Платформа с клетками-предшественниками человека для поиска активных веществ лекарственных препаратов

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к системе для прогнозирования способности любой малой молекулы вызывать дифференцировку клеток и ее функциональности, проведению исследования с целью прогноза способности молекулы вызывать дифференцировку и ее функциональности, с использованием системы и системе для прогнозирования противоракового свойства химического соединения. Система, в которой используемое количество испытуемой молекулы составляет между 5 и 20 mM, включает диагностический планшет со множеством чашек, покрытых активными мезенхимными стволовыми клетками, среду для выращивания, множество сред, вызывающих дифференцировку, пробу для положительного контроля, подходящую для такой используемой вызывающей дифференцировку среды и средство для прогноза функциональности испытуемой молекулы. Способ включает воздействие на диагностический планшет испытуемой молекулой SM1 или молекулой SM2 в стерильном DMSO, пополнение чашек на планшете 10mM испытуемой молекулы каждые 72 ч и мониторирование фенотипа клеток посредством прогностического метода путем сравнения их с пробами для положительного контроля, используемыми в исследовании. Затем осуществляют оценку генотипа клеток, дифференцированных под воздействием испытуемой молекулы, сравнение их с контрольными пробами, и оценку токсичности испытуемой молекулы на системе полученных от человека стволовых клеток. Система для прогнозирования противоракового свойства химического соединения включает диагностическую платформу со множеством чашек, покрытых активными взятыми у пациента специфическими клетками-предшественниками/стволовыми клетками опухоли и активными мезенхимными стволовыми клетками, платформу для выявления лекарственного вещества с использованием полученных от пациента специфических раковых клеток и опухолевой системы, выращенной на ксенотрансплантатах, полученных от пациента и поверхность для отбора лекарственного вещества, обладающую двумя свойствами: диагностировать соответствие молекул своему назначению и их токсичность. Изобретение позволяет повысить эффективность селективной оценки способности малых молекул вызывать дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток в фенотипически чувствительные остеоциты, адипоциты, хондроциты, кардиомиоциты, гепатоциты и бета-клетки, нейроны, эпителиальные клетки. 3 н. и 6 з п. ф-лы, 3 табл., 2 пр., 4 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к технологии продуктов, основанной на использовании стволовых клеток, в частности оно относится к комплекту, основанному на полученных от живого человека гомогенных клетках-предшественниках и служащему для прогнозирования способности мелких молекул вызывать дифференцировку клеток и/или их регенерацию, и способу его приготовления. Полученный комплект полезен как инструмент для выполнения анализа, от фенотипического до генотипического, исследуемых кандидатов на использование в качестве лекарственного вещества с высокой пропускной способностью.

Обсуждение предпосылок создания изобретения и уровня техники

Главным вызовом в исследованиях в области регенеративной медицины является идентификация и разработка лекарственных препаратов, которые могут помочь в излечении дегенеративных заболеваний. Отсутствие подходящей системы, основанной на работе in vitro с клетками человека, которые похожи на стволовые клетки-предшественники и которые способны к дифференцировке в различные типы клеток, таких как нейронные, миоциты, бета-клетки, остеоциты, хондроциты, адипоциты, гепатоциты, клетки эпителия и т.п., затормозило сам процесс выявления этих новых молекул предлагаемых активных веществ лекарств, с установленным воздействием на имитированную систему человека.

Распознавание и разработка новых и полезных молекул, предполагаемых активных веществ лекарств, продолжает поглощать огромные технические и финансовые ресурсы. Всегда трудно установить новую и полезную терапию дегенеративных патологий лекарственными препаратами. Усовершенствование терапии и возрастание выживаемости пациента будет основано на развитии таргетных и эффективных методов лечения. Кроме того, терапия при лечении связанных с возрастом дегенеративных заболеваний может улучшить качество жизни человека и замедлить дегенеративные процессы. Следовательно, распознавание правильного вида соединений, которые могут оказаться лекарственным веществом, и отбор их в соответствии с их биологическим соответствием требует метода, который может быть эффективным в данной области.

Год за годом фармацевтические компании делают упор на постепенное усовершенствование при исследовании существующих лекарственных препаратов, повторяющиеся циклы биологического тестирования модифицированных соединений привели к значительному проценту доступных лекарств, предназначенных для одной цели. Основное направление фармацевтических исследований много лет назад начало смещаться в сторону целенаправленного обнаружения новых химических классов и новых молекул. Возникновение высокопроизводительного отбора, или HTS, произошло в действительности при изменении направления и благодаря произошедшим одновременно технологическим прорывам, и сейчас этот метод получил широкое распространение во всей биофармацевтической промышленности.

Создание образа для исследования, основанного на клетках-предшественниках, полученных от пациента или донора, который может служить для прогноза определенной физиологической реакции, автоматизация исследования с тем, чтобы его можно было многократно воспроизводимо выполнить, и последовательные испытания образцов, взятых из банка химикатов с тем, чтобы выявить химические структуры, способные "поразить" анализируемый образец, - это шаги, которые входят в процедуру отбора в предположении, что подобные структуры могут оказаться способными вызывать ожидаемую физиологическую реакцию. Для того чтобы исключить результаты, привнесенные исследованием, множество различных вторичных опытов сопровождает высокопроизводительный отбор особенно токсичных соединений.

Высокопроизводительный отбор предназначен для обнаружения присутствия химических образцов, обладающих определенными биологическими или биохимическими свойствами. Эти свойства выбираются для того, чтобы выявить соединения, которые могут вызвать определенную биологическую реакцию при их применении in vitro. При проведении высокопроизводительного отбора в большей степени распознаются кандидаты на использование в качестве лекарственного вещества, чем те агенты, которые окончательно будут использоваться в качестве активных веществ лекарственных препаратов. Уровень желаемой биологической характеристики, выявленный при проведении высокопроизводительного отбора, может служить основанием для синтеза фармацевтами производных соединений из соединений определенного класса химических веществ.

В заявке США US 20160109430 "Methods for drug discovery" описаны опыты для распознавания кандидатов на использование в качестве лекарственных веществ, которые регулируют старение клеток, и они основаны на обнаружении того, что количество ATRX (X-связанный синдром альфа-талассемии/олигофрении) очагов увеличивается в клетках, когда они подвергаются старению. В соответствии с этим, в цитируемом изобретении предлагаются образцы для анализа и комплекты для распознавания комбинаций лекарственных веществ, которые могут быть полезны при лечении пациентов, имеющих различные формы рака, и для распознавания соединений, которые могут быть полезны при лечении дегенеративных заболеваний, например болезней Паркинсона, Альцгеймера, амиотрофического бокового склероза, остеоартрита, дегенеративного заболевания хрящевой ткани, диабета, мышечной дистрофии, а также для увеличения груди и восстановления сердечной мышцы.

В заявке США US 20160209398 "Assay for drug discovery based on in-vitro differentiated cells" описана аналитическая система для определения терапевтического или токсического эффекта предлагаемого лекарства, основанная на анализе его активности в клетках, которые были дифференцированы in vitro из стволовых клеток и которые стали демонстрировать фенотип, похожий на заболевание, которое предполагается лечить.

Однако в настоящее время отсутствуют доступные компоненты для исследований, основанные на специфических клетках человека, с помощью которых можно действительно проверить или прогнозировать способность либо известной молекулы лекарственного вещества, либо полностью нового банка химикатов с неизвестным биологическим соответствием вызвать дифференцировку, которую можно должным образом тестировать на выращенных и хорошо определенных стволовых клетках in vitro так же эффективно, как позволяет данное изобретение. Фенотипические изменения клеток при воздействии молекул можно наблюдать через интервал времени от 24 часов до 28 дней, что является свидетельством большей эффективности этого основанного на клетках комплекта для исследований, как изложено в нижеследующих параграфах.

Краткое изложение сущности изобретения

Основной целью данного изобретения является использование обширного ресурса стромы для получения мезенхимных стволовых клеток, их плюрипотентного свойства образовывать на основе клеток однородную платформу, которая могла бы прогнозировать способность мелких молекул вызывать транс-дифференцировку, при воздействии ими на клеточную платформу. Приготовленная платформа способна превращать в нейроны, миоциты, бета-клетки, остеоциты, хондроциты, адипоциты, гепатоциты и клетки эпителия при воздействии на них мелких молекул. В данном изобретении также предлагается новый способ приготовления платформы (комплекта), которую, управляя способностью мелких молекул оказывать заданное воздействие, можно подвергать воздействию мелких молекул и которая совместима с растворителем, в котором растворены мелкие молекулы, с тем, чтобы она могла трансформироваться в клетки специального типа, что косвенным образом позволяет прогнозировать роль мелких молекул в регенерации или дифференцировке при заболевании, при котором повреждаются клетки конкретного типа.

Краткое описание чертежей

Отмеченные выше и другие отличительные признаки, и преимущества данного изобретения и способы достижения их станут более очевидными, и настоящее описание будет более понятным благодаря ссылкам на следующее описание вариантов выполнения данного изобретения, рассматриваемого совместно с прилагаемыми чертежами, на которых:

На Фиг. 1 показан перспективный вид прогностической платформы, описанной в данном изобретении, включающей множество чашек, содержащих соответствующее вещество, вызывающее дифференцировку, среду для выращивания и пробы для положительного контроля.

На Фиг. 2 показаны пиктограммы фенотипов, иллюстрирующие изменение морфологии мезенхимных стволовых клеток фибробласта до нейронных процессов, согласно эксперименту, проведенному в Примере 1.

На Фиг. 3 показан перспективный вид прогностического чипа, как описано в Примере 2, включающего множество чашек, содержащих соответствующие клетки; и

На Фиг. 4 показана микрофотография различных фаз мертвых раковых клеток, полученных из опухоли молочной железы при обработке их SM1 в течение 24 часов в Примере 2.

Подробное описание предпочтительных вариантов выполнения

Сейчас будут сделаны детальные ссылки на примеры выполнения системы. Прежде, чем подробно описывать варианты выполнения изобретения, которые соответствуют раскрытию сущности данного изобретения, необходимо отметить, что эти варианты выполнения заключаются, главным образом, в комбинации компонентов платформы. В этом документе предполагается, что термин "содержит", "содержащий" или "включающий" или любые их варианты, относится к не исключающему включению, такому, что система, способ, платформа, продукт, устройство или установка, которые содержат ряд элементов, включают не только эти элементы, но могут включать другие элементы, не обязательно перечисленные в такой системе или присущие такой системе, способу, изделию, устройству или установке. Элемент, которому предшествует "включает …", без дальнейших ограничений не исключает наличие дополнительных идентичных элементов в технологии, продукте, способе, изделии, устройстве или установке, которые содержат этот элемент.

Не обязательно следует считать, что описанный здесь вариант выполнения является предпочтительным или имеет преимущества по сравнению с другими вариантами выполнения. Все варианты выполнения, описанные в этом подробном описании, являются иллюстративными и представлены для того, чтобы дать возможность специалистам изготовить или использовать изобретение, а не для того, чтобы ограничить объем изобретения, который определен формулой изобретения.

Специалистам будет очевидно, что в отношении данного изобретения можно выполнить различные модификации и изменения, которые не будут выходить за пределы сущности и объема изобретения. Таким образом, предполагается, что данное изобретение охватывает все модификации и изменения этого изобретения при условии, что они входят в объем прилагаемых пунктов патентных притязаний и их эквивалентов.

В следующем описании с целью разъяснения изложен ряд конкретных деталей с тем, чтобы обеспечить глубокое понимание настоящей конструкции нового устройства. Однако специалисту в данной области будет очевидно, что настоящее изобретение можно осуществить без этих конкретных деталей.

Клинические исследования, проведенные в данном изобретении, были в особенности сконцентрированы на MSC (мезенхимных стволовых клетках), полученных из пупочного канатика, зубной пульпы и других стромальных мезенхимных тканей. Этот способ не предполагает хирургическое или какие-либо инвазивные оперативные действия для сбора любых тканей, напротив, они собираются из выбрасываемых биологический отходов или как традиционные отходы. MSC, полученные из указанных выше мезенхимных тканей изолируются, выращиваются и увеличивают свой объем, согласно новому способу, описанному в первичной заявке 932/СНЕ/2013.

Полученные на переносе 1, согласно способу, описанному в 932/СНЕ/2013, гомогенные клетки высеваются (5000 клеток на чашку) в 100 мкл полной среды (DMEM с 15% плодной сыворотки коровы и 1% пенициллина/стрептомицина) на планшет с 12 чашками и выращиваются в течение всей ночи при 37°С, 5% - содержании СО₂ и 95% влажности. После выращивания в течение ночи среда дня выращивания описывается, и в помеченные чашки добавляются свежеприготовленные индукционные среды, согласно маркировке, с положительной контрольной пробой и тестируемыми соединениями. Планшет повторно подвергается инкубации в инкубаторе при 37°С, 5% - содержании СО₂, как показано на Фиг. 1. Среда подается и обновляется каждые 72 часа путем удаления использованной в течение 28 дней. Мезенхимные стволовые клетки (MSC), выращенные из костного мозга пациента и венозной крови, также один раз переносились и высеивались, как было описано выше для комплекта для исследования.

Комплект для исследования:

В вариантах выполнения, не имеющих ограничительного смысла, в настоящем изобретении предлагается комплект для исследования с использованием клеток для определения дифференцирующей способности и функционального свойства молекулы, который используют главным образом для выявления соединения, обладающего лекарственным действием. Комплект для исследования с использованием клеток, прогнозирующий способность клеток к дифференцировке и функциональность любой мелкой молекулы, включает планшет для высевания на чашки со множеством чашек, покрытых активными предшественниками мезенхимных стволовых клеток; среду для выращивания; ряд сред для дифференцировки; положительную контрольную пробу, предназначенную для оценки такой дифференцировки; и средства для прогноза функциональности испытуемой молекулы.

В приведенной ниже Таблице 1 перечислены среды для выращивания и среды для дифференцировки, доступные вместе с исследовательским комплектом, а в Таблице 2 перечислены пробы для положительного контроля, доступные для соответствующей дифференцировки.

Пример 1

Прогностическая платформа обрабатывается мелкими молекулами X в количестве 10 mM в стерильном DMSO/клетки из маркированной чашки + SM1 и клетки + SM2, при этом SM1 - мелкая молекула 1, a SM2 - мелкая молекула 2. Чашки заново пополняют 10 mM мелких молекул X каждые 72 часа. Фенотипические пиктограммы, представленные на Фиг. 2, показывают изменение морфологии мезенхимных стволовых клеток фибробластов в сторону нейронных процессов уже через 3 дня, в то время как чашка с пробами для положительного контроля, содержащая форсколин, показала дифференцировку в морфологию нейронов после девятого дня (данные не показаны).

Пример 2

Прогностический планшет для прогнозирования противоракового свойства химического соединения, содержащий диагностическую платформу со множеством чашек (покрытых активными специфическими опухолевыми клетками-предшественниками или стволовыми клетками, взятыми у пациента, и активными мезенхимными стволовыми клетками-предшественниками), подвергается воздействию мелкой молекулы X в количестве 5-10 mM в стерильном DMSO/клетки из маркированной чашки + SM1, при этом SM1 - мелкая молекула 1, как показано на Фиг. 3. Чашки заново пополняют 5-10 mM мелких молекул X каждые 48 часов. В Таблице 3 перечислены среды для выращивания и среды для дифференцировки, доступные вместе с комплектом для исследований. Выполненные под микроскопом пиктограммы различных фаз, представлены на Фиг. 4, показывают умирающие раковые клетки опухоли молочной железы после 24-часового воздействия SM1.

1. Система для прогнозирования способности любой малой молекулы вызывать дифференцировку клеток и ее функциональности, в которой используемое количество испытуемой молекулы составляет между 5 и 20 mM и включает:

(а) диагностический планшет со множеством чашек, покрытых активными мезенхимными стволовыми клетками;

(b) среду для выращивания;

(с) множество сред, вызывающих дифференцировку;

(d) пробу для положительного контроля, подходящую для такой используемой вызывающей дифференцировку среды; и

(e) средство для прогноза функциональности испытуемой молекулы.

2. Система по п. 1, в которой используемое количество испытуемой молекулы растворено в диметилсульфоксиде (DMSO).

3. Система по п. 1, которая используется для прогнозирования способности малых молекул регенерировать/дифференцировать остеоциты, хондроциты, адипоциты, бета-клетки поджелудочной железы, кардиомиоциты, клетки эпителия и аналогичные им клетки из мезенхимных стволовых клеток.

4. Система по п. 1, в которой диагностический планшет содержит от 12 до 24 чашек.

5. Система по п. 1, в которой среда для выращивания в этом исследовании включает минимальную необходимую поддерживающую среду Dulbecco (DMEM) и эпидермальный фактор роста (EG F).

6. Система по п. 1, в которой среду, вызывающую дифференцировку, выбирают из группы, включающей среду для нейрогенной дифференцировки (С28015)(Promega), среду для дифференцировки адиноцитов (AL521)(Himedia), среду для дифференцировки эпителиальных клеток (ax0035)(Axol), диметилсульфоксид DMSO, среду для дифференцировки остеоцитов (AL522)(Himedia), среду для дифференцировки бета-клеток, среду для кардиомиогенной дифференцировки (A25042SA)(Gibco) и аналогичные им, в зависимости от прогнозируемой функциональности испытуемой молекулы.

7. Система по п. 6, в которой средство положительного контроля, используемого для перечисленных сред для дифференцировки, следует выбирать из группы, включающей форсколин (Tocris) для нейрогенной дифференцировки, аскорбиновую кислоту (Lonza) для адипогенной дифференцировки, вальпроевую кислоту (Sigma) для дифференцировки эпителиальных клеток, кверцетингидрат (TCI chemicals) как среду для дифференцировки остеоцитов, 5-йодотуберцидин (Sigma) как среду для дифференцировки бета-клеток и форболмиристатацетат (Sigma) для кардиомиогенной дифференцировки.

8. Способ проведения исследования с целью прогноза способности молекулы вызывать дифференцировку и ее функциональности, с использованием системы по п.1, включающий следующие стадии:

(а) воздействие на диагностический планшет испытуемой молекулой SM1 или молекулой SM2 в стерильном DMSO, SM1- малая молекула 1; SM2 - малая молекула 2;

(b) пополнение чашек на планшете 10mM испытуемой молекулы каждые 72 ч;

(с) мониторирование фенотипа клеток посредством прогностического метода путем сравнения их с пробами для положительного контроля, используемыми в исследовании;

(d) оценка генотипа клеток, дифференцированных под воздействием испытуемой молекулы, и сравнением их с контрольными пробами.

(e) оценка токсичности испытуемой молекулы на системе полученных от человека стволовых клеток; и

(f) получение LD50 (летальной дозы) для испытуемой молекулы на диагностической системе с использованием полученных от человека стволовых клеток.

9. Система для прогнозирования противоракового свойства химического соединения, содержащая систему по п.1 и включающая:

(а) диагностическую платформу со множеством чашек, покрытых активными взятыми у пациента специфическими клетками-предшественниками/стволовыми клетками опухоли и активными мезенхимными стволовыми клетками,

(b) платформу для выявления лекарственного вещества с использованием полученных от пациента специфических раковых клеток и опухолевой системы, выращенной на ксенотрансплантатах, полученных от пациента,

(с) поверхность для отбора лекарственного вещества, обладающую двумя свойствами: диагностировать соответствие молекул своему назначению и их токсичность.