Сополимеры ди-n-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина и способы их получения

Изобретение относится к новым полимерным соединениям, а именно к сополимерам ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина, которые могут быть использованы в медицинской промышленности в составе лекарственных препаратов для предотвращения развития и лечения различных заболеваний и применяться в качестве полимерных носителей для различных белков и других действующих веществ. Сополимеры ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина имеют нижеуказанную общую формулу I, в которой X = Cl^-, Br^-, СН₃СОО^-, ОН^-, k = 50-1000 (от 1 до 99% от общего количества звеньев); l = 32-1000 (от 1 до 90% от общего количества звеньев); m = 0-1000 (от 0 до 50% от общего количества звеньев); n = 0-1000 (от 0 до 50% от общего количества звеньев); p = 0-1000 (от 0 до 50% от общего количества звеньев). По первому варианту способ получения сополимеров ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина общей формулы I заключается в том, что проводят катионную полимеризацию 1,4-диазобицикло[2.2.2]октана при температуре от 150 до 230°C. Далее осуществляют окисление полученного поли-1,4-этиленпиперазина водным раствором пероксида водорода. По второму варианту получают карбоксилсодержащие производные сополимеров ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина общей формулы I, в которой р>0. Способ получения карбоксилсодержащих производных сополимеров заключается в том, что проводят алкилирование поли-1,4-этиленпиперазина в водном растворе любой галогенуксусной кислотой, в водном растворе уксусной кислоты или в безводной уксусной кислоте. Затем осуществляют окисление полученного сополимера 1,4-этиленпиперазина и N-карбоксиметил-1,4-этиленпиперазина водным раствором пероксида водорода. Изобретение позволяет получить нетоксичные сополимеры, обладающие антирадикальной активностью и свойствами защищать белки в условиях химического стресса. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 14 пр.

(I)

 

Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к новым полимерным соединениям, сополимерам ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина. Соединения обладают антирадикальной активностью, способны защищать белки в условиях химического стрессового воздействия и могут быть использованы в составе лекарственных препаратов для предотвращения развития и лечения различных заболеваний. Соединения также могут применяться в качестве безопасных полимерных носителей для различных белков и других действующих веществ.

Уровень техники.

Свободные радикалы и разнообразные реакции с их участием являются причиной возникновения многих распространенных заболеваний. Вещества с антирадикальной активностью (АРА) участвуют в регуляции протекания свободно-радикальных превращений в организме, существенно влияя на его состояние. В последнее время получили широкое распространение исследования антирадикальных свойств соединений, при этом, большое внимание уделяется исследованию активных (реактивных) форм кислорода (АФК). Патологические последствия в организме возникают при чрезмерном накоплении АФК, пероксидов и их вторичных продуктов – состоянии, называемом окислительным стрессом. При этом причины, вызывающие окислительный стресс, достаточно разнообразны, но все они вызывают окислительную модификацию макромолекул. Нуклеиновые кислоты, белки, углеводы и липиды составляют основу структурно-функциональной организации живых организмов и являются мишенями для АФК. Действие АФК приводит к повреждению ДНК как носителю наследственной информации. При повреждении ДНК затрагивается матричный механизм синтеза белков в организме. Окислительная модификация (повреждение) белков при старении может служить причиной дальнейшего развития негативных процессов. При этом происходит не только изменение аминокислотных остатков белков, но и нарушается их третичная структура, что приводит к процессам денатурации и агрегации.

Современные исследования показывают, что различные оксиды третичных аминов играют большую роль в обеспечении процессов жизнедеятельности всех живых организмов. Так, например, триметиламина N-оксид (ТМАО) относится к природным осмолитам, участвует в процессах фолдинга белков. ТМАО защищает белки в условиях стресса (осмотический, химический или термический) путем стабилизации белковой глобулы в условиях внутриклеточного краудинга. Краудинг влияет на все биохимические процессы в клетке, при которых наблюдается изменение исключенного объема. К числу таких процессов относятся:

1. Сворачивание вновь синтезированных полипептидных цепей в компактные функциональные белки;

2. Разворачивание белков (в том числе индуцированное химическим или тепловым стрессом);

3. Образование олигомерных структур и мультиферментных комплексов;

4. Агрегация белков в нефункциональные агрегаты, такие как, например, бактериальные тельца включения и бляшки при амилоидных болезнях человека (болезни Паркинсона и Альцгеймера).

В клетке оксиды третичных аминов с одной стороны защищают белки от денатурации, с другой – способствуют агрегации развернутого состояния молекулы (повышение реакционной способности целевого действия). От других осмолитов TMAO отличается также тем, что кроме всего прочего обладает способностью восстанавливать связывание глюкокортикоидов с мутантными рецепторами [1].

Большое практическое значение имеют исследования роли N-оксидов третичных аминов в предотвращении развития и лечении различных офтальмологических заболеваний. Так, например, при миоцилиновой глаукоме ТМАО, участвуя в фолдинге белков, ингибирует образование мутантных белков. Если же мутантный белок уже образовался, то неэффективное очищение от мутантных миоцилиновых белков приводит к агрегации, клеточному стрессу и смерти клеток. В этом случае, ТМАО рефолирирует мутантный белок в его нативное состояние или ускоряет скорость его деградации с последующим выведением [2].

Мутации в генах, которые вызывают образование агрегированных кристаллинов в составе модифицированных, поврежденных или частично развернутых белковых структур, приводят к образованию непрозрачности линзы и развитию катаракты.

N-оксиды третичных аминов стабилизируют белки-кристаллины в клетках линзового волокна. В условиях внутриклеточного краудинга это способствует оптимальной мутности и высокому светопропусканию и, как следствие, к прозрачности линзы [3].

С химической точки зрения N-оксидные соединения отличаются от других органических соединений самой высокой полярностью связи N-O. Дипольный момент N-O-связи составляет около 5 Д, что значительно превышает дипольный момент всех других химических связей. Высокая полярность N-O-связи обуславливает высокие гидрофильные свойства веществ и их комплементарность в отношении различных белков, в частности, способность вступать в электростатическое взаимодействие с белковыми молекулами. При этом высокая биодоступность и способность практически неограниченно растворяться в биологических средах затрудняет создание эффективных лекарственных препаратов с высокой локальной концентрацией действующего вещества и продолжительным периодом действия. С этой точки зрения получение высокомолекулярных поли-N-оксидных полимерных молекул, способных в результате деструкции генерировать низкомолекулярные N-оксидные соединения позволяет создать эффективные лекарственные препараты пролонгированного действия.

В настоящее время в офтальмологической практике широко применяется синтетический антиоксидант Эмоксипин^®. Глазные капли в качестве действующего вещества содержат 1% раствор 6-метил-2-этилпиридин-3-ола (ГФ РФ XIII, т.3, стр. 215). Препарат применяется в виде водорастворимых солей (хлоргидрат или сукцинат) ввиду достаточно высокой гидрофобности молекулы 6-метил-2-этилпиридин-3-ола. Глазные капли улучшают кровоснабжение тканей глаза и повышают их устойчивость к действию свободных радикалов. При этом, при применении глазных капель, отмечается побочное действие в виде различных симптомов раздражения глаз (жжение, зуд, отек и покраснение конъюнктивы). Полученные нами производные ди-N-оксидов обладают антиоксидантной активностью и свойствами защищать нативные белки от неблагоприятного стрессового воздействия, при этом сополимеры крайне гидрофильны, так как содержат большое количество высокополярных N-оксидных групп. Благодаря этим положительным свойствам производные ди-N-оксидов можно рассматривать как эффективные и безопасные действующие вещества в офтальмологических лекарственных препаратах, применяемых в форме глазных капель.

Суммируя вышеизложенное можно говорить о том, что получение новых полимерных ди-N-оксидных соединений актуально и перспективно для создания новых лекарственных препаратов.

Работы по получению полимерных соединений с N-О-связью были начаты в середине прошлого века немецкими химиками с целью создания лекарственного препарата для лечения силикоза легких. В изобретении, представленном ими в 1965 году в патенте (US 3,532,709) описаны производные поли-N-оксидов как продукты окисления имидаминов и способы их получения.

Идеи немецких ученых по получению поли-N-оксидных соединений получили развитие в научных работах советских химиков, которыми был разработан метод получения поли-1,4-этиленпиперазина путем катионной полимеризации 1,4-диазобицикло[2.2.2]октана с дальнейшей химической модификацией полимера. Так, в патенте RU 2073031 описаны производные поли-1,4-этиленпиперазина, обладающие иммуномодулирующей, противовирусной и антибактериальными активностями общей формулы II:

где R₁ – алкил (С₁-С₁₆), -(СН₂)_1-16ОН, -(СН₂)_1-5СОR;

где R₂ – -ОН, -ОСН₃, -О(СН₂)_1-3СН₃, -NHNH₂, -NH(CH₂)_1-10NH₂;

n = 310 – 2000; z = 0,1 – 0,8; q = 0,2 – 0,9, если в полимере звеньев q=0,2, тогда звеньев Z=0,8; Hal – Cl, Br, I.

Соединения получают частичным окислением поли-1,4-этиленпиперазина водным раствором пероксида водорода и полученные N-оксиды поли-1,4-этиленпиперазина алкилируют с образованием четвертичных аммониевых солей. При этом в изобретении RU 2073031 не представлены сополимеры, содержащие звенья с двумя N-оксидными группами в одном звене общей формулы III:

Наиболее близкими по назначению, по своим свойствам и химической структуре к описываемым в данном изобретении сополимерам ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина являются сополимеры гетероцепных алифатических поли-N-оксидов, представленные в изобретении RU 2428991, общей формулы IV:

где R=N, CH; х=2-4; у=0, 2; n=10-1000; q=(0,1-0,9)n; z=(0,1-0,9)n.

Описанные в изобретении RU 2428991 сополимеры обладают антиоксидантной активностью, терапевтическим действием в качестве детоксиканта и иммуномодулирующего агента. Сополимеры получают частичным окислением поли-1,4-этиленпиперазина водным раствором пероксида водорода. При этом, в изобретении RU 2428991, также как и в изобретении RU 2073031 не описываются сополимеры, содержащие две N-оксидные группы в одном звене общей формулы (III). Авторы изобретений RU 2428991 и RU 2073031 рассматривали полученные ими соединения, в первую очередь, как новые эффективные и безопасные лекарственные средства с иммуномодулирующей и адъювантной активностью. С этой точки зрения, введение N-оксидных групп необходимо лишь для «разбавления» ими звеньев полимерной цепи, содержащей незамещенные аминогруппы. Тем самым до безопасного для организма уровня снижается плотность положительных зарядов, которые возникают в результате протонирования свободных аминогрупп. В результате частичного окисления аминогрупп происходит драматическое снижение токсичности, изначально присущее всем полиаминам. При этом частичное окисление не ухудшает растворимость сополимера в воде, а напротив, улучшает, поскольку N-оксидные группы представляют собой гидрофильные диполи. Однако, N-оксидные группы, имеющие отрицательный заряд на атоме кислорода инертны в отношении также отрицательно заряженного двойного фосфоролипидного клеточного слоя и, понятно, не могут служить в этом отношении триггерами для запуска иммунной системы.

Иными словами, авторы вышеуказанных изобретений при разработке иммуномодуляторов и адъювантов стремились найти оптимальное соотношение незамещенных аминогрупп и N-оксидных групп, при котором токсичность сополимера уже была бы снижена до приемлемого уровня, но его способность взаимодействовать с клеточной мембраной и активировать иммунные клетки, еще не утрачена. Таким образом, авторы вышеприведенных изобретений считали дальнейшее окисление нецелесообразным с точки зрения биологических свойств сополимеров[4]. Что не менее важно, в научно-исследовательских работах авторами изобретений RU 2428991 и RU 2073031 было найдено, что одновременно с окислением поли-1,4-этиленпиперазина водным раствором H₂O₂ происходит деструкция со значительным снижением молекулярной массы сополимера. Так, например, при окислении поли-1,4-этиленпиперазина с молекулярной массой 180 кДа водным раствором H₂O₂ получали сополимеры поли-N-оксидов с молекулярной массой от 8 кДа (звенья с одним окисленным атомом азота составляли 58 %, не окисленные звенья 48 %) до 35 кДа (звенья с одним окисленным атомом азота составляли 20 %, не окисленные звенья 80 %). Ввиду значительного падения молекулярной массы по мере дальнейшего окисления звеньев сополимера считалось невозможным получать полимерные молекулы, когда более 50 % атомов азота окислены. Также постулировалось то, что, звенья, содержащие две N-оксидные группы в одном звене общей формулы (III) можно получить лишь в достаточно «жестких» условиях (нагревание, большой избыток H₂O₂) и только в крайне небольших количествах только in situ (ввиду их нестабильности и деструкции при выделении) [5].

Таким образом, на момент начала работ по представленному изобретению считалось, что: 1. Получение сополимеров с двумя N-оксидными группами в одном звене общей формулы (III) не имеет практического смысла; 2. Сополимеры с двумя N-оксидными группами в одном звене получить крайне сложно и только с небольшим содержанием таких звеньев в составе сополимера; 3. Сополимеры с двумя N-оксидными группами в одном звене крайне нестабильны, их можно получить только in situ.

Суммируя вышеизложенное можно сказать, что на момент начала наших исследований, для специалистов в данной области было очевидным, что получить и выделить сополимеры, содержащие две N-оксидные группы в одном звене общей формулы (III) практически невозможно и не имеет какого-либо практического смысла.

При проведении исследований по окислению поли-1,4-этиленпиперазина водным раствором H₂O₂ при ультрафиолетовом облучении реакционной массы нами неожиданно было обнаружено, что сополимеры поли-1,4-этиленпиперазина содержащие звенья с двумя N-оксидными группами в одном звене общей формулы III можно достаточно легко получать и выделять без какой-либо заметной деструкции полимерных молекул. Проведенные исследования также показали, что вопреки существовавшим представлениям, перегруппировка Мезенгеймера в случае N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина преимущественно останавливается на стадии образования стабильных звеньев 1,4-оксиэтиленпиперазина, схема I:

При этом также достаточно неожиданно было выявлено, что после того, как 50 % атомов азота в полимерной цепочке окислены, при дальнейшем окислении перегруппировка Мезенгеймера может происходить в обратном направлении, схема II:

Описанные в патентах RU 2428991 и RU 2073031 сополимеры не содержат звенья общей формулы V:

Раскрытие сущности изобретения.

В результате проведенных исследований нами были получены новые, ранее неизвестные сополимеры ди-N-оксидов общей формулы (I). Проведенные исследования свойств полученных сополимеров показали, что они не токсичны, обладают антирадикальной активностью и свойствами защищать белки от денатурации в условиях химического стрессового воздействия. Исследования показали, что только при наличии в составе сополимера звеньев с двумя N-оксидными группами в одном звене общей формулы (I) данные свойства сополимеров проявляются в полной мере. Свойство сополимеров общей формулы (I) защищать белки в условиях химического стрессового воздействия было использовано для получения высокоактивных конъюгатов с rHuG-CSF и другими рекомбинантными белками.

Нами были разработаны способы получения сополимеров с двумя N-оксидными группами в одном звене общей формулы (I) и их конъюгатов с различными белками. Разработанные способы отличаются высокими выходами и простотой и могут быть масштабированы для использования в медицинской промышленности для производства лекарственных препаратов.

Целью настоящего изобретения являлось получение нового класса полимерных соединений - производных ди-N-оксидов поли-1,4 –этиленпиперазина, в качестве:

1) эффективных и безопасных действующих веществ новых лекарственных препаратов с антирадикальной активностью;

2) безопасных полимерных носителей для белков и других действующих веществ в лекарственных препаратах пролонгированного действия;

3) исходных соединений для создания адъювантов путем дальнейшей модификации сополимеров.

Поставленная цель достигалась тем, что были получены и исследованы новые, ранее неизвестные полимерные соединения, содержащие в своей структуре ди-N-оксидные пиперазиновые звенья, сополимеры ди-N-оксидов поли-1,4 –этиленпиперазина общей формулы (I):

, где:

X = Cl^-, Br^-, CH₃COO^-, OH^-;

k = 50 – 1000 (от 1 до 100 % от общего количества звеньев);

l = 0 – 1000 (от 0 до 90 % от общего количества звеньев);

m = 0 – 1000 (от 0 до 50 % от общего количества звеньев);

n = 0 – 1000 (от 0 до 50 % от общего количества звеньев);

p = 0 – 1000 (от 0 до 50 % от общего количества звеньев);

общее количество звеньев составляет от 50 до 2000 (k+l+m+n+p = 100 %);

полимерная молекула имеет линейное строение, звенья сополимера распределены в полимерной цепочке статистически и могут находиться в любом порядке и последовательности. Молекулярно-массовое распределение сополимеров составляет от 1,05 до 1,16. Полимерные цепочки имеют следующие концевые группы:

, где

R = -H, -CH₃, -C₂H₅, -OH, -CH₂C(O)H, -CH₂C(O)OH.

Полученные полимерные соединения изучали при помощи ЯМР-спектроскопии (H¹, C¹³, N¹⁵), ИК-спектрофотометрии (количественное определение N-O и -СООН групп при 966 см^-1 и 1633 см^-1 соответственно), элементного анализа, эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (определение молекулярной массы) с применением метода малоуглового рассеяния лазерного излучения (LALLS, определение молекулярно-массового распределения), титрометрией (количественное определение N-O-групп титрованием TiCl₃) и многими другими современными физико-химическими методами исследований.

Технический результат изобретения состоит в создании нового класса полимерных соединений - сополимеров ди-N-оксидов поли-1,4 –этиленпиперазина общей формулы (I). Соединения нетоксичны, обладают антирадикальной активностью, свойствами защищать белки в условиях химического стресса и могут быть использованы в лекарственных препаратах для предотвращения развития и лечения различных заболеваний. Карбоксилсодержащие производные соединений общей формулы (I) могут применяться в медицинской промышленности в качестве полимерных носителей для конъюгации с белками и другими действующими веществами при производстве лекарственных препаратов.

Указанный технический результат достигается соединениями, представляющими собой сополимеры ди-N-оксидов общей формулы (I).

Изобретательский уровень подтверждается тем, что ранее для специалистов в данной области было очевидным, что получить и выделить сополимеры общей формулы (I), содержащие две N-оксидные группы в одном звене общей формулы (III), крайне затруднительно и практически невозможно.

Осуществление изобретения.

Сополимеры ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина общей формулы (I) получают используя в качестве сырья коммерчески доступный 1,4-диазобицикло[2.2.2]октан по общей схеме синтеза III:

Поли-1,4-этиленпиперазин (звенья n = 100 %) получают из

1,4-диазобицикло[2.2.2]октана путем катионной полимеризации. В качестве катализаторов катионной полимеризации можно использовать следующие группы катализаторов:

1. Комплексообразующие вещества. К этой группе относятся соли различных металлов, способных к комплексообразованию. Процесс полимеризации вызывают как сильные кислоты Льюиса (SnCl₄, AlCl₃, ZnCl₂, BF₃), так и слабые (галогениды меди, никеля, кадмия, марганца, кобальта, нитраты меди, никеля, а также гидраты указанных солей).

2. Сильные органические и неорганические кислоты (HCl, HBr, HI, азотная, хлорная, толуолсульфокислота, метансульфокислота, трихлоруксусная и другие сильные органические кислоты).

3. Органические галоидалкилы RX, где X = Cl, Br, I; R = CH₃, C₂H₅.

4. Аммонийные соли и четвертичные аммонийные соли с различными анионами (Cl^-, Br^-, I^-, ClO₄^-, OH^-, CH₃SO₄^-).

В качестве катализаторов катионной полимеризации преимущественно использовали бромгидрат 1,4-диазобицикло[2.2.2]октана в количестве от 0,01 до 1 % по массе к мономеру. Полимеризацию проводили при температуре от 150 до 230 °С (предпочтительно от 170 до 180 °С) в течение от 6 до 18 часов. При температуре проведения полимеризации выше 200 °С начинает происходить частичная термическая деструкция циклических связей C-N поли-1,4-этиленпиперазина, поэтому для получения строго линейных и неразветвленных полимерных молекул необходимо проводить полимеризацию при более низких температурах.

Получение сополимеров ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина общей формулы I, где р = 0 % (отсутствуют карбокилсодержащие звенья р) осуществляют путем окисления поли-1,4-этиленпиперазина двумя способами. В первом способе (схема синтеза III, способ A) используют водные растворы пероксида водорода (окисление атомарным кислородом О^*). Во втором способе (схема синтеза III, способ B) реакцию окисления водным раствором пероксида водорода проводят при ультрафиолетовом облучении реакционной массы с длинной волны 254 нм. При использовании способа (B) окисление проходит намного эффективней за счет большей реакционной способности образующегося в результате фотолиза Н₂О₂ гидроксил-радикала OH^*, схема (IV):

Разработанный способ проведения окисления поли-1,4-этиленпиперазина и его производных гидроксил-радикалом OH^*, имеет следующие преимущества:

1. Скорость реакции окисления OH^* примерно в 2-3 раза выше, в сравнении с окислением О^*, что позволяет проводить процесс окисления быстрее, эффективнее и с меньшим расходом реактивов.

2. Высокая реакционная способность OH^* позволяет проводить реакцию окисления в мягких условиях, при комнатной температуре, получая ди-N-окисленные звенья k сополимера в большом количестве, до k = 100 % включительно.

3. Способ отличается простотой исполнения (в реактор погружается коммерчески доступная УФ-лампа) и небольшими затратами электроэнергии, что важно для дальнейшего промышленного использования.

После проведения окисления реакционную массу очищают от примесей диализом или ультрафильтрацией (дистиллированная вода, кассеты или диализные пленки с пределом отсечения от 1 до 50 кДа), контролируя степень очистки от Н₂О₂ (индикаторные полоски на Н₂О₂ компании Merck, США, кат.№110011 с пределом обнаружения Н₂О₂ 0,5 мг/л).

Карбоксилсодержащие производные ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина общей формулы (I), где количество звеньев p ≥ 1 (присутствуют карбокилсодержащие звенья р), получают путем алкилирования поли-1,4-этиленпиперазина бромуксусной или любой другой галогенуксусной кислотой с последующим окислением (схема синтеза III, способ C). Алкилирование проводят в воде, в водном растворе уксусной кислоты (температура от 20 до 100 °С), или в безводной уксусной кислоте при температуре 100 °С. Алкилированный поли-1,4-этиленпиперазин очищают диализом или ультрафильтрацией (дистиллированная вода, кассеты или диализные пленки с пределом отсечения от 1 до 50 кДа). При необходимости карбоксилсодержащие производные можно выделить в чистом виде путем лиофилизации. Полученный лиофилизат представляет собой пористую белую массу, хорошо растворимую в воде (рН от 2 до 13) при степени алкилирования более 35 % (количество алкилированных звеньев р > 35 %). При степени алкилирования менее 35 % сополимер нерастворим в воде при рН > 6,30.

После алкилирования и очистки проводят окисление водным раствором Н₂О₂, предпочтительно при ультрафиолетовом облучении c длинной волны 254 нм.

Затем реакционную массу очищают от избытка Н₂О₂ диализом или ультрафильтрацией в тангенциальном потоке (дистиллированная вода), контролируя степень очистки по остаточному количеству Н₂О₂ (индикаторные полоски на Н₂О₂ компании Merck, США, кат.№110011 с пределом обнаружения Н₂О₂ 0,5 мг/л). После ультафильтрационной отмывки очищенный раствор стерилизуют фильтрацией (0,2 мкм) и лиофильно высушивают. Получают лиофилизат сополимера общей формулы (I) в виде пористой белой массы.

Ниже изобретение иллюстрируется примерами способов получения и анализа, которые не ограничивают объем притязаний в рамках заявленной формулы изобретения.

Примеры получения.

Все исходные реагенты и растворители, если не описано иное, применяли c чистотой 99+% компании Sigma-Aldrich (США) без дополнительной очистки.

Температуру плавления определяли на приборе Melting Point М-565, (Buchi, Швейцария). Измерения рН проводили с использованием рН-метра модели Orion Star A211 компании ThermoFisher (США). Элементный состав определяли на

CHNS-анализаторе Eurovector Euro EA 3000, компании Eurovector (Италия).

ИК-спектры регистрировали на ИК-спектрометре VARIAN 3100 FT-IR Excalibur Series, компании Varian (США).

Очистку и выделение полученных сополимеров и конъюгатов проводили с использованием диализа или ультрафильтрации в тангенциальном потоке. Для диализа использовали пленки с номинальным пределом отсечения 3,5 и 12 кДа компании Carl Roth (Германия), кат. № Е657.1 и Е677.1. Для ультрафильтрации небольших (до 200 мл) объемов использовали систему фильтрации в тангенциальном потоке Minim™ II компании Pall (США). При больших объемах использовали установку с общей площадью фильтрации 0,1 м² и номинальным пределом отсечения по молекулярной массе 5 кДа, Centramate SS Holder, Pall (США). Спектры ЯМР ¹³С были получены на спектрометре ECA 600 (JEOL, Япония) с рабочей частотой 150 МГц для ядер углерода, их обработка проводилась с помощью программы Delta (JEOL), обеспечивающей управление прибором, сбор и анализ данных. Регистрация спектров проходила при следующих основных условиях:

1) количество точек на спектр 64;

2) время релаксационной задержки 4 секунды;

3) 45º импульс;

4) более 20000 сканирований (время накопления около суток).

Для приготовления растворов исследуемых ЯМР и ИК-спектроскопией образцов использовали: 1) D₂O, 99.9+ atom % D, Sigma-Aldrich (кат. № 151882);

2) NaOD 40 % in D₂O 99+ atom D, Sigma-Aldrich (кат.№ 176788).

Пример 1. Получение поли-1,4-этиленпиперазина (звенья n = 100 %).

Перед полимеризацией проводят дополнительную очистку мономера. Коммерчески доступный 1,4-диазобицикло[2.2.2]октан (Merck, cat.# 8.03456, содержание основного вещества 98+%) очищают сублимационной перегонкой в вакууме (5 мм.рт.ст.) и получают мономер для полимеризации с содержанием основного вещества 99,9+% (ГЖХ). Выход 92 %. Тпл.= 157,5-159,0 °С,

n²⁰_D = 1,4634. В очищенный таким образом мономер (100,0 г) добавляют катализатор катионной полимеризации: 1,4- диазобицикло[2.2.2]октана бромгидрат (0,5 г) и смесь нагревают в инертной атмосфере аргона при температуре 180 °С в течение 10 часов. Полимер извлекают из реактора, промывают дистиллированной водой (3×3 литра), сушат и получают 99,0 г

поли-1,4-этиленпиперазина. Выход 99 %. Тпл. > 300 °С (с разл.). Спектр ЯМР-C13 (при pH = 2,0), δ, м.д.: 50,36 (с; 4С; циклические), 51,45 (с; 2С; экзоциклические). Найдено: С 64.21, Н 10.93, N 24.86; Вычислено: С 64.24, Н 10.78, N 24.98.

Пример 2. Получение сополимера ди-N-оксида 1,4-этиленпиперазина,

N-оксида 1,4-этиленпиперазина, 1,4-оксиэтиленпиперазина и

1,4-этиленпиперазина.

Полученный в Примере 1 поли-1,4-этиленпиперазин 6,0 г растворяют в водном растворе уксусной кислоты (40 мл дистиллированной воды и 10 мл ледяной уксусной кислоты) и при перемешивании добавляют 24 мл 30 % водного раствора Н₂О₂. Далее реакционную массу перемешивают 12 часов при комнатной температуре. Затем реакционную массу очищают от избытка Н₂О₂ ультрафильтрацией в тангенциальном потоке (дистиллированная вода, кассета с пределом отсечения 5 кДа), контролируя степень очистки по остаточному количеству Н₂О₂ (индикаторные полоски на Н₂О₂ компании Merck, США, кат. №110011 с пределом обнаружения Н₂О₂ 0,5 мг/л). После ультафильтрационной отмывки очищенный раствор стерилизуют фильтрацией (0,2 мкм) и лиофильно высушивают. Получают 6,2 г лиофилизата сополимера общей формулы (I), где k = 2 % , l = 43 % , m = 29 %, n = 26 % , p = 0 %, в виде пористой белой массы, растворимой в воде и 0,9 % растворе натрия хлорида. Выход 94 %. Тпл.= 204-210 °С (с разл.). Определяют молекулярную массу (Mw) методом эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (SEC-HPLC). Для проведения анализа используют:

1) насос для хроматографии при высоких давлениях LC-20AD, (Shimadzu, Япония);

2) рефрактометрический детектор RID-10A, (Shimadzu, Япония);

3) хроматографическая колонка UltraSW mAb Aggregate, 300×7,8 мм, заполненная гидрофильным полимером с диаметром частиц 3 мкм, Tosoh;

4) подвижная фаза: водный раствор 0,2 М NaCl c добавлением 3 % AcOH, рН 2,0-2,5;

5) скорость потока: 0,8 мл/мин;

6) температура колонки: 20 °С;

7) программно-аппаратный комплекс для сбора и обработки хроматографических данных МультиХром, версия 3.2.

Для построения калибровочного графика используют международные стандарты молекулярных масс: STD Р-10, STD Р-20, STD Р-50, STD Р-100 и STD Р-200 в диапазоне от 10 до 200 кДа (Shodex STANDARD P-82, компании Showa Denko К.К., кат. № F8400000). Растворы стандартов хроматографируют в подвижной фазе не менее двух раз каждый и определяют времена удерживания (t_R) максимумов пиков. Полученные значения (t_R) усредняют методом линейной регрессии, используя программу Microsoft Office Excel, получая уравнение калибровочной прямой – зависимость молекулярной массы стандартов от их времени удерживания в полулогарифмических координатах:

Lg (Mw) = 7,308 – 0,262×(t_R) (1)

Коэффициент корреляции полученной зависимости равен 0,99877. Затем хроматографируют образец сополимера в подвижной фазе. С помощью программы сбора и обработки данных на полученной хроматограмме интегрируют пик полимера и определяют время (t_R), которое соответствует положению вертикальной линии, делящей пик вещества на две равные по площади части (различия в площадях обеих половин не должны превышать 1,0 %). Рассчитывают молекулярную массу полимера (Mw), подставляя (t_R) в уравнение (1). Мw = 24 кДа.

Общее количество N-оксидных групп определяют титрованием TiCl₃. Сначала определяют молярность свежеприготовленного 1,0 % раствора TiCl₃ титрованием раствора калия бихромата до появления зеленого окрашивания раствора (в раствор калия бихромата добавляют 2-3 капли спиртового раствора дифениламина). Затем готовят испытуемый раствор сополимера путем растворения точной навески 350,0 мг в 60,0 мл дистиллированной воды. К полученному раствору добавляют 20,0 мл 1,0 % раствора TiCl₃ и избыток титана (III) титруют 25 мМ раствором железоаммонийных квасцов. Точно так же проводят холостой опыт, только без добавления навески испытуемого сополимера. Количество N-оксидных групп рассчитывают с учетом холостого опыта по стехиометрии, где для восстановления 1 моля N-O групп расходуется 2 моля TiCl₃. Количество окисленных атомов N составляет 47 % от всех атомов N в сополимере.

Спектр ЯМР-C13 (при pH = 13,0), δ, м.д.:

1) звенья k - 61,06 (с; 4С; циклические), 64,12 (с; 2С; экзоциклические);

2) звенья l - 50,95-51,25 м.д. (м; 2С; циклические при N), 60,45 м.д. (с; 2С; циклические при N-O);

3) звенья m - 53,64 (с; 2С; циклические при N), 48,40 м.д. (с; 2С; циклические при

N-O-), 67,66 (с; 1С; экзоциклические N-O-CH₂-);

4) звенья n - 53,64 (с; 4С; циклические), 55,40 (с; 2С; экзоциклические);

Найдено: С 57.95, Н 9.68, N 22.52; Вычислено: С 58.19, Н 9.77, N 22.62.

Пример 3. Получение сополимера ди-N-оксида 1,4-этиленпиперазина, N-оксида 1,4-этиленпиперазина, 1,4-оксиэтиленпиперазина и 1,4-этиленпиперазина.

Полученный в Примере 1 поли-1,4-этиленпиперазин 6,0 г растворяют в водном растворе уксусной кислоты (40 мл дистиллированной воды и 10 мл уксусной кислоты) и при перемешивании добавляют Н₂О₂ (12 мл 30 % водного раствора). Затем в реакционную массу помещают УФ-лампу (Pen-Ray UV Lamp, Cole-Parmer EW-97606-00) и перемешивают в течении 12 часов при комнатной температуре. Далее реакционную массу очищают как в Примере 2 и лиофильно высушивают. Получают 6,7 г лиофилизата сополимера общей формулы (I), где k = 40 % , l = 32 %, m = 18, n = 10, p = 0 %, в виде пористой белой массы, растворимой в воде и 0,9 % растворе натрия хлорида. Выход - 95 %. Тпл.= 206-210 °С (с разл.). Определяют молекулярную массу сополимера как описано в Примере 2, Мw = 23 кДа.

Спектр ЯМР-C13 (при pH = 13,0), δ, м.д.:

1) звенья k - 61,06 (с; 4С; циклические), 64,12 (с; 2С; экзоциклические);

2) звенья l - 50,95-51,25 м.д. (м; 2С; циклические при N), 60,45 м.д. (с; 2С; циклические при N-O);

3) звенья m - 53,64 (с; 2С; циклические при N), 48,40 м.д. (с; 2С; циклические

при N-O-), 67,66 (с; 1С; экзоциклические N-O-CH₂-);

4) звенья n - 53,64 (с; 4С; циклические), 55,40 (с; 2С; экзоциклические);

Найдено: С 54.48, Н 8.98, N 21.02; Вычислено: С 54.53, Н 9.15, N 21.20.

Пример 4. Получение ди-N-оксида поли-1,4 –этиленпиперазина(звенья k = 100%).

Полученный в Примере 1 поли-1,4-этиленпиперазин 10,0 г растворяют в 150 мл 5 мМ фосфатного буферного раствора с рН = 6,0-6,2. Затем при перемешивании и температуре 20 °С добавляют 60 мл 30 % раствора пероксида водорода и перемешивают реакционную массу 24 часа при температуре 47-50 °С. Далее реакционную массу очищают как в Примере 2, стерилизуют фильтрацией (0,2 мкм) и лиофильно высушивают. Получают 12,1 г лиофилизата в виде пористой белой массы, растворимой в воде и 0,9 % растворе натрия хлорида. Выход 95 %.

Тпл.= 209-210 °С (с разл.). Мw = 28 кДа. Спектр ЯМР-C13 (при pH = 2,0), δ, м.д.: 61,06 (с; 4С; циклические), 64,12 (с; 2С; экзоциклические). Найдено: С 49.82, Н 8.13, N 19.29; (C₆H₁₂N₂O₂)k, Вычислено: С 49.99, Н 8.39, N 19.43, О 22,19.

Пример 5. Получение ди-N-оксида поли-1,4 –этиленпиперазина (звенья k = 100%).

Полученный в Примере 1 поли-1,4-этиленпиперазин 10,0 г растворяют в 150 мл 5 мМ фосфатного буферного раствора с рН = 6,0-6,2. Затем при перемешивании и температуре 20 °С добавляют 25 мл 30 % раствора Н₂О₂. Далее в реакционную массу помещают УФ-лампу (Pen-Ray UV Lamp, Cole-Parmer EW-97606-00) и перемешивают 12 часов при комнатной температуре. Затем реакционную массу очищают как в Примере 2, стерилизуют фильтрацией (0,2 мкм) и лиофильно высушивают. Получают 12,3 г лиофилизата в виде пористой белой массы, растворимой в воде и 0,9 % водном растворе натрия хлорида. Выход 96 %. Тпл.= 209-210 °С (с разл.). Мw = 26 кДа. Спектр ЯМР-C13 (при pH = 2,0), δ, м.д.: 61,06 (с; 4С; циклические), 64,12 (с; 2С; экзоциклические). Найдено: С 49.82, Н 8.13, N 19.29; Вычислено: С 49.99, Н 8.39, N 19.43, О 22,19.

Пример 6. Получение сополимера ди-N-оксида 1,4-этиленпиперазина, N-оксида 1,4-этиленпиперазина, 1,4-оксиэтиленпиперазина, 1,4-этиленпиперазина и N-карбоксиметилен-1,4-этиленпиперазина.

Полученный в Примере 1 поли-1,4-этиленпиперазин 20,0 г растворяют в 400 мл ледяной уксусной кислоты, добавляют 20,0 г бромуксусной кислоты и перемешивают при температуре 100 °С до полного выпадения осадка (2 часа). Затем реакционную массу охлаждают, добавляют 400 мл воды и растворяют при перемешивании осадок. После полного растворения осадка сополимер отмывают на ультрафильтрационной установке (8×2 литра дистиллированной воды, 5 кДа) и концентрируют до конечного объема 400 мл. В полученный раствор добавляют пероксид водорода (100 мл 30% водного раствора),100 мл уксусной кислоты и перемешивают при температуре 20 °С в течение 24 часов. После этого реакционную массу очищают ультрафильтрацией, как в Примере 2. Далее очищенный раствор стерилизуют фильтрацией (0,2 мкм) и лиофильно высушивают. Получают 19,8 г лиофилизата сополимера общей формулы (I), где k = 4 % , l = 52 %, m = 21 %, n = 18 %, p = 5 %, в виде пористой белой массы, растворимой в воде и 0,9 % растворе натрия хлорида. Выход 84 %. Тпл.= 203-8 °С (разл.). Мw = 21 кДа.

Спектр ЯМР-C13 (при pH = 9,0), δ, м.д.:

1) звенья k - 61,06 (с; 4С; циклические), 64,12 (с; 2С; экзоциклические);

2) звенья l - 50,95-51,25 м.д. (м; 2С; циклические при N), 60,45 м.д. (с; 2С; циклические при N-O);

3) звенья m - 53,64 (с; 2С; циклические при N), 48,40 м.д. (с; 2С; циклические при N-O-), 67,66 (с; 1С; экзоциклические N-O-CH₂-);

4) звенья n - 53,64 (с; 4С; циклические), 55,40 (с; 2С; экзоциклические);

5) звенья p – 62,27(с; 1С; -CH₂COO^-), 170,67 (с; 1С: -CH₂СOO^-).

Найдено: С 56.43, Н 9.50, N 21.63; Вычислено: С 56.52, Н 9.47, N 21.79.

Пример 7. Получение сополимера ди-N-оксида 1,4-этиленпиперазина, N-оксида 1,4-этиленпиперазина, 1,4-оксиэтиленпиперазина, 1,4-этиленпиперазина и N-карбоксиметилен-1,4-этиленпиперазина.

Полученный в Примере 1 поли-1,4-этиленпиперазин 20,0 г растворяют в 400 мл ледяной уксусной кислоты, добавляют 20,0 г бромуксусной кислоты и перемешивают при температуре 100 °С до полного выпадения осадка (2 часа). Затем реакционную массу охлаждают, добавляют 400 мл воды и растворяют при перемешивании осадок. После растворения осадка реакционную массу отмывают на ультрафильтрационной установке (8×2 литра дистиллированной воды, 5 кДа) и концентрируют до конечного объема 400 мл. Далее в полученный раствор добавляют пероксид водорода (30 мл 30% водного раствора), 20 мл уксусной кислоты, помещают в реакционную массу УФ-лампу (Pen-Ray UV Lamp, Cole-Parmer EW-97606-00) и перемешивают в течение 12 часов при комнатной температуре. После этого реакционную массу очищают ультрафильтрацией, как в Примере 2. Затем очищенный раствор стерилизуют фильтрацией (0,2 мкм) и лиофильно высушивают. Получают 20,5 г лиофилизата сополимера общей формулы (I), где k = 16 % , l = 42 %, m = 20 %, n = 17 %, p = 5 %, в виде пористой белой массы, растворимой в воде и 0,9 % растворе натрия хлорида. Выход 86 %. Тпл.= 204-9 °С (с разл.). Мw = 20 кДа. Спектр ЯМР-C13 (при pH = 9,0), δ, м.д.:

1) звенья k - 61,06 (с; 4С; циклические), 64,12 (с; 2С; экзоциклические);

2) звенья l - 50,95-51,25 м.д. (м; 2С; циклические при N), 60,45 м.д. (с; 2С; циклические при N-O);

3) звенья m - 53,64 (с; 2С; циклические при N), 48,40 м.д. (с; 2С; циклические при N-O-), 67,66 (с; 1С; экзоциклические N-O-CH₂-);

4) звенья n - 53,64 (с; 4С; циклические), 55,40 (с; 2С; экзоциклические);

5) звенья p - 62,27(с; 1С; -CH₂COO^-), 170,67 (с; 1С: -CH₂СOO^-).

Найдено: С 55.33, Н 9.41, N 21.27; Вычислено: С 55.35, Н 9.33, N 21.46.

Пример 8. Получение сополимера ди-N-оксида 1,4-этиленпиперазина, N-оксида 1,4-этиленпиперазина, 1,4-оксиэтиленпиперазина, 1,4-этиленпиперазина и N-карбоксиметилен-1,4-этиленпиперазина.

Полученный в Примере 1 поли-1,4-этиленпиперазин 20,0 г растворяют в 300 мл 5 мМ фосфатного буферноо раствора с рН = 6,0-6,2 , добавляют 10,0 г бромуксусной кислоты и перемешивают при температуре 60 °С 3 часа. Затем реакционную массу охлаждают, отмывают на ультрафильтрационной установке (8×2 литра дистиллированной воды, 5 кДа) и концентрируют до конечного объема 400 мл. В полученный раствор добавляют пероксид водорода (30 мл 30% водного раствора), 20 мл уксусной кислоты, помещают в реакционную массу УФ-лампу (Pen-Ray UV Lamp, Cole-Parmer EW-97606-00) и перемешивают в течении 12 часов при комнатной температуре. После этого реакционную массу очищают ультрафильтрацией как в Примере 2. Полученный раствор стерилизуют фильтрацией (0,2 мкм) и лиофильно высушивают. Получают 22,3 г лиофилизата сополимера общей формулы (I), где k = 12 %, l = 45 %, m = 11 %, n = 17 % , p = 15 %, в виде пористой белой массы, растворимой в воде, и 0,9 % растворе натрия хлорида. Выход 86 %. Тпл.= 204-9 °С (с разл.). Мw = 19 кДа. Спектр ЯМР-C13 (при pH = 9,0), δ, м.д.:

1) звенья k - 61,06 (с; 4С; циклические), 64,12 (с; 2С; экзоциклические);

2) звенья l - 50,95-51,25 м.д. (м; 2С; циклические при N), 60,45 м.д. (с; 2С; циклические при N-O);

3) звенья m - 53,64 (с; 2С; циклические при N), 48,40 м.д. (с; 2С; циклические при

N-O-), 67,66 (с; 1С; экзоциклические N-O-CH₂-);

4) звенья n - 53,64 (с; 4С; циклические), 55,40 (с; 2С; экзоциклические);

5) звенья p – 62,27(с; 1С; -CH₂COO^-), 170,67 (с; 1С: -CH₂СOO^-).

ИК-спектроскопия. Колебания C-N-C 1157 см^-1 и 1123 см^-1; деформационные (крутильные) колебания связи C-H 1338 см^-1 и 1311 см^-1; деформационные (ножничные) колебания связи C-H 1455 см^-1; колебания связи N-O 947 см^-1; колебания COOH-группы 1633 см^-1. Найдено: С 54.10, Н 9.15, N 20.36;

Вычислено: С 54.15, Н 9.03, N 20.49.

Пример 9. Изучение стабилизирующего действия сополимеров ди-N-оксида поли-1,4-этиленпиперазина к рекомбинантному человеческому гранулоцитарному колониестимулирующему фактору (rHuG-CSF) в условиях химического стресса.

Изучают стабилизирующее действие сополимеров в отношении белка в зависимости от количества ди-N-оксидных звеньев (звенья k) в составе сополимера. Для исследований используют белок rHuG-CSF квалификации «Ph.Eur», производства компании Relians Life Science Pvt. Ltd. (Индия) с концентрацией белка 2,14 мг/мл, в буферном растворе (10 мМ ацетат натрия, 5 % сорбитол, рН = 4,0). Ацетатный буферный раствор меняют на 12,5 мМ фосфатный с рН = 4,0 с одновременной концентрацией белка до 4,0 мг/мл (используют ультрафильтрацию в тангенциальном потоке, кассеты с пределом отсечения 3 кДа). При перемешивании и охлаждении (2-4 °С) в 2,0 мл раствора rHuG-CSF (С_белка = 4,0 мг/мл; 12,5 мМ NaH₂PO₄, pH = 4,05) добавляют 18,0 мг NaCl. Далее в раствор добавляют навеску 5,0 мг испытуемого сополимера. Раствор выдерживают при температуре 2-4 °С в течение 24 часов. После этого измеряют концентрацию белка в растворах (С_белка ) спектрофотометрическим методом (ГФ РФ XIII ч.1). Рассчитывают стабилизирующее действие сополимера как отношение измеренной концентрации белка к исходной, умноженное на 100 %. Результаты измерений стабилизирующего действия сополимеров к rHuG-CSF представлены в Таблице № 1.

Таблица №1. Стабилизирующее действие сополимеров ди-N-оксидов к rHuG-CSF.

Сополимер	Молекулярная масса сополимера, кДа	Звенья сополимера, %	Стабилизирующее действие, % от исходной концентрации белка в испытуемом растворе
k	l	m	n	p
Пример 2	24	2	43	29	26	-	21±1
Пример 3	23	40	32	18	10	-	95±3
Пример 5	26	100	-	-	-	-	97±3
Пример 6	21	4	52	21	18	5	26±1
Пример 7	20	16	42	20	17	5	86±3
Пример 8	19	12	45	11	17	15	78±2

Пример 10. Получение конъюгата rHuG-CSF с сополимером ди-N-оксида

1,4-этиленпиперазина, N-оксида 1,4-этиленпиперазина,

1,4-оксиэтиленпиперазина, 1,4-этиленпиперазина и

N-карбоксиметилен-1,4-этиленпиперазина.

Для конъюгации с белком используют полученный в Примере 7 полимерный носитель с молекулярной массой 20 кДа общей формулы (I), где k = 16 % , l = 42 %, m = 20 %, n = 17 % , p = 5 %. Используют белок rHuG-CSF квалификации «Ph.Eur», производства компании Relians Life Science Pvt. Ltd. (Индия) с концентрацией белка 2,14 мг/мл, в буферном растворе (10 мМ ацетат натрия, 5 % сорбитол, рН = 4,0). Ацетатный буферный раствор меняют на 12,5мМ фосфатный с рН = 4,0 с одновременной концентрацией белка до 4,0 мг/мл (используют ультрафильтрацию в тангенциальном потоке, кассеты с пределом отсечения 3 кДа). При перемешивании и охлаждении (2-4 °С) в 10,0 мл раствора rHuG-CSF (40,0 мг белка, С_белка = 4,0 мг/мл; 12,5 мМ NaH₂PO₄, pH = 4,05) добавляют 40,0 мг полимерного носителя и 90,0 мг NaCl Затем доводят рН до 4,6–4,7 (1М HCl) и добавляют порциями по 50 мкл в течение 8 часов 1 М водный раствор 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорида (EDAC), контролируя ход реакции по ионообменной ВЭЖХ. По достижении степени конъюгации 98-99 % (всего требуется примерно 400 мкл 1 М раствора EDAC), конъюгированный rHuG-CSF очищают диализом (пленка 3,5 кДа; 10 мМ ацетатный буферный раствор, рН = 4,00). При приготовлении ацетатного буферного раствора для доведения рН используют AcOH (необходимо отсутствие Cl^- анионов в растворе). После диализа в раствор добавляют сорбитол (5 % масс), доводят рН до 4,00-4,05 и стерилизуют фильтрацией (0,2 мкм). Получают 12,0 мл бесцветного прозрачного раствора конъюгата rHuG-CSF с концентрацией белка 3,25 мг/мл (спектрофотометрический метод, ГФ РФ XIII ч.1). Выход 97,5 %. Молекулярная масса конъюгата 39 кДа (SEC-HPLC). Удельная активность 118 МЕ/нг (в расчете на белок, используют стандартный метод определения специфической активности [6] на клетках линии NFS-60).

Пример 11. Получение конъюгата рекомбинантного человеческого интерферона бета-1а (rHu INF beta-2a) с сополимером ди-N-оксида 1,4-этиленпиперазина, N-оксида 1,4-этиленпиперазина, 1,4-оксиэтиленпиперазина, 1,4-этиленпиперазина и N-карбоксиметилен-1,4-этиленпиперазина.

Для конъюгации с белком используют полученный в Примере 7 полимерный носитель с молекулярной массой 20 кДа общей формулы (I), где k = 16 % , l = 42 %, m = 20 %, n = 17 % , p = 5 %. Используют рекомбинантный человеческий интерферон бета-2a (rHu INF beta-2a) квалификации «Ph.Eur» компании Relians Life Science Pvt. Ltd (Индия). При перемешивании и охлаждении (2-4 °С) в 5,0 мл раствора белка (14,0 мг белка, С_белка = 2,8 мг/мл; 10 мМ NaH₂PO₄, pH = 4,8) добавляют 45,0 мг NaCl и 14,0 мг полимерного носителя. Затем доводят рН до 4,6–4,7 (1М HCl) и добавляют порциями по 5 мкл каждые 30 минут 0,5 М водный раствор EDAC, контролируя ход реакции при помощи ионообменной ВЭЖХ. По мере достижения степени конъюгации 99+% (всего требуется примерно 50 мкл 0,5 М раствора EDAC), конъюгированный INF beta-2a очищают диализом (пленка 3,5 кДа; 0,15 M L-Arg, 10 мМ AcONa, рН = 4,8) и стерилизуют фильтрацией (0,2 мкм). Получают 6,0 мл бесцветного прозрачного раствора конъюгата INF beta-2a с концентрацией белка 2,20 мг/мл. Выход 94 %. Молекулярная масса конъюгата 40 кДа (SEC-HPLC). Удельная активность 1,0×10⁸ МЕ/мг (в расчете на белок).

Пример 12. Получение конъюгата рекомбинантного человеческого интерферона альфа-2b (rHu INF-α2b) с сополимером ди-N-оксида 1,4-этиленпиперазина, N-оксида 1,4-этиленпиперазина, 1,4-оксиэтиленпиперазина, 1,4-этиленпиперазина и N-карбоксиметилен-1,4-этиленпиперазина.

Для конъюгации с белком используют полученный в Примере 7 полимерный носитель с молекулярной массой 20 кДа общей формулы (I), где k = 16 % , l = 42 %, m = 20 %, n = 17 % , p = 5 %. Используют рекомбинантный человеческий интерферон альфа-2b квалификации «фармацевтическая субстанция» компании Intas Biopharmaceuticals Ltd. (Индия). При перемешивании и охлаждении (2-4 °С) в 20,0 мл раствора INF-α2b (60,0 мг белка, С_белка = 3,0 мг/мл; 10 мМ NaH₂PO₄, pH = 5,1) добавляют 180,0 мг NaCl и 60,0 мг полимерного носителя. Затем доводят рН до 4,7–4,8 (1М HCl) и добавляют порциями по 10 мкл каждые 30 минут 1 М водный раствор 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорида (EDAC), контролируя ход реакции по ионообменной ВЭЖХ. По мере достижения степени конъюгации 99+% (всего требуется примерно 100 мкл 1 М раствора EDAC), конъюгированный INF-α2b очищают диализом (пленка 3,5 кДа; 0,15 M NaCl, 20 мМ AcONa, рН = 5,1) и стерилизуют фильтрацией (0,2 мкм). Получают 25,0 мл бесцветного прозрачного раствора конъюгата INF-α2b с концентрацией белка 2,28 мг/мл. Выход 95 %. Молекулярная масса конъюгата 40 кДа (SEC-HPLC). Удельная активность 1,1×10⁸ МЕ/мг (в расчете на белок).

Пример 13. Исследование токсичности производных ди-N-оксидов поли-1,4 –этиленпиперазина общей формулы (I).

Исследовалась токсичность сополимеров общей формулы (I), полученных в Примерах 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8. Исследование каждого испытуемого образца проводят на 5 здоровых белых мышах обоего пола массой 20,0±0,5 грамм мышах. Навеску испытуемого образца 200 мг растворяют в 10,0 мл 0,9 % раствора NaCl и вводят внутривенно в хвостовую вену мыши в тест-дозе 0,5 мл (10 мг испытуемого вещества). Период наблюдения за животными составляет 7 суток. Клинический осмотр каждого животного проводят в течение первых трех часов после введения и далее один раз в сутки. Осмотр животных проводят в клетке содержания, в руках и на стационарной открытой площадке. Испытуемый образец считают нетоксичным, если в течение всего срока наблюдения отсутствует гибель животных, ни у одного из животных не проявляются признаки интоксикации и отсутствует снижение массы тела животных по сравнению с исходной.

На протяжении всего исследования испытуемые образцы сополимеров, полученные в Примерах 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 не проявили признаков токсичности.

Пример 14. Определение антирадикальной активности (АРА) сополимеров ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина общей формулы (I).

Недостатки известных способов оценки АРА заключаются в том, что измерения проводят непрямыми методами. Результаты измерений представляются в относительных единицах, в качестве эталонных веществ обычно используют аскорбиновую или галловую кислоты, проявляющие в разных условиях разную АРА, что не позволяет сравнивать результаты измерений АРА между собой. Данные недостатки устраняет использование прямого, безэталонного метода измерения АРА с применением электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) на модели 2,2-дифенил-1-пикрилгидразида (ДФПГ). Источником информации о значении АРА служит степень уменьшения парамагнитных центров ДФПГ при взаимодействии с исследуемым веществом. Измерения АРА проводят на ЭПР-спектрометре «Elexsys E500» с программным обеспечением «Xepr» (Bruker, США). Готовят 1,0 мл 1 мМ раствор ДФПГ в этаноле, затем готовят 1,0 мл 10 мМ раствор исследуемого вещества в дистиллированной воде. Далее к 1,0 мл раствора ДФПГ добавляют100 мкл раствора исследуемого вещества и через 30 минут после смешивания регистрируют ЭПР-спектры. В качестве базового сигнала служит ЭПР-спектр смеси 1,0 мл раствора ДФПГ и 100 мкл дистиллированной воды. Используя данные спектров, рассчитывают значение АРА по формуле (2):

АРА = C_D×(N₁-N₂)/N₁ (2), где:

АРА – антирадикальная активность, М-экв;

С_D – концентрация стабильного радикала ДФПГ в исходном растворе, М;

N₁ – начальное количество парамагнитных частиц ДФПГ;

N₂ – количество парамагнитных частиц ДФПГ после взаимодействия с исследуемым веществом.

Результаты измерений антирадикальной активности испытуемых образцов представлены в Таблице № 2.

Таблица № 2. Антирадикальная активность сополимеров ди-N-оксидов.

Сополимер	Молекулярная масса сополимера, кДа	Звенья сополимера, %	Антирадикальная активность (АРА), М-экв.
k	l	m	n	p
Пример 2	24	2	43	29	26	-	0,95±0,03
Пример 3	23	40	32	18	10	-	1,87±0,05
Пример 5	26	100	-	-	-	-	1,66±0,05
Пример 6	21	4	52	21	18	5	1,12±0,03
Пример 7	20	16	42	20	17	5	1,58±0,04
Пример 8	19	12	45	11	17	15	1,22±0,04

Литература.

1. Aaron L. Miller, W. Austin Elam, Betty H. Johnson, Shagufta H. Khan, Raj Kumar, E. Brad Thompson. Restored mutant receptor: Corticoid binding in chaperone complexes by trimethylamine N-oxide. PMID: 28301576 PMCID: PMC5354453 DOI: 10.1371/journal.pone. 0174183. http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0174183

2. J. Nicole Burns, Susan D. Orwig, Julia L. Harris, J. Derrick Watkins, Douglas Vollrath, and Raquel L. Lieberman. Rescue of glaucoma-causing mutant myocilin thermal stability by chemical chaperones. ACS Chem Biol. 2010 May 21; 5(5): 477–487. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2874607/

3. Bo Gong, Li-Yun Zhang, Chi-Pui Pang, Dennis Shun-Chiu Lam, and Gary Hin-Fai Yam. Trimethylamine N-oxide alleviates the severe aggregation and ER stress caused by G98R αA-crystallin. Mol Vis. 2009; 15: 2829–2840. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2796635/

4. Кабанов В.А., «От синтетических полиэлектролитов к полимер-субъединичным вакцинам», Лекции лауреатов Демидовской премии (1993-2004). Екатеринбург: Издательство Уральского университета, 2006, стр. 412-447.

5. Пучкова Н.Г., Некрасов А.В. и др., «Синтез и свойства полимерных алифатических N-окисей», журнал «Высокомолекулярные соединения», 1980, т. (А)ХXII, 6, стр. 1281-1285.

6. Вайнсон А.А., Мещерикова В.В., «Методика оценки специфической активности генно-инженерных препаратов Г-КСФ, интерферонов α,β и соматотропина in vitro», Российский биотерапевтический журнал, 2012, №3/том 11, стр. 29-32.

Патент US 3,532,709 (1965г).

https://www.google.ru/patents/US3532709?dq=US+patent+3532709&hl=ru&sa=X&ved=0ahUKEwi0qPKi85DZAhWkiKYKHbZ2C9YQ6AEIJzAA

1. Сополимеры ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина, обладающие антирадикальной активностью и свойствами защищать белки в условиях химического стресса, общей формулы I

,

где

X = Cl^-, Br^-, СН₃СОО^-, ОН^-;

k = 50-1000 (от 1 до 99% от общего количества звеньев);

l = 32-1000 (от 1 до 90% от общего количества звеньев);

m = 0-1000 (от 0 до 50% от общего количества звеньев);

n = 0-1000 (от 0 до 50% от общего количества звеньев);

p = 0-1000 (от 0 до 50% от общего количества звеньев).

2. Способ получения сополимеров ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина, имеющих общую формулу по п. 1, осуществляют путем катионной полимеризации 1,4-диазобицикло[2.2.2]октана при температуре от 150 до 230°C с последующим окислением полученного поли-1,4-этиленпиперазина водным раствором пероксида водорода.

3. Способ получения сополимеров ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина по п. 2, отличающийся тем, что окисление проводят при ультрафиолетовом облучении реакционной массы с длиной волны 254 нм.

4. Способ получения карбоксилсодержащих производных сополимеров ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина, имеющих общую формулу по п. 1, где р>0, осуществляют путем алкилирования поли-1,4-этиленпиперазина любой галогенуксусной кислотой в водных растворах, в водном растворе уксусной кислоты или в безводной уксусной кислоте, с последующим окислением полученного сополимера 1,4-этиленпиперазина и N-карбоксиметил-1,4-этиленпиперазина водным раствором пероксида водорода.

5. Способ получения карбоксилсодержащих производных сополимеров ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина по п. 4, отличающийся тем, что алкилирование поли-1,4-этиленпиперазина проводят бромуксусной кислотой.

6. Способ получения карбоксилсодержащих производных сополимеров ди-N-оксидов поли-1,4-этиленпиперазина по п. 4, отличающийся тем, что окисление проводят при ультрафиолетовом облучении реакционной массы с длиной волны 254 нм.