кодирует: рибосомальный белок насекомого, такой как рибосомальный белок L19, рибосомальный белок L40 или рибосомальный белок S27A; субъединицу протеасомы насекомого, такую как белок Rpn6, Pros 25, белок Rpn2, белок бета 1 субъединицы протеасомы или белок бета 2 Pros; β-коатомер COPI-везикулы насекомого, γ-коатомер COPI-везикулы, β'-коатомерный белок или ζ-коатомер COPI-везикулы; белок тетраспанин 2 A насекомого, который представляет собой предполагаемый белок трансмембранного домена; белок насекомого, принадлежащий к семейству актина, такой как актин 5C; белок убиквитин-5E насекомого; белок Sec23 насекомого, который представляет собой активатор ГТФазы, вовлеченной во внутриклеточный транспорт белков; белок "crinkled" насекомого, который представляет собой нестандартный миозин, который вовлечен в двигательную активность; белок "crooked neck" насекомого, который вовлечен в регуляцию ядерного альтернативного сплайсинга мРНК; белок G-субъединицы вакуолярной H+-АТФазы насекомого и Tbp-1 насекомого, такой как Tat-связывающий белок. В публикациях заявок на патент США 2012/029750, US 20120297501 и 2012/0322660 описаны интерферирующие рибонуклеиновые кислоты (РНК или двухцепочечные РНК), которые функционируют при поглощении видами насекомых-вредителей с подавлением экспрессии целевого гена в указанном насекомом-вредителе, где РНК содержит по меньшей мере один элемент сайленсинга, где элемент сайленсинга представляет собой участок двухцепочечной РНК, содержащий гибридизованные комплементарные цепи, из которых одна цепь содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах целевого гена. В публикации заявки на патент США 2012/0164205 описаны потенциальные мишени для интерферирующих двухцепочечных рибонуклеиновых кислот для подавления беспозвоночных вредителей, в том числе: гомологичная последовательность Chd3, гомологичная последовательность бета-тубулина, гомологичная последовательность 40 кДа V-АТФазы, гомологичная последовательность EF1α, гомологичная последовательность субъединицы p28 протеосомы 26S, J гомологичная последовательность эпоксидгидролазы ювенильного гормона, гомологичная последовательность белка хлоридных каналов, зависимых от набухания, гомологичная последовательность белка глюкоза-6-фосфат-1-дегидрогеназы, гомологичная последовательность белка Act42A, гомологичная последовательность фактора 1 АДФ-рибозилирования, гомологичная последовательность белка фактора транскрипции IIB, гомологичные последовательности хитиназы, гомологичная последовательность фермента, конъюгирующего убиквитин, гомологичная последовательность глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, гомологичная последовательность убиквитина B, J омолог эстеразы ювенильного гормона и гомологичная последовательность альфа-тубулина.

Применение в пестицидном контроле

Из уровня техники известны общие способы использования штаммов, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления или ее вариант, в пестицидном контроле или при конструировании других организмов в качестве пестицидных средств. См., например, патент США № 5039523 и EP 0480762A2.

Могут быть выбраны микроорганизмы-хозяева, которые, как известно, заселяют "фитосферу" (филлоплан, филлосферу, ризосферу и/или ризоплан) одной или нескольких сельскохозяйственных культур, представляющих интерес. Эти микроорганизмы выбирают таким образом, чтобы они могли успешно конкурировать в конкретной окружающей среде с микроорганизмами дикого типа, обеспечивать стабильное поддержание и экспрессию гена, экспрессирующего полипептид PtIP-96, и, желательно, обеспечивать улучшенную защиту пестицида от разрушения и инактивации в окружающей среде.

В качестве альтернативы, полипептиды PtIP-96 получают путем введения гетерологичного гена в клеточного хозяина. Экспрессия гетерологичного гена приводит, прямо или опосредованно, к выработке и сохранению пестицида внутри клетки. Эти клетки затем обрабатывают в условиях, которые продлевают активность токсина, вырабатываемого в клетке, когда осуществляют применение клетки по отношению к среде целевого(целевых) вредителя(вредителей). Полученный продукт сохраняет токсичность токсина. Эти инкапсулированные естественным образом полипептиды PtIP-96 затем можно составлять в соответствии с традиционными методиками для внесения в среду пребывания целевого вредителя, например, в почву, воду и на листву растений. См., например, EPA 0192319 и ссылочные документы, процитированные в нем.

Пестицидные композиции

В некоторых вариантах осуществления активные ингредиенты можно наносить в форме композиции и можно наносить на возделываемую площадь или растение, подлежащие обработке, одновременно или последовательно с другими соединениями. Эти соединения могут представлять собой удобрения, средства борьбы с сорняками, криопротекторы, поверхностно-активные вещества, детергенты, пестицидные мыла, масла, применяемые во время состояния покоя, полимеры и/или составы с носителем с замедленным высвобождением или биоразлагаемым носителем, который обеспечивает длительное дозированное внесение на целевой площади после однократного внесения состава. Они также могут представлять собой селективные гербициды, химические инсектициды, вируциды, микробоциды, амебоциды, пестициды, фунгициды, бактерициды, нематоциды, моллюскоциды или смеси из нескольких этих препаратов, при необходимости, вместе с дополнительными приемлемыми с точки зрения сельского хозяйства носителями, поверхностно-активными веществами или вспомогательными средствами, способствующими нанесению, традиционно используемыми в области техники, связанной с получением составов. Подходящие носители и вспомогательные средства могут быть твердыми или жидкими и соответствуют веществам, обычно используемым в технологии составления, например, природным или регенерированным минеральным веществам, растворителям, диспергирующим веществам, смачивающим средствам, веществам, придающим клейкость, связующим или удобрениям. Аналогично, составы можно получать в виде съедобных "приманок" или формировать в "ловушки" для вредителей, что обеспечивает поедание или заглатывание пестицидного состава целевым вредителем.

Способы нанесения активного ингредиента или агрохимической композиции, которая содержит по меньшей мере один из полипептидов PtIP-96, вырабатываемых штаммами бактерий, включают нанесение на листья, покрытие семян и внесение в почву. Количество применений и норма применения зависят от интенсивности поражения соответствующим вредителем.

Композицию можно составлять в виде порошка, дуста, пеллеты, гранулы, распыляемого раствора, эмульсии, коллоидного вещества, раствора и т. п., и ее можно получать при помощи таких традиционных способов как сушка, лиофилизация, гомогенизация, экстракция, фильтрация, центрифугирование, осаждение или концентрирование культуры клеток, содержащих полиpпептид. Во всех таких композициях, которые содержат по меньшей мере один такой пестицидный полипептид, полипептид может присутствовать в концентрации от приблизительно 1% до приблизительно 99% по весу.

При помощи способов согласно настоящему раскрытию можно уничтожать вредителей из группы чешуекрылых, двукрылых, настоящих клопов, нематод, полужесткокрылых или жесткокрылых или уменьшать их количество на указанной площади, или такие композиции можно вносить профилактически в окружающую среду для предотвращения заражения восприимчивым вредителем. Предпочтительно, вредитель заглатывает пестицидно эффективное количество полипептида или контактирует с ним. Применяемый в данном документе термин "пестицидно эффективное количество" относится к количеству пестицида, которое может приводить к гибели по меньшей мере одного вредителя или к заметно сниженному росту, питанию или нормальному физиологическому развитию вредителя. Это количество будет варьировать в зависимости от таких факторов, как, например, специфические целевые вредители, подлежащие контролю, специфическая среда, местоположение, растение, культура или сельскохозяйственный участок, подлежащие обработке, условия окружающей среды и способ, норма, концентрация, стабильность и количество внесений пестицидно эффективной полипептидной композиции. Составы также могут варьировать в зависимости от климатических условий, экологических соображений и/или частоты внесения, и/или тяжести заражения вредителями.

Описанные пестицидные композиции можно создавать путем составления либо суспензии бактериальных клеток, кристаллов и/или спор, либо выделенного белкового компонента с требуемым носителем, приемлемым с точки зрения сельского хозяйства. Композиции можно составлять перед введением с помощью надлежащих способов, таких как лиофилизация, сублимационная сушка, высушивание, или в водном носителе, среде или подходящем растворителе, таком как солевой раствор или другой буфер. Составленные композиции могут находиться в форме дуста, или гранулированного материала, или суспензии в масле (растительном или минеральном), или водных эмульсий или эмульсий масло-в-воде, или в виде смачиваемого порошка, или в комбинации с любым другим материалом носителя, подходящим для сельскохозяйственного применения. Подходящие носители, приемлемые с точки зрения сельского хозяйства, могут быть твердыми или жидкими и хорошо известны из уровня техники. Термин "приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель" охватывает все вспомогательные средства, инертные компоненты, диспергирующие вещества, поверхностно-активные вещества, вещества, придающие клейкость, связующие и т. д., которые обычно применяются в технологии составления пестицидов; причем они хорошо известны специалистам по составлению пестицидов. Составы можно смешивать с одним или несколькими твердыми или жидкими вспомогательными средствами и получать при помощи различных способов, например, путем равномерного перемешивания, смешивания и/или размалывания пестицидной композиции с подходящими вспомогательными средствами с применением традиционных методик составления. Подходящие составы и способы нанесения описаны в патенте США № 6468523, включенном в данный документ посредством ссылки. Растения можно также обрабатывать одной или несколькими химическими композициями, в том числе одним или несколькими гербицидами, инсектицидами или фунгицидами. Иллюстративные химические композиции включают следующее. Гербициды для фруктов/овощей: атразин, бромацил, диурон, глифосат, линурон, метрибузин, симазин, трифлуралин, флуазифоп, глуфосинат, галосульфурон от Gowan, паракват, пропизамид, сетоксидим, бутафенацил, галосульфурон, индазифлам; инсектициды для фруктов/овощей: альдикарб, Bacillus thuriengiensis, карбарил, карбофуран, хлорпирифос, циперметрин, дельтаметрин, диазинон, малатион, абамектин, цифлутрин/бета-цифлутрин, эсфенвалерат, лямбда-цигалотрин, ацеквиноцил, бифеназат, метоксифенозид, новалурон, кромафенозид, тиаклоприд, динотефуран, флуакрипирим, толфенпирад, клотианидин, спиродиклофен, гамма-цигалотрин, спиромезифен, спиносад, ринаксипир, циазипир, спинотерам, трифлумурон, спиротетрамат, имидаклоприд, флубендиамид, тиодикарб, метафлумизон, сульфоксафлор, цифлуметофен, цианопирафен, имидаклоприд, клотианидин, тиаметоксам, спиноторам, тиодикарб, флоникамид, метиокарб, эмамектин-бензоат, индоксакарб, фортиазат, фенамифос, кадусафос, пирипроксифен, фенбутатин-оксид, гекстиазокс, метомил, 4-[[(6-хлорпиридин-3-ил)метил](2,2-дифторэтил)амино]фуран-2(5H)-он; фунгициды для фруктов/овощей: карбендазим, хлороталонил, EBDC, сера, тиофанат-метил, азоксистробин, цимоксанил, флуазинам, фосетил, ипродион, крезоксим-метил, металаксил/мефеноксам, трифлоксистробин, этабоксам, ипроваликарб, трифлоксистробин, фенгексамид, окспоконазола фумарат, циазофамид, фенамидон, зоксамид, пикоксистробин, пираклостробин, цифлуфенамид, боскалид; гербициды для злаков: изопротурон, бромоксинил, иоксинил, фенокси-соединения, хлорсульфурон, клодинафоп, диклофоп, дифлуфеникан, феноксапроп, флорасулам, флуроксипир, метсульфурон, триасульфурон, флукарбазон, йодосульфурон, пропоксикарбазон, пиколинафен, мезосульфурон, бефлубутамид, пиноксаден, амидосульфурон, тифенсульфурон-метил, трибенурон, флупирсульфурон, сульфосульфурон, пирасульфотол, пироксулам, флуфенацет, тралкоксидим, пироксасульфон; фунгициды для злаков: карбендазим, хлороталонил, азоксистробин, ципроконазол, ципродинил, фенпропиморф, эпоксиконазол, крезоксим-метил, квиноксифен, тебуконазол, трифлоксистробин, симеконазол, пикоксистробин, пираклостробин, димоксистробин, протиоконазол, флуоксастробин; инсектициды для злаков: диметоат, лямбда-цигалотрин, дельтаметрин, альфа-циперметрин, β-цифлутрин, бифентрин, имидаклоприд, клотианидин, тиаметоксам, тиаклоприд, ацетамиприд, динетофуран, хлорпирифос, метамидофос, оксидеметон-метил, пиримикарб, метиокарб; гербициды для маиса: атразин, алахлор, бромоксинил, ацетохлор, дикамба, клопиралид, (S-)диметенамид, глуфосинат, глифосат, изоксафлутол, (S-)метолахлор, мезотрион, никосульфурон, примисульфурон, римсульфурон, сулькотрион, форамсульфурон, топрамезон, темботрион, сафлуфенацил, тиенкарбазон, флуфенацет, пироксасульфон; инсектициды для маиса: карбофуран, хлорпирифос, бифентрин, фипронил, имидаклоприд, лямбда-цигалотрин, тефлутрин, тербуфос, тиаметоксам, клотианидин, спиромезифен, флубендиамид, трифлумурон, ринаксипир, дельтаметрин, тиодикарб, β-цифлутрин, циперметрин, бифентрин, люфенурон, трифлуморон, тефлутрин, тебупиримфос, этипрол, циазипир, тиаклоприд, ацетамиприд, динетофуран, авермектин, метиокарб, спиродиклофен, спиротетрамат; фунгициды для маиса: фенитропан, тирам, протиоконазол, тебуконазол, трифлоксистробин; гербициды для риса: бутахлор, пропанил, азимсульфурон, бенсульфурон, цигалофоп, даимурон, фентразамид, имазосульфурон, мефенацет, оксазикломефон, пиразосульфурон, пирибутикарб, квинклорак, тиобенкарб, инданофан, флуфенацет, фентразамид, галосульфурон, оксазикломефон, бензобициклон, пирифталид, пеноксулам, биспирибак, оксадиаргил, этоксисульфурон, претилахлор, мезотрион, тефурилтрион, оксадиазон, феноксапроп, пиримисульфан; инсектициды для риса: диазинон, фенитротион, фенобукарб, монокротофос, бенфуракарб, бупрофезин, динотефуран, фипронил, имидаклоприд, изопрокарб, тиаклоприд, кромафенозид, тиаклоприд, динотефуран, клотианидин, этипрол, флубендиамид, ринаксипир, дельтаметрин, ацетамиприд, тиаметоксам, циазипир, спиносад, спиноторам, эмамектин-бензоат, циперметрин, хлорпирифос, картап, метамидофос, этофенпрокс, триазофос, 4-[[(6-хлорпиридин-3-ил)метил](2,2-дифторэтил)амино]фуран-2(5H)-он, карбофуран, бенфуракарб; фунгициды для риса: тиофанат-метил, азоксистробин, карпропамид, эдифенфос, феримзон, ипробенфос, изопротиолан, пенцикурон, пробеназол, пироквилон, трициклазол, трифлоксистробин, диклоцимет, феноксанил, симеконазол, тиадинил; гербициды для хлопчатника: диурон, флуометурон, MSMA, оксифлуорфен, прометрин, трифлуралин, карфентразон, клетодим, флуазифоп-бутил, глифосат, норфлуразон, пендиметалин, пиритиобак-натрий, трифлоксисульфурон, тепралоксидим, глуфосинат, флумиоксазин, тидиазурон; инсектициды для хлопчатника: ацефат, альдикарб, хлорпирифос, циперметрин, дельтаметрин, малатион, монокротофос, абамектин, ацетамиприд, эмамектин бензоат, имидаклоприд, индоксакарб, лямбда-цигалотрин, спиносад, тиодикарб, гамма-цигалотрин, спиромезифен, пиридалил, флоникамид, флубендиамид, трифлумурон, ринаксипир, бета-цифлутрин, спиротетрамат, клотианидин, тиаметоксам, тиаклоприд, динетофуран, флубендиамид, циазипир, спиносад, спиноторам, гамма-цигалотрин, 4-[[(6-хлорпиридин-3-ил)метил](2,2-дифторэтил)амино]фуран-2(5H)-он, тиодикарб, авермектин, флоникамид, пиридалил, спиромезифен, сульфоксафлор, профенофос, триазофос, эндосульфан; фунгициды для хлопчатника: этридиазол, металаксил, квинтозен; гербициды для сои: алахлор, бентазон, трифлуралин, хлоримурон-этил, хлорансулам-метил, феноксапроп, фомесафен, флуазифоп, глифосат, имазамокс, имазаквин, имазетапир, (S-)метолахлор, метрибузин, пендиметалин, тепралоксидим, глуфосинат; инсектициды для сои: лямбда-цигалотрин, метомил, паратион, тиокарб, имидаклоприд, клотианидин, тиаметоксам, тиаклоприд, ацетамиприд, динетофуран, флубендиамид, ринаксипир, циазипир, спиносад, спиноторам, эмамектин-бензоат, фипронил, этипрол, дельтаметрин, β-цифлутрин, гамма- и лямбда-цигалотрин, 4-[[(6-хлорпиридин-3-ил)метил](2,2-дифторэтил)амино]фуран-2(5H)-он, спиротетрамат, спинодиклофен, трифлумурон, флоникамид, тиодикарб, бета-цифлутрин; фунгициды для сои: азоксистробин, ципроконазол, эпоксиконазол, флутриафол, пираклостробин, тебуконазол, трифлоксистробин, протиоконазол, тетраконазол; гербициды для сахарной свеклы: хлоридазон, десмедифам, этофумезат, фенмедифам, триаллат, клопиралид, флуазифоп, ленацил, метамитрон, квинмерак, циклоксидим, трифлусульфурон, тепралоксидим, квизалофоп; инсектициды для сахарной свеклы: имидаклоприд, клотианидин, тиаметоксам, тиаклоприд, ацетамиприд, динетофуран, дельтаметрин, β-цифлутрин, гамма/лямбда-цигалотрин, 4-[[(6-хлорпиридин-3-ил)метил](2,2-дифторэтил)амино]фуран-2(5H)-он, тефлутрин, ринаксипир, циаксипир, фипронил, карбофуран; гербициды для канолы: клопиралид, диклофоп, флуазифоп, глуфосинат, глифосат, метазахлор, трифлуралин, этаметсульфурон, квинмерак, квизалофоп, клетодим, тепралоксидим; фунгициды для канолы: азоксистробин, карбендазим, флудиоксонил, ипродион, прохлораз, винклозолин; инсектициды для канолы: карбофурановые фосфороорганические соединения, пиретроиды, тиаклоприд, дельтаметрин, имидаклоприд, клотианидин, тиаметоксам, ацетамиприд, динетофуран, β-цифлутрин, гамма и лямбда-цигалотрин, тау-флувалериат, этипрол, спиносад, спиноторам, флубендиамид, ринаксипир, циазипир, 4-[[(6-хлорпиридин-3-ил)метил](2,2-дифторэтил)амино]фуран-2(5H)-он.

В некоторых вариантах осуществления гербицид представляет собой атразин, бромацил, диурон, хлорсульфурон, метсульфурон, тифенсульфурон-метил, трибенурон, ацетохлор, дикамба, изоксафлутол, никосульфурон, римсульфурон, пиритиобак-натрий, флумиоксазин, хлоримурон-этил, метрибузин, квизалофоп, S-метолахлор, гексазинон или их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления инсектицид представляет собой эсфенвалерат, хлорантранилипрол, метомил, индоксакарб, оксамил или их комбинации.

Пестицидная и инсектицидная активность

"Вредитель" включает без ограничений насекомых, грибы, бактерии, нематод, клещей, иксодовых клещей и т. п. Насекомые-вредители включают насекомых, выбранных из отрядов Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera и т. д., в частности Lepidoptera и Coleoptera.

Специалистам в данной области техники будет понятно, что не все соединения в равной степени эффективны против всех вредителей. Соединения согласно вариантам осуществления проявляют активность против насекомых-вредителей, которые могут включать экономически важных вредителей агрономических, лесных, тепличных продуктов, продуктов питомников декоративных растений, продуктов питания и волокнистых продуктов, продуктов, связанных со здоровьем людей и животных, продуктов, связанных с домашней и коммерческой структурой, товаров для дома и продуктов для хранения.

Личинки из отряда Lepidoptera включают без ограничения совок, подгрызающих совок, пядениц и гелиотин семейства Noctuidae Spodoptera frugiperda JE Smith (совка травяная); S. exigua Hübner (совка малая); S. litura Fabricius (табачная совка, гусеница, пожирающая соцветия); Mamestra configurata Walker (совка Берта); M. brassicae Linnaeus (совка капустная); Agrotis ipsilon Hufnagel (совка-ипсилон); A. orthogonia Morrison (совка прямоугольная); A. subterranea Fabricius (совка зернистая); Alabama argillacea Hübner (совка хлопковая американская); Trichoplusia ni Hübner (совка ни); Pseudoplusia includens Walker (соевая совка); Anticarsia gemmatalis Hübner (совка бархатных бобов); Hypena scabra Fabricius (совка клеверная); Heliothis virescens Fabricius (табачная листовертка); Pseudaletia unipuncta Haworth (совка луговая); Athetis mindara Barnes и Mcdunnough (совка шершавая); Euxoa messoria Harris (чернобокая гусеница совки); Earias insulana Boisduval (совка хлопковая египетская); E. vittella Fabricius (совка пятнистая); Helicoverpa armigera Hübner (совка щетинконогая резедовая); H. zea Boddie (совка кукурузная или хлопковая совка); Melanchra picta Harris (гусеница совки); Egira (Xylomyges) curialis Grote (цитрусовая совка); огневок, чехлоносок, бабочек, строящих паутинные гнезда, конусных бабочек и вредителей, скелетирующих листья, из семейства Pyralidae Ostrinia nubilalis Hübner (мотылек стеблевой кукурузный); Amyelois transitella Walker (гусеницы, повреждающие рубчики цитрусовых); Anagasta kuehniella Zeller (огневка мельничная); Cadra cautella Walker (огневка сухофруктовая); Chilo suppressalis Walker (желтая рисовая огневка); C. partellus, (сорговая огневка); Corcyra cephalonica Stainton (огневка рисовая); Crambus caliginosellus Clemens (огневка кукурузная); C. teterrellus Zincken (огневка мятликовая); Cnaphalocrocis medinalis Guenée (листовертка рисовая); Desmia funeralis Hübner (виноградная листовертка); Diaphania hyalinata Linnaeus (дынная огневка); D. nitidalis Stoll (огневка огурцов-пикули); Diatraea grandiosella Dyar (огневка кукурузная юго-западная), D. saccharalis Fabricius (огневка сахарного тростника); Eoreuma loftini Dyar (мексиканская рисовая огневка); Ephestia elutella Hübner (огневка зерновая (какао)); Galleria mellonella Linnaeus (большая восковая моль); Herpetogramma licarsisalis Walker (огневка-травянка); Homoeosoma electellum Hulst (огневка подсолнечниковая); Elasmopalpus lignosellus Zeller (малая кукурузная огневка); Achroia grisella Fabricius (малая восковая моль); Loxostege sticticalis Linnaeus (луговой мотылек); Orthaga thyrisalis Walker (чайная моль); Maruca testulalis Geyer (огневка акациевая); Plodia interpunctella Hübner (моль индийская мучная); Scirpophaga incertulas Walker (стеблевая рисовая огневка); Udea rubigalis Guenée (огневка ржаво-коричневая); а также листоверток, листоверток-почкоедов, плодожорок и гусениц-вредителей плодов из семейства Tortricidae Acleris gloverana Walsingham (западная черноголовая листовертка); A. variana Fernald (восточная черноголовая листовертка); Archips argyrospila Walker (листовертка плодовых деревьев); A. rosana Linnaeus (европейская листовертка) и другие виды Archips, Adoxophyes orana Fischer von Rösslerstamm (листовертка сетчатая); Cochylis hospes Walsingham (полосатая подсолнечниковая моль); Cydia latiferreana Walsingham (лещинная плодожорка); C. pomonella Linnaeus (яблонная плодожорка); Platynota flavedana Clemens (листовертка изменчивая); P. stultana Walsingham (листовертка всеядная); Lobesia botrana Denis & Schiffermüller (листовертка европейская виноградная); Spilonota ocellana Denis & Schiffermüller (листовертка почковая); Endopiza viteana Clemens (листовертка виноградная); Eupoecilia ambiguella Hübner (листовертка гроздевая); Bonagota salubricola Meyrick (листовертка бразильская яблочная); Grapholita molesta Busck (плодожорка восточная персиковая); Suleima helianthana Riley (листовертка подсолнечниковая); Argyrotaenia spp.; Choristoneura spp.

Другие выбранные сельскохозяйственные вредители из отряда Lepidoptera включают без ограничения Alsophila pometaria Harris (осенний плодовый червь); Anarsia lineatella Zeller (моль фруктовая полосатая); Anisota senatoria J.E. Smith (сатурния оранжевая дубовая); Antheraea pernyi Guérin-Méneville (китайский дубовый шелкопряд); Bombyx mori Linnaeus (тутовый шелкопряд); Bucculatrix thurberiella Busck (кривоусая хлопковая моль); Colias eurytheme Boisduval (люцерновая желтушка); Datana integerrima Grote & Robinson (хохлатка ореховая); Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov (сибирский шелкопряд), Ennomos subsignaria Hübner (пяденица ильмовая); Erannis tiliaria Harris (пяденица липовая); Euproctis chrysorrhoea Linnaeus (шелкопряд золотистый); Harrisina americana Guérin-Méneville (пироморфида американская); Hemileuca oliviae Cockrell (гусеница бабочки-сатурнии); Hyphantria cunea Drury (американская белая бабочка); Keiferia lycopersicella Walsingham (томатная моль); Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst (пяденица гемлоковая восточная); L. fiscellaria lugubrosa Hulst (пяденица гемлоковая западная); Leucoma salicis Linnaeus (волнянка ивовая); Lymantria dispar Linnaeus (непарный шелкопряд); Manduca quinquemaculata Haworth (бражник пятиточечный, томатный бражник); M. sexta Haworth (томатный бражник, табачный бражник); Operophtera brumata Linnaeus (пяденица зимняя); Paleacrita vernata Peck (пяденица весенняя); Papilio cresphontes Cramer (парусник кресфонтес, "апельсиновая собака"); Phryganidia californica Packard (коконопряд кольчатый калифорнийский); Phyllocnistis citrella Stainton (цитрусовая мушка-минер); Phyllonorycter blancardella Fabricius (моль-пестрянка плодовая нижнесторонняя); Pieris brassicae Linnaeus (белянка капустная большая); P. rapae Linnaeus (белянка капустная малая); P. napi Linnaeus (белянка брюквенная); Platyptilia carduidactyla Riley (пальцекрылка артишоковая); Plutella xylostella Linnaeus (моль капустная); Pectinophora gossypiella Saunders (розовый коробочный червь); Pontia protodice Boisduval and Leconte (клетчатая белянка); Sabulodes aegrotata Guenée (всеядная пяденица); Schizura concinna J.E. Smith (хохлатка); Sitotroga cerealella Olivier (моль ячменная ангумуазская); Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller (походный шелкопряд сосновый); Tineola bisselliella Hummel (моль комнатная); Tuta absoluta Meyrick (томатная моль); Yponomeuta padella Linnaeus (горностаевая моль плодовая); Heliothis subflexa Guenée; Malacosoma spp. и Orgyia spp.

Представляют интерес личинки и имаго из отряда Coleoptera, в том числе долгоносики из семейств Anthribidae, Bruchidae и Curculionidae (в том числе без ограничения: Anthonomus grandis Boheman (долгоносик хлопковый); Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel (долгоносик рисовый водяной); Sitophilus granarius Linnaeus (долгоносик амбарный); S. oryzae Linnaeus (долгоносик рисовый); Hypera punctata Fabricius (долгоносик точечный); Cylindrocopturus adspersus LeConte (долгоносик подсолнечниковый стеблевой); Smicronyx fulvus LeConte (красный подсолнечниковый долгоносик); S. sordidus LeConte (серый подсолнечниковый долгоносик); Sphenophorus maidis Chittenden (долгоносик маисовый)); земляные блошки, блошки, корневые черви, листоеды, картофельные жуки и листовые минеры семейства Chrysomelidae (в том числе без ограничения: Leptinotarsa decemlineata Say (колорадский жук); Diabrotica virgifera virgifera LeConte (западный кукурузный жук); D. barberi Smith and Lawrence (северный кукурузный жук); D. undecimpunctata howardi Barber (южный кукурузный жук); Chaetocnema pulicaria Melsheimer (земляная кукурузная блошка); Phyllotreta cruciferae Goeze (блошка крестоцветная); Phyllotreta striolata (полосатая блошка); Colaspis brunnea Fabricius (листоед виноградный); Oulema melanopus Linnaeus (пьявица красногрудая); Zygogramma exclamationis Fabricius (подсолнечниковый листоед)); жуки из семейства Coccinellidae (в том числе без ограничения Epilachna varivestis Mulsant (мексиканская фасолевая коровка)); хрущи и другие жуки из семейства Scarabaeidae (в том числе без ограничения: Popillia japonica Newman (хрущик японский); Cyclocephala borealis Arrow (дупляк северный, хрущ); C. immaculata Olivier (дупляк южный, хрущ); Rhizotrogus majalis Razoumowsky (хрущ европейский); Phyllophaga crinita Burmeister (личинка хруща); Ligyrus gibbosus De Geer (жук морковный)); кожееды семейства Dermestidae; проволочники из семейства Elateridae, Eleodes spp., Melanotus spp.; Conoderus spp.; Limonius spp.; Agriotes spp.; Ctenicera spp.; Aeolus spp.; короеды семейства Scolytidae и жуки из семейства Tenebrionidae.

Представляют интерес имаго и незрелые особи отряда Diptera, в том числе минирующие мушки Agromyza parvicornis Loew (кукурузная минирующая мушка); галлицы (в том числе без ограничения: Contarinia sorghicola Coquillett (галлица сорговая); Mayetiola destructor Say (гессенская муха); Sitodiplosis mosellana Géhin (оранжевая зерновая галлица); Neolasioptera murtfeldtiana Felt, (подсолнечниковая галлица)); плодовые мушки (Tephritidae), Oscinella frit Linnaeus (плодовые мушки); цветочные мухи (в том числе без ограничения: Delia platura Meigen (муха ростковая); D. coarctata Fallen (муха озимая) и другие Delia spp., Meromyza americana Fitch (американская меромиза); Musca domestica Linnaeus (комнатные мухи); Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein (малые комнатные мухи); Stomoxys calcitrans Linnaeus (жигалки осенние)); мухи полевые, жигалки, мухи мясные, Chrysomya spp.; Phormia spp. и другие мухи-вредители надсемейства Muscoidea, слепни Tabanus spp.; носоглоточные оводы Gastrophilus spp.; Oestrus spp.; бычьи оводы Hypoderma spp.; пестряки Chrysops spp.; Melophagus ovinus Linnaeus (рунец овечий) и другие Brachycera, комары Aedes spp.; Anopheles spp.; Culex spp.; мошки Prosimulium spp.; Simulium spp.; мокрецы, москиты, сциариды и другие Nematocera.

В качестве насекомых, представляющих интерес, включены имаго и личинки из отрядов Hemiptera и Homoptera, такие как без ограничения хермесы из семейства Adelgidae, слепняки из семейства Miridae, цикады из семейства Cicadidae, цикадки, Empoasca spp.; из семейства Cicadellidae, насекомые надсемейства Fulgoroidea из семейств Cixiidae, Flatidae, Fulgoroidea, Issidae и Delphacidae, горбатки из семейства Membracidae, листоблошки из семейства Psyllidae, белокрылки из семейства Aleyrodidae, тли из семейства Aphididae, филлоксеры из семейства Phylloxeridae, мучнистые червецы из семейства Pseudococcidae, червецы из семейств Asterolecanidae, Coccidae, Dactylopiidae, Diaspididae, Eriococcidae Ortheziidae, Phoenicococcidae и Margarodidae, кружевницы из семейства Tingidae, щитники из семейства Pentatomidae, клопы-черепашки, Blissus spp.; и другие наземники из семейства Lygaeidae, пенницы из семейства Cercopidae, краевики из семейства Coreidae, а также красноклопы и красноклопы хлопковые из семейства Pyrrhocoridae.

Важные с точки зрения сельского хозяйства представители отряда Homoptera дополнительно включают без ограничения: Acyrthisiphon pisum Harris (тля гороховая); Aphis craccivora Koch (тля люцерновая); A. fabae Scopoli (тля свекловичная); A. gossypii Glover (тля хлопковая, тля бахчевая); A. maidiradicis Forbes (тля кукурузная корневая); A. pomi De Geer (тля яблонная); A. spiraecola Patch (тля зеленая цитрусовая); Aulacorthum solani Kaltenbach (тля картофельная обыкновенная); Chaetosiphon fragaefolii Cockerell (тля земляничная американская); Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko (русская пшеничная тля); Dysaphis plantaginea Paaserini (тля яблоневая розовая); Eriosoma lanigerum Hausmann (тля яблонная кровяная); Brevicoryne brassicae Linnaeus (капустная тля); Hyalopterus pruni Geoffroy (тля сливовая опыленная); Lipaphis erysimi Kaltenbach (тля ложнокапустная); Metopolophium dirrhodum Walker (розанно-злаковая тля); Macrosiphum euphorbiae Thomas (большая картофельная тля); Myzus persicae Sulzer (тля персиковая, тля оранжерейная); Nasonovia ribisnigri Mosley (тля салатная зеленая); Pemphigus spp. (тли корневые и тли галловые); Rhopalosiphum maidis Fitch (тля сорговая); R. padi Linnaeus (тля черемуховая обыкновенная); Schizaphis graminum Rondani (тля злаковая обыкновенная); Sipha flava Forbes (тля желтая сахарного тростника); Sitobion avenae Fabricius (тля листовая); Therioaphis maculata Buckton (пятнистая люцерновая тля); Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (тля померанцевая) и T. citricida Kirkaldy (тля цитрусовая); Adelges spp. (хермесы); Phylloxera devastatrix Pergande (филлоксера гикори); Bemisia tabaci Gennadius (белокрылка табачная, белокрылка хлопковая); B. argentifolii Bellows и Perring (белокрылка магнолиевая); Dialeurodes citri Ashmead (белокрылка цитрусовая); Trialeurodes abutiloneus (белокрылка полосатокрылая) и T. vaporariorum Westwood (белокрылка тепличная); Empoasca fabae Harris (цикадка картофельная); Laodelphax striatellus Fallen (темная цикадка); Macrolestes quadrilineatus Forbes (цикадка астровая); Nephotettix cinticeps Uhler (цикадка зеленая); N. nigropictus Stål (рисовая цикадка); Nilaparvata lugens Stål (бурая рисовая цикадка); Peregrinus maidis Ashmead (цикадка кукурузная); Sogatella furcifera Horvath (цикадка белоспинная); Sogatodes orizicola Muir (дельфацид рисовый); Typhlocyba pomaria McAtee (цикадка яблонная); Erythroneoura spp. (цикадки виноградные); Magicicada septendecim Linnaeus (периодическая цикада); Icerya purchasi Maskell (червец австралийский желобчатый); Quadraspidiotus perniciosus Comstock (щитовка калифорнийская); Planococcus citri Risso (мучнистый червец виноградный); Pseudococcus spp. (другие мучнистые червецы); Cacopsylla pyricola Foerster (листоблошка грушевая); Trioza diospyri Ashmead (листоблошка хурмовая).

Важные с точки зрения сельского хозяйства виды из отряда Hemiptera включают без ограничения: Acrosternum hilare Say (щитник зеленый); Anasa tristis De Geer (клоп-ромбовик печальный); Blissus leucopterus leucopterus Say (клоп-черепашка); Corythuca gossypii Fabricius (кружевница хлопковая); Cyrtopeltis modesta Distant (клоп томатный); Dysdercus suturellus Herrich-Schäffer (красноклоп хлопковый); Euschistus servus Say (клоп коричневый вонючий); E. variolarius Palisot de Beauvois (щитник однопятнистый); Graptostethus spp. (комплекс клопов-наземников); Leptoglossus corculus Say (клоп-краевик сосновый); Lygus lineolaris Palisot de Beauvois (клоп луговой); L. Hesperus Knight (слепняк западный матовый); L. pratensis Linnaeus (клопик полевой); L. rugulipennis Poppius (клоп травяной); Lygocoris pabulinus Linnaeus (зеленый слепняк); Nezara viridula Linnaeus (зеленый овощной клоп); Oebalus pugnax Fabricius (клоп-щитник рисовый); Oncopeltus fasciatus Dallas (клоп молочайный большой); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (клоп-слепняк хлопковый).

Кроме того, варианты осуществления могут быть эффективными против Hemiptera, например Calocoris norvegicus Gmelin (клопик картофельный); Orthops campestris Linnaeus; Plesiocoris rugicollis Fallen (клоп яблонный северный); Cyrtopeltis modestus Distant (томатный клоп); Cyrtopeltis notatus Distant (клоп-слепняк); Spanagonicus albofasciatus Reuter (слепняк белоточечный); Diaphnocoris chlorionis Say (клоп-слепняк гледичии); Labopidicola allii Knight (слепняк луковый); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (слепняк хлопковый); Adelphocoris rapidus Say (клоп быстрый); Poecilocapsus lineatus Fabricius (слепняк четырехлинейный); Nysius ericae Schilling (низиус вересковый); Nysius raphanus Howard (ложная черепашка); Nezara viridula Linnaeus (зеленый овощной клоп); Eurygaster spp.; Coreidae spp.; Pyrrhocoridae spp.; Tinidae spp.; Blostomatidae spp.; Reduviidae spp. и Cimicidae spp.

Также включены имаго и личинки из отряда Acari (клещи), такие как Aceria tosichella Keifer (галловый клещ пшеничный); Petrobia latens Müller (петробия многоядная); клещики паутинные и клещики красные семейства Tetranychidae, Panonychus ulmi Koch (красный плодовый клещ); Tetranychus urticae Koch (обыкновенный паутинный клещ); (T. mcdanieli McGregor (клещик Макданиела); T. cinnabarinus Boisduval (красный паутинный клещик); T. turkestani Ugarov & Nikolski (туркестанский паутинный клещик); плоские клещи семейства Tenuipalpidae, Brevipalpus lewisi McGregor (оранжевый клещ); ржавчинные и почковые клещи семейства Eriophyidae и другие клещи, питающиеся листьями, а также клещи, опасные для здоровья человека и животных, т. е. пылевые клещи семейства Epidermoptidae, железницы семейства Demodicidae, зерновые клещи семейства Glycyphagidae, иксодовые клещи отряда Ixodidae. Ixodes scapularis Say (черноногий клещ); I. holocyclus Neumann (австралийский паралитический клещ); Dermacentor variabilis Say (клещ иксодовый собачий); Amblyomma americanum Linnaeus (иксодовый клещ Amblyomma) и конские и чесоточные клещи семейств Psoroptidae, Pyemotidae и Sarcoptidae.

Представляющими интерес насекомыми-вредителями из отряда Thysanura являются, например, Lepisma saccharina Linnaeus (чешуйница); Thermobia domestica Packard (термобия).

Дополнительные охваченные вредители-артроподы включают: пауков из отряда Araneae, таких как Loxosceles reclusa Gertsch and Mulaik (бурый паук-отшельник) и Latrodectus mactans Fabricius (черная вдова), а также многоножек из отряда Scutigeromorpha, таких как Scutigera coleoptrata Linnaeus (обыкновенная мухоловка).

Насекомое-вредитель, представляющее интерес, включает надсемейство щитников и других родственных насекомых, в том числе без исключения виды, принадлежащие к семейству Pentatomidae (Nezara viridula, Halyomorpha halys, Piezodorus guildini, Euschistus servus, Acrosternum hilare, Euschistus heros, Euschistus tristigmus, Acrosternum hilare, Dichelops furcatus, Dichelops melacanthus, и Bagrada hilaris (клоп из рода Bagrada)), семейству Plataspidae (Megacopta cribraria - полушаровидный щитник) и семейству Cydnidae (Scaptocoris castanea - коричневый клоп-землекоп), а также виды Lepidoptera, в том числе без ограничения: моль капустную, например Helicoverpa zea Boddie; соевую совку, например Pseudoplusia includens Walker, и совку бархатных бобов, например Anticarsia gemmatalis Hübner.

Способы измерения пестицидной активности хорошо известны из уровня техники. См., например, Czapla and Lang, (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews, et al., (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone, et al., (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293 и патент США № 5743477, все из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Как правило, белок смешивают и применяют в анализах с кормлением. См., например, Marrone, et al., (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Такие анализы могут включать приведение растений в контакт с одним или несколькими вредителями и определение способности растения выживать и/или вызывать гибель вредителей.

Нематоды включают паразитических нематод, таких как галловые, цистообразующие и ранящие нематоды, в том числе Heterodera spp., Meloidogyne spp. и Globodera spp.; в частности представителей цистообразующих нематод, в том числе без ограничения, Heterodera glycines (соевая цистообразующая нематода); Heterodera schachtii (цистообразующая нематода свеклы); Heterodera avenae (цистообразующая нематода злаков), и Globodera rostochiensis, и Globodera pailida (цистообразующие нематоды картофеля). Ранящие нематоды включают Pratylenchus spp.

Средство для обработки семян

Для защиты и повышения урожайности, а также для улучшения технологий усовершенствования признаков, дополнительные средства для обработки семян могут обеспечивать дополнительную приспособляемость культурных растений и экономически эффективный контроль насекомых, сорняков и заболеваний. Семенной материал можно обрабатывать, как правило, обрабатывать поверхность с помощью композиции, содержащей комбинации химических или биологических гербицидов, антидотов гербицидов, инсектицидов, фунгицидов, ингибиторов и усилителей прорастания, питательных веществ, регуляторов и активаторов роста растений, бактерицидов, нематоцидов, авицидов и/или моллюскоцидов. Эти соединения, как правило, составляют вместе с дополнительными носителями, поверхностно-активными веществами или вспомогательными средствами, способствующими нанесению, традиционно используемыми в области техники, связанной с получением составов. Покрытия можно наносить с помощью пропитки материала для размножения жидким составом или с помощью покрытия комбинированным влажным или сухим составом. Примеры различных типов соединений, которые можно применять в качестве средств для обработки семян, представлены в The Pesticide Manual: A World Compendium, C.D.S. Tomlin Ed., Published by the British Crop Production Council, который включен в данный документ посредством ссылки.

Некоторые средства для обработки семян, которые можно применять на семенах сельскохозяйственных культур, включают без ограничения один или несколько из абсцизовой кислоты, ацибензолар-S-метила, авермектина, амитрола, азаконазола, азоспириллума, азадирахтина, азоксистробина, Bacillus spp. (в том числе один или несколько из видов cereus, firmus, megaterium, pumilis, sphaericus, subtilis и/или thuringiensis), Bradyrhizobium spp. (в том числе один или несколько из betae, canariense, elkanii, iriomotense, japonicum, liaonigense, pachyrhizi и/или yuanmingense), каптана, карбоксина, хитозана, клотианидина, меди, циазипира, дифеноконазола, этидиазола, фипронила, флудиоксонила, флуоксастробина, флуквинконазола, флуразола, флуксофенима, белка гарпина, имазалила, имидаклоприда, ипконазола, изофлавеноидов, липохитоолигосахарида, манкозеба, марганца, манеба, мефеноксама, металаксила, метконазола, миклобутанила, PCNB, пенфлуфена, пинециллума, пентиопирада, перметрина, пикоксистробина, протиоконазола, пираклостробина, ринаксипира, S-метолахлора, сапонина, седаксана, TCMTB, тебуконазола, тиабендазола, тиаметоксама, тиокарба, тирама, толклофос-метила, триадименола, триходермы, трифлоксистробина, тритиконазола и/или цинка. Средство для покрытия семян PCNB, относящееся к номеру регистрации EPA 00293500419, содержит квинтозен и терразол. TCMTB называется 2-(тиоцианометилтио)бензотиазол.

Сорта семян и семена со специфическими трансгенными признаками можно тестировать для определения того, какие дополнительные варианты обработки семян и нормы внесения могут дополнять такие сорта и трансгенные признаки для повышения урожайности. Например, сорт с хорошей потенциальной урожайностью, но с восприимчивостью к пыльной головне, может получить преимущество от применения средства для обработки семян, которое обеспечивает защиту от пыльной головни, сорт с хорошей потенциальной урожайностью, но с восприимчивостью к цистообразующим нематодам, может получить преимущество от применения средства обработки семян, которое обеспечивает защиту от цистообразующей нематоды и т. д. Аналогично, сорт, включающий трансгенный признак, обеспечивающий устойчивость к насекомым, может выиграть от второго механизма действия, придаваемого средством для обработки семян, сорт, включающий трансгенный признак, придающий устойчивость к гербициду, может выиграть от средства обработки семян антидотом, который повышает устойчивость растений к такому гербициду и т. д. К тому же, хорошее укоренение и ранняя всхожесть, которые являются результатом правильного применения средства для обработки семян, могут приводить к более эффективному использованию азота, лучшей способности переносить засуху и общему повышению потенциальной урожайности сорта или сортов, содержащих определенный признак, в комбинации со средством для обработки семян.

Способы уничтожения насекомого-вредителя и контроля популяции насекомых

В некоторых вариантах осуществления представлены способы уничтожения насекомого-вредителя, включающие приведение в контакт насекомого-вредителя, либо одновременно, либо последовательно, с инсектицидно эффективным количеством рекомбинантного полипептида PtIP-96. В некоторых вариантах осуществления предусмотрены способы уничтожения насекомого-вредителя, включающие приведение в контакт насекомого-вредителя с инсектицидно эффективным количеством рекомбинантного пестицидного белка под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108 или его варианта.

В некоторых вариантах осуществления представлены способы контроля популяции насекомого-вредителя, включающие приведение в контакт популяции насекомого-вредителя, либо одновременно, либо последовательно, с инсектицидно эффективным количеством рекомбинантного полипептида PtIP-96. В некоторых вариантах осуществления представлены способы контроля популяции насекомого-вредителя, включающие приведение в контакт популяции насекомого-вредителя с инсектицидно эффективным количеством рекомбинантного полипептида PtIP-96 под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108 или его варианта. Применяемые в данном документе термины "контроль популяции вредителя" или "контролировать вредителя" относятся любому эффекту в отношении вредителя, который приводит к ограничению вреда, который наносит вредитель. Контроль вредителя включает без ограничений уничтожение вредителя, подавление развития вредителя, изменение плодовитости или роста вредителя таким образом, что вредитель оказывает меньше вреда в отношении растения, снижение количества производимого потомства, получение менее приспособленных вредителей, получение вредителей, более восприимчивых к нападению хищников или удержание вредителей от поедания растения.

В некоторых вариантах осуществления представлены способы контроля популяции насекомого-вредителя, устойчивого к пестицидному белку, включающие приведение в контакт популяции насекомого-вредителя, либо одновременно, либо последовательно, с инсектицидно эффективным количеством рекомбинантного полипептида PtIP-96. В некоторых вариантах осуществления предусмотрены способы контроля популяции насекомого-вредителя, устойчивого к пестицидному белку, включающие приведение в контакт популяции насекомого-вредителя с инсектицидно эффективным количеством рекомбинантного полипептида PtIP-96 под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108 или его варианта.

В некоторых вариантах осуществления представлены способы защиты растения от насекомого-вредителя, включающие экспрессию в растении или его клетке рекомбинантного полинуклеотида, кодирующего полипептид PtIP-96. В некоторых вариантах осуществления представлены способы защиты растения от насекомого-вредителя, включающие экспрессию в растении или его клетке рекомбинантного полинуклеотида, кодирующего полипептид PtIP-96 под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108 или его варианты.

Стратегии управления устойчивостью насекомых (IRM)

Было доказано, что экспрессия δ-эндотоксинов B. thuringiensis в трансгенных растениях кукурузы является эффективным средством контроля важных с точки зрения сельского хозяйства насекомых-вредителей (Perlak, et al., 1990; 1993). Однако возникли насекомые, которые устойчивы к δ-эндотоксинам B. thuringiensis, экспрессирующимся в трансгенных растениях. Такая устойчивость, если она станет широко распространенной, будет явно ограничивать коммерческое значение идиоплазмы, содержащей гены, кодирующие такие δ-эндотоксины B. thuringiensis.

Одним способом повышения эффективности трансгенных инсектицидов против целевых вредителей и одновременного снижения развития устойчивых к инсектицидам вредителей является создание нетрансгенных (т. е. не содержащих инсектицидные белок) рефугиев (участок земли с сельскохозяйственными культурами/кукурузой, не содержащими инсектицидный белок) для применения вместе с трансгенными сельскохозяйственными культурами, вырабатывающими один инсектицидный белок, активный против целевых вредителей. Управление по охране окружающей среды Соединенных Штатов (epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm, доступ к которому можно получить с применением префикса www) публикует требования по применению трансгенных сельскохозяйственных культур, вырабатывающих один Bt-белок, активный против целевых вредителей. В дополнение, Национальная ассоциация кукурузоводов на своем веб-сайте: (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn, доступ к которому можно получить с применением префикса www) также предлагает аналогичные руководства, касающиеся требований к рефугиям. Из-за потерь, обусловленных насекомыми в пределах зоны рефугия, более крупные рефугии могут снижать общую урожайность.

Другим способом повышения эффективности трансгенных инсектицидов против целевых вредителей и одновременного снижения развития устойчивых к инсектицидам вредителям может быть создание хранилища инсектицидных генов, которые эффективны против групп насекомых-вредителей и которые проявляют свои эффекты посредством отличающихся механизмов действия.

Экспрессия в растении двух или большего числа инсектицидных композиций, токсичных для одного вида насекомых, при этом каждый инсектицид экспрессируется на эффективных уровнях, будет представлять собой другой способ для достижения контроля развития устойчивости. Это основано на принципе, что эволюция устойчивости к двум отдельным механизмам действия значительно менее вероятна, чем только к одному. Roush, например, описывает стратегию двух токсинов, также называемую "создание пирамиды" или "пакетирование", для управления инсектицидными трансгенными сельскохозяйственными культурами. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353:1777-1786). Пакетирование или создание пирамиды из двух различных белков, каждый из которых эффективен против целевых вредителей и при этом отсутствует перекрестная устойчивость или она невелика, может обеспечивать возможность применения меньшего рефугия. Управление по охране окружающей среды США требует значительно меньший (как правило 5%) структурированный рефугий для высаживания кукурузы, не являющейся Bt, чем для продуктов с одним признаком (как правило 20%). Существуют различные способы обеспечения эффектов IRM рефугия, в том числе различные геометрические паттерны высаживания в полях и смеси семян "в мешке", как дополнительно обсуждается у Roush.

В некоторых вариантах осуществления полипептид PtIP-96 по настоящему раскрытию применим в качестве стратегии управления устойчивостью насекомых в комбинации (т. е. в составе пирамиды) с другими пестицидными белками, включающими без ограничения Bt-токсины, инсектицидные белки Xenorhabdus sp. или Photorhabdus sp. и т. п.

Предусмотрены способы контроля заражения насекомыми отряда Lepidoptera и/или Coleoptera трансгенного растения, которые обеспечивают управление устойчивостью насекомых, включающие экспрессию в растении по меньшей мере двух различных инсектицидных белков, имеющих отличающиеся механизмы действия.

В некоторых вариантах осуществления способы контроля заражения насекомыми из отряда Lepidoptera и/или Coleoptera трансгенного растения и содействия в управлении устойчивостью насекомых по меньшей мере к одному из инсектицидных белков включают полипептид PtIP-96, инсектицидный в отношении насекомых из отряда Lepidoptera и/или Coleoptera.

В некоторых вариантах осуществления способы контроля заражения насекомыми из отряда Lepidoptera и/или Coleoptera трансгенного растения и содействия в управлении устойчивостью насекомых по меньшей мере к одному из инсектицидных белков включают полипептид PtIP-96 под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108 или его варианты, инсектицидные в отношении насекомых из отряда Lepidoptera и/или Coleoptera.

В некоторых вариантах осуществления способы контроля заражения насекомыми из отряда Lepidoptera и/или Coleoptera трансгенного растения и содействия в управлении устойчивостью насекомых включают экспрессию в трансгенном растении полипептида PtIP-96 и белка Cry, инсектицидных в отношении насекомых из отряда Lepidoptera и/или Coleoptera, причем они имеют отличающиеся механизмы действия.

В некоторых вариантах осуществления способы контроля заражения насекомыми из отряда Lepidoptera и/или Coleoptera трансгенного растения и содействия в управлении устойчивостью насекомых включают экспрессию в трансгенном растении полипептида PtIP-96 под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108 или его вариантов и белка Cry, инсектицидных в отношении насекомых из отряда Lepidoptera и/или Coleoptera, причем они имеют отличающиеся механизмы действия.

Также представлены способы снижения вероятности появления устойчивости у насекомых из отряда Lepidoptera и/или Coleoptera к трансгенным растениям, экспрессирующим в растениях инсектицидные белки для контроля видов насекомых, включающие экспрессию полипептида PtIP-96, инсектицидного в отношении вида насекомых, в комбинации со вторым белком, инсектицидным в отношении вида насекомых, причем они имеют отличающиеся механизмы действия.

Также представлены средства для эффективного управления устойчивостью насекомых из отряда Lepidoptera и/или Coleoptera к трансгенным растениям, включающие совместную экспрессию на высоких уровнях в растениях двух или более инсектицидных белков, токсичных для насекомых из отряда Lepidoptera и/или Coleoptera, но при этом каждый характеризуется отличающимся механизмом осуществления его активности в отношении уничтожения, при этом два или более инсектицидных белка включают полипептид PtIP-96 и белок Cry. Также предусмотрены средства для эффективного управления устойчивостью насекомых из отряда Lepidoptera и/или Coleoptera к трансгенным растениям, включающие совместную экспрессию на высоких уровнях в растениях двух или более инсектицидных белков, токсичных для насекомых из отряда Lepidoptera и/или Coleoptera, но при этом каждый характеризуется отличающимся механизмом осуществления его активности применительно к уничтожению, при этом два или более инсектицидных белка включают полипептид PtIP-96 под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108 или его варианты и белок Cry.

В дополнение, представлены способы получения разрешения контролирующих органов для выращивания или коммерческой реализации растений, экспрессирующих белки, инсектицидные в отношении насекомых из отряда Lepidoptera и/или Coleoptera, включающие стадию обращения, предоставления или ссылки на данные анализов связывания белков насекомых, демонстрирующие, что полипептид PtIP-96 не конкурирует с сайтами связывания белков Cry у таких насекомых. В дополнение, предусмотрены способы получения разрешения контролирующих органов для выращивания или коммерческой реализации растений, экспрессирующих белки, инсектицидные в отношении насекомых из отряда Lepidoptera и/или Coleoptera, включающие стадию обращения, предоставления или ссылки на данные анализов связывания белков насекомых, показывающих, что полипептид PtIP-96 под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108 или его варианты не конкурируют с сайтами связывания для белков Cry у таких насекомых.

Способы повышения урожайности растения

Представлены способы повышения урожайности. Способы включают получение растения или растительной клетки, экспрессирующих полинуклеотид, кодирующий пестицидную полипептидную последовательность, раскрытую в данном документе, и выращивание растения или его семени в поле, зараженном вредителем, против которого полипептид обладает пестицидной активностью. В некоторых вариантах осуществления полипептид обладает пестицидной активностью против вредителя из группы чешуекрылых, жесткокрылых, двукрылых, полужесткокрылых или нематод, и поле заражено вредителем из группы чешуекрылых, полужесткокрылых, жесткокрылых, двукрылых или нематод.

Как определено в данном документе, "урожайность" растения относится к качеству и/или количеству биомассы, продуцируемой растением. Применяемый в данном документе термин "биомасса" относится к любому измеренному продукту растения. Увеличением продукции биомассы является любое улучшение урожайности измеренного продукта растения. Увеличение урожайности растения имеет несколько коммерческих применений. Например, увеличение биомассы листьев растения может приводить к увеличению урожайности листовых овощей для потребления человеком или животными. Кроме того, увеличение биомассы листьев можно применять для увеличения производства фармацевтических или промышленных продуктов растительного происхождения. Увеличение урожайности может предусматривать любое статистически значимое увеличение, в том числе без ограничения, по меньшей мере 1% повышение, по меньшей мере 3% повышение, по меньшей мере 5% повышение, по меньшей мере 10% повышение, по меньшей мере 20% повышение, по меньшей мере 30% повышение, по меньшей мере 50% повышение, по меньшей мере 70% повышение, по меньшей мере 100% или большее повышение урожайности по сравнению с растением, не экспрессирующим пестицидную последовательность.

В конкретных способах урожайность растения повышается в результате улучшенной устойчивости к вредителю растения, экспрессирующего полипептид PtIP-96, раскрытый в данном документе. Экспрессия полипептида PtIP-96 приводит к сниженной способности вредителя к заражению растения или питанию на растении, таким образом, улучшая урожайность растения.

Способы переработки

Дополнительно представлены способы переработки растения, части растения или семени с получением пищевого или кормового продукта из растения, части растения или семени, содержащих полипептид PtIP-96. Растения, части растения или семена, представленные в данном документе, можно перерабатывать с получением масла, белковых продуктов и/или побочных продуктов, которые являются производными, полученными путем переработки, которые имеют коммерческое значение. Неограничивающие примеры включают трансгенные семена, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PtIP-96, который можно перерабатывать с получением соевого масла, соевых продуктов и/или соевых побочных продуктов.

"Переработка" относится к любым физическим и химическим способам, применяемым для получения какого-либо соевого продукта, и они включают без ограничения кондиционирование нагреванием, вальцевание и измельчение, экструзию, экстракцию растворителем или вымачивание в воде и экстракцию цельных или дробленых семян.

Следующие примеры представлены для иллюстрирования, а не для ограничения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Пример 1 - Идентификация инсектицидного белка, активного против Selaginella kraussiana

Аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 идентифицировали посредством BLAST (средство поиска основного локального выравнивания; Altschul, et al., (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410; см. также ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/, доступ к которому можно получить с применением префикса www), когда проводили поиск полинуклеотидной последовательности, кодирующей инсектицидные полипептиды PtIP-65 по публикации согласно PCT WO2015/120270 в отношении транскриптома Selaginella kraussiana в пределах внутренней базы данных DUPONT PIONEER. Последовательность транскриптома применяли для разработки праймеров для клонирования последовательности кДНК PtIP-96Aa. Данный клон получали с помощью полимеразной цепной реакции с применением набора для ПЦР KOD Hot Start DNA polymerase® PCR (Novagen, Merck KGaA, Дармштадт, Германия) и общей РНК из Selaginella kraussiana (Id. образца PS-8780) в качестве матрицы. Клонированный продукт ПЦР подтверждали путем секвенирования. На основе результатов секвенирования ДНК полинуклеотидная последовательность PtIP-96Aa показана как SEQ ID NO: 4, а кодируемая полипептидная последовательность как SEQ ID NO: 9.

Биологические анализы в отношении трех видов вредителей, совки соевой (SBL) (Chrysodeixis includens), совки кукурузной (CEW) (Helicoverpa zea) и огневки кукурузной (ECB) (Ostrinia nubialis), проводили с применением экстракта белка растительной ткани из образца PS-8780 Selaginella kraussiana, помещенного на питательную среду для Lepidoptera на основе агара (Southland Products Inc., Лейк-Виллидж, Арканзас) в формате 96-луночного планшета. Применяли по шесть повторностей на каждый образец. Образцы оставляли высыхать на поверхности питательной среды и от двух до пяти новорожденных насекомых помещали в каждую лунку обработанного планшета. После четырех дней инкубации при 27°C личинок оценивали в отношении смертности или тяжести остановки роста. Баллы регистрировали количественно как погибшие (3), со значительной остановкой роста (2) (незначительный рост или отсутствие роста, но живые и эквивалентные личинкам 1^ого возраста), с остановкой роста (1) (рост до второго возраста, но не эквивалентны контролям) или нормальные (0). Воздействие на образец протеиназы K и тепловая обработка приводили к потере активности, что указывает на то, что действующее начало было белковым по природе. Результаты биологических анализов показаны в таблице 1.

Таблица 1

	CEW	ECB	SBL
Экстракт белка PS-8780	+	+	+

Пример 2. Транскриптомное секвенирование Selaginella kraussiana

Транскриптом для Selaginella kraussiana из образца Id. PS-8780 получали следующим образом. Общие РНК выделяли из замороженных тканей путем применения набора Qiagen® RNeasy® для выделения общей РНК. Библиотеки для секвенирования из полученных общих РНК получали с применением набора для секвенирования мРНК TruSeq™ и протокола от Illumina®, Inc. (Сан-Диего, Калифорния). Вкратце, мРНК выделяли путем присоединения к гранулам с олиго(dT), фрагментировали до среднего размера 180 нуклеотидов, подвергали обратной транскрипции в кДНК с помощью случайных гексамерных праймеров, подвергали репарации концов, добавляли 3' A-хвост и лигировали с помощью пронумерованных адаптеров TruSeq™ от Illumina®. Лигированные фрагменты кДНК подвергали ПЦР-амплификации с применением праймеров TruSeq™ от Illumina® и очищенные продукты ПЦР проверяли в отношении качества и количества на чипе Agilent Bioanalyzer® DNA 7500. После оценки качества и количества по 100 нг библиотек транскриптов нормализовали путем обработки с помощью дуплекс-специфичной нуклеазы (DSN) (Evrogen®, Москва, Россия). Нормализацию завершали путем добавления 200 мМ буфера Hepes, за которым следовала тепловая денатурация и пять часов гибридизации при 68°C. Гибридизированную библиотеку обрабатывали с помощью 2 мкл фермента DSN в течение 25 минут, очищали с помощью колонок Qiagen® MinElute® в соответствии с протоколами производителя, и амплифицировали двенадцать циклов с применением специфичных в отношении адаптера праймеров от Illumina®. Конечные продукты очищали с помощью гранул Ampure® XP (Beckman Genomics, Данверс, Массачуссетс) и проверяли в отношении качества и количества на чипе Agilent Bioanalyzer® DNA 7500.

Нормализованные библиотеки транскриптов секвенировали в соответствии с протоколами производителя на Illumina® Genome Analyzer IIx. Каждую библиотеку гибридизировали в проточных ячейках с двумя дорожками и амплифицировали, блокировали, линеализировали и гибридизировали с праймером с применением процесса получения клональных кластеров на cBot® от Illumina. Секвенирование завершали на Genome Analyzer IIx, который давал шестьдесят миллионов ридов со спаренными концами из 75 п.о. на нормализованную библиотеку.

Пример 3 - Идентификация гомологов полипептида PtIP-96

Определение генной идентичности, проводимое с помощью BLAST® в внутренней базе данных транскриптомов папоротников и других примитивных растений DUPONT PIONEER, идентифицировало гомологи полипептида PtIP-96Aa (SEQ ID NO: 4). Гомологи полипептида PtIP-96Aa и организм, в котором они были идентифицированы, показаны в таблице 2. В некоторых случаях гомологи идентифицировали из пула образцов изолятов папоротника и/или видов, идентифицированных в таблице 2 как "mix1", "mix3" и "mix4". Папоротники в пуле образцов показаны в таблице 3.

Таблица 2

ID образца	Виды	Название	н.к. последовательность	а.к. последовательность
PS-9145	Ophioglossum pendulum	PtIP-96Ec	SEQ ID NO: 1	SEQ ID NO: 6
PS-9427	Colysis wrightii 'Monstifera'	PtIP-96Ea	SEQ ID NO: 2	SEQ ID NO: 7
PS-7897	Colysis wrightii	PtIP-96Eb	SEQ ID NO: 3	SEQ ID NO: 8
PS-7896	Selaginella victoriae	PtIP-96Ha	SEQ ID NO: 5	SEQ ID NO: 10
PS-8780	Selaginella kraussiana 'Variegata'	PtIP-96Aa	SEQ ID NO: 4	SEQ ID NO: 9
PS-8780CF	Selaginella kraussiana 'Variegata'	PtIP-96Ab	SEQ ID NO: 11	SEQ ID NO: 12
PS-8780CF	Selaginella kraussiana 'Variegata'	PtIP-96Ac	SEQ ID NO: 13	SEQ ID NO: 14
PS-8780CF	Selaginella kraussiana 'Variegata'	PtIP-96Ad	SEQ ID NO: 15	SEQ ID NO: 16
PS-8780CF	Selaginella kraussiana 'Variegata'	PtIP-96Ae	SEQ ID NO: 17	SEQ ID NO: 18
PS-8780CF	Selaginella kraussiana 'Variegata'	PtIP-96Af	SEQ ID NO: 19	SEQ ID NO: 20
PS-12342-2	Adiantum raddianum 'Gracillimum'	PtIP-96Ag	SEQ ID NO: 21	SEQ ID NO: 22
PS-2-2	Cyathea australis	PtIP-96Ah	SEQ ID NO: 23	SEQ ID NO: 24
mix1	Adiantum/Cyrtomium	PtIP-96Ca	SEQ ID NO: 25	SEQ ID NO: 26
mix1	Adiantum/Cyrtomium	PtIP-96Cb	SEQ ID NO: 27	SEQ ID NO: 28
PS-12342-1	Adiantum raddianum 'Gracillimum'	PtIP-96Cc	SEQ ID NO: 29	SEQ ID NO: 30
PS-12342-4	Adiantum raddianum 'Gracillimum'	PtIP-96Cd	SEQ ID NO: 31	SEQ ID NO: 32
PS-2-3	Adiantum raddianum 'Fragrans'	PtIP-96Ce	SEQ ID NO: 33	SEQ ID NO: 34
PS-3-1	Adiantum raddianum 'Fritz Luthi'	PtIP-96Cf	SEQ ID NO: 35	SEQ ID NO: 36
PS-3-2	Adiantum raddianum 'Fritz Luthi'	PtIP-96Cg	SEQ ID NO: 37	SEQ ID NO: 38
PS-3-3	Adiantum raddianum 'Fritz Luthi'	PtIP-96Ch	SEQ ID NO: 39	SEQ ID NO: 40
PS-11707	Cyrtomium falcatum	PtIP-96Da	SEQ ID NO: 41	SEQ ID NO: 42
PS-5-1	Cyathea australis	PtIP-96Db	SEQ ID NO: 43	SEQ ID NO: 44
PS-5-2	Cyathea australis	PtIP-96Dc	SEQ ID NO: 45	SEQ ID NO: 46
PS-2-1	Adiantum raddianum 'Fragrans'	PtIP-96De	SEQ ID NO: 47	SEQ ID NO: 48
PS-2-4	Adiantum raddianum 'Fragrans'	PtIP-96Df	SEQ ID NO: 49	SEQ ID NO: 50
PS-5-3	Cyathea australis	PtIP-96Dd	SEQ ID NO: 51	SEQ ID NO: 52
PS-9224AF	Lygodium flexuosum	PtIP-96Ed	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 54
PS-9135AF	Platycerium bifurcatum	PtIP-96Ee	SEQ ID NO: 55	SEQ ID NO: 56
PS-9135AF	Platycerium bifurcatum	PtIP-96Ef	SEQ ID NO: 57	SEQ ID NO: 58
mix3	Platycerium/Huperzia/Lygodium	PtIP-96Eg	SEQ ID NO: 59	SEQ ID NO: 60
mix3	Platycerium/Huperzia/Lygodium	PtIP-96Eh	SEQ ID NO: 61	SEQ ID NO: 62
PS-9135AF	Platycerium bifurcatum	PtIP-96Ew	SEQ ID NO: 109	SEQ ID NO: 1
PS-9135AF	Platycerium bifurcatum	PtIP-96Ei	SEQ ID NO: 63	SEQ ID NO: 64
PS-9135AF	Platycerium bifurcatum	PtIP-96Ej	SEQ ID NO: 65	SEQ ID NO: 66
PS-9135AF	Platycerium bifurcatum	PtIP-96Ek	SEQ ID NO: 67	SEQ ID NO: 68
PS-9135AF	Platycerium bifurcatum	PtIP-96El	SEQ ID NO: 69	SEQ ID NO: 70
PS-9135AF	Platycerium bifurcatum	PtIP-96Em	SEQ ID NO: 71	SEQ ID NO: 72
PS-9135AF	Platycerium bifurcatum	PtIP-96En	SEQ ID NO: 73	SEQ ID NO: 74
PS-13327-1	Polystichium tsus-simense	PtIP-96Eo	SEQ ID NO: 75	SEQ ID NO: 76
PS-13327-2	Polystichium tsus-simense	PtIP-96Ep	SEQ ID NO: 77	SEQ ID NO: 78
PS-11698	Davallia fejeensis	PtIP-96Eq	SEQ ID NO: 79	SEQ ID NO: 80
PS-9210-1	Aglaomorpha meyeniana 'Roberts'	PtIP-96Er	SEQ ID NO: 81	SEQ ID NO: 82
PS-9210-2	Aglaomorpha meyeniana	PtIP-96Es	SEQ ID NO: 83	SEQ ID NO: 84
PS-9210-3	Aglaomorpha meyeniana	PtIP-96Et	SEQ ID NO: 85	SEQ ID NO: 86
PS-9210-4	Aglaomorpha meyeniana	PtIP-96Eu	SEQ ID NO: 87	SEQ ID NO: 88
PS-9210-5	Aglaomorpha meyeniana	PtIP-96Ev	SEQ ID NO: 89	SEQ ID NO: 90
mix4	Selaginella victoriae	PtIP-96Hb	SEQ ID NO: 91	SEQ ID NO: 92
mix4	Selaginella victoriae	PtIP-96Hc	SEQ ID NO: 93	SEQ ID NO: 94
mix4	Selaginella victoriae	PtIP-96Hd	SEQ ID NO: 95	SEQ ID NO: 96
mix4	Selaginella victoriae	PtIP-96He	SEQ ID NO: 97	SEQ ID NO: 98
mix4	Selaginella victoriae	PtIP-96Hf	SEQ ID NO: 99	SEQ ID NO: 100
mix4	Selaginella victoriae	PtIP-96Hg	SEQ ID NO: 101	SEQ ID NO: 102
mix4	Selaginella victoriae	PtIP-96Hh	SEQ ID NO: 103	SEQ ID NO: 104
mix4	Selaginella victoriae	PtIP-96Hi	SEQ ID NO: 105	SEQ ID NO: 106
mix4	Selaginella victoriae	PtIP-96Hj	SEQ ID NO: 107	SEQ ID NO: 108

кДНК получали из организмов-источников с идентифицированными гомологами с помощью обратной транскрипции из общей РНК или синтезировали на основе последовательности, собранной из транскриптома. Гены, полученные из кДНК, кодирующие гомологи PtIP-96, подвергали ПЦР-амплификации за счет их соответствующих кДНК с применением праймеров, разработанных для кодирующих последовательностей каждого гомолога, и субклонировали в вектор для временной экспрессии в растении. Клонированные продукты ПЦР подтверждали путем секвенирования.

Значения в процентах идентичности аминокислотных последовательностей между гомологами полипептида PtIP-96, рассчитанные с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша, реализованного в программе Needle (набор инструментов EMBOSS), представлены в виде матричной таблицы в таблице 4a-4e. Пустые части матричной таблицы не показаны.

Таблица 4a

	PtIP-96Aa SEQ ID NO: 9	PtIP-96Ab SEQ ID NO: 12	PtIP-96Ac SEQ ID NO: 14	PtIP-96Ad SEQ ID NO: 16	PtIP-96Ae SEQ ID NO: 18	PtIP-96Af SEQ ID NO: 20	PtIP-96Ag SEQ ID NO: 22	PtIP-96Ah SEQ ID NO: 24	PtIP-96Ca SEQ ID NO: 26	PtIP-96Cb SEQ ID NO: 28	PtIP-96Cc SEQ ID NO: 30
PtIP-96Ec SEQ ID NO: 6	56,3	56,5	55,5	56,0	56,0	56,0	56,3	56,5	55,5	55,2	56,3
PtIP-96Aa SEQ ID NO: 9	-	99,5	99,2	99,5	99,2	99,8	99,8	99,2	75,4	75,1	76,5
PtIP-96Ab SEQ ID NO: 12	-	-	98,8	99,0	98,8	99,2	99,2	99,2	75,4	75,1	76,5
PtIP-96Ac SEQ ID NO: 14	-	-	-	99,2	99,0	99,5	99,0	98,5	74,6	74,4	75,8
PtIP-96Ad SEQ ID NO: 16	-	-	-	-	99,2	99,8	99,2	98,8	75,1	74,9	76,2
PtIP-96Ae SEQ ID NO: 18	-	-	-	-	-	99,5	99,0	98,5	74,6	74,4	75,8
PtIP-96Af SEQ ID NO: 20	-	-	-	-	-	-	99,5	99,0	75,1	74,9	76,2
PtIP-96Ag SEQ ID NO: 22	-	-	-	-	-	-	-	99,0	75,4	75,1	76,5
PtIP-96Ah SEQ ID NO: 24	-	-	-	-	-	-	-	-	75,4	75,1	76,2
PtIP-96Ca SEQ ID NO: 26	-	-	-	-	-	-	-	-	-	99,7	98,7
PtIP-96Cb SEQ ID NO: 28	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	98,4

Таблица 4b

	PtIP-96Cd SEQ ID NO: 32	PtIP-96Ce SEQ ID NO: 34	PtIP-96Cf SEQ ID NO: 36	PtIP-96Cg SEQ ID NO: 38	PtIP-96Ch SEQ ID NO: 40	PtIP-96Da SEQ ID NO: 42	PtIP-96Db SEQ ID NO: 44	PtIP-96Dc SEQ ID NO: 46	PtIP-96Dd SEQ ID NO: 52	PtIP-96De SEQ ID NO: 48	PtIP-96Df SEQ ID NO: 50
PtIP-96Ec SEQ ID NO: 6	55,5	56,3	56,0	56,0	54,0	60,3	57,3	57,3	57,1	53,5	52,8
PtIP-96Aa SEQ ID NO: 9	75,9	76,2	76,0	76,0	73,4	60,0	70,1	69,9	69,9	71,8	70,9
PtIP-96Ab SEQ ID NO: 12	75,9	76,2	76,0	76,0	73,4	60,3	70,4	70,1	70,1	72,0	71,2
PtIP-96Ac SEQ ID NO: 14	75,1	75,5	75,2	75,2	72,6	59,3	69,4	69,2	69,2	71,0	70,2
PtIP-96Ad SEQ ID NO: 16	75,6	76,0	75,8	75,8	73,1	59,8	69,7	69,4	69,4	71,3	70,4
PtIP-96Ae SEQ ID NO: 18	75,1	75,5	75,2	75,2	72,6	59,3	69,4	69,2	69,2	71,0	70,2
PtIP-96Af SEQ ID NO: 20	75,6	76,0	75,8	75,8	73,1	59,8	69,9	69,7	69,7	71,5	70,7
PtIP-96Ag SEQ ID NO: 22	75,9	76,2	76,0	76,0	73,4	59,8	70,1	69,9	69,9	71,5	70,7
PtIP-96Ah SEQ ID NO: 24	75,9	76,5	76,2	76,2	73,4	60,3	70,1	69,9	69,9	72,3	71,2
PtIP-96Ca SEQ ID NO: 26	99,5	98,7	98,4	98,4	97,4	61,8	68,8	68,8	68,5	64,9	66,2
PtIP-96Cb SEQ ID NO: 28	99,2	98,4	98,2	98,2	97,2	61,5	68,5	68,5	68,3	64,6	65,9
PtIP-96Cc SEQ ID NO: 30	98,2	99,7	99,5	99,5	96,1	62,6	69,3	69,3	69,1	65,7	64,9
PtIP-96Cd SEQ ID NO: 32	-	98,2	97,9	97,9	96,9	61,8	69,2	69,2	69,0	65,4	66,7
PtIP-96Ce SEQ ID NO: 34	-	-	99,7	99,7	96,1	62,6	69,3	69,3	69,1	66,0	64,9
PtIP-96Cf SEQ ID NO: 36	-	-	-	99,5	95,9	62,4	69,1	69,1	68,9	65,7	64,6
PtIP-96Cg SEQ ID NO: 38	-	-	-	-	95,9	62,4	69,3	69,3	69,1	65,7	64,6
PtIP-96Ch SEQ ID NO: 40	-	-	-	-	-	60,5	67,1	67,1	66,8	63,1	64,4
PtIP-96Da SEQ ID NO: 42	-	-	-	-	-	-	63,9	63,9	63,6	55,3	54,5
PtIP-96Db SEQ ID NO: 44	-	-	-	-	-	-	-	99,8	99,8	62,8	62,3
PtIP-96Dc SEQ ID NO: 46	-	-	-	-	-	-	-	-	99,5	62,8	62,3
PtIP-96Dd SEQ ID NO: 52	-	-	-	-	-	-	-	-	-	62,6	62,0
PtIP-96De SEQ ID NO: 48	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	98,7

Таблица 4c

	PtIP-96Ea SEQ ID NO: 7	PtIP-96Eb SEQ ID NO: 8	PtIP-96Ed SEQ ID NO: 54	PtIP-96Ee SEQ ID NO: 56	PtIP-96Ef SEQ ID NO: 58	PtIP-96Eg SEQ ID NO: 60	PtIP-96Eh SEQ ID NO: 62	PtIP-96Ei SEQ ID NO: 64	PtIP-96Ej SEQ ID NO: 66	PtIP-96Ek SEQ ID NO: 68	PtIP-96El SEQ ID NO: 70
PtIP-96Ec SEQ ID NO: 6	83,9	83,6	73,3	96,3	99,2	96,0	96,0	96,3	96,6	95,5	95,8
PtIP-96Aa SEQ ID NO: 9	56,2	56,0	58,2	55,8	56,0	55,6	55,6	55,8	55,6	55,6	55,6
PtIP-96Ab SEQ ID NO: 12	56,5	56,2	58,4	56,0	56,3	55,8	55,8	56,0	55,8	55,8	55,8
PtIP-96Ac SEQ ID NO: 14	55,5	55,2	57,4	55,1	55,3	54,8	54,8	55,1	54,8	54,8	54,8
PtIP-96Ad SEQ ID NO: 16	56,0	55,8	56,6	55,6	55,8	55,3	55,3	55,6	55,3	55,3	55,3
PtIP-96Ae SEQ ID NO: 18	56,0	55,8	57,9	55,6	55,8	55,3	55,3	55,6	55,3	55,3	55,3
PtIP-96Af SEQ ID NO: 20	56,0	55,8	57,9	55,6	55,8	55,3	55,3	55,6	55,3	55,3	55,3
PtIP-96Ag SEQ ID NO: 22	56,2	56,0	58,2	55,8	56,0	55,6	55,6	55,8	55,6	55,6	55,6
PtIP-96Ah SEQ ID NO: 24	56,8	56,5	58,8	56,0	56,3	55,8	55,8	56,0	55,8	55,8	55,8
PtIP-96Ca SEQ ID NO: 26	54,1	54,1	55,5	54,6	55,5	54,6	54,4	54,6	54,4	54,6	54,6
PtIP-96Cb SEQ ID NO: 28	54,1	54,1	55,3	54,4	55,2	54,4	54,1	54,4	54,1	54,4	54,4
PtIP-96Cc SEQ ID NO: 30	54,4	54,4	56,3	55,4	56,3	55,4	55,2	55,4	55,2	55,4	55,4
PtIP-96Cd SEQ ID NO: 32	54,1	54,1	55,5	54,6	55,5	54,6	54,4	54,6	54,4	54,6	54,6
PtIP-96Ce SEQ ID NO: 34	54,7	54,7	56,6	55,4	56,3	55,4	55,2	55,4	55,2	55,4	55,4
PtIP-96Cf SEQ ID NO: 36	54,4	54,4	56,3	55,2	56,0	55,2	54,9	55,2	54,9	55,2	55,2
PtIP-96Cg SEQ ID NO: 38	54,7	54,7	56,6	55,2	56,0	55,2	54,9	55,2	54,9	55,2	55,2
PtIP-96Ch SEQ ID NO: 40	52,6	52,6	54,0	53,1	54,0	53,1	52,8	53,1	52,8	53,1	53,1
PtIP-96Da SEQ ID NO: 42	58,3	58,0	60,6	61,1	60,6	61,4	60,8	61,1	60,8	61,4	61,4
PtIP-96Db SEQ ID NO: 44	55,2	54,9	57,4	57,8	57,6	58,0	57,6	57,8	57,6	58,0	58,0
PtIP-96Dc SEQ ID NO: 46	55,2	54,9	57,4	57,8	57,6	58,0	57,6	57,8	57,6	58,0	58,0
PtIP-96Dd SEQ ID NO: 52	54,9	54,7	57,1	57,6	57,3	57,8	57,3	57,6	57,3	57,8	57,8
PtIP-96De SEQ ID NO: 48	54,6	54,3	55,9	52,8	53,5	52,5	52,5	52,8	52,5	52,8	52,5
PtIP-96Df SEQ ID NO: 50	54,0	53,8	54,9	52,0	52,8	51,8	51,8	52,0	51,8	52,0	51,8
PtIP-96Ea SEQ ID NO: 7	-	99,7	77,8	83,4	83,6	83,1	83,1	83,4	83,1	83,1	82,8
PtIP-96Eb SEQ ID NO: 8	-	-	77,5	83,1	83,3	82,8	82,8	83,1	82,8	82,8	82,5
PtIP-96Ed SEQ ID NO: 54	-	-	-	73,3	73,9	73,6	73,1	73,3	73,1	73,9	73,6
PtIP-96Ee SEQ ID NO: 56	-	-	-	-	95,5	99,7	99,7	100	99,7	99,2	99,4
PtIP-96Ef SEQ ID NO: 58	-	-	-	-	-	95,8	95,2	95,5	95,8	96,3	96,0
PtIP-96Eg SEQ ID NO: 60	-	-	-	-	-	-	99,4	99,7	99,4	99,4	99,7
PtIP-96Eh SEQ ID NO: 62	-	-	-	-	-	-	-	99,7	99,4	98,9	99,2
PtIP-96Ei SEQ ID NO: 64	-	-	-	-	-	-	-	-	99,7	99,2	99,4
PtIP-96Ej SEQ ID NO: 66	-	-	-	-	-	-	-	-	-	98,9	99,2
PtIP-96Ek SEQ ID NO: 68	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	99,7

Таблица 4d

	PtIP-96Em SEQ ID NO: 72	PtIP-96En SEQ ID NO: 74	PtIP-96Eo SEQ ID NO: 76	PtIP-96Ep SEQ ID NO: 78	PtIP-96Eq SEQ ID NO: 80	PtIP-96Er SEQ ID NO: 82	PtIP-96Es SEQ ID NO: 84	PtIP-96Et SEQ ID NO: 86	PtIP-96Eu SEQ ID NO: 88	PtIP-96Ev SEQ ID NO: 90
PtIP-96Ec SEQ ID NO: 6	96,9	96,0	56,1	54,3	56,4	76,3	74,6	85,6	94,2	85,6
PtIP-96Aa SEQ ID NO: 9	55,3	55,8	59,1	62,8	62,2	54,9	54,6	55,9	57,0	55,6
PtIP-96Ab SEQ ID NO: 12	55,6	56,0	59,3	62,8	62,7	55,1	55,6	55,7	57,2	54,7
PtIP-96Ac SEQ ID NO: 14	54,6	55,1	58,4	62,1	61,5	54,1	53,8	55,1	56,2	54,8
PtIP-96Ad SEQ ID NO: 16	55,1	55,6	59,2	62,6	62,1	54,6	54,3	55,6	57,5	55,3
PtIP-96Ae SEQ ID NO: 18	55,1	55,6	58,4	62,1	61,5	54,4	54,1	55,1	56,8	54,8
PtIP-96Af SEQ ID NO: 20	55,1	55,6	58,9	62,6	62,0	54,6	54,3	55,6	56,8	55,3
PtIP-96Ag SEQ ID NO: 22	55,3	55,8	59,1	62,8	62,2	54,9	54,6	55,9	57,0	55,6
PtIP-96Ah SEQ ID NO: 24	55,6	56,0	59,3	63,3	62,7	55,4	55,1	55,9	57,5	54,9
PtIP-96Ca SEQ ID NO: 26	54,4	54,6	56,0	54,2	57,5	54,9	54,5	56,3	55,2	56,3
PtIP-96Cb SEQ ID NO: 28	54,1	54,4	55,7	54,0	57,2	54,6	54,2	56,1	54,9	56,1
PtIP-96Cc SEQ ID NO: 30	55,2	55,4	56,7	54,9	58,2	55,2	54,8	56,6	55,4	56,6
PtIP-96Cd SEQ ID NO: 32	54,4	54,6	56,0	54,2	57,5	54,9	54,5	56,3	55,2	56,3
PtIP-96Ce SEQ ID NO: 34	55,2	55,4	56,9	55,1	58,5	55,4	55,0	56,9	55,7	56,9
PtIP-96Cf SEQ ID NO: 36	54,9	55,2	56,7	54,9	58,2	55,2	54,8	56,6	55,4	56,6
PtIP-96Cg SEQ ID NO: 38	54,9	55,2	56,7	54,9	58,2	55,4	55,0	56,9	55,4	56,9
PtIP-96Ch SEQ ID NO: 40	52,8	53,1	55,0	53,3	56,5	53,4	53,0	54,8	53,6	54,8
PtIP-96Da SEQ ID NO: 42	60,6	61,1	64,2	62,1	64,7	56,5	55,1	58,8	59,6	58,8
PtIP-96Db SEQ ID NO: 44	57,3	57,8	65,4	66,2	69,1	54,3	54,3	56,6	57,7	56,8
PtIP-96Dc SEQ ID NO: 46	57,3	57,8	65,6	66,4	68,7	54,3	54,3	56,6	57,7	56,8
PtIP-96Dd SEQ ID NO: 52	57,1	57,6	65,2	66,0	68,9	54,0	54,0	56,3	57,5	56,5
PtIP-96De SEQ ID NO: 48	53,3	52,5	57,9	54,4	59,7	53,4	53,4	53,8	53,3	53,2
PtIP-96Df SEQ ID NO: 50	52,5	51,8	56,9	53,5	58,7	52,9	52,9	53,3	52,8	52,7
PtIP-96Ea SEQ ID NO: 7	83,9	83,4	54,4	52,7	54,1	80,7	79,4	89,8	82,5	89,5
PtIP-96Eb SEQ ID NO: 8	83,7	83,1	54,4	52,7	54,1	80,5	79,2	89,5	82,3	89,2
PtIP-96Ed SEQ ID NO: 54	73,3	73,3	55,3	53,5	58,5	72,5	70,8	77,8	72,1	77,8
PtIP-96Ee SEQ ID NO: 56	97,7	99,7	55,2	53,4	56,0	77,2	75,4	84,8	97,8	84,8
PtIP-96Ef SEQ ID NO: 58	97,7	95,2	56,4	54,5	56,6	76,1	74,3	85,4	93,3	85,4
PtIP-96Eg SEQ ID NO: 60	98,0	99,4	55,4	53,6	56,3	76,9	75,1	84,5	97,5	84,5
PtIP-96Eh SEQ ID NO: 62	97,5	99,4	54,9	53,1	55,8	76,9	75,1	84,5	97,5	84,5
PtIP-96Ei SEQ ID NO: 64	97,7	99,7	55,2	53,4	56,0	77,2	75,4	84,8	97,8	84,8
PtIP-96Ej SEQ ID NO: 66	98,0	99,4	54,9	53,1	55,8	76,9	75,1	84,5	97,5	84,5
PtIP-96Ek SEQ ID NO: 68	98,6	98,9	55,4	53,6	56,3	76,9	75,1	84,5	96,9	84,5
PtIP-96El SEQ ID NO: 70	98,3	99,2	55,4	53,6	56,3	76,6	74,9	84,2	97,2	84,2
PtIP-96Em SEQ ID NO: 72	-	97,5	55,2	53,4	56,0	76,9	75,1	85,4	95,6	85,4
PtIP-96En SEQ ID NO: 74	-	-	55,2	53,4	56,0	77,2	75,4	84,8	97,5	84,8
PtIP-96Eo SEQ ID NO: 76	-	-	-	94,7	83,0	51,9	51,7	55,5	55,2	55,6
PtIP-96Ep SEQ ID NO: 78	-	-	-	-	86,7	50,2	50,1	53,7	53,4	53,8
PtIP-96Eq SEQ ID NO: 80	-	-	-	-	-	51,8	52,4	55,7	55,3	56,5
PtIP-96Er SEQ ID NO: 82	-	-	-	-	-	-	97,8	83,0	76,5	83,0
PtIP-96Es SEQ ID NO: 84	-	-	-	-	-	-	-	81,1	76,0	81,1
PtIP-96Et SEQ ID NO: 86	-	-	-	-	-	-	-	-	83,9	99,7
PtIP-96Eu SEQ ID NO: 88	-	-	-	-	-	-	-	-	-	83,9

Таблица 4e

	PtIP-96Ha SEQ ID NO: 10	PtIP-96Hb SEQ ID NO: 92	PtIP-96Hc SEQ ID NO: 94	PtIP-96Hd SEQ ID NO: 96	PtIP-96He SEQ ID NO: 98	PtIP-96Hf SEQ ID NO: 100	PtIP-96Hg SEQ ID NO: 102	PtIP-96Hh SEQ ID NO: 104	PtIP-96Hi SEQ ID NO: 106	PtIP-96Hj SEQ ID NO: 108
PtIP-96Ec SEQ ID NO: 6	29,4	29,4	29,7	29,7	29,6	29,4	29,4	29,2	29,2	29,6
PtIP-96Aa SEQ ID NO: 9	27,0	27,2	27,8	27,8	27,6	27,6	27,6	27,0	27,4	27,6
PtIP-96Ab SEQ ID NO: 12	26,8	27,0	27,6	27,6	27,4	27,4	27,4	26,8	27,2	27,4
PtIP-96Ac SEQ ID NO: 14	26,4	26,6	27,2	27,2	27,0	27,0	27,0	26,4	26,8	27,0
PtIP-96Ad SEQ ID NO: 16	26,8	27,0	27,6	27,6	27,4	27,4	27,4	26,8	27,2	27,4
PtIP-96Ae SEQ ID NO: 18	26,6	26,8	27,4	27,4	27,2	27,2	27,2	26,6	27,0	27,2
PtIP-96Af SEQ ID NO: 20	26,8	27,0	27,6	27,6	27,4	27,4	27,4	26,8	27,2	27,4
PtIP-96Ag SEQ ID NO: 22	27,0	27,2	27,8	27,8	27,6	27,6	27,6	27,0	27,4	27,6
PtIP-96Ah SEQ ID NO: 24	26,8	27,0	27,6	27,6	27,4	27,4	27,4	26,8	27,2	27,4
PtIP-96Ca SEQ ID NO: 26	28,8	29,0	29,8	29,8	30,0	29,6	29,6	28,8	29,4	30,0
PtIP-96Cb SEQ ID NO: 28	28,8	29,0	29,8	29,8	30,0	29,6	29,6	28,8	29,4	30,0
PtIP-96Cc SEQ ID NO: 30	28,8	29,0	29,8	29,8	30,0	29,6	29,6	28,8	29,3	30,0
PtIP-96Cd SEQ ID NO: 32	28,8	29,0	29,8	29,8	30,0	29,6	29,6	28,8	29,4	30,0
PtIP-96Ce SEQ ID NO: 34	28,8	29,0	29,8	29,8	30,0	29,6	29,6	28,8	29,3	30,0
PtIP-96Cf SEQ ID NO: 36	28,5	28,8	29,6	29,6	29,8	29,3	29,3	28,5	29,1	29,8
PtIP-96Cg SEQ ID NO: 38	28,5	28,8	29,6	29,6	29,8	29,3	29,3	28,5	29,1	29,8
PtIP-96Ch SEQ ID NO: 40	28,4	28,6	29,4	29,4	29,6	29,2	29,2	28,4	29,0	29,6
PtIP-96Da SEQ ID NO: 42	34,3	34,6	35,1	35,1	35,0	34,6	34,6	34,3	34,3	35,0
PtIP-96Db SEQ ID NO: 44	26,9	27,1	27,2	27,2	27,0	26,8	26,8	26,9	26,6	27,0
PtIP-96Dc SEQ ID NO: 46	26,9	27,1	27,2	27,2	27,0	26,8	26,8	26,9	26,6	27,0
PtIP-96Dd SEQ ID NO: 52	26,7	26,9	27,0	27,0	26,8	26,6	26,6	26,7	26,4	26,8
PtIP-96De SEQ ID NO: 48	25,9	26,3	26,9	26,9	26,7	26,7	26,7	26,1	26,5	26,9
PtIP-96Df SEQ ID NO: 50	25,9	26,4	26,9	26,9	26,7	26,7	26,7	26,2	26,5	26,9
PtIP-96Ea SEQ ID NO: 7	29,0	29,0	29,3	29,3	28,7	29,0	29,0	28,8	28,8	28,7
PtIP-96Eb SEQ ID NO: 8	29,0	29,0	29,3	29,3	28,7	29,0	29,0	28,8	28,8	28,7
PtIP-96Ed SEQ ID NO: 54	28,9	28,9	29,1	29,1	29,0	28,9	28,9	28,6	28,6	29,0
PtIP-96Ee SEQ ID NO: 56	29,7	29,7	29,9	29,9	29,8	29,7	29,7	29,4	29,4	29,8
PtIP-96Ef SEQ ID NO: 58	29,4	29,4	29,7	29,7	29,6	29,4	29,4	29,2	29,2	29,6
PtIP-96Eg SEQ ID NO: 60	29,9	29,9	30,1	30,1	30,0	29,9	29,9	29,7	29,7	30,0
PtIP-96Eh SEQ ID NO: 62	29,4	29,4	29,7	29,7	29,6	29,4	29,4	29,2	29,2	29,6
PtIP-96Ei SEQ ID NO: 64	29,7	29,7	29,9	29,9	29,8	29,7	29,7	29,4	29,4	29,8
PtIP-96Ej SEQ ID NO: 66	29,7	29,7	29,9	29,9	29,8	29,7	29,7	29,4	29,4	29,8
PtIP-96Ek SEQ ID NO: 68	29,7	29,7	29,9	29,9	29,8	29,7	29,7	29,4	29,4	29,8
PtIP-96El SEQ ID NO: 70	29,9	29,9	30,1	30,1	30,0	29,9	29,9	29,7	29,7	30,0
PtIP-96Em SEQ ID NO: 72	29,2	29,2	29,4	29,4	29,4	29,2	29,2	29,0	29,0	29,4
PtIP-96En SEQ ID NO: 74	29,4	29,4	29,7	29,7	29,6	29,4	29,4	29,2	29,2	29,6
PtIP-96Eo SEQ ID NO: 76	25,3	25,5	26,1	26,1	25,9	25,5	25,5	25,3	25,3	25,9
PtIP-96Ep SEQ ID NO: 78	24,6	24,8	25,3	25,3	25,1	24,8	24,8	24,6	24,6	25,1
PtIP-96Eq SEQ ID NO: 80	25,4	25,6	26,2	26,2	26,0	25,6	25,6	25,4	25,4	26,0
PtIP-96Er SEQ ID NO: 82	29,0	29,3	29,5	29,5	29,0	29,3	29,3	29,3	29,0	29,0
PtIP-96Es SEQ ID NO: 84	28,6	28,8	29,0	29,0	28,5	28,8	28,8	28,8	28,6	28,5
PtIP-96Et SEQ ID NO: 86	29,3	29,3	29,5	29,5	29,0	29,3	29,3	29,3	29,0	29,0
PtIP-96Eu SEQ ID NO: 88	29,3	29,3	29,5	29,5	29,0	29,3	29,3	29,0	29,0	29,0
PtIP-96Ev SEQ ID NO: 90	29,3	29,3	29,5	29,5	29,0	29,3	29,3	29,3	29,0	29,0
PtIP-96Ha SEQ ID NO: 10	-	98,7	96,7	97,0	97,5	97,7	97,5	98,7	97,7	97,2
PtIP-96Hb SEQ ID NO: 92	-	-	97,5	96,7	97,2	97,5	97,2	99,5	98,5	97,0
PtIP-96Hc SEQ ID NO: 94	-	-	-	98,7	98,2	97,0	96,7	97,5	98,0	98,0
PtIP-96Hd SEQ ID NO: 96	-	-	-	-	98,5	98,2	98,0	96,7	97,2	98,2
PtIP-96He SEQ ID NO: 98	-	-	-	-	-	97,7	97,5	97,2	97,7	99,7
PtIP-96Hf SEQ ID NO: 100	-	-	-	-	-	-	99,7	97,5	98,5	97,5
PtIP-96Hg SEQ ID NO: 102	-	-	-	-	-	-	-	97,2	98,2	97,2
PtIP-96Hh SEQ ID NO: 104	-	-	-	-	-	-	-	-	98,5	97,0
PtIP-96Hi SEQ ID NO: 106	-	-	-	-	-	-	-	-	-	97,5

Пример 4 - Идентификация гомологов PtIP-96 при помощи очистки белка

Гомологи полипептида PtIP-96 можно также идентифицировать при помощи очистки белка, масс-спектрометрии (MS) и ПЦР-клонирования из Selaginella kraussiana или других плаунов и папоротников.

Собирали растительные ткани, подвергали быстрому замораживанию в жидком N₂ и хранили при -80^oC. После хранения его измельчали в мелкий порошок при температуре жидкого N₂ с помощью шаровой мельницы Geno (SPEX, Метачен, Нью-Джерси). Для экстракции белка к каждым 5 г сырого веса ткани добавляли 20 мл 50 мМ буфера Tris, pH 8,0, 150 мМ KCl, 2,5 мМ EDTA, 1,5% поливинилполипирролидона (PVPP) и смесь ингибиторов протеаз (Roche Diagnostics, Германия). Гомогенат центрифугировали для удаления клеточного дебриса, фильтровали через 0,22 мкм фильтры и обессоливали с применением 10 мл колонки для обессоливания Zeba (Thermo Scientific, Иллинойс).

Для очистки белка растительный материал измельчали в мелкий порошок при температуре жидкого N₂ с помощью шаровой мельницы Geno (SPEX, Метачен, Нью-Джерси). Белок экстрагировали в 100 мМ буфере Tris, pH 8,0, 150 мМ KCl, 2,5 мМ EDTA, 1,5% PVPP и смеси ингибиторов протеаз (Roche Diagnostics, Германия). Экстрагированный материал центрифугировали для удаления клеточного дебриса, фильтровали через Miracloth® (Calbiochem) и затем добавляли до 35% сульфат аммония и давали отстояться. Суспензию центрифугировали и полученный осадок ресуспендировали в малом объеме 20 мМ буфера Tris, pH 8. После осветления путем центрифугирования его подвергали обессоливанию с применением колонки Sephadex G25 (GE, Пискатавей, Нью-Джерси), уравновешенной в 20 мМ буфере Tris, pH 8. Пул обессоленной белковой фракции загружали на 1 мл колонку Mono Q (GE, Пискатавей, Нью-Джерси) и элюировали с помощью линейного (60 CV (объемов колонки) градиента от 0 M до 0,7 M NaCl в 20 мМ Tris, pH 8,0. Фракции, активные против SBL и ECB, объединяли и подвергали обессоливанию в 25 мМ MOPS, pH 6,7. Активную фракцию загружали на 4 мл колонку Mono P (буфер A: 25 мМ MOPS, pH 6,7; буфер B: Polybuffer 74, pH 4) с применением 4 CV линейного градиента (0% буфера B), за которым следовала отмывка с помощью 15 CV 100% буфера B.

Идентификацию белка проводили посредством MS-анализа после расщепления белка с помощью трипсина. Белки для идентификации с помощью MS получали после прогона образца на геле LDS-PAGE, окрашенном с помощью красителя бриллиантовый синий G-250. Полоски, представляющие интерес, вырезали из геля, удаляли краситель, восстанавливали с помощью дитиотреитола и затем алкилировали с помощью йодоацетамида. После расщепления с помощью трипсина в течение ночи, образцы анализировали с помощью наножидкостной хроматографии/тандемной масс-спектрометрии (нано-LC/ES-MSMS) на масс-спектрометре Thermo Q Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific), сопряженной с системой для наножидкостной хроматографии Eksigent NanoLC Ultra 1-D Plus и автодозатором nanolc-as2 (AB Sciex). Идентификацию белков проводили путем поиска данных нано-LC/MSMS в сравнении с внутрилабораторной базой данных транскриптомов, содержащей транскрипты из исходных растительных материалов и открытой базы данных белков Swiss-Prot с применением средства поиска Mascot (Matrix Science).

Пример 5. Временная экспрессия в листьях и биологический анализ на насекомых

Полипептиды PtIP-96 экспрессировали с использованием системы для временной экспрессии под контролем вирусного промотора dMMV и/или AtUBQ10 (Dav, et. al., (1999) Plant Mol. Biol. 40:771-782; Norris SR et al (1993) Plant Mol Biol. 21(5):895-906). Из уровня техники хорошо известен способ инфильтрации агробактериями путем введения клеточной суспензии Agrobacterium в растительные клетки интактных тканей для того, чтобы можно было измерить или изучить воспроизводимые инфицирование и дальнейшую экспрессию трансгена, полученного из растения (Kapila, et. al., (1997) Plant Science 122:101-108). Вкратце, фасоль кустовую (фасоль обыкновенная, Phaseolus vulgaris) или сою(Glycine max) на стадии одного листа подвергали инфильтрации агробактериями с помощью нормализованных культур бактериальных клеток тестируемых и контрольных штаммов. Через 4-7 дней из каждого проростка вырезали листовые диски и заражали их по отдельности 2 новорожденными особями совки соевой (SBL) (Chrysodeixis includens), 2 новорожденными особями совки кукурузной (CEW) (Helicoverpa zea) или 4 новорожденными особями огневки кукурузной (ECB) (Ostrinia nubialis). Контрольные листовые диски получали с Agrobacterium, содержащими только флуоресцентный маркер DsRed2 (Clontech™, 1290 Terra Bella Ave. Маунтин-Вью, Калифорния 94043). Листовые диски от не подвергнутых инфильтрации растений включали в качестве второго контроля. Потребление зеленых тканей листа оценивали через два (CEW) или три (ECB, SBL, FAW) дня после заражения. Временно экспрессируемые полипептиды PtIP-96 защищали листовые диски от потребления насекомыми, которыми их заражали, в то же время полное потребление зеленой ткани наблюдали для ткани отрицательного контроля и необработанной ткани (таблица 5). Н.о.=не определено

Таблица 5

Полипептид	Идентификатор последовательности	SBL	CEW	ECB	VBC
PtIP-96Aa	SEQ ID NO: 9	++	++	+	-
PtIP-96Ab	SEQ ID NO: 12	++	++	++	++
PtIP-96Ac	SEQ ID NO: 14	+	++	Н.о.	Н.о.
PtIP-96Ad	SEQ ID NO: 16	++	++	++	++
PtIP-96Ae	SEQ ID NO: 18	+	-	Н.о.	Н.о.
PtIP-96Af	SEQ ID NO: 20	++	++	Н.о.	Н.о.
PtIP-96Ca	SEQ ID NO: 26	++	++	++	++
PtIP-96Cb	SEQ ID NO: 28	++	++	Н.о.	Н.о.
PtIP-96Da	SEQ ID NO: 42	+	+	+	+
PtIP-96Db	SEQ ID NO: 44	++	++	Н.о.	-
PtIP-96Dc	SEQ ID NO: 46	++	++	Н.о.	+
PtIP-96Dd	SEQ ID NO: 52	+	+	Н.о.	+
PtIP-96De	SEQ ID NO: 48	+	+	Н.о.	-
PtIP-96Df	SEQ ID NO: 50	+	+	Н.о.	-
PtIP-96Eb	SEQ ID NO: 8	Н.о.	++	-	+
PtIP-96Ea	SEQ ID NO: 7	Н.о.	++	-	+
PtIP-96Ec	SEQ ID NO: 6	Н.о.	++	+	++
PtIP-96Ew	SEQ ID NO: 6	Н.о.	++	++	++
PtIP-96Ee	SEQ ID NO: 56	Н.о.	++	+	++
PtIP-96Ef	SEQ ID NO: 58	Н.о.	++	+	++
PtIP-96Eg	SEQ ID NO: 60	Н.о.	++	+	++
PtIP-96Eh	SEQ ID NO: 62	Н.о.	++	+	++
PtIP-96Ei	SEQ ID NO: 64	Н.о.	++	+	++
PtIP-96Ej	SEQ ID NO: 66	Н.о.	++	++	++
PtIP-96Ek	SEQ ID NO: 68	Н.о.	++	++	++
PtIP-96El	SEQ ID NO: 70	Н.о.	++	+	++
PtIP-96Em	SEQ ID NO: 72	Н.о.	++	+	++
PtIP-96En	SEQ ID NO: 74	Н.о.	++	++	++
PtIP-96Ed	SEQ ID NO: 54	-	++	+	++
PtIP-96Ha	SEQ ID NO: 10	Н.о.	+	++	Н.о.
PtIP-96Hb	SEQ ID NO: 92	-	+	Н.о.	Н.о.
PtIP-96Hc	SEQ ID NO: 94	-	+	Н.о.	Н.о.
PtIP-96Hd	SEQ ID NO: 96	-	+	Н.о.	Н.о.
PtIP-96He	SEQ ID NO: 98	-	+	Н.о.	Н.о.
PtIP-96Hf	SEQ ID NO: 100	-	+	Н.о.	Н.о.
PtIP-96Hg	SEQ ID NO: 102	-	+	Н.о.	Н.о.
PtIP-96Hh	SEQ ID NO: 104	-	+	Н.о.	Н.о.
PtIP-96Hi	SEQ ID NO: 106	-	+	Н.о.	Н.о.
PtIP-96Hj	SEQ ID NO: 108	-	-	Н.о.	Н.о.

Пример 6. Опосредованная Agrobacterium трансформация маиса и регенерация трансгенных растений

Для опосредованной Agrobacterium Agrobacterium трансформации маиса с использованием полинуклеотидов PtIP-96 согласно настоящему раскрытию применяли способ Zhao (патент США № 5981840 и публикация согласно PCT № WO 1998/32326; содержание которых включено в данный документ посредством ссылки). Вкратце, незрелые зародыши выделяли из маиса и зародыши приводили в контакт с суспензией Agrobacterium в условиях, при которых бактерии способны перенести нуклеотидную последовательность по меньшей мере в одну клетку по меньшей мере одного из незрелых зародышей (стадия 1: стадия инфицирования). На этой стадии незрелые зародыши погружали в суспензию Agrobacterium для инициации инокуляции. Зародыши в течение определенного времени культивировали совместно с Agrobacterium (стадия 2: стадия совместного культивирования). Незрелые зародыши можно культивировать на твердой среде после стадии инфицирования. После периода совместного культивирования предполагалась необязательная стадия "покоя". На этой стадии покоя зародыши инкубировали в присутствии по меньшей мере одного антибиотика, который, как известно, подавляет рост Agrobacterium, без добавления селективного средства для трансформации растений (стадия 3: стадия покоя). Незрелые зародыши культивировали на твердой среде с антибиотиком, но без селективного средства, для элиминации Agrobacterium и в течение фазы покоя для инфицированных клеток. Затем инокулированные зародыши культивировали на среде, содержащей селективное средство, и выделяли растущий трансформированный каллюс (стадия 4: стадия отбора). Незрелые зародыши культивировали на твердой среде с селективным средством, что приводило к селективному росту трансформированных клеток. Затем каллюс регенерировали с получением растения (стадия 5: стадия регенерации) и каллюсы, выращенные на селективной среде, культивировали на твердой среде для регенерации растений.

Пример 7. Трансформация и регенерация сои (Glycine max)

Трансгенные линии сои получали с помощью способа бомбардировки генной пушкой (Klein et al., Nature (London) 327:70-73 (1987); патент США № 4945050) с применением устройства BIORAD Biolistic PDS1000/He и либо плазмиды, либо фрагмента ДНК. Для трансформации и регенерации растений сои применяют следующие исходные растворы и среды:

Исходные растворы:

Исходный 100 X раствор сульфатов:

37,0 г MgSO₄^.7 H₂O, 1,69 г MnSO₄^.H₂O, 0,86 г ZnSO₄^.7 H₂O, 0,0025 г CuSO₄^.5 H₂O

Исходный 100 X раствор галогенидов:

30,0 г CaCl₂^.2 H₂O, 0,083 г KI, 0,0025 г CoCl₂^.6 H₂O

Исходный 100X раствор P, B, Mo:

18,5 г KH₂PO₄, 0,62 г H₃BO₃, 0,025 г Na₂MoO₄^.2 H₂O

Исходный 100X раствор Fe EDTA:

3,724 г Na₂EDTA, 2,784 г FeSO₄^.7 H₂O

Исходный раствор 2,4 D:

10 мг/мл витамина

Исходный 1000X раствор витаминов B5:

100,0 г мио-инозитола, 1,0 г никотиновой кислоты, 1,0 г пиридоксина HCl, 10 г тиамина HCl.

Среда (на литр):

Твердая среда SB199:

1 упаковка солей MS (Gibco/ BRL - № по кат. 11117-066), 1 мл исходного 1000X раствора витаминов B5, 30 г сахарозы, 4 мл 2,4-D (конечная концентрация 40 мг/л), pH 7,0, 2 г Gelrite

Твердая среда SB1:

1 упаковка солей MS (Gibco/ BRL - № по кат. 11117-066), 1 мл исходного 1000X раствора витаминов B5, 31,5 г глюкозы, 2 мл 2,4-D (конечная концентрация 20 мг/л), pH 5,7, 8 г агара TC

SB196:

по 10 мл каждого вышеуказанных исходных растворов 1-4, 1 мл исходного раствора витаминов B5, 0,463 г (NH₄)₂ SO₄, 2,83 г KNO₃, 1 мл исходного раствора 2,4 D, 1 г аспарагина, 10 г сахарозы, pH 5,7

SB71-4:

соли Гамборга B5, 20 г сахарозы, 5 г агара TC, рН 5,7.

SB103:

1 упаковка смеси солей Murashige & Skoog, 1 мл исходного раствора витаминов В5, 750 мг MgCl₂ гексагидрата, 60 г мальтозы, 2 г геллановой камеди, рН 5,7.

SB166:

SB103, дополненная активированным углем из расчета 5 г на литр.

Инициация эмбриогенных суспензионных культур сои

Бобы с незрелыми семенами из доступных растений сои собирали через 45-55 дней после высаживания, очищали от оболочек и помещали в стерильный контейнер Magenta. Семена сои стерилизовали путем встряхивания в течение 15 мин. в 5% растворе Clorox® с 1 каплей мыла Ivory™ (т.е. 95 мл автоклавированной дистиллированной воды плюс 5 мл Clorox® и 1 капля мыла, тщательно перемешанных). Семена промывали с использованием 2 л стерильной дистиллированной воды и семена размером менее 3 мм помещали на отдельные предметные стекла. Срезали верхний конец семени и семядоли выдавливали из семенной оболочки. Семядоли переносили на чашки, содержащие среду SB199 (25-30 семядолей на чашку), на две недели, затем переносили на SB1 на 2-4 недели. Чашки обертывали волокнистой лентой. По прошествии этого времени отрезали вторичные зародыши и помещали в жидкую среду SB196 на 7 дней.

Условия культивирования:

Эмбриогенные суспензионные культуры сои (сорт 93Y21) поддерживали в 50 мл жидкой среды SB196 на ротационном шейкере, 100-150 об./мин., 26°C с фотопериодом 16:8 часов день/ночь при интенсивности света 80-100 мкЭрг/м²/с. Культуры пассировали через каждые 7-14 дней путем инокуляции количества ткани размером до ½ десятицентовой монеты (скопления, растущие вместе) в 50 мл свежей жидкой среды SB196.

Получение ДНК для бомбардировки

При процедурах бомбардировки генной пушкой возможно применение очищенных 1) плазмидной ДНК целиком; или 2) фрагментов ДНК, содержащих только кассету(ы) экспрессии рекомбинантной ДНК, представляющую интерес. Для каждых семнадцати трансформаций путем бомбардировки готовили 85 мкл суспензии, содержащей 1-90 пикограммов плазмидной ДНК на пару оснований каждой ДНК-плазмиды. ДНК-плазмиды или фрагменты совместно осаждали на частицах золота следующим образом. ДНК в суспензии добавляли к 50 мкл суспензии с 10-60 мг/мл 0,6 мкм частиц золота и затем объединяли с 50 мкл CaCl₂ (2,5 M) и 20 мкл спермидина (0,1 M). Смесь перемешивали на вихревой мешалке в течение 5 с, центрифугировали в микроцентрифуге в течение 5 с и удаляли супернатант. Затем частицы, покрытые ДНК, однократно промывали с помощью 150 мкл 100% этанола, перемешивали на вихревой мешалке и снова центрифугировали в микроцентрифуге, затем ресуспендировали в 85 мкл безводного этанола. Затем по пять мкл частиц золота, покрытых ДНК, загружали на каждый диск макроносителя.

Получение тканей и бомбардировка ДНК:

Приблизительно 100 мг двухнедельной суспензионной культуры помещали в пустую 60 мм X 15 мм чашку Петри и остаточную жидкость удаляли из ткани с применением пипетки. Ткань располагали на расстоянии приблизительно 3,5 дюйма от задерживающего экрана и каждую чашку с тканью бомбардировали один раз. Давление разрыва мембраны устанавливали на 650 фунтов на квадратный дюйм и из камеры откачивали воздух до давления -28 дюймов ртутного столба. После бомбардировки ткань из каждой чашки разделяли между двумя колбами, помещали обратно в жидкую среду и культивировали как описано выше.

Отбор трансформированных зародышей и регенерация растений:

После бомбардировки ткань из каждой подвергнутой бомбардировке чашки разделяли и помещали в две колбы с жидкой средой для поддержания культуры SB196 на чашку с подвергнутой бомбардировке ткани. Через семь дней после бомбардировки жидкую среду в каждой колбе заменяли свежей средой SB196 для поддержания культуры с добавлением 100 нг/мл селективного средства (селективной среды). Для отбора трансформированных клеток сои применяемое селективное средство может представлять собой соединение сульфонилмочевины (SU) с химическим названием 2 хлор-N-((4-метокси-6-метил-1,3,5-триазин-2-ил)аминокарбонил) бензолсульфонамид (обычные названия: DPX-W4189 и хлорсульфурон). Хлорсульфурон представляет собой активный ингредиент гербицида на основе сульфонил мочевины GLEAN® от DuPont. Селективную среду, содержащую SU, заменяли через каждые две недели в течение 8 недель. После 8-недельного периода отбора наблюдали, что островки зеленой, трансформированной ткани растут из нетрансформированных, некротических эмбриогенных кластеров. Эти предполагаемые трансгенные объекты выделяли и поддерживали в жидкой среде SB196 с SU из расчета 100 нг/мл в течение еще 5 недель, при этом среду меняли каждые 1-2 недели, с получением новых, клонально размножающихся, трансформированных эмбриогенных суспензионных культур. Зародыши проводили суммарно приблизительно 13 недель в контакте с SU. Суспензионные культуры пассировали и поддерживали в виде скоплений незрелых зародышей, и также регенерировали в целые растения путем созревания и проращивания отдельных соматических зародышей.

Соматические зародыши становились пригодными для проращивания после четырех недель в среде для созревания (1 неделя в SB166, затем 3 недели в SB103). Затем их извлекали из среды для созревания и подсушивали в пустых чашках Петри до семи дней. Затем подсушенные зародыши высаживали в среду SB714, где их оставляли прорастать в тех же световых и температурных условиях, описываемых выше. Проросшие зародыши переносили в горшечную среду и выращивали до зрелости с получением семян.

Пример 8. Трансформация посредством бомбардировки частицами и регенерация трансгенных растений

Незрелые зародыши маиса от тепличных растений-доноров бомбардировали плазмидой, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую инсектицидный белок. Початки очищали от листовой обертки и подвергали поверхностной стерилизации в 30% отбеливателе Clorox® вместе с 0,5% моющего средства Micro в течение 20 минут, и ополаскивали два раза стерильной водой. Незрелые зародыши вырезали и помещали рубчиком вниз (щитком вверх), 25 зародышей на чашку, на среду 560Y на 4 часа и затем выравнивали в пределах целевой зоны 2,5 см при подготовке к бомбардировке. ДНК плазмидного вектора, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую инсектицидный белок, функционально связанный с промотором, осаждали на 1,1 мкм (средний диаметр) вольфрамовые гранулы с применением процедуры преципитации с CaCl₂следующим образом: 100 мкл подготовленных частиц вольфрама в воде; 10 мкл (1 мкг) ДНК в буфере Tris EDTA (1 мкг общей ДНК); 100 мкл 2,5 M CaCl₂ и 10 мкл 0,1 M спермидина.

Каждый реагент добавляли последовательно к суспензии частиц вольфрама, при этом она находилась на вихревой мешалке для множества пробирок. Конечную смесь подвергали непродолжительной ультразвуковой обработке и обеспечивали инкубацию при постоянном перемешивании на вихревой мешалке в течение 10 минут. После периода осаждения пробирки непродолжительно центрифугировали, жидкость удаляли, промывали с помощью 500 мл 100% этанола и центрифугировали в течение 30 секунд. Жидкость вновь удаляли и к конечному осадку частиц вольфрама добавляли 105 мкл 100% этанола. Для бомбардировки генной пушкой частицы вольфрама/ДНК подвергали непродолжительной ультразвуковой обработке, и вносили 10 мкл на центр каждого макроносителя, и давали высохнуть приблизительно 2 минуты перед бомбардировкой. Чашки с образцами бомбардировали с помощью генной пушки на уровне № 4. Все образцы получали однократный выстрел из расчета 650 фунтов/кв. дюйм, при этом общее количество аликвот, взятых из каждой пробирки с полученными частицами/ДНК, составляло десять.

После бомбардировки зародыши поддерживали на среде 560Y в течение 2 дней, затем переносили на среду для отбора 560R, содержащую 3 мг/л биалафоса, и пассировали каждые 2 недели. Спустя приблизительно 10 недель отбора каллюсные клоны, устойчивость которых была выявлена в результате отбора, переносили на среду 288J для инициирования регенерации растений. После созревания соматических зародышей (2-4 недели) хорошо развитые соматические зародыши переносили в среду для проращивания и переносили в освещаемую комнату для культивирования. Спустя приблизительно 7-10 дней развивающиеся проростки переносили на безгормональную среду 272V в пробирках на 7-10 дней до хорошего укоренения проростков. Затем растения переносили во вставки в лотки (эквивалентны горшку на 2,5 дюйма), содержащие почвенную горшечную смесь, и выращивали в течение 1 недели в вегетационной камере, впоследствии выращивали в течение дополнительных 1-2 недель в теплице, затем переносили в горшки Classic 600 (1,6 галлона) и выращивали до зрелости. За растениями вели наблюдение и проводили оценку в отношении экспрессии полипептида PtIP-96 с помощью анализов, известных из уровня техники, таких как, например, иммунологические анализы и вестерн-блоттинг.

Трансгенные растения маиса, положительные в отношении экспрессии инсектицидных белков, тестировали на пестицидную активность с применением стандартных биологических анализов, известных из уровня техники. Такие способы включают, например, биологические анализы с иссечением корня и биологические анализы целого растения. См., например, публикацию заявки на патент США № US 2003/0120054 и международную публикацию № WO 2003/018810.

Среда для бомбардировки (560Y) содержала 4,0 г/л основных солей N6 (SIGMA C-1416), 1,0 мл/л витаминной смеси Эрикссона (1000 раз SIGMA-1511), 0,5 мг/л тиамина-HCl, 120,0 г/л сахарозы, 1,0 мг/л 2,4-D и 2,88 г/л L-пролина (доведенных до объема с помощью D-I H₂O после доведения pH до 5,8 с помощью KOH); 2,0 г/л Gelrite (добавленного после доведения до объема с помощью D-I H₂O) и 8,5 мг/л нитрата серебра (добавленного после стерилизации среды и охлаждения до комнатной температуры). Среда для отбора (560R) содержала 4,0 г/л основных солей N6 (SIGMA C-1416), 1,0 мл/л витаминной смеси Эрикссона (1000 раз SIGMA-1511), 0,5 мг/л тиамина-HCl, 30,0 г/л сахарозы и 2,0 мг/л 2,4-D (доведенных до объема с помощью D-I H₂O после доведения pH до 5,8 с помощью KOH); 3,0 г/л Gelrite (добавленного после доведения до объема с помощью D-I H₂O) и 0,85 мг/л нитрата серебра и 3,0 мг/л биалафоса (оба из которых добавлены после стерилизации среды и охлаждения до комнатной температуры).

Среда для регенерации растений (288J) содержала 4,3 г/л солей по MS (GIBCO 11117-074), 5,0 мл/л исходного раствора витаминов по MS (0,100 г никотиновой кислоты, 0,02 г/л тиамина-HCL, 0,10 г/л пиридоксина-HCL и 0,40 г/л глицина, доведенных до объема с помощью очищенной D-I H₂O) (Murashige and Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 мг/л миоинозитола, 0,5 мг/л зеатина, 60 г/л сахарозы и 1,0 мл/л 0,1 мМ абсцизовой кислоты (доведенных до объема с помощью очищенной D-I H₂O после доведения pH до 5,6); 3,0 г/л Gelrite (добавленного после доведения до объема с помощью D-I H₂O), и 1,0 мг/л индолилуксусной кислоты, и 3,0 мг/л биалафоса (добавленных после стерилизации среды и охлаждения до 60°C). Безгормональная среда (272V) содержала 4,3 г/л солей по MS (GIBCO 11117-074), 5,0 мл/л исходного раствора витаминов по MS (0,100 г/л никотиновой кислоты, 0,02 г/л тиамина-HCL, 0,10 г/л пиридоксина-HCL и 0,40 г/л глицина, доведенных до объема с помощью очищенной D-I H₂O), 0,1 г/л миоинозитола и 40,0 г/л сахарозы (доведенных до объема с помощью очищенной D-I H₂O после доведения pH до 5,6); и 6 г/л бактоагара (добавленного после доведения до объема с помощью очищенной D-I H₂O), ее стерилизовали и охлаждали до 60°C.

Пример 9. Эффективность контроля насекомых у стабильно трансформированных растений сои и кукурузы против широкого спектра насекомых из группы чешуекрылых

Из трансформированных растений вырезали листовые диски и тестировали их в отношении инсектицидной активности полипептидов PtIP-96 против совки кукурузной (SBL) (Chrysodeixis includens), совки кукурузной, (CEW) (Helicoverpa zea), огневки кукурузной (ECB) (Ostrinia nubialis), совки бархатных бобов (VBC) (Anticarsia gemmatalis) и совки травяной (Spodoptera frugiperda).

Приведенное выше описание различных проиллюстрированных вариантов осуществления согласно настоящему раскрытию не подразумевается как исчерпывающее или служащее для ограничения объема точной раскрытой формой. Хотя конкретные варианты осуществления и примеры описаны в данном документе для иллюстративных целей, в пределах объема настоящего раскрытия возможны различные эквивалентные модификации, как будет понятно специалистам в данной области. Представленные в данном документе идеи можно применять для других целей, отличающихся от примеров, описанных выше. В свете вышеизложенных идей возможны многочисленные модификации и вариации, и, следовательно, они находятся в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.

Эти и другие изменения можно выполнять в свете вышеизложенного подробного описания. В целом, в следующей формуле изобретения используемые термины не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения конкретными вариантами осуществления, раскрытыми в описании и формуле изобретения.

Полное раскрытие каждого процитированного документа (в том числе патенты, патентные заявки, статьи из научных журналов, рефераты, руководства, книги или другие раскрытия) в Предпосылках изобретения, Подробном описании и Примерах включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.

Были сделаны попытки обеспечения точности в отношении применяемых чисел (например количества, температуры, концентрации и т. д.), но могут предусматриваться некоторые экспериментальные ошибки и отклонения. Если не указано иное, части представляют собой части по весу, молекулярный вес представляет собой средний молекулярный вес; температура приведена в градусах по Цельсию и давление является атмосферным или практически атмосферным.

1. Рекомбинантный полипептид PtIP-96 с последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42 или SEQ ID NO: 54, где полипептид PtIP-96 обладает инсектицидной активностью против совки кукурузной (Helicoverpa zea).

2. Рекомбинантный полипептид PtIP-96 по п.1, где последовательность полипептида PtIP-96 по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42 или SEQ ID NO: 54.

3. Рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид PtIP-96 по любому из пп.1, 2.

4. Рекомбинантный полинуклеотид по п.3, где полинуклеотид представляет собой кДНК.

5. Рекомбинантный полинуклеотид по п.3, где полинуклеотид представляет собой синтетический полинуклеотид.

6. Рекомбинантный полинуклеотид по п.5, где полинуклеотид имеет кодоны, оптимизированные для экспрессии в культуре, важной с точки зрения сельского хозяйства.

7. Устойчивое к вредителям трансгенное растение, содержащее полинуклеотид по любому из пп.3-6, где вредителем является совка кукурузная (CEW) (Helicoverpa zea).

8. Инсектицидная ДНК-конструкция, содержащая полинуклеотид по любому из пп.3-6, функционально связанный с гетерологичным регуляторным элементом.

9. Устойчивое к вредителям трансгенное растение, содержащее ДНК-конструкцию по п.8, где вредителем является совка кукурузная (CEW) (Helicoverpa zea).

10. Инсектицидная композиция, содержащая полипептид PtIP-96 по любому из пп.1, 2 и приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель или вспомогательное средство.

11. Инсектицидный белок слияния, содержащий полипептид PtIP-96 по любому из пп.1, 2.

12. Способ контроля популяции совки кукурузной (CEW) (Helicoverpa zea), включающий приведение в контакт популяции насекомого-вредителя с полипептидом PtIP-96 по любому из пп.1, 2.

13. Способ подавления роста или уничтожения насекомого-вредителя, где насекомым-вредителем является совка кукурузная (CEW) (Helicoverpa zea), включающий приведение в контакт насекомого-вредителя с композицией, содержащей полипептид PtIP-96 по любому из пп.1, 2.

14. Способ контроля заражения трансгенного растения насекомым совкой кукурузной (CEW) (Helicoverpa zea) и обеспечения управления устойчивостью насекомых, включающий экспрессию в растении полипептида PtIP-96 по любому из пп.1, 2.

15. Способ контроля популяции совки кукурузной (CEW) (Helicoverpa zea), включающий приведение в контакт указанной популяции с трансгенным растением по п.7 или 9.

16. Способ подавления роста или уничтожения совки кукурузной (CEW) (Helicoverpa zea), включающий трансформирование растения ДНК-конструкцией по п.8.

17. Способ по п.16, дополнительно включающий приведение в контакт совки кукурузной (CEW) (Helicoverpa zea) с трансгенным растением или растительной клеткой.

18. Способ по любому из пп.13, 14, 15, 16 или 17, где совка кукурузная (CEW) (Helicoverpa zea) или ее популяция является устойчивой по меньшей мере к одному Bt-токсину.

19. Применение полипептида PtIP-96 по любому из пп.1, 2 для подавления роста или уничтожения совки кукурузной (CEW) (Helicoverpa zea) или ее популяции.

20. Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 или SEQ ID NO: 108, где полипептид обладает инсектицидной активностью против совки кукурузной (Helicoverpa zea).

Изобретение относится к области биохимии, в частности к мутантной клетке растения табака, имеющей сниженный уровень норникотина по сравнению с клеткой растения табака дикого типа, а также к растению табака, растительному материалу и табачной композиции, содержащей вышеуказанную клетку.

Снижение превращения никотина в норникотин в растениях // 2733837

Термостабильные комплексы активазы rubisco // 2733438

Изобретение относится к области биохимии, в частности комплексу для повышения термостойкости у растения, содержащему активазу Rubisco (RCA) из Oryza australiensis и рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазу/оксигеназу (Rubisco) из растения, отличного от O.

Способ управления метаболизмом клетки // 2731897

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа управления метаболизмом клетки. Сущность способа состоит в том, что метаболизм микроорганизмов регулируется на уровне трансляции за счет раздельной регуляции экспрессии генов, кодирующих белки, составляющие единый токсин-антитоксин модуль MazE/MazF.

Растения салат-латук, имеющие резистентность против nasonovia ribisnigri биотипа 1 // 2731639

Изобретение относится к области биохимии, в частности к растению Lactuca sativa, содержащему фрагмент интрогрессии из Lactuca virosa на хромосоме 6 и на хромосоме 7, которое обладает большей резистентностью против Nasonovia ribisnigri биотипа 1 (Nr:1) по сравнению с растением, не содержащим указанные фрагменты интрогрессии, а также к его семени, листку, части и головке.

Растения салат-латук, имеющие резистентность против nasonovia ribisnigri биотипа 1 // 2731639

Ген-восстановитель rf4 для цитоплазматической мужской стерильности (cms) c-типа кукурузы, молекулярные маркеры и их применение // 2729107

Изобретение относится к области биохимии, в частности к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты для восстановления фертильности в кукурузе, а также к способу восстановления фертильности в кукурузе с ее использованием.

Композиции и способы получения (r)-ретикулина и его предшественников // 2729065

Изобретение может быть использовано в фармацевтической промышленности и относится к рекомбинантному вектору экспрессии и способам получения (R)-ретикулина или его предшественника формулы (II).

Получение омега 3 длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот из масличных культур при использовании синтаз pufa траустохидридов // 2728854

Изобретение относится к области биохимии, в частности к генетически модифицированному растению канолы или сои, которое продуцирует масло, содержащее эйкозапентаеновую кислоту в количестве от 0,01 до 10% по массе общих жирных кислот, к его семени, а также к маслу, полученному из вышеуказанного семени.

Термостабильные комплексы активазы rubisco // 2733438