Применение ингибитора ацетилхолинэстеразы и идалопирдина для снижения риска падений у пациентов с болезнью паркинсона

Настоящее изобретение относится к применению N-(2-(6-фтор-1Н-индол-3-ил)этил)-3-(2,2,3,3-тетрафторпропокси)бензиламина (идалопирдина) для изготовления лекарственного средства для снижения риска падений у пациента с болезнью Паркинсона, где лечение дополнительно включает введение донепезила указанному пациенту. При этом доза донепезила может составлять от 1 до 30 мг, суточная доза идалопирдина - от 10 до 120 мг. Комбинация идалопирдина и донепезила обеспечивает значительное снижение числа падений при болезни Паркинсона. 2 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл., 2 пр.

 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к применению ингибитора ацетилхолинэстеразы и идалопирдина для снижения риска падений у пожилых пациентов, таких как пожилые пациенты с болезнью Паркинсона. Настоящее изобретение дополнительно относится к комбинации ингибитора ацетилхолинэстеразы и идалопирдина для снижения риска падений у пациентов, страдающих от болезни Паркинсона.

Предпосылки изобретения

Падения являются основной причиной смерти у пожилых людей и у большинства пациентов с болезнью Паркинсона (PD), основной причиной госпитализации и долгосрочного ухода при нечувствительности к леводопе. Падение при PD считают связанным с дегенерацией холинергических нейронов переднего мозга, что, в сочетании с недостаточностью дофамина в полосатом теле, нарушает когнитивный контроль за удержанием равновесия, ходьбой и процессом движения.

В дополнение к характерным для заболевания двигательным симптомам, отражающим, в первую очередь, недостаточность дофамина в полосатом теле, ярко выраженные симптомы со стороны автономной нервной системы, поведения и когнитивной деятельности, включая склонность к падениям, указывают на то, что болезнь Паркинсона (PD) основана на более широкомасштабных, мультисистемных нейродегенеративных процессах¹. Падения у пациентов с PD^2,3 и также у здоровых пожилых людей⁴ зачастую являются событиями, приводящими к инвалидности^5,6. Как программы на основе физических упражнений^7-9, так и лечение с помощью ингибиторов ацетилхолинэстеразы^10,11 снижают число случаев падения у пожилых людей и пациентов с PD, однако остается неудовлетворенная потребность в дополнительном снижении склонности к падениям.

Хотя падения у пациентов ассоциированы с многочисленными факторами риска^12-14, нарушения в контроле за процессом движения со стороны внимания являются главным влияющим фактором, в частности, когда необычные поверхности и препятствия или второстепенные задачи осложняют контроль походки, удержания равновесия и процесса движения^15-22. Ошибки при ходьбе, удержании равновесия и процессе движения в норме вызывают компенсаторный контроль со стороны внимания. Однако, поскольку патологический процесс также воздействует на системы головного мозга, отвечающие за внимание, такое компенсаторное применение ресурсов внимания все чаще неспособно восстановить процесс движения и предотвратить падения. В подтверждение данной точки зрения, дегенерация как холинергических нейронов базальных отделов переднего мозга (BF), дающих отростки к участкам конечного мозга и таламуса - главной системе головного мозга, отвечающей за внимание^23,24, - так и холинергических нейронов ствола головного мозга, дающих отростки к таламусу и базальным ядрам, коррелирует с низкой скоростью ходьбы, "застыванием" при ходьбе и падениями у пациентов с PD^25-29.

Также при других заболеваниях ЦНС, таких как деменция с тельцами Леви (LBD), прогрессирующий супрануклеарный паралич (PSP) и мультисистемная атрофия (MSA), удержание равновесия, ходьба и процесс движения нарушены вследствие дегенерации холинергических нейронов³⁰.

Из вышеизложенного совершенно понятно, что остается неудовлетворенная потребность в лечении для применения в снижении риска падений у пациентов с болезнью Паркинсона, а также у пациентов с другими заболеваниями ЦНС, при которых дегенерация холинергических нейронов приводит к нарушению удержания равновесия, ходьбы и процесса движения.

N-(2-(6-фтор-1Н-индол-3-ил)этил)-3-(2,2,3,3-тетрафторпропокси)бензиламин с названием по INN "идалопирдин" (изображено ниже) впервые раскрыт в WO 02/078693, и он представляет собой эффективный и селективный антагонист рецептора 5-НТ₆, который проходил клинические испытания для лечения нарушения когнитивных функций, ассоциированного с шизофренией, и в качестве средства лечения при AD.

В 2012 году сообщалось о клиническом исследовании идалопирдина, применяемого в лечении болезни Альцгеймера (AD). Данные продемонстрировали, что идалопирдин совместно с донепезилом из расчета 10 мг/сутки значительно улучшал когнитивную функцию у 278 пациентов с AD по сравнению с плацебо совместно с донепезилом, как было измерено по когнитивной подшкале (ADAS-cog) шкалы оценки AD. Идалопирдин показал положительные результаты для вторичных конечных точек, включая показатели общего впечатления и повседневной деятельности, по сравнению с пациентами, которых лечили донепезилом. Последующее исследование фазы III не смогло подтвердить данные результаты.

Результаты, включенные в настоящую заявку на патент, были частично раскрыты в электронной публикации (doi: 10.111/ejn.13354, опубликована 29 июля 2016 года)³¹. Кроме того, Мичиганский комплексный тест контроля двигательной активности (МСМСТ), который применяется для оценки воздействия лечения на падения, ходьбу и остановки в процессе движения, был описан в статье Kucinski et al.³²

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к антагонисту рецептора 5-НТ₆, такому как идалопирдин (IDL), и ингибитору ацетилхолинэстеразы (AChEI), такому как донепезил (DON), ривастигмин (Riva) или галантамин (GAL), для применения в лечении болезни Паркинсона за счет снижения риска падений у пациента с болезнью Паркинсона. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что совместное введение донепезила и идалопирдина или ривастигмина и идалопирдина снижает риск падений у крыс с двойным повреждением стриарной дофаминергической и кортикальной холинергической системы (DL). Такие результаты позволяют предположить, что совместное лечение с помощью AChEI и антагониста рецептора 5-НТ₆ может снижать склонность к падениям у пациентов с PD, в частности, у пациентов с PD, у которых также проявляется склонность к относительно коротким остановкам в процессе движения, вызываемым дистракторами или возникающим самопроизвольно.

Краткое описание графических материалов

Фигура 1.

Падения во время прохождения по стержню (N=70, n=14 на группу и по 7/пол). Во всех условиях тестирования крысы DL падали более часто, чем крысы SH/VEH. Более того, при сравнении с крысами DL/VEH обработка DON+IDL значительно снижала число случаев падения (А). Проверка отдельных условий тестирования (В-Е) указывает на то, что снижению числа падений, связанных с прохождением стержня, вращающегося в необычном направлении по часовой стрелке (cw) и попеременно вращающегося в направлениях cw и против часовой стрелки (сс), в первую очередь способствует общий эффект DON+IDL у крыс DL. На данной и следующих фигурах указаны результаты апостериорных множественных сравнений, которые были основаны на значимых результатах ANOVA, которые описаны в разделе "Результаты" (*, **, ***, Р<0,05, 0,01, 0,001; сокращения, применяемые на данной и остальных фигурах: SH, ложно оперированные; DL, двойное повреждение холинергических нейронов базальных отделов переднего мозга и дофаминергических стриарных нейронов; DON, донепезил, IDL, идалопирдин, Riva, ривастигмин).

Фигура 2.

Эффекты дистрактора в виде дверного проема (N=70, n=14 на группу и по 7/пол). Все крысы DL, за исключением крыс DL/DON+IDL, падали более часто, чем крысы SH/VEH, при воздействии данного пассивного дистрактора (А,В). Чтобы разобраться в потенциальных поведенческих механизмах, опосредующих эффекты DON+IDL, у крыс DL/VEH и DL/DON+IDL дополнительно анализировали поведение, связанное с дверным проемом. Падения, связанные с дверным проемом, были ассоциированы с остановкой при движении или "застыванием" походки по мере приближения или достижения крысами проема. В целом, более длительные "застывания" были связаны с большим числом падений (С) как у крыс DL/VEH, так и у крыс DL/DON+IDL. Действительно, число падений, связанных с более длительными "застываниями", не отличалось у разных групп (D). Однако крысы, обработанные DON+IDL, падали значительно реже, если "застывания" оставались относительно короткими (<2 с). Доля коротких "застываний" самих по себе не отличалась у разных групп. Как проиллюстрировано на Е, после коротких "застываний", и даже если они не упали, крысы DL/VEH возобновляли движение вперед относительно медленно, при этом хвост у них обычно располагался относительно низко, и они имели сгорбленное положение тела (обратите внимание, что данная крыса соскользнула после прохода через дверь). В отличие от этого, когда крысы DL/DON+IDL возобновляли движение вперед, иногда начиная с прыжка (как показано здесь), они быстро восстанавливали обычную скорость прохождения и плавное движение вперед с высоким и жестким положением хвоста и прямым положением тела.

Фигура 3.

Выполнение задания с активным дистрактором (N=70, n=14 на группу и по 7/пол). Чтобы смоделировать воздействие второстепенной задачи, как раз в то время, когда крысы выполняли прохождение по вращающемуся стержню, им предлагали воду (см. верхнюю фотографию; крысы были лишены воды вследствие параллельного суточного тестирования SAT). В целом, крысы DL с меньшей вероятностью вовлекались в данную постороннюю деятельность, на что указывает меньшее число попыток отыскать воду (А). Крысы DL также с меньшей вероятностью отыскивали воду без совершения падения (В). Ни одна из обработок лекарственными средствами (донепезил (DON) или идалопирдин (IDL) отдельно или в комбинации) не улучшала значимо показатели крыс DL в присутствии данного активного дистрактора.

Фигура 4

Общее число падений для дней с 2 по 5, вместе взятых. Показано общее зарегистрированное число падений (ось y) либо у крыс с двойным повреждением (DL), либо у ложно оперированных крыс после обработки средой-носителем, 1 мг/кг ривастигмина, 10 мг/кг идалопирдина или обработки комбинацией в течение десяти дней. Столбики представляют среднее ± sem, *** Р<0,001 при сравнении с DL + среда-носитель. Число N указано в скобках.

Фигура 5

Общее число падений с попеременно вращающегося стержня (день 5). Показано общее зарегистрированное число падений (ось y) либо у крыс с двойным повреждением (DL), либо у ложно оперированных крыс после обработки средой-носителем, 1 мг/кг ривастигмина, 10 мг/кг идалопирдина или обработки комбинацией в течение десяти дней. Столбики представляют среднее ± sem, *** Р<0,001, ** Р<0,01 при сравнении с DL + среда-носитель. Число N указано в скобках.

Фигура 6

Общее число падений со стержня, вращающегося против часовой стрелки (день 4). Показано общее зарегистрированное число падений (ось y) либо у крыс с двойным повреждением (DL), либо у ложно оперированных крыс после обработки средой-носителем, 1 мг/кг ривастигмина, 10 мг/кг идалопирдина или обработки комбинацией в течение десяти дней. Столбики представляют среднее ± sem, *** Р<0,001 при сравнении с DL + среда-носитель. Число N указано в скобках.

Фигура 7

Общее число падений с неподвижного стержня. Показано общее зарегистрированное число падений (ось y) либо у крыс с двойным повреждением (DL), либо у ложно оперированных крыс после обработки средой-носителем, 1 мг/кг ривастигмина, 10 мг/кг идалопирдина или обработки комбинацией в течение десяти дней. Столбики представляют среднее ± sem, *** Р<0,001 при сравнении с DL + среда-носитель. Число N указано в скобках.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

По всему настоящему описанию подразумевается, что термин "идалопирдин" (иногда сокращенный как IDL) включает любую форму соединения, такую как свободное основание и фармацевтически приемлемые соли. Свободное основание и фармацевтически приемлемые соли включают безводные формы и сольватированные формы, такие как гидраты. Безводные формы включают аморфные и кристаллические формы, а сольваты включают кристаллические формы. Аналогично, подразумевается, что термин "донепезил" (иногда сокращенный как DON) включает любую форму соединения, такую как свободное основание и фармацевтически приемлемые соли и т.д. Ингибитор ацетилхолинэстеразы (в настоящем контексте сокращенный как "AChEI") представляет собой химическое вещество или лекарственное средство, которое ингибирует разложение ацетилхолина ферментом ацетилхолинестеразой, тем самым повышая как уровень, так и продолжительность действия нейромедиатора ацетилхолина. В настоящем контексте примеры ингибиторов ацетилхолинэстеразы включают без ограничений донепезил, ривастигмин и галантамин.

По всему настоящему описанию термин "пожилой пациент" относится к лицу, возраст которого составляет по меньшей мере 60 лет, как, например, по меньшей мере 65 лет, как, например, по меньшей мере 70, 75, 80, 85 или 90 лет.

В настоящем контексте, когда идалопирдин применяется в комбинации с AChEI, в одном варианте осуществления это указывает на то, что указанные два соединения можно вводить одновременно, например, в виде фармацевтической композиции, содержащей оба соединения. В другом варианте осуществления, когда идалопирдин применяется в комбинации с AChEI, это указывает на то, что указанные два соединения вводят отдельно в виде подходящих отдельных фармацевтических композиций. Эти отдельные композиции можно вводить одновременно, например, через равные промежутки времени один раз в сутки либо утром, либо вечером, или их можно вводить независимо, например, одно соединение через равные промежутки времени один раз в сутки утром, а другое соединение через равные промежутки времени один раз в сутки вечером.

В настоящем контексте "фармацевтическая композиция" относится к лекарственной форме, например, к лекарственной форме для перорального применения, такой как твердая лекарственная форма для перорального применения, как правило, таблетки или капсулы. Термин "фармацевтические композиции по настоящему изобретению" относится ко всем фармацевтическим композициям, охватываемым формулой изобретения и описанием.

В настоящем контексте выражение "фармацевтические вспомогательные вещества" включает, например, инертные твердые разбавители или наполнители, стерильные водные растворы и различные органические растворители, применяемые в фармацевтических композициях по настоящему изобретению.

В настоящем контексте "стандартная лекарственная форма" относится к составленной единице фармацевтической композиции, например, одной таблетке или одной капсуле. В настоящем контексте выражение "терапевтически эффективные количества" соединения означает количество, достаточное для излечения, облегчения или частичного прекращения клинических проявлений данного заболевания и его осложнений при терапевтическом вмешательстве, предусматривающем введение указанного соединения. Количество, достаточное для осуществления этого, определяется как "терапевтически эффективное количество". Эффективные количества для каждой цели будут зависеть от тяжести заболевания или повреждения, а также от веса и общего состояния субъекта. Следует понимать, что определение соответствующей дозировки можно обеспечить с применением общепринятых экспериментов, путем построения матрицы значений и тестирования различных точек в матрице, что находится в пределах компетенции квалифицированного врача.

Термин "функциональное нарушение холинергических нейронов" представляет собой патологию, при которой нормальное функционирование холинергических нейронов осуществляется не на полную мощность.

Термин "дегенерация холинергических нейронов" представляет собой патологию, при которой прогрессирующее разрушение холинергических нейронов в головном мозге.

В настоящем контексте подразумевается, что выражения "лечение" или "лечить" указывают на контроль и уход за пациентом с целью облегчения, прекращения, частичного прекращения или задержки прогрессирования клинического проявления заболевания, или излечение заболевания. В одном аспекте настоящего изобретения "лечение" и "лечить" относится к профилактическому (превентивному) лечению. В другом аспекте выражение "лечение" и "лечить" относится к (терапевтическому) лечению. Пациентом, подлежащим лечению, предпочтительно является млекопитающее, в частности человек.

"Крысы DL" представляют собой крыс, которые подверглись двойному повреждению стриарной дофаминергической и кортикальной холинергической системы.

Подробное описание изобретения

Авторы настоящего изобретения неожиданно выяснили, что комбинация идалопирдина и донепезила или идалопирдина и ривастигмина была способна снижать риск падений в животной модели, что указывает на возможность применения комбинации из этих двух веществ для терапевтического лечения, заключающегося в снижении риска падений у пациентов с PD и пожилых пациентов. Вкратце, эффекты донепезила (DON) и идалопирдина (IDL) тестировали на крысах с кортикальной холинергической и стриарной дофаминергической недостаточностью (крысы DL), проходящих по вращающимся стержням и выполняющих задание с длительным удержанием внимания (SAT). Основные результаты указывают на то, что обработка DON+IDL снижала число падений с вращающегося стержня, а также число падений, вызванных дистрактором в виде дверного проема. DON+IDL предотвращал падения, в первую очередь, путем увеличения эффективности и активности возобновления прохождения по вращающемуся стержню после относительно коротких остановок в процессе движения. Крысы DL, обработанные DON+IDL, проявляли меньшее число падений при прохождении по вращающемуся стержню, чем остальные группы крыс DL, и они падали менее часто в сочетании с относительно короткими остановками, вызванными дверным проемом. Кроме того, при обработке крыс DL Riva+IDL также показано сниженное число падений у крыс DL в сравнении с крысами DL, обработанными только средой-носителем. См. дополнительные подробности в разделе экспериментов.

У людей, склонных к падениям, как и у крыс DL, медленная скорость ходьбы и остановки в процессе движения, вызванные дистракторами или происходящие без явных причин, дестабилизируют движение вперед и повышают риск падений. Остановки или "застывание" при ходьбе приводят к нестабильности в контроле положения тела и походки, а также к разрушению связи между выбором и планированием движения, и, таким образом, такие остановки могут отражать разрушение кортико-стриарного взаимодействия, в противоположность исключительно недостаточности дофамина в полосатом теле.

Таким образом, настоящее изобретение относится к идалопирдину и AChEI для применения в лечении пожилого пациента за счет снижения риска падений. Настоящее изобретение дополнительно относится к идалопирдину и AChEI для применения в лечении болезни Паркинсона за счет снижения риска падений у пациента с болезнью Паркинсона. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей идалопирдин и AChEI вместе с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом.

По настоящему изобретению идалопирдин и AChEI или фармацевтически приемлемую соль любого из этих двух соединений можно вводить любым подходящим путем, например, перорально, транмукозально или парентерально, и идалопирдин и/или AChEI могут быть представлены в любой форме, подходящей для такого введения. В одном варианте осуществления и в соответствии с целью настоящего изобретения как идалопирдин, так и AChEI вводят в форме твердых фармацевтических единиц, допустимо в виде таблеток или капсул, или в форме суспензий, растворов или дисперсий для инъекции.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно составлять с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, а также с любыми другими известными вспомогательными средствами и вспомогательными веществами в соответствии с общепринятыми методиками, такими как раскрываемые в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22 Edition, Hauber, Ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2013. Таким образом, таблетки можно изготовить путем смешивания активных ингредиентов со стандартным носителем, таким как вспомогательное средство и/или разбавитель, и последующего прессования смеси в таблетирующей машине.

Подходящие фармацевтические носители и вспомогательные вещества включают инертные твердые разбавители или наполнители, стерильный водный раствор и различные органические растворители. Неограничивающими примерами твердых носителей являются кукурузный крахмал, лактоза, сульфат кальция, сахароза, циклодекстрин, тальк, желатин, агар, пектин, аравийская камедь, стеарат магния, стеариновая кислота и низшие алкиловые эфиры целлюлозы. Неограничивающими примерами жидких носителей являются сироп, арахисовое масло, оливковое масло, фосфолипиды, жирные кислоты, амины жирных кислот, полиоксиэтилен и вода.

Также можно применять любые другие вспомогательные средства или добавки, такие как красители, ароматизаторы и консерванты, при условии, что они совместимы с активными ингредиентами. Таким образом, фармацевтические композиции по настоящему изобретению, как правило, содержат эффективное количество идалопирдина и/или AChEI и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей.

Фармацевтические композиции, образованные путем объединения соединения, используемого настоящем изобретении, и фармацевтических приемлемых носителей, затем легко вводят при помощи множества лекарственных форм, подходящих для раскрытых путей введения.

Активные фармацевтические ингредиенты, используемые в настоящем изобретении, т.е. идалопирдин и AChEI, можно вводить отдельно в качестве чистых соединений или в комбинации с фармацевтически приемлемыми носителями или вспомогательными веществами либо в однократных, либо многократных дозах.

Фармацевтические композиции можно специально составлять для введения любым подходящим путем, таким как пероральный, ректальный, назальный, легочный, местный (включая трансбуккальный и сублингвальный), трансдермальный и парентеральный (включая подкожный, внутримышечный и внутривенный) пути, при этом пероральный путь является предпочтительным. Следует принять во внимание, что путь введения может зависеть от общего состояния и возраста подлежащего лечению субъекта, природы подлежащего лечению состояния и выбранного активного ингредиента.

Фармацевтические композиции для перорального введения включают твердые пероральные лекарственные формы, такие как таблетки, капсулы, порошки и гранулы; и жидкие пероральные лекарственные формы, такие как растворы, эмульсии, суспензии и сиропы, а также порошки и гранулы для растворения или суспендирования в подходящей жидкости.

Твердые пероральные лекарственные формы могут быть в виде отдельных единиц (например, таблетки или твердые или мягкие капсулы), каждая из которых содержит предварительно определенное количество активного ингредиента и предпочтительно одно или несколько подходящих вспомогательных веществ. При необходимости, твердые лекарственные формы можно покрывать оболочками, такими как энтеросолюбильные оболочки, или их можно составлять так, чтобы обеспечивать модифицируемое высвобождение активного ингредиента, такое как замедленное или пролонгированное высвобождение, в соответствии со способами, хорошо известными из уровня техники. При необходимости, твердая лекарственная форма может представлять собой лекарственную форму, распадающуюся под действием слюны, такую как таблетка, диспергируемая в полости рта. Примеры вспомогательных веществ, пригодных для твердого состава для перорального применения, включают без ограничений микрокристаллическую целлюлозу, кукурузный крахмал, лактозу, маннит, повидон, кроскармеллозу натрия, сахарозу, циклодекстрин, тальк, желатин, пектин, стеарат магния, стеариновую кислоту и низшие алкиловые простые эфиры целлюлозы. Сходным образом, твердый состав может включать вспомогательные вещества для составов с замедленным или пролонгированным высвобождением, известные в области техники, такие как глицерилмоностеарат и гипромеллоза. Если для перорального введения применяют твердый материал, то состав можно получать, например, путем смешивания активного ингредиента с твердыми вспомогательными веществами, а затем прессованием смеси в стандартной таблетирующей машине; или состав, например, в форме порошка, гранул или минитаблеток, может быть помещен, например, в твердую капсулу. Количество твердого вспомогательного вещества будет существенно изменяться, но будет, как правило, находиться в пределах от приблизительно 25 мг до приблизительно 1 г на стандартную дозу.

Жидкие пероральные лекарственные формы могут быть представлены, например, в виде настоек, сиропов, капель для перорального применения или заполненных жидкостью капсул. Жидкие пероральные лекарственные формы также могут быть представлены в виде порошков для получения раствора или суспензии в водной или неводной жидкости. Примеры вспомогательных веществ, пригодных для жидкого состава для перорального применения, включают без ограничений этанол, пропиленгликоль, глицерин, полиэтиленгликоли, полоксамеры, сорбит, полисорбат, моно- и диглицериды, циклодекстрины, кокосовое масло, пальмовое масло и воду. Жидкие пероральные лекарственные формы можно получать, например, путем растворения или суспендирования активного ингредиента в водной или неводной жидкости или путем включения активного ингредиента в жидкую эмульсию типа масло-в-воде или вода-в-масле. В твердых и жидких составах для перорального применения могут использоваться дополнительные вспомогательные вещества, такие как красители, вкусовые добавки и консерванты и т.д.

Фармацевтические композиции для парентерального введения включают стерильные водные и неводные растворы, дисперсии, суспензии или эмульсии для инъекции или инфузии, концентраты для инъекции или инфузии, а также стерильные порошки, подлежащие восстановлению в виде стерильных растворов или дисперсий для инъекции или инфузии перед применением. Примеры вспомогательных веществ, пригодных для парентерального состава, включают без ограничений воду, кокосовое масло, пальмовое масло и растворы циклодекстринов. Если необходимо, водные составы следует подходящим образом забуферить и придать им изотоничность с помощью достаточного количества солевого раствора или глюкозы.

Другие типы фармацевтических композиций включают суппозитории, средства для ингаляции, кремы, гели, кожные пластыри, имплантаты и составы для трансбуккального или сублингвального введения.

Если предусматривается одновременное введение идалопирдина и AChEI, особенно удобной может быть композиция, содержащая как идалопирдин, так и AChEI. В качестве альтернативы идалопирдин и AChEI можно вводить отдельно в форме подходящих композиций. Композиции можно получать, как описано выше в данном документе. В одном варианте осуществления настоящего изобретения отдельные единичные формы идалопирдина и AChEI вводят одновременно, например, оба соединения вводят через равные промежутки времени один раз в сутки либо утром, либо вечером. В другом варианте осуществления отдельные единичные формы идалопирдина и AChEI вводят независимо, например, идалопирдин вводят через равные промежутки времени один раз в сутки утром, a AChEI - через равные промежутки времени один раз в сутки вечером или наоборот.

В настоящем изобретении также предусмотрен набор, содержащий отдельные стандартные лекарственные формы, содержащие идалопирдин, и отдельные стандартные лекарственные формы, содержащие AChEI, при этом все они содержатся в одном и том же контейнере или упаковке, например, блистерной упаковке.

Фармацевтические композиции и наборы по настоящему изобретению предпочтительно содержат идалопирдин и AChEI в терапевтически эффективных количествах. Суточная доза идалопирдин предпочтительно составляет от 10 до 200 мг, как, например, от 10 мг до 120 мг, как, например, от 10 мг до 100 мг, как, например, от 30 мг до 90 мг, как, например, от 30 мг до 60 мг. Суточная доза донепезила предпочтительно составляет от 1 мг до 30 мг, как, например, от 5 мг до 23 мг, как, например, 10 мг. Суточная доза ривастигмина предпочтительно составляет от 1 мг до 20 мг. Суточная доза галантамина предпочтительно составляет от 4 мг до 24 мг, как, например, от 8 мг до 24 мг, как, например, 8 мг, 12 мг, 16 мг, 20 мг или 24 мг.

Варианты осуществления согласно настоящему изобретению

Раскрыты следующие варианты осуществления изобретения. Первый вариант осуществления обозначен Е1, второй вариант осуществления обозначен Е2 и так далее.

Е1. Идалопирдин и AChEI для применения в лечении пожилого пациента за счет снижения риска падений.

Е2. Идалопирдин и AChEI для применения в лечении по варианту осуществления 1, где указанному пожилому пациенту был поставлен диагноз болезнь Паркинсона.

Е3. Идалопирдин и AChEI для применения в лечении заболевания ЦНС, выбранного из группы, состоящей из деменции с тельцами Леви (LBD), прогрессирующего супрануклеарного паралича (PSP), мультисистемной атрофии (MSA) и болезни Паркинсона, где лечение болезни Паркинсона выбрано из группы, состоящей из снижения риска падений у пациента с болезнью Паркинсона, увеличения низкой скорости ходьбы у пациента с болезнью Паркинсона, сокращения остановок в процессе движения у пациента с болезнью Паркинсона, снижения "застывания" при ходьбе у пациента с болезнью Паркинсона и увеличения контроля ходьбы у пациента с болезнью Паркинсона.

Е4. Идалопирдин и AChEI по любому из вариантов осуществления 1-3, где указанный AChEI выбран из донепезила, ривастигмина и галантамина.

Е5. Идалопирдин и AChEI для применения в лечении по любому из вариантов осуществления 1-4, где, если AChEI представляет собой донепезил, доза донепезила составляет от 1 до 30 мг, как, например, от 5 до 23 мг, если AChEI представляет собой галантамин, доза составляет от 4 до 24 мг; и если AChEI представляет собой ривастигмин, доза ривастигмина составляет от 1 до 20 мг.

Е6. Идалопирдин и AChEI для применения в лечении по любому из вариантов осуществления 1-5, где суточная доза идалопирдина составляет от 10 мг до 120 мг, как, например, от 10 мг до 100 мг, как, например, от 30 мг до 90 мг, как, например, от 30 мг до 60 мг.

Е7. Идалопирдин и AChEI для применения в лечении по любому из вариантов осуществления 1-6, где указанный идалопирдин и указанный AChEI вводят одновременно.

Е8. Идалопирдин и донепезил для применения в лечении по любому из вариантов осуществления 1-6, где указанный идалопирдин и указанный AChEI вводят независимо.

Е9. Идалопирдин и донепезил для применения в лечении по любому из вариантов осуществления 1-8, где указанный идалопирдин и указанный AChEI содержатся в отдельных стандартных лекарственных формах.

Е10. Идалопирдин и донепезил для применения в лечении по любому из вариантов осуществления 1-7, где указанный идалопирдин и указанный AChEI содержатся в одной стандартной лекарственной форме.

Е11. Способ лечения пожилого пациента за счет снижения риска падений, при этом способ предусматривает введение терапевтически эффективных количеств идалопирдина и AChEI нуждающемуся в этом пациенту.

Е12. Способ по варианту осуществления 11, где указанному пожилому человеку был поставлен диагноз болезнь Паркинсона.

Е13. Способ лечения заболевания ЦНС, выбранного из группы, состоящей из деменции с тельцами Леви (LBD), прогрессирующего супрануклеарного паралича (PSP), мультисистемной атрофии (MSA) и болезни Паркинсона, где лечение болезни Паркинсона выбрано из группы, состоящей из снижения риска падений у пациента с болезнью Паркинсона, увеличения низкой скорости ходьбы у пациента с болезнью Паркинсона, сокращения остановок в процессе движения у пациента с болезнью Паркинсона, снижения "застывания" при ходьбе у пациента с болезнью Паркинсона и увеличения контроля ходьбы у пациента с болезнью Паркинсона, причем способ предусматривает введение терапевтически эффективных количеств идалопирдина и AChEI нуждающемуся в этом пациенту.

Е14. Способ по любому из вариантов осуществления 11-13, где указанный AChEI выбран из донепезила, ривастигмина и галантамина.

E15. Способ по любому из вариантов осуществления 11-14, где, если AChEI представляет собой донепезил, терапевтически эффективное количество донепезила составляет от 1 до 30 мг, как, например, от 5 до 23 мг; если AChEI представляет собой галантамин, доза составляет от 4 до 24 мг; и, если AChEI представляет собой ривастигмин, указанное терапевтически эффективное количество ривастигмина составляет от 1 до 20 мг.

Е16. Способ по любому из вариантов осуществления 11-15, где указанное терапевтически эффективное количество идалопирдина составляет от 10 мг до 120 мг, как, например, от 10 мг до 100 мг, как, например, от 30 мг до 90 мг, как, например, от 30 мг до 60 мг.

Е17. Способ по любому из вариантов осуществления 11-16, при котором указанный идалопирдин и указанный AChEI вводят одновременно.

Е18. Способ по любому из вариантов осуществления 11-16, где указанный идалопирдин и указанный AChEI вводят независимо.

Е19. Способ по любому из вариантов осуществления 11-18, где указанный идалопирдин и указанный AChEI содержатся в отдельных стандартных лекарственных формах.

Е20. Способ по любому из вариантов осуществления 11-17, где указанный идалопирдин и указанный AChEI содержатся в одной стандартной лекарственной форме.

Е21. Применение идалопирдина и AChEI для производства лекарственного препарата для лечения пожилого пациента за счет снижения риска падений.

Е22. Применение идалопирдина и AChEI по варианту осуществления 21, где указанному пожилому человеку был поставлен диагноз болезнь Паркинсона.

Е23. Применение идалопирдина и AChEI для производства лекарственного препарата для лечения заболевания ЦНС, выбранного из группы, состоящей из деменции с тельцами Леви (LBD), прогрессирующего супрануклеарного паралича (PSP), мультисистемной атрофии (MSA) и болезни Паркинсона, где лечение болезни Паркинсона выбрано из группы, состоящей из снижения риска падений у пациента с болезнью Паркинсона, увеличения низкой скорости ходьбы у пациента с болезнью Паркинсона, сокращения остановок в процессе движения у пациента с болезнью Паркинсона, снижения "застывания" при ходьбе у пациента с болезнью Паркинсона и увеличения контроля ходьбы у пациента с болезнью Паркинсона.

Е24. Применение идалопирдина и AChEI по любому из вариантов осуществления 21-

23, где указанный AChEI выбран из донепезила, ривастигмина и галантамина.

Е25. Применение идалопирдина и AChEI по любому из вариантов осуществления 21-24, где, если AChEI представляет собой донепезил, указанный лекарственный препарат содержит от 1 до 30 мг, как, например, от 5 до 23 мг донепезила; если AChEI представляет собой галантамин, доза составляет от 4 до 24 мг; и, если AChEI представляет собой ривастигмин, указанный лекарственный препарат содержит от 1 до 20 мг ривастигмина.

Е26. Применение идалопирдина и AChEI по любому из вариантов осуществления 21-25, где указанный лекарственный препарат содержит идалопирдин в количестве от 10 мг до 120 мг, как, например, от 10 мг до 100 мг, как, например, от 30 мг до 90 мг, как, например, от 30 мг до 60 мг.

Е27. Фармацевтическая композиция, содержащая идалопирдин и AChEI совместно с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом.

Е28. Фармацевтическая композиция по варианту осуществления 27, где указанный AChEI выбран из донепезила, ривастигмина и галантамина.

Е29. Фармацевтическая композиция по любому из вариантов осуществления 27-28, содержащая от 30 мг до 60 мг идалопирдина, где, если AChEI представляет собой донепезил, указанный лекарственный препарат содержит от 1 до 30 мг, как, например, от 5 до 23 мг донепезила, если AChEI представляет собой галантамин, указанный лекарственный препарат содержит от 4 до 24 мг; и если AChEI представляет собой ривастигмин, указанная композиция содержит от 1 до 20 мг ривастигмина.

Е30. Фармацевтическая композиция по любому из вариантов осуществления 27-28, содержащая от 30 мг до 60 мг идалопирдина.

Е31. Фармацевтическая композиция по любому из вариантов осуществления 27-30 для применения в лечении пожилого пациента за счет снижения риска падений.

Е32. Фармацевтическая композиция для применения в лечении по варианту осуществления 31, где указанному пожилому пациенту был поставлен диагноз болезнь Паркинсона.

Е33. Фармацевтическая композиция по любому из вариантов осуществления 27-30 для применения в лечении заболевания ЦНС, выбранного из группы, состоящей из деменции с тельцами Леви (LBD), прогрессирующего супрануклеарного паралича (PSP), мультисистемной атрофии (MSA) и болезни Паркинсона, где лечение болезни Паркинсона выбрано из группы, состоящей из снижения риска падений у пациента с болезнью Паркинсона, увеличения низкой скорости ходьбы у пациента с болезнью Паркинсона, сокращения остановок в процессе движения у пациента с болезнью Паркинсона, снижения "застывания" при ходьбе у пациента с болезнью Паркинсона и увеличения контроля ходьбы у пациента с болезнью Паркинсона.

Е34. Набор, содержащий идалопирдин и AChEI.

Е35. Набор по варианту осуществления 34, где указанный AChEI выбран из донепезила, ривастигмина и галантамина.

Е36. Набор по любому из вариантов осуществления 34-35, который адаптирован для одновременного введения указанного идалопирдина и указанного AChEI.

Е37. Набор по любому из вариантов осуществления 34-35, который адаптирован для независимого введения указанного идалопирдина и указанного AChEI.

Все литературные источники, включая публикации, патентные заявки и патенты, цитируемые в данном документе, настоящим включены с помощью ссылки во всей своей полноте и в той же степени, как если бы каждый литературный источник был отдельно и конкретно обозначен как включенный с помощью ссылки и приведен в данном документе во всей своей полноте (в максимальной степени, допускаемой законом), вне зависимости от любого другого отдельно сделанного в любом месте данного документа включения конкретных документов.

Использование в контексте описания настоящего изобретения форм единственного числа, множественного числа и аналогичных ссылок следует понимать как то, что они охватывают и единственное, и множественное число, если в данном документе не указано иное или это однозначно противоречит контексту. Например, выражение "соединение" следует понимать как относящееся к различным "соединениям" по настоящему изобретению или конкретному описываемому аспекту, если не указано иное.

Описание в данном документе любого аспекта или аспектов настоящего изобретения с использованием терминов, таких как "содержащий", "имеющий", "включающий" или "содержащий в себе" по отношению к элементу или элементам, предназначено для подтверждения аналогичного аспекта или аспектов настоящего изобретения, который "состоит из", "состоит практически из" данного конкретного элемента или элементов или "практически содержит" их, если не указано иное или это однозначно не противоречит контексту (например, композиция, описанная в данном документе как содержащая конкретный элемент, должна также пониматься как описывающая композицию, состоящую из данного элемента, если не указано иное или это однозначно не противоречит контексту).

Следует понимать, что различные аспекты, варианты осуществления, реализации и признаки настоящего изобретения, упомянутые в данном документе, могут быть заявлены по отдельности или в любом сочетании.

Литературные источники

1. Langston JW. The Parkinson's complex: Parkinsonism is just the tip of the iceberg. Ann Neurol 2006; 59(4):591-596.

2. Balash Y, Peretz C, Leibovich G, Herman T, Hausdorff JM, Giladi N. Falls in outpatients with Parkinson's disease: frequency, impact and identifying factors. J Neurol 2005; 252(11):1310-1315.

3. Wood ВН. Incidence and prediction of falls in Parkinson's disease: a prospective multidisciplinary study. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry 2002; 72(6):721-725.

4. Tinetti ME, Speechley M, Ginter SF. Risk factors for falls among elderly persons living in the community. N Engl J Med 1988; 319(26):1701-1707.

5. Baker SP, Harvey AH. Fall injuries in the elderly. Clin Geriatr Med 1985; 1(3):501-512.

6. Dellinger AM, Stevens JA. The injury problem among older adults: mortality, morbidity and costs. J Safety Res 2006; 37(5):519-522.

7. Cameron ID, Gillespie LD, Robertson MC, et al. Interventions for preventing falls in older people in care facilities and hospitals. Cochrane Database Syst Rev 2012; 12:CD005465.

8. Gillespie LD, Robertson MC, Gillespie WJ, et al. Interventions for preventing falls in older people living in the community. Cochrane Database Syst Rev 2012; 9:CD007146.

9. Shen X, Wong-Yu IS, Мак MK. Effects of exercise on falls, balance, and gait ability in Parkinson's disease: A aeta-analysis. Neurorehabil Neural Repair 2015.

10. Chung KA, Lobb BM, Nutt JG, Horak FB. Effects of a central cholinesterase inhibitor on reducing falls in Parkinson disease. Neurology 2010; 75(14):1263-1269.

11. Henderson EJ, Lord SR, Brodie MA, et al. Rivastigmine for gait stability in patients with Parkinson's disease (ReSPonD): a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2 trial. Lancet Neurol 2016 [Epub ahrad of print].

12. van der Marck MA, Klok MP, Okun MS, et al. Consensus-based clinical practice recommendations for the examination and management of falls in patients with Parkinson's disease. Parkinsonism Relat Disord 2014; 20(4):360-369.

13. Montero-Odasso M, Verghese J, Beauchet O, Hausdorff JM. Gait and cognition: a complementary approach to understanding brain function and the risk of falling. J Am Geriatr Soc 2012;60(11):2127-2136.

14. Ensrud KE, Blackwell TL, Mangione CM, et al. Central nervous system-active medications and risk for falls in older women. J Am Geriatr Soc 2002; 50(10):1629-1637.

15. Allcock LM, Rowan EN, Steen IN, Wesnes K, Kenny RA, Burn DJ. Impaired attention predicts falling in Parkinson's disease. Parkinsonism Relat Disord 2009; 15(2): 110-115.

16. LaPointe LL, Stierwalt JAG, Maitland CG. Talking while walking: Cognitive loading and injurious falls in Parkinson's disease. International Journal of Speech-Language Pathology 2010; 12(5):455-459.

17. Theill N, Martin M, Schumacher V, Bridenbaugh SA, Kressig RW. Simultaneously measuring gait and cognitive performance in cognitively healthy and cognitively impaired older adults: the Basel motor-cognition dual-task paradigm. J Am Geriatr Soc 2011; 59(6):1012-1018.

18. Brown LA, Shumway-Cook A, Woollacott MH. Attentional demands and postural recovery: the effects of aging. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 1999; 54(4):M165-171.

19. Woollacott M, Shumway-Cook A. Attention and the control of posture and gait: a review of an emerging area of research. Gait Posture 2002; 16(1):1-14.

20. Hausdorff JM, Doniger GM, Springer S, Yogev G, Simon ES, Giladi N. A common cognitive profile in elderly fallers and in patients with Parkinson's disease: the prominence of impaired executive function and attention. Exp Aging Res 2006; 32(4):411-429.

21. Yogev-Seligmann G, Hausdorff JM, Giladi N. The role of executive function and attention in gait. Mov Disord 2008;23(3):329-342.

22. Amboni M, Barone P, Hausdorff JM. Cognitive contributions to gait and falls: evidence and implications. Mov Disord 2013; 28(11):1520-1533.

23. Hasselmo ME, Sarter M. Modes and models of forebrain cholinergic neuromodulation of cognition. Neuropsychopharmacology 2011; 36(1):52-73.

24. Gritton HJ, Howe WM, Mallory CS, Hetrick VL, Berke JD, Sarter M. Cortical cholinergic signaling controls the detection of cues. Proc Natl Acad Sci USA 2016; 113(8):E1089-1097.

25. Bohnen N1, Frey KA, Studenski S, et al. Gait speed in Parkinson disease correlates with cholinergic degeneration. Neurology 2013; 81(18): 1611-1616.

26. Bohnen NI, Albin RL. Cholinergic denervation occurs early in Parkinson disease. Neurology 2009; 73(4):256-257.

27. Bohnen NI, Frey KA, Studenski S, et al. Extra-nigral pathological conditions are common in Parkinson's disease with freezing of gait: an in vivo positron emission tomography study. Mov Disord 2014; 29(9):1118-1124.

28. Bohnen NI, MLTM, Koeppe RA, et al. History of falls in Parkinson disease is associated with reduced cholinergic activity. Neurology 2009; 73(20): 1670-1676.

29. Yarnall A, Rochester L, Burn DJ. The interplay of cholinergic function, attention, and falls in Parkinson's disease. Mov Disord 2011; 26(14):2496-2503.

30. Bohnen NI, Albin RL. The Cholinergic System and Parkinson Disease. Behav Brain Res. 2011; 221(2):564-573.

31. Kucinski A, de Jong I, Sarter M. Reduing falls in Parkinson's disease: Interactions between donepezil and the 5-НТ₆ receptor antagonist idalopirdine on falls in a rat model of impaired cognitive control of complex movements. doi:10.1111/ejn. 13354

32. Kucinski, A. et al. Modelling fall propensity in Parkinson's disease: Deficits in the attentional control of complex movements in rats with cortical-cholinergic and striatal-dopaminergic deaf-ferentation. J Neurosci, 2013; 33, 16522-16539

Примеры

Пример 1. Снижение риска падений у крыс DL. обработанных донепезилом и идалопирдином

Материалы и способы

Субъекты

Взрослых самцов и самок крыс Sprague Dawley (Harlan; N=70; 35 самцов и 35 самок) возрастом 3-6 месяцев содержали по отдельности в непрозрачных одиночных стандартных клетках (27,70 см × 20,30 см) в условиях контроля температуры и влажности (23°С, 45%). На протяжении всего эксперимента самцы крыс весили больше самок (F(1,69)=460,29, Р<0,001; самцы: 359,86+4,27 г самки: 249,24+2,48 г), но значения веса не отличалась в разных экспериментальных группах (группа основного эффекта и взаимодействие пол × группа: для обеих F<0,29, для обеих Р>0,88). Животных содержали в режиме 12:12 часов день/ночь (свет включали в 8:00 утра). Пища (Rodent Chow; Harlan Teklad) была доступна без ограничений. Доступ к воде постепенно ограничивали за 7-дневный период (12, 8, 5, 3, 1, 0,5, 0,25 часа доступа к воде в день) за неделю до предоперационного и постоперационного тестирования поведения. Во время тестирования воду давали в качестве вознаграждения за правильные ответы во время выполнения SAT и после прохождения по бруску в МСМСТ (см. ниже). Крысам также давали воду без ограничений в течение 15 минут после выполнения SAT каждый день.

Расписание экспериментов

Изначально животных тренировали в отношении SAT (~2 месяца ежедневных тренировок; ~9:00-11:00 утра). После достижения последней стадии тренировки животных оставляли на данной стадии в течение 14 последующих суток. Во время последних 6 суток тренировки крыс также тренировали на МСМСТ в послеобеденное время (~2:00-4:00 дня). Предыдущие эксперименты показали, что на выполнение каждой из задач не влияло то, что крыс тренировали в отношении обеих задач в один и тот же день. Более того, поскольку авторы ранее продемонстрировали, что циркадный ритм крыс подстраивается к ежесуточной отработке SAT, что дает устойчивый дневной фенотип, все тестирования поведения возможно проводить во время активной фазы суток у животных.

После предоперационной тренировки животных подвергали стереотаксическим операциям с нанесением повреждений, за которыми следовало 4-недельное восстановление. Во время последней недели восстановления животных постепенно ограничивали в воде. Затем проводили оценку эффектов лекарственного средства с помощью сеансов SAT и МСМСТ на протяжении 12 последовательных дней (совокупность условий теста при МСМСТ см. в таблице 1):

Инъекции лекарственного средства или среды-носителя проводили за 30 минут до выполнения SAT (в ~9:30 инъекции, тестирование SAT в 10:00-10:45 утра) и в послеобеденное время перед тестированием МСМСТ (~3:30-6:00 вечера). В случае пробежек МСМСТ крысам проводили инъекции по отдельности, так что испытания начинались точно через 30 минут после проведения инъекции у каждого животного.

Повреждения

Из 70 крыс у 56 (28 самок и 28 самцов) выполнили двойное повреждение стриарной дофаминергической и кортикальной холинергической системы (DL), и их случайным образом отнесли к 4 группам с разными условиями обработки после проведения операций (n=14/группа, по 7/пол). У 14 крыс (по 7/пол) выполнили ложные повреждения. 6-OHDA доставляли билатерально к дофаминовым окончаниям в дорсальные отделы полосатого тела (Sigma-Aldrich; 6,0 мкг/2 мкл/инфузия, болюс; растворенный в 0,9% NaCl с 0,1% аскорбиновой кислоты; два места инфузии на полушарие: АР +1,2 и +0,2 мм; ML ±2,5 и ±3,0 мм относительно брегмы; DV -4,8 и -5,0 мм от черепа). Дезипрамина гидрохлорид (10 мг/кг; i.p.; Sigma-Aldrich) вводили крысам, получающим инфузии 6-OHDA за 30 минут до проведения операции для защиты норадренергических нейронов⁴. На холинергические нейроны базальных отделов переднего мозга, расположенные в банальном ядре и безымянной субстанции, нацеливались с помощью иммунотоксина, 192 IgG-сапорина (Advanced Targeting Systems) в aCSF, вводимого инфузией билатерально (120 нг/мкл; 0,5 мкл/полушарие; АР -0,8; ML ± 2,9; DV -7,8). Ложно оперированные крысы получали равные объемы 0,9% NaCl с 0,1% аскорбиновой кислоты (полосатое тело) и aCSF (базальные отделы переднего мозга) без нейротоксинов.

Мичиганский комплексный тест контроля двигательной активности (МСМСТ)

Комплексные показатели выполнения движения, включая склонность к падениям, оценивали с применением МСМСТ (подробности и иллюстрацию см. в Kucinski, A. et al (2013) Modelling fall propensity in Parkinson's disease Deficits in the attentional control of complex movements in rats with cortical-cholinergic and striatal-dopaminergic deafferentation. J Neurosci, 33, 16522-16539). Данное устройство для прохождения по бруску было разработано для испытания способности крыс выполнять движения, требующие внимания, и корректировать ошибки при выполнении шагов во время перехода по поверхности узкого квадратного стержня (2,54 см²). Концы бруска (длиной 2,0 м) удерживались в пазах, которые позволяли вращать стержень с помощью редукторного электродвигателя (10 об./мин.), связанного с одним концом элемента-бруска. Прохождение по стержню, в частности, при его вращении, гарантированно приводило к падениям и другим нарушениям движения у крыс с двойным повреждением стриарных дофаминергических и кортикальных холинергических синаптических входов. Поверхность плоской доски (шириной 13,3 см) также применяли для оценки основных двигательных способностей и для привыкания к устройству. Две идентичные платформы (площадка 23,0×31,5 см), расположенные на противоположных концах бруска, были окружены выдвижными стенками (высотой 27,0 см) для образования структур в форме концевых коробок. Стенки поднимаются и опускаются вручную и фиксируются в нужном положении с помощью фрикционного зажима, который перемещается в вертикальной борозде в опорной структуре под платформой. Стенки, обращенные с бруску, имели отверстия (шириной 9,0 см), чтобы крысы могли входить в концевые коробки и покидать их. Медные чашки для воды (диаметром 2,7 см, глубиной 3 см) были вмонтированы в пол концевых коробок, и крысам предоставляли ~150 мкл воды после каждого прохождения. Это вознаграждение подразумевалось в качестве поощрения для выполнения прохождения по собственной инициативе и, тем самым, ограничения манипуляций экспериментатора во время тестирования.

В начале тестового сеанса крыс помещали на стержень или доску на расстоянии ~10 см от концевой коробки и позволяли им войти в коробку и получить вознаграждение в виде воды. После попадания внутрь коробки при первом испытании и в течение последующих испытаний крысам давали ~45 с для того, чтобы напиться воды и исследовать обстановку. Крысы могли покидать концевые коробки, чтобы пройти к противоположной стороне бруска в любое время. Если после 45 с крысы не начинали прохождение, стенки опускали в качестве сигналов для начала прохождения. Большинство крыс выполняли прохождение по собственной инициативе, когда стенки опускались, однако, если этого не происходило, экспериментатор пододвигал крыс к доске или стержню. Если происходило падение, животные падали на фрагмент безопасной сетки (0,7×0,2 м), полученный из бадминтонной сетки (обычной), помещенной на 20 см ниже элемента-бруска. Рамка для размещения сетки также служила в качестве точки крепления для различных камер, зеркал и дистракторных элементов.

Падения, соскальзывания и время прохождения оценивали, как описано в Kucinski, A. et al (2013) Modelling fall propensity in Parkinson's disease: Deficits in the attentional control of complex movements in rats with cortical-cholinergic and striatal-dopaminergic deafferentation. J Neurosci, 33, 16522-16539). Падение засчитывали в следующих случаях: когда соскальзывание/ошибочные шаги заставляли крысу прекратить движение вперед и утратить прямое положение тела при ходьбе, приводящие к тому, что нижняя сторона животного оказывалась на поверхности стержня, когда крыса полностью падала со стержня на сетку под стержнем или цеплялась за стержень с помощью своих лап, когда крыса приостанавливала движение вперед и вцеплялась в стержень при его вращении (таким образом переворачиваясь вверх ногами вместе с ним), или когда крыса приостанавливала движение вперед и сидела перпендикулярно на стержне в течение более 2 с, при этом совершая безуспешные попытки возобновления движения вперед. Соскальзывание засчитывали, когда любая из лап крысы теряла контакт с поверхностью стержня и вытягивалась ниже нижней горизонтальной границы стержня. Время прохождения определяли как продолжительность прохождения всего расстояния по бруску. Во время испытаний, при которых происходило падение, соскальзывания и время прохождения рассчитывали пропорционально путем умножения на отношение расстояния полного прохождения к расстоянию, на котором задние конечности теряли контакт со стержнем во время падения.

Во время прохождений представляли два дистрактора. Во-первых, в последовательность теста МСМСТ вводили пассивный дистрактор в виде дверного проема, состоящий из поверхности 46,0×39,4 см с вырезом в форме дверного проема размером 20 см × 10 см, сделанный из пенопласта. Дистрактор помещали в средней точке по длине бруска (отметка 100 см) с помощью вертикальных брусков, отстоящих на 3,5 см от поверхности стержня на обеих сторонах, и при этом верхняя граница выреза дверного проема располагалась на 11 см над плоской поверхностью стержня. Ранее авторы выяснили, что данный дистрактор вызывал нарушения движения, такие как "застывание" в процессе ходьбы и падения, следовательно моделируя эффекты такого дистрактора у пациентов с PD. Во-вторых, животных тестировали, применяя задание с активным дистрактором, при котором во время прохождения на платформу (диаметром 4,9 см) помещали вознаграждение в виде воды (3 капли воды; ~150 мкл). Платформу также помещали на отметке 100 см, при этом платформу и стержень разделяли 2-3 см.

Вначале крыс приучали к заданию в ходе 4 испытаний по формированию поведения (тестовые дни 8 и 9). В этих испытаниях крыс помещали прямо на неподвижный (невращающийся) стержень вблизи платформы (приблизительно посередине бруска) и позволяли выпить воду с платформы. После испытаний по формированию поведения крыс подвергали 4 тестовым испытаниям, в которых крысы выполняли самостоятельные прохождения по вращающемуся стержню (с попеременно меняющимися направлениями) с предоставлением вознаграждений в виде воды. В течение остальных двух тестовых дней (10 и 12) крысы выполняли по 10 тестовых пробежек в день. В дополнение к падениям подсчитывали число полученных вознаграждений в виде воды, определяемых как слизывание/питье воды с платформы в течение ≥1 секунды. Все испытания регистрировали с применением системы из 4 камер видеонаблюдения (КТ&С; модель KPCS190SH черно-белая камера видеонаблюдения с 1/3'' SONY Super HAD CCD) с поворотными основаниями, которые были закреплены на внешнем несущем каркасе с внешней стороны устройства с помощью струбцин. Показатели выполнения анализировали с помощью воспроизведения видеозаписи экспериментаторы, которые на знали о статусе повреждения и схеме обработки крыс.

Задание с длительным удержанием внимания (SAT)

Устройство

Тренировку и тестирование проводили с применением 12 камер оперантного обусловливания (MED Associates Inc.), расположенных внутри отдельных звукоизолирующих боксов. Каждая камера была оснащена двумя выдвижными рычагами, индикаторной лампой с белым светом (2,8 Вт) на центральной панели и водораздатчиком, расположенным на той же стене, что и лампы на панели. Водораздатчик был способен осуществлять выдачу 45 мкл воды за раз. Воспроизведение сигнала, манипуляции с рычагом, выдачу подкрепления и сбор данных контролировали с помощью программного обеспечения Pentium PC и Med-PC для Windows (версия 4.1.3; MED Associates).

Приобретение навыков

Лишенных воды крыс сначала тренировали нажимать на рычаг для получения вознаграждения в виде воды в соответствии с модифицированным графиком подкрепления через определенное число реакций-1 (FR1) для подкрепления с помощью воды. Во время данной фазы тренировки нажатие на любой рычаг приводило к выдаче воды. Как правило, животные не проявляют предпочтения одной из сторон в отношении того, какой рычаг нажимать; однако, если один рычаг был нажат последовательно 5 раз, схему FR1 модифицировали таким образом, чтобы животное должно было нажать на противоположный рычаг перед тем, как можно было получить следующее вознаграждение. После 3 последовательных дней с 120 подкрепленными нажатиями на рычаг в течение каждого крыс начинали тренировать для различения события, сопровождающегося сигналом (подсветка 1 с с помощью индикаторной лампы на центральной панели), и события с отсутствием сигнала (без подсветки). Через две секунды (с) после события, сопровождающегося сигналом, или события с отсутствием сигнала оба рычага в камере оперантного обусловливания выдвигались, и они оставались вьщвинутыми в течение 4 с или до тех пор, пока на рычаг не нажимали. Если в течение 4 с не происходило нажатия, рычаги задвигались и засчитывалось бездействие. Непосредственно после ответов (либо правильных, либо неправильных) оба рычага задвигались и переменный интервал между пробами (ITI; 12±3 с) сбрасывался. В случае испытаний, сопровождающихся сигналом, нажатие на левый рычаг подкреплялось и оно называлось "попаданием", в то время как нажатие на правый рычаг не подкреплялось и оно называлось "промахом". В случае испытаний с отсутствием сигнала подкреплялось нажатие на правый рычаг и оно называлось "правильным пропуском", в то время как нажатие на левый рычаг не подкреплялось и оно называлось "ложной тревогой".

Животные получали вознаграждения в виде воды только за правильные ответы (45 мкл за каждое попадание и правильный пропуск), в то же время неправильные ответы (промахи и ложные тревоги) не вознаграждались. Для исключения возможности предпочтения выбора половину животных тренировали по противоположной схеме. События, сопровождающиеся сигналом, и события с отсутствием сигнала представляли в псевдослучайном порядке по 81 испытание каждого (всего 162 испытания) за сеанс. Во время этой фазы тренировки за неправильными ответами следовали коррекционные испытания, во время которых повторяли предыдущее испытание. После трех последовательных неправильных ответов в ходе коррекционных испытаний животное подвергали принудительному испытанию, в котором рычаг был выдвинут в течение 90 с или до тех пор, пока животное не ответит. Если испытание с принудительным выбором представляло собой испытание, сопровождающееся сигналом, свет сигнала оставался включенным в течение всего времени, пока рычаг был выдвинут.Во время данной стадии тренировки в помещении не включали внутреннее освещение. Животных продвигали на следующую стадию формирования поведения, если они отвечали правильно на ≥70% как испытаний, сопровождающихся сигналом, так и испытаний с отсутствием сигнала в течение 3 последовательных дней.

Во время третьей фазы формирования поведения вводили различную продолжительность сигнала (500, 50 и 25 мс) и ITI уменьшали до 9±3 с. Коррекционные испытания и испытания с принудительным выбором также исключали. Тип испытания и продолжительность сигнала определяли псевдослучайным образом для каждого испытания. Устанавливали продолжительность сеанса 40 минут. После по меньшей мере 3 дней стабильного выполнения, определяемого как по меньшей мере 70% попаданий при сигналах продолжительностью 500 мс, 70% правильных пропусков и ≤30% бездействий, животных начинали тренировать на выполнение окончательного варианта задания. Окончательный вариант был идентичен предыдущей стадии тренировки, за исключением того, что на протяжении всего сеанса в помещении было включено внутреннее освещение. Добавление включенного внутреннего освещения в помещении представляет собой критический элемент тестирования на длительное удержание внимания, поскольку это требует от животного ограничить свое поведение и сосредоточиться на индикаторной лампе на центральной панели во время выполнения задания. После достижения окончательной стадии тренировки перед проведением операций с нанесением повреждений животные оставались на данной стадии в течение 14 последовательных дней, и баллы, полученные в течение последних 5 дней выполнения задания, усредняли для определения баллов до проведения операции для каждого животного. Во время постоперационного тестирования эффектов лекарственного средства крыс тестировали только на конечной стадии в течение 12 последовательных дней и баллы, полученные в последние 5 дней, вновь усредняли для окончательных анализов.

Показатели выполнения SAT

Во время каждого сеанса SAT регистрировали следующие показатели поведения: попадания, промахи, ложные тревоги, правильные пропуски и бездействия. Промахи и ложные тревоги представляют собой противоположность попаданий и правильных пропусков соответственно. Подсчитывали относительное число попаданий (попадания/попадания + промахи) для каждой продолжительности сигнала, а также относительное число правильных пропусков (правильные пропуски/правильные пропуски + ложные тревоги). В дополнение общий показатель способности к вниманию, балл SAT, которые объединяет как относительное число попаданий (h), так и относительное число ложных тревог (f), также определяли для каждой продолжительности сигнала. Балл SAT рассчитывали с применением следующей формулы: (h-f)/[2(h+f)-(h+f)²]. Таким образом, баллы SAT не искажаются за счет ошибок, обусловленных бездействием. Баллы SAT варьировали в диапазоне от 1,0 до -1,0, при этом 1,0 указывает на то, что все ответы представляли собой попадания и правильные пропуски, 0 указывает на неспособность различать события, сопровождающиеся сигналом, и события с отсутствием сигнала, а -1,0 указывает на то, что все ответы представляли собой промахи и ложные тревоги. Ошибки, обусловленные бездействием, регистрировали отдельно.

Гистологическое исследование и оценки повреждений

После завершения постоперационного тестирования лекарственного средства крыс вводили в глубокий наркоз и проводили транскардиальную перфузию со скоростью 50 мл/мин. с помощью 0,1 М раствора фосфатного буфера (PBS) в течение 2 минут, за которой следовала перфузия с помощью 4% параформальдегида в 0,4 М Na-фосфатном растворе и 15% пикриновой кислоте (рН 7,4) в течение 9 минут. Головной мозг быстро иссекали и подвергали постфикации в течение 2-6 ч. при 4°С, а затем промывали в 0,1 М PBS и хранили в 30% растворе сахарозы и допускали его погружение. Фронтальные срезы (толщиной 40 мкм) нарезали с применением замораживающего микротома (CM 2000R; Leica) и хранили в незамерзающем растворе. Осуществляли иммунное окрашивание с помощью тирозингидроксилазы (ТН) и СЬАТ, как описано в литературе.

Срезы, которые подвергли иммунному окрашиванию с помощью ТН, визуализировали при увеличении 4х с применением цифрового микроскопа Leica DM400B. Для захвата изображений применяли программное обеспечение SPOT 5.1 (Spot Imaging Solutions). По два среза (АР +1,2 и +0,2 мм) применяли для получения единого балла, описывающего размер и степень билатеральных поражений. Инфузии 6-OHDA нацеливали в дорсальные отделы полосатого тела посередине между медиальной и латеральной границами. Размер повреждения оценивали, исходя из размера области отсутствия ТН, наблюдаемой в дорсальных отделах полосатого тела, при этом балл 10 соответствовал отсутствию ТН в 100% дорсальных отделов полосатого тела, балл 5 - в 50%, а балл 1 - в 10%. Величину вымывания ТН (степень отсутствия ТН) в области повреждения также определяли, исходя из шкалы от 1 до 10, при этом оценка 10 соответствовала полной элиминации ТН в месте повреждения, а более низкие значения соответствовали проценту оставшейся ТН (например: 5 представляет собой 50% отсутствие ТН, 2 представляет собой 20% отсутствие ТН). Баллы, определяющие размер и величину повреждения, усредняли как для разных срезов, так и для полушарий, с получением единого балла повреждения для каждой крысы.

Для оценки величины утраты холинергических клеток проводили полуколичественные оценки числа холинергических нейронов, как описано выше. Фотографии базальных отделов переднего мозга двух полушарий, окрашенных с помощью ChAT, получали при увеличении 5х с применением цифрового микроскопа Leica DM400B. Оценки количества клеток получали для области базального ядра Мейнерта (nbM) и безымянной субстанции (SI) в пределах участка 680 мкм × 680 мкм, и для горизонтального ядра из диагональной полоски/преоптической области в пределах участка 1000 мкм × 1300 мкм. Функцию "подсчета" программы Photoshop CS6 применяли для количественной оценки числа ACh-клеток. Этот сервис также метит каждый уже подсчитанный нейрон для предотвращения двойного подсчета и обеспечивает возможность просмотра с помощью второго счетчика. Данные полуколичественные оценки для двух полушарий усредняли с получением единой оценки на крысу. Чтобы определить взаимоотношения между степенью повреждений и показателями выполнения и проверить аналогичность повреждений у разных групп с повреждениями DL, для каждой крысы получали единый составной балл, отражающий тяжесть повреждения двух систем. С данной целью утрату холинергических клеток в двух областях базальных отделов переднего мозга на полушарие оценивали от 5 до 1 (5: утрата >90% клеток относительно контроля; 4: >80%; 3: >70%; 2: >60%; 1: утрата >30-50%). Этот балл, умноженный на 2, усредняли с баллом повреждения на основе ТН, описанным выше, для получения единого составного балла (до 10) на крысу DL.

Введение и дозы лекарственного средства

Донепезил и идалопирдин растворяли в 5% растворе среды-носителя на основе 2-гидроксипропил-бета-циклодекстрина. Крыс разделили на следующие группы в зависимости от введения лекарственного средства (14 на группу, по 7 одного пола): подвергнутые ложному нанесению повреждений и введению среды-носителя (SH/VEH), DL и введение среды-носителя (DL/VEH), DL и введение донепезила (DL/DON), DL и введение идалопирдина (DL/IDL) и DL и введение идалопирдина вместе с донепезилом (DL/DON+IDL). Растворы готовили накануне вечером перед введением и заменяли каждые 6 дней. DON и IDL растворяли в одном и том же растворе для комбинированного лечения. Инъекции крысам вводили s.c. (2,0 мл/кг) попеременно в четыре места инъекции (слева в шею, в правый бок, справа в шею, в левый бок; последовательность повторяли). Инъекции крысам утром вводили за 30 минут до проведения SAT и в послеобеденное время за 30 минут до проведения МСМСТ.

Дозы лекарственных средств выбирали, исходя из данных, полученных в пилотном эксперименте, в котором оценивали эффекты DON отдельно, из расчета 0,1, 0,3 и 1,0 мг/кг, или вводимого в комбинации с IDL (5,0 мг/кг) на 4 крысах DL в каждом случае. Результаты позволяют сделать вывод, что наиболее явное положительное воздействие на выполнение МСМСТ крысами DL могла оказывать комбинация обработок, включающая среднюю дозу DON.

Статистические анализы

Сравнивали показатели выполнения SAT и МСМСТ у пяти групп, в первую очередь, с применением ANOVA для внутригрупповых повторных показателей, а также однофакторного или двухфакторного ANOVA, если применимо. Пол выступал в качестве фактора во всех анализах. Анализ баллов и попаданий SAT также включал внутригрупповой фактор продолжительности сигнала (500, 50 и 25 мс). Для пробежек по стержню в МСМСТ (тестовые дни 2-5) оценивали время прохождения, соскальзывания и падения с использованием условия (неподвижный, вращающийся против часовой стрелки (сс) или по часовой стрелке (cw), или вращающийся в попеременно меняющихся направлениях) в качестве внутригруппового фактора. Для каждого условия (или дня) показатели выполнения усредняли для 6 пробежек каждой крысы в этот день, и эти усредненные значения использовали для статистических анализов. В тестовые дни с применением дверного проема (6, 7 и 11) падения, вызванные дистрактором в виде дверного проема, сравнивали у разных групп и полов. Падения и вознаграждения, полученные во время применения условия с активным дистрактором, сравнивали с применением двухфакторного ANOVA. Сравнения поведения "застывания", вызванного дверным проемом, и других показателей выполнения между крысами DL/VEH и DL/DON+IDL проводили с применением двухфакторного ANOVA. Двухфакторный ANOVA также использовали для сравнения составного балла повреждения на основе TH/ChAT между разными группами обработки лекарственным средством и полами. После обнаружения значимых основных эффектов проводили апостериорные множественные сравнения с применением теста наименьшей значимой разницы (LSD). После обнаружения значимых взаимодействий между эффектами группы и другими факторами выполняли однофакторный ANOVA в отношении эффектов группы и тесты множественного сравнения с помощью LSD. Статистические анализы осуществляли с применением SPSS для Windows (версия 17.0: SPSS). В случаях нарушения предположения о сферичности приведены F-значения с поправкой Хюнха-Фельдта вместе с нескорректированными степенями свободы. Установили уровень значимости, составляющий 0,05. Точные Р-значения заявлены, как рекомендовано ранее. Дисперсия заявлена и иллюстрирована в виде стандартной ошибки среднего (SEM). Величина эффекта для выбранных эффектов заявлена с применением критерия d Коэна.

Результаты

Предоперационное выполнение SAT и МСМСТ

Перед проведением операции крыс подвергали тренировке SAT до тех пор, пока они не достигали стабильного выполнения, и они также осваивались с МСМСТ.

Снижение числа случаев падения у крыс DL с помощью DON+IDL

В первый день постоперационного тестирования МСМСТ (таблица 1) крысы проходили по поверхности доски. Данная поверхность редко приводила к случаям соскальзывания или падениям и, таким образом, оценивали только время прохождения. Время прохождения не отличалось между группами и полами (основные эффекты и взаимодействие: все F<1,46, все Р>0,23; 4,02±0,16 с на прохождение).

В дни 2, 3, 4 и 5 крысы выполняли прохождения по поверхности стержня, и их оценивали в отношении времени прохождения, а также случаев соскальзывания и падений (6 прохождений в день, всего 24 пробежки). В день 2 стержень оставался неподвижным (не вращался), вслед за чем следовало вращение стержня (10 об./мин.) в обычном направлении против часовой стрелки (сс) в день 3. В день 4 направление вращения меняли на необычное направление по часовой стрелке (cw), а в день 5 направление вращения меняли попеременно в последовательных испытаниях (cc-cw-cc-cw-cc-cw). Показатели выполнения анализировали в отношении эффектов группы, пола и условия тестирования (неподвижный стержень, сс, cw, попеременное изменение) в качестве внутригруппового фактора.

Падения

Прохождение по вращающемуся стержню обычно повышало число падений у всех животных (основной эффект условия тестирования: F(3,180)=6,48, Р<0,001; падения с неподвижного стержня: 21,67±1,90%, стержня, вращающегося против часовой стрелки (сс): 32,62±1,90%, по часовой стрелке (cw): 30.00±2.34%, с попеременным изменением направления: 30,00±2,00%; меньшее число падений с неподвижного стержня, чем для всех других условий; все Р<0,001). Среди всех этих испытаний основной эффект группы на частоту падений (F(4,60)=2,62, Р=0,04) отражал, что в сравнении с частотой падений у крыс DL/VEH крысы SH/VEH и DL/DON+IDL падали значимо реже (критерий Коэна d=0,96; множественные сравнения см. на фиг. 1А). Более того и в отличие от крыс DL/DON+IDL, частота падения которых была статистически аналогична таковой, наблюдаемой у крыс SH-VEH, крысы, обработанные только IDL, падали столь же часто, как и необработанные крысы DL (DL/VEH). Частота падений у крыс DL/DON демонстрировала тенденцию более низкого значения, чем у крыс DL/VEH, но эффект не достигал значимости (Р=0,17). Эффекты группы и условие тестирование не взаимодействовали (F(12,180)=1,00, Р=0,45), что указывает на то, что выполнение при всех условиях вращения стержня вносило вклад в эффект DON+IDL (фиг. 1B-D). Отсутствовал эффект пола и не было взаимодействий с участием пола (все F<1,69, все Р>0,17).

Скорость прохождения

Подобно эффектам в отношении падений, скорость прохождения у разных групп отличалась (F(4,60)=3,31, Р=0,02), при этом группа обработки, у которой падения наблюдались также часто, как у крыс DL, обработанных средой-носителем, DL/IDL, демонстрировала наиболее медленные прохождения (SH/VEH: 3,96±0,19 с; DL/VEH: 4,62±0,25 с; DL/DON: 4,48±0,36 с; DL/IDL: 5,48±0,45 с, DL/DON+IDL: 4,58±0,32 с; DL/IDL значимо медленнее всех остальных групп). Более того, самцы в целом были медленнее самок F(1,60)=13,54, Р=0,001; самцы: 5,12±0,23 с, самки: 4,13±0,17 с. У обоих полов масса тела не коррелировала со скоростью прохождения (оба R2<0,06). На скорость прохождения не влияли условия тестирования и не было обнаружено ни 2-, ни 3-факторных взаимодействий между 3 факторами (все (F<0,91, р>0,33).

Соскальзывания

Прохождение по вращающемся стержням обычно вызывало большее число случаев соскальзывания по сравнению с неподвижным стержнем (F(3,180)=37,53, Р<0,001; неподвижный: 1,02±0,67 соскальзывания; сс: 2,31±0,16; cw: 2,39±0,15; с попеременным изменением направления: 2,35±0,13). Разные группы не отличались по числу соскальзываний (F(4,60)=2,37, Р=0,06), при этом наблюдалась тенденция, отражавшая, что крысы DL/IDL, по-видимому, соскальзывали чаще всех остальных крыс DL (SH/VEH: 1,60+0,11; DL/VEH: 2,04+0,16; DL/DON: 2,04+0,14; DL/IDL: 2,51+0,38, DL/DON+IDL: 1,92+0,16). Самцы соскальзывали чаще самок (F(1,60)=5,64, Р=0,02; самцы: 2,24±0,17; самки: 1,79±0,10), но опять таки отсутствовали взаимодействия между тремя факторами (все F<1,01, р>0,44). Соскальзывания у самцов, но не у самок, положительно коррелировали с их массой тела (самцы: R2=0,14, Р=0,03; самки: R2=0,08, Р=0,10).

Снижение числа падений, связанных с дверным проемом, у крыс DL, обработанных с помощью DON+IDL

У пациентов с PD, которые уже имеют склонность к "застыванию" при ходьбе, узкие двери с очень высокой эффективность вызывают "застывание" и, таким образом, повышают риск падений. Высказана гипотеза, что данный эффект отражает смещение ограниченных ресурсов внимания от поддержки движения вперед к обработке информации о данном пассивном дистракторе. Дистрактор в виде дверного проема (фиг. 2А) помещали на стержне в тестовые дни 6, 7 и 11.

В целом, дистрактор в виде двери более чем трехкратно увеличивал процентное значение испытаний, при которых происходили падения (F(1,60)=117,10, Р<0,001; падения при наличии двери: 38,34±2,89%, падения в отсутствие двери: 11,30±1,34%). Основной эффект группы (F(4,60)=3,24, Р=0,018) и значимое взаимодействие дверь × группа (F(4,60)=3,15, Р=0,02) отражали то, что число падений, вызванных дверным проемом, объясняются различиями групп (фиг. 2В). Крысы DL, которых обрабатывали одним из VEH, DON или IDL, испытывали больше падений, связанных с дверным проемом, чем крысы SH/VEH. В отличие от этого, число случаев падения у крыс DL/DON+IDL в присутствии дверного приема не отличалось от такового у крыс SH/VEH и было значимо ниже, чем число случаев падения у крыс DL/IDL (критерий Коэна d=0,74; фиг. 2В). У все крыс число случаев падения, связанных с дверным проемом, снижалось в течение трех дней тестирования (основной эффект дня: F(1,120)=48,31, Р<0,001; день 1: 64,76±4,42% падения, 2: 38,10±4,14%, 3: 12,14±2,14; все взаимодействия с остальными факторами: F<1,34, P>0,23).

Дверной проем вызывал почти в два раза больше падений у самцов, чем у самок, однако самцы не падали чаще самок в отсутствие дверного проема (пол × условие: F(1,60)=34,24, Р<0,001; процент падений, связанных с дверью, для всех испытаний; самки: 25,69±3,76%, самцы: 50,99±3,22%, t(69)=26,09, Р<0,001; число падений в отсутствие двери, самки: 13,27±1,81%, самцы: 9,32±1,95%, t(69)=2,20, Р=0,14). Падения, связанные с дверным проемом, у самцов не коррелировали с их массой тела или скоростью прохождения (оба R2<0,03). Однако у более медленных самок наблюдалось больше падений при данных условиях (R2=0,21, Р=0,005). Отсутствовали значимые взаимодействия между 3 факторами (все F<1,31, все Р>0,25).

Микроповеденческие взаимосвязи

Чтобы определить потенциальные поведенческие взаимосвязи эффекта обработки DON+IDL с падениями, связанными с дверным проемом, проводили анализ микроповедения животного во время прохождения дверного проема с помощью видеосъемки. Были выбраны пробежки с дверным проемом самцов и самок крыс DL/VEH и DL/DON+IDL в дни, когда число случаев их падения отражало их групповые средние (дни 6 и 7 для самок и 11 для самцов). В большинстве случаев наблюдали, что крысы обеих групп прекращали движение вперед при достижении дверного проема (эффекты групп на продолжительность "застывания": F(1,27)=1,22, Р=0,28; DL/VEH: 1,25±0,22 с/"застывание"; DL/DON+IDL: 0,93±0,21 с). Более того, продолжительность периодов "застывания" у отдельных крыс коррелировала с числом случаев их падения (фиг. 2С). Поскольку более длительные "застывания" почти обязательно были связаны с падениями у всех крыс, "застывания", вызванные дверным проемом, группировали в длительные (≥2 с) по сравнению с короткими "застываниями" (<2 с). Процент испытаний, при которых происходили длительные "застывания", у двух групп не отличался (6 испытаний на животное; F(1,27)=2,59, Р=0,12; 26,79±4,95% испытаний включали длительные "застывания"). В дополнение, число случаев падения, связанного с длительными "застываниями" - у животных, которые демонстрировали по меньшей мере одно такое "застывание" (10 DL/VEH и 9 DL/DON+IDL), - не отличалось у этих двух групп (F(1,18)=0,004, Р=0,95; DL/VEH: 62,67±12.62% падений при пробежках, включающих "застывания", связанные с дверным проемом; DL/DON+IDL: 63,89±13,89%). Однако число случаев падения, связанного с короткими "застываниями", у крыс DL/VEH было выше, чем у DL/DON+IDL (14 крыс на группу; F(1,27)=5,27, Р=0,03, фигура 2D). Таким образом, данные наблюдения указывают на то, что обработка крыс DL с помощью DON+IDL не повышала долю пробежек с дверным проемом, которые были связаны с относительно короткими "застываниями", но крысы, обработанные DON+IDL, обладали большей способностью к возобновлению продолжения прохождения после коротких "застываний".

Чтобы дополнительно подробно описать потенциальные эффекты комбинированного лечения с помощью DON+IDL, выбирали репрезентативные пробежки (два первых испытания с дверным проемом в день 2 у самок и в день 3 в случае самцов; по 2 испытания на крысу), при этом подсчитывали число случаев следующего поведения в течение 1-секундного периода, начинающегося вскоре после и во время короткого "застывания" (0,5-1,5 с периодов "застывания"): (1) внезапное увеличение скорости прохождения после "застывания"; (2) высокое и жесткое положение хвоста в момент прохождения под дверным проемом, связанное с контролируемым прямым положением тела и ориентацией вперед, в отличие от низкого волочащегося хвоста и сгорбленного положения тела и ориентации вниз, типичных для крыс DL; 31 (3) качание хвостом для сохранения равновесия после соскальзываний, связанных с дверным проемом; (4) использование передних конечностей для 'выталкивания' передней части тела обратно на стержень после соскальзываний; (5) активные движения задними конечностями ('ходьба на месте') во время "застываний" для сохранения равновесия на стержне и (6) небольшие 'прыжки' после "застывания" для восстановления импульса для прямолинейного движения через дверной проем. Результаты указывают на то, что, во-первых, составной балл, сокращающий подсчеты всех 6 видов поведения, отрицательно коррелировал с числом случаев падения у обеих групп (обе R²>0,42, обе Р<0,02), что указывает на то, что активные восстановительные движения после коротких "застываний" являются четкими показателями успешных пробежек с дверным проемом. Во-вторых, крысы DL/DON+IDL демонстрировали больше случаев поведения категории №2 (выше), чем крысы DL/VEH (Х²=7,22, Р=0,03, DL/VEH: 0,18±0,10 подсчетов/испытание, DL/DON+IDL: 0,54±0,11; все другие категории поведения: Р>0,30; фиг. 2Е).

Отсутствие эффектов обработки в отношении падений, связанных с активным дистрактором

Падения у пожилых людей и пациентов с PD коррелируют с неудовлетворительным выполнением двойных задач. Чтобы смоделировать влияние перераспределения ресурсов внимания на второстепенную задачу на комплексный контроль процесса движения, лишенным воды крысам предлагали воду для ее отыскания при прохождении по вращающемуся стержню.

В целом, 54 из 70 (77,14%) животных отыскивали воду (определялось как слизывание воды в течение по меньшей мере 1 с, независимо от падений) по меньшей мере в одном испытании (13 SH/VEH, 9 DL/VEH, 10 DL/DON, 11 DL/IDL и 11 DL/DON+IDL; 26 самцов и 28 самок). Основной эффект группы указывал на то, что все крысы DL отыскивали воду реже, чем крысы SH/VEH (F(4,60)=3,32, Р=0,016), хотя множественные сравнения показали, что подсчет случаев отыскивания у крыс DL/DON был не значимо ниже, чем у DL/VEH (фиг. 3А). Самки отыскивали воду чаще, чем самцы (F(1,60)=10,56, Р=0,002; самки: 49,78±6,32%, самцы: 26,69±4,36%], однако эффекты пола не взаимодействовали с группой (F(4,60)=1,50, Р=0,22). В данном тесте значения отыскания воды и падения представляют собой смешанные показатели, поскольку прекращение движения вперед для отыскания воды связано с высоким риском падения. Крысы SD/VEH чаще добивались успеха в отыскании воды без падения, чем крысы DL (F(4,60)=5,84, Р<0,001; фиг. 3В). Более того, самки успешно отыскивали воду без падений чаще самцов (F(1,60)=10,81, Р=0,002; самки 33,98+5,02% испытаний; самцы: 16,73+3,36%), однако данный эффект не проявлял взаимодействия с группой (F(1,69)=l,56, Р=0,19). Ни у одного пола данный показатель не коррелировал с массой тела, скоростью прохождения или падениями, связанными с дверным проемом все R2<0,1). Таким образом, повреждения DL снижали вовлечение в случае активного дистрактора и повышали связанное с ним число случаев падения, но обработки лекарственными средствами не помогали выполнению прохождения по стержню в присутствии данного активного дистрактора.

Отсутствие эффектов обработки на выполнение SAT

После завершения периода постоперационного восстановления, составляющего четыре недели, животных возвращали к утреннему тестированию SAT и послеобеденному тестированию МСМСТ, и при этом обработки лекарственными средствами вводили за 30 минут до утреннего тестового сеанса, а также послеобеденного тестового сеанса. Повреждения DL ухудшали выполнение SAT. Однако ни одна из обработок не улучшала выполнение.

Пример 2: Снижение числа падений у крыс DL, обработанных ривастигмином и идалопирдином

Краткий обзор исследования

Крыс с двойным повреждением (DL) или ложно оперированных крыс обрабатывали с помощью подкожного (s.c.) введения либо среды-носителя (10% 2-гидроксипропил-β-циклодекстрана; 2-HPBCD, в солевом растворе), 1 мг/кг ривастигмина, 10 мг/кг идалопирдина или комбинации этих двух средств лечения в течение 10 последовательных дней в объеме 5 мл/кг. Статистические сравнения проводили с помощью однофакторного ANOVA и апостериорного критерия Даннета для множественных сравнений с животными DL, обработанными средой-носителем, в качестве контроля.

МСМСТ: отличия от устройства, применяемого в примере 1

Устройство было аналогично тому, которое использовалось ранее (Kucinski et al., 2013). Оно состояло из 3-метрового прямого стержня с квадратным сечением (2,54 см²) или зигзагообразного стержня с двумя криволинейными поверхностями вдоль стержня, поддерживаемых между двумя метровыми стойками, на которых удерживались начальная и концевая платформы. Эти идентичные платформы были размеров 30 см × 25 см, и в состав каждой входила медная чашка для воды диаметром 3 см, вмонтированная в пол. Платформы были окружены структурами с выдвижными стенками, которые имели высоту 23 см, когда они находились в полностью поднятом положении. Эти стенки могли подниматься и опускаться механическим способом с помощью электромотора 12 В постоянного тока, управляемого дистанционно с помощью тумблерного переключателя, и, таким образом, обеспечивается возможность превращения из открытой платформы для начала прохождения в структуру в форме коробки для окончания. На стенке, обращенной к бруску, располагалось отверстие шириной 9 см, чтобы обеспечить крысам доступ для выхода на брусок и схода с бруска. Стержень был изготовлен из алюминиевого профиля, заключенного в серую тканевую клейкую ленту, используемую для увеличения силы сцепления. В условиях доски прямо сверху стержня помещали доску шириной 13,3 см, и ее вставляли внутрь краев поддерживающих стоек. Электромотор 12 В постоянного тока применяли для вращения стержня, управляемого широтно-импульсным модулятором. На расстоянии 20 см под стержнем подвешивали страховочную сетку для поимки крыс во время падения. Записи МСМСТ выполняли с применением 4 камер видеонаблюдения Marshall 1080-HD-DI модель CV500 Series (В-30/25Р частота кадров/59,941), установленной на раме, параллельной одной стороне стержня. Видеозаписи преобразовывали в единый канал с помощью устройства для множественного просмотра с преобразованием четырех SDI в HDMI (Matrox MicroQuad) и просматривали напрямую на PC с использованием программного обеспечения Elgato Game Capture HD.

Результаты

Результаты показаны на фигурах 4-7, и можно наблюдать, что комбинированная обработка крыс DL с помощью идалопирдина и ривастигмина (DL/Riva+IDL) снижала число падений по сравнению с необработанными крысами DL (DL/Veh)

1. Применение N-(2-(6-фтор-1Н-индол-3-ил)этил)-3-(2,2,3,3-тетрафторпропокси)бензиламина (идалопирдина) для изготовления лекарственного средства для снижения риска падений у пациента с болезнью Паркинсона, где лечение дополнительно включает введение донепезила указанному пациенту.

2. Применение по п.1, где доза донепезила составляет от 1 до 30 мг.

3. Применение по п.1, где суточная доза идалопирдина составляет от 10 до 120 мг.