Способ коррекции атерогенеза в эксперименте с помощью 1-гидроксигерматрана

Изобретение относится к медицине, фармакологии и биологии и касается способа снижения общей (суммарной) активности лизосомального липолитического фермента – кислой фосфолипазы А1 (кФЛА1). Сущность способа заключается в том, что животному вводят внутримышечно композицию, содержащую 1-гидроксигерматран и фармацевтически приемлемый водный носитель. При этом доза активного вещества составляет 5,0 мг/кг массы животного. Препарат вводят ежедневно в течение 2 месяцев. Использование способа позволяет снизить активность кФЛА1, обеспечивая снижение гиперлипидемий и предотвращение атеросклеротических поражений кровеносных сосудов. 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к медицине, фармакологии и биологии и касается нового средства, влияющего на активность фосфолипаз.

Фосфолипазы играют важную роль в обмене липидов в живых организмах. Составной частью многих тканей и секретов живых организмов являются фосфолипазы группы А. Фосфолипазы А1 в большинстве своем - внутриклеточные ферменты, часто мембраносвязанные, не нуждаются в коферменте. Их молекулярные массы варьируют в пределах 15-90 тыс.; оптимальная каталитическая активность проявляется при pH 4,0 (для лизосомальных ферментов) или 8,0-9,5 (для ферментов микросом, плазматических мембран и цитозоля); широко распространены в животных тканях (печень, сердце, мозг) и в микроорганизмах (Bacillus subtilis, В. megateiium, Mycobacter phlei, Escherichia coli). Фосфолипазы А1 отщепляют ацильную цепь фосфолипида в sn-1 положении. При действии фосфолипазы А1 на фосфолипид образуется 1-лизофосфолипид и жирная кислота.

Доказано, что фосфолипазы являются биомаркерами активности атеросклеротического процесса [см. Душкин М.И. Макрофаги и атеросклероз: патофизиологические и терапевтические аспекты. // Бюлл. СО РАМН (2006); № 2 (120), с.47-55], эффективности проводимой терапии как у больных атеросклерозом, так и у больных с осложнениями атеросклероза, в частности ишемической болезни сердца - ИБС (стенокардией напряжения II ФК) [см. Богданова С.Н. Клинико-экспериментальное изучение влияния фактора питания на активность лизосомальных гидролаз тромбоцитов и мононуклеарных лейкоцитов при атеросклерозе. Автореф. дисс. канд., Москва (1992), 28 с., Данковцев Е.Н., Затейщиков Д.А. Биомаркеры в кардиологии: липопротеинассоциированная фосфолипаза А2. // Фарматека (2007); № 15 (149). Кардиология, неврология, с.22-28].

Известно, что на раннем этапе атерогенеза происходит активация эндотелия, который экспрессирует на своей поверхности адгезионные молекулы для моноцитов, нейтрофилов и лейкоцитов крови и продуцирует хемоаттрактанты, привлекающие моноциты в интиму сосудов. Моноциты, мигрирующие в субэндотелиальное пространство, дифференцируются в макрофаги, которые выступают как катализаторы образования окисленных ЛНП, миграции и пролиферации гладкомышечных клеток из мышечной оболочки в интиму. Частицы модифицированных ЛНП предпочтительно захватываются с помощью специфических рецепторов макрофагами, которые трансформируются в пенистые клетки. Активированные макрофаги, продуцирующие металлопротеиназы и коллагеназу, в определенных ситуациях способствуют распаду коллагена в бляшке и возникновению такого грозного осложнения, как разрыв бляшки, образование тромба и развитие инфаркта миокарда. Липидный профиль в значительной мере определяется состоянием макрофагов, их ферментативными реакциями. В этом плане заслуживают внимания исследования и разработка средств, изменяющих активность липаз макрофагов, в частности кислой фосфолипазы А1 (кФЛА1) (КФ 3.1.1.32) с оптимумом pH 4,0, вызывающей деградацию структуры фосфолипидов, отщепляя ацильные остатки от углеродных атомов C₁ в молекуле лецитина и других фосфолипидов с образованием промежуточных продуктов гидролиза - лизолецитина и лизофосфолипидов, обладающих сильным мембранотоксическим действием [см. Покровский А.А., Тутельян В.А. Лизосомы. - Наука, 1976, 380 с., Брокерхоф X., Дженсен Р. Липолитические ферменты, пер. с англ., М., 1978, с.242-356.].

В литературе имеются сведения о возможности снижения общей (суммарной) активности ФЛА различными химическими соединениями [см. Губергриц Н.Б. «Эссенциале форте Н», «Эссенциале Н» в гепатологии и гастроэнтерологии. Сучасна гастроентерологiя, № 5 (43), 2008, с.79-89].

Известно также, что при введении некоторых препаратов, например, липостабила, который оказывает гиполипидемическое действие, происходит активация кислых и щелочных фосфолипаз [см. Самсонов М.А., Васильев А.В., Погожева А.В., Бобкова С.Н. Сравнительная оценка гиполипидемического действия ПНЖК w-3 и липостабила. //Вопр. питания, 1996, № 4, с.12-16].

Однако существует потребность в поиске и внедрении в практику новых диагностических и лекарственных средств, обладающих активностью в отношении фосфолипаз.

В качестве ближайшего аналога может быть указан способ снижения общей активности кФЛА1 с использованием комплекса трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка (см. Расулов М.М., Воронков М.Г., Стороженко П.А., Мирскова А.Н., Снисаренко Т.А., Абзаева К.А., Ваганов М.А. Применение комплекса трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метил-феноксиацетатом) цинка для снижения общей активности кислой фосфолипазы А1// Патент на изобретение RU №2545888, 10.04.2015).

Комплекс трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка (аналог), или цитримин (цинкатран), обладает широким спектром терапевтического действия и имеет формулу: (HOCH₂CH₂)₃N⋅Zn(OOCCH₂OC₆H₄CH₃^-2)₂

и вид:

К недостатку прототипа можно отнести небольшой эффект угнетения активности фосфолипазы.

Заявляемое изобретение относится к приоритетному направлению развития науки и технологий «Биомедицинские и ветеринарные технологии жизнеобеспечения и защиты человека и животных» [см. Алфавитно-предметный указатель к Международной патентной классификации по приоритетным направлениям развития науки и технологий / Ю.Г. Смирнов, Е.В. Скиданова, С.А. Краснов - М.: ПАТЕНТ, 2008. - с.15].

Задача настоящего изобретения состоит в разработке нового средства, которое возможно использовать для понижения общей активности лизосомального липолитического фермента - кислой фосфолипазы А1.

Технический результат - расширение арсенала способов воздействия на активность кислой фосфолипазы А1 путем применения средства - 1-гидроксигерматрана, за счет его новой выявленной биологической активности, а именно, способности снижать суммарную активность кФЛА1.

Поставленная задача решается тем, что в качестве средства, понижающего общую активность кислой фосфолипазы А1, предлагается использовать синтезированное ранее (см. Воронков М.Г., Адамович С.Н. и др. Синтез новых биологически активных O-гидрометаллоатранов //ЖОХ, 2009, т.79, №1, С.162-163), биологически активное соединение - 1-гидроксигерматран, который имеет формулу:

1-гидроксигерматран, или герматранол-гидрат, имеет следующий вид:

Известно свойство герматранол-гидрата стимулировать экспрессию матричной РНК триптофанил-тРНК-синтетазы [см. Расулов М.М., Стороженко П.А. и др. Герматранол-гидрат, стимулирующий экспрессию матричной РНК триптофанил-тРНК-синтетазы. Патент РФ № 2553986 С1, 20.06.2015].

1-гидроксигерматран может быть использован в клинической медицине для создания препаратов, обладающих антигиперлипидемическим действием и не имеющих побочных эффектов.

Заявляемая биологическая активность 1-гидроксигерматрана в качестве средства, обладающего свойством снижать активность кислой фосфолипазы А1, не была известна и в литературе не описана.

Впервые показано, что введение 1-гидроксигерматрана влияет на активность лизосомального липолитического фермента из класса гидролаз (КФ 3.1.1): кФЛА1 (КФ 3.1.1.32).

Таким образом, предлагается способ снижения общей (суммарной) активности лизосомального липолитического фермента - кислой фосфолипазы А1, включающий введение композиции, которая содержит 1-гидроксигерматран в качестве активного вещества, а также фармацевтически приемлемый водный носитель, экспериментальному животному внутримышечно ежедневно в течение 2 месяцев в дозе активного вещества 5,0 мг/кг массы животного.

При этом в качестве фармацевтически приемлемого водного носителя предлагается использование официальной дистиллированной воды, воды для инъекций или официального физиологического раствора - 0,9% раствора натрия хлорида.

При этом раствор готовится «ex tempore» и может содержать 5-20 мас.% 1-гидроксигерматрана.

При разработке изобретения авторы использовали различные растворители для получения средства для воздействия на активность кФЛА1. Были испытаны различные растворы на водной основе, в частности раствор вышеуказанного активного вещества в воде для инъекций, официальной дистиллированной воде и в официальном 0,9% растворе натрия хлорида. При этом во всех случаях были получены аналогичные результаты. Следует отметить, что нами исследовались полученные таким образом растворы с различной концентрацией активного вещества - 1-гидроксигерматрана (5%, 10%, 20%, 50%, 70%). При этом положительные эффекты от их использования, отмеченные ниже, значимо не различались. В исследованиях использовали различные дозы активного вещества: от 0,1 мг/кг до 20 мг/кг массы животного. Эффект угнетения активности фермента кФЛА1 присутствовал во всех случаях и был прямо пропорционален дозе используемого активного вещества. Соответственно, для достижения указанного нами технического результата важным является как таковое новое свойство данного соединения, а не его доза или конкретный водный растворитель. Поэтому ниже, в примере, приведен для демонстрации только опыт с использованием активного вещества в дозе 5,0 мг/кг массы животного ежедневно. В данном случае применяли раствор активного вещества, который приготовляли ex tempore, используя официальный физиологический раствор (0,9% натрия хлорида), смешивая с ним активное вещество.

Возможность осуществления изобретения может быть проиллюстрирована следующими данными.

Пример

Эксперименты проводили на кроликах шиншилла с исходной массой тела 1,8-2,0 кг в соответствии с «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации». Правила утверждены приказом Министерства здравоохранения РФ от 19.06.2003 г №267 (Правила лабораторной практики в Российской Федерации Министерства здравоохранения РФ Приказ от 19 июня 2003 года № 267 http:// www. kodeks.ru (24 апреля 2010г)). Животных содержали в соответствии с правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемыми для экспериментальных и иных научных целей. По окончании эксперимента животным проводили эвтаназию цервикальной дислокацией 5-го позвонка, соблюдая правила «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986).

1-гидроксигерматран смешивали «ex tempore» до полного растворения в официальном 0,9% растворе натрия хлорида.

Комплекс трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка (аналог, цитримин) так же смешивали «ex tempore» до полного растворения в официальном 0,9% растворе натрия хлорида.

Гиперлипидемию вызывали методом Аничкова-Халатова (известная экспериментальная модель развития атеросклероза).

Животных группировали по 10 голов следующим образом:

1) группа опыта, которым вводили внутримышечно свежеприготовленный раствор 1-гидроксигерматрана в дозе активного вещества 5,0 мг/кг массы животного ежедневно в течение 2 месяцев.

2) группа плацебо-контроля, которым вводили внутримышечно эквиобъемное количество официального 0,9% раствора натрия хлорида ежедневно в течение 2 месяцев.

3) группа животных, получавших внутримышечно свежеприготовленный раствор аналога - цитримина (цинкатрана) в дозе активного вещества 5,0 мг/кг массы животного ежедневно в течение 2 месяцев.

Эталоном служили данные, полученные у интактных кроликов.

В конце экспериментов у животных в грудном отделе аорты стандартными методами определяли содержание липидов, триацилглицеринов, β-липопротеинов и холестерина. Для определения активности кислой фосфолипазы А1 из кусочков грудной аорты диспергированием выделяли клетки интимы известным методом [см. Нагорнев В.А. Методология в изучении проблемы атеросклероза. // Мед. акад. ж. 2005, т.5, в.3, с.121-133]. Для этого использовали раствор (0,5 мл), содержащий коллагеназу - тип 4 и эластазу - тип 3 («sigma», США). Время диспергирования - 75 мин при 37°С (1 мл/50 мг ткани). Полученную суспензию клеток промывали холодным раствором Хенкса. Осадок при последней промывке гомогенизировали в 2 мл 0,25М раствора сахарозы pH 7,4 с 0,001 м ЭДТА. Конечное разведение гомогенатов аорты соответствовало 1:20 (вес : объем). Супернатант использовали для исследования активности кислой фосфолипазы А1. Активность кФЛА1 определяли спектрофотометрически по известному методу [см. Булычев А.Г., Семенова Е.Г., Ассиновская О.А. Влияние агрегации нейтрального красного, акридинового оранжевого и хлористого аммония клетками (сублинии) на активность лизосомальных гидролаз. // Цитология. - (1986). Т.28, № 7. С.703-711], используя в качестве субстрата β-нафтилкаприлат («sigma», США). К 0,2 мл исследуемого материала добавляли 0,5 мл субстратного раствора в 0,2 М ацетатного буфера, pH 5,2, с 0,2% тритоном Х-100, инкубировали на водяной бане в течение 30 мин при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 0,5 мл «fast blue В» («serva», ФРГ) (1 мг/мл в 0,05 М фосфатного буфера, pH 7,2), через 5 мин добавляли 1 мл 10% охлажденного раствора трихлоруксусной кислоты, еще через 3 мин - 1,5 мл этилового эфира уксусной кислоты, затем образцы встряхивали, центрифугировали на центрифуге WKH-1 при 150 g 15 мин. Отбирали 0,5 мл верхней фазы в микрокювету и проводили спектрометрию при 525 нм. Суммарную активность кФЛА1 выражали в микромолях β-нафтола, образовавшегося за 1 мин на 1 г белка.

Статистическую обработку данных проводили методом Стьюдента. Данные представляли в виде средних и стандартных значений ошибки - М и m, соответственно. Достоверными считали различия при р ≤ 0,05 (см. Петри А., Сэбин К., 2009).

Результаты ферментативного анализа представлены в таблице 1 и демонстрируют улучшение липолитических показателей и уровня кФЛА1 при использовании заявленного способа как по сравнению с группой контроля, так и по сравнению с использованием аналога (цитримина, цинкатрана).

Корреляционный анализ выявил связь средней силы между уровнем активности кФЛА1 и показателями липидного обмена после введения 1-гидроксигерматрана (таблица 2).

Активацию системы лизосомального липолиза можно рассматривать как компенсаторную реакцию ферментных систем на фоне преобладания неспецифического, нерегулируемого эндоцитоза модифицированных липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) или надмолекулярных ЛПНП-содержащих комплексов. При этом в условиях субстратного насыщения может возникнуть относительная недостаточность отдельных лизосомальных ферментов (в частности, кФЛА1), расщепляющих этерифицированный холестерин (ЭХС), что приводит к аккумуляции ЭХС и триглицеридов в клетках крови и повышению риска развития атеросклероза [см. Нагорнев В.А. Методология в изучении проблемы атеросклероза. // Мед. акад. ж. 2005, т.5, в.3, с.121-133.]. Наряду с этим изменения в состоянии лизосомального аппарата интимы можно расценивать и как адаптационные перестройки на стадии липоидоза, и как результат функциональной недостаточности на стадии образования фиброзной бляшки.

Таким образом, реакции кислой фосфолипазы указывают на структурно- функциональные нарушения в деятельности субклеточных структур при развитии атеросклероза и, соответственно, полезными могут быть средства - модуляторы таких реакций. Установление новых свойств 1-гидроксигерматрана позволит использовать его, например, для повышения устойчивости сосудистой системы к холестерину при развитии атеросклеротического процесса, гиперлипидемии. Также он может быть использован для образования вторичных посредников или предшественников в синтезе биологически активных веществ - эйкозаноидов. Ввиду важности выявленного механизма корреляции активности ферментной системы в зависимости от состояния организма 1-гидроксигерматран можно будет использовать не только для профилактики и/или лечения состояний, связанных с нарушением нормальной функции фосфолипазы А1 макрофагов, но и при скрининге, например, соединений, обладающих аналогичной активностью.

Таблица 1.

Показатели липидного обмена при применении 1-гидроксигерматрана

Показатели	Ткань аорты
Эталон - интактные
Липиды общие (мМ/л)	0,2±0,014
Холестерол (мМ/л)	0,11±0,02
Триацилглицерины (мМ/л)	0,13±0,01
β-липопротеины (мМ/л)	0,09±0,002
Кислая фосфолипаза А1 (мкМ/мин/ на 1г белка)	0,9±0,03
Плацебо - контроль
Липиды общие (мМ/л)	5,1±0,09**
Холестерол (мМ/л)	4,2±0,9**
Триацилглицерины (мМ/л)	4,16±0,1**
β- липопротеины (мМ/л)	4,1±0,1**
Кислая фосфолипаза А1 (мкМ/мин/ на 1г белка)	5,3±0,2**
Аналог - цитримин в дозе 5,0 мг/кг
Липиды общие (ммоль/л)	1,52±0,07* **
Холестерол (ммоль/л)	2,15±0,05* **
Триацилглицерины (ммоль/л)	2,8±0,08* **
β-липопротеины (ммоль/л)	1,61±0,04* **
Кислая фосфолипаза А1 (мкМ/мин/ на 1г белка)	2,15±0,1* **
Опыт - 1-гидроксигерматран в дозе 5,0 мг/кг
Липиды общие (мМ/л)	0,66±0,01* **
Холестерол (мМ/л)	0,22±0,05* **
Триацилглицерины (мМ/л)	0,19±0,03* **
β-липопротеины (мМ/л)	0,12±0,01* **
Кислая фосфолипаза А1 (мкМ/мин/ на 1г белка)	0,97±0,04* **

Примечание: * - p<0.05 по отношению к плацебо - контролю;

** - p<0.05 по отношению к эталону.

Таблица 2.

Коэффициенты корреляции (r) активности кислой ФЛА1 в ткани аорты с показателями липидного обмена при использовании 1-гидроксигерматрана

Энзим	Липиды общие	Холестерол	Триацил - глицерины	β-липо-протеины
кФЛА1	r=0,37	r=0,38	r=0,43	r=0,42

1. Способ снижения общей (суммарной) активности лизосомального липолитического фермента – кислой фосфолипазы А1, включающий введение животному лекарственного средства, отличающийся тем, что в качестве такого средства используют композицию, содержащую 1-гидроксигерматран и фармацевтически приемлемый водный носитель, которую вводят животному внутримышечно в дозе 5,0 мг активного вещества/кг массы животного ежедневно в течение 2 месяцев.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют композицию, полученную ex tempore смешиванием 1-гидроксигерматрана и фармацевтически приемлемого водного носителя.

3. Способ по любому из пп. 1 или 2, отличающийся тем, что в качестве водного носителя используют воду для инъекций, официальную дистиллированную воду или официальный физиологический раствор.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что композиция может содержать 5-20 мас.% 1-гидроксигерматрана.