Способ выявления яиц гельминтов в пробах различных объектов окружающей среды
Владельцы патента RU 2737880:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии" (RU)
Изобретение относится к области санитарной паразитологии, экологии человека и ветеринарии, может быть использовано для достоверной оценки паразитарной нагрузки на некоторые объекты окружающей среды (почв, песка, сточных вод и их осадков, навоза и навозных стоков) и применено в санитарно-эпидемиологическом надзоре. Способ выявления яиц гельминтов в пробах различных объектов окружающей среды включает смешивание предварительно отмытого исследуемого образца с флотационным раствором и последующее микроскопирование всего объема флотанта, при этом в качестве флотационного раствора используют нитрата натрия плотностью 1,34 и осуществляют фильтрацию всего объема флотанта через аналитические трековые мембраны с диаметром пор 2,5-3,0 мкм. Изобретение обеспечивает повышение точности обнаружения паразитарного загрязнения за счет сокращения потери искомых патогенов на этапах исследования. 3 ил.
Предполагаемое изобретение относится к области санитарной паразитологии, экологии человека и ветеринарии, может быть использовано для достоверной оценки паразитарной нагрузки на некоторые объекты окружающей среды (почв, песка, сточных вод и их осадков, навоза и навозных стоков) и применено в санитарно-эпидемиологическом надзоре.
Представленное изобретение позволяет повысить выявляемость яиц гельминтов в изучаемых субстратах, а также достоверно оценить жизнеспособность выявленных возбудителей паразитозов.
В своей работе, с целью оптимизации выявления яиц гельминтов и минимизации потерь на этапах исследования, нами разработана модификация методики Романенко Н.А. «Способ выявления яиц гельминтов в пробах различных объектов окружающей среды». Основные принципы модификации: использование отобранных в процессе сравнительных исследований наиболее эффективных флотационных растворов, а именно раствора нитрата натрия с плотностью 1,34, в сочетании с фильтрацией всего объема рабочего раствора через аналитические трековые мембраны или мембранные фильтры с диаметром пор 2,5-3,0 мкм. Данный метод применим для исследования различных субстратов, таких как сточные воды, осадки сточных вод, почвы, смывы с плодово-овощной и плодово-ягодной продукции и др. Изобретение направлено на более точное обнаружение паразитарного загрязнения и достоверное определение инвазионности выявленных патогенов.
Все экологические пробы представляют собой сложную задачу для обнаружения и количественного определения яиц гельминтов. Разработка и усовершенствование существующих методов, применимых к исследуемым субстратам, является обязательным условием обеспечения стандартизации методов исследования и обеспечения достоверности результатов.
Количественная оценка загрязнения окружающей среды гельминтами создает серьезные технические проблемы: необходимы методы, обладающие достаточной чувствительностью для оценки низких, но эпидемиологически значимых концентраций паразитарных агентов в пробах объектов окружающей среды, в том числе, сточных вод и их осадков.
Отделение яиц гельминтов от твердых веществ в пробе вызывает затруднение, особенно при исследовании осадка, компоста и биосодержащих веществ в связи с их неоднородностью. Образцы с высокой концентрацией посторонних частиц (включая частицы почвы) могут легко захватывать яйца или прикрепляться к яйцам, что приведет к низкому уровню выявляемое™ или полному ее отсутствию.
Надежная количественная оценка жизнеспособных яиц имеет важное значение как в отношении целевых значений, основанных на риске, так и для подтверждения эффективности системы санитарии. Существуют общепринятые методы определения жизнеспособности: по внешнему виду, культивированием в оптимальных условиях и методом окрашивания витальными красками (МУК 4.2.2661-10 «Методы санитарно-паразитологических исследований», World Health Organization et al. Integrated guide to: Sanitary Parasitology. - World Health Organization. Regional Office for the Eastern Mediterranean, 2004. - №. WHO-EM/CEH/121/E.)
Известны способы определения яиц гельминтов путем извлечения их из исследуемого субстрата за счет флотации. Искомые патогены всплывают в верхние слои флотанта, и в то же время оседают более тяжелые частицы, такие как почва, осадок и другие.
Кардинально другой способ обнаружения яиц гельминтов в почве предложен авторами: Черникова Е.А., Новожилов К.А., Беребнев Б.Н. «Способ обнаружения яиц гельминтов в пробах почвы». Метод заключается в применении 1,5% перекиси водорода: в пробирку с почвой приливали 25 мл 1,5% перекиси водорода. Повторяли перемешивание и отстаивание еще 2 раза, т.е. всего 3 перемешивания. Оставленный субстрат отстаивался в течение 20-25 мин, затем смывали осевший на стенки субстрат. Ожидали окончания реакции перекиси и снимали пипеткой верхний слой, отличавшийся по цвету от остальной жидкости. Переносили на предметное стекло и микроскопировали (см. патент RU №2570935, кл. G01N 33/24; опубл. 20.12.2015.).
Недостатки метода: 1) Присутствие большого количества пузырьков перекиси водорода в поле зрения затрудняет просмотр материала при микроскопировании;
2) Снятие верхнего слоя жидкости не обеспечивает полного захвата искомых патогенов.
В качестве прототипа нами выбран общепринятый метод санитарно-паразитологических исследований - метод Романенко Н.А., где в качестве флотационного раствора используется насыщенный раствор нитрата натрия с плотностью 1,38-1,4 (Романенко Н.А., Падченко И.К., Чебышев Н.В. Санитарная паразитология. - М.: Медицина. - 2000. - 319 с). Для исследования почв по способу Романенко Н.А. берут навеску 25 г, помещают в центрифужную пробирку объемом 250 мл и приливают 150 мл воды. Смесь тщательно перемешивают стеклянной палочкой, а затем центрифугируют при 800-1000 об/мин. 5 мин. Сливают воду и при необходимости повторяют промывку. Затем в пробирку приливают 150 мл насыщенного раствора нитрата натрия с плотностью 1,38-1,4. Перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют при 800-1000 об/мин. 5 мин. Пробирку устанавливают в штатив, доливают тем же насыщенным раствором соли до уровня на 2-3 мм ниже краев пробирки и накрывают обезжиренным предметным стеклом. С помощью пипетки вносят насыщенный раствор соли до его соприкосновения с нижней стороной стекла, которое осторожно передвигают до полного покрытия центрифужной пробирки. Через 20-25 мин отстаивания стекла снимают, переворачивая нижней поверхностью вверх, а на их место помещают другие (при необходимости и третьи). На предметные стекла с поверхностной пленкой наносят 1-2 капли 30% раствора глицерина, накрывают их покровными стеклами, а затем микроскопируют.
Основным недостатком данного метода является потеря яиц в процессе флотации, так как происходит утрата искомых патогенов на этапах выполнения исследования. Все яйца гельминтов и цисты/ооцисты кишечных простейших имеют определенный удельный вес, в связи с чем они неравномерно распределяются в слоях флотационного раствора (Хроменкова Е.П. Санитарно-гельминтологическое обоснование мероприятий по охране окружающей среды как основа профилактики гельминтозов: Автореферат дис…канд.мед.наук. - М. - 1993. - 20 с.) и не все достигают поверхностной пленки, которую мы исследуем в конечном итоге.
Технический результат предлагаемого изобретения заключается в повышении точности обнаружения паразитарного загрязнения за счет сокращения потери искомых патогенов на этапах исследования, а также в достоверном определении инвазионности выявленных патогенов.
Целью первого этапа усовершенствования известного метода был поиск флотационных растворов с различным удельным весом, обеспечивающим наиболее эффективное выделение яиц гельминтов из объектов окружающей среды.
Поставленная задача решается тем, что способ выявления яиц гельминтов в пробах различных объектов окружающей среды включает смешивание предварительно отмытого исследуемого образца с флотационным раствором и последующее микроскопирование всего объема флотанта.
В соответствии с изобретением, в качестве флотационного раствора используют нитрата натрия плотностью 1,34 и осуществляют фильтрацию всего объема флотанта через аналитические трековые мембраны с диаметром пор 2,5-3,0 мкм.
Кроме того, при необходимости определения жизнеспособности выявленных яиц гельминтов осуществляют инкубирование при температуре +27±1°С в течение 2-х недель.
Кроме того, микроскопирование соскоба с фильтра осуществляют с добавлением 50% раствора глицерина.
Предлагаемый способ осуществлялся следующим образом.
Выявляемость оценивалась в зависимости от плотности флотационных растворов и удельного веса яиц гельминтов.
Материалом для проведения опытов была сточная вода после очистки и культура яиц Ascaris spp., Toxocara spp., Opistorchis felineus, Diphillobothrium latum, Teania spp., которую получали из маток соответствующих паразитов.
Исследования выполняли в соответствии с действующим МУК 4.2.2661-10 «Методы санитарно-паразитологических исследований» методом Романенко Н.А. для исследования сточной воды на яйца гельминтов.
Были получены результаты, которые свидетельствуют о недостаточной степени выявляемости яиц гельминтов при использовании метода Романенко Н.А. (не более 66%).
В связи с этим, нами была проведена замена исследования только поверхностной пленки флотационной жидкости, на исследование всего объема флотанта за счет включения этапа фильтрации.
Продолжение поиска наиболее эффективного флотационного раствора с целью достоверной оценки загрязнения объектов окружающей среды выполнялось с последующей модификацией методики санитарно-паразитологического исследования на примере сточной воды.
Исследуемую пробу обрабатывали по методике Романенко Н.А. Для этого брали 100 мл одного из анализируемых флотационных растворов, центрифугировали при 1000 об/мин 5 минут, проводили фильтрацию всего объема флотанта с использованием прибора вакуумного фильтрования типа ПВФ-35 через аналитические трековые мембраны или мембранные фильтры с диаметром пор 2,5-3,0 мкм. (см. табл. 1)
Изобретение проиллюстрировано таблицами. На фиг. 1 представлена таблица 1, где показана эффективность выявления яиц некоторых гельминтов в сточной воде с применением сочетания флотации и фильтрации (* фильтрация осуществлялась через аналитические трековые мембраны с диаметром пор 2,5-3,0 мкм.)
На фиг. 2 представлена таблица 2. где показаны результаты сравнения эффективности санитарно-паразитологических методов в зависимости от сроков исследования почвы.
На фиг. 3 - показана сравнительная эффективность предлагаемого метода и метода Романенко Н.А. при исследовании объектов окружающей среды (*1. Ascaris spp., 2. Toxocara spp., 3. Enterobius spp., 4. Teania spp., 5. Trichocephalus spp., 6. Thominx spp., 7. Diphyllobothrium spp., 8. Dicrocoelium spp.)
В результате исследований установлено, что выявляемость различных видов яиц гельминтов обеспечивается следующими флотационными растворами:
Яйца аскарид - раствор нитрата натрия (1,34) - 89,3%; раствор нитрата аммония (аммиачной селитры) (1,3) - 89,6%;
Яйца токсокар - раствор нитрата натрия (1,34) - 92,6%; раствор Бреза (1,28) - 98,0%;
Яйца описторхов - раствор нитрата натрия (1,34) - 89,4%, раствор Брудастова (1,48) - 97,2%;
Яйца дифиллоботриума - раствор нитрата натрия (1,4) - 199,1%, раствор нитрата натрия (1,34) - 90,5%;
Онкосферы тениид - раствор нитрата натрия (1,34) - 95,7%, раствор сульфата цинка (1,24) - 92,6%, раствор Брудастова (1,48) - 97,5%.
Проведенные исследования показали, что включение этапа фильтрации способствовало увеличению выявляемости тест-объектов с 60% до 98%, а также позволило наиболее полно выделить яйца гельминтов из исследуемого субстрата.
Наибольшей эффективностью выявления всех изучаемых тест-объектов обладает раствор нитрата натрия с плотностью 1,34. Эффективность выявления яиц Ascaris spp, Toxocara spp, Opistorchis felineus, Diphillobothrium latum и Teania spp.при использовании данного раствора составляет соответственно: 89,2%; 92,6%; 89,4%; 90,5%; 95,7%. Показано также, что флотационным раствором, обеспечивающим достаточно высокую эффективность выявления различного вида яиц: Ascaris suum, Toxocara spp, Opistorchis felineus, Diphillobothrium latum и Teania spp. является раствор нитрата натрия с плотностью 1,4 (71,3%; 80,8%; 77,6%; 99,1% и 76,6%). Сравнивая 12 изученных растворов, считаем, что, использовать как универсальный целесообразно раствор нитрата натрия с плотностью 1,34, который продемонстрировал высокую степень выявляемости основных паразитарных агентов, обладающих различным удельным весом.
Унификация заключается во включении в стандартный метод Романенко Н.А. дополнительного этапа фильтрации и изменение плотности флотационного раствора. После промывки субстрата водой к нему приливают флотационный раствор нитрата натрия плотностью 1,34. Объем насыщенного раствора зависит от величины стакана. Так в стакан объемом 250 мл приливали 150 мл раствора, перемешивали и центрифугировали при 1000 об/мин 5 мин. Затем раствор (надосадочную жидкость) фильтровали через аналитические трековые мембраны или мембранные фильтры с диаметром пор 2,5-3,0 мкм. После этого фильтр помещали в чашку Петри с фильтровальной бумагой, смоченной 1% раствором соляной кислоты (для предотвращения бактериального роста), инкубировали при температуре +27±1°С в течение 2-х недель с периодическим увлажнением и аэрированием (1 раз в 3 дня или по мере высыхания фильтровальной бумаги). По истечении двух недель с фильтров делали соскоб предметным стеклом на покровное стекло, добавляли каплю 50% раствора глицерина и микроскопировали.
Для оценки эффективности выявления яиц гельминтов были проведены сравнительные испытания трех способов: метода Романенко Н.А., метода по патенту RU 2570935 «Способ обнаружения яиц гельминтов в пробах почвы», и предлагаемого нами «Способа выявления яиц гельминтов в пробах различных объектов окружающей среды» на примере почвы. Результаты представлены в таблице 2.
Способ обнаружения яиц гельминтов в пробах почвы с применением 1,5% перекиси водорода (согласно патенту №2570935) показал себя как малоэффективный, максимальный процент выявления яиц гельминтов составил 30,9%. Просмотр материала при исследовании данным методом затруднялся присутствием большого количества пузырьков в поле зрения. Установлены большие потери яиц гельминтов на этапах исследования и микроскопирования субстрата (более 70,0%), так как снятие верхнего слоя жидкости не обеспечивает полного захвата искомых патогенов.
Стандартный метод Романенко Н.А. также показал недостаточную эффективность (от 48,3 до 70,6%). Об этом также свидетельствовали исследования, проведенные ранее (см. табл. 2). Потеря яиц гельминтов, по-видимому, происходит на конечном этапе флотации, так как сцепление с предметным стеклом не у всех объектов может произойти одновременно. Кроме того, возможно также послойное распределение яиц гельминтов во флотационном растворе и некоторые объекты не достигают поверхностной пленки.
Наиболее эффективным методом санитарно-паразитологических исследований, на примере санитарно-паразитологического исследования почв, в проведенных сравнительных исследованиях показал себя предложенный нами «Способ выявления яиц гельминтов в пробах различных объектов окружающей среды». При применении этой методики минимизируется потеря яиц за счет исследования всего флотирующегося раствора и концентрации паразитарных патогенов на фильтрационных материалах. Установлено, что во всех повторениях опытов по отработке унификации метода Романенко Н.А. эффективность выявления яиц гельминтов была наибольшей по сравнению с вариантами сравнения и составляла от 77,4 до 83,4%. Выявленные яйца гельминтов хорошо просматривались во время микроскопических исследований, подсчет не затруднялся различными примесями. Также данный метод позволяет наиболее достоверно оценить жизнеспособность паразитарных агентов за счет возможности культивирования яиц гельминтов в оптимальных условиях.
Нами были проведены также натурные испытания, которые подтвердили результаты предшествующих лабораторных исследований (см. Табл. 3).
Рекомендуемый нами метод позволяет повысить эффективность выявления яиц гельминтов в объектах окружающей природной среды. Он может быть использован в очагах гельминтозов как для количественного, так и для качественного определения паразитарных агентов в изучаемых субстратах. В очагах смешанных инвазий его можно использовать для индикации загрязненности объектов окружающей среды.
Способ выявления яиц гельминтов в пробах различных объектов окружающей среды, включающий смешивание предварительно отмытого исследуемого образца с флотационным раствором и последующее микроскопирование всего объема флотанта, отличающийся тем, что в качестве флотационного раствора используют нитрат натрия плотностью 1,34 и осуществляют фильтрацию всего объема флотанта через аналитические трековые мембраны с диаметром пор 2,5-3,0 мкм.
