Средство для стимуляции роста сельскохозяйственных культур

Изобретение относится к биотехнологии. Предложено средство на основе штамма бактерий Bacillus subtilis Ч-13, депонированного под регистрационным номером ВНИИСХМ Д-606 и обладающего способностью продуцировать растительные гормоны роста – ауксины и витамины группы В. Изобретение обеспечивает расширение арсенала биопрепаратов, стимулирующих рост сельскохозяйственных культур. 9 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и представляет собой применение известного штамма бактерий Bacillus subtilis Ч-13 в качестве средства для стимуляции роста сельскохозяйственных культур.

Известен патент РФ №2327737 с пр. 01.08.2006 г. на изобретение «Штамм бактерий Bacillus megaterium, мобилизующий фосфор и кремний из объектов литосферы и устойчивый к полигексаметиленгуанидину», МПК C12N 1/20, C05F 11/08, C12R 1/11, опубликовано 27.06.2008 г.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и геохимии. Штамм Bacillus megaterium var. phosphaticum BKM В-2357Д способен выщелачивать фосфор и кремний из объектов литосферы и устойчив к полигексаметиленгуанидину. Штамм может быть использован для получения бактериального препарата, повышающего приживаемость в почве и урожайность сельскохозяйственных культур, для рекультивации техногенно загрязненных земель.

Известен патент РФ №2558291 с пр. 24.12.2013 г. на изобретение «Полифункциональное средство для растениеводства», МПК C12N 1/20, A01N 63/00, опубликовано: заявка 27.062015 г., опубликовано 27.07.2015 г.

Описанный штамм споровых бактерий Bacillus megaterium 501 GR обладает ростостимулирующим эффектом, улучшает фосфорное питание растений, а также способствует биоремедиации загрязненных пестицидами почв. Использование штамма Bacillus megaterium 501 GR позволяет повысить продуктивность растений, а также защитить их от фитопатогенных грибов и микроорганизмов, вызывающих заболевания корней.

Известен патент РФ №2649359 с приоритетом от 13.12.2016 г. на изобретение «Штамм эндофитных бактерий Bacillus megaterium V3 в качестве средства для улучшения питания, ускорения роста и увеличения продуктивности зерновых, овощных, технических и древесных культур» МПК A01N 63/00, C12N 1/20, опубликовано 02.04.2018 г.

Высокая ростостимулирующая активность штамма Bacillus megaterium V3 вызвана способностью создавать с растением растительно-микробную систему путем колонизации эндофитными бактериями корневой системы и внутренних тканей растения.

Штамм может быть использован в составе различных микробных препаратов, для эффективного использования которых титр бактерий Bacillus megaterium V3 должен составлять 10⁵-10⁹ кл/мл культуральной жидкости.

Известны также зарубежные публикации, в которых описано использование бактерий вида Bacillus megaterium в качестве средства стимуляции роста растений и/или их корней (например, в патенте KR 20100963774 В1 от 14.06.2010 г. на штамм Bacillus megaterium KNUC 251 или в заявке США20130014434, опубликованной 17.01.2013 г., в которой питательная композиция для корней пересаживаемого растения содержит в числе других микроорганизмов бактерии Bacillus megaterium).

Известна группа изобретений «Способ предпосевной обработки семян овощных культур и способ получения препарата для предпосевной обработки семян овощных культур» по патенту РФ №2140138 с приоритетом от 13.11.98 г., авторов Чеботаря В.К., Быковой Н.В., Темновой О.В., Орловой Н.А. и Хотяновича А.В. Эти способы осуществляются с помощью биофунги-цидного препарата, содержащего штамм бактерий Bacillus subtilis Ч-13. Изобретения позволяют повысить эффективность защиты овощных культур от фитопатогенных грибов при предпосевной обработки семян.

Известно также изобретение «Средство для защиты зерновых сельскохозяйственных культур, подсолнечника, винограда от фитопатогенных микроорганизмов, а овощных культур от фитопатогенных бактерий» по патенту РФ №2259397 с пр. от 02.04.2003 г., авторы Чеботарь В.К., Быкова Н.В., Темнова О.В., Орлова Н.А., Хотянович А.В., МПК C12N 1/20, C12R 1:125, А01С 1/06, опубликовано 27.08.2005 г.

Штамм бактерий Bacillus subtilis Ч-13 используют при производстве микробиологического удобрения для увеличения продуктивности овощных, зерновых и технических культур в торфяной форме «Бисолби», сухой форме «БисолбиФит» и жидкой форме «Экстрасол» (Свидетельство о гос.регистрации №0680-07-2018-216-0-0-0-1 от 29.03.2007).

Известно изобретение «Способ получения биоудобрений» по патенту РФ №2241692 с приоритетом от 11.10.2002 г. авторов Чеботаря В.К., Козакова А.Е., Ерофеева СВ., МПК C05G 1/0, C12N 1/20, C12R 1:125, опубликовано 10.12.2004 г.

Этот способ заключается в совмещении гранулированных минеральных удобрений с микробной биомассой в виде бактериального препарата на основе штамма бактерий «Bacillus subtilis Ч-13», обладающего антагонистическими свойствами к фитопатогенной микрофлоре в почве, Совмещение производят путем опудривания или опрыскивания бактериальным препаратом поверхности гранул минеральных удобрений, либо в виде жидкой фракции в составе влагозащитных композиций минеральных удобрений.

При этом кроме тотального санирующего эффекта от фитопатогенной микрофлоры, происходит обогащение гранул минеральных удобрений биопрепаратом, что способствует более эффективному усвоению растениями минеральных веществ из этих удобрений, т.к. минеральные элементы в составе обработанных биопрепаратом гранул находятся в более стабильном физико-химическом состоянии, менее подвержены вымыванию и переходу в газообразное состояние (более всего это касается минерального азота).

Известно изобретение «Способ получения биоминеральных удобрений и мелиорантов (варианты)» по патенту РФ №2512277 с приоритетом от 10.10.2012 г., авторов Чеботаря В.К. и Ерофеева СВ., МПК C05F 11/08, опубликовано 10.04.2014 г.

Способ предусматривает совмещение сухих или жидких минеральных удобрений (мелиорантов) с микробиологическим препаратом на основе агрономически полезных микроорганизмов: в 1-м варианте - в виде сухого мелкодисперсного порошка с титром 10²-10⁵ кл/г из расчета 2-6 кг/т, а во 2-м варианте - в жидком виде с титром 10⁴-10⁷ кл/г, который наносят на сухое минеральное удобрение или мелиорант путем мелкодисперсного распыления, либо вносят в жидкое минеральное удобрение, из расчета 1-4 кг/т

Это увеличивает коэффициент использования питательных веществ из удобрений и мелиорантов (КИУ) на 10-50%, что приводит к увеличению продуктивности сельскохозяйственных растений на 12-40%.

Известно изобретение «Штамм бактерий Bacillus subtilis 8А в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов» по патенту РФ №2495119 с приоритетом от 29.11.2012 г., авторов Чеботаря В.К. и др., МПК C12N 1/20, C12N 1/125, A01N 63/00, опубликовано 10.10.2013 г. (прототип).

Указанный штамм обладает высокой фунгицидной и бактерицидной активностью. Установлена также высокая ростостимулирующая активность штамма Bacillus subtilis 8А и биопрепарата на его основе, что приводит к повышению урожайности растений.

Задачей изобретения является выявление нового штамма или новых свойств у известного штамма, пригодного для использования в сельском хозяйстве в качестве средства для стимуляции роста и увеличения продуктивности овощных и зерновых культур, а также позволяющего расширить арсенал подобных средств.

Указанная задача решается за счет того, что в качестве средства для стимуляции роста сельскохозяйственных культур применен штамм бактерий Bacillus subtilis Ч-13, у которого выявлена и экспериментально подтверждена способность стимулировать рост сельскохозяйственных культур за счет продуцирования на корнях растений растительных гормонов роста и витаминов.

Штамм ризосферных споровых бактерий «Bacillus subtilis Ч-13» был выделен из черноземной почвы Республики Молдова и депонирован под регистрационным номером ВНИИСХМ Д-606 от 10.09.1998 г. в группе эпифитных микроорганизмов.

Штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и фи-зиолого-биохимическими признаками.

Клетки имеют форму правильных палочек с закругленными концами и монополярным перитрихиальным расположением жгутиков. Размер клеток 1,0×2,0 мкм. Штамм образует споры, расположенные в центре клетки, положительно окрашивается по Граму. Через 24 часа роста на жидкой питательной среде наблюдалось накопление поли-β-оксибутирата. Рост в жидкой и полужидкой питательной среде микроаэрофильный, метаболизм дыхательный и бродильный. На мясо-пептонном агаре образует сухие колонии кремового цвета, пастообразной консистенции с неровными изрезанными краями. Диаметр колоний 20-40 мм. Оптимальная температура для роста 37°С. При температуре более 45°С и менее 15°С рост замедленный. Оптимальное значение рН среды 6,8, рост происходит также при рН от 4,5 до 8,0.

Штамм Bacillus subtilis Ч-13 гидролизует казеин, желатин, крахмал и лакмусовое молоко. Лакмус при этом обесцвечивался. Штамм обладает сильной каталазной активностью и не обладает липазной активностью. Штамм способен расти при температуре 40°С, наличии 7% NaCl и 0,001% лизоцима.

В качестве единственного источника углерода штамм использует с образованием кислоты арабинозу, ксилозу, маннит, глюкозу, галактозу, фруктозу, мальтозу, сорбит, глицерин, декстрин, крахмал и с образованием щелочи рамнозу и дульцит.

Штамм бактерии Bacillus subtilis Ч-13 выращивают на доступной питательной среде, состоящей из мелассы и кукурузного экстракта, что является преимуществом по сравнению, например, со способом культивирования псевдомонад, в котором используют дефицитные и дорогие питательные среды.

В соответствии с «Методическими указаниями Минздрава СССР» №2620-82 и №4263-87 экспериментально определено, что штамм Bacillus subtilis Ч-13 является невирулентным, нетоксичным и нетоксигенным, относится к 4-му классу опасности.

Штамм ризосферных споровых бактерий «Bacillus subtilis Ч-13» на основании современных методов может быть идентифицирован также как Bacillus amiloliqufaciens (Borriss R.,Chen X.H., Rueckert С, Blom J., Becker A., et al. 2011. Relationship of Bacillus amyloliquefaciens clades associated with strains DSM 7T and FZB42T: a proposal for Bacillus amyloliquefaciens subsp.amyloliquefaciens subsp.nov. and Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum subsp.nov. based on complete genome sequence comparisons. Int J Syst Evol Microbiol 61: 1786-1801) и Bacillus velezensis (Christopher A. Dunlap,Soo-Jin Kim, Soon-Wo Kwon and Alejandro P. Rooney. Bacillus velezensis is not a later heterotypic synonym of Bacillus amyloliquefaciens; Bacillus methylotrophicus, Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum and 'Bacillus oryzicola' are later heterotypic synonyms of Bacillus velezensis based on phylogenomics. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology/ 2016, 66, 1212-1217 DOI 10.1099 /ijsem. 0.000858).

Выявлена и экспериментально установлена способность штамма Bacillus subtilis Ч-13 продуцировать гормоны роста растений - ауксины и витамины в питательной среде для выращивания бактерий.

Продукция фитогормонов является одним из главных механизмов стимуляции роста растений различными ассоциированными с ними бактериями, включая виды рода Bacillus (Perez-Garcia A, Romero D, de Vicente A. 2011. Plant protection and growth stimulation by microorganisms: biotechnological applications of Bacilli in agriculture. Curr Opin Biotechnol.:22:187-193). Исследования с использованием ВЭЖХ показали, что супернатант (надосадочная жидкость - жидкая фаза, остающаяся после того, как нерастворимые вещества осаждаются в процессе центрифугирования или осаждения).

Bacillus subtilis Ч-13, выращиваемый на среде с триптофаном, содержит индол-3-уксус-ную кислоту (ИУК) и несколько родственных ей соединений В.К. Чеботарь, Н.М.Макарова, А.И.Шапошников, Л.В.Кравченко. Антифун-галъные и фитостимулирующие свойства ризосферного штамма Bacillus subtilis Ч-13- продуцента биопрепаратов. 2009. Прикладная биохимия и микробиология, т. 45, №4, с. 465-469). ИУК является самым биологически активным членом семейства ауксинов. Предполагается, что действие бактериальной ИУК основано на увеличении общей поглощающей площади корней, что ведет к увеличению поглощения воды и питательных веществ и стимулирует рост растений (Spaepen S, Vanderleyden J, Remans R. 2007. Indole-3-acetic acid in microbial and microorganism-plant signaling. FEMS Microbiol Rev 31:425-448).

При помощи реакции Сальковского (Brick, J. M., Bostock, R. M., and Silvers tone, S. E. 1991. Rapid in situ assay for indole acetic acid production by bacteria immobilized on nitrocellulose membrane. Applied Environment Microbiology, 57, 535-538) определяли содержание ауксина в культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis Ч-13. Для этого штамм выращивали в жидкой среде 1/20 TSB (производитель Sigma,USA), с добавлением L-триптофана 500 кг/мл, при 200 об/мин, при комнатной температуре 2-е суток. Полученную суспензию центрифугировали при скорости 4000 об/мин в течение 2 мин. Суперна-тант использовали для анализа. Для предварительного определения содержания индольных соединений (в том числе, бактериальных ауксинов) использовали реакцию Сальковского. Исследуемый образец смешивали 1:1 с реактивом Сальковского (50 мл 35% хлорной кислоты и 1 мл 0,5М сернокислого железа), оставляли на 30-40 минут, после чего измеряли оптическую плотность при 530 нм. В качестве контроля использовали 1/20 TSB, с добавлением L-триптофана 500 мкг/мл, в качестве положительного контроля - 1/20 TSB, с добавлением гетероауксина 100 мкг/мл. Продуцирование бактериальных ауксинов в питательной среде для выращивания бактерий у штамма бактерий Bacillus subtilis Ч-13 составило 3-5 мкг/мл.

Витамины из группы В оказывают значительное влияние на растения, ускоряют обмен веществ, укрепляют корни, под их воздействием растения лучше растут и развиваются. Витамины - важные микропитательные вещества, продуцируемые многими растениями и бактериями (Palacios OA.,Bashan Y, de-Bashan LE. 2014. Proven and potential involvement of vitamins in interactions of plants with plant growth-promoting bacteria: an overview. Biol. Fertil. Soils 50: 415-432).

Главная физиологическая роль витаминов заключается в том, что они служат кофакторами в многочисленных метаболических путях, а также являются антиоксидантами.

Витамин В1 (тиамин) помогает растениям пережить стрессовые условия, а также стимулирует их рост. Витамин В3 (никотиновая кислота и его вторая форма - никотинамид) отлично подходит для реанимации растений. Витамин В6 (или пиридоксин) стимулирует иммунную систему растений. Витамин В12 (цианокобаламин) участвует в выработке хлорофилла, активизирует рост и обмен веществ растений.

Анализ культуральной жидкости штамма бактерий Bacillus subtilis Ч-13, выращенного в жидкой среде 1/20 TSB (72 часа при 28°С), показал наличие в ней витамина В3 (никотиновой кислоты в количестве 0,0475 мкг/мл, никотинамида - 0,0146 мкг/мл) и витамина В6 (пиридоксина) в количестве 0,072 мкг/мл.

Анализ культуральной жидкости штамма бактерий Bacillus subtilis Ч-13, выращенного на картофельно-декстрозной среде (PDB,Sigma,USA) в течение 7 дней при 30°С в стационарной фазе, выявил в ней наличие витамина В1 (тиамина) в количестве 0,0091 мкг/мл и витамина В12 (цианокобаламина) в количестве 0,0045 мкг/мл.

Таким образом, результаты опытов с культуральной жидкостью штамма бактерий Bacillus subtilis Ч-13, подтверждают наличие в ней витаминов группы В, а именно: В1, В3, В6 и В12, которые способны оказывать влияние на иммунитет растений, их устойчивость к стрессовым факторам и в конечном счете - на продуктивность растений.

Экспериментально установлено, что штамм бактерий Bacillus subtilis Ч-13 обладает ростостимулирующим эффектом по отношению к различным сельскохозяйственным культурам

Анализ ростостимулирующей активности бактерий: штамма Bacillus subtilis Ч-13 и штамма - прототипа Bacillus subtilis 8А проводили в лабораторном опыте по оригинальной методике с использованием растений салата сорта «Ералаш» и яровой пшеницы сорта «Тризо». Для этого семена растений сначала стерилизовали в течение 2-х минут в 70% этаноле и отмывали в стерильной водопроводной воде. Затем семена замачивали на 20 мин в суспензии бактерий с титром клеток 10⁷ КОЕ/мл и раскладывали в стерильные влажные камеры по 25 шт. в 4-х кратной повторности. В контроле семена замачивали в стерильной водопроводной воде. Далее семена инкубировали в фитотроне 96 ч при температуре (25+1)°С.После инкубирования измеряли длину корешков и побегов, а ростостимулирующую активность тестируемых штаммов бактерий рассчитывали по отношению к контрольным проросткам. Результаты представлены в таблицах 1,2.

Из данных, приведенных в Таблице 1 видно, что изучаемый штамм бактерий Bacillus subtilis Ч-13 обладает более сильной ростостимулирующей активностью по отношению к проросткам салата по сравнению со штаммом -прототипом Bacillus subtilis 8А, увеличивая среднюю длину корня в 1,2 раза, а среднюю длину зеленой части ростка в 1,18 раза.

Из данных, приведенных в Таблице 2 видно, что изучаемый штамм бактерий Bacillus subtilis Ч-13 обладает более сильной ростостимулирующей активностью по отношению к проросткам пшеницы по сравнению со штаммом - прототипом Bacillus subtilis 8А, увеличивая среднюю длину корня в 1,4 раза, а среднюю длину зеленой части ростка в 1,37 раза.

Экспериментально также установлено, что штамм Bacillus subtilis Ч-13 обладает фитостимулирующим эффектом по отношению к различным сельскохозяйственным культурам, в частности, к ячменю, кресс-салату и кукурузе.

Были проведены микровегетационные опыты, в которых определяли влияние бактерий Bacillus subtilis на развитие корневой системы и зеленой массы растений ярового ячменя сорта «Вакула», на биомассу кресс-салата сорта «Весенний» и на биомассу кукурузы сорта «Добрыня».

Опыты по влиянию бактерий штамма Bacillus subtilis Ч-13 и бактерий штамма - прототипа Bacillus subtilis 8А на развитие корней и биомассу ячменя, в зависимости от концентрации изучаемых штаммов проводили в вегетационном боксе с 16 часовым световым днем, температурой 22°С и интенсивностью света 5000-6000 лк. В качестве субстрата использовали предварительно просеянный и отмытый от глинистых и иных примесей кварцевый песок с фракцией 0,6-1,0 мм. Песок стерилизовали в течение часа при 1,5 атм., остужали и набивали сосуды по весу. Для полива и питания растений применяли минеральный раствор PNS содержащий (мг/л): Ca(NO₃)×4H₂O - 972; MgSO₄×7H₂O - 616; NaNO₃ - 140; KH₂PO₄ - 170; NH₄NO₃ - 55; Fe-EDTA - 20; ZnSO₄×7H₂O - 1,7; B4Na₂O₇×7H₂O - 3,35; CuSO₄×5H₂O - 0,25 и Na₂MoO₄×2H₂O - 0,12 мг/л.

Инокуляцию проростков проводили ночной (20-ти часовой) культурой штаммов бактерий, выращенных на жидкой среде LB следующего состава (г/л): триптон -10,0, дрожжевой экстракт -5,0, Mg₂SO₄ -2,5, рН=7,2. Для этого семена ячменя помещали в чашку Петри и замачивали на 30 мин. в рабочем растворе бактериальной суспензии с известным титром, после чего высаживали в песок. На сосуд высаживали по 7 семян ячменя, замоченных в суспензии изучаемых штаммов в течение 30 мин., без предварительного проращивания. Растения ячменя выращивали в течение 16 дней, после чего корневую систему отмывали от песка и анализировали общую длину корней и биомассу растений в программе Image J 1.50b. Для анализа из каждого варианта отбирали по 5 типичных растений. Результаты опытов представлены в Таблице 3.

Таким образом, из данных Таблицы 3 видно, что растворы бактериальной суспензии Bacillus subtilis Ч-13 с титром 105-107 КОЕ/мл оказывают существенное влияние на общую длину зародышевых корней ячменя с. «Вакула», увеличивая ее на 35-54% по сравнению с контролем, а также на биомассу растений, увеличивая ее на 20-32% по сравнению с контролем. При этом штамм Bacillus subtilis Ч-13 оказывает большее стимулирующее влияние на общую длину зародышевых корней ячменя по сравнению со штаммом-прототипом Bacillus subtilis 8А, используемым в растениеводстве в качестве средства для повышения продуктивности растений.

То есть данные Таблицы 3 подтверждают на примере растений ярового ячменя сорта «Вакула» более эффективное ростостимулирующее влияние штамма Bacillus subtilis Ч-13 по сравнению со штаммом-прототипом Bacillus subtilis 8А.

Для определения ростостимулирующей активности бактерий штамма Bacillus subtilis Ч-13 и штамма-прототипа Bacillus subtilis 8А на растениях кресс-салата сорта «Весенний» были приготовлены 0,1%, 1% и 10% растворы бактериальных суспензий исследуемых штаммов с изначальным титром бактерий 1,0×10⁹ КОЕ/мл. Семена кресс-салата помещали в стерильные пробирки, заливали приготовленными растворами исследуемых штаммов и замачивали на 10 мин. В контроле семена замачивали в стерильной водопроводной воде. Подготавливали «влажные камеры»: в стерильные чашки Петри раскладывали фильтровальную бумагу и увлажняли стерильной водопроводной водой объемом 5 мл на камеру. Семена кресс-салата стерильным пинцетом помещали на поверхность влажных камер по 25 штук на чашку (как минимум в 3-х кратной повторности). Влажные камеры помещали в фитотрон и инкубировали 5 суток при t° 28°С, после чего измеряли длину побега и корня проростков. Полученные данные обрабатывали с помощью программы Excel.

Результаты опыта представлены в Таблице 4.

Из данных, представленных в Таблице 4, видно, что 0,1%, 1% и 10% растворы бактериальной суспензии Bacillus subtilis Ч-13 с изначальным титром бактерий 1,0x109 КОЕ/мл оказывали эффективное влияние на длину корней кресс-салата, увеличивая их на 40,9-73,1% по сравнению с контролем, а также большее стимулирующее влияние на длину корней кресс-салата по сравнению с влиянием штамма-прототипа Bacillus subtilis 8А (увеличение на 13,3-46,1%). Кроме того, 0,1-10% растворы бактериальной суспензии Bacillus subtilis Ч-13 повлияли на длину побегов кресс-салата, длина которых увеличилась на 9,1-13,4% по сравнению с контролем, что больше, чем влияние бактериальной суспензии штамма-прототипа Bacillus subtilis 8А (увеличение на 0,5-6,6%).

Таким образом данные Таблицы 4 подтверждают на примере кресс-салата сорта «Весенний» более эффективное ростостимулирующее влияние штамма Bacillus subtilis Ч-13 по сравнению со штаммом-прототипом Bacillus subtilis 8А.

Для определения ростостимулирующей активности бактерий штамма Bacillus subtilis Ч-13 и штамма-прототипа Bacillus subtilis 8А на растениях кукурузы сорта «Добрыня» были приготовлены 0,1%, 1% и 10% растворы бактериальных суспензий исследуемых штаммов с изначальным титром бактерий 1,0×10⁹ КОЕ/мл. Семена кукурузы помещали в стерильные стаканчики, заливали приготовленными растворами исследуемых штаммов и замачивали на 10 мин. В контроле семена замачивали в стерильной водопроводной воде. Подготавливали «влажные камеры»: в стерильные чашки Петри раскладывали фильтровальную бумагу и увлажняли стерильной водопроводной водой объемом 5 мл на камеру. Семена кукурузы стерильным пинцетом помещали на поверхность влажных камер по 10 штук на чашку (как минимум в 3-х кратной повторности). Влажные камеры помещали в фитотрон и инкубировали 5 суток при t° 28°С, после чего измеряли длину побега и корня проростков. Полученные данные обрабатывали с помощью программы Excel.

Результаты опыта представлены в Таблице 5.

Из данных, представленных в Таблице 5, видно, что 0,1%, 1% и 10% растворы бактериальной суспензии Bacillus subtilis Ч-13 с изначальным титром бактерий 1,0x10⁹ КОЕ/мл оказывали значительное влияние на длину побегов кукурузы, увеличивая их на 26-36,8% по сравнению с контролем, а также оказывали большее стимулирующее влияние на длину побегов кукурузы по сравнению с влиянием штамма-прототипа Bacillus subtilis 8А (увеличение на 13,3-23,5%). Результаты опытов показали, что 0,1-10% растворы бактериальной суспензии Bacillus subtilis Ч-13 существенно повлияли на длину корней кукурузы, длина которых увеличилась на 17,7-33,2% по сравнению с контролем, что было больше, чем влияние бактериальной суспензии штамма-прототипа Bacillus subtilis 8А (увеличение на 12,1-16,6%).

Таким образом данные Таблицы 5 подтверждают на примере кукурузы сорта «Добрыня» более эффективное ростостимулирующее влияние штамма Bacillus subtilis Ч-13 по сравнению со штаммом-прототипом Bacillus subtilis 8А.

Проведены полевые опыты по влиянию микробиологического препарата Экстрасол, содержащего штамм бактерий Bacillus subtilis Ч-13, на урожайность ярового ячменя, озимой пшеницы, подсолнечника, гороха и картофеля.

Полевой производственный опыт по изучению сравнительного действия микробиологического удобрения Экстрасол на основе штамма Bacillus subtilis Ч-13 со стандартным протравителем семян Виал Траст проводился на поле ОАО «Агропромышленное объединение Элеком» Ромодановского р-на Республики Мордовия. Изучаемая культура - яровой ячмень, сорт «Зазерский 85», ценный пивоваренный сорт белорусской селекции.

Опыт проводили по следующей схеме: в контроле - применение протравителя Виал Траст, а в опыте - дополнительно к протравителю осуществляли обработку семян ячменя Экстрасолом в дозе 0,25 л/т + опрыскивание посевов ячменя Экстрасолом в дозе 1 л/га.

За день до посева семена ячменя обрабатыли Экстрасолом согласно официально рекомендованным нормам. Семена обрабатывали в затененном месте при их полном смачивании рабочим раствором. Рабочий раствор готовили в день обработки.

Обработанные семена высушивали в тени и на следующий день производили посев в норме 5 млн шт/га и или 230 кг/га в физическом весе.

Опрыскивание посевов ячменя Экстрасолом проводили в рекомендованные сроки в вечерние часы при безветренной погоде.

Удобрение общим фоном вносили весной под культивацию в дозе N34, т.е. 0,1 т/га аммиачной селитры в физическом весе.

Результаты опыта представлены в Таблице 6.

Из представленных в Таблице 6 данных следует, что микробиологическое удобрение Экстрасол на основе штамма Bacillus subtilis Ч-13 оказывает влияние как на повышение продуктивности биомассы соломы, так и на увеличение урожайности зерна ярового ячменя сорта «Зазерский 85». При двукратном применении Экстрасола урожайность зерна повышалась на 16,4%, а биомасса соломы повышалась на 20,6%. Более высокий прирост урожайности ярового ячменя отмечен в варианте с двукратной обработкой семян и посевов микробиологическим удобрением Экстрасолом - 0,48 т/га.

Полевые производственные опыты по изучению эффективности действия удобрения Экстрасол на основе штамма Bacillus subtilis Ч-13 на урожайность озимой пшеницы сортов Ростовчанка-5, Вита, Прикумская 141, Украинка одесская, Дока, Одесская 200, Иришка, Батько проводились в хозяйствах, расположенных в различных сельскохозяйственных зонах Ставропольского края: крайне засушливой, засушливой и неустойчивого увлажнения, где Экстрасолом обрабатывали семена и растения озимой пшеницы по вегетации. В качестве контроля использовали вариант, где обработка Экстрасолом не проводилась.

Результаты опытов представлены в Таблице 7.

Из представленных в Таблице 7 данных следует, что применение микробиологического удобрения Экстрасол на основе штамма Bacillus subtilis Ч-13 для обработки семян и растений озимой пшеницы по вегетации в заслушли-вых сельскохозяйственных зонах Ставропольского края и г. Краснодар оказывает влияние на повышение урожая зерна озимой пшеницы на 2,5-6,2 ц/га или на 5,4-23% по сравнению с контролем.

Полевые производственные опыты по изучению эффективности действия удобрения Экстрасол на основе штамма Bacillus subtilis Ч-13 на урожайность гороха сортов Эйфель, Мультик, Мадонна, Феникс и подсолнечника гибрида ПР63А90 и гибрида ПР64А15 проводились в хозяйствах, расположенных в различных сельскохозяйственных зонах Ставропольского края: засушливой, неустойчивого увлажнения и достаточного увлажнения. В качестве контроля использовали вариант, где обработка Экстрасолом не применялась. Результаты опытов представлены в Таблице 8.

Из представленных в Таблице 8 данных следует, что применение микробиологического удобрения Экстрасол на основе штамма Bacillus subtilis Ч-13 для обработки семян и растений по вегетации гороха и подсолнечника в различных сельскохозяйственных зонах Ставропольского края увеличивало урожай зерна гороха на 2-7 ц/га или на 7,1-33,3% по сравнению с контролем и урожай зерна подсолнечника на 2-3 ц/га или на 10,8-14%.

Полевой производственный опыт испытаний микробиологического препарата Экстрасол на основе штамма Bacillus subtilis Ч-13 проводился на картофеле сорт «Удача» в ООО «Багаевск-Агро» Багаевского района Ростовской области. Обработка почвы: после предшественника безотвальная вспашка на глубину 33 см, выравнивание; весной - культивация, рыхление. Орошение: в среднем через 5-6 дней (из расчета 4 м³/м² за сезон). Внесение минеральных удобрений: осенью - азофоска 500 кг/га; весной - азофоска 100 кг/га, аммиачная селитра 100 кг/га; в период вегетации одновременно с поливом внекорневая подкормка аммиачной селитрой 100 кг/га.

Применение Экстрасола в опытном варианте происходило на фоне всех защитных мероприятии против болезней, вредителей и сорняков, которые проводились хозяйством на данном поле картофеля.

Обработка клубней: протравитель с фунгицидно-инсектицидными свойствами Престиж 1 л/т + гуминовое удобрение Лигногумат 0,2 кг/га {Справочник агронома по защите сельскохозяйственных культур от вредителей, болезней и сорняков на 2016 год. - Азов: ООО «АзовПечать», 2016, 260 с. ) при посадке для защиты клубней от почвообитающих болезней и вредителей.

Борьба с сорняками: Ураган Форте, BP (500 г/л глифосата к-ты) - 2,5-3 л/га в осенний период после предшественника, Титус СТС (250 г/кг римсульфурона) двукратно: 30 г/га по 1-й волне сорняков, 20 г/га - по 2-й волне.

Борьба с болезнями: Ридомил Голд МЦ, ВДГ (640 г/кг манкоцеб + 40 г/кг мефеноксам) 2,5 кг/га опрыскивание (трехкратно): 1-е профилактическое при высоте ботвы 10-12 см, затем опрыскивание Ширлан, СК (500 г/л флуазинама) 0,3-0,4 л/га, в фазе смыкания рядков, интервал 7-10 дней.

Борьба с вредителями: Актара, ВДГ (250 г/кг тиаметоксам) 60 г/га, опрыскивание в фазе образования соцветий против личинок колорадского жука I-IV возрастов - однократно.

Схема опыта: Обработка клубней в картофелесажалке при посадке с нормой расхода Экстрасола 1 л/т (10% рабочий раствор). Опрыскивание картофеля по вегетации в баковых смесях с фунгицидами с нормой расхода Экстрасола 2 л/га (1% раб. раствор): первое опрыскивание в фазе бутонизации - начала цветения - (Ширлан 0,4 л/га+Экстрасол 2 л/га); второе опрыскивание перед увяданием (отмиранием) ботвы - (Ридомил Голд МЦ, ВДГ 2,5 кг/га+Экстрасол 2 л/га);

Эталон. Мероприятия по защите картофеля от сорняков, болезней и вредителей по схеме, принятой в хозяйстве.

Результаты опыта представлены в Таблице 9.

Таким образом, из представленных в Таблице 9 данных следует, что трехкратное применение биологического препарата Экстрасол на основе штамма Bacillus subtilis Ч-13 при выращивании картофеля (обработка семенных клубней и две обработки по вегетации в период активного роста надземной части растений) в комплексе с защитными мероприятиями позволило увеличить урожайность культуры на 26 ц/га и получить прибавку урожая в размере 10% в сравнении с контрольным вариантом (схема обработок, принятая в хозяйстве).

При визуальных наблюдениях отмечено, что на опытном участке с применением Экстрасола всходы появились на 1-2 дня раньше; быстрее завершилось цветение; средняя высота кустов была на 5,6% меньше; не было полегания стеблей у основания куста как в эталоне; клубней образовалось на 27% меньше, но они были в среднем на 42% крупнее, чем в эталоне; на 5 дней позже началось усыхание ботвы. На хорошем агрофоне в комплексе с защитными мероприятиями препарат Экстрасол на основе штамма Bacillus subtilis Ч-13 обеспечил получение прибавки урожая картофеля благодаря повышению устойчивости растений к неблагоприятным погодным условиям.

Ниже приведены примеры изготовления микробиологическ препаратов на основе штамма Bacillus subtilis Ч-13.

Пример 1.

Выращивают культуру бактерий Bacillus subtilis Ч-13 в жидкой стерильной питательной среде, содержащей:

- 4% пшеничных отрубей и

- 0,3% мела,

на качалке или в ферментере при 33 ± 1°С в течение 24-36 часов до достижения в культуральной жидкости титра не менее 1×10⁹ клеток/мл и содержания спор не менеее 90%. Затем получают жидкую форму микробиологического препарата следующим путем: смешивают 20% культуральной жидкости и 80% воды (титр препарата - не менее 1,5×108 кл/мл).

Пример 2.

Выращивают культуру бактерий Bacillus subtilis Ч-13 в жидкой стерильной питательной среде следующего состава:

Меласса - 25 г/л,

кукурузный экстракт - 12,5 г/л,

MgSO₄×7H₂O - 0,25 г/л,

СаС1₂×2H₂O - 1 г/л,

MnSO₄ - 0,1 г/л,

FeSO₄ - 0,0001 г/л,

CuSO₄ - 0,0001 г/л

на качалке или в ферментере при 33°С в течение 24-36 часов до достижения в культуральной жидкости титра не менее 1×10⁹ кл/мл и содержания спор не менеее 90%. После чего получают жидкую форму микробиологического препарата, смешивая 20% культуральной жидкости и 80% воды (титр препарата - не менее 1,5×10⁸ кл/мл).

Таким образом, в результате проведенных опытов, была выявлена и экспериментально подтверждена способность штамма бактерий Bacillus subtilis Ч-13 стимулировать рост сельскохозяйственных культур за счет продуцирования на их корнях растительных гормонов роста - ауксинов и витаминов группы В.

При этом на основе штамма бактерий Bacillus subtilis Ч-13 могут быть получены различные биопрепараты, что позволяет расширить арсенал существующих аналогичных средств.

Важным является также и то, что при использовании указанного штамма в составе микробиологических препаратов бактерии Bacillus subtilis Ч-13 образуют споры, что позволяет сохранять эти препараты без потери жизнеспособности бактерий в течении длительного срока, не менее 12 месяцев.

Количество жизнеспособных клеток и спор штамма бактерии Bacillus subtilis Ч-13 для его эффективного использования в составе различных микробиологических препаратов должно составлять 10⁴-10⁹ клеток на 1 мл культуральной жидкости. Экспериментально установлено, что использование штамма в концентрации менее 10⁴ кл/мл ведет к снижению эффекта стимуляции роста сельскохозяйственных культур, а увеличение концентрации свыше 10¹⁰ кл/мл не приводит к увеличению эффективности их стимуляции роста.

Применение штамма бактерий Bacillus subtilis Ч-13, депонированного в ВНИИСХМ под номером Д-606, в качестве средства для стимуляции роста сельскохозяйственных культур.