Интрогрессия qtl урожая в растения cucumis sativus

Авторы патента:

КАНГАЛ Гюлай (NL)

ТЭНКСЛИ Стивен Д. (US)

КРААН Петер Арнолд Гийсберт (NL)

БЕЕНДЕРС Франк (NL)

ГЕРМАНС Фредди (NL)

КАСА Александра М. (US)

КУЛЕВЕЙН Ханс-Петер (NL)

ВАН ДЕ ВАЛ Марион (NL)

РЁЛИНГ Герхард Т.М. (NL)

C12Q1/6895 - Способы измерения или испытания, использующие ферменты или микроорганизмы (устройства для измерения или испытания при работе с ферментами или микроорганизмами, например счетчики колоний C12M 1/34); составы для них; способы получения подобных составов

A01H5/08 - плоды

A01H5/00 - Цветковые, например покрытосеменные растения

A01H1/04 - способы селекции

A01H1/00 - Способы модификации генотипов (A01H 4/00 имеет преимущество)

Владельцы патента RU 2741964:

НУНХЕМС Б.В. (NL)

Изобретение относится к области биохимии, в частности к культивированному растению Cucumis sativus var. sativus, обладающему увеличенным урожаем плодов, к его части, семени, плоду, а также к его клетке. Также раскрыт способ идентификации культивированного растения С.sativus var. sativus, включающего рекомбинантную хромосому 3, а также к способу обнаружения содержит ли культивированное растение огурца фрагмент интрогрессии на хромосоме 3. Изобретение также относится к способу идентификации растения дикого родственника огурца, содержащего QTL урожая на хромосоме 3. Изобретение позволяет эффективно получать растение Cucumis sativus var. sativus, обладающее увеличенным урожаем плодов. 8 н. и 13 з.п. ф-лы, 5 табл., 2 пр.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к области разведения огурцов. Присутствует локус количественных признаков (QTL), расположенный на хромосоме 3 генома огурца, который может применяться для увеличения урожая культивированных огурцов (Cucumis sativus var. sativus), таких как корнишоны (например, виды American pickling, European pickling), салатные огурцы (например, American slicing), длинные огурцы, короткие огурцы. Европейские тепличные огурцы, огурцы типа Бейт-Альфа, огурцы типа oriental trellis (также обозначаемые как 'burpless'), Азиатские огурцы (которые могут быть далее подразделены на различные типы, такие как индийский пестрый огурец, китайский длинный огурец, корейский огурец и японский огурец, причем первый относится к индийской группе огурцов, а последние три к восточноазиатской группе огурцов).

QTL обозначается в настоящей заявке как QTL3.1. Также обеспечиваются культивированные растения огурца, содержащие фрагмент интрогрессии на хромосоме 3, содержащей QTL3.1, причем фрагмент интрогрессии значительно увеличивают урожай плодов культивированного огурца, содержащего интрогрессию по сравнению с таким же культивированным огурцом, не содержащим интрогрессию. Фрагмент интрогрессии, содержащий QTL3.1, происходит из дикого родственника огурца. Одно растение дикого родственника огурца было использовано для создания двойной гаплоидной популяции, которая затем использовалась для картирования и для интрогрессии QTL в европейский длинный тип огурца. Из этого типа QTL легко переносится в любой другой культивированный тип огурца, такой как короткие типы огурцов, или в другие линии разведения или сорта длинного огурца. Семена, содержащие фрагмент интрогрессии, депонировали под номером доступа NCIMB 42346.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения культивированное растение огурца, содержащее фрагмент интрогрессии на хромосоме 3 обеспечивается, содержащий QTL3.1, в результате чего фрагмент интрогрессии значительно увеличивает выход плодов культивированного огурца, содержащего интрогрессию, по сравнению с тем же культивированным огурцом, у которого нет интрогрессии. Также один или более молекулярных маркеров (особенно однонуклеотидные полиморфизмы или SNP), которые присутствуют на фрагменте интрогрессии и которые указывают на присутствие фрагмента интрогрессии, и способы применения таких маркеров обеспечиваются настоящим изобретением. Подобным образом получают семена, части растений, клетки и/или ткани, содержащие QTL3.1 в их геноме и имеющие, в противном случае, геном культивированного огурца в их геноме. Отмечают, что термин «геном культивированного огурца» не исключает, что существуют другие фрагменты интрогрессии во всем геноме, например, на других хромосомах и/или для других признаков.

Подобным образом, семена, части растения, семена и/или ткани, содержащие QTL3.1 на хромосоме 3 и содержащие, в противном случае, хромосому 3 культивированного огурца в их геноме обеспечиваются. В одном варианте выполнения настоящего изобретения растения, семена, части растения, клетки и/или ткани содержат фрагмент интрогрессии из дикого родственника огурца, причем фрагмент интрогрессии содержит QTL3.1, где QTL локализуется физически в области, начинающейся при 21.5 Мб и заканчивающейся при 27.23 Мб хромосомы 3. Таким образом, в одном варианте выполнения настоящего изобретения вся или часть области, начинающейся при 21.5 Мб и заканчивающейся при 27.23 Мб хромосомы 3, происходит из дикого родственника огурца и содержит положительный QTL урожая (QTL3.1 или его вариант). В одном варианте выполнения настоящего изобретения другие области хромосомы 3, т.е. от 0 Мб до 21.5 Мб и/или от 27.23 Мб до конца хромосомы 3, содержат или состоят из хромосомных областей культивированного огурца.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения культивированное растение Cucumis sativus var. sativus, содержащее фрагмент интрогрессии из дикого родственника огурца на хромосоме 3 в гомозиготной или гетерозиготной форме, обеспечивается, где указанный фрагмент интрогрессии содержит локус количественных признаков (QTL), локализованный между маркером однонуклеотидного полиморфизма SNP_01 при нуклеотиде 75 последовательности SEQ ID NO: 1 (или варианта последовательности SEQ ID NO: 1) и маркером однонуклеотидного полиморфизма SNP_27 при нуклеотиде 75 последовательности SEQ ID NO: 27 (или варианта последовательности SEQ ID NO: 1), где QTL обеспечивает увеличение урожая плодов огурца. В одном варианте выполнения настоящего изобретения QTL локализуется между основанием 21,507,892 (SNP_01) и основанием 27,233,985 (SNP_27) хромосомы 3.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения QTL3.1 (т.е. фрагмент интрогрессии, содержащий QTL) присутствует в гетерозиготной форме в культивированном растении огурца, клетке или ткани, особенно в длинном огурце. В другом варианте выполнения настоящего изобретения QTL3.1 (т.е. фрагмент интрогрессии, содержащий QTL) присутствует в гомозиготной форме в культивированном растении огурца, клетке или ткани, особенно в длинном огурце. В конкретном варианте выполнения настоящего изобретения культивированное растение огурца представляет собой F1 гибрид, особенно F1 гибрид, полученный скрещиванием двух инбредных родительских линий, причем по меньшей мере одна из родительских линий содержит QTL3.1 (т.е. фрагмент интрогрессии, содержащий QTL) в гомозиготной форме. В конкретном варианте выполнения настоящего изобретения культивированное растение огурца не содержит какие-либо другие фрагменты интрогрессии на хромосоме 3 генома огурца, которые влияют на урожай. В другом варианте выполнения настоящего изобретения, могут присутствовать другие фрагменты интрогрессии на хромосоме 3, например, на различных областях хромосомы.

Уровень техники

Культивированный огурец (Cucumis sativus var. sativus L.) является важной овощной культурой во всем мире. Он принадлежит к семейству Cucurbitaceae. Предполагается, что он происходит из Юго-Восточной Азии от диких предков с небольшими горькими плодами, такими как Cucumis sativus сорт hardwickii.

Геном культивированного огурца имеет семь пар хромосом (n=7), и размер гаплоидного генома составляет около 367 Мб (мегабазы) с общей оценкой около 26,682 генов. Геном огурца стал первым геномом овощной культуры, который был секвенирован (Huang et al. 2009, Nature Genetics, Volume 41, Number 12, p 1275-1283 и http://www.icugi.org/cgi-bin/gb2/gbrowse/cucumber_v2/).

Урожай культивированного огурец в последние десятилетия не увеличился. Shetty и Wehner 2002 (CropSci. 42: 2174-2183) провели скрининг USDA коллекции зародышевой плазмы огурца по качеству плодов и урожайности плодов в полевых условиях в Северной Каролине (США) и предположили, что культурные сорта с высокой урожайностью, выявленные в их исследовании, могут быть использованы для разработки культурных сортов с высокой урожайностью.

В WO 2009/082222 применялись сведения, полученные Shetty и Wehner в 2002 (выше) для экземпляров Turkish Beit-Alpha местный сорт PI 169383, для идентификации QTL для массы плодов огурцов на стадии сбора урожая на группе сцепления 3 и/или 4 для PI 69383. Этим донором является местный сорт огурца Turkish Beit-Alpha (который не является диким родственником огурца) и не содержит маркеры SNP согласно настоящему изобретению. Кроме того, в патентной заявке описываются растения огурца, содержащие замещение всей хромосомы 3, т.е. вся хромосома 3 взята из донора PI 169383.

Wei et al. 2014 (BMC Genomics 15: 1158, p 1-10) раскрывают генетическую карту длины незрелого и зрелого плода и массы незрелого плода в популяции, полученной в результате скрещивания между китайской инбредной линией огурца (СС3) и NC76. NC76 получен из местного сорта Cucumis sativus var. sativus из Афганистана (PI 246930) (который не является диким родственником огурца) и имеет короткие плоды (7~10 см). Посредством скрещивания NC76 с короткими плодами с СС3 с длинными плодами, они получили генетическую карту QTL в сегрегации популяции F2 для длины плода (незрелого и зрелого) и массы незрелого плода, как представлено в дополнительном файле 6. Они обнаружили два QTL для длины незрелого плода (f13.1 и f13.2), два QTL для массы незрелого плода (fw3.1 и fw3.2) и один QTL для длины зрелого плода (mf13.1) на группе сцепления 3 (LG3), в дополнение к другому QTL для длины незрелого плода на LG 1 (f11.l) и LG6 (f16.1), но они не раскрывают какой-либо информации в отношении урожая плодов в общем.

Fazio et al. 2003 (Theor Appi Genet 107: 864-874) нанесли на генетическую карту признаки, включая накопленные плоды на растение за три урожая и морфологические признаки, такие как мелколистность ('11'). Их группа сцепления 6 как оказалось, соответствует физической хромосоме 3. Они нанесли на генетическую карту один QTL, называемый fp16.1, который оказал положительный эффект на кумулятивное число плодов на растение за три сбора урожая (число плодов на растение измеряли при трех моментах времени сбора урожая) к маркеру OP-AG1-2 при положении 40.8 сМ. Его обнаружили только в одном положении. Они также нанесли на генетическую карту другой QTL, называемый nfp6.2, который оказывал положительный эффект на число плодов на растение, к маркеру AK5-SCAR в положении 38.6 сМ. Этот QTL обнаружили в одном положении и обнаружили при всех трех сборах урожая в этом положении. Эти QTL физически локализуются ниже половины хромосомы 3 (около 3.0 Мб), тогда как QTL согласно настоящему изобретению локализуется выше половины хромосомы 3, между 2 1.50 Мб и 27.23 Мб хромосомы 3.

Тем не менее, по-прежнему существует потребность в определении QTL для урожая плодов огурца, чтобы иметь возможность увеличить урожайность плодов современных сортов огурца.

Общие определения

Форма единственного числа не исключает возможность, что присутствует более, чем один элемент, если исходя из контекста не следует, что присутствует один и только один из элементов. Форма единственного числа, таким образом, как правило, означает "по меньшей мере один".

Как применяется в настоящей заявке, "растение" включает в себя целое растение или любые части или их производные, такие как органы растений (например, собранные или несобранные органы накопления запасных питательных веществ, клубни, плоды, листья, семена, и т.д.), растительные клетки, протопласты растений, культуры растительных клеток или тканей, из которых могут быть регенерированы целые растения, каллусы растений, скопления клеток растений и растительные клетки, которые являются интактными в растениях, или части растений, такие как зародыши, пыльца, семяпочки, завязи, плоды (например, собранные ткани или органы, такие как собранные плоды огурца или их части), цветы, листья, семена, клубни, луковицы, размноженные клонами растения, корни, корнеплоды, стебли, верхушки корней и тому подобное. Также включена любая стадия развития, такая как саженцы, незрелые и зрелые, и т.д. Когда упоминаются «семена растения», они либо относятся к семенам, из которых растение может быть выращено, или к семенам, произведенным на растении, после самоопыления или перекрестного опыления.

«Сорт растения» представляет собой группу растений в пределах одного и того же ботанического таксона наименьшей известной степени, которая (независимо от того, выполнены ли условия для признания прав селекционера растений или нет) может быть определена на основе выражения признаков, которую в результате определенного генотипа или комбинации генотипов можно отличить от любой другой группы растений посредством выражения по меньшей мере одного из этих признаков, и можно рассматривать как единое целое, потому что можно размножать без какого-либо изменения. Поэтому термин «сорт растения» не может применяться для обозначения группы растений, даже если они одного вида, если все они характеризуются наличием одного или двух локусов или генов (или фенотипических характеристик, обусловленных этими конкретными локусами или генами), но которые могут сильно отличаться друг от друга в отношении других локусов или генов.

"F1, F2, F3, и т.д." относится к последовательным родственным поколениям после кросса между двумя родительскими растениями или родительскими линиями. Растения, выращенные из семян, полученных скрещиванием двух растений или линий, называют поколением F1. Самоопыление растений F1 приводит к поколению F2 и т.д.

Растение "F1 гибрид" (или F1 гибридное семя) представляет собой поколение, полученное скрещиванием двух инбредных родительских линий. Таким образом, F1 гибридные семена представляют собой семена, из которых вырастают F1 гибридные растения. F1 гибриды являются более сильными и дают более высокий урожай, благодаря гетерозису. Инбредные линии, по существу, являются гомозиготными в большинстве локусов генома.

Термин "линия растения" или "линия скрещивания" относится к растению и его потомству. Как применяется в настоящей заявке, термин "инбредная линия" относится к линии растений, которая неоднократно самоопылялась и является почти гомозиготной. Таким образом, термин "инбредная линия" или "родительская линия" относится к растению, которое подвергалось нескольким генерациям (например, по меньшей мере 5, 6, 7 или более) инбридинга, приводя к линии растения с высокой однородностью.

Термин "аллель (аллели)" означает любую одну или более альтернативные формы гена в конкретном локусе, все аллели которого относятся к одному признаку или характеристике в конкретном локусе. В диплоидной клетке организма аллели данного гена расположены в определенном месте или локусе (множество локусов) на хромосоме. Один аллель присутствует на каждой хромосоме пары гомологичных хромосом. Диплоидные виды растений могут содержать большое количество различных аллелей в определенном локусе. Это могут быть одинаковые аллели гена (гомозиготные) или два разных аллеля (гетерозиготные). Таким образом, например, в настоящей заявке может быть сделана ссылка на "аллель урожая" локуса урожая QTL3.1.

Термин «ген» означает последовательность (геномную) ДНК, содержащую область (транскрибируемый участок), которая транскрибируется в молекулу информационной РНК (мРНК) в клетке и функционально связанную регуляторную область (например, промотор). Различные аллели гена представляют собой, таким образом, различную альтернативную форму гена. которая может быть в виде, например, различий в один или более нуклеотидов в геномной последовательности ДНК (например, в промоторной последовательности, экзонных последовательностях, интронных последовательностях и т.д.). мРНК и/или аминокислотной последовательности кодируемого белка.

Термин "локус" (множество локусов) означает определенное место или места или участок на хромосоме, где обнаруживается, например QTL, ген или генетический маркер. Таким образом, локус урожая (локус увеличения урожая) является местом в геноме огурца, где QTL3.1 обнаруживается. В культивированном огурце QTL находятся на хромосоме 3 (применяя хромосомное ассигнование из Huang et al. 2009, Nature Genetics, Volume 41, Number 12, p 1275-1283 и http://www.icugi.org/cgi-bin/gb2/gbrowse/cucumber_v2/) т.е. они интрогрессированы в геном культивированного огурца (т.е. на хромосому 3) из дикого родственника огурца.

Термин "локус количественных признаков", или "QTL" представляет собой хромосомный локус, который кодирует один или более аллелей, которые влияют на экспрессивность непрерывно распределенного (количественного) фенотипа. Локус количественных признаков, обеспечивающий увеличенный урожай (или "QTL урожая"), называют в настоящей заявке QTL3.1.

"Геном огурца" и "физическое положение в геноме огурца" и "хромосома 3" относятся к физическому геному культивированного огурца, во всемирном интернет-пространстве на icugi.org/cgi-bin/gb2/gbrowse/cucumber_v2/, и физическим хромосомам и физическому положению на хромосомах. Поэтому, например, SNP_01 расположен на нуклеотиде (или 'основании'), физически расположенном в месте нуклеотида 21,507,892 хромосомы 3, которая имеет физический размер от 0 до 39,47 Мб (т.е. 39,474,669 оснований).

«Физическое расстояние» между локусами (например, между молекулярными маркерами и/или между фенотипическими маркерами) на одной и той же хромосоме представляет собой фактически физическое расстояние, выраженное в основаниях или парах оснований (пары оснований), килооснованиях или парах килооснований (тысяча пар оснований) или мегабазах или парах мегабаз (Мб).

«Генетическое расстояние» между локусами (например, между молекулярными маркерами и/или между фенотипическими маркерами) на одной и той же хромосоме измеряется частотой кроссинговера или частотой рекомбинации (RF) и указывается в сантиморганах (сМ). Одному сМ соответствует частота рекомбинации 1%. Если никакие рекомбинанты не могут быть найдены, RF равна нулю, и локусы либо очень близки друг к другу физически, либо идентичны. Чем дальше расположены два локуса, тем выше RF.

"Фрагмент интрогрессии" или "сегмент интрогрессия" или "область интрогрессия" относится к фрагменту хромосомы (или части или области хромосомы), который был введен в другое растение того же или родственного вида путем скрещивания или традиционных методов разведения, таких как обратное скрещивание, т.е. интрогрессированный фрагмент является результатом методов размножения, ссылающихся на глагол «интрогрессировать» (например, обратное скрещивание). В отношении огурцов дикие или примитивные огурцы (например, местные сорта) или дикие родственники культивированного огурца могут применяться для интрогрессии фрагментов дикого генома в геном культивированного огурца, Cucumis sativus var. sativus L. Такое культивированное растение огурца, таким образом, имеет "геном культивированного Cucumis sativus var. sativus", но содержит в геноме фрагмент дикого или примитивного огурца (например, местный сорт) или дикого родственника огурца, например, фрагмент интрогрессии генома дикого родственника Cucumis sativus, такого как Cucumis sativus сорт hardwickii, С.sativus сорт sikkimensis Cucumis sativus сорт xishuangbannesis, или другого дикого родственника огурца. Поэтому, например, согласно настоящему изобретению обеспечивается культивированный огурец, содержащий геном культивированного огурца, и в этом геноме один фрагмент интрогрессии на хромосоме 3 культивированного огурца, которые сообщают увеличенный урожай по сравнению с геномом культивированного огурца, не содержащим фрагменты интрогрессии (и имеющим хромосому 3 культивированного огурца без фрагмента интрогрессии). Понятно, что термин "фрагмент интрогрессии" не включает хромосому целиком, а только часть хромосомы. Фрагменты интрогрессии могут быть большими, например, составлять три четверти или половину хромосомы, но предпочтительно он меньше, как например, около 15 Мб или менее, как например, около 10 Мб или менее, около 9 Мб или менее, около 8 Мб или менее, около 7 Мб или менее, около 6 Мб или менее, около 5 Мб или менее, около 4 Мб или менее, около 3 Мб или менее, около 2.5 Мб или 2 Мб или менее, около 1 Мб (равно 1,000,000 пар оснований) или менее, или около 0.5 Мб (равно 500,000 пар оснований) или менее, как например, около 200,000 пар оснований (равно 200 пар килооснований) или менее, около 100,000 пар оснований (100 тысяч пар оснований) или менее, около 50,000 пар оснований (50 тысяч пар оснований) или менее, около 25.000 пар оснований (25 тысяч пар оснований) или менее.

"Культивированный огурец" или "одомашненный огурец" относится к растениям Cucumis sativus var. sativus т.е. сорта, линии скрещивания или культивары, культивированные людьми и имеющие хорошие агрономические характеристики, в частности производящих съедобные и маркируемые плоды хорошего качества и однородности; такие растения не являются растением "дикого родственника огурца" или "примитивного огурца", т.е. растениями, которые в общем дают намного более плохие урожаи и имеют более плохие агрономические характеристики, чем культивированные растения, и являются менее однородными генетически и по их физиологическим и/или морфологическим характеристикам. "Дикие растения" включают, например, экотипы, местные сорта или дикие экземпляры или дикие родственники видов. Культивированные растения огурца (линии или сорта) также могут отличаться от дикого или примитивного огурца значительно более низким количеством SNP (менее 2,000,000 SNP) и INDEL (вставки/делеции более короткие, чем 5 пар оснований; менее 150,000 INDEL) в геноме и их значительно более низкой нуклеотидной плотностью (равна или менее 2.3×10^-3 π), как описано в Таблица 1 в Qi et al, Nature Genetics December 2013.Vol 45.No. 12, pages 1510-1518. Число SNP, число INDEL и нуклеотидную плотность можно определить, как описано в настоящей заявке, в частности в части 'Способы'.

«Индийская группа огурцов» относится к диким огурцам или диким родственникам огурцов из Индии, имеющим большое числом SNP (более 3000000 SNP) и INDEL (вставки/делеции короче 5 пар оснований, более 200000 INDEL) в геноме и высокую нуклеотидную плотность (более 3.0×10^-3 π или даже более 4.0×10^-3 π).

"Евразийская группа огурцов" относится к культивированным огурцам из центральной или западной Азии, Европы и Соединенных Штатов, имеющим низкое число SNP (менее 2.000,000 SNP. или менее 1,500.000 SNP) и INDEL (вставки/делеции короче 5 пар оснований; менее 150,000 INDEL, предпочтительно менее 100.000) в геноме и низкую нуклеотидную плотность (равна или менее 2.3×10^-3 π, предпочтительно менее 2.0×10^-3 π).

"Восточноазиатская группа огурцов" относится к культивированным огурцам из Восточной Азии, как например, Китай, Корея и Япония, имеющим низкое число SNP (менее 2,000,000 SNP, или менее 1,500,000 SNP) и INDEL (вставки/делении короче 5 пар оснований; менее 150,000 INDEL, предпочтительно менее 100,000) в геноме и низкую нуклеотидную плотность (равна или менее 2.3×10^-3 π, предпочтительно менее 2.0×10^-3 π или даже менее 1.5×10^-3 π).

"Группа огурцов Xishuangbanna" относится к огурцам из области Xishuangbanna в Китае, имеющим низкое число SNP (менее 2,000,000 SNP, или менее 1,500,000 SNP или даже менее 100,000 SNP) и INDEL (вставки/делеции короче 5 пар оснований; менее 150,000 INDEL, предпочтительно менее 100,000) в геноме и низкую нуклеотидную плотность (равен или менее 2.3×10^-3 π, предпочтительно менее 2.0×10^-3 π или даже менее 1.5×10^-3 π).

"Дикий огурец" или "примитивный огурец" относится к С. sativus var. sativus, которые обычно дают гораздо более плохие урожаи и имеют более плохие агрономические характеристики, чем культивированные растения и менее однородны генетически и по своим физиологическим и/или морфологическим характеристикам. Дикие растения включают, например, экотипы, местные сорта или дикие экземпляры или дикие родственники вида.

"Дикий родственник (родственники) огурца" относятся к Cucumis sativus сорт hardwickii, С. sativus сорт sikkimensis, Cucumis sativus сорт xishuangbannesis.

"Местный сорт (сорта)" относится к примитивным культиварам Cucumis sativus var. sativus, разработанным в местных географических регионах, которые часто демонстрируют высокую степень генетической изменчивости в их геноме и проявляют высокую степень морфологической и/или физиологической изменчивости в пределах местного сорта (например, большая вариация в размере плода, и т.д.), т.е. являются значительно менее однородными, чем культивированный огурец. Местные сорта, поэтому, согласно настоящему изобретению включены в группу "дикий огурец, которая отличается от "культивированного огурца.

"Однородность" или "однородные" относится к генетическим и фенотипическим характеристикам линии растения или сорта. Инбредные линия являются весьма генетически однородными, поскольку их получают путем нескольких генераций инбридинга. Подобным образом, и F1 гибриды, которые получают из таких инбредных линий, являются весьма однородными по своим генотипическим и фенотипическим характеристикам и производительности.

Термин "аллель урожая" относится к аллелю, обнаруживаемому в локусе урожая QTL3.1, интрогрессированному в культивированный огурец (на хромосоме 3 культивированного С.sativus var. sativus) из дикого родственника огурца. Термин "аллель урожая", таким образом, также охватывает аллели урожая, получаемые из других экземпляров Cucumis. Когда один или два аллеля урожая присутствуют в локусе в геноме (т.е. в гетерозиготной или гомозиготной форме), линия или сорт растения дает значительно более высокий урожай плодов, чем генетический контроль, не содержащий QTL. В культивированном растении огурца, не содержащем фрагмент интрогрессии, аллель С. sativus var. sativus, обнаруживаемая в том же локусе на хромосоме 3, согласно настоящему изобретению обозначается как аллель "дикого типа" (wt). Так как QTL урожая являются доминантными, растения wt/wt показывают стандартный урожай, тогда как растения QTL3.1/wt и растения QTL3.1/QTL3.1 представляют собой растения, которые обладают фенотипом увеличенного урожая, обеспечиваемым аллелем (аллелями) урожая. Генотип SNP маркеров, раскрытых в настоящей заявке, также указывает на дикий тип или QTL либо в гомозиготной, либо в гетерозиготной форме. Например, генотип SNP_01, указывающий на QTL3.1 представляет собой 'ТС' (QTL3.l/wt) или 'ТТ' (QTL3.1/QTL3.1), тогда как генотипом, указывающим на дикий тип, является 'СС' (wt/wt).

Генетический элемент, фрагмент интрогрессии или ген или аллель, сообщающий признак (такой как урожай) считается "получаемый из" или может быть "получен из" или "происходящий из" или может "происходить из" или "как присутствует в" или "как обнаружено в" растении или семени или ткани или клетки, если он может быть перенесен из растения или семени, в котором он присутствует, в другое растение или семя, в котором он не присутствует (как например линия или сорт), используя традиционные методы разведения, не приводящие к фенотипическому изменению растения-реципиента, за исключением добавления признака, сообщаемого генетическим элементов, локусом, фрагментом интрогрессии, геном или аллелем. Термины используются взаимозаменяемо, и генетический элемент, локус, фрагмент интрогрессии, ген или аллель могут, таким образом, быть перенесены в любой другой генетический фон, лишенный этого признака. Могут применяться не только семена, депонированные и содержащие генетический элемент, локус, фрагмент интрогрессии, ген или аллель, но также потомство/потомки таких семян, которые были отобраны для сохранения генетического элемента, локуса, фрагмента интрогрессии, гена или аллеля, могут применяться и охватываются настоящим изобретением, как например коммерческие сорта, разработанные из депонированных семян или из их потомства. Содержит ли растение (ли геномная ДНК, клетка или ткань растения) тот же самый генетический элемент, локус, фрагмент интрогрессии, ген или аллель, как получено из депонированных семян, может быть определено специалистом в данной области техники, используя одну или более методик, известных в данной области, таких как фенотипические анализы, секвенирование всего генома, анализ молекулярного маркера, нанесение признаков на генетическую карту, роспись хромосомы, тесты аллеморфизма и тому подобное, или комбинации методик.

"Вариант" или "ортолог" последовательности (вариантная или ортологическая последовательность) или "вариант QTL3.1" относится к QTL урожая (QTL3.1), или фрагменту интрогрессии, содержащему QTL, которые получены из других растений диких родственников огурца, чем QTL3.1, присутствующий в NCIMB 42346, но вариант которых содержит один или более SNP, связанных с QTL3.1. и где вариантная геномная последовательность имеет существенную идентичность последовательности с SEQ ID NO: содержащей SNP (любой одной последовательностью из SEQ ID NO: 1-27), т.е. имеет идентичность последовательности по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более. Таким образом, когда в настоящем описании делается ссылка на определенный генотип SNP в определенной геномной последовательности (выбранной из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 27), это охватывает также генотип SNP в вариантах геномной последовательности, т.е. генотип SNP в геномной последовательности, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 98%, 99% с последовательностью, на которую ссылаются (выбранной из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 27). Таким образом, любая ссылка в настоящей заявке на любую одну из последовательностей SEQ ID NO: 1-27 в одном варианте также охватывает вариант любой одной из SEQ ID NO: 1-27, причем указанный вариант имеет идентичность последовательности по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более с указанной последовательностью.

"Урожай" или "урожай плодов" или "средний урожай" относится к среднему числу плодов на растение (FrPP) и/или средней массе плода (граммы) на растение (GrPP). Их определяют для каждой линии растения, гибрида или сорта, выращенных при таких же условиях (например, линия, гибрид или сорт с QTL и генетический контроль без QTL), и среднее FrPP и/или GrPP каждой линии, гибрида или сорта вычисляют. В зависимости от типа огурца, урожай плодов измеряют различными путями. Так, например, типы, которые производят плоды непрерывно в течение определенного периода времени, такие как поступающие на рынок в свежем виде (например, длинные типы огурцов, такие как Европейский тепличный огурец, мини-или миди-типы), плоды собираются, когда они достигают товарного размера, и сбор урожая производится в течение определенного периода времени упоминается как «период сбора урожая» (например, период сбора урожая начинается, когда первые плоды достигают товарного размера и могут иметь длину, соответствующую по меньшей мере 10. 11, 12 или более неделям). Так, например, среднее FrPP и/или GrPP на линию измеряется на день и складывается в течение всех дней в конце периода сбора, чтобы рассчитать кумулятивное FrPP и/или GrPP для каждой линии или сорта (смотрите также примеры). «Товарный размер» относится к плодам, которые являются достаточно длинными и достаточно тяжелыми для продажи.

Таким образом, плоды товарного размера собирают в момент времени, который является оптимальным или около оптимального для товарного плода и плода для продажи. Для длинных типов огурцов, таких как Европейский тепличный огурец, товарный размер достигается, когда плод составляет по меньшей мере около 26 или 27 см в длину и имеет минимальную массу 250 грамм. Для типов огурцов, которые собирают только в один момент времени, таких как корнишоны, "урожай" или "урожай плодов" или "средний урожай" относится к среднему числу плодов, составляющих или выше 1.5 см по диаметру, на растение (FrPP) и/или среднюю массу плодов (граммы), составляющих или выше 1.5 см по диаметру, на растение (GrPP) в единый момент времени сбора урожая. Единый момент времени сбора урожая соответствует практике выращивания и выбран для максимального увеличения количества плодов, имеющих диаметр 1,5 см и 5,0 см. В зависимости от желаемого размера плода момент времени, как правило, достигается, когда около 5%, около 10%, около 15% или около 20% плодов больше по размеру (т.е. имеют диаметр плода, равный 5.0 см или более). Уборка производится вручную или машинным сбором. Таким образом, в одном варианте собирают все плоды на растение и подсчитывают и/или взвешивают только те, которые имеют диаметр по меньше мере 1,5 см (т.е. подсчитываются и/или взвешиваются все плоды с диаметром по меньше мере 1,5 см, в том числе и негабаритные).

"Увеличенный урожай плодов" или "значительно увеличенный урожай плодов" относится к линии или сорту культивированного растения огурца, содержащим фрагмент интрогрессии на хромосоме 3, содержащий QTL3.1, дающим (благодаря QTL) статистически значительно более высокое среднее число плодов на растение (FrPP) и/или значительно более высокую среднюю массу плода на растение (GrPP), по сравнению с растением генетического контроля, не содержащим фрагменты интрогрессии на хромосоме 3, при выращивании в экспериментах на урожай в тех же условиях. Предпочтительно полевые условия проводятся с несколькими повторениями (2, 3. или предпочтительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, или более) с достаточным количеством растений (например, по меньшей мере 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, или более растений на линию), содержащих фрагмент интрогрессии на хромосоме 3 и не содержащих фрагмент интрогрессии на хромосоме 3 (т.е. генетические контроли).

"Генетический контроль" представляет собой линию, сорт или гибрид огурца, который имеет такой же или очень подобный культурный геном, как и растение огурца, содержащее интрогрессию на хромосоме 3, за исключением того, что не содержит интрогрессии на хромосоме 3, т.е. хромосома 3 является "дикого типа", т.е. геном культивированного огурца. Например, семена, депонированные под номером доступа NCIMB 42346 представляют собой семена тестового гибрида F1, полученного между линией интрогрессии (огурца длинного типа), содержащей QTL3.1 на хромосоме 3, и элитной линией скрещивания огурца (огурца длинного типа), тогда как генетическим контролем, депонированным под номером NCIMB 42345, являются семена рекуррентного родителя линии интрогрессии (не содержащей QTL3.1) и той же элитной линия скрещивания огурца.

Термин "анализ маркера" относится к анализу молекулярного маркера, который может применяться, чтобы протестировать присутствует ли на хромосоме 3 культивированного С. sativus var. sativus интрогрессия из дикого родственника огурца, фрагмент интрогрессии которых содержит QTL урожая (QTL3.1) (или содержит ли дикий родственник огурца QTL3.1 в его геноме), путем определения генотипа любого одного или более маркеров, связанных с QTL3.1, например, например, генотипа одного или более SNP маркеров, выбранных из SNP_01 -SNP_27, и/или любого специфичного для генома дикого родственника огурца маркера между SNP маркерами SNP_01 и SNP_27, и/или в пределах 7 сМ или в пределах 5 сМ, 3 сМ, 2 сМ, 1 сМ любого одного из этих маркеров, и/или в пределах 5 Мб, 3 Мб, 2 Мб, 1 Мб, 0.5 Мб, 0.1 Мб, 50 кб, 20 кб, 10 кб, 5 кб, 2 кб, 1 кб или менее любого одного из этих маркеров. Маркер "между" двумя маркерами физически располагается между маркерами на хромосоме.

SNP маркеры, приведенные в настоящей заявке, т.е. SNP_01 - SNP_27, локализуются в данном порядке на фрагменте интрогрессии. "Последовательные" маркеры относятся к маркерам в том же порядке последовательности, так например, двумя последовательными маркерами могут быть SNP_01 и SNP_02; SNP_02 и SNP_03; SNP_03 и SNP_04, и т.д.. и тремя последовательными маркерами могут быть SNP_01 и SNP_02 и SNP_03; SNP_02 и SNP_03 и SNP_04; и т.д.

"Среднее значение" или "среднее" относится согласно настоящему изобретению к среднему арифметическому значению, и оба термина используются взаимозаменяемо. Термин "среднее значение" или "среднее", таким образом, относится к среднему арифметическому значению для нескольких измерений. Специалисту в данной области техники понятно, что фенотип линии растения или сорта зависит в некоторой степени от условий произрастания, и поэтому измеряются средние арифметические значения для по меньшей мере 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 или более растений (или частей растений), предпочтительно в рандомизированных экспериментальных моделях с несколькими повторениями и подходящими контрольными растениями, выращенными при тех же условиях в том же эксперименте. "Статистически значимый" или "статистически значимо" отличный или "значительно" отличный относится к характеристике линии растения или сорта, которые, при сравнении с подходящим контролем (например, в настоящей заявке, генетическим контролем), показывают статистически значимое отличие их характеристик (например, р-значение составляет менее 0.05, р<0.05, применяя ANOVA) от (среднего значения) контроля.

"Рекомбинантная хромосома" относится к хромосоме, имеющей новый генетический облик, возникающий в результате кроссинговера между гомологичными хромосомами, например "рекомбинантная хромосома 3", т.е. хромосома 3, которая не присутствует ни в одном из родительских растений и возникла в результате редкого события кросеинговера между гомологичными хромосомами пары хромосомы 3. Согласно настоящему изобретению обеспечиваются, например, рекомбинантная хромосома огурца 3, содержащая интрогрессию из дикого родственника огурца.

Термин "традиционные методы разведения" согласно настоящему изобретению охватывает скрещивание, обратное скрещивание, самоопыление, селекцию, получение двойного галоида, эмбриональное спасение, слияние протопластов, выбор с помощью маркера, мутационную селекцию и т.д. как известно селекционеру (т.е. методы, отличные от методов генетической модификации/трансформации/трансгенных методов), посредством которых, например, рекомбинантную хромосому 3 можно получить, идентифицировать и/или переносить.

"Обратное скрещивание" относится к методу селекции, с помощью которого (одиночный) признак, такой как QTL урожая, может быть перенесен из более низшего генетического фона (например, дикого родственника огурца или огурца дикого типа; также обозначается как «донор») в высший генетический фон (также обозначается как "рекуррентный родитель"), например культивированный огурец. Потомство кросса (например, растение F1, полученное скрещиванием дикого родственника огурца с культивированным огурцом; или растение F2 или растение F3, и т.д., полученное самоопылением F1) является "обратно скрещенным" до родителя с высшим генетическим фоном, например культивированного родителя. После повторного обратного скрещивания, признак низшего генетического фона будет включен в высший генетический фон.

"Выбор с помощью маркера" или "MAS" представляет собой процесс использования присутствия молекулярных маркеров, которые генетически связаны с определенным локусом или с определенной областью хромосомы (например, фрагмент интрогрессии), для выбора растений по присутствию конкретного локуса или области (фрагмент интрогрессии). Например, молекулярный маркер, генетически связанный с QTL урожая, может применяться для обнаружения и/или выбора растения огурца, содержащего QTL урожая на хромосоме 2 и/или 6. Чем ближе генетическая связь молекулярного маркера с локусом (например около 7 сМ, 6 сМ, 5 сМ, 4 сМ, 3 сМ, 2 сМ, 1 сМ, 0.5 сМ или менее), тем менее вероятно, что маркер диссоциирует от локуса посредством мейотической рекомбинации. Аналогично, чем ближе два маркера связаны друг с другом (например, в пределах 7 сМ или 5 сМ, 4 сМ, 3 сМ, 2 сМ, 1 сМ или менее), тем менее вероятно, что два маркера будут отделены друг от друга (и, скорее всего, они будут совместно выделяться как единое целое).

Маркер "в пределах 7 сМ или в пределах 5 сМ, 3 сМ, 2 сМ, или 1 сМ" другого маркера относится к маркеру, который генетически привязывается к области, фланкирующей маркер, в пределах 7 сМ или 5 сМ, 3 сМ, 2 сМ, или 1 сМ (т.е. с обеих сторон маркера). Подобным образом, маркер в пределах 5 Мб, 3 Мб, 2.5 Мб, 2 Мб, 1 Мб, 0.5 Мб, 0.4 Мб, 0.3 Мб, 0.2 Мб, 0.1 Мб, 50 кб, 20 кб, 10 кб, 5 кб, 2 кб, 1 кб или менее, области геномной ДНК, фланкирующей маркер (т.е. с обеих сторон маркера).

"LOD-оценка" (логарифм (основание 10) расхождений) относится к статистическому тесту, часто используемому для анализа сцепления в популяциях животных и растений. Оценка LOD сравнивает вероятность получения тестовых данных, если эти два локуса (локусы молекулярных маркеров и/или локусы фенотипических признаков) действительно сцеплены, с вероятностью наблюдения одних и тех же данных чисто случайно. Положительные оценки LOD свидетельствуют о наличие сцепления, и оценка LOD выше 3.0 рассматривается как очевидное сцепление. Оценка LOD, равная +3, указывает на вероятность от 1000 до 1, что наблюдаемое сцепление не происходит случайно.

"Вегетативное размножение", "вегетативная репродукция" или "клональное размножение" применяются в настоящей заявке взаимозаменяемо и означают способ, в котором берут часть растения и позволяют части растения образовать по меньшей мере корни, где часть растения, например, определяется как или происходит из (например, путем разрезания) листа, пыльцы, зародыша, семядолей, гипокотиля, клеток, протопласт, меристематической клетки, корня, кончика корня, пестика, пыльника, цветка, кончика побега, побега, стебля, плода, черешка и т.д. Когда целое растение регенерируется путем вегетативного размножения, это также обозначается как вегетативное размножение.

"Клеточная культура" или "тканевая культура" относится к in vitro культуре клеток или тканей растения.

"Регенерация" относится к развитию растения из клеточной культуры или тканевой культуры или вегетативному размножению.

Термин "неразмножающаяся клетка" относится к клетке, которая не может регенерироваться в целое растение.

"Трансген" или "химерный ген" относится к генетическому локусу, содержащему последовательность ДНК, такую как рекомбинантный ген, который был введен в геном растения путем трансформации, такой как трансформация, опосредованная Agrobacterium. Растение, содержащее трансген, стабильно интегрированный в его геном, обозначается как "трансгенное растение".

"Выделенная последовательность нуклеиновой кислоты" или "выделенная ДНК" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая больше не находится в природной среде, из которой она была выделена, например, последовательности нуклеиновой кислоты в бактериальной клетке-хозяине или в ядерном или пластидном геноме растении.

"Клетка-хозяин" или "рекомбинантная клетка-хозяин" или "трансформированная клетка" являются терминами, относящимися к новой индивидуальной клетке (или организму), возникающей в результате по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты, введенной в указанную клетку. Клетка-хозяин предпочтительно является растительной клеткой или бактериальной клеткой. Клетка-хозяин может содержать нуклеиновую кислоту в качестве экстрахромосомно (эписомальной) реплицирующейся молекулы, или содержать нуклеиновую кислоту, интегрированную в ядерный или пластидный геном клетки-хозяина, или в качестве введенной хромосомы, например минихромосомы.

"Идентичность последовательности" и "сходство последовательности" можно определить выравниванием двух пептидных или двух нуклеотидных последовательностей с использованием глобальных или локальных алгоритмов выравнивания. Последовательности могут затем обозначаться как «по существу идентичные" или "весьма подобные", когда они оптимально выровнены, например, с помощью программы GAP или BESTFIT или фильтрующей программы "Needle" (с использованием параметров по умолчанию, см. ниже), определяя по меньшей мере определенный минимальный процент идентичности последовательности (как определено ниже). Эти программы используют глобальный алгоритм выравнивания Нидлмана-Вунша для выравнивания двух последовательностей по всей длине, получая максимальное количество совпадений и сводя к минимуму количество гэпов. Обычно параметры по умолчанию используется штраф за открытие гэпа = 10 и штраф за расширение гэпа = 0,5 (как для нуклеотидного, так и белкового выравнивания). Для нуклеотидов применяемой матрицей весов замен является DNAFULL, и для белков матрицей весов замен является Blosum 62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89. 915-919). Выравнивания последовательности и показатели процентной идентичности последовательности, например, могут быть определены с помощью компьютерных программ, таких как EMBOSS, как доступно во всемирной сети по адресу ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/. Альтернативно подобие или идентичность последовательности могут быть определены с помощью функции поиска в базах данных, таких как FASTA, BLAST и т.д., но совпадения должны быть получены и приведены в соответствие попарно, чтобы сравнить идентичность последовательности. Два протеина или два белковых домена или две последовательности нуклеиновых кислот имеют «существенную идентичность последовательности», если идентичность последовательности в процентах составляет по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более (например по меньшей мере 99.1, 99.2 99.3 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 или более (как определено с помощью Emboss "needle", используя параметры по умолчанию, т.е. штраф за открытие гэпа = 10. штраф за расширение гэпа = 0.5, используя матрицу весов замен DNAFULL для нуклеиновых кислот, и Blosum62 для белков).

Когда делается ссылка на последовательность нуклеиновой кислоты (например, ДНК или геномную ДНК), имеющую "последовательность, по существу идентичную" ссылочной последовательности или имеющую последовательность, идентичную на по меньшей мере 80%, например по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.2%, 99.5%, 99.9% ссылочной последовательности, в одном варианте выполнения настоящего изобретения указанная нуклеотидная последовательность рассматривается как по существу идентичная данной нуклеотидной последовательности и может быть идентифицирована, используя строгие условия гибридизации. В другом варианте выполнения настоящего изобретения, последовательность нуклеиновой кислоты содержит одну или более мутаций, по сравнению с данной нуклеотидной последовательностью, но все еще может быть идентифицирована, используя строгие условия гибридизации.

"Строгие условия гибридизации" могут применяться для идентификации нуклеотидных последовательностей, которые по существу идентичны данной нуклеотидной последовательности. Строгие условия зависят от последовательности и будут отличаться в разных обстоятельствах. Как правило, строгие условия выбираются так, что составляют на около 5°С точки плавления (Tm) для конкретных последовательностей при определенной ионной силе и рН. Tm представляет собой температуру (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% целевой последовательности гибридизуется идеально подобранным зондом. Обычно выбирают такие строгие условия, при которых концентрация соли составляет около 0,02 моля при рН 7, а температура составляет по меньшей мере 60°С. Уменьшение концентрации соли и/или повышение температуры увеличивает жесткость условий. Строгие условия для гибридизаций РНК-ДНК (нозерн-блоты с использованием зонда, например, 100 нт) являются, например, теми, которые включают по меньшей мере одну промывку в 0.2Х SSC при 63°С в течение 20 мин, или эквивалентные условия. Строгие условия для гибридизации ДНК-ДНК (Саузерн-блоты с использованием зонда, например, 100 нт) являются, например, теми, которые включают по меньшей мере одну промывку (как правило 2) в 0.2Х SSC при температуре, равной по меньшей мере 50°С, как правило около 55°С, в течение 20 мин, или эквивалентные условия. Смотрите также Sambrook et al. (1989) и Sambrook и Russell (2001).

"Тонкое картирование" относится к способам, посредством которых положение QTL может быть определено более точно (сужено), и посредством которых размер фрагмента интрогрессии, содержащего QTL, сокращается. Например, почти изогенная линия для QTL (QTL-NIL) может быть получена, которая содержит различные, перекрывающиеся фрагменты фрагменты интрогрессии в пределах иной однородной генетической среды рекуррентного родителя. Такие линии могут затем применяться для нанесения на генетическую карту места локализации QTL и для идентификации линии, имеющей более короткий фрагмент интрогрессии, содержащий QTL.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к культивированному растению Cucumis sativus var. sativus, содержащему QTL урожая на хромосоме 3, интрогрессированного из дикого родственника огурца. В частности, повышенная урожайность обеспечивается (сообщается) фрагментом интрогрессии на хромосоме культивированного огурца 3 (содержащей QTL3.1 или его вариант), где указанный фрагмент интрогрессии происходит из дикого родственника огурца.

Когда в настоящей заявке делается ссылка на фрагмент интрогрессии на хромосоме 3, имеющий QTL урожая, это охватывает различные размеры фрагментов интрогрессии, например, фрагмент, как обнаружено в NCIMB 42346, содержащий все маркеры SNP (SNP_01 - SNP_27, или любой маркер между ними, для фрагмента на хромосоме 3), но также более маленький фрагмент интрогрессии (содержащий менее 27 SNP маркеров, как например, только 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26 из SNP маркеров), где, однако, фрагмент остается достаточно большим для сообщения значительно увеличенного урожая (по сравнению с генетическим контролем), когда фрагмент интрогрессии находится в гетерозиготной или гомозиготной форме в геноме культивированного огурца. Другими словами, фрагмент сохраняет QTL3.1 или его вариант, т.е. все еще обеспечивает значительно увеличенный урожай (по сравнению с контролем, например, генетическим контролем), когда фрагмент интрогрессии находится в гетерозиготной или гомозиготной форме в геноме культивированного огурца.

Таким образом, в одном варианте выполнения настоящего изобретения обеспечивается культивированное растение огурца, содержащее фрагмент интрогрессии из дикого родственника огурца, где фрагмент интрогрессии содержит QTL3.1, или его вариант, и где фрагмент интрогрессии содержит всю или часть области, начинающейся при нуклеотиде (или основании) 21,507,892 хромосомы 3 и заканчивающейся при нуклеотиде (или основании) 27,233,985 хромосомы 3. Другими словами, вся или часть области, начинающейся при нуклеотиде 21,507,892 хромосомы 3 и заканчивающейся при нуклеотиде 27,233,985 хромосомы 3, происходит, в одном варианте выполнения настоящего изобретения, из дикого родственника огурца и содержит QTL3.1 или его вариант. Какая подобласть содержит QTL3.1 можно определить посредством, например, тонкого картирования. Поэтому, например, если QTL3.1, как обнаружено, находится между SNP_01 и SNP_10, тогда растение согласно настоящему изобретению должно содержать только область интрогрессии, начинающуюся при нуклеотиде 21,507,892 хромосомы 3 (SNP_01) и заканчивающуюся при нуклеотиде 23,706,444 (SNP_10) хромосомы 3.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения QTL3.1 (или его вариант) локализуется между маркером SNP_01 в SEQ ID NO: 1 (или в варианте последовательности SEQ ID NO: 1) и маркер SNP_27 в SEQ ID NO: 27 (или в варианте последовательности SEQ ID NO: 27). В другом варианте выполнения настоящего изобретения QTL3.1 (или его вариант) локализуется между маркером SNP_01 в SEQ ID NO: 1 (или в варианте последовательности SEQ ID NO: 1) и маркер SNP_10 в SEQ ID NO: 10 (или в варианте последовательности SEQ ID NO: 10). В другом варианте выполнения настоящего изобретения QTL3.1 (или его вариант) локализуется между маркером SNP_10 в SEQ ID NO: 10 (или в варианте последовательности SEQ ID NO: 10) и маркер SNP_20 в SEQ ID NO: 20 (или в варианте последовательности SEQ ID NO: 20). В другом варианте выполнения настоящего изобретения QTL3.1 (или его вариант) локализуется между маркером SNP_20 в SEQ ID NO: 20 (или в варианте последовательности SEQ ID NO: 20) и маркер SNP_27 в SEQ ID NO: 27 (или в варианте последовательности SEQ ID NO: 27). В другом варианте выполнения настоящего изобретения QTL3.1 (или его вариант) локализуется между маркером SNP_06 в SEQ ID NO: 06 (или в варианте последовательности SEQ ID NO: 06) и маркер SNP_23 в SEQ ID NO: 23 (или в варианте последовательности SEQ ID NO: 23).

В другом варианте выполнения настоящего изобретения фрагмент интрогрессии согласно настоящему изобретению (содержащий QTL3.1 или его вариант) представляет собой фрагмент, содержащий более маленький фрагмент (часть) области, начинающейся при нуклеотиде (или основании) 21,507,892 хромосомы 3 и заканчивающейся при нуклеотиде (или основании) 27,233,985 хромосомы 3, например, имеющий размер, например, 5.0 Мб, 4.0 Мб, 3.0 Мб, 2.5 Мб, 2 Мб, 1 Мб, 0.5 Мб, 100 кб, 50 кб, 35 кб, 30 кб, 20 кб, или менее и содержащий QTL или его вариант. В одном варианте выполнения настоящего изобретения часть составляет по меньшей мере 5 кб, 10 кб, 20 кб по размеру, или более.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения культивированное растение огурца согласно настоящему изобретению содержит фрагмент интрогрессии из дикого родственника огурца, фрагмент интрогрессии которого содержит QTL3.1 или его вариант, где фрагмент интрогрессии содержит все части области, начинающейся при 21.50 Мб и заканчивающейся при 27.3 Мб физической хромосомы 3.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения фрагмент интрогрессии на хромосоме 3, содержащий QTL3.1, или его вариант, является получаемым скрещиванием растения, выращенного из NCIMB42346 с другим растением огурца, особенно культивированного растения огурца, в одном варианте выполнения настоящего изобретения огурцом длинного типа.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения культивированное растение огурца согласно настоящему изобретению, содержащее QTL3.1, или его вариант, представляет собой растение, в котором указанный фрагмент интрогрессии на хромосоме 3 является получаемым скрещиванием растения, выращенного из семян, депонированных под номером доступа NCIMB 42345, с другим растением огурца. Таким образом, в одном варианте выполнения настоящего изобретения QTL представляет собой QTL, присутствующий в семенах, депонированных под номером доступа NCIMB 42345.

Когда делается ссылка на маркеры SNP в настоящей заявке, которые указывают на присутствие фрагмента интрогрессии (и QTL урожая, присутствующий на фрагменте интрогрессии), понятно, что упоминается генотип SNP, который является показателем фрагмента интрогрессии, т.е. генотип SNP, как представлено в Таблице 5 далее. Отмечается, что генотип маркера SNP может отличать фрагмент интрогрессии, находящийся в гомозиготной или гетерозиготной форме, как показано в таблице. В гомозиготной форме нуклеотид идентичен, а в гетерозиготной форме нуклеотид не идентичен. SNP-генотип хромосомы «дикого типа» без фрагмента интрогрессии это другой генотип, также приведенный в Таблице 5 (под генотипом рецидивирующего родителя). Так, например, генотип SNP_01 указывающий на фрагмент интрогрессии, содержащий QTL3.1, представляет собой 'ТС' (QTL3.1/wt) или 'ТТ' (QTL3./QTL3.1), тогда как генотип SNP, указывающий на дикий тип/генетический контроль (отсутствие фрагмента интрогрессии), представляет собой 'СС' (wt/wt). Таким образом, при ссылке на растение или часть растения (например, клетка), содержащие фрагмент интрогрессии в гомозиготной или гетерозиготной форме, понятно, что маркеры SNP, связанные с фрагментом интрогрессии, имеют соответствующий генотип SNP.

Поэтому, в одном варианте выполнения настоящего изобретения, обеспечивает культивированное растение Cucumis sativus var. sativus, содержащее фрагмент интрогрессии на хромосоме 3 в гомозиготной или гетерозиготной форме, где указанный фрагмент интрогрессии обеспечивает увеличение урожая плодов огурца по сравнению с растением огурца, не содержащим фрагмент интрогрессии на хромосоме 3, например, генетическим контролем или контрольным сортом, при выращивании при тех же условиях.

Увеличение урожая плодов огурца фенотипически выражается как (статистически) значительно более высокое среднее число плодов на растение (FrPP) линии или разновидности культивированного растения огурца, содержащей фрагмент интрогрессии на хромосоме 3 в гомозиготной или гетерозиготной форме, по сравнению с линией или разновидностью генетического контроля, не содержащей фрагмент интрогрессии на хромосоме 3, при выращивании в той же среде, и/или значительно более высокая средняя масса плода на растение (GrPP) линии или разновидности растений, содержащей фрагмент интрогрессии, по сравнению с линией или разновидностью генетического контроля, не содержащей фрагмент интрогрессии, при выращивании в той же среде.

Урожай плодов (общее среднее FrPP и/или GrPP) предпочтительно составляет у растения огурца, содержащего QTL3.1 (или вариант) по меньшей мере на 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% выше, чем у контроля, предпочтительно чем у генетического контроля, при выращивании при тех же условиях.

Растения согласно настоящему изобретению поэтому содержат геном культивированного огурца, с по меньшей мере одной или двумя рекомбинантными хромосомами, а именно одной или двумя рекомбинантными хромосомами 3 (т.е. гетерозиготной или гомозиготной). Рекомбинантные хромосомы содержат фрагмент дикого родственника огурца, который легко отличить от генома культивированного огурца посредством анализа молекулярного маркера, секвенирования всего генома, "росписи" хромосомы и подобных методик.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения фрагмент интрогрессии на хромосоме 3 происходит из дикого родственника огурца, содержит положительный QTL3.1 урожая, или его вариант, и содержит всю или часть области, начинающейся при нуклеотиде 21,507,892 хромосомы 3 и заканчивающейся при нуклеотиде 27,233,985 хромосомы 3. Таким образом, фрагмент интрогрессии содержит QTL3.1 урожая или его вариант и один или более или все (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27) SNP маркеры дикого родственника огурца, выбранного SNP_01 - SNP_27, как показано в Таблице 5.

Понятно, что для маркеров, которые представляют собой более маленькие фрагменты интрогрессии, описанные в настоящей заявке, т.е. не содержащие 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более маркеров из маркеров, перечисленных в настоящей заявке (например, SNP_01 to SNP_27), или подгрупп этих маркеров, SNP генотип дикого родственника огурца отсутствует (т.е. донорный генотип не обнаруживается), и, вместо этого, SNP генотип культивированного огурца обнаруживается для "пропущенного" SNP маркера.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения присутствие фрагмента интрогрессии на хромосоме 3 в геноме растения или клетки растения или ткани растения (или в ДНК, экстрагированной из них) обнаруживается посредством анализа молекулярного маркера, который обнаруживает один или более молекулярных маркеров фрагмента интрогрессии. Однако, как упомянуто, могут применяться другие методики, например, SNP генотип маркеров также может быть обнаружен посредством секвенирования или применяя альтернативные маркеры, локализованные между SNP маркерами, раскрытыми в настоящей заявке, или в пределах 7 сМ, или в пределах 5 сМ, маркера, раскрытого в настоящей заявке; или в пределах 5 Мб, 3 Мб, 2.5 Мб, 2 Мб, 1 Мб, 0.5 Мб, 0.4 Мб, 0.3 Мб, 0.2 Мб, 0.1 Мб, 50 кб, 20 кб, 10 кб, 5 кб, 2 кб, 1 кб или менее маркера, раскрытого в настоящей заявке.

Когда ссылка делается на один или более молекулярные маркеры, являющиеся "обнаруживаемыми" посредством анализа молекулярного маркера, это означает, конечно, что растение или часть растения содержит один или более маркеров в его геноме, так как, в противном случае, маркеры были бы не обнаруживаемыми.

Растения огурца, содержащие фрагмент интрогрессии на хромосоме 3 (QTL 3.1 урожая)

В одном варианте выполнения настоящего изобретения обеспечивается культивированное растение Cucumis sativus var. sativus, содержащее фрагмент интрогрессии из дикого родственника огурца на хромосоме 3 в гомозиготной или гетерозиготной форме, где указанный фрагмент интрогресеии содержит локус количественных признаков (QTL), локализованный между маркером однонуклеотидного полиморфизма SNP_01 при нуклеотиде 75 последовательности SEQ ID NO: 1 (или варианта последовательности SEQ ID NO: 1) и маркером однонуклеотидного полиморфизма SNP_27 при нуклеотиде 75 последовательности SEQ ID NO: 27 (или варианта последовательности SEQ ID NO: 1), где QTL обеспечивает увеличение урожая плодов огурца. В одном варианте выполнения настоящего изобретения QTL локализован между основанием 21,507,892 (SNP_01) и основанием 27,233,985 (SNP_27) хромосомы 3.

Таким образом, в одном варианте выполнения настоящего изобретения QTL3.1 локализуется в области между SNP_01 в SEQ ID NO: 1 (или в ее варианте) и SNP_27 в SEQ ID NO: 27 (или его вариант).

Поэтому, в одном варианте выполнения настоящего изобретения обеспечивается культивированное растение Cucumis sativus var. sativus, содержащее фрагмент интрогрессии на хромосоме 3 в гомозиготной или гетерозиготной форме, где указанный фрагмент интрогрессии обеспечивает увеличение урожая плодов огурца (по сравнению с растением, не содержащим фрагмент интрогрессии, например, генетический контроль), и где указанный фрагмент интрогрессии обнаруживается посредством анализа молекулярного маркера (т.е. растение содержит один или более молекулярных маркеров), который обнаруживает по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 2 или 3, или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27 маркеров, выбранных из группы, состоящей из:

a) генотип ТС или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_01 в SEQ ID NO: 1 (или в ее варианте);

b) генотип ТС или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_02 в SEQ ID NO: 2 (или в ее варианте);

c) генотип ТС или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_03 в SEQ ID NO: 3 (или в ее варианте);

d) генотип ТС или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_04 в SEQ ID NO: 4 (или в ее варианте);

e) генотип GA или GG для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_05 в SEQ ID NO: 5 (или в ее варианте);

f) генотип ТС или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_06 в SEQ ID NO: 6(или в ее варианте);

g) генотип ТС или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_07 в SEQ ID NO: 7(или в ее варианте);

h) генотип ТС или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_08 в SEQ ID NO: 8(или в ее варианте);

i) генотип СТ или СС для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_09 в SEQ ID NO: 9 (или в ее варианте);

j) генотип СТ или СС для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_10 в SEQ ID NO: 10 (или в ее варианте);

k) генотип TG или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_11 в SEQ ID NO: 11 (или в ее варианте);

l) генотип AG или АА для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_12 в SEQ ID NO: 12 (или в ее варианте);

m) генотип ТС или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_13 в SEQ ID NO: 13 (или в ее варианте);

n) генотип AG или АА для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_14 в SEQ ID NO: 14 (или в ее варианте);

о) генотип СТ или СС для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_15 в SEQ ID NO: 15 (или в ее варианте);

р) генотип СТ или СС для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_16 в SEQ ID NO: 16 (или в ее варианте);

q) генотип GA или GG для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_17 в SEQ ID NO: 17 (или в ее варианте);

r) генотип СТ или СС для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_18 в SEQ ID NO: 18 (или в ее варианте);

s) генотип GA или GG для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_19 в SEQ ID NO: 19 (или в ее варианте);

t) генотип СТ или СС для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_20 в SEQ ID NO: 20 (или в ее варианте);

u) генотип AC или АА для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_21 в SEQ ID NO: 21 (или в ее варианте);

v) генотип ТС или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_22 в SEQ ID NO: 22 (или в ее варианте);

w) генотип СТ или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_23 в SEQ ID NO: 23 (или в ее варианте);

х) генотип GA или GG для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_24 в SEQ ID NO: 24 (или в ее варианте);

у) генотип GA или GG для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_25 в SEQ ID NO: 25 (или в ее варианте);

z) генотип GA или GG для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_26 в SEQ ID NO: 26 (или в ее варианте);

аа) генотип AG или АА для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_27 в SEQ ID NO: 27 (или в ее варианте); и необязательно

bb) любой специфичный для генома дикого родственника огурца маркер между маркером SNP_01 и SNP_27.

Как упомянуто ранее, при ссылке SNP в вариантной последовательности (в варианте последовательности), эта вариантная последовательность на по меньшей мере 85% идентична упомянутой последовательности.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения указанный по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 2 или 3, или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27 маркеров выбираются из группы, состоящей из маркеров а)-аа). В одном варианте выполнения настоящего изобретения указанный по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 2 или 3, или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27 маркеров являются последовательными маркерами.

Как упомянуто, специалист в данной области техники также может разработать другие молекулярные маркеры, например, маркер, специфичный для генома дикого родственника огурца, между маркером SNP_01 и SNP_27 и/или в пределах 7 сМ или в пределах 5 сМ любого из SNP_01 - SNP_27, и/или в пределах 5 Мб, 3 Мб, 2.5 Мб, 2 Мб, 1 Мб, 0.5 Мб, 0.4 Мб, 0.3 Мб, 0.2 Мб, 0.1 Мб, 50 кб, 20 кб, 10 кб, 5 kb или менее любого из SNP_01 - SNP_27. Такими маркерами также могут быть удлинение нуклеотида, CAPS маркеры, INDEL и т.д. Специалист в данной области техники может, например, секвенировать фрагмент интрогрессии, обнаруженный в семенах, депонированных под номером доступа NCIMB 42346 и применять информацию о последовательности для разработки новых маркеров и анализов маркеров.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения QTL3.1 локализуется в области между SNP_01 в SEQ ID NO: 1 (или в ее варианте) и SNP_10 в SEQ ID NO: 10 (или его вариант).

Таким образом, в другом варианте выполнения настоящего изобретения обеспечивается культивированное растение Cucumis sativus var. sativus, содержащее фрагмент интрогрессии на хромосоме 3 в гомозиготной или гетерозиготной форме, где указанный фрагмент интрогрессии обеспечивает увеличение урожая плодов огурца (по сравнению с растением, не содержащим фрагмент интрогрессии, например, генетический контроль), и где указанный фрагмент интрогрессии обнаруживается посредством анализа молекулярного маркера, который обнаруживает по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 2 или 3, или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 маркеров, выбранных из группы, состоящей из:

a) генотип ТС или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_01 в SEQ ID NO: 1 (или в ее варианте);

b) генотип ТС или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_02 в SEQ ID NO: 2 (или в ее варианте);

c) генотип ТС или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_03 в SEQ ID NO: 3 (или в ее варианте);

d) генотип ТС или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_04 в SEQ ID NO: 4 (или в ее варианте);

e) генотип GA или GG для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_05 в SEQ ID NO: 5 (или в ее варианте);

f) генотип ТС или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_06 в SEQ ID NO: 6 (или в ее варианте);

g) генотип ТС или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_07 в SEQ ID NO: 7 (или в ее варианте);

h) генотип ТС или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_08 в SEQ ID NO: 8 (или в ее варианте);

i) генотип СТ или СС для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_09 в SEQ ID NO: 9 (или в ее варианте);

j) генотип СТ или СС для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_10 в SEQ ID NO: 10 (или в ее варианте); и необязательно

k) любой специфичный для генома дикого родственника огурца маркер между маркером SNP_01 и SNP_10.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения указанный по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 2 или 3, или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 маркеров выбираются из группы, состоящей из маркеров a)-j). В одном варианте выполнения настоящего изобретения указанный по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 2 или 3, или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 маркеров являются последовательными маркерами.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения QTL3.1 локализуется в области между SNP_10 в SEQ ID NO: 10 (или в ее варианте) и SNP_20 в SEQ ID NO: 20 (или его вариант).

Поэтому в другом варианте выполнения настоящего изобретения обеспечивается культивированное растение Cucumis sativus var. sativus, содержащее фрагмент интрогрессии на хромосоме 3 в гомозиготной или гетерозиготной форме, где указанный фрагмент интрогрессии обеспечивает увеличение урожая плодов огурца (по сравнению с растением, не содержащим фрагмент интрогрессии, например, генетический контроль), и где указанный фрагмент интрогрессии обнаруживается посредством анализа молекулярного маркера, который обнаруживает по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 2 или 3, или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 маркеров, выбранных из группы, состоящей из:

1) генотип СТ или СС для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_10 в SEQ ID NO: 10 (или в ее варианте);

2) генотип TG или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_11 в SEQ ID NO: 11 (или в ее варианте);

3) генотип AG или АА для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_12 в SEQ ID NO: 12 (или в ее варианте);

4) генотип ТС или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_13 в SEQ ID NO: 13 (или в ее варианте);

5) генотип AG или АА для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_14 в SEQ ID NO: 14 (или в ее варианте);

6) генотип СТ или СС для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_15 в SEQ ID NO: 15 (или в ее варианте);

7) генотип СТ или СС для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_16 в SEQ ID NO: 16 (или в ее варианте);

8) генотип GA или GG для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_17 в SEQ ID NO: 17 (или в ее варианте);

9) генотип СТ или СС для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_18 в SEQ ID NO: 18 (или в ее варианте);

10) генотип GA или GG для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_19 в SEQ ID NO: 19 (или в ее варианте);

11) генотип СТ или СС для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_20 в SEQ ID NO: 20 (или в ее варианте); и необязательно

12) любой специфичный для генома дикого родственника огурца маркер между маркером SNP_10 и SNP_20.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения указанный по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 2 или 3, или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 маркеров выбираются из группы, состоящей из маркеров 1)-11). В одном варианте выполнения настоящего изобретения указанный по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 2 или 3, или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, или 11 маркеров являются последовательными маркерами.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения QTL3.1 локализуется в области между SNP_20 в SEQ ID NO: 20 (или в ее варианте) и SNP_27 в SEQ ID NO: 27 (или его вариант).

Поэтому в другом варианте выполнения настоящего изобретения обеспечивается культивированное растение Cucumis sativus var. sativus, содержащее фрагмент интрогрессии на хромосоме 3 в гомозиготной или гетерозиготной форме, где указанный фрагмент интрогрессии обеспечивает увеличение урожая плодов огурца (по сравнению с растением, не содержащим фрагмент интрогрессии, например, генетический контроль), и где указанный фрагмент интрогрессии обнаруживается посредством анализа молекулярного маркера, который обнаруживает по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 2 или 3, или по меньшей мере 4, 5, 6, 7 или 8 маркеров, выбранных из группы, состоящей из:

1) генотип СТ или СС для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_20 в SEQ ID NO: 20 (или в ее варианте);

2) генотип АС или АА для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_21 в SEQ ID NO: 21 (или в ее варианте);

3) генотип ТС или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_22 в SEQ ID NO: 22 (или в ее варианте);

4) генотип СТ или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_23 в SEQ ID NO: 23 (или в ее варианте);

5) генотип GA или GG для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_24 в SEQ ID NO: 24 (или в ее варианте);

6) генотип GA или GG для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_25 в SEQ ID NO: 25 (или в ее варианте);

7) генотип GA или GG для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_26 в SEQ ID NO: 26 (или в ее варианте);

8) генотип AG или АА для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_27 в SEQ ID NO: 27 (или в ее варианте); и необязательно

9) любой специфичный для генома дикого родственника огурца маркер между маркером SNP_20 и SNP_27.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения указанный по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 2 или 3, или по меньшей мере 4, 5, 6, 7 или 8 маркеров выбираются из группы, состоящей из маркеров 1)-8). В одном варианте выполнения настоящего изобретения указанный по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 2 или 3, или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, или 8 маркеров являются последовательными маркерами.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения QTL3.1 локализуется в области между SNP_06 в SEQ ID NO: 06 (или в ее варианте) и SNP_23 в SEQ ID NO: 23 (или его вариант).

Таким образом, обеспечивается культивированное растение Cucumis sativus var. sativus, содержащее фрагмент интрогресеии на хромосоме 3 в гомозиготной или гетерозиготной форме, где указанный фрагмент интрогресеии обеспечивает увеличение урожая плодов огурца (по сравнению с растением, не содержащим фрагмент интрогресеии, например, генетический контроль), и где указанный фрагмент интрогрессии обнаруживается посредством анализа молекулярного маркера, который обнаруживает по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 2 или 3, или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 маркеров, выбранных из группы, состоящей из:

a) генотип ТС или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_06 в SEQ ID NO: 6 (или в ее варианте);

b) генотип ТС или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_07 в SEQ ID NO: 7 (или в ее варианте);

c) генотип ТС или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_08 в SEQ ID NO: 8 (или в ее варианте);

d) генотип СТ или СС для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_09 в SEQ ID NO: 9 (или в ее варианте);

e) генотип СТ или СС для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_10 в SEQ ID NO: 10 (или в ее варианте);

f) генотип TG или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_11 в SEQ ID NO: 11 (или в ее варианте);

g) генотип AG или АА для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_12 в SEQ ID NO: 12 (или в ее варианте);

h) генотип ТС или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_13 в SEQ ID NO: 13 (или в ее варианте);

i) генотип AG или АА для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_14 в SEQ ID NO: 14 (или в ее варианте);

j) генотип СТ или СС для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_15 в SEQ ID NO: 15 (или в ее варианте);

k) генотип СТ или СС для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_16 в SEQ ID NO: 16 (или в ее варианте);

l) генотип GA или GG для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_17 в SEQ ID NO: 17 (или в ее варианте);

m) генотип СТ или СС для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_18 в SEQ ID NO: 18 (или в ее варианте);

n) генотип GA или GG для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_19 в SEQ ID NO: 19 (или в ее варианте);

о) генотип СТ или СС для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_20 в SEQ ID NO: 20 (или в ее варианте);

р) генотип АС или АА для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_21 в SEQ ID NO: 21 (или в ее варианте);

q) генотип ТС или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_22 в SEQ ID NO: 22 (или в ее варианте);

r) генотип СТ или ТТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_23 в SEQ ID NO: 23 (или в ее варианте); и необязательно

s) любой специфичный для генома дикого родственника огурца маркер между маркером SNP_06 и SNP_23.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения указанный по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 2 или 3, или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 маркеров выбираются из группы, состоящей из маркеров а)-r). В одном варианте выполнения настоящего изобретения указанный по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 2 или 3, или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, или 18 маркеров являются последовательными маркерами.

Фрагмент, содержащий QTL, может, таким образом, быть большим (содержащий SNP_01 - SNP_27), или может быть меньше и не содержать маркеры, имеющие генотип дикого родственника огурца (т.е. маркеры имеют, вместо этого, генотип культивированного огурца, смотрите также генотип рекуррентного родителя в Таблице 5), но он может все еще обеспечивать увеличенный урожай культивированному растению огурца, т.е. он может все еще содержать аллель урожая (QTL3.1 или вариант). Такие более маленькие фрагменты интрогрессии представляют собой вариант выполнения настоящего изобретения. Растения, имеющие более маленькие фрагменты интрогрессии, которые все еще обеспечивают увеличенный урожай (т.е. содержат аллель урожая), могут быть получены используя известные методики, такие как тонкое картирование или подобные методики. Например, начиная с растения, содержащего фрагмент интрогрессии, как обнаруживается в семенах, депонированных под номером доступа NCIMB 42346, и скрещивая такое растение с другим культивированным растением огурца, и посредством самоопыления потомства указанного кросса, и/или обратного скрещивания потомства, с получением популяции растения, которая может содержать рекомбинанты, имеющие более маленький фрагмент интрогрессии на хромосоме 3, фрагменты которой все еще обеспечивают увеличенный выход относительно растения, не содержащего фрагмент интрогрессии (такого как генетический контроль, например, растения, выращенные из семян, депонированных под номером NCIMB 42345), например, фрагмент, содержащий маркеры SNP_01 - SNP_10 (или более маленький, например, содержащий только 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 из SNP маркеров), SNP_10 - SNP_20 (или более маленький, например, содержащий только 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 из SNP маркеров), SNP_20 - SNP_27 (или более маленький, например, содержащий только 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 из SNP маркеров) или SNP_06 - SNP_23 (или более маленький, например, содержащий только 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 из SNP маркеров), анализы маркера могут применяться для определения размера более маленького фрагмента интрогрессии. Один или более SNP маркеров с генотипом дикого родственника огурца могут отсутствовать. Генотип культивированного огурца затем обнаруживается по этим SNP маркерам. Урожай растений, содержащих такой более маленький фрагмент интрогрессии, можно затем сравнить в экспериментах на урожайность, как описано в настоящей заявке, т.е. выращивая множество растений, содержащих более маленький фрагмент интрогрессии, в полевых экспериментах вместе с подходящими контрольными растениями, не содержащими фрагмент интрогрессии. Контрольные растения предпочтительно являются генетическим контролем, таким как NCIMB 42345. Если средний урожай остается значительно выше, чем в контроле, то меньший фрагмент интрогрессии сохранил QTL3.1.

Альтернативно, тот же или сорт QTL (QTL3.1 или вариант QTL3.1) может быть интрогрессирован из другого источника дикого типа, причем необязательно не все маркеры SNP, раскрытые в настоящей заявке, могут присутствовать. Такие альтернативные источники дикого родственника огурца могут быть идентифицированы с использованием маркеров SNP, представленных в настоящей заявке, посредством скрининга зародышевой плазмы (т.е. экземпляров) диких родственников огурца, применяя анализ маркера для обнаружения генотипа маркеров SNP_01 - SNP_27, или маркеров SNP_01 - SNP_10, SNP_10 - SNP_20, SNP_20 - SNP_27, или SNP_06 - SNP_23, или даже только более маленькой подгруппы этих маркеров (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, или более). Растения, содержащие QTL3.1 или вариант QTL3.1 из других источников, также являются вариантом выполнения настоящего изобретения. До тех пор, пока по меньшей мере один или более (или все) из SNP из SNP_01 - SNP_27, или из SNP из SNP_01 - SNP_10, или из SNP из SNP_10 - SNP_20, или из SNP из SNP_20 - SNP_27, или из SNP из SNP_06 - SNP_23, присутствует, растение имеет урожай-повышающий генотип, т.е. растение содержит QTL3.1 (или его вариант). Специалист в данной области техники может интрогрессировать QTL3.1 (или его вариант) в культивированный огурец, чтобы увеличить урожай плодов, как описано в настоящей заявке, и чтобы подтвердить, что QTL увеличивает урожай, когда присутствует в культивированном огурце.

Как описано выше, в одном варианте выполнения настоящего изобретения культивированное растение огурца согласно настоящему изобретению содержит фрагмент интрогрессии, содержащий по меньшей мере подряд SNP маркеров с генотипом дикого родственника огурца, т.е. по меньшей мере 1, 2, 3, 4, или 5 маркеров из SNP_01 - SNP_27, или SNP_01 - SNP_10, или из SNP_10 - SNP_20, или из SNP_20 - SNP_27, или из SNP_06 - SNP_23. В одном варианте выполнения настоящего изобретения культивированное растение огурца содержит все, или все за исключением 1 или 2 маркеров из SNP_01 - SNP_27, или из SNP_01 - SNP_10, или из SNP_10 - SNP_20, или из SNP_20 - SNP_27, или из SNP_06 - SNP_23.

Таким образом, фрагмент интрогрессии (и культивированное растение огурца или часть растения, например, клетка, содержащие фрагмент интрогрессии) может быть обнаружен в анализе маркера посредством обнаружения SNP генотипа фрагмента интрогрессии (т.е. зародышевой плазмы дикого родственника огурца) одного или более или всех маркеров, указанных выше.

Таким образом, в одном варианте выполнения настоящего изобретения, локус количественных признаков (QTL3.1), как обнаружено, присутствует на хромосоме 3 дикого родственника огурца, который, при переносе (интрогрессии) в сорт или линию разведения культивированного огурца, и когда присутствует в гетерозиготной или гомозиготной форме, придает значительно увеличенный урожай плодов культивированному растению огурца. QTL, или фрагмент интрогрессии, содержащий QTL (содержащий аллель урожая), является, таким образом, доминантным, т.е. он является достаточным, чтобы иметь фрагмент интрогрессии на одной из хромосом 3 (одна рекомбинантная хромосома 3), тогда как гомологичной хромосомой 3 пары может быть (нерекомбинантная) хромосома 3 культивированного С.sativus var. sativus, не содержащего фрагмент интрогрессии.

Хотя источником QTL урожая в контексте настоящего изобретения является единственным специфическим диким источником, вероятно, есть и другие дикие виды Cucumis, которые содержат QTL3.1 в том же локусе на хромосоме 3. Такие локусы могут содержать аллели урожая, которые имеют несколько другие нуклеотидные последовательности, т.е. варианты аллелей (QTL), обнаруживаемых в настоящей заявке. Такие варианты QTL также могут быть идентифицированы и интрогрессированы в культивированный огурец, как описано в настоящей заявке, с получением культивированного растения огурца, содержащего геном культивированного С. sativus var. sativus и рекомбинантную хромосому 3, причем рекомбинантная хромосома 3 содержит фрагмент интрогрессии дикого вида Cucumis sativus, который сообщает увеличенный урожай фенотипу культивированного растения огурца, когда присутствует в гомозиготной или гетерозиготной форме. Чтобы идентифицировать такой дикий огурец или дикие родственники огурца, содержащие QTL3.1, дикие образцы могут быть проанализированы, например, в анализе маркера путем сравнения последовательностей или другими методами, на присутствие одного или более SNP маркеров, приведенных в настоящей заявке. Предполагаемые QTL урожая (или варианты QTL) могут затем быть интрогрессированы в культивированный огурец, например, применяя MAS, т.е. применяя один или более (или все) из SNP маркеров, приведенных в настоящей заявке для обнаружения и/или отбора потомственных растений (например, беккросс-растений), содержащих рекомбинантную хромосому 3. Отобранные растения, т.е. культивированные растения огурца, содержащие фрагмент интрогрессии на хромосоме 3, где фрагмент интрогрессии на хромосоме 3 обнаруживается одним или более из SNP маркеров SNP_01 - SNP_27, одним или более из SNP маркеров SNP_01 - SNP_10, одним или более из SNP маркеров SNP_10 - SNP_20, одним или более из SNP маркеров SNP_20 - SNP_27, или одним или более из SNP маркеров SNP_06 - SNP_23 (как описано в настоящей заявке), могут затем подвергаться определению фенотипа в экспериментах на урожай вместе с подходящими контрольными растениями, предпочтительно по меньшей мере генетическим контролем, чтобы определить действительно ли фрагмент интрогрессии вызывает значительное увеличение урожая.

Образцы диких родственников огурца получают из системной коллекции зародышевой плазмы USDA National Plant или других коллекций семян, и могут, таким образом, быть протестированы на присутствие QTL3.1, применяя, например, анализ маркеров, как описано в настоящей заявке, и образцы, содержащие один или более из SNP маркеров (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или все 27 SNP маркеров, указывающих на QTL3.1) могут быть скрещены с культивированным растением огурца, имеющим нормальные нерекомбинантные хромосомы 3 дикого типа. F1 или F2 поколение (или последующее поколение, такое как F3 или беккросс-поколение) может затем быть проанализировано на рекомбинантные растения, имеющие фрагмент интрогрессии или его часть, применяя анализы молекулярных маркеров, описанные в настоящей заявке.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения, фрагмент интрогрессии происходит из дикого родственника огурца, который принадлежит к Индийской группе огурцов, и который переносится на хромосому 3 Евразийской группы хромосом, таким образом создавая культивированное растение огурца, содержащее QTL3.1 урожая или его вариант. Таким образом, в одном варианте выполнения настоящего изобретения фрагмент интрогрессии, содержащий QTL3.1 урожая является происходящим из (или происходит из) или является получаемым из (или происходит из; или как присутствует в) диком родственнике огурца, который принадлежит к Индийской группе огурцов.

В конкретном варианте выполнения настоящего изобретения, фрагмент интрогрессии, содержащий QTL3.1 урожая является происходящим из (или происходит из) или является получаемым из (или происходит из; или как присутствует в) семян, представительный пример которых был депонирован под номером доступа NCIMB 42346, или из их потомства. Потомством может быть любое потомство, которое содержит один или более (или все) SNP маркеры, указывающие на (и связанные с) QTL, как описано. Таким образом, потомство не ограничено до F1 или F2 потомства депозита, но может быть получено любым потомством, полученным либо самоопылением и/или скрещиванием с другим растением огурца.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения фрагмент интрогрессии идентифицируется одним или более из маркеров, описанных в настоящей заявке, особенно маркеров SNP_01 - SNP_27 для фрагмента интрогрессии на хромосоме 3, или подряда маркеров, таких как один или более из маркеров, выбранных из SNP маркеров SNP_01 - SNP_10, или из SNP маркеров SNP_10 - SNP_20, или из SNP маркеров SNP_20 - SNP_27, или из SNP маркеров SNP_06 - SNP_23. В одном варианте выполнения настоящего изобретения изобретение обеспечивает культивированное растение огурца, имеющее геном культивированного (одомашненного) огурца, который имеет увеличенный урожай плодов, где увеличенный урожай плодов обеспечивается фрагментом интрогрессии на хромосоме 3 культивированного огурца, где указанный фрагмент интрогрессии получают посредством (или является получаемым посредством) скрещивания культивированного растения, выращенного из семян, депонированных под номером NCIMB 42346, или потомства этого растения (которое содержит один или более маркеров, раскрытых в настоящей заявке, связанных с QTL) с культивированным растением огурца. Таким образом, в одном варианте выполнения настоящего изобретения культивированное растение огурца согласно настоящему изобретению содержит тот же фрагмент интрогрессии и ту же рекомбинантную хромосому 3, как присутствует в NCIMB 42346 (содержащий все из маркеров SNP генотипа дикого родственника огурца SNP_01 - SNP_27), или оно содержит более короткий фрагмент этого фрагмента интрогрессии, причем более короткий фрагмент сохраняет генетический элемент, обеспечивающий увеличенный урожай плодов (QTL3.1).

Таким образом, в одном варианте выполнения настоящего изобретения изобретение относится к растению согласно настоящему изобретению т.е. культивированному растению Cucumis sativus var. sativus, содержащему фрагмент интрогрессии из дикого родственника огурца на хромосоме 3 в гомозиготной или гетерозиготной форме, и где указанный фрагмент интрогрессии представляет собой фрагмент интрогрессии "как в" / являющийся "идентичным с" / являющийся "таким же как в" семенах, депонированных под номером NCIMB 42346, или представляет его более короткий фрагмент, но все еще обеспечивает увеличенный урожай плодов благодаря присутствию QTL3.1.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения изобретение относится к растению согласно настоящему изобретению т.е. культивированному растению Cucumis sativus var. sativus, содержащему фрагмент интрогрессии из дикого родственника огурца на хромосоме 3 в гомозиготной или гетерозиготной форме, и где указанный фрагмент интрогрессии представляет собой фрагмент интрогрессии или вариант фрагмента интрогрессии из семян, депонированных под номером NCIMB 42346, т.е. он содержит QTL 3.1 урожая, но геномная последовательность может быть другой. Поскольку дикие образцы будут генетически различными, геномная последовательность фрагмента интрогрессии, содержащего QTL3.1 из других диких родственников огурца, наиболее вероятно не будет идентична геномной последовательности, так как интрогрессирована в NCIMB 42346, и даже ген, обеспечивающий урожай (содержащий промотор, интроны и экзоны), может отличаться по нуклеотидной последовательности, но функция будет такой же, т.е. обеспечение увеличенного урожая плодов. Расхождение можно увидеть в том, что некоторые маркеры SNP, связанные с QTL3.1, могут быть в общем обнаружены в различных экземплярах, тогда как другие SNP маркеры могут быть обнаружены только в определенных экземплярах. Поэтому, например, не все из SNP_01 - SNP_27 можно обнаружить в других диких родственниках огурца. Однако повышающая урожай QTL3.1 (содержащая, например, вариант или ортолог аллеля урожая) все еще может присутствовать в таких экземплярах дикого типа. Специалист в данной области техники способен идентифицировать и интрогрессировать область, содержащую QTL 3.1, обнаруженную в других диких родственниках огурца, в культивированный огурец, например, обнаруживая диких родственников, содержащих SNP маркеры или их подряд, и перенося эти SNP маркеры (или подряд) в линию или сорт культивированного огурца, и оценивая урожай плодов культивированной линии или сорта по сравнению с линией или сортом, не содержащим SNP маркеры (или подряд), т.е. не содержащим фрагмент интрогрессии.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения присутствие фрагмента интрогрессии или области хромосомы 3 (или вариантная или ортологическая область хромосомы 3), содержащих QTL3.1, обнаруживается посредством анализа молекулярного маркера, который обнаруживает по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или более (или всеми 27) маркерами однонуклеотидного полиморфизма (SNP), выбранными из группы, состоящей из: