Способ получения трансплантата для лечения лимбальной недостаточности

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению трансплантата для лечения лимбальной недостаточности. Способ включает механическую очистку аллогенной склеры, ее замачивание в 6% растворе перекиси водорода и выдерживание 4 часа (достигается разрушение тканевых пигментов, липидных структур и обеззараживание), затем промывают стерильной дистиллированной водой и замораживают при температуре -20°C 2 часа (что позволяет разрушить клеточные мембраны). Затем после дефростации замачивают в водном растворе гидроксида аммония 10% на 2 часа при температуре 40°C (что способствует вымыванию липидов, но не вызывает денатурацию коллагена). Далее отмывают стерильным физиологическим раствором, замачивают в 6% растворе перекиси водорода и выдерживают 6 часов. Далее промывают стерильным физиологическим раствором, разделяют на фрагменты шириной 2 мм и длиной 4 мм и вымачивают в физиологическом растворе в течение 20 минут. Фрагменты помещают в культуральные планшеты с 10 мл питательной среды DMEM/F12 с добавлением 15% эмбриональной сыворотки и добавляют 1 мл концентрированной клеточной суспензии ММСК и прогениторных клеток эпителия роговицы (0,5-0,6×10⁶ клеток/мл) и инкубируют в течение 5 суток. 1 табл., 2 пр.

 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, а также к биотехнологии, и предназначено для хирургического лечения частичной или тотальной лимбальной недостаточности в качестве трансплантата, создающего биологический барьер, препятствующий нарастанию конъюнктивы на роговицу, а также как источника мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) и прогениторных клеток эпителия роговицы, обладающих барьерной, противовоспалительной, иммуномодулирующей и регенеративной активностью.

Известен способ получения гомосклерального трансплантата для использования в офтальмологии «Способ получения гомосклерального трансплантата» (Патент РФ на изобретение №2627453 от 07.06.2016 г. дата гос. per. 08.09.2017 г.). Способ включает механическую очистку донорской склеры, двукратную последовательную обработку перекисью водорода, гидроксидом аммония, вымачивание, заморозку, нагревание, фрагментирование и хранение в этиловом спирте до использования.

Недостатком данного трансплантата является то, что он не применим для лечения лимбальной недостаточности, ввиду отсутствия в нем клеток, что требует его заселения лимбальными стволовыми клетками.

Известен способ лечения лимбальной недостаточности с использованием стволовых клеток путем аутотрансплантации участка лимба (зоны физиологического залегания стволовых клеток роговичного эпителия) различного размера взятого из здорового глаза методом ламеллярной кератэктомии. Данный способ описан рядом авторов (Шишкин М.М., Цыганова Т.А. Лимбальная трансплантация как профилактика рецидивов птеригиума // Вестник ОГУ. 2004. №S. С. 132) и применяется достаточно широко. Способ обеспечивает восстановление функционально-анатомической целостности пораженного лимба.

Недостатками данного способа являются высокая вероятность развития секторальной лимбальной недостаточности, а также воспалительных и дистрофических процессов на здоровом глазу из которого был изъят участок лимба, причем вероятность таких осложнений значительно возрастает с увеличением размеров изъятого участка. Так при тотальной лимбальной недостаточности данный метод не применим.

Задачи: создание комбинированного трансплантата, содержащего стволовые клетки эпителия роговицы и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), культивированные на склере, обладающего высокой биосовместимостью, иммуномодулирующей, регенеративной и противовоспалительной активностью, а также, уменьшение риска развития рецидива и воспалительных и дистрофических осложнений.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является анатомическое и функциональное восстановление лимбальной зоны у пациентов с ее поражением, а также создание комбинированного трансплантата, содержащего стволовые клетки эпителия роговицы и ММСК, культивированные на децеллюляризированной склере, обладающего высокой биосовместимостью, максимально очищенного от антигенов, который может быть использован для трансплантации как с целью восстановления дефекта лимбальной зоны, так и с иммуномодулирующей и репаративной целью. Это возможно благодаря использованию гомосклерального трансплантанта в качестве матрицы для культивирования прогениторных клеток эпителия роговицы и ММСК, получаемой по описанному нами ранее в патенте способу: «Способ получения гомосклерального трансплантата» (Патент РФ на изобретение №2627453 от 07.06.2016 г. дата гос. рег. 08.09.2017 г.).

Сущностью изобретения является то, что в качестве матрицы для культивирования прогениторных клеток эпителия роговицы и ММСК используют гомосклеральный трансплантат, полученный известным методом, который разделяют на фрагменты шириной 2 мм и длиной 4 мм и вымачивают в физиологическом растворе в течение 20 минут, затем фрагменты помещают в планшеты с 10 мл питательной среды DMEM/F12 с добавлением 15% эмбриональной сыворотки и добавляют 1 мл концентрированной клеточной суспензии ММСК и прогениторных клеток эпителия роговицы (0,5-0,6×10⁶ клеток/мл), полученную путем обработки культуральных планшетов трипсином + ЭДТА после предварительной 21-25 дневной инкубации донорских фрагментов лимба в питательной среде, после чего производят культивацию в СО₂ инкубаторе при 37°С 5 суток. На 5 сутки фрагменты гомосклерального трансплантата с культивированными в них ММСК и прогениторными клетками эпителия роговицы используют для трансплантации пациентам с частичной или полной лимбальной недостаточностью, а так же в качестве источника ММСК.

Апробация проведена на 23 глазах с диагнозом рецидивирующий птеригиум (секторальная лимбальная недостаточность) и на 18 глазах с диагнозом постожоговое бельмо роговицы (тотальная лимбальная недостаточность) в сочетании со сквозной кератопластикой (пересадкой роговицы). Результаты представлены в таблице.

Способ осуществляют следующим образом. Гомосклеральный трансплантат получают по способу, описанному Киселевым А.В. и соавт. (Патент РФ на изобретение №2627453 от 07.06.2016 г. дата гос. рег. 08.09.2017 г.), разделяют на фрагменты необходимого размера и вымачивается в стерильном физиологическом растворе в течение 20 минут для удаления этилового спирта, который используют в качестве консерванта для его хранения. Затем фрагменты гомосклерального трансплантата помещают в планшеты с 10 мл. питательной среды, обогащенной 15% эмбриональной сыворотки. В питательную среду вводят эмульгированные ММСК и прогениторные клетки эпителия роговицы, получаемые путем обработки донорского материала, консервированного по способу, описанному С. А. Борзеноком, Б.Э. Малюгиным, Х.Д. Тонаевой и соавт. в патенте РФ №2475218 от 20.02.2013 г., трипсином + ЭДТА, что позволяет снять адгезированные к пластику культивированные клетки и перевести их в эмульгированное состояние. Полученную эмульсию клеток концентрируют путем щадящего центрифугирования и добавляют в питательную среду к фрагментам гомосклерального трансплантата, после чего производят культивацию в СО₂ инкубаторе при 37°С 5 суток. На 5 сутки фрагменты гомосклерального трансплантата с культивированными в них ММСК и прогениторными клетками используют с целью трансплантации пациентам с частичной или полной лимбальной недостаточностью, а так же в качестве источника ММСК, обладающего местной иммуномодулирующей, противовоспалительной и репаративной активностью, путем его трансплантации в зоны повреждения тканей.

Пример №1. Пациентка женщина 42 года трехкратно оперировали по поводу рецидивирущего птеригиума 2 степени (заболевания развивающегося при секторальной лимбальной недостаточности). Пациентке была выполнена операция удаления рецидивирующего птеригиума путем его отсепаровки от подлежащих тканей - роговицы и склеры, и последующем иссечением. В зоне иссеченного птеригиума проводили восстановление барьерной функции лимба путем подшивания фрагмента гомосклерального трансплантата соответствующей формы, который получили путем культивации ММСК и прогениторных клеток эпителия роговицы на фрагментах гомосклерального трансплантата в условиях СО₂ инкубатора при 37°С в течение 5 суток по предложенному способу. На первые сутки после операции не наблюдалось воспалительных и аллергических реакций, эрозия роговицы практически полностью покрылась роговичным эпителием. Через 2 недели после операции были сняты швы с конъюнктивы и трансплантата. В сроки наблюдения 6 месяцев реакции на трансплантат не наблюдалось, он уплостился и пророс соединительной тканью. При явке через 2 года рецидива птеригиума не наблюдается, глаз спокоен.

Пример №2. Пациентка, женщина 37 лет, двухкратно оперировали по поводу симблефарона нижнего века, сочетанного с птеригиумом после перенесенного ожога нижнего свода конъюнктивы и части роговицы секундным клеем. Пациентке была выполнена операция устранения симблефарона и рецидивирующего птеригиума с восстановлением лимбальной зоны в пределах ложа иссеченного птеригиума предложенным трансплантатом, соответствующей формы, приготовленного по описанному способу. На первые сутки после операции не наблюдалось воспалительных и аллергических реакций. Через 2 недели после операции были сняты швы с конъюнктивы и трансплантата. В сроки наблюдения 6 месяцев реакции на трансплантат не наблюдалось. При явке через 1,5 года рецидива птеригиума и симблефарона не наблюдается, глаз спокоен.

Способ получения трансплантата для лечения лимбальной недостаточности заключается в том, что используют гомосклеральный трансплантат, который готовят из аллогенной склеры, при этом после механической очистки ее замачивают в 6% растворе перекиси водорода и выдерживают 4 часа (достигается разрушение тканевых пигментов, липидных структур и обеззараживание), затем промывают стерильной дистиллированной водой и замораживают при температуре -20°C 2 часа (что позволяет разрушить клеточные мембраны), затем после дефростации замачивают в водном растворе гидроксида аммония 10% на 2 часа при температуре 40°C (что способствует вымыванию липидов, но не вызывает денатурацию коллагена), после отмывают стерильным физиологическим раствором, замачивают в 6% растворе перекиси водорода и выдерживают 6 часов, затем промывают стерильным физиологическим раствором, затем разделяют на фрагменты шириной 2 мм и длиной 4 мм и вымачивают в физиологическом растворе в течение 20 минут, затем фрагменты помещают в культуральные планшеты с 10 мл питательной среды DMEM/F12 с добавлением 15% эмбриональной сыворотки и добавляют 1 мл концентрированной клеточной суспензии ММСК и прогениторных клеток эпителия роговицы (0,5-0,6 × 10⁶ клеток/мл) и инкубируют в течение 5 суток.