Композиция для лечения рака, объединяющая анти-cd26 антитело и другое противораковое средство

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен конъюгат, нацеленный на CD26, включающий анти-CD26 антитело, соединенное с триптолидом. Новый конъюгат антитело-лекарственное средство получен в результате конъюгации анти-CD26 антитела (YS110) с триптолидом и является высокоэффективным ингибитором CD26-положительных клеток злокачественной мезотелиомы. Изобретение может быть использовано для эффективной химиотерапии злокачественной мезотелиомы с уменьшенными побочными воздействиями на пациента. 5 н. и 2 з.п. ф-лы, 54 ил., 5 табл., 12 пр.

 

Перекрестная ссылка

Настоящая заявка притязает на приоритет по заявке на патент № 2015-179672, поданной в Японии 11 сентября 2015, полностью включенной в настоящее описание посредством отсылки. Патенты, заявки на патент и литература, цитированные в настоящем описании, полностью включены в настоящее описание посредством отсылок.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композиции для лечения рака, включающей анти-CD26 антитело в качестве активного ингредиента в комбинации с другими противораковыми средствами. Настоящее изобретение также относится к области конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC).

Уровень техники

Сообщается, что в химиотерапии мезотелиомы терапия одним противораковым средством показывает такую низкую чувствительность к лекарственному средству как 20% или меньше (непатентная литература 1). Соответственно, комбинируют несколько лекарственных средств для более эффективного лечения мезотелиомы. Например, сообщается об использовании комбинации цисплатина и пеметрекседа чтобы оказать более эффективное терапевтическое воздействие, чем при применении каждого лекарственного средства по отдельности (непатентная литература 2). По этой причине в настоящее время в стандартной химиотерапии мезотелиомы одновременно применяют цисплатин и пеметрексед (непатентная литература 3). Однако даже при такой сопутствующей терапии средний период выживания составляет чуть меньше 12 месяцев. Таким образом, требуется разработка более эффективной химиотерапии. Кроме того, сопутствующая терапия с цисплатином и пеметрекседом подавляет рост раковых клеток за счет механизма, включающего цитотоксичность. Поэтому существует потребность в терапии с меньшими побочными воздействиями на пациента, в частности лечение, основанное не на платине.

Гемцитабин представляет собой нуклеозидное производное дезоксицитидина, в котором водород в положении 2' сахарной цепи замещен фтором, которое действует как ингибитор синтеза ДНК. Это лекарственное средство превосходно по безопасности (непатентная литература 4) и широко используется как противораковое средство. Однако при мезотелиоме действие одного гемцитабина является недостаточным. Ожидается, что комбинация гемцитабина с соответствующим противораковым средством приведет к большей эффективности. Например, поскольку показано, что пеметрексед и гемцитабин обладают противораковым действием, будучи примененными сами по себе, были предприняты попытки комбинированной терапии этими лекарственными средствами, но с точки зрения продления среднего периода выживания при лечении мезотелиомы их действие оказалось таким же, как при использовании одного пеметрекседа (непатентная литература 5). Также сообщается, что при сравнении лечения комбинацией цисплатин-пеметрексед с лечением комбинацией цисплатин-гемицитабин лечение мезотелиомы комбинацией цисплатин-пеметрексед было более эффективным (непатентная литература 6). Также при комбинировании эпирубицина и гемцитабина получают лишь чуть улучшенное действие (непатентная литература 7). Также сообщается, что при использование комбинации гемциатбина и средства на основе алкалоида барвинка – винорелбина против злокачесвенных опухолей, винорелбин не улучшает действие (непатентная литература 8). Соответственно, такие предыдущие испытания с применением комбинаций с гемцитабином не преуспели в создании улучшеного комбинированного лечения.

Выяснено, что одновременное использование доцетаксела и гемцитабина дает небольшое улучшение в эффективности, поскольку комбинация продлевает средний период выживания до 15 месяцев (непатентная литература 3). Сообщается, что одновременное использование гемцитабина с антифолатом метотрексатом немного продлевает средний период выживания до 19,4 месяцев (непатентная литература 10). Однако эти противораковые средства в комбинации с гемцитабином имеют не специфичную в отношении клеток активность и, следовательно, могут вызывать побочные эффекты.

Эффекты сопутствующего применения также исследовали в случае иных, чем мезотелиома, раковых заболеваний. Например, сопутствующее применение циспалтина и пеметрекседа оказывает превосходное действие при раке легких (непатентная литература 11). Также довольно часто используют ингибитор EGFR гефитиниб (Iressa), и требуется разработка сопутствующей терапии с использованием иных лекарственных средств, чем циспалтин и гемцитабин.

Другая стратегия усиления терапевтического действия сопутствующей терапии циспалтин-пеметрексед предлагает использовать комбинацию с дополнительными лекарственными средствами. Так как стандартная терапия мезотелиомы вызывает анемию, можно назначить эритропоэтин, но эритропоэтин не усиливает цитотоксическое воздействие комбинации циспалтин-пеметрексед на клеточные линии мезотелиомы (непатентная литература 12). Сообщается, что ингибитор гистондеацетилазы (HDAC) вориностат не оказывает продлевающее жизнь действие по сравнению с плацебо у больных мезотелиомой (непатентная литература 13). Сообщается, что ингибитор HDAC вальпроат, используемый как противосудорожное лекарственное средство, усиливает противоопухолевую действенность сопутствующего применения циспалтина и пеметрекседа в экспериментах с использованием клеточных линий мезотелиомы (непатентная литература 14). Однако вальпроат часто вызывает побочные эффекты, такие как тошнота или рвота, и таким образом не рассматривается как подходящий для введения больным раком, которые ощущают сильную усталость.

Сделана попытка комбинированного использования с генетическим лечением, и сообщается о трансфекции клеток геном SOCS-1 для усиления цитотоксического действия сопутствующей терапии циспалтин-пеметрексед в экспериментах с использованием клеточных линий мезотелиомы (непатентная литература 15). Известно, что у большинства больных мезотелиомой ген р53 нормальный, но инактивирован из-за недостатка р14 (ARF) или р16 (INK4A). Сообщается, что введение гена р53 в клеточные линии мезотелиомы синергетическим образом усиливает цитотоксическое действие цисплатина или пеметрекседа, и особенно, что введение гена р53 в плевру мышей, которым интраплеврально трансплантирована мезотелиома, усиливает противоопухолевую активность цисплатина (непатентная литература 16). Однако в настоящее время лечение в клинике посредством переноса генов затруднительно и сложно на практике, и таким образом существует потребность в более удобном и более эффективном методе.

В большинстве случаев в биопсиях мезотелиомы наблюдается экспрессия фактора роста клеток сосудистого эндотелия (VEGF), что предполагает возможность, что VEGF вовлечен в рост мезотелиомы. Соответственно, исследовали эффект от дополнительного введения анти-VEGF антитела бевацизумаба к стандартной терапии в фазе II клинических испытаний (непатентная литература 17). Однако бевацизумаб не мог усиливать терапевтическое действие стандартной сопутствующей терапии циспалтин-пеметрексед. Исследовали добавление низкомолекулярного соединения – ингибитора рецепторной тирозинкиназы (RTK) сунитиниба к стандартной сопутствующей терапии циспалтин-пеметрексед в 10 случаях клеток немелкоклеточного рака и 1 случае мезотелиомы на фазе I клинических испытаний, но не наблюдали лечебного взаимодействия (непатентная литература 18).

Сообщается, что интерферон-бета синергетическим образом усиливает цитотоксическую активность цисплатина или пеметрекседа в экспериментах с использованием клеточных линией мезотелиомы (непатентная литература 19). Такой эффект вероятно основан на экспрессии р53, вызванной интерфероном-бета. Однако при практическом применении проблемой может стать побочные эффекты, такие как лихорадка или недомогание, связанные с введением интерферона-бета.

Клиническая картина мезотелиомы характеризуется инвазией плевры (непатентная литература 20). Одним из симптомов является значительная одышка из-за накопления плеврального выпота, вызванного инвазией плевры. Хотя мезотелиома характеризуется инвазией, активность против инвазии проанализирована недостаточно. Сообщается, что введение вышеуказанного гена SOCS-1 в клетки мезотелиомы синергетическим образом повышает противоинвазивную активность комбинации циспалтин-пеметрексед (непатентная литература 21). Мезотелин представляет собой гликопротеин в 40 кДа, сверхэкспрессируемый при мезотелиоме, раке поджелудочной железы и раке яичников, и, как сообщается, способствует инвазии клеточных линий мезотелиомы (непатентная литература 22). Однако пока нет сообщений о появлении эффективного лекарства типа низкомолекулярного соединения-ингибитора или антитела против мезотелина . Также сообщается, что ассоциированный с беременностью плазменный белок А (РАРРА) стимулирует инвазию в экспериментах с использованием клеточных линией мезотелиомы (непатентная литература 23). Однако не сообщается об эффективном веществе для лечения мезотелиомы, нацеленном на РАРРА.

Соответственно, не существует практически приемлемого способа лечения, который может решить проблемы сопутствующего лечения мезотелиомы цисплатином с пеметрекседом.

Конъюгаты антитело-лекарственное средство уже используются на практике как таргетная терапия главным образом в случае злокачественных опухолей. Конъюгация средства, имеющего противораковую активность, с антителом, которое специфически связывается с опухолевыми клетками, имеет преимущества, поскольку средство эффективно внедрится в опухолевые клетки, а также побочное действие из-за токсичности для неопухолевых клеток уменьшается. Конъюгаты антитело-лекарственное средство получают следующими процедурами: мышиное моноклональное антитело против антигена, который специфически экспрессируется на опухолевых клетках, гуманизируют с применением метода моделирования in silico, и выбирают лекарственное средство, имеющее очень высокую противоопухолевую активность в отношении намеченных опухолевых клеток, которое конъюгируют с гуманизировнным антителом через сшивающий агент. В настоящее время FDA Соединенных Штатов одобрены в качестве лекарственных средств два конъюгата антитело-лекарственное средство (показания: острый миелоидный лейкоз и злокачественная лимфома) и 35 конъюгатов антитело-лекарственное средство проходят клинические испытания с 2013. Ни один из конъюгатов антитело-лекарственное средство не одобрен в Японии. Хотя конъюгаты антитело-лекарственное средство перспективны как противоопухолевые лекарственные средства в смысле как усиления эффективности, так и снижения побочного действия, лишь несколько конъюгатов антитело-лекарственное средство разрешены для применения на практике из-за множества стадий исследования, которое требуется, таких как (1) выбор антигена и получение моноклонального антитела, имеющего благоприятную специфичность, (2) гуманизация антитела, (3) введение антитела в опухолевые клетки, (4) выбор лекарственного средства для присоединения, (5) выбор сшивающего агента и (6) безопасность. Злокачественная мезотелиома является заболеванием с плохим прогнозом даже при комбинированном методе лечения, и таким образом, требуется разработка нового метода лечения. Однако конъюгата антитело-лекарственное средство, одобренного в качестве лекарственного средства для лечения злокачественной мезотелиомы, не имеется.

CD26 представляет собой трансмембранный белок и является костимулирующей молекулой, вовлеченной в активацию Т-клеток. В последние годы показана высокая экспрессия CD26 в различных злокачественных опухолях, включая злокачественную мезотелиому. Из-за онкоспецифичности CD26 предполагается его использование в противоопухолевых воздействиях (патентная литература 1 и 2). Так как CD26 особенно сверхэкспрессируется в мезотелиоме (непатентная литература 24), анти-CD26 антитело рассматривается как весьма безопасное. Действительно, анти-CD26 антитело подавляет рост клеток мезотелиомы (непатентная литература 25 и патентная литература 3), и во Франции уже завершается фаза I клинических испытаний гуманизированного анти-CD26 антитела YS110, которая показывает его безопасность (непатентная литература 26). Однако об одновременном использовании анти-CD26 антитела с другими лекарственными средствами не сообщается.

Список цитированной литературы

Патентная литература

Патентная литература 1: международная публикация № WO02/14462

Патентная литература 2: международная публикация № WO2007/014169

Патентная литература 3: международная публикация № WO2008/114876

Непатентная литература

Непатентная литература 1: Ong T and Vogelzang NJ, 1996

Непатентная литература 2: Ellis P et al., 2006; Jaenne PA., 2006

Непатентная литература 3: Vogelzang et al., 2003; Stahel RA et al., 2010, Boons C.C.L.M., 2013

Непатентная литература 4: Toschi L et al., 2005

Непатентная литература 5: Janne PA et al., 2008

Непатентная литература 6: Shukuya T et al., 2014

Непатентная литература 7: Okuno SH et al., 2008

Непатентная литература 8: Zauderer MG et al., 2014

Непатентная литература 9: Ralli M et al., 2009

Непатентная литература 10: Kuribayashi K. et al., 2013

Непатентная литература 11: Sun JM et al., J. Clin. Oncol., 33 (22), 2450. 2015

Непатентная литература 12: Palumbo C et al., 2008

Непатентная литература 13: Zauderer and Krug, 2012

Непатентная литература 14: Vandermeets F. et al., 2009

Непатентная литература 15: Iwahori H. et al., 2013

Непатентная литература 16: Li Q. et al., 2012

Непатентная литература 17: Dowell JE et al., 2012

Непатентная литература 18: Camidge DR e al., 2013

Непатентная литература 19: Li Q et al., 2013

Непатентная литература 20: Robinson and Lake, 2005

Непатентная литература 21: Iwamoto H. et al., 2013

Непатентная литература 22: Servais EL et al., 2012

Непатентная литература 23: Huang J. et al., 2013

Непатентная литература 24: Amatya VJ et al., 2011

Непатентная литература 25: Inamoto T. et al., 2007

Непатентная литература 26: Angebin E. et al.

Непатентная литература 27: Yamada K. et al., Plos One, 2013, Apr 29; 8 (4): e62304

Сущность изобретения

Как описано выше, для того, чтобы решить проблемы сопутствующей терапии цисплатин-пеметрексед, в настоящее время в стадии реализации находятся многие исследования по улучшению стандартной химиотерапии мезотелиомы, например, по ее комбинации с другими лекарственными средствами. Однако их применение на практике сталкивается с проблемами. Противоопухолевое действие стандартной сопутствующей терапии цисплатин-пеметрексед основано на цитотоксическом действии, и таким образом, при добавлении другого лекарственного средства к стандартной терапии требуется, чтобы это дополнительное лекарственное средство не имело действия, основанного на токсичности, было безопасное и более эффективное. Также существует потребность в новом высоко безопасном способе лечения, который основан не на цитотоксичности подобно стандартной терапии, и основан не на терапии с платиной.

Хотя патологической особенностью мезотелиомы является локальная инвазия, мало исследований лекарственных средств против мезотелиомы сосредоточено на инвазии. Авторы изобретения считают, что можно обеспечить более эффективный способ лечения может путем разработки способа лечения мезотелиомы, сосредоточенного на ингибирующем действии на инвазию.

CD26 сверхэкспрессируется в мезотелиоме и рассматривается как весьма подходящий. Действительно, анти-CD26 антитело подавляет рост клеток мезотелиомы и поэтому находится в фазе I клинических испытаний на больных с мезотелиомой. Соответственно, авторы изобретения исследовали способ лечения с использованием стандартной сопуствующей терапии цисплатин-пеметрексед в комбинации с анти-CD26 антителом в отношении роста и инвазии клеточных линий мезотелиомы. В результате обнаружено, что подавление роста мезотелиомы стандартной сопутствующей терапией цисплатин-пеметрексед усиливается при комбинировании с анти-CD26 антителом. Авторы изобретения также обнаружили, что сопутствующее применение цисплатина и пеметрекседа лишь незначительно подавляет инвазию, в то время как комбинация анти-CD26 антитела с одновременным использованием цисплатина и пеметрекседа синергетическим образом ингибирует инвазию.

Авторы изобретения также провели анализ молекул, вовлеченных в усиление ингибирующего действия на инвазию, с использованием микроматричного анализа клеток мезотелиомы, обработанных анти-CD26 антителом, и обнаружили участие AAMP, ESAM, FUT8, RAC1, FYN и RNF20.

Авторы изобретения исследовали эффект от комбинации воздействия на CD26 с различными лекарственными средствами и нашли, что сопутствующее применение гуманизированного антитела к CD26 и гемцитабина или гефитиниба против роста клеточных линий мезотелиомы может предоставить весьма эффективный и безопасный способ лечения мезотелиомы.

Авторы изобретения также исследовали конъюгаты антитело-лекарственное средство с использованием анти-CD26 антитела. В результате успешно получили новый конъюгат антитело-лекарственное средство (Y-TR1), демонстрирующей сильное воздействие на CD26-положительные клетки мезотелиомы, который получен путем конъюгации через двухвалентный сшивающий агент анти-CD26 антитела (YS110) с триптолидом, который, как известно, обладает сильной противоопухолевой активностью, но до этого не использовался в конъюгатах антитело-лекарственное средство.

Соответственно, настоящее изобретение относится к препаратам сопутствующей терапии, представляющим собой анти-CD26 антитело и дополнительное лекарственное средство и конъюгату, включающему анти-CD26 антитело, соединенное с триптолидом. Конкретнее, настоящее изобретение относится к аспектам, перечисленным далее.

(1) Конъюгат, включающий анти-CD26 антитело или его фрагмент, соединенные с триптолидом.

(2) Конъюгат согласно (1), в котором анти-CD26 антитело или его фрагмент представляют собой гуманизированное антитело или его фрагмент.

(3) Конъюгат согласно (2), в котором гуманизированное антитело или его фрагмент включает вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую 80% или большую идентичность с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 8-14, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую 80% или большую идентичность с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 1-7.

(4) Конъюгат согласно (2) или (3), в котором гуманизированное антитело или его фрагмент включает вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую 80% или большую идентичность с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 1-7, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую 80% или большую идентичность с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 8-14.

(5) Конъюгат согласно любому из (2)-(4), в котором гуманизированное антитело или его фрагмент включает по меньшей мере одну тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, имеющую 90% или большую идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 17, и по меньшей мере одну легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, имеющую 90% или большую идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 18.

(6) Конъюгат согласно любому из (2)-(5), в котором гуманизированное антитело или его фрагмент включает по меньшей мере одну тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность от позиции 20 до позиции 465 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17, и по меньшей мере одну легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность от позиции 21 до позиции 234 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18.

(7) Конъюгат согласно любому из (2)-(6), в котором гуманизированное антитело или его фрагмент связывается с одним или несколькими пептидами, выбранными из группы, включающей SEQ ID NO: 19-28.

(8) Конъюгат согласно (2), при этом гуманизированное антитело продуцировано штаммом, обозначенным s604069.YST-pABMC148 (x411) имеющим номер депонирования PTA-7695 в Американской коллекции типовых культур (ATCC).

(9) Конъюгат согласно любому из (1)-(8), при этом фрагмент выбирают из группы, включающей Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv и F(ab')2.

(10) Фармацевтическая композиция, включающая конъюгат согласно любому из (1)-(9) в качестве активного ингредиента.

(11) Фармацевтическая композиция согласно (10) для лечения злокачественной мезотелиомы.

(12) Ингибитор роста клеток злокачественной мезотелиомы, включающий конъюгат согласно любому из (1)-(9).

(13) Агент для лизиса клеток злокачественной мезотелиомы, включающий конъюгат согласно любому из (1)-(9).

(14) Применение конъюгата согласно любому из (1)-(9) при изготовлении фармацевтической комопзиции для лечения злокачественной мезотелиомы.

(15) Фармацевтическая композиция, включающая анти-CD26 антитело или его фрагмент и дополнительное противоопухолевое средство.

(16) Фармацевтическая композиция согласно (15), при этом дополнительное противоопухолевое средство представляет собой одно или несколько лекарственных средств, выбранных из группы, включающей цисплатин, пеметрексед, гефитиниб и гемцитабин.

(17) Фармацевтическая композиция согласно (15) или (16), при этом анти-CD26 антитело или его фрагмент представляют собой гуманизированное антитело или его фрагмент.

(18) Фармацевтическая композиция согласно (17), при этом гуманизированное антитело или его фрагмент включает вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую 80% или большую идентичность с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 8-14, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую 80% или большую идентичность с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 1-7.

(19) Фармацевтическая композиция согласно (17), при этом гуманизированное антитело или его фрагмент включает вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую 80% или большую идентичность с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 1-7, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую 80% или большую идентичность с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 8-14.

(20) Фармацевтическая композиция согласно (17), при этом гуманизированное антитело или его фрагмент включает по меньшей мере одну тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, имеющую 90% или большую идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 17, и по меньшей мере одну легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, имеющую 90% или большую идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 18.

(21) Фармацевтическая композиция согласно (17), при этом гуманизированное антитело или его фрагмент включает по меньшей мере одну тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность от позиции 20 до позиции 465 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17, и по меньшей мере одну легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность от позиции 21 до позиции 234 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18.

(22) Фармацевтическая композиция согласно любому из (17)-(21), при этом гуманизированное антитело или его фрагмент связывается с одним или несколькими пептидами, выбранными из группы, включающей SEQ ID NO: 19-28.

(23) Фармацевтическая композиция согласно любому из (17)-(22), при этом гуманизированное антитело продуцировано штаммом, обозначенным s604069.YST-pABMC148 (x411) имеющим номер депонирования PTA-7695 вАмериканской коллекции типовых культур (ATCC).

(24) Фармацевтическая композиция согласно любому из (15)-(23), при этом фрагмент выбирают из группы, включающей Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv и F(ab')2.

(25) Фармацевтическая композиция согласно любому из (15)-(24) для лечения злокачественной мезотелиомы.

(26) Ингибитор роста клеток злокачественной мезотелиомы, включающий фармацевтическую композицию согласно любому из (15)-(24).

(27) Агент для лизиса клеток злокачественной мезотелиомы, включающий фармацевтическую композицию согласно любому из (15)-(24).

(28) Применение анти-CD26 антитела и дополнительного противоопухолевого средства при изготовлении фармацевтической композиции для лечения злокачественной мезотелиомы.

(29) Применение согласно (28), при этом дополнительное противоопухолевое средство представляет собой одно или несколько лекарственных средств, выбранных из группы, включающей цисплатин, пеметрексед, гефитиниб и гемцитабин.

Положительные эффекты изобретения

Комбинация гуманизированного антитела к CD26 с одним или несколькими лекарственными средствами, выбранными из группы, включающей цисплатин, пеметрексед, гефитиниб и гемцитабин, синергетическим образом усиливает ингибирующее действие на инвазию, которая является патологической особенностью и радикальной проблемой мезотелиомы, и/или усиливает ингибирующее действие на рост клеток мезотелиомы и таким образом рассматривается как весьма полезная при лечении мезотелиомы. Поскольку сопутствующее применение гефитиниба или гемцитабина и анти-CD26 антитела является неплатиновой терапией, оно может представлять в существееной степени безопасную лекарственную терапию мезотелиомы. Кроме того, гуманизированное анти-CD26 антитело, конъюгированное с триптолидом, может эффективно подавлять рост клеток злокачественной мезотелиомы при меньшем количестве триптолида. Соответственно, может быть предложено менее токсичное и высоко эффективное средство против злокачественной опухоли.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 представляет собой спектры интактных масс неконъюгированных YS110 и Y-TR1 (SMCC), измеренные MALDI-TOFF масс-спектрометрией. Фигура 1A показывает неконъюгированное YS110 (измеренная величина 147012,7), и фигура 1B показывает Y-TR1 (SMCC) (измеренная величина 151815,6).

Фигура 2 представляет собой график связывания Y-TR1 с клеточной линией злокачественной мезотелиомы MSTO, клон 12 (CD26-положительный). Первичное антитело Y-TR1, вторичное антитело FITC-конъюгированный кроличий античеловеческий IgG. При 10 мкг/мл или выше Y-TR1 показывает интактное связывание с CD26-положительными клетками. По ординате показана интенсивность флуоресценции, и по абсциссе показано число клеток.

Фигура 3 представляет собой кривые токсичности триптолида для клеточных линий злокачественной мезотелиомы и Т-клеточного лейкоза. А: MSTO дикого типа (wt); В: MSTO, клон 12; С: JMN; D: Jurkat CD26(-); E: Jurkat CD26(+). Ордината показывает интенсивность флуоресценции (%). Абсцисса показывает концентрацию (нМ) триптолида.

Фигура 4 представляет собой кривые токсичности in vitro TR1 для клеточной линии злокачественной мезотелиомы. Ордината показывает интенсивность флуоресценции (%) против контроля, и абсцисса показывает концентрацию (нМ) TR1.

Фигура 5 представляет собой кривые токсичности in vitro TR1 для клеточных линий злокачественной мезотелиомы и Т-клеточного лейкоза. Фигура 5А показывает цитотоксичность Y-TR1 для CD26-положительной клеточной линии злокачественной мезотелиомы MSTO, клон 12, при сравнении различных используемых линкеров. Y-TR1 с использованием SMCC показывает наивысшую цитотоксичность. Фигура 5В показывает цитотоксичность TR1 для CD26-положительной клеточной линии злокачественной мезотелиомы JMN в сравнении с неконъюгированным YS110. Фигура 5С представляет собой кривую, показывающую цитотоксичность in vitro Y-TR1 для CD26-положительных клеток злокачественной мезотелиомы MSTO, клон 12, которую сравнивают с цитотоксичностью для CD26-отрицательной клеточной линии MSTO дикого типа (wt). Y-TR1 показывает более высокую цитотоксичность против CD26-положительных клеток злокачественной мезотелиомы MSTO, клон 12, чем против CD26-отрицательной линии MSTO дикого типа (wt).

Фигура 6 представляет собой диаграмму сравнения величин IC50 неконъюгированного TR1 и Y-TR1 в молярных концентрациях.

Фигура 7 представляет собой диаграмму противоопухолевой активности in vivo Y-TR1, измеренной с использованием мышиных моделей NOD/SCID с ксенотрансплантатом, которым трансплантирована CD26-положительная клеточная линия злокачественной мезотелиомы JMN. Y-TR1 вводят интраперитонеально по 4 мг/кг/доза три раза в неделю. Y-TR1 вводят в целом 9 раз от дня введения подкожно 1х10⁷ клеток JMN (день 0). Средний оцененный объем опухоли в день 55 сравнивают для 3 групп (контрольная группа, группа, которой вводили YS110, и группа, которой вводили Y-TR1) с помощью защищенного критерия Фишера для множественного сравнения разностей наименьших квадратов. Средний объем опухоли в группе, которой вводили Y-TR1, заметно меньше, чем в контрольной группе и группе, которой вводили YS110 (p < 0,05). Ордината показывает оцененный средний объем опухоли (мм³), и абсцисса показывает группу.

Фигура 8 представляет собой графики экспрессии CD26 в клеточной линии мезотелиомы. Название каждой испытываемой клеточной линии указано над графиками.

Фигура 9 представляет собой графики кривых дозовой зависимости для цисплатина и пеметрекседа. Ордината показывает жизнеспособные клетки (мутность: OD), и абсцисса показывает концентрацию цисплатина или пеметрекседа. Левые графики показывают результаты при использовании клеток MESO1, и правые графики показывают результаты при использовании клеток Н2452. Верхние графики показывают результаты для цисплатина, и нижние графики показывают результаты для пеметрекседа.

Фигура 10 представляет собой диаграммы, показывающие ингибирующее действие на рост MESO1 при использовании комбинации YS110 с цисплатином (Cis) или пеметрекседом (РМТ). Фигура 10А показывает результаты с цисплатином, и фигура 10В показывает результаты с пеметрекседом. Ордината показывает жизнеспособные клетки (мутность: OD), и абсцисса показывает количество каждого введенного лекарственного средства. Анти-CD26 представляет собой анти-CD26 антитело YS110. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Фигура 11 представляет собой диаграммы ингибирующего действия на рост H2452 при использовании комбинации YS110 с цисплатином (Cis) или пеметрекседом (РМТ). Фигура 11A показывает результаты с цисплатином, и фигура 11B показывает результаты с пеметрекседом. Ордината показывает жизнеспособные клетки (мутность: OD), и абсцисса показывает количество каждого введенного лекарственного средства. Анти-CD26 представляет собой анти-CD26 антитело YS110. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Фигура 12 представляет собой диаграммы ингибирующего действия на рост при использовании комбинации цисплатин (Cis) - пеметрексед (РМТ) с одновременным использованием YS110. Фигура 12А показывает результаты для клеток MESO1, и фигура 12В показывает результаты для клеток H2452. Ордината показывает жизнеспособные клетки (мутность: OD), и абсцисса показывает введенное лекарственное средство. Анти-CD26 представляет собой анти-CD26 антитело YS110. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Фигура 13 представляет собой диаграмму и фотографию, показывающие действие YS110 на ингибирование in vivo роста клеток JMN цисплатином (Cis) или пеметрекседом (РМТ). На диаграмме ордината показывает массу опухоли (мг), и абсцисса показывает введенное лекарственное средство. Фотография показывает иссеченные образцы опухоли. *p < 0,05, **p < 0,01.

Фигура 14 представляет собой диаграмму и фотографию, показывающие действие YS110 на ингибирование in vivo роста клеток JMN при одновременным использовании цисплатина (Cis) и пеметрекседа (РМТ). На диаграмме ордината показывает массу опухоли (мг), и абсцисса показывает введенное лекарственное средство. Фотография показывает иссеченные образцы опухоли. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Фигура 15 представляет собой диаграмму и фотографию, показывающие действие YS110 на ингибирование in vivo роста клеток MESO1 при одновременном использовании цисплатина и пеметрекседа. На диаграмме ордината показывает массу опухоли (мг), и абсцисса показывает введенное лекарственное средство. Фотография показывает иссеченные образцы опухоли. *p < 0,05, **p < 0,01.

Фигура 16 представляет собой диаграмму и фотографию, показывающие действие YS110 на ингибирование in vivo роста клеток Н2452 при одновременном использовании цисплатина (Cis) и пеметрекседа (РМТ). На диаграмме ордината показывает массу опухоли (мг), и абсцисса показывает введенное лекарственное средство. Фотография показывает иссеченные образцы опухоли. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Фигура 17 представляет собой диаграммы, показывающие активность цисплатина (Cis) или пеметрекседа (РМТ) в отношении инвазии клеток. Ордината показывает число инвазивных клеток, и абсцисса показывает концентрацию (мкМ) каждого лекарственного средства. Левые диаграммы показывают результаты для использования клеток MESO1, и правые диаграммы показывают результаты для использования клеток Н2452. Верхние диаграммы показывают результаты для цисплатина, и нижние диаграммы показывают результаты для пеметрекседа. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Фигура 18 представляет собой диаграммы, показывающие ингибирующее действие на инвазию клеток при одновременном использовании цисплатина (Cis) и пеметрекседа (РМТ). Ордината показывает число инвазивных клеток, и абсцисса показывает концентрацию (мкМ) каждого лекарственного средства. Верхние диаграммы показывают результаты для использования клеток MESO1, и нижние диаграммы показывают результаты для использования клеток Н2452. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Фигура 19А представляет собой диаграмму, показывающую ингибирующее действие на инвазию клеток MESO1 при использовании комбинации YS110 и цисплатина (Cis). Ордината показывает число инвазивных клеток, и абсцисса показывает концентрацию (мкМ) каждого лекарственного средства. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Фигура 19В представляет собой таблицу анализа взаимодействия цисплатина с YS110 для ингибирующего действия на инвазию клеток MESO1.

Фигура 20А представляет собой диаграмму, показывающую ингибирующее действие на инвазию клеток Н2452 при использовании комбинации YS110 и цисплатина (Cis). Ордината показывает число инвазивных клеток, и абсцисса показывает концентрацию (мкМ) каждого лекарственного средства. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Фигура 20В представляет собой таблицу анализа взаимодействия цисплатина с YS110 для ингибирующего действия на инвазию клеток Н2452.

Фигура 21 представляет собой графики кривых дозовой зависимости для гемцитабина против клеточной линии мезотелиомы. Ордината показывает жизнеспособные клетки (мутность: OD), и абсцисса показывает концентрацию гемцитабина.

Фигура 22А представляет собой диаграмму действия при использовании комбинации YS110 и гемцитабина (Gem) на рост клеток саркоматоидной мезотелиомы MESO1. Ордината показывает число клеток (×10³ клеток), и абсцисса показывает количество каждого введенного лекарственного средства. *p < 0,05, **p < 0,01. Фигура 22В представляет собой таблицу анализа взаимодействия гемцитабина с YS110 для ингибирующего действия на рост клеток MESO1.

Фигура 23А представляет собой диаграмму действия при использовании комбинации YS110 и гемцитабина (Gem) на рост клеток саркоматоидной мезотелиомы JMN. Ордината показывает число клеток (×10³ клеток), и абсцисса показывает количество каждого введенного лекарственного средства. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Фигура 23В представляет собой таблицу анализа взаимодействия гемцитабина с YS110 для ингибирующего действия на рост клеток JMN.

Фигура 24А представляет собой диаграмму действия при использовании комбинации YS110 и гемцитабина (Gem) на рост клеток эпителиоидной мезотелиомы Н2452. Ордината показывает число клеток (×10³ клеток), и абсцисса показывает количество каждого введенного лекарственного средства. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Фигура 24В представляет собой таблицу анализа взаимодействия гемцитабина с YS110 для ингибирующего действия на рост клеток Н2452.

Фигура 25А представляет собой диаграмму действия при использовании комбинации анти-CD26 антитела и гемцитабина (Gem) на рост клеток эпителиоидной мезотелиомы Н226. Ордината показывает число клеток (10³ клеток), и абсцисса показывает количество каждого введенного лекарственного средства. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Фигура 25В представляет собой таблицу анализа взаимодействия гемцитабина с YS110 для ингибирующего действия на рост клеток Н226.

Фигура 26 представляет собой графики действия при использовании комбинации гемцитабина (Gem) с цисплатином (Cis)-пееметрекседом (РМТ). Ордината показывает жизнеспособные клетки (мутность: OD), и абсцисса показывает введенное лекарственное средство. Черные квадраты показывают контрольную группу. Черные кружочки показывают группу, которой вводили 3×10^-8 М гемцитабина. Черные треугольники показывают группу, которой вводили 1×10^-9 М гемцитабина.

Фигура 27 представляет собой диаграмму и фотографию, показывающие действие при использовании комбинации YS110 и гемцитабина (Gem) на ингибирование in vivo роста клеток эпителиоидной мезотелиомы Н226, и таблицу взаимодействия гемцитабина с YS110. На диаграмме ордината показывает массу опухоли (мг), и абсцисса показывает введенное лекарственное средство. Фотография показывает иссеченные образцы опухоли.

Фигура 28 представляет собой диаграмму и фотографию, показывающие действие при использовании комбинации YS110 и гемцитабина (Gem) на ингибирование in vivo роста клеток саркоматоидной мезотелиомы JMN, и таблицу взаимодействия гемцитабина с YS110. На диаграмме ордината показывает массу опухоли (мг), и абсцисса показывает введенное лекарственное средство. Фотография показывает иссеченные образцы опухоли.

Фигура 29 представляет собой диаграмму, показывающую действие при использовании комбинации YS110 и цисплатина-пеметрекседа на рост in vivo CD26-положительной клеточной линии рака легких клеток НСС827. На диаграмме ордината показывает массу опухоли (мг), и абсцисса показывает введенное лекарственное средство. Фотография показывает иссеченные образцы опухоли.

Фигура 30 представляет собой диаграмму, показывающую действие при использовании комбинации YS110 и гефитиниба на рост in vivo CD26-положительной клеточной линии рака легких клеток НСС4006. На диаграмме ордината показывает массу опухоли (мг), и абсцисса показывает введенное лекарственное средство.

Фигура 31 представляет собой диаграмму, показывающую действие при использовании комбинации YS110 и гефитиниба на рост in vivo CD26-положительной клеточной линии рака легких клеток НСС827. На диаграмме ордината показывает массу опухоли (мг), и абсцисса показывает введенное лекарственное средство.

Фигура 32 представляет собой диаграммы сравнения ингибирующего рост действия цисплатина и перметекседа для клеток MESO1 и клеток JMN. Ордината показывает степень ингибирования роста (%), и абсцисса показывает концентрацию (М) каждого лекарственного средства. Фигура 32А показывает результаты сравнения ингибирующего рост действия цисплатина. Фигура 32В показывает результаты сравнения ингибирующего рост действия перметекседа.

Фигура 33 представляет собой диаграммы сравнения ингибирующего рост действия гемцитабина для клеток MESO1 и клеток JMN и сравнения клеток Н2452 и клеток Н226. Фигура 33А показывает результаты сравнения ингибирующего действия гемцитабина на рост MESO1 и JMN. Фигура 33В показывает результаты сравнения ингибирующего действия гемцитабина на рост Н2452 и Н226.

Описание воплощений

1. Антитело

Термин «антитело» в настоящем описании относится к молекуле иммуноглобулина, способной специфически связываться с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид или антитело, через по меньшей мере один сайт узнавания антигена в вариабельных участках молекулы иммуноглобулина. Антитело, используемое в настоящем описании, включает полное поликлональное антитело или моноклональное антитело, а также их фрагменты (Fab, Fab', F(ab')2, Fv и т.д.), одноцепочечной вариабельный фрагмент (scFv), их варианты, слитый белок, содержащий часть антитела, и другие модифицированные структуры молекулы иммуноглобулина, содержащие сайт узнавания антигена. Антитело может представлять собой любой класс антител, такой как IgG, IgA или IgM (или его подкласс), и не обязательно относится к определенному классу. Иммуноглобулины разделяют на различные классы согласно аминокислотным последовательностям константных доменов тяжелой цепи антитела. Типично пять классов иммуноглобулинов представляют собой IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, некоторые из которых дополнительно подразделяют на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Соответствующие константные домены тяжелых цепей иммуноглобулинов различных классов называют α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Соответствующие структуры субъединиц и трехмерные структуры для иммуноглобулинов различных классов хорошо известны.

«Моноклональное антитело», описанное в настоящем описании, относится к антителу, полученному из популяции клеток, продуцирующих по существу гомогенные антитела. Конкретно отдельные антитела, содержащиеся в популяции клеток, являются идентичными за исключением природных мутантов, которые могут присутствовать с небольшой вероятностью. Моноклональное антитело направлено на одну область детерминанты и является весьма специфическим. В отличие от типичного поликлонального антитела против различных антигенов, направленных на различные антигенные детерминанты (эпитопы), каждое моноклональное антитело направлено на одну антигенную детерминанту антигена. Определение «моноклональное» относится к свойствам антитела, полученного из популяции клеток, продуцирующих по существу гомогенные антитела, и не должно интерпретироваться как требующее определенного способа получения антитела. Моноклональное антитело, используемое согласно настоящему изобретению, можно получить методом рекомбинантных ДНК, описанным, например, в патенте США № 4816567. Моноклональное антитело также можно выделить из фаговой библиотеки, полученной с использованием метода, описанного в, например, McCafferty et al., 1990, Nature, 348: 552-554.

«Гуманизированное антитело», используемое в настоящем описании, относится к форме нечеловеческого (например, мышиного) антитела, которое представляет собой химерный иммуноглобулин, или его фрагменту, содержащему цепь иммуноглобулина или минимальную последовательность, происходящую из нечеловеческого иммуноглобулина (Fv, Fab, Fab', F(ab')2, или другие неполные антигенсвязывающие последовательности антитела, и т.д.). Некоторые гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки из определяющего комплементарность участка (CDR) реципиента заменены остатками из CDR вида, не относящегося к человеку (донорное антитело), такого как мышь, крыса или кролик, имеющего желательную специфичность, аффинность и способность. В некоторых случаях остатки каркасного участка Fv (FR) человеческого иммуноглобулина заменяют соответствующими остатками, происходящими не от человека. Некоторые гуманизированные антитела содержат по меньшей мере один, обычно два вариабельных участка от вида, не относящегося к человеку (донорное антитело), такого как мышь, крыса или кролик, имеющего желательную специфичность, аффинность и/или способность, и один или несколько остатков каркасного участка Fv, и/или один или несколько остатков каркасного участка Fv CDR заменены соответствующими человеческими остатками (т.е., остатками, происходящими из последовательности человеческого антитела). В целом по меньшей мере несколько остатков каркасного участка Fv могут быть заменены в одном или нескольких вариабельных участках гуманизированного антитела. Гуманизированное антитело также может содержать остаток, который не находится ни в антителе-реципиенте, ни в привитом CDR или каркасной последовательности, и может содержать остаток для дополнительного улучшения и оптимизации характеристик антитела.

Некоторые гуманизированные антитела содержат по существу все или по меньшей мере один, как правило, два вариабельных участка. В этих вариабельных участках все или по существу все CDR соответствуют CDR нечеловеческого иммуноглобулина, и все или по существу все FR являются FR консенсусных последовательностей человеческого иммуноглобулина. Некоторые гуманизированные антитела содержат по существу все или по меньшей мере один, как правило, два вариабельных участка. В этих вариабельных участках подавляющее большинство аминокислотных остатков CDR происходят из CDR нечеловеческого иммуноглобулина, и один или больше аминокислотных остатков FR происходят из FR консенсусных последовательностей человеческого иммуноглобулина. Наиболее предпочтительно гуманизированное антитело может содержать по меньшей мере часть константного участка (Fc) человеческого иммуноглобулина или домен (как правило, человеческого иммуноглобулина). Некоторые гуманизированные антитела имеют модифицированный участок Fc, как описано в международной публикации № WO99/58572. Некоторые формы гуманизированного антитела имеют один или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6) измененных CDR первоначального антитела. Такие CDR также называют одним или несколькими CDR, «происходящими» от одного или нескольких CDR первоначального антитела.

Термин «вариабельный участок» антитела относится к вариабельным участкам легкой цепи или тяжелой цепи антитела, каждому отдельно или комбинации. Вариабельные участки тяжелой цепи и легкой цепи состоят, каждый, из четырех каркасных участков (FR), соединенных тремя определяющими комплементарность участками (CDR), также известными как гипервариабельные участки. CDR в каждой цепи сохраняются в непосредственной близости FR и вносят вклад в образование антигенсвязывающего сайта антитела вместе с CDR другой цепи. Используют по меньшей мере два метода определения CDR: (1) подход, основанный на разнообразии последовательностей различных видов (например, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); и (2) подход, основанный на кристаллографическом поиске комплексов антиген-антитело (Al-Lazikani et al., (1997), J. Molec. Biol., 273: 927-948)). Иногда для определения CDR используют комбинацию этих двух подходов.

Термин «константный участок» антитела относится к константным участкам легкой цепи или тяжелой цепи каждому по отдельности или в комбинации.

Термин эпитоп, «специфически связывающийся с» антителом, полностью определен в технике, и в технике также хорошо известны способы определения специфического связывания. Когда молекула реагирует или действует совместно с определенной клеткой или веществом более часто, быстрее, в течение более длительного периода и/или с большей аффинностью по сравнению с ее взаимодействием или совместным действием с другими клетками или веществами, такую молекулу рассматривают как проявляющую «специфическое связывание». Когда антитело связывается с мишенью с большей аффинностью или активностью связывания, более быстро и/или в течение более длительного периода по сравнению с его связыванием с другими веществами, тогда антитело «специфически связывается с мишенью». Например, антитело, специфически связывающееся с одним эпитопом CD26, является антителом, связывающимся с этим эпитопом CD26 с большей аффинностью или активностью связывания, более быстро и/или в течение более длительного периода по сравнению с его связыванием с другими эпитопами CD26. Из этого определения следует представлять, что, например, антитело (или часть или эпитоп), специфически связывающееся с первой мишенью, может или не может специфически связываться со второй мишенью. Таким образом, «специфическое связывание» необязательно требует (хотя может включать) исключительного связывания.

Термин «клетка-хозяин» включает каждую отдельную клетку или клеточную культуру, которая может служить в качестве реципиента вектора для внедрения полинуклеотидной вставки или уже является реципиентом. Клетка-хозяин включает потомство отдельной клетки-хозяина. Необязательно требуется, чтобы потомство было идентично первоначальной родительской клетке (морфологически или в комплементах геномной ДНК) из-за природной, случайной или запланированной мутации. Клетка-хозяин включает клетку, трансфицированную in vivo полинуклеотидом по настоящему изобретению.

«Изолированное» антитело, антитело, полинуклеотид, вектор, клетка или композиция представляет собой антитело, антитело, полинуклеотид, вектор, клетку или композицию в форме, которая не обнаружена в природе. Изолированное антитело, антитело, полинуклеотид, вектор, клетка или композиция включает вариант, очищенный до формы, которая не обнаружена в природе. В некотором воплощении изолированное антитело, антитело, полинуклеотид, вектор, клетка или композиция являются по существу чистыми.

«Лечение» при использовании в настоящем описании представляет собой подход для получения благоприятных или желательных клинических результатов. Благоприятные или желательные клинические результаты для цели настоящего изобретения включают, но без ограничения, смягчение одного или нескольких симптомов, уменьшение степени заболевания, стабилизированное (т.е., без обострения) состояние заболевания, приостановку или замедление развития заболевания, восстановление или ремиссию болезненного состояния и ослабление (частичное или полное) независимо от того, поддается обнаружению или не поддается. «Лечение» также означает повышение ожидаемой продолжительности жизни пациента относительно возможной ожидаемой продолжительности жизни пациента без лечения.

«Эффективное количество» является количеством, достаточным для достижения благоприятных или желательных клинических результатов, включая клинические результаты. Эффективное количество можно вводить в одной или нескольких дозировках. Эффективным количеством конъюгата анти-CD26 антитела, анти-CD26 антитела и дополнительного терапевтического средства или подобного, описанного в настоящем описании, для цели настоящего изобретения является количество, достаточное для приостановки развития состояния, ассоциированного с ростом опухоли. Как понимается в технике, например, эффективное количество конъюгата анти-CD26 антитела или анти-CD26 антитела и дополнительного противоракового средства может изменяться согласно или в зависимости от, в частности, других факторов, таких как история болезни пациента и тип (и/или количество) конъюгата анти-CD26 антитела или используемого дополнительного противоракового средства.

«Фармацевтически приемлемый носитель» или «фармацевтически приемлемый эксципиент», используемый в настоящем описании, включает любой материал, который способен сохранять биологическую активность активного ингредиента при объединении с активным ингредиентом, не вступает в реакцию с иммунной системой испытываемого субъекта при доставке и является нетоксичным для испытываемого субъекта. Их примеры включают, но без ограничения, любой стандартный фармацевтический носитель, включая забуференный фосфатом физиологический раствор, воду, эмульсии, такие как эмульсии масло/вода, и различные типы смачивающих средств. Предпочтительным разбавителем для введения распылением или парентерального введения является забуференный фосфатом физиологический раствор или физиологический раствор (0,9%). Композицию, содержащую такой носитель, получают хорошо известным обычным способом (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; и Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Mack Publishing, 2000).

Анти-CD26 антитело

В одном воплощении анти-CD26 антитело, используемое в настоящем описании, специфически связывается с человеческим CD26. В одном воплощении анти-CD26 антитело, описанное в настоящем описании, связывается с тем же эпитопом, что и мышиное моноклональное антитело 14D10. В одном воплощении анти-CD26 антитело, описанное в настоящем описании, имеет способность блокировать связывание мышиного моноклонального антитела 14D10 с человеческим CD26 (конкурирует с мышиным моноклональным антителом 14D10) в конкурентном анализе. В одном воплощении анти-CD26 антитело, описанное в настоящем описании, имеет способность блокировать связывание мышиного моноклонального антитела 1F7 с человеческим CD26 (конкурирует с мышиным моноклональным антителом 1F7) в конкурентном анализе. Конкурентный анализ можно выполнить путем приведения в контакт испытываемого антитела с иммобилизованным эпитопом или антигеном, вымывая затем несвязанные антитела, с последующим приведением в контакт меченного антитела 14D10 или антитела 1F7 с эпитопом или антигеном, и вымывая несвязанные антитела, с последующей детекцией связанного антитела 14D10 или антитела 1F7. Когда связывание антитела 14D10 или антитела 1F7 с эпитопом или антигеном, приведенным в контакт с испытываемым антителом, уменьшается по сравнению со связыванием антитела 14D10 или антитела 1F7 с контрольным эпитопом или антигеном в отсутствие контакта с испытываемым антителом, можно утверждать, что испытываемое антитело имеет способность блокировать связывание антитела 14D10 или антитела 1F7 (конкурировать с антителом 14D10 или антителом 1F7) в конкурентном анализе.

Примеры аффинности связывания анти-CD26 антитела, используемого в настоящем изобретении, в отношении человеческого CD26 включают аффинность с константой диссоциации (т.е., Kd) меньше 10^-5 M, меньше 5 × 10^-5 M, меньше 10^-6 M, меньше 5 × 1^0-7 M, меньше 10^-7 M, меньше 5 × 10^-8 M, меньше 10^-8 M, меньше 5 × 10^-9 M, меньше 10^-9 M, меньше 5 × 10^-10 M, меньше 10^-10 M, меньше 5 × 10^-11 M или меньше 10^-11 M. Константа диссоциации также может составлять 10^-15 M или больше, 5 × 10^-15 M или больше, 10^-14 M или больше, 5 × 10^-14 M или больше, 10^-13 M или больше, 5 × 10^-13 M или больше, 10^-12 M или больше, 5 × 10^-12 M или больше, 10^-11 M или больше, 5 × 10^-11 M или больше, 10^-10 M или больше или 5 × 10^-10 M или больше. Способы определения аффинности известны в технике. Аффинность связывания можно определить с ипользованием, например, биосенсора BIAcore, биосенсора KinExA, анализа близкой сцинтилляции, ELISA, иммуноанализа ORIGEN (IGEN International, Inc.), тушения флуоресценции, переноса энергии флуоресценции и/или дрожжевого дисплея. Аффинность можно скринировать с использованием соответствующего биоанализа.

Одним из способов определения аффинности связывания антитела против CD26 является измерение аффинности монофункционального фрагмента Fab антитела. Для того, чтобы получить монофункциональный фрагмент Fab, антитело, например, IgG, можно расщепить папаином или экспрессировать рекомбинантным методом. Аффиность анти-CD26 фрагмента Fab моноклонального антитела можно определить с использованием системы поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (BIAcore 3000(TM), BIAcore Inc., Piscataway, NJ). Чип SA (стрептавидин) используют согласно инструкции поставщика. Биотинилированный CD26 можно разбавить HBS-EP (100 мM HEPES, pH 7,4, 150 мM NaCl, 3 мM EDTA, 0,005% P20) и впрыснуть в концентрации 0,005 мг/мл на чип. Достигают два интервала антигенной плотности, используя переменное время течения через отдельные каналы чипа: 10-20 ответных единиц (RU) для детальных кинетических тестов и 500-600 RU для концентраций. Смесь буферного раствора Пирса для элюирования и 4 M раствора NaCl (2:1) эффективно извлекает связанный Fab, сохраняя в то же время активность CD26 на чипе на протяжении 200 или больше впрысков. Буферный раствор HBS-EP можно использовать как проточный буферный раствор во всех анализах BIAcore. Серийные разведения (0,1 - 10 × оцененная KD) очищенного образца Fab впрыскивают при 100 мкл/мин в течение 2 минут и как правило, время диссоциации до 30 минут является приемлемым. Концентрацию белка Fab можно определить ELISA и/или электрофорезом SDS-PAGE с использованием стандартного Fab, имеющего известную концентрацию (определенную анализом на аминокислоты). Скорость ассоциации (kon) и скорость диссоциации (koff) скорости реакции получают в одно и то же время, используя программу BIAevaluation и подбирая данные к модели 1:1 связывания Лэнгмюра (Lofas & Johnsson, 1990). Величину константны равновесия диссоциации (KD) вычисляют как koff/kon.

В одном воплощении настоящее изобретение относится к конъюгату анти-CD26 антитело-триптолид или фармацевтической композиции, содержащей анти-CD26 антитело и дополнительное противораковое средство, которое ингибирует рост клеток, экспрессирующих CD26. Настоящее изобретение также охватывает воплощение, в котором конъюгат или композиция применимы при лечении состояния (заболевания или расстройства и т.д.), ассоциированного с экспрессией CD26, например, злокачественной мезотелиомы. В одном воплощении конъюгат или композиция по настоящему изобретению могут иметь одну или несколько особенностей из числа (а) связывания с CD26, (b) регулирования активности CD26, (с) остановки клеточного цикла CD26+ клеток в контрольной точке G1/S, (d) ингибирования роста клеток, экспрессирующих CD26 (например, клеток злокачественной мезотелиомы), (е) ингибирования связывания CD26 с внеклеточным матриксом и/или (f) применения при лечении состояния, ассоциированного с экспрессией CD26. В одном воплощении состояние, ассоциированное с CD26, представляет собой заболевание или расстройство, ассоциированное со сверхэкспрессией CD26. В одном воплощении состояние, ассоциированное с экспрессией CD26, опосредуется по меньшей мере частично CD26. В одном воплощении состояние, ассоциированное с экспрессией CD26, является состоянием, ассоциированным с ростом клеток, экспрессирующих CD26. В одном воплощении заболевание или расстройство представляет собой рак (например, злокачественную мезотелиому, рак легких, рак почек, рак печени или другие злокачественные опухоли с участием экспрессии CD26).

В одном воплощении антитело, содержащееся в конъюгате или композиции по настоящему изобретению, включает как вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 80% идентичность с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 8-14, так и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 80% идентичность с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 1-7. В одном воплощении антитело, содержащееся в конъюгате или композиции по настоящему изобретению, включает вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 80% идентичность с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 8-14, и вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 80% идентичность с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 1-7.

В одном воплощении антитело, содержащееся в конъюгате или композиции по настоящему изобретению, включает по меньшей мере 5 последовательных аминокислот, по меньшей мере 8 последовательных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 10 последовательных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 15 последовательных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 20 последовательных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 30 последовательных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 50 последовательных аминокислот аминокислотной последовательности любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-14.

Настоящее изобретение также относится к конъюгату анти-CD26 антитело – триптолид или фармацевтической композиции, содержащей анти-CD26 антитело и дополнительное противораковое средство, которые включают фрагмент последовательности антитела, описанного в настоящем описании (например, любой из SEQ ID NO: 1-7, SEQ ID NO: 8-14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16). В одном воплощении антитело включает фрагмент последовательности антитела, описанного в настоящем описании, имеющий длину по меньшей мере в приблизительно 50 аминокислот, по меньшей мере в приблизительно 75 аминокислот или по меньшей мере в приблизительно 100 аминокислот.

SEQ ID NO: 15

EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9ASGX10X11LX12TYGVHWVRQAPGKGLEWX13GVIWGX14GRTDYDX15X16FMSRVTISX17DX18SKX19TX20YLQX21NSLRAEDTAVYYCX22RX23RHDWFDYWGQGTTVTVSS

В последовательности, описанной выше, X1 представляет собой E или Q, X2 представляет собой A или G, X3 представляет собой G или E, X4 представляет собой L или V, X5 представляет собой V, K или E, X6 представляет собой G или E, X7 представляет собой T или S, X8 представляет собой T или S, X9 представляет собой T или K, X10 представляет собой F или Y, X11 представляет собой S или T, X12 представляет собой T, N или S, X13 представляет собой V или M, X14 представляет собой G или D, X15 представляет собой A или S, X16 представляет собой A или S, X17 представляет собой K или R, X18 представляет собой N или T, X19 представляет собой S или N, X20 представляет собой V или A, X21 представляет собой M или L, X22 представляет собой V, M или T, и X23 представляет собой N или S.

SEQ ID NO: 16

XIIX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9CX10ASQX11IRNX12LNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLXI3X14GVPX15RFSGSGSGTDFTLTISRLX16X17EDX18AX19YYCQQSX20KLPX21TFGSGTKVEIK

В последовательности, описанной выше, X1 представляет собой D или E, X2 представляет собой L или E, X3 представляет собой M или L, X4 представляет собой A или V, X5 представляет собой S или T, X6 представляет собой L, P, или A, X7 представляет собой D или E, X8 представляет собой V или A, X9 представляет собой T или S, X10 представляет собой S или R, X11 представляет собой G или D, X12 представляет собой S или N, X13 представляет собой H или Q, X14 представляет собой S или T, X15 представляет собой S, D или A, X16 представляет собой E или Q, X17 представляет собой P или A, X18 представляет собой F или V, X19 представляет собой T, A, или I, X20 представляет собой I или N, и X21 представляет собой F или L.

Таблица 1 показывает аминокислотные последовательности гуманизированных вариантов VL X376 (SEQ ID NO: 1), X377 (SEQ ID NO: 2), X378 (SEQ ID NO: 3), X379 (SEQ ID NO: 4), X380 (SEQ ID NO: 5), X381 (SEQ ID NO: 6) и X394 (SEQ ID NO: 7). Схемы с нумерацией по Кабат и последовательной нумерацией соответствуют вариабельным участкам легкой цепи.

Таблица 2 показывает аминокислотные последовательности гуманизированных вариантов VH X384 (SEQ ID NO: 8), X385 (SEQ ID NO: 9), X386 (SEQ ID NO: 10), X387 (SEQ ID NO: 11), X388 (SEQ ID NO: 12), X399 (SEQ ID NO: 13) и X420 (SEQ ID NO: 14). Таблица показывает схемы как с последовательной нумерацией, так и нумерацией по Кабат. Схема нумерации по Кабат включает 82a, 82b и 82c.

Антитело может дополнительно включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17 или ее фрагмент или вариант. В одном воплощении антитело включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17. В одном воплощении антитело включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17 за исключением сигнальной последовательности (специалисты в данной области техники легко поймут, что в одном воплощении сигнальная последовательность антитела отщеплена от антитела). В одном воплощении антитело включает вариабельный участок в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17. В одном воплощении антитело включает антитело (или его фрагмент), имеющее по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, или по меньшей мере приблизительно 98% идентичность с аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17. В одном воплощении антитело включает фрагмент аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17, имеющий в длину по меньшей мере приблизительно 10 аминокислот, по меньшей мере приблизительно 25 аминокислот, по меньшей мере приблизительно 50 аминокислот, по меньшей мере приблизительно 75 аминокислот или по меньшей мере приблизительно 100 аминокислот. В одном воплощении антитело связывается с человеческим CD26.

Тяжелая цепь (SEQ ID NO: 17)

MEWSWVFLFFLSVTTGVHSEVQLVESGAGVKQPGGTLRLTCTASGFSLTTYGVHWVRQAPGKGLEWVGVIWGDGRTDYDAAFMSRVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMRNRHDWFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Антитело также включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18 или ее фрагмент или вариант. В одном воплощении антитело включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18. В одном воплощении антитело включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18 за исключением сигнальной последовательности (специалисты в данной области техники легко поймут, что в одном воплощении сигнальная последовательность антитела отщеплена от антитела). В одном воплощении антитело включает вариабельный участок в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18. В одном воплощении антитело включает антитело (или его фрагмент), имеющее по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, или по меньшей мере приблизительно 98% идентичность с аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18. В одном воплощении антитело включает фрагмент аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18, имеющий в длину по меньшей мере приблизительно 10 аминокислот, по меньшей мере приблизительно 25 аминокислот, по меньшей мере приблизительно 50 аминокислот, по меньшей мере приблизительно 75 аминокислот или по меньшей мере приблизительно 100 аминокислот. В одном воплощении антитело также включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18 или ее фрагмент или вариант. В одном воплощении антитело связывается с человеческим CD26. В одном воплощении антитело представляет собой, например, антитело, включающее по меньшей мере одну тяжелую цепь (например, каждое две тяжелые цепи), включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17 за исключением сигнальной последовательности, и по меньшей мере одну легкую цепь (например, каждое две легкие цепи), включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18 за исключением сигнальной последовательности.

Легкая цепь (SEQ ID NO: 18)

MSVPTQVLGLLLLWLTDARCDILLTQSPSSLSATPGERATITCRASQGIRNNLNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDVAAYYCQQSIKLPFTFGSGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Гуманизированное анти-CD26 антитело «YS110», описанное в настоящем описании, обозначает антитело, константный участок тяжелой цепи которого состоит из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 17, и константный участок тяжелой цепи состоит из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 18. Сообщается, что после связывания с CD26 на мембране клетки злокачественной опухоли YS110 поглощается клеткой и затем переносится в ядро (Yamada K. et al., Plos One, 2013. Apr 29; 8 (4): e62304). Конкретнее считается, что YS110 растворяется в цитоплазме путем кавеолин-зависимого эндоцитоза и переносится в ядро ранними эндоцитозными пузырьками. Соответственно, в одном аспекте противоопухолевое действие (например, терапевтическое действие на мезотелиому) конъюгата YS110-триптолид может быть основано на таком действии YS110. Конкретно, анти-CD26 антитело по настоящему изобретению может представлять собой антитело, которое, после связывания с CD26 на мембране клетки злокачественной опухоли и поглощения клеткой и переноса затем в ядро, можно определить путем приведения в контакт меченного антитела с клетками, определения затем позиции антитела под микроскопом или подобным образом на основании метки и определения позиционного соотношения между позицией и внутриклеточной организацией.

В другом аспекте антитело связывается с одним или несколькими пептидами, выбранными из группы, включающей YSLRWISDHEYLY (SEQ ID NO: 19; пептид 6), LEYNYVKQWRHSY (SEQ ID NO: 20; пептид 35), TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO: 21; пептид 55), LWWSPNGTFLAYA (SEQ ID NO: 22; пептид 84), RISLQWLRRIQNY (SEQ ID NO: 23; пептид 132), YVKQWRHSYTASY (SEQ ID NO: 24; пептид 37), EEEVFSAYSALWW (SEQ ID NO: 25; пептид 79), DYSISPDGQFILL (SEQ ID NO: 26; пептид 29), SISPDGQFILLEY (SEQ ID NO: 27; пептид 30) и IYVKIEPNLPSYR (SEQ ID NO: 28; пептид 63). В одном воплощении антитело специфически связывается с одним или несколькими пептидами, описанными выше. Эти пептиды являются участками человеческого CD26. В одном воплощении антитело специфически связывается с одним или несколькими пептидами, выбранными из группы, включающей YSLRWISDHEYLY (SEQ ID NO: 19; пептид 6), LEYNYVKQWRHSY (SEQ ID NO: 20; пептид 35), TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO: 21; пептид 55), LWWSPNGTFLAYA (SEQ ID NO: 22; пептид 84), RISLQWLRRIQNY (SEQ ID NO: 23; пептид 132), YVKQWRHSYTASY (SEQ ID NO: 24; пептид 37), EEEVFSAYSALWW (SEQ ID NO: 25; пептид 79), DYSISPDGQFILL (SEQ ID NO: 26; пептид 29), SISPDGQFILLEY (SEQ ID NO: 27; пептид 30) и IYVKIEPNLPSYR (SEQ ID NO: 28; пептид 63), по сравнению с одним или несколькими пептидами, соответствующими другим участкам человеческого CD26.

В одном воплощении антитело связывается с одним из следующих пептидов: YSLRWISDHEYLY (SEQ ID NO: 19; пептид 6); LEYNYVKQWRHSY (SEQ ID NO: 20; пептид 35); TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO: 21; пептид 55); LWWSPNGTFLAYA (SEQ ID NO: 22; пептид 84) и RISLQWLRRIQNY (SEQ ID NO: 23; пептид 132). В одном альтернативном воплощении антитело связывается с каждым из следующих пептидов: YSLRWISDHEYLY (SEQ ID NO: 19; пептид 6); TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO: 21; пептид 55); RISLQWLRRIQNY (SEQ ID NO: 23; пептид 132); YVKQWRHSYTASY (SEQ ID NO: 24; пептид 37) и EEEVFSAYSALWW (SEQ ID NO: 25; пептид 79). В одном воплощении антитело связывается с каждым из следующих пептидов: DYSISPDGQFILL (SEQ ID NO: 26; пептид 29); SISPDGQFILLEY (SEQ ID NO: 27; пептид 30) и TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO: 21; пептид 55). В одном альтернативном воплощении антитело связывается с каждым из следующих пептидов: DYSISPDGQFILL (SEQ ID NO: 26; пептид 29); SISPDGQFILLEY (SEQ ID NO: 27; пептид 30); TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO: 21; пептид 55) и IYVKIEPNLPSYR (SEQ ID NO: 28; пептид 63).

Связываются ли два антитела с одним и тем же эпитопом, узнавая идентичные или пространственно перекрывающиеся эпитопы, можно определить конкурентным анализом. Обычно антиген иммобилизуют на многолуночном планшете, и измеряют блокирующее действие немеченого антитела против связывания меченного антитела. Обычной меткой для такого конкурентного анализа является радиоактивная метка или ферментная метка. Эпитоп, с которым связывается антитело, можно определить методом картирования эпитопов, известным специалистам в данной области техники.

В одном воплощении антитело включает один или несколько константных участков. В одном воплощении антитело включает человеческий константный участок. В одном воплощении константный участок является константным участком тяжелой цепи. В другом воплощении константный участок является константным участком легкой цепи. В одном воплощении антитело включает константный участок, имеющий по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или 100% идентичность с человеческим константным участком. В одном воплощении антитело включает участок Fc. В одном воплощении антитело включает человеческий участок Fc. В одном воплощении антитело включает участок Fc, имеющий по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или 100% идентичность с человеческим участком Fc.

В одном воплощении антитело представляет собой антитело IgG. В одном воплощении антитело представляет собой антитело IgG1. В другом воплощении антитело представляет собой антитело IgG2. В одном воплощении антитело представляет собой антитело человеческий IgG.

Антитело может представлять собой антитело в мономерной, димерной или полимерной формах. Например, биспецифическое антитело или моноклональное антитело со специфичностью связывания в отношении по меньшей мере двух различных антигенов можно получить с использованием антитела, раскрытого в настоящем описании (см., например, Suresh et al., Methods in Enzymology, 1986, 121, 210). До сих пор рекомбинантное получение биспецифического антитела основано на коэкспрессии двух пар тяжелая-легкая цепь иммуноглобулина, включающих две тяжелые цепи, различающиеся по специфичности (Millstein Cuello, Nature, 1983, 305, 537-539).

Согласно одному подходу к получению биспецифического антитела вариабельные участки антитела (антигенсвязывающие сайты антитела), имеющие желательную специфичность связывания, сливают с константными участками иммуноглобулина. Предпочтительно сайты слияния включают константные участки тяжелой цепи иммуноглобулина в по меньшей мере группах шарнирного и СН2 и СН3 участков. По меньшей мере один сайт слияния предпочтительно имеет первый константный участок тяжелой цепи (СН1), содержащий сайт, существенный для связывания легкой цепи. ДНК, кодирующие слияния тяжелой цепи иммуноглобулина, и, если желательно, ДНК, кодирующую легкую цепь иммуноглобулина, встраивают в отдельные экспрессирующие векторы, которыми затем котрансфицируют соответствующий организм-хозяин. В одном воплощении, в котором для обеспечения оптимального выхода в конструкции используют неравные отношения трех цепей антител, возможно регулировать составляющие пропорции этих трех цепей антитела. Если экспрессия по меньшей мере двух цепей антитела в равных соотношениях приводит к высоким выходам, или если соотношения не являются особенно важными, в экспрессирующий вектор можно встроить кодирующие последовательности для двух или всех трех цепей антитела.

Один пример подхода включает биспецифическое антитело, составленное из гибридной тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющей первую специфичность связывания в одном из плечей, и гибриной пары тяжелая-легкая цепь (имеющей вторую специфичность связывания) в другом плече. Такая асимметричная структура (имеющая легкую цепь иммуноглобулина только в одной половине частицы антитела молекулы биспецифического антитела) облегчает отделение нужного биспецифического соединения от нежелательных комбинаций цепей иммуноглобулина. Такой подход описан в международной публикации № WO94/04690, опубликованной 3 марта 1994.

Гетероконъюгатное антитело, включающее два ковалентно соединенных антитела, также включено в объем определения антитело. Такое антитело используют для нацеливания клеток иммунной системы на ненужные клетки (патент США № 4676980) или для лечения ВИЧ-инфекции (международные публикации №№ WO91/00360 и WO92/200373 и европейский патент № 03089). Гетероконъюгатное антитело можно получить с использованием обычного метода сшивания. Соответствующие агенты сшивания и методы сшивания хорошо известны в технике и описаны в патенте США № 4676980.

В отдельном воплощении антитело представляет собой фрагмент антитела. В одном воплощении антитело выбирают из группы, включающей, например, Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv и F(ab')2. В одном воплощении антитело представляет собой Fab. Разработаны различные методы получения фрагментов антитела. Такие фрагменты можно получить расщеплением белка полного антитела (см., например, Morimoto et al., 1992, J. Biochem. Biophys. Methods, 24: 107-117; и Brennan et al., 1985, Science, 229: 81), или можно также получить непосредственно из клеток-хозяев. Например, фрагменты Fab'-SH можно извлечь непосредственно из E. coli и химически связать с образованием фрагмента F(ab')2 (Carter et al., 1992, Bio/Technology, 10: 163-167). В другом воплощении F(ab')2 образуется с использованием лейцинового зиппера GCN4, который промотирует сборку молекул F(ab')2. Согласно альтернативному подходу, фрагмент Fv, Fab или F(ab')2 выделяют непосредственно из рекомбинантной культуры клеток-хозяев.

В одном воплощении антитело представляет собой его одноцепочечной вариабельный фрагмент (scFv), вариант, слитый белок, частью которого является антитело, гуманизированное антитело, химерное антитело, диатело, линейное (linear) антитело, одноцепочечное антитело или любую другую молекулу иммуноглобулина, имеющую модифицированную конфигурацию.

Одноцепочечный вариабельный фрагмент получают, соединяя вариабельные участки легкой цепи и/или тяжелой цепи с использованием короткого пептида (Bird et al. (1988), Science, 242: 423-426). Линкерный пептид представляет собой, например, (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 29), который образует сшивку приблизительно 3,5 нм между карбоксиконцом одного из вариабельных участков и аминоконцом другого вариабельного участка. Также созданы и используются линкеры, имеющие другие последовательности (Bird et al., (1988)). Кроме того, линкер можно модифицировать для дополнительных функций, таких как иммобилизация лекарственного средства или иммобилизация на твердом носителе. Одноцепочечный вариант можно получить любым рекомбинантным методом или методом синтеза. При получении scFv методом синтеза можно использовать автоматический синтезатор. При получении scFv рекомбинантным методом соответствующую плазмиду, содержащую полинуклеотид, кодирующий scFv, можно перенести в соответствующую клетку-хозяина или эукариотическую (например, дрожжевые клетки, клетки растения, клетки насекомого или клетки млекопитающего) или прокариотическую (E. coli). Полинуклеотид, кодирующий scFv, представляющий интерес, можно получить стандартной методикой, такой как лигирование полинуклеотидов. Полученный scFv можно выделить с использованием стандартного метода очистки белков, известного в технике.

Другие формы одноцепочечных антител, такие как диатело, также относятся к антителу. Диатело представляет собой двухвалентное биспецифическое антитело, домены VH и VL которого экспрессированы на одной цепи антитела, но вынуждены образовывать пару с комплементарными доменами другой цепи с использованием линкера слишком короткого, чтобы образовывать пары этих доменов VH и VL на одной и той же цепи, причем посредством этого создается два сайта связывания антигенов (см., например, Holliger P. et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448; и Poljak R. J. et al. (1994), Structure, 2: 1121-1123).

Антитело включает модифицированную форму антитела, описанную в настоящем описании. Примеры такой модифицированной формы включают функционально эквивалентные антитела без заметного влияния на свойства антитела и варианты, имеющие усиленную или ослабленную активность. Модификация антитела является рутинной операцией в технике и не нуждается в подробном описании в настоящем описании. Примеры модифицированного антитела включают антитела, включающие консервативную замену аминокислотных остатков, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот без заметного ухудшения функциональной активности, или использование химических аналогов.

Вставка или добавление к аминокислотной последовательности включает слияние по амино- и/или карбоксильному концу, где размер добавляемого участка находится в интервале от 1 остатка до антитела, содержащего 100 или более остатков, и вставку в последовательность одного или нескольких аминокислотных остатков. Примеры вариантов концевой вставки включают антитело, имеющее N-концевой метионильный остаток, или антитело, слитое с эпитопной меткой. Другие варианты вставки молекулы антитела включают антитело, слитое по N- или С-концу с ферментом или антителом, увеличивающим время полужизни антитела в сыворотке.

Вариант замещения имеет другой остаток, встраиваемый вместо по меньшей мере одного аминокислотного остатка, удаленного из последовательности антитела. CDR относятся к сайтам, которым достается больше всего мутагенеза замены, хотя изменения FR также предполагаются. Консервативные замены показаны в таблице 3 под заголовком «Консервативная замена». Такая замена, которая изменяет биологическую активность, в таблице 3 называется «Примером замены», или как это описано более подробно ниже в связи с классами аминокислот, может быть введена более существенная замена и продукты могут скринированы.

Таблица 3: Аминокислотные замены

Значительное изменение биологических свойств антитела достигается путем отбора замены, которая существенно влияет на поддержание (а) структуры каркаса антитела в значимом районе, например, конформации листа или спирали, (b) заряда или гидрофобности молекулы в сайте-мишени или (с) объем боковой цепи. Встречающиеся в природе остатки классифицируются на следующие группы на основании общих свойств боковой цепи:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu и Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser и Thr;

(3) кислотные: Asp и Glu;

(4) основные: Asn, Gln, His, Lys и Arg;

(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly и Pro; и

(6) ароматические: Trp, Tyr и Phe.

Неконсервативную замену выполняют, обменивая члена одного из этих классов на члена другого класса. Более консервативная замена включает обмен члена определенного класса на другого члена того же класса.

Любой цистеиновый остаток, который не вовлечен в поддержание соответствующей конформации антитела, может быть заменен обычно на серин, посредством чего улучшается устойчивость молекулы к окислению и предотвращается анормальное сшивание. В частности, когда антитело представляет собой фрагмент антитела, цистеиновая связь может быть добавлена к антителу для того, чтобы улучшить устойчивость антитела.

Аминокислотная модификация выстраивается от замены или модификации в одной или нескольких аминокислотах до полного переконструирования участка, такого как вариабельная область. Изменение в вариабельной области может изменить аффинность связывания и/или специфичность. В одном воплощении 1-5 или меньше аминокислот заменяют консервативно в домене CDR. В другом воплощении 1-3 или меньше аминокислот заменяют консервативно в домене CDR3. В еще одном другом воплощении домен CDR представляет собой CDRH3 и/или CDRL3.

Модифицированное антитело также включает гликозилированные и негликозилированные антитела и антитела, имеющие другие посттрансляционные модификации, например, гликозилирование различными сахарами, ацетилирование и фосфорилирование. Антитела гликозилируют в консервативных позициях в их константных участках (Jefferis and Lund, 1997, Chem. Immunol., 65: 111-128; и Wright and Morrison, 1997, TibTECH, 15: 26-32). Олигосахаридные боковые цепи иммуноглобулинов влияют на функции белков (Boyd et al., 1996, Mol. Immunol., 32: 1311-1318; и Wittwe and Howard, 1990, Biochem., 29: 4175-4180) и внутримолекулярное совместное действие между частицами гликопротеина, что может влиять на конформацию и представленную трехмерную структуру поверхности гликопротеина (Hefferis and Lund, цит. выше; и Wyss and Wagner, 1996, Current Opin. Biotech., 7: 409-416). Данные гликопротеины могут быть нацелены на некоторые молекулы на основании специфического узнавания структур через олигосахариды. Также сообщается, что гликозилирование антител влияет на антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). В частности, сообщается, что при экспрессии в клетках CHO, экспрессирующих также β-(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазу III (GnTIII), где гликозилтрансфераза катализирует образование делящегося пополам GlcNAc, под контролем тетрациклина, антитела проявляют улучшенную активность ADCC (Umana et al., 1999, Nature Biotech., 17:176-180).

Гликозилирование антител обычно является или N-связанным или О-связанным. Гликозилирование N-связанное означает присоединение углеводной группы к боковой цепи аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин, аспарагин-Х-треонин и аспарагин-Х-цистеин (где Х представляет собой любую аминокислоту иную, чем пролин) являются узнаваемыми последовательностями для ферментативного присоединения углеводной группы к аспарагиновой боковой цепи. Таким образом, любая из этих трипептидных последовательностей, присутствующих в антителе, создает потенциальный сайт гликозилирования. О-связанное гликозилирование означает присоединение одного из углеводов N-ацетилгалактозамина, галактозы и ксилозы к гидроксиаминокислоте, чаще всего серину или треонину, хотя можно использовать 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.

Добавление сайта гликозилирования к антителу обычно достигается путем изменения аминокислотной последовательности таким образом, что антитело содержит одну или несколько трипептидных последовательностей, описанных выше (для сайта N-связанного гликозилирования). Изменение также можно выполнить путем добавления или замены одного или нескольких сериновых или треониновых остатков последовательности первоначального антитела (для сайта О-связанного гликозилирования).

Паттерн гликозилирования антитела можно также изменить без изменения фундаментальной нуклеотидной последовательности. Гликозилирование зависит в большой степени от клеток-хозяев, используемых для экспрессии антитела. Так как тип клеток, используемых для экспрессии рекомбинантного гликопротеина, например, антитела, редко является соответствуюшей ему природной клеткой из-за сложностей с обработкой, можно предсказать наличие различных паттернов гликозилирования (см., например, Hse et al., 1997, J. Biol. Chem., 272: 9062-9070).

Кроме отбора клеток-хозяев, факторы, которые влияют на гликозилирование во время рекомбинантного получения антитела, включают тип роста, композицию среды, плотность культуры, насыщение кислородом, рН, схемы очистки и т.д.. Предложены различные способы изменения паттерна гликозилирования, достигаемые в определенных организмах-хозяевах, и они включают введение или сверхэкспрессию определенных ферментов, вовлеченных в продуцирование олигосахаридов (патенты США №№ 5047335, 5510261 и 5278299). Гликозилирование или определенный тип гликозилирования можно устранить из гликопротеина с использованием фермента, например, эндогликозидазы Н (EndoH). Рекомбинантные клетки-хозяева можно генетически изменить, чтобы они стали дефектными в процессинге определенного типа полисахаридов. Такие и подобные методы известны в технике.

Другие способы модификации включают использование методов сочетания, известных в технике. Примеры таких методов включают, но без ограничения ими, ферментативные подходы, окислительное замещение и хелатообразование. Например, с помощью модификации к антителу можно добавить метку для иммуноанализа. Модифицированное антитело получают с использованием процедур, принятых в технике, и его можно скринировать с использованием стандартного анализа, известного в технике. Некоторые методы для этого описаны ниже и в примерах.

Другие модифицированные антитела включают антитела, модифицированные так, как описано в международной публикации № WO99/58572, опубликованной 18 ноября 1999. Такие антитела включают связывающий домен, направленный на молекулу-мишень, а также эффекторный домен, имеющий аминокислотную последовательность, по существу гомологичную всем или части константных доменов тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина. Такие антитела способны связываться с молекулой-мишенью, не вызывая заметного комплементзависимого лизиса или клеточноопосредованной деструкции мишени. В одном воплощении эффекторный домен может специфически связываться с FcRn и/или FcγRIIb. Они обычно имеют в основе химерные домены, происходящие от двух или больше доменов СН2 тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина. Антитела, модифицированные таким образом, особенно подходят для применения в длительной терапии антителами и не дают воспалительных и других вредных реакций на обычную терапию антителами.

Антитело включает аффиннозрелую форму. Афиннозрелое антитело можно получить, например, способом, известным в технике (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10: 779-783; Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci. USA, 91: 3809-3813; Schier et al., 1995, Gene, 169: 147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154 (7): 3310-9; Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896; и международная публикация № WO2004/058184). Кандидата в аффиннозрелое антитело можно скринировать или выбрать на основании улучшенной и/или измененной аффинности связывания любым методом, известным в технике, включая любой метод скрининга с использованием анализа методом поверхностного плазмонного резонанса BIAcore, фагового дисплея, дрожжевого дисплея и рибосомного дисплея.

Моноклональное антитело можно получить методом гибридом, описанным в Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256: 495. По методу гибридом мышей, хомяков или других соответствующих животных-хозяев обычно иммунизируют вакциной, чтобы посредством этого вызвать продуцирование лимфоцитов или способность продуцировать антитела, специфически связывающиеся с вакциной. С другой стороны, лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro.

Моноклональное антитело (и другие антитела) также можно получить методом рекомбинантных ДНК, описанным в патенте США № 4816567. ДНК, кодирующую моноклональное антитело, изолируют и секвенируют обычными методами, такими как использование олигонуклеотидного зонда, который может специфически связываться с геном, кодирующим тяжелую цепь или легкую цепь моноклонального антитела. Изолированную таким образом ДНК встраивают в экспрессирующий вектор, которым затем трансфицируют клетки-хозяева, такие как клетки E. coli, обезьяньи клетки COS, клетки яичника китайского хомячка (CHO) или миеломные клетки, которые не продуцируют белки иммуноглобулины без переноса экспрессирующего вектора, чтобы посредством этого добиться синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах.

В одном воплощении антитело экспрессируется в любом организме, включая, но без ограничения, бактерии, дрожжи, растения, насекомых и млекопитающих, или клетках, полученных из любого организма. Определенный тип клеток включает, но без ограничения, клетки Drosophila melanogaster, клетки Saccharomyces cerevisiae и других дрожжей, клетки E. coli, клетки Bacillus subtilis, клетки SF9, клетки HEK-293, клетки Neurospora, клетки BHK, клетки CHO, клетки COS, клетки Hela, фибробласты, клеточные линии шванномы, иммортализованные миелоидные клеточные линии млекопитающих и лимфоидные клеточные линии, клетки Jurkat, тучные клетки и другие эндокринные и экзокринные клетки и нейрональные клетки.

Специалистам в данной области техники известны различные системы экспрессии белков, векторы и клеточные среды, применимые при получении антител. См., например, международные публикации WO03/054172, WO04/009823 и WO03/064630, которые все полностью включены в настоящее описание в качестве ссылок. В одном воплощении при экспрессии антител используют экспрессирующую систему с глутаминсинтетазой (GS).

Предпочтительно антитело, экспрессированное таким образом, очищают или изолируют согласно способу, известному специалистам в данной области техники. Примеры способа очистки включают электрофоретический, молекулярнобиологический, иммунологический и хроматографический подходы. Примеры таких подходов включают ионнообменную, гидрофобную, аффинную хроматографию, ВЭЖХ с обращенной фазой и изоэлектрическое фокусирование. Необходимая степень очистки может изменяться в зависимости от предназначения антитела. В зависимости от воплощений очистка не является необходимой.

ДНК можно модифицировать, например, путем ковалентного соединения всей или части кодирующей последовательности неиммуноглобулинового антитела с кодирующей последовательностью иммуноглобулина. Таким путем получают «химерное» или «гибридное» антитело, раскрытое в настоящем описании. Обычно такое неиммуноглобулиновое антитело замещают константными доменами антитела по настоящему изобретению или замещают вариабельными доменами антигенсвязывающего сайта антитела по настоящему изобретению для того, чтобы создать химерное бивалентное антитело, включающее один антигенсвязывающий сайт со специфичностью для одного поверхностного эпитопа на CD26, и другой антигенсвязывающий сайт со специфичностью для другого антигена или эпитопа CD26.

Антитело также предполагает гуманизированное антитело. Терапевтические антитела часто вызывают вредные реакции частично из-за возникающей иммунной реакции на вводимые антитела. Это может привести к снижению эффективности лекарственного средства, снижению числа клеток, имеющих антиген-мишень, и нежелательной воспалительной реакции. Для того, чтобы обойти эти проблемы, можно получить рекомбинантное анти-CD26 гуманизированное антитело. Общие положения гуманизации антител включают сохранение основной последовательности антигенсвязывающей группы антитела, меняя в то же время по меньшей мере часть нечеловеческой остальной части антитела на последовательность человеческого антитела. Четыре общие обычные стадии для гуманизации моноклонального антитела включают, но без ограничения, (1) определение нуклеотидных последовательностей, кодирующих вариабельные домены легкой цепи и тяжелой цепи исходного антитела, и их предполагаемых аминокислотных последовательностей, (2) дизайн гуманизированного антитела, т.е. определение каркасных участков или остатков антитела и/или остатков CDR для использования в процессе гуманизации, (3) фактические методологию/метод гуманизации и (4) трансфекцию и экспрессию гуманизированного антитела. Константные участки антитела для применения в клинических испытаниях и лечении людей также могут быть сделаны более близкими к человеческим константным участкам методом рекомбинации для того, чтобы избежать иммунной реакции. См., например, патенты США №№ 5997867 и 5866692.

Группу Fcγ в рекомбинантном гуманизированном антителе можно модифицировать для того, чтобы посредством этого избежать взаимодействия с рецептором Fcγ и иммунной системой комплемента. Такой метод получения антител описан в международной публикации № WO99/58572.

Сообщается о многих молекулах «гуманизированного» антитела, включающих антигенсвязывающий сайт, происходящий от нечеловеческого иммуноглобулина. Их примеры включают V-участки грызунов и их ассоциированные определяющие комплементарность участки (CDR), слитые с человеческими константными доменами. См., например, Winter et al., Nature, 349: 293-299 (1991); Lobuglio et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86: 4220-4224 (1989); Shaw et al., J. Immunol., 138: 4534-4538 (1987); и Brown et al., Cancer Res., 47: 3577-3583 (1987). В других ссылках описываются CDR грызунов, привитые на человеческие несущие каркасные участки (FR) перед слиянием с соответствующими константными доменами человеческого антитела. См., например, Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988); и Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986). В еще одной ссылке описываются CDR грызунов, подерживаемые перестроенными рекомбинантным путем каркасными участками грызунов. См., например, публикацию европейского патента № 519596. Такие типы «гуманизированных» молекул создают для минимизации ненужной иммунологической реакции на молекулы античеловечского антитела грызуна, которая ограничивает период терапевтического применения и эффективность молекул у людей-реципиентов. Другие методы гуманизации антител, которые можно использовать, раскрыты в Daugherty et al., Nucl. Acids Res., 19: 2471-2476 (1991), патентах США №№ 6180377, 6054297, 5997867, 5866692, 6210671 и 6350861 и в международной публикации № WO01/27160.

Другие примеры методов гуманизации антител описаны в международной публикации № WO02/084277 и публикации патента США № 2004/0133357, включенных полностью в настоящее описание в качестве ссылок.

Кроме того, с другой стороны, можно получить полностью человеческое антитело с использованием коммерчески доступных мышей, cконструированных так, чтобы они экспрессировали специфические белки человеческого иммуноглобулина. Трансгенных животных, созданных для получения более желательной (например, полностью человеческого антитела) или более сильной иммунной реакции, также можно использовать при получении гуманизированных или человеческих антител. Примеры такого метода включают Xenomouse(TM) от Abgenix Inc. (Fremont, California) и HuMAb-Mouse(R) и TC Mouse(TM) от Medarex, Inc. (Princeton, N.J.).

С другой стороны, антитело можно получить рекомбинантно методом фагового дисплея. См., например, патенты США №№ 5565332, 5580717, 5733743 и 6265150; и Winter et al., Annu. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). С другой стороны, метод фагового дисплея (McCafferty et al., Nature, 348: 552-553 (1990)) можно использовать для получения человеческих антител и фрагментов человеческих антител in vitro из репертуаров генов вариабельного (V) домена иммуноглобулина от иммунизированных доноров. Согласно этому методу, гены V домена антитела клонируют в одной рамке с основными или минорными генами вирусных белков оболочки нитевидных бактериофагов, таких как M13 или fd, и они экспонируются в виде функциональных фрагментов антитела на поверхности фаговых частиц. Поскольку нитевидные частицы содержат копию одноцепочечной ДНК фагового генома, отбор антитела на основе функциональных свойств также ведет к отбору генов, кодирующих антитела, проявляющие такие свойства. Таким образом, фаги имитируют некоторые свойства В-клеток. Фаговый дисплей можно выполнить в различных форматах. Для обзора см., например, Johnson Kevin S. and Chiswell David J., Current Opinion in Structural Biology, 3, 564-571 (1993). В фаговом дисплее можно использовать несколько источников сегментов V гена.

Clackson et al. (Nature, 352: 624-628 (1991)) выделили различные матрицы антиоксазолоновых антител из небольшой случайной комбинаторной библиотеки V генов, полученных из селезенок иммунизированных мышей. Можно сконструировать репертуары V-генов от иммунизированных доноров людей, и можно изолировать антитела против различных матриц антигенов (включая аутоантигены) по существу следуя методу, описанному в Mark et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), или в Griffith et al., EMBO J., 12: 725-734 (1993). При естественном иммунном ответе гены антитела накапливают мутации в высокой степени (соматическая гипермутация). Некоторые из введенных изменений будут придавать высокую аффинность, и В-клетки, экспонирующие высокоаффинный поверхностный иммуноглобулин, преимущественно реплицируются и дифференцируются во время последующей антигенной стимуляции. Этот естественный процесс можно имитировать методом, известным как «перетасовка цепей» (Marks et al., Bio/Technol., 10: 779-783 (1992)). В этом методе аффинность первичных человеческих антител, полученных фаговым дисплеем, можно улучшить последующей заменой генов V-участков тяжелой цепи и легкой цепи репертуарами природных вариантов (репертуарами) генов V-доменов, полученных от иммунизированных доноров. Этот метод допускает получение антител и фрагментов антител, имеющих аффинность в интервале пМ-нМ. Стратегия получения очень больших репертуаров фаговых антител (также известных как «мать всех библиотек») описана в Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993).

Человеческое антитело, имеющее аффинность и специфичность, эквивалентные исходному антителу грызуна, можно получить из антитела грызуна перетасовкой генов. Согласно этому способу, также называемому как «импринтинг эпитопа», гены V доменов тяжелой или легкой цепи антител грызуна, полученных методом фагового дисплея, заменяют репертуарами генов человеческих V доменов, создавая химеры грызун-человек. Отбор на основе антигена позволяет изолировать человеческие вариабельные участки, которые могут реконструировать функциональный антигенсвязывающий сайт. Конкретно, эпитоп определяет (импринтирует) отбор партнера. Когда метод повторяют для замены оставшихся V-доменов грызуна, получают человеческое антитело (см. международную публикацию № WO9306213, опубликованную 1 апреля 1993). В отличие от обычной гуманизации антител грызунов прививкой CDR, этот метод обеспечивает полностью человеческие антитела, свободные от происходящих от грызуна остатков каркасов или CDR. Хотя обсуждение, описанное выше, относится к гуманизированным антителам, очевидно, что общие обсужденные принципы приемлемы для, например, ориентирования на применение к собакам, кошкам, приматам, лошадям и крупному рогатому скоту.

Химерное или гибридное антитело также можно получить in vitro известным методом химического синтеза белков, включая способ с использованием сшивающего агента. Например, иммунотоксины можно сконструировать, используя реакцию дисульфидного обмена или образования тиоэфирной связи. Примеры реагентов, подходящих для такой цели, включают иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат.

Одноцепочечный фрамент Fv можно также получить как описано в Iliades et al., 1997, FEBS Letters, 409: 437-441. Сочетание таких одноцепочечных фрагментов с использованием различных линкеров описано в Kortt et al., 1997, Protein Engineering, 10: 423-433. Различные методы, касающиеся рекомбинантного получения и рекомбинантной манипуляции антителами, хорошо известны в технике.

Антитело можно конъюгировать с группой водорастворимого полимера. Антитело можно конъюгировать с полиэтиленгликолем (ПЭГ), монометокси-ПЭГ, сополимером этиленгликоль/пропиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозой, декстраном, поливиниловым спиртом или подобным. Антитело можно модифицировать в произвольной позиции в молекуле или в предварительно установленных позициях в молекуле, и оно может содержать одну, две или три или больше присоединенных групп. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или линейным. В одном воплощении группа присоединена к полипептиду через линкер. В одном воплощении присоединенная группа повышает время полужизни антитела в кровотоке у животных in vivo. Способы присоединения к антителам полимеров, таких как ПЭГ, хорошо известны в технике. В одном воплощении антитело представляет собой пегилированное антитело, такое как пегилированное антитело. Конъюгат можно дополнительно конъюгировать с дополнительным другим лекарственным средством, таким как химиотерапевтическое средство, радионуклеид, иммунотерапевтическое средство, цитокин, хемокин, контрастное вещество, токсин, биологический агент, фермент, ингибитор или антитело.

2. Конъюгат антитело-лекарственное средство

В одном воплощении настоящее изобретение относится к конъюгату, включающему антитело и триптолид, конъюгированные друг с другом. Триптолид представляет собой (3bS,4aS,5aS,6R,6aR,7aS,7bS,8aS,8bS)-6-гидрокси-6a-изопропил-8b-метил-3b,4,4a,6,6a,7a,7b,8b,9,10-декагидротрисоксирено[6,7:8a,9:4b,5]фенантро[1,2-c]фуран-1(3H)-он – название по ИЮПАК, и имеет структуру, представленную следующей формулой:

Формула 1

.

Соответственно, конъюгат антитело-триптолид по настоящему изобретению может быть представлен следующей формулой:

Формула 2

в которой Ab представляет собой антитело, L представляет собой линкер, и n представляет собой число молекул триптолида, присоединенных к антителу.

Антитело и триптолид соединены ковалентно через линкер L. Для того, чтобы соединить антитело и триптолид, в качестве линкера можно использовать поливалентный линкер (например, двухвалентный линкер). Линкеры, которые могут присоединять лекарственные средства к антителу, хорошо известны в технике. Линкер может быть расщепляемым или может быть нерасщепляемым. Линкер может содержать или может не содержать атом серы. Например, линкер может расщепляться кислотой, под действием света, пептидазой, эстеразой, с восстановлением дисульфидной связи или быть гидрофобным. Линкер может иметь, например, малеимидную группу или галогенацетильную группу в основной структуре.

Примеры линкера включают N-сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)пропионат (SPDP), эфир N-[γ-малеимидобутирилокси]сукцинимида (GMBS), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), натриевую соль N-(4-малеимидобутирилокси)сульфосукцинимида (Sulfo-GMBS), натриевую соль N-[(4-малеимидометил)циклогексилкарбонилокси]сульфосукцинимида (Sulfo-SMCC), N-сукцинимидил-4-(малеимидометил)циклогексан-1-карбокси-(6-амидокапроат) (LC-SMCC), N-сукцинимидиловый эфир κ-малеимидоундекановой кислоты (KMUA), N-сукцинимидиловый эфир ε-малеимидокапроновой кислоты (EMCS), эфир м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида (MBS), эфир N-(α-малеимидоацетокси)сукцинимида (AMSA), сукцинимидил-6-(β-малеимидопропионамидо)гексаноат (SMPH), N-сукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират (SMPB), N-(п-малеимидофенил)изоцианат (PMIP), сшивающие агенты на основе малеимида, содержащие ПЭГ, N-сукцинимидилиодацетат (SIA), N-сукцинимидил(4-иодацетил)аминобензоат (SIAB), N-сукцинимидилбромацетат (SBA) и N-сукцинимидил-3-(бромацетоамидо)пропионат (SBAP).

Исходным материалом в случае триптолида может являться димер, имеющий приведенную далее структуру для того, чтобы усилить устойчивость при хранении, и сам этот димер можно использовать с восстановлением.

Формула 3

В этом случае димер восстанваливают и получают следующее вещество, содержащее группу 4-оксо-4-[(2-тиолэтил)амино]бутановой кислоты, связанную с каждой молекулой триптолида.

Формула 4

Группу 4-оксо-4-[(2-тиолэтил)амино]бутановой кислоты, связанную с триптолидом, можно использовать в качестве линкера L. С другой стороны, группу 4-оксо-4-[(2-тиолэтил)амино]бутановой кислоты можно удалить, и линкер, указанный выше, можно присоединить непосредственно к триптолиду как линкер L. С другой стороны, линкер L может представлять собой группу, в которой даухвалентный линкер, упомянутый выше, связан с группой 4-оксо-4-[(2-тиолэтил)амино]бутановой кислоты. Например, когда 4-оксо-4-[(2-тиолэтил)амино]бутановую кислоту и SMCC используют в качестве линкера L, конъюгат антитело-триптолид по настоящему изобретению можно представить следующей формулой:

Формула 5

Число молекул триптолида (представленное n в формуле, описанной выше), присоединенных к одной молекуле антитела, может равняться в среднем по меньшей мере 1 и может равняться, например, 2 или больше, 2,5 или больше, 3 или больше, 3,5 или больше, 4 или больше, 4,5 или больше, 5 или больше, 5,5 или больше, 6 или больше, 6,489 или больше, 6,5 или больше, 7 или больше, 7,5 или больше, 8 или больше, 8,5 или больше, 9 или больше, 9,5 или больше или 10 или больше. Также число молекул триптолида (представленное n в формуле, описанной выше), присоединенных к одной молекуле антитела, может равняться в среднем 3 или меньше, 3,5 или меньше, 4 или меньше, 4,5 или меньше, 5 или меньше, 5,5 или меньше, 6 или меньше, 6,5 или меньше, 7 или меньше, 7,5 или меньше, 8 или меньше, 8,5 или меньше, 9 или меньше, 9,5 или меньше или 10 или меньше. С другой стороны, число молекул триптолида (представленное n в формуле, описанной выше), присоединенных к одной молекуле антитела, может равняться 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-10, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 2-4, 2-3, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-10, 4-9, 4-8, 4-7, 4-6, 4-5, 5-10, 5-9, 5-8, 5-7, 5-6, 6-10, 6-9, 6-8, 6-7, 7-10, 7-9, 7-8, 8-10, 8-9, 9-10, или 1, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 6,489, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 или 10.

Присоединения линкера к антителу обычно достигают путем ацилирования лизинового остатка антитела. Позиция присоединения триптолида к антителу особо не ограничивается до тех пор, пока позиция не влияет на специфичность антитела. В частности, триптолид присоединяют к константному участку антитела.

Конъюгат антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению можно получить способом, хорошо известным специалистам в данной области техники. Например, сначала для связи друг с другом можно ввести во взаимодействие антитело и линкер, и затем линкер можно присоединить к лекарственному средству (триптолиду). Конкретно антитело вводят во взаимодействие с линкером в 10-50 кратном молярном количестве от антитела, растворенного в ДМСО, при комнатной температуре в течение 30 минут в PBS-ЭДТК (рН 7,5), и непрореагировавщие линкеры удаляют, и получают антитело, присоединенное к линкеру. Димер производного триптолида растворяют в 100% этаноле и восстанавливают в течение 2 часов. Модифицированное линкером антитело и триптолид можно ввести во взаимодействие в течение ночи в отношении 1:5,68 при комнатной температуре в PBS-ЭДТК, рН 7,5, и получить продукт присоединения антитело-линкер-триптолид.

3. Сопутствующее лекарственное средство

Настоящее изобретение также относится к сопутствующему лекарственному средству для антитела и дополнительному противоопухолевому средству. Примеры противоопухолевых средств, которые можно использовать одновременно с антителом, могут включать алкилирующие лекарственные средства, включая азотные аналоги горчичного газа, такие как циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан, бусульфан и тиотепу, и нитромочевины, такие как нимустин, ранимустин, дакарбазин, прокарбазин, темозоломид, кармустин, стрептозоцин и бендамустин; соединения платины, такие как цисплатин, карбоплатин, оксаплатин и недаплатин; антиметаболиты как лекарственные средства, такие как эноцитабин, капецитабин, кармофур, кладрибин, цитарабин, октофосфат цитарабина, тегафур, тегафур + урацил, тегафур/гимерацил/отерацил калия, доксифлуридин, неларабин, гидроксикарбамид, 5-фторурацил (5-FU), флударабин, пеметрексед, пентостатин, меркаптопурин и метотрексат; растительные алкалоиды или лекарственные средства, ингибирующие микротрубочки, такие как иринотекан, этопозид, эрибулин, собузоксан, доцетаксел, ногитекан, паклитакел, винорелбин, винкристин, виндезин и винбластин; противораковые антибиотики, такие как актиномицин D, акларубицин, амрубицин, идарубицин, эпирубицин, зиностатин стималамер, даунорубицин, доксорубицин, пирарубицин, блеомицин, пепломицин, митомицин С, митоксантрон и липосомный доксорубицин; противораковые вакцины, такие как сипулейцил-Т; молекулярные таргетные лекарственные средства, такие как ибритумомаб тиуксетан, имтиниб, эверолимус, эрлотиниб, гефитиниб, гемтузумаб, оксогамицин, сунитиниб, цетуксимаб, сорафениб, дазатиниб, тамибаротен, трастузумаб, тритиноин, панитумумаб, бевацизумаб, бортезомиб, лапатиниб и ритуксимаб; гормональные средства, такие как анастрозол, экземестан, эстрамустин, этинилэстрадиол, хлормадинон, гозерелин, тамоксифен, дексаметазон, торемефин, бикалутамид, фдутамид, преднизолон, фосфестрол, митотан, метилтестостерон, медроксипрогестерон, мепитиостан, лейпрорелин и летрозол; и модификаторы биологических реакций, такие как интерферон α, интерферон β, интерферон γ, интерлейкин, убенимекс, сухая BCG и лентинан. Предпочтительным является цисплатин, пеметрексед или гемцитабин, и гемцитабин является особенно предпочтительным.

Сопутствующее лекарственное средство (фармацевтическая композиция, содержащая два или больше лекарственных средств) по настоящему изобретению может содержать все или часть лекарственных средств, относящихся к двум или более типам, используемых одновременно в одном препарате, или предоставлено в виде отдельных препаратов, каждый содержащий каждое единственное лекарственное средство для одновременного применения. С другой стороны, сопутствующее лекарственное средство по настоящему изобретению может предоставляться в форме набора для одновременного применения, включающего отдельные препараты, содержащие каждое из лекарственных средств по отдельности, или все лекарственые средства, или несколько из двух или более типов лекарственных средств, которые используют одновременно.

4. Применение

Конъюгат или сопутствующее лекарственное средство по настоящему изобретению применимы в различных применениях, включая, но без ограничения, способ лечения или способ лизирования злокачественных клеток. Настоящее изобретение включает, например, фармацевтическую композицию, терапевтическое лекарственное средство против злокачественной мезотелиомы, ингибитор роста клеток злокачественной мезотелиомы и агент, лизирующий клетки злокачественной мезотелиомы, которые содержат конъюгат или сопутствующее лекарственное средство по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента. Настоящее изобретение также может относиться к конъюгату или сопутствующему лекарственному средству по настоящему изобретению для применения в фармацевтической композиции, терапевтическом лекарственном средстве против злокачественной мезотелиомы, ингибиторе роста клеток злокачественной мезотелиомы или агенте, лизирующем клетки злокачественной мезотелиомы. С другой стороны, настоящее изобретение может относиться к применению конъюгата по настоящему изобретению или применению анти-CD26 антитела и противоопухолевого средства при изготовлении фармацевтической композиции, терапевтического лекарственного средство против злокачественной мезотелиомы, ингибитора роста клеток злокачественной мезотелиомы или агента, лизирующего клетки злокачественной мезотелиомы. В одном аспекте настоящее изобретение включает способ лечения злокачественной мезотелиомы, способ ингибирования роста клеток злокачественной мезотелиомы и способ лизирования клеток злокачественной мезотелиомы, включающие введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества конъюгата или сопутствующего лекарственного средства по настоящему изобретению. Соответственно, настоящее изобретение также относится к способу ингибирования роста клеток, экспрессирующих CD26. Ингибирование роста клеток, экспрессирующих CD26, включает любое наблюдаемое ингибирование, включая частичное ингибирование роста и полное ингибирование роста. В одном воплощении рост клеток ингибируется по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 99% или приблизительно на 100%. Способ можно выполнять in vitro или in vivo. В одном воплощении способ включает стадию контактирования клеток с конъюгатом или сопутствующим лекарственным средством, описанным в настоящем описании. Как правило, для ингибирования роста клеток клетки приводят в контакт с достаточным количеством конъюгата или сопутствующего лекарственного средства.

В одном воплощении клетки, экспрессирующие CD26, являются клетками млекопитающего и предпочтительно человеческими клетками. В одном воплощении клетки, экспрессирующие CD26, являются раковыми клетками. В одном воплощении клетки, экспрессирующие CD26, являются клетками злокачественной мезотелиомы, рака легких, рака почек, рака печени или других злокачественных опухолей, участвующих в экспрессии CD26. В одном воплощении опухолевые клетки являются злокачественными или доброкачественными.

Методы оценки ингибирования роста клеток известны в технике. Их примеры включают анализ с МТТ (см., например, Aytac et al. (2003), British Journal of Cancer, 88: 455-462; Ho et al. (2001), Clinical Cancer Research, 7: 2031-2040; Hansen et al. (1989), J. Immunol. Methods, 119: 203-210; и Aytac et al. (2001), Cancer Res., 61: 7204-7210).

Настоящее изобретение также относится к способу лечения субъекта от состояния, ассоциированного с экспрессией CD26. Способ лечения субъекта от состояния, ассоциированного с экспрессией CD26, включает введение субъекту эффективного количества композиции, включающей конъюгат или сопутствующее лекарственное средство, описанные в настоящем описании. Состояние, ассоциированное с экспрессией CD26, может быть ассоциировано с анормальной экспрессией CD26. Состояние, ассоциированное с экспрессией CD26, может являться состоянием, ассоциированным с изменением анормальности в экспрессии CD26 (в одном воплощении повышение или понижение уровня экспрессии CD26 (по сравнению с нормальным образцом) и/или несоответствующая экспрессия, например, экспрессия в тканях и/или клетках, обычно не экспрессирующих CD26, или недостаточность экспрессии CD26 в тканях или клетках, обычно экспрессирующих CD26). Состояние, ассоциированное с экспрессией CD26, может являться состоянием, ассоциированным со сверхэкспрессией CD26. Состояние, ассоциированное с экспрессией CD26, может опосредоваться, по меньшей мере частично, CD26, может являться состоянием, ассоциированным с экспрессирующими CD26 клетками или может являться состоянием, ассоциированным с анормальным ростом экспрессирующих CD26 клеток. Клетки, экспрессирующие CD26, могут представлять собой Т-клетки или опухолевые клетки. Опухолевые клетки могут являться злокачетвенными или доброкачественными.

Состояниие, ассоциированное с экспрессией CD26 у субъекта, включает пролиферативное заболевание, в частности, рак. Рак представляет собой злокачественную мезотелиому, рак легких, рак почек, рак печени или любую другую злокачественную опухоль, участвующую в экспрессии CD26.

Способ (включая способ лечения), описанный в настоящем описании, можно выполнить одной направленной инъекцией один раз или несколько раз в одно или несколько мест. Введение также можно выполнить в несколько мест почти одновременно. Частота введения определяется и регулируется в ходе лечения и основывается на желательных результатах, которых нужно достичь. В некоторых случаях может подойти препарат конъюгата, сопутствующего лекарственного средства или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению с пролонгированным высвобождением. В технике известны различные препараты и устройства для достижения пролонгированного высвобождения.

Субъект для лечения или профилактики включает млекопитающих, таких как люди, крупный рогатый скот, лошади, собаки, кошки, свиньи и овцы, и предпочтительно является человеком.

Конъюгат или сопутствующее лекарственное средство предпочтительно вводят млекопитающему как содержащееся в носителе (предпочтительно фармацевтически приемлемом носителе). Соответствующие носители и их препараты описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; и в Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, Mack Publishing, 2000. Как правило, в препарате используют соответствующее количество фармацевтически приемлемой соли с тем, чтобы препарат имел изотоничность. Примеры носителя включают физиологический раствор, растворы Рингера и растворы декстрозы. В таких растворах рН предпочтительно составляет приблизительно 5 – приблизительно 8, предпочтительнее приблизительно 7 – приблизительно 7,5. Другие примеры носителя включают препараты с пролонгированным высвобождением, такие как полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело. Матрицы находятся в форме имеющих форму изделий, например, пленок, липосом или микрочастиц. Будет очевидно для специалистов в данной области техники, что определенный носитель может быть предпочтительнее в зависимости от, например, способа введения и концентрации антитела, которое вводят.

Конъюгат или сопутствующее лекарственное средство можно вводить млекопитающему инъекцией (например, системной, внутривенной, интраперитонеальной, подкожной, внутримышечной или интрапортальной инъекцией) или можно вводить другими способами (например, инфузией), которые обеспечивают надежную доставку в эффективной форме в кровоток. Конъюгат или сопутствующее лекарственное средство можно вводить методом изолированной перфузии, таким как изолированная перфузия тканей, для того, чтобы вызвать локальное терапевтическое действие. Предпочтительной является 0130]

Эффективные дозы и схемы для введения конъюгата или сопутствующего лекарственного средства по настоящему изобретению определяют эмпирически. Методы такого определения заключены в здравом техническом смысле в технике. Специалистам в данной области техники будет понятно, что доза вводимого конъюгата или сопутствующего лекарственного средства изменяется в зависимости от, например, млекопитающего, которое будет получать конъюгат или сопутствующее лекарственное средство, пути введения, конкретного типа используемого антитела и других лекарственных средств, вводимых млекопитающему. Типичное суточное количество вводимого конъюгата (используемого одного) или сопутствующего лекарственного средства может колебаться от приблизительно 1 мкг/кг массы тела до 100 мг/кг массы тела или больше в сутки, хотя и зависит от факторов, упомянутых выше. Вообще можно использовать любое из следующих вводимых количеств: по меньшей мере приблизительно 50 мг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 10 мг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 3 мг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 1 мг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 750 мкг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 500 мкг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 250 мкг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 100 мкг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 50 мкг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 10 мкг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 1 мкг/кг массы тела или больше.

Конъюгат или сопутствующее лекарственное средство можно вводить млекопитающему также путем одновременного применения с эффективными количествами одного или нескольких других терапевтических лекарственных средств. Конъюгат или сопутствующее лекарственное средство можно вводить последовательно или одновременно с одним или несколькими другими терапевтическими лекарственными средствами. Количества конъюгата или сопутствующего лекарственного средства и терапевтического лекарственного средства зависят от, например, типов используемых лекарственных средств, патологического состояния, от которого лечат, схемы введения и пути введения и, как правило, могут быть меньше, чем количества конъюгата или сопутствующего лекарственного средства и терапевтического лекарственного средства, используемых по отдельности.

Физиологическое состояние млекопитающего, получившего таким образом конъюгат или сопутствующее лекарственное средство, можно контролировать различными способами, известными специалистам в данной области техники.

5. Способ скрининга на соединение, показывающее синергетическое действие при одновременном использовании с анти-CD26 антителом

В другом альтернативном аспекте настоящее изобретение относится к способу скрининга на соединение, показывающее синергетическое действие при одновременном использовании с анти-CD26 антителом. Способ скрининга по настоящему изобретению основан на CD26, который совместно действует и противодействует CD6 (Okamoto et al., PLOS One (2014), 9 (1): e86671). Когда предполагаемое химиотерапевтическое средство совместно действует с CD26, его действие ослабляется CD9. Поэтому предполагаемое средство, проявляющее различное ингибирующее действие на рост клеточной линии, коэкспрессирующей CD26 и CD9, и клеточной линии, экспрессирующей CD26, но не экспрессирующей CD9, можно определить как средство, показывающее синергетическое действие при сопутствующем действии с анти-CD26 антителом. Конкретно способ скрининга по настоящему изобретению представляет собой способ скрининга на соединение, показывающее синергетическое противоопухолевое действие при одновременном использовании с анти-CD26 антителом, включающий следующие стадии:

(а) культивирование опухолевой клеточной линии, коэкспрессирующей CD26 и CD9, и клеточной линии, экспрессирующей CD26, но не экспрессирующей CD9, в присутствии испытываемого соединения;

(b) измерение соответственных чисел клеток культивированных таким образом опухолевых клеточных линий;

(с) вычисление ингибирующего рост действия испытываемого соединения на опухолевую клеточную линию, коэкспрессирующую CD26 и CD9, и ингибирующего рост действия испытываемого соединения на клеточную линию, экспрессирующую CD26, но не экспрессирующую CD9; и

(d) сравнение ингибирующего рост действия испытываемого соединения на опухолевую клеточную линию, коэкспрессирующую CD26 и CD9, и ингибирующего рост действия испытываемого соединения на клеточную линию, экспрессирующую CD26, но не экспрессирующую CD9, и отбор испытываемого соединения как соединения, вероятно показывающего синергетическое противоопухолевое действие при одновременном использовании с анти-CD26 антителом, когда ингибирующее рост действие на клеточную линию, экспрессирующую CD26, но не экспрессирующую CD9, более сильное.

В этом способе клеточную линию мезотелиомы MESO1 или Н2452 можно использовать в качестве опухолевой клеточной линии, коэкспрессирующей CD26 и CD9. JMN или Н226 можно использовать в качестве опухолевой клеточной линии, экспрессирующей CD26, но не экспрессирующей CD9.

На стадии измерения соответственных чисел клеток опухолевых клеточных линий можно выбрать любой известный способ до тех пор, пока способ обеспечивает измерение величин, отображающих числа клеток. Например, вместо числа клеток можно использовать другие численные величины, служащие в качестве показателя числа клеток, такие как мутность, или величины, измеренные в анализе с МТТ.

Ингибирующее рост действие на каждую опухолевую клеточную линию можно вычислить как число клеток, с которым контроль принимают за 100, или можно вычислить численную величину, служащую в качестве показателя для эффективности лекарственного средства, такую как IC50. О степени ингибирующего рост действия можно утверждать как о превосходном ингибирующем рост действии, когда число клеток, рост которых подавлен, является высоким.

Далее в настоящем описании настоящее изобретение будет описываться подробнее с обращением к примерам. Однако настоящее изобретение не ограничивается этими примерами. Все литературные источники, цитированные в настоящем описании, полностью включены в настоящее описание в качестве ссылок.

(Пример 1) Конъюгация антитела и лекарственного средства

(1) Исходный материал

Гуманизированное анти-CD26 антитело YS110 создают на основе мышиного анти-CD26 антитела 14D10 и экспрессируют согласно уже описанному подходу (см. международную публикацию № WO2007/014169; и Inamoto T. et al., Clin. Cancer Res. (2007), 13: 4191-200).

Триптолид, имеющий приведенную далее структуру (молекулярная формула C20H24O6; MW = 360,4) закупают у Shaanxi Taiji Technology (Shanxi Sheng, China).

Формула 6

(2) Протокол конъюгации

В триптолид вводят группу SH по ChemGenesis Inc. (Tokyo, Japan). Полученное производное триптолида называют TR1. TR1 предоставляют в виде димера таких производных триптолида, соединенных через связь S-S для усиленной химической устойчивости, и он имеет приведенную далее структуру.

Формула 7

Гетеробивалентный линкер SPDP (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат) (каталожный № 21857, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA), GMBS (эфир N-[γ-малеимидобутирилокси]сукцинимида) (каталожный № 22309, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) или SMCC (сукцинимидил-4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилат) (каталожный № 22360, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) растворяют в ДМСО непосредственно перед использованием. YS110 модифицируют через взаимодействие с гетеробиваленым линкером SPDP (15-кратное молярное количество от антитела), GMBS (30-кратное молярное количество от антитела) или SMCC (20-кратное молярное количество от антитела) при комнатной температуре в течение 30 минут в PBS-ЭДТК (pH 7,5). Непрореагировавшие линкеры удаляют с использованием колонки для обессоливания HiTrap (каталожный № 21857, GE Healthcare Inc., Buckinghamshire, UK). Растворяют производное триптолида димер TR1 S-S в 100% этаноле и восстанавливают в иммобилизованном восстанавливающем геле TCEP Reducing Gel (каталожный № 77712, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) в течение 2 часов. Концентрацию группы SH в восстановленном TR1-SH измеряют анализом с DTNB ((5,5-дитиобис(2-нитробензойная кислота)). Модифицированное линкером YS110 и TR1-SH вводят во взаимодействие в течение ночи в отношении 1:5,68 при комнатной температуре в PBS-ЭДТК, pH 7,5. Непрореагировавший TR1-SH удаляют с использованием колонки PD-10 (каталожный № 17085101, GE Healthcare Inc., Buckinghamshire, UK). Все эти реакции приводятся ниже.

Формула 8

Полученный продукт стерилизуют фильтрацией на фильтровальной установке Millex-GV, 0,22 мкм (кат. № SLGV 013SL, EMD Millipore, Billerica, MA). Конечную концентрацию измеряют с использованием набора реагентов для анализа на белок ВСА (каталожный № 23225, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA). Оставшийся в продукте неконъюгированный TR1-SH измеряют анализом с DTNB.

(3) Результаты

YS110 и TR1 конъюгированы с использованием гетеробивалентного линкера (SPDP, GMBS или SMCC) согласно способу, описанному выше. Концентрация конечного продукта, измеренная с использованием набора реагентов для анализа белков BCA (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA), составляет приблизительно 1 мг/мл. Оставшийся неконъюгированным TR1-SH в продукте измеряют анализом с DTNB, но он детектируется с трудом (данные не приводятся).

(Пример 2) Культивирование клеток

Клеточную CD26-отрицательную линию злокачественной мезотелиомы MSTO-211H (Американская коллекция типовых культур, Manassas, VA) трансфицируют геном CD26 и обозначают как клон 12 MSTO (Aoe K. et al., Clin. Cancer Res. (2012), 18: 1447-56). Клеточную CD26-отрицательную линию Jurkat Т-клеточного лейкоза (Американская коллекция типовых культур, Manassas, VA) трансфицируют геном CD26 и обозначают как Jurkat CD26(+) (Tanaka T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993), 90: 4586-90). Клеточная CD26-положительная линия JMN, восстановленная из злокачественной мезотелиомы, любезно предоставлена профессором Chikao Morimoto, the Institute of Medical Science, the University of Tokyo. Все клеточные линии культивируют в среде RPMI (каталожный № 11875-093, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA), содержащей 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки (FBS, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA), ABPC (100 мкг/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл), при 37°C в атмосфере с 5% CO₂.

(Пример 3) Масс-спектрометрия

Отношение лекарственное средство/антитело в Y-TR1 анализируют после ультрафильтрации масс-спектрометрией с матрично-активировнной лезерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOFmass) с использованием Autoflex III (Bruker Corporation, Billerica, MA).

Интактные массы неконъюгированного YS110 и Y-TR1 (SMCC), анализированные MALDI-TOFmass, составляют 147012,7 и 151815,6, соответственно (фигура 1). Оцененное молекулярное количество TR1, конъюгированного с антителом группой SMCC, составляет 739,6. На основе этого молекулярного количества можно вычислить среднее число групп TR1-SMCC, присоединенных к одной молекуле YS110, согласно выражению {(151815,6 – 147012,7) / 739,6} и получить в результате 6,489. Это означает, что к одной молекуле YS110 присоединены в среднем 6,489 молекул TR-1.

(Пример 4) Анализ на связывание

Для того, чтобы проверить связывание Y-TR1 с CD26-положительными клетками злокачественной мезотелиомы, получают культивированные MSTO-wt клетки (CD26-отрицательные) и клетки клона 12 MSTO (CD26-положительные). По 1×10⁶ клеток каждой клеточной линии культивируют с 1 мкг/мл, 10 мкг/мл или 100 мкг/мл Y-TR1 при 4°C в течение 30 минут. Клетки промывают три раза и культивируют с FITC-конъюгированным кроличьим античеловеческим IgG (каталожный № 6140-02, Southern Biotech, Birmingham, AL) при отношении разведения 1:100 при 4°C в течение 30 минут. Клетки промывают три раза и затем анализируют FACS с использованием Epics XL-MCL (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA).

Интактное связывание Y-TR1 с CD26-положительной клеточной линией клона 12 MSTO злокачественной мезотелиомы подтверждают анализом методом проточной цитометрии (фигура 2).

(Пример 5) Анализ на цитотоксичность

Цитотоксичность триптолида, YS110 и Y-TR1 для клеточных линий злокачественной мезотелиомы и Т-клеточного лейкоза измеряют с использованием набора для колориметрической оценки пролиферации клеток WST-1 (каталожный № 11644807001, Roche Applied Science, Rotkreuz, Switzerland), на основании колориметрической детекции красителя формазана. Коротко, 5×10³ клеток MSTO-wt, клон 12 MSTO, JMN, Jurkat CD26(-) или Jurkat CD26(+) культивируют с триптолидом (0-100 нM), TR1 (0-100 нM), YS110 (0-100 мкг/мл) или Y-TR1 (0-100 мкг/мл) в 96-луночном планшете в среде RPMI, содержащей 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки, ABPC (100 мкг/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл), при 37°C в течение 48 часов в атмосфере с 5% CO₂. Анализ с WST-1 проводят согласно руководству, предоставленному изготовителем. Фоновое поглощение каждого образца при 630 нм вычитают из его величины, измеренной при 450 нм. Эксперимент проводят трижды, и приводят типичные результаты.

Как видно на фигуре 3, триптолид показывает зависимое от дозы токсическое действие на клеточные линии злокачественной мезотелиомы MSTO-wt, клон 12 MSTО и JMN и клеточные линии Т-клеточного лейкоза Jurkat и Jurkat (+) после обработки в течение 48 часов. Величина IC50 триптолида и этих клеточных линий приводится в таблице 4.

Производное триптолида TR1, которое создают для присоединения к линкеру, проверяют на его цитотоксичность и величину IC50 таким же путем, какой указан выше. Результаты приводятся на фигуре 4 и в таблице 4. TR1 восстанавливают из SS димера с использованием иммобилизованного перед анализом TR-1 в восстанавливающем геле TCEP Reducing Gel (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA).

Y-TR1 показывает зависимую от дозы цитотоксичность для CD26-положительных клеточных линий злокачественной мезотелиомы и Т-клеточного лейкоза (фигура 5). Сравнивают цитотоксичность Y-TR1 для CD26-положительной клеточной линии злокачественной мезотелиомы клон 12 MSTО с 3 типами линкеров (SPDP, GMBS и SMCC) (фигура 5A). В результате такого сравнения 3 типов гетеробивалентных линкеров величина IC50 Y-TR1 для клона 12 MSTO составляет 38 мкг/мл, 18 мкг/мл и 15 мкг/мл в случае использования SPDP, GMBS и SMCC, соответственно (таблица 5). В этом эксперименте конъюгат Y-TR1 с SMCC показывает наилучшую цитотоксичность. Поэтому в последующих экспериментах используют Y-TR1 (SMCC). Цитотоксичность Y-TR1 для CD26-положительных или CD26-отрицательных клеточных линий злокачественной мезотелиомы и лейкоза сравнивают с цитотоксичностью неконъюгированного YS110 (фигуры 5A и 5B). Величина IC50 Y-TR1 (SMCC) для различных клеточных линий приводится в таблице 4. Y-TR1 по сравнению с YS110 показывает заметно более высокую цитотоксичность для CD26-положительных клеток (клон 12 MSTO, JMN и Jurkat CD26(+)). Клеточные CD26-положительные линии (клон 12 MSTO и Jurkat CD26(+)), по сравнению с соответствующими CD26-отрицательными клетками (MSTO wt и Jurkat CD26(-)), значительно более чувствительны к цитотоксичности Y-TR1 (фигуры 5C и 5D). Свободное TR-1 (соответствующее Y-TR1) в случае клеточной линии клона 12 MSTO вычисляют из величин IC50 Y-TR1 (приблизительно 15 мкг/мл = 99 нM) и неконъюгированного TR-1 (250 нM). В результате одна молекула Y-TR1 соответствует 2,5 молекулам TR1 (фигура 6). Это подтверждает, что цитотоксическое действие на клеточную линию мезотелиомы на молекулу триптолида заметно усиливается конъюгацией с анти-CD26 антителом YS110. Такие результаты показывают, что злокачественную мезотелиому можно лечить меньшим вводимым количеством.

Таблица 4

Таблица 5

(Пример 6) Анализ действия in vivo и исследование токсичности

Мышей NOD/SCID (NOD/LtSz-scid) держат в клетке-микроизоляторе в специфическом виварии без патогенов (SPF) и обеспечивают свободный прием стерилизованного корма и стерилизованной воды. Протокол эксперимента с животными проводят с одобрения Комитета по уходу за животными и их использованию.

Вводят подкожно 1×10⁷ культивированных клеток JMN 6-8-недельным самкам мышей NOD/SCID. 30 животных произвольно распределяют на группы для 3 типов обработки: контрольную группу, группу с введением YS110 и группу с введением Y-TR1. Вводят интраперитонеально 4 мг/кг/доза YS110 или Y-TR1 группам с YS110 и Y-TR1 три раза в неделю (всего 9 раз) от дня инокуляции опухоли. Контрольной группе вводят такое же количество PBS. Когда опухоль становится явно видимой, опухоль иссекают, и измеряют ее размер штангенциркулем с нониусом. Предполагаемый объем опухоли определяют путем вычисления согласно выражению π / 6 × L × W × W (Tomayko MM et al., Cancer Chemother Pharmacol. (1989), 24: 148-54). Статистическое различие между средними объемами опухолей в этих группах определяют по защищенному критерию Фишера для множественного сравнения разностей наименьших квадратов (PLSD). Статистический анализ проводят с использованием программы SPSS (IBM, Armonk, NY).

Фигура 7 показывает результаты по эффективности in vivo Y-TR1 при сравнении с неконъюгированным YS110 на мышиных моделях NOD/SCID с ксенотрансплантатом, полученные с использованием CD26-положительной клеточной линии JMN злокачественной мезотелиомы. Сравнивают средний объем опухоли в день 55, установленный согласно формуле объема эллипсоида (π / 6 × L × W × H) (Tomayko MM et al., Cancer Chemother. Pharmacol. (1989), 24: 148-54), в 3 группах (контроль, YS110 и Y-TR1) с помощью защищенного критерия Фишера для множественного сравнения разностей наименьших квадратов (PLSD). Средний объем опухоли в группе с введением Y-TR1 (получившей в целом 36 мг/кг Y-TR1) заметно меньше по сравнению с контрольной группой и группой с введением YS110 (p < 0,05). По завершении эксперимента (день 55) с помощью мегаскопа подтверждается полное подавление роста опухоли у двух из девяти мышей в группе с введением Y-TR1. Фигура 7 показывает один типичный пример схожих результатов эксперимента, полученных дважды. По завершении эксперимента средняя масса тела мышей в группах заметно не различается.

(Пример 7) Подтверждение экспрессии CD26 в клеточной линии мезотелиомы

Экспрессию CD26 в клеточной линии мезотелиомы подтверждают измерением FACS. Из CD26-положительных клеточных линий мезотелиомы ACC-MESO1 и JMN используют как клеточные линии саркоматоидной мезотелиомы, и NCI-H2452 и NCI-H226 используют как клеточные линии эпителиоидной мезотелиомы. Клетки ACC-MESO1, JMN, NCI-H2452 и NCI-H226 окрашивают комплексом анти-CD26 моноклональное антитело-FITC с последующим анализом методом FACS.

Результаты приводятся на фигуре 8. Подтверждается, что все испытанные клеточные линии экспрессируют CD26.

(Пример 8) Усиление ингибирующего рост действия на клетки мезотелиомы цисплатина-пеметрекседа путем одновременного использования с YS110

(1) Кривые дозовой зависимости цисплатина и пеметрекседа

Клетки MESO1 или H2452 (2×10³ клетки/лунка) инкубируют в 96-луночном планшете. Через один час в планшет добавляют цисплатин или пеметрексед в количестве 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6, 10^-5 или 10^-4 M (n = 6). В день 2 проводят анализ с MTT.

Результаты приводятся на фигуре 9. Цисплатин и пеметрексед подавляют рост MESO1 и H2452 в зависимости от дозы.

(2) Усиление ингибирующего рост клеток действия цисплатина и пеметрекседа на клетки MESO1 за счет YS110

Клетки MESO1 (2×10³ клетки/лунка) инкубируют в 96-луночном планшете. Через один час в планшет добавляют комбинацию 0,3, 3 или 10 мкM цисплатина и 0,1, 3 или 10 мкг/мл YS110, или комбинацию 0,03, 0,3 или 1 мкM пеметрекседа и 0,1, 3 или 10 мкг/мл YS110. В день 2 проводят анализ с MTT. Значимое различие проверяют двусторонним t-критерием (vs контр.).

Результаты приводятся на фигуре 10. YS110 усиливает ингибирующее рост клеток действие цисплатина и пеметрекседа.

Пеметрексед

(3) Усиление ингибирующего рост клеток действия цисплатина и пеметрекседа на клетки Н2452 за счет YS110

Клетки Н2452 (2×10³ клетки/лунка) инкубируют в 96-луночном планшете. Через один час в планшет добавляют комбинацию 0,03, 0,3 или 1 мкM цисплатина и 0,1, 3 или 10 мкг/мл YS110, или комбинацию 0,01, 0,1 или 0,3 мкM пеметрекседа и 0,1, 3 или 10 мкг/мл YS110 (n=6). В день 2 проводят анализ с MTT. Значимое различие проверяют двусторонним t-критерием (vs контр.).

Результаты приводятся на фигуре 11. YS110 усиливает ингибирующее рост клеток действие цисплатина и пеметрекседа.

(4) Усиление ингибирующего действия на рост клеток MESO1 одновременного использования цисплатина-пеметрекседа за счет YS110

Клетки MESO1 (2×10³ клетки/лунка) или клетки Н2452 (2×10³ клетки/лунка) инкубируют в 96-луночном планшете. Через один час в планшет добавляют комбинацию 0,3 мкM цисплатина - 0,1 мкM пеметрекседа или YS110 (10 мкг/мл) плюс комбинация 0,3 мкM цисплатина - 0,1 мкM пеметрекседа (n=6). В день 2 проводят анализ с MTT. Значимое различие проверяют двусторонним t-критерием (vs контр.).

Результаты приводятся на фигуре 12. YS110 усиливает ингибирующее рост клеток действие цисплатина и пеметрекседа.

(5) Усиление ингибирующего действия на рост клеток JMN in vivo цисплатина и пеметрекседа за счет YS110

Клетки JMN (3×10⁵ клетки/животное) трансплантируют подкожно в спину самкам мышей SCID. День пересадки обозначают как день 0. Мышам дважды (дни 1 и 4) вводят интраперитонеально одно YS110 (10 мг/кг), один цисплатин (0,5 мг/кг), один пеметрексед (50 мг/кг), цисплатин (0,5 мг/кг) и YS110 (10 мг/кг), используемые одновременно, или пеметрексед (50 мг/кг) и YS110 (10 мг/кг), используемые одновременно. В день 7 опухоли иссекают, и измеряют массу опухолей. Значимое различие проверяют двусторонним t-критерием (vs контр.).

Результаты приводятся на фигуре 13. YS110 усиливает ингибирующее действие цисплатина и пеметрекседа на рост опухоли in vivo.

(6) Усиление ингибирующего действия на рост клеток JMN in vivo одновременного использования цисплатина-пеметрекседа за счет YS110

Клетки JMN (5×10⁵ клетки/животное) трансплантируют подкожно в спину самкам мышей SCID. День пересадки обозначают как день 0. Мышам дважды (дни 1 и 4) вводят интраперитонеально используемые одновременно цисплатин (0,5 мг/кг)-пеметрексед (50 мг/кг), одно YS110 (10 мг/кг) или YS110 (10 мг/кг), используемое одновременно с одновременным использованием цисплатина-пеметрекседа. В день 7 опухоли иссекают, и измеряют массу опухолей. Значимое различие проверяют двусторонним t-критерием (vs контр.).

Результаты приводятся на фигуре 14. YS110 усиливает ингибирующее действие цисплатина-пеметрекседа на рост опухоли in vivo.

(7) Усиление ингибирующего действия на рост клеток MESО1 in vivo одновременного использования цисплатина-пеметрекседа за счет YS110

Клетки MESО1 (3×10⁵ клетки/животное) трансплантируют подкожно в спину самкам мышей SCID. День пересадки обозначают как день 0. Мышам дважды (дни 1 и 4) вводят интраперитонеально одно YS110 (10 мг/кг), используемые одновременно цисплатин (0,5 мг/кг)-пеметрексед (50 мг/кг) или YS110 (10 мг/кг), используемое одновременно с одновременным использованием цисплатина-пеметрекседа. В день 7 опухоли иссекают, и измеряют массу опухолей. Значимое различие проверяют двусторонним t-критерием (vs контр.).

Результаты приводятся на фигуре 15. YS110 усиливает ингибирующее действие цисплатина-пеметрекседа на рост опухоли in vivo на клетках MESО1.

(8) Усиление ингибирующего действия на рост клеток Н2452 in vivo одновременного использования цисплатина-пеметрекседа за счет YS110

Клетки Н2452 (3×10⁵ клетки/животное) трансплантируют подкожно в спину самкам мышей SCID. День пересадки обозначают как день 0. Мышам дважды (дни 1 и 4) вводят интраперитонеально одно YS110 (10 мг/кг), используемые одновременно цисплатин (0,5 мг/кг)-пеметрексед (50 мг/кг) или YS110 (10 мг/кг), используемое одновременно с одновременным использованием цисплатина-пеметрекседа. В день 7 опухоли иссекают, и измеряют массу опухолей. Значимое различие проверяют двусторонним t-критерием (vs контр.).

Результаты приводятся на фигуре 16. YS110 усиливает ингибирующее действие цисплатина-пеметрекседа на рост опухоли in vivo на клетках Н2452.

(Пример 9) Усиление ингибирующего действия цисплатина-пеметрекседа на инвазию клеток путем одновременного использования с YS110 на клетках мезотелиомы

(1) Действие цисплатина и пеметрекседа на инвазию клеток

Клетки MESО1 или клетки Н2452 (2,5×10⁴ клетки/лунка) вносят в камеру Бойдена. Через один час в камеру добавляют цисплатин (5, 10 или 30 мкМ) или пеметрексед (1, 10 или 30 мкМ) (n=5), с последующим анализом на инвазию с помощью камеры Бойдена. Через 24 часа после внесения клеток инвазивные клетки окрашивают с помощью набора для окрашивания Diff-Quick. Значимое различие проверяют двусторонним t-критерием (vs контр.).

Результаты приводятся на фигуре 17. Цисплатин подавляет инвазию при 10 и 30 мкМ. С другой стороны, пеметрексед на оказывает ингибирующего действия на инвазию даже при 30 мкМ.

(2) Ингибирующее действие на инвазию клеток одновременного использования цисплатина и пеметрекседа

Клетки MESО1 или клетки Н2452 (2,5×10⁴ клетки/лунка) вносят в камеру Бойдена. Через один час в камеру добавляют комбинацию цисплатина (0, 3 или 10 мкМ) и пеметрекседа (0, 10 или 30 мкМ) (n=5), с последующим анализом на инвазию с помощью камеры Бойдена. Через 24 часа после внесения клеток инвазивные клетки окрашивают с помощью набора для окрашивания Diff-Quick. Значимое различие проверяют двусторонним t-критерием (vs контр.).

Результаты приводятся на фигуре 18. Цисплатин подавляет инвазию при 10 мкМ, в то время как пеметрексед не усиливает ингибирующее действие цисплатина на инвазию клеток даже при 30 мкМ. Такие результаты показывают, что комбинация пеметрекседа с цисплатином не усиливает ингибирующее действие на инвазию клеток, и цисплптин и цисплатин-пеметрексед эквивалентны в отношении инвазии клеток.

(3) YS110 усиливает ингибирующее инвазию клеток действие цисплатина на клетки MESО1

Клетки MESО1 (2,5×10⁴ клетки/лунка) вносят в камеру Бойдена. Через один час в камеру добавляют комбинацию цисплатина (0, 10 или 20 мкМ) и YS110 (0, 10 или 20 мкг/мл) (n=5), с последующим анализом на инвазию с помощью камеры Бойдена. Через 24 часа после внесения клеток инвазивные клетки окрашивают с помощью набора для окрашивания Diff-Quick. Значимое различие проверяют двусторонним t-критерием (vs контр.). Затем исследуют взаимодействие YS110 с одновременным применением цисплатина и пеметрекседа. Взаимодействие анализируют двухфакторным ANOVA.

Результаты приводятся на фигуре 19. YS110 усиливает ингибирующее действие цисплатина-пеметрекседа на инвазию клеток (фигура 19А). В комбинациях YS110 (10 мкг/мл) + цисплатин (10 мкМ) и YS110 (20 мкг/мл) + цисплатин (10 мкМ) происходит взаимодействие (фигура 19В).

(4) YS110 усиливает ингибирующее инвазию действие цисплатина на клетки Н2452

Клетки Н2452 (2,5×10⁴ клетки/лунка) вносят в камеру Бойдена. Через один час в камеру добавляют комбинацию цисплатина (0, 3 или 10 мкМ) и YS110 (0, 10 или 20 мкг/мл) (n=5), с последующим анализом на инвазию с помощью камеры Бойдена. Через 24 часа после внесения клеток инвазивные клетки окрашивают с помощью набора для окрашивания Diff-Quick. Значимое различие проверяют двусторонним t-критерием (vs контр.). затем исследуют взаимодействие YS110 с одновременным применением цисплатина и пеметрекседа. Взаимодействие анализируют двухфакторным ANOVA.

Результаты приводятся на фигуре 20. YS110 синергетическим образом усиливает ингибирующее действие цисплатина на инвазию клеток (фигура 20А). В комбинациях YS110 (10 мкг/мл) + цисплатин (10 мкМ) и YS110 (20 мкг/мл) + цисплатин (10 мкМ) происходит взаимодействие (фигура 20В).

(Пример 10) Сопутствующее применение гемцитабина и YS110 для клеток мезотелиомы

1. Кривая дозовой зависимости гемцитабина с клеточной линией мезотелиомы

Гемцитабин исследуют на его действие на рост клеточной линии мезотелиомы. Клеточную линию мезотелиомы MESO1, JMN, H2452 или H226 (2×10³ клетки/лунка) вносят в 96-луночный планшет. Через 1 час в планшет добавляют гемцитабин (10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6, 10^-5 или 10^-4 M) (N=6). Через 2 дня проводят анализ с MTT. Значимое различие проверяют двусторонним t-критерием (vs контр.).

Результаты приводятся на фигуре 21. Гемцитабин сильнее подавляет рост JMN и H226.

(2) Действие YS110 и гемцитабина, используемых одновременно, на рост клеток саркоматоидной мезотелиомы MESO1

Клетки MESО1 (2×10³ клетки/лунка) вносят в 96-луночный планшет. Через один час в планшет добавляют гемцитабин (0, 10^-8, 3×10^-8 или 10^-7 M) и YS110 (0, 1, 3 или 10 мкг/мл) в комбинации. В день 2 проводят анализ с MTT. Значимое различие проверяют двусторонним t-критерием (vs контр.). Затем исследуют взаимодействие при одновременном использовании лекарственных средств (n = 6). Взаимодействие между YS110 и гемцитабином, используемыми одновременно, анализируют двухфакторным ANOVA.

Результаты приводятся на фигуре 22. YS110 усиливает ингибирующее рост действие гемцитабина (фигура 22А). В комбинации гемцитабина (10^-8 M) и YS110 (3 мкг/мл) наблюдают взаимодействие (фигура 22В).

(3) Действие YS110 и гемцитабина, используемых одновременно, на рост клеток саркоматоидной мезотелиомы JMN

Клетки JMN (2×10³ клетки/лунка) вносят в 96-луночный планшет. Через один час в планшет добавляют гемцитабин (0, 3×10^-10, 10^-9 или 3×10^-8 M) и YS110 (0, 1, 3 или 10 мкг/мл) в комбинации. В день 2 проводят анализ с MTT. Значимое различие проверяют двусторонним t-критерием (vs контр.). Затем исследуют взаимодействие при одновременном использовании лекарственных средств (n = 6). Взаимодействие между YS110 и гемцитабином, используемыми одновременно, анализируют двухфакторным ANOVA.

Результаты приводятся на фигуре 23. YS110 усиливает ингибирующее рост действие гемцитабина (фигура 23А). В комбинации гемцитабина (3×10^-8 M) и YS110 (3 мкг/мл) и комбинации гемцитабина (3×10^-8 M) и YS110 (10 мкг/мл) наблюдают взаимодействие (фигура 23В).

(4) Действие YS110 и гемцитабина, используемых одновременно, на рост клеток эпителиоидной мезотелиомы Н2452

Клетки Н2452 (2×10³ клетки/лунка) вносят в 96-луночный планшет. Через один час в планшет добавляют гемцитабин (0, 10^-8, 3×10^-8 или 10^-7 M) и YS110 (0, 1, 3 или 10 мкг/мл) в комбинации. В день 2 проводят анализ с MTT. Значимое различие проверяют двусторонним t-критерием (vs контр.). Затем исследуют взаимодействие при одновременном использовании лекарственных средств (n = 6). Взаимодействие между YS110 и гемцитабином, используемыми одновременно, анализируют двухфакторным ANOVA.

Результаты приводятся на фигуре 24. YS110 усиливает ингибирующее рост действие гемцитабина (фигура 24А). В комбинации гемцитабина (10^-7 M) и YS110 (3 мкг/мл) наблюдают взаимодействие (фигура 24В).

(5) Действие YS110 и гемцитабина, используемых одновременно, на рост клеток эпителиоидной мезотелиомы Н226

Клетки Н226 (2×10³ клетки/лунка) вносят в 96-луночный планшет. Через один час в планшет добавляют гемцитабин (0, 10^-8, 3×10^-8 или 10^-7 M) и YS110 (0, 1, 3 или 10 мкг/мл) в комбинации. В день 2 проводят анализ с MTT. Значимое различие проверяют двусторонним t-критерием (vs контр.). Затем исследуют взаимодействие при одновременном использовании лекарственных средств (n = 6). Взаимодействие между YS110 и гемцитабином, используемыми одновременно, анализируют двухфакторным ANOVA.

Результаты приводятся на фигуре 25. YS110 усиливает ингибирующее рост действие гемцитабина (фигура 25А). В комбинации гемцитабина (10^-8 M) и YS110 (3 мкг/мл), комбинации гемцитабина (3×10^-8 M) и YS110 (3 мкг/мл) и комбинации гемцитабина (3×10^-8 M) и YS110 (10 мкг/мл) наблюдают взаимодействие (фигура 25В).

(6) Одновременное применение гемцитабина со стандартной терапией цисплатин-пеметрексед

Клетки MESO1, JMN, H2452 или H226 (2×10³ клетки/лунка) вносят в 96-луночный планшет. Через один час в планшет добавляют 3×10^-8 M или 10^-7 M гемцитабина путем одновременного использования с комбинацией цисплатина (0, 0,1, 0,3 или 1 мкM) и пеметрекседа (0, 0,03, 0,1 или 0,3 мкM) (n = 6). В день 2 проводят анализ с MTT.

Результаты приводятся на фигуре 26. Сопутствующее применение гемцитабина с комбинацией цисплатин-пеметрексед не усиливает ингибирующее рост действие цисплатина-пеметрекседа.

(7) Сопутствующее применение YS110 и гемцитабина in vivo против роста клеток эпителиоидной мезотелиомы Н226

Н226 (3,8×10⁵ клетки/животное) трансплантируют подкожно в спину самкам мышей SCID. День пересадки обозначают как день 0. Мышам дважды (дни 2 и 4) (n=6) вводят интраперитонеально YS110 (10 мг/кг), гемцитабин (20 мг/кг) или YS110 (10 мг/кг) + гемцитабин (20 мг/кг). В день 7 опухоли иссекают, и измеряют массу опухолей. Значимое различие проверяют двусторонним t-критерием (vs контр.). Взаимодействие между YS110 и гемцитабином, используемыми одновременно, анализируют двухфакторным ANOVA.

Результаты приводятся на фигуре 27. Группы с одним YS110, одним гемцитабином и YS110 + гемцитабин показывают ингибирующее действие 34%, 29% и 88%, соответственно, и каждая показывает существенное ингибирующее действие. При одновременном использования YS110 и гемцитабина наблюдают взаимодействие.

(7) Сопутствующее применение YS110 и гемцитабина in vivo против роста клеток саркоматоидной мезотелиомы JMN

Клетки JMN (3×10⁵ клетки/животное) трансплантируют подкожно в спину самкам мышей SCID. День пересадки обозначают как день 0. Мышам дважды (дни 2 и 4) (n=6) вводят интраперитонеально YS110 (10 мг/кг), гемцитабин (10 мг/кг) или YS110 (10 мг/кг) + гемцитабин (10 мг/кг). В день 7 опухоли иссекают, и измеряют массу опухолей. Значимое различие проверяют двусторонним t-критерием (vs контр.). Взаимодействие между YS110 и гемцитабином, используемыми одновременно, анализируют двухфакторным ANOVA.

Результаты приводятся на фигуре 28. Группы с одним YS110, одним гемцитабином и YS110 + гемцитабин показывают ингибирующее действие 34%, 29% и 88%, соответственно, и каждая показывает существенное ингибирующее действие. При одновременном использования YS110 и гемцитабина наблюдают взаимодействие.

(Пример 11) Сопутствующее применение с YS110 in vivo против роста CD26-положительной клеточной линии рака легких

(1) Сопутствующее применение YS110 и цисплатина-пеметрекседа in vivo против роста CD26-положительной клеточной линии рака легких НСС827

Клетки НСС827 (1,8×10⁵ клетки/животное) трансплантируют подкожно в спину самкам мышей SCID. День пересадки обозначают как день 0. В день 1 мышам вводят интраперитонеально один YS110 (10 мг/кг), цисплатин (0,5 мг/кг) + пеметрексед (50 мг/кг) или YS110 (10 мг/кг) + цисплатин (0,5 мг/кг) + пеметрексед (50 мг/кг). В день 4 вводят те же количества тех же лекарственных средств тем же способом, что и в день 1 (n=6). В день 7 опухоли иссекают, и измеряют массу опухолей. Значимое различие проверяют двусторонним t-критерием (vs контр.).

Результаты приводятся на фигуре 29. YS110 усиливает действие цисплатина-пеметрекседа.

(2) Сопутствующее применение YS110 и гефитиниба in vivo против роста CD26-положительной клеточной линии рака легких НСС4006

Клетки НСС4006 (0,5×10⁵ клетки/животное) трансплантируют подкожно в спину самкам мышей SCID. День пересадки обозначают как день 0. Мышам дважды (дни 1 и 4) вводят YS110 (10 мг/кг, интраперитонеальное введение), гефитиниб (100 мг/кг, пероральное введение) или YS110 (10 мг/кг, интраперитонеальное введение) + гефитиниб (100 мг/кг, пероральное введение). В день 7 опухоли иссекают, и измеряют массу опухолей. Значимое различие проверяют двусторонним t-критерием (vs контр.).

Результаты приводятся на фигуре 30. YS110 усиливает действие гефитиниба.

(3) Сопутствующее применение YS110 и гефитиниба in vivo против роста CD26-положительной клеточной линии рака легких НСС827

Клетки НСС827 (0,9×10⁵ клетки/животное) трансплантируют подкожно в спину самкам мышей SCID. День пересадки обозначают как день 0. Мышам дважды (дни 1 и 4) вводят YS110 (10 мг/кг, интраперитонеальное введение), гефитиниб (100 мг/кг, пероральное введение) или YS110 (10 мг/кг, интраперитонеальное введение) + гефитиниб (100 мг/кг, пероральное введение). В день 7 опухоли иссекают, и измеряют массу опухолей. Значимое различие проверяют двусторонним t-критерием (vs контр.).

Результаты приводятся на фигуре 31. YS110 усиливает действие гефитиниба.

(Пример 12) Исследование системой скрининга для определения того, можно ли ожидать проявления синергетического действия химиотерапевтического средства за счет одновременного использования с антителом к CD26

Полагают, что лекарственная терапия проявляет синергетическое действие через совместное действие вовлеченных молекул. Это предполагает возможность того, что можно ожидать, что химиотерапевтическое средство, которое проявляет противораковое действие, действуя совместно с антителом к CD26, покажет синергетическое действие за счет одновременного применения с антителом к CD26. CD26 и CD9 действуют совместно и противодействуют друг другу (Okamoto et al., PLOS One (2014), 9 (1): e86671). Это предполагает возможность того, что действие химиотерапевтического средства, которое действует совместно с CD26, ослабляется CD9. Соответственно, клеточные линии мезотелиомы MESO1 и Н2452, коэкспрессирующие CD26 и CD9, и клеточные линии JMN и Н226, экспрессирующие CD26, но не экспрессирующие CD9, используют в исследовании по установке системы скрининга для определения того, можно ли ожидать проявления синергетического действия химиотерапевтического средства за счет одновременного использования с антителом к CD26.

(1) Сравнение ингибирующего рост действия цисплатина и пеметрекседа с использованием клеточных линий MESO1 и JMN

Ингибирующее рост действие цисплатина (10^-9-10^-4 М) и пеметрекседа (10^-9-10^-4 М) сравнивают с использованием клеточных линий MESO1 и JMN.

Результаты приводятся на фигуре 32. Фигура 32А показывает, что, как результат сравнения ингибирующего рост действия цисплатина, ингибирующее рост действие цисплатина на MESO1 и JMN не различается. Фигура 32В показывает, что, как результат сравнения ингибирующего рост действия пеметрекседа, ингибирующее рост действие пеметрекседа на MESO1 и JMN не различается. Такие результаты предполагают, что возможность синергетического действия не ожидается ни при одновременном применении анти-CD26 антитела и цисплатина, ни при одновременном применении анти-CD26 антитела и пеметрекседа.

(2) Сравнение ингибирующего рост действия гемцитабина с использованием клеточных линий MESO1, Н2452, JMN и Н226

Ингибирующее рост действие гемцитабина (10^-9-10^-4 М) сравнивают с использованием клеточных линий MESO1, Н2452, JMN и Н226.

Результаты приводятся на фигуре 33. Фигура 33А показывает, что, как результат сравнения ингибирующего рост действия гемцитабина на MESO1 и JMN, гемцитабин проявляет существенно более сильное ингибирующее рост действие на JMN, чем на MESO1. Фигура 33В показывает, что, как результат сравнения ингибирующего рост действия гемцитабина на Н2452 и Н226, гемцитабин проявляет существенно более сильное ингибирующее рост действие на Н226, чем на Н2452. При сравнении MESO1 и JMN и Н2452 и Н226 более сильное ингибирующее рост действие гемцитабина наблюдают на JMN и Н226, не экспрессирующие CD9. Такие результаты предполагают, что при одновременном использовании анти-CD26 антитела и гемцитабина можно ожидать синергетическое действие.

Как описано выше, цисплатин и пеметрексед не различаются по ингибирующему рост действию на клетки MESO1 (CD9+) и клетки JMN (CD9-). В экспериментах, описанных выше, подтверждается, что сопутствующее применение анти-CD26 антитела с цисплатином или пеметрекседом имеет аддитивное действие, показывая, что синергетическое действие получают путем одновременного использования с анти-CD26 антителом, когда отсутствует различие в ингибирующем рост действии на клетки MESO1 (CD9+) и клетки JMN (CD9-). С другой стороны, гемцитабин показывает существенное различие в ингибирующем рост действии на MESO1 (CD9+) и JMN (CD9-) и на Н2452 (CD9+) и Н226 (CD9-). В экспериментах, описанных выше, подтверждается, что сопутствующее применение анти-CD26 антитела с гемцитабином имеет синергетическое действие, показывая, что синергетическое действие получают путем одновременного использования с анти-CD26 антителом, когда существует различие в ингибирующем рост действии на клетки CD9+ и клетки CD9-. Такие результаты показывают, что появление синергетического действия путем одновременного использования с антителом к CD26 можно скринировать, используя клетки, экспрессирующие CD26 и CD9-, и клетки, экспрессирующие CD26, но не экспрессирующие CD9- (JMN или Н226).

--->

SEQUENCE LISTING

<110> Y's AC Co., Ltd.

<120> Cancer treatment composition combining anti CD26 antibody and

other cancer drugs

<130> PW16008YS

<150> 2015-179672

<151> 2015-09-11

<160> 29

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 1

Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Asn

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ser Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Lys Leu Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 2

Glu Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Asn

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ser Ser Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Lys Leu Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 3

Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Ser

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ser Ser Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Lys Leu Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Peptide

<400> 4

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asn

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ser Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Lys Leu Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 5

Glu Ile Glu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Ser

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ser Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Lys Leu Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Syntetic peptide

<400> 6

Glu Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Ser

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ser Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Lys Leu Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 7

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 7

Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Asn

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ser Ser Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Lys Leu Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 8

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Gly Val Lys Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Arg Thr Asp Tyr Asp Ala Ala Phe Met

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met

85 90 95

Arg Asn Arg His Asp Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Lys Gln Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Arg Thr Asp Tyr Asp Ala Ala Phe Met

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met

85 90 95

Arg Asn Arg His Asp Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Gly Val Glu Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Arg Thr Asp Tyr Asp Ala Ala Phe Met

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val

85 90 95

Arg Asn Arg His Asp Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 11

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asn Thr Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Arg Thr Asp Tyr Asp Ala Ser Phe Met

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr

85 90 95

Arg Ser Arg His Asp Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Lys Gln Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Ser Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Arg Thr Asp Tyr Asp Ser Ser Phe Met

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr

85 90 95

Arg Asn Arg His Asp Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 13

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Lys Gln Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Arg Thr Asp Tyr Asp Ala Ala Phe Met

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met

85 90 95

Arg Asn Arg His Asp Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Lys Gln Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Arg Thr Asp Tyr Asp Ala Ala Phe Met

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met

85 90 95

Arg Asn Arg His Asp Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 15

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa is Glu or Gln

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> Xaa is Ala or Gly

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa is Gly or Glu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> Xaa is Leu or Val

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa is Val, Lys or Glu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> Xaa is Gly or Glu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17)..(17)

<223> Xaa is Thr or Ser

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (21)..(21)

<223> Xaa is Thr or Ser

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (23)..(23)

<223> Xaa is Thr or Lys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (27)..(27)

<223> Xaa is Phe or Tyr

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (28)..(28)

<223> Xaa is Ser or Thr

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (30)..(30)

<223> Xaa is Thr, Asn or Ser

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (48)..(48)

<223> Xaa is Val or Met

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (54)..(54)

<223> Xaa is Gly or Asp

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (61)..(61)

<223> Xaa is Ala or Ser

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (62)..(62)

<223> Xaa is Ala or Ser

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (71)..(71)

<223> Xaa is Lys or Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (73)..(73)

<223> Xaa is Asn or Thr

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (76)..(76)

<223> Xaa is Ser or Asn

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (78)..(78)

<223> Xaa is Val or Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (82)..(82)

<223> Xaa is Met or Leu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (96)..(96)

<223> Xaa is Val, Met or Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (98)..(98)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Xaa Ser Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Pro Gly Xaa

1 5 10 15

Xaa Ala Arg Leu Xaa Cys Xaa Ala Ser Gly Xaa Xaa Leu Xaa Thr Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Xaa

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Xaa Gly Arg Thr Asp Tyr Asp Xaa Xaa Phe Met

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Xaa Asp Xaa Ser Lys Xaa Thr Xaa Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Xaa Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Xaa

85 90 95

Arg Xaa Arg His Asp Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa is Asp or Glu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa is Leu or Glu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa is Met or Leu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> Xaa is Ala or Val

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14)..(14)

<223> Xaa is Ser or Thr

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (15)..(15)

<223> Xaa is Leu, Pro or Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17)..(17)

<223> Xaa is Asp or Glu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (19)..(19)

<223> Xaa is Val or Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (22)..(22)

<223> Xaa is Thr or Ser

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (24)..(24)

<223> Xaa is Ser or Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (28)..(28)

<223> Xaa is Gly or Asp

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (32)..(32)

<223> Xaa is Ser or Asn

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (55)..(55)

<223> Xaa is His or Gln

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (56)..(56)

<223> Xaa is Ser or Thr

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (60)..(60)

<223> Xaa is Ser, Asp or Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (79)..(79)

<223> Xaa is Glu or Gln

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (80)..(80)

<223> Xaa is Pro or Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (83)..(83)

<223> Xaa is Phe or Val

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (85)..(85)

<223> Xaa is Thr, Ala or Ile

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (92)..(92)

<223> Xaa is Ile or Asn

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (96)..(96)

<223> Xaa is Phe or Leu

<400> 16

Xaa Ile Xaa Xaa Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Xaa Xaa Xaa Gly

1 5 10 15

Xaa Arg Xaa Thr Ile Xaa Cys Xaa Ala Ser Gln Xaa Ile Arg Asn Xaa

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ser Ser Asn Leu Xaa Xaa Gly Val Pro Xaa Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Xaa Xaa

65 70 75 80

Glu Asp Xaa Ala Xaa Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Xaa Lys Leu Pro Xaa

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 17

<211> 465

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic pepitde

<400> 17

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Gly Val Lys Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Thr Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu

35 40 45

Thr Thr Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Arg Thr Asp Tyr Asp Ala

65 70 75 80

Ala Phe Met Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Thr

85 90 95

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Met Arg Asn Arg His Asp Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

115 120 125

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

130 135 140

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

145 150 155 160

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

165 170 175

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

180 185 190

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

195 200 205

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

210 215 220

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

225 230 235 240

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

245 250 255

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

260 265 270

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

275 280 285

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

290 295 300

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

305 310 315 320

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

325 330 335

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

340 345 350

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

355 360 365

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

370 375 380

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

385 390 395 400

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

405 410 415

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

420 425 430

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

435 440 445

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450 455 460

Lys

465

<210> 18

<211> 234

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 18

Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

1 5 10 15

Asp Ala Arg Cys Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Thr Pro Gly Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly

35 40 45

Ile Arg Asn Asn Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

50 55 60

Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ser Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Arg Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile

100 105 110

Lys Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 19

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 19

Tyr Ser Leu Arg Trp Ile Ser Asp His Glu Tyr Leu Tyr

1 5 10

<210> 20

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 20

Leu Glu Tyr Asn Tyr Val Lys Gln Trp Arg His Ser Tyr

1 5 10

<210> 21

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 21

Thr Trp Ser Pro Val Gly His Lys Leu Ala Tyr Val Trp

1 5 10

<210> 22

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 22

Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly Thr Phe Leu Ala Tyr Ala

1 5 10

<210> 23

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 23

Arg Ile Ser Leu Gln Trp Leu Arg Arg Ile Gln Asn Tyr

1 5 10

<210> 24

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 24

Tyr Val Lys Gln Trp Arg His Ser Tyr Thr Ala Ser Tyr

1 5 10

<210> 25

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 25

Glu Glu Glu Val Phe Ser Ala Tyr Ser Ala Leu Trp Trp

1 5 10

<210> 26

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 26

Asp Tyr Ser Ile Ser Pro Asp Gly Gln Phe Ile Leu Leu

1 5 10

<210> 27

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 27

Ser Ile Ser Pro Asp Gly Gln Phe Ile Leu Leu Glu Tyr

1 5 10

<210> 28

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 28

Ile Tyr Val Lys Ile Glu Pro Asn Leu Pro Ser Tyr Arg

1 5 10

<210> 29

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 29

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<---

1. Конъюгат, нацеленный на CD26, включающий анти-CD26 антитело, соединенное с триптолидом, где анти-CD26 антитело является гуманизированным антителом, тяжелая цепь которого состоит из аминокислотной последовательности от положения 20 до положения 465 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17, а легкая цепь состоит из аминокислотной последовательности от положения 21 до положения 234 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18.

2. Конъюгат по п. 1, при этом гуманизированное антитело продуцировано штаммом, обозначенным s604069.YST-pABMC148 (x411), имеющим номер депонирования PTA-7695 в Американской коллекции типовых культур (ATCC).

3. Фармацевтическая композиция для лечения состояния, связанного с экспрессией CD26, включающая эффективное количество конъюгата по любому из пп. 1, 2 в качестве активного ингредиента.

4. Фармацевтическая композиция по п.3 для лечения злокачественной мезотелиомы.

5. Ингибитор роста клеток злокачественной мезотелиомы, состоящий из конъюгата по любому из пп. 1, 2.

6. Агент для лизиса клеток злокачественной мезотелиомы, состоящий из конъюгата по любому из пп. 1, 2.

7. Применение конъюгата по любому из пп. 1, 2 при изготовлении фармацевтической композиции для лечения злокачественной мезотелиомы.