Способы классификации пациентов с солидным раком

Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и касается классификации пациентов, страдающих от солидного рака. Для этого осуществляют количественное определение не менее двух биологических маркеров, характеризующих иммунный ответ пациента на имеющийся у него солидный рак, сравнивают эти величины с распределением величин, полученных для данных маркеров от контрольной группы пациентов, имеющих такой же рак, определяют процентили распределения полученных величин и сравнивают среднеарифметические значения процентиля с предварительно установленным контрольным среднеарифметическим значением процентиля, которые коррелируют с временем выживания или ответом пациента на лечение. Это обеспечивает возможность точного прогнозирования in vitro времени выживания, а также восприимчивости пациента к противоопухолевому лечению. 2 н. и 17 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 пр., 3 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам классификации пациентов, страдающих от солидного рака, в частности, к способам прогнозирования времени выживания пациента, страдающего от солидного рака, и/или к способам оценки восприимчивости пациента, страдающего от солидного рака, к противораковому лечению.

Уровень техники

Как подробно поясняют Galon et al (Cancer classification using the Immunoscore: a worldwide task force. J. Transl. Med., 2012; 10: 205), прогнозирования клинического результата при раке обычно достигают гистопатологической оценкой образцов ткани, полученных во время хирургической резекции первичной опухоли. Традиционное определение стадий опухоли (классификация AJCC/UICC-TNM) суммирует данные по опухолевой массе, присутствию раковых клеток при дренировании и в регионарных лимфоузлах (N) и подтверждению метастаз (М). Однако теперь выяснилось, что клинический результат может существенно изменяться у пациентов в одной и той же стадии. Существующая классификация предоставляет ограниченную прогностическую информацию и не предсказывает реакцию на терапию. В последнее время в литературе упоминается о важности иммунной системы реципиента при контроле за развитием опухоли. Так, данные подтверждают мнение о включении иммунологических биомаркеров как инструмента для предсказания прогноза и реакции на терапию. Накапливающиеся данные, собранные от больших групп раковых заболеваний человека, показывают влияние классификации иммунитета, которая имеет прогностическую важность, которая может усилить значимость классификации AJCC/UICC-TNM. Поэтому необходимо начинать включать «иммунооценку» (Immunoscore) в традиционную классификацию, обеспечивая таким образом необходимый прогностический и потенциально предикативный инструмент. Включение такого параметра как биомаркер при классификации раковых заболеваний в качестве рядовой и прогностической оценки опухолей будет облегчать принятие клинических решений, включая рациональную стратификацию лечения пациентов.

Во многих заявках на патент описываются способы прогнозирования времени выживания пациента, страдающего от солидного рака, и/или способы оценки восприимчивости пациента, страдающего от солидного рака, к противораковому лечению, путем измерения иммунологических биомаркеров. Можно сослаться, например, на WO2015007625, WO2014023706, WO2014009535, WO2013186374, WO2013107907, WO2013107900, WO2012095448, WO2012072750 и WO2007045996. Все эти способы дают хорошие результаты. Как поясняется в обзоре Galon et al. Immunity 39, 2013, 11-26, прогностические и предикативные иммунные отличительные черты в значительной степени перекрываются.

Авторы настоящего изобретения нашли путь для дополнительного повышения точности способов прогнозирования времени выживания пациента, страдающего от солидного рака, и способов оценки восприимчивости пациента, страдающего от солидного рака, к противораковому лечению.

Раскрытие и осуществление изобретения

Настоящее изобретение относится к способу in vitro прогнозирования времени выживания пациента, страдающего от солидного рака, который включает следующие стадии:

а) количественное определение двух или больше биологических маркеров, показывающих статус иммунного ответа указанного пациента против указанного рака, причем каждый биологический маркер, показывающий статус иммунного ответа, определяют количественно в образце опухоли, полученном от указанного пациента;

b) сравнение каждой из величин, полученных на стадии а) для указанных двух или больше биологических маркеров, с распределением величин, полученных для каждого из указанных двух или больше биологических маркеров от контрольной группы пациентов, страдающих от указанного рака;

с) определение для каждой величины, полученной на стадии а) для указанных двух или больше биологических маркеров, процентиля распределения, которому соответствуют величины, полученные на стадии а);

d) вычисление среднеарифметического значения или медианы процентиля; и

е) сравнение среднеарифметического значения или медианы процентиля, полученных на стадии d), с предварительно установленным контрольным среднеарифметическим значением или предварительно установленной контрольной медианой процентиля, которые коррелируют с временем выживания.

Типично время выживания представляет собой выживаемость без болезни (DPS), выживаемость без прогрессирования заболевания (PFS), болезнь-специфическую выживаемость (DSS) или общую выживаемость (OS).

Настоящее изобретение также относится к способу in vitro оценки восприимчивости пациента, страдающего от солидного рака, к противораковому лечению, который включает следующие стадии:

а) количественное определение двух или больше биологических маркеров, показывающих статус иммунного ответа указанного пациента против указанного рака, причем каждый биологический маркер, показывающий статус иммунного ответа, определяют количественно в образце опухоли, полученном от указанного пациента;

b) сравнение каждой из величин, полученных на стадии а) для указанных двух или больше биологических маркеров, с распределением величин, полученных для каждого из указанных двух или больше биологических маркеров от контрольной группы пациентов, страдающих от указанного рака;

с) определение для каждой величины, полученной на стадии а) для указанных двух или больше биологических маркеров, процентиля распределения, которому соответствуют величины, полученные на стадии а);

d) вычисление среднеарифметического значения или медианы процентиля; и

е) сравнение среднеарифметического значения или медианы процентиля, полученных на стадии d), с предварительно установленным контрольным среднеарифметическим значением или предварительно установленной контрольной медианой процентиля, которые коррелируют с реакцией на указанное противораковое лечение.

Термин «среднеарифметическое значение» следует понимать в широком смысле, и он охватывает «классическое» арифметическое среднее образца, которое представляет собой сумму выборочных значений, деленную на число данных в образце, и также взвешенное арифметическое среднее:

.

Веса w_i могут представлять собой меру достоверности влияния на среднее за счет соответственных величин.

Медиана особенно применяется, когда определяют количественно множество (обычно более 5, 10, 15, 200) биологических маркеров.

Способы по изобретению имеют уникальные и многочисленные преимущества.

Указанные способы весьма существенно функционируют и имеют четкую избирательную способность, поскольку биомаркеры, рассматриваемые в этих способах, имеют важные специфические характеристики.

Рассматриваемые биомаркеры являются иммунными биомаркерами. В частности, биомаркеры являются адаптивными иммунными биомаркерами. Одной из их неотъемлемых характеристик является то, что эти иммунные биомаркеры ассоциируются со временем до смерти, со временем до реакции на лечение, с амплитудой реакции на лечение и с длительным периодом времени, в течение которого пациент реагирует на лечение.

Одним из преимуществ способов по изобретению является то, что уровень интенсивности, экспрессии, плотности, количество каждого биомаркера ассоциируется с продолжительностью, с периодом выживаемости, с продолжительностью выживания и продолжительной реакцией на лечение.

Способы по изобретению применимы, поскольку чем выше или ниже уровни биомаркеров, тем длиннее или короче выживание и лучше или хуже реакция на лечение.

Одним из неотъемлемых новых элементов, связанных с высокой эффективностью способов, является то, что способы независимы от клинических данных и последующего врачебного наблюдения за пациентами. Средний процентиль можно вычислить, основываясь на исходных и нормализованных данных биомаркера, независимо от результата для пациентов.

Полный адаптивный иммунный ответ характеризуется набором биомаркеров, которые, когда обогащены совместно, улучшают стратификацию пациентов по категориям длительного выживания и более хорошей реакции на лечение.

Среднее величин процентилей всех биомаркеров, взвешенное для каждого биомаркера, дает возможность весьма точной стратификации пациентов по категориям риска.

Обычно контрольная группа пациентов, страдающих от указанного рака, включает по меньшей мере 100, 200, 300, 400, 500, 1000 или 2000 пациентов.

Обычно способы по изобретению применяют к различным органам, подверженным раку (таким как молочная железа, толстая кишка, прямая кишка, легкие, голова и шея, мочевой пузырь, яичники, предстательная железа), и также к различным типам раковых клеток (аденокарциномы, плоскоклеточного рака, крупноклеточного рака, меланомы и т.д.).

Типично пациент, подвергаемый вышеуказанному способу, может страдать от солидного рака, выбранного из группы, включающей адренальнокортикальный рак, рак ануса, рак желчных протоков (например, перихилярный рак, рак внепеченочных желчных протоков, рак внутрипеченочных желчных протоков), рак мочевого пузыря, рак кости (например, остеобластому, остеохондрому, гемангиому, хондромиксоидную фиброму, остеосаркому, хондросаркому, фибросаркому, злокачественную фиброзную гистицитому, гигантоклеточную опухоль кости, хордому, множественную миелому), рак головного мозга и центральной нервной системы (например, менингиому, астоцитому, олигодендроглиому, эпендимому, глиомы, медуллобластому, ганглиоглиому, шванному, герминому, краниофарингиому), рак молочной железы (например, протоковую карциному in situ молочной железы, инфильтрующую протоковую карциному, инфильтрующую дольковую карциному, дольковую карциному in situ, гинекомастию), рак шейки матки, колоректальный рак, рак эндометрия (например, эндометриальную аденокарциному, серозную папиллярную аденокарциному, светлоклеточную аденокарциному), рак пищевода, рак желчного пузыря (слизеобразующую аденокарциному, мелкоклеточную карциному), гастроинтестинальные карциноидные опухоли (например, хориокарциному, хорионаденому (пузырный занос)), саркому Капоши, рак почки (например, почечно-клеточный рак), рак гортани и гипофарингеальный рак, рак печени (например, гемангиому, аденому печени, очаговую узелковую гиперплазию, печеночно-клеточный рак), рак легкого (например, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого), мезотелиому, плазмоцитому, рак полости носа и околоносовых пазух (например, эстезионейробластому, срединную гранулему), рак носоглотки, нейробластому, рак ротовой полости и ротоглотки, рак яичников, панкреатический рак, рак полового члена, рак гипофиза, рак предстательный железы, ретинобластому, рабдомиосаркому (например, эмбриональную рабдомиосаркому, альвеолярную рабдомиосаркому, плеоморфную рабдомиосаркому), рак слюнных желез, рак кожи (например, меланому, немеланомный рак кожи), рак вилочковой железы, рак щитовидной железы (например, фолликулярный рак, анапластический рак, недифференцированный рак, медуллярную карциному щитовидной железы), рак влагалища, рак вульвы и рак матки (например, лейомиосаркому).

В предпочтительном воплощении рак представляет собой колоректальный рак.

При использовании в настоящем описании термин «образец опухолевой ткани» обозначает образец любой опухолевой ткани, полученный от пациента. Указанный образец ткани получают с целью оценки in vitro. В некоторых воплощениях образец опухоли может быть результатом биопсии, выполненной в первичной опухоли пациента или выполненной в метастазе пациента на расстоянии от первичной опухоли пациента. Например, на эндоскопическую биопсию, выполненную в кишечнике пациента, влияет колоректальный рак. Типично образец опухолевой ткани фиксируют в формалине и заливают жестким фиксатором, таким как парафин (воск) или эпоксидная смола, который помещают в форму и позднее отверждают и получают блок, который сразу режут. Затем с использованием микротома можно получить тонкие ломтики материала, поместить на предметное стекло и представить, например, для иммуногистохимии (с использованием автоматического устройства IHC, такого как BenchMark® XT, для получения окрашенных слайдов). Образец опухолевой ткани можно использовать в микрочипах, называемых тканевыми микрочипами (TMA). TMA состоит из парафиновых блоков, в которых до 1000 отдельных тканевых пятен собраны в матрицу, которая допускает несколько гистологических анализов. Такая технология дает возможность быстрой визуализации молекулярных мишеней в образцах ткани за один раз на уровне ДНК, РНК или белка. Технология TMA описана в WO2004000992, US8068988, Olli et al., 2001, Human Molecular Genetics, Tzankov et al., 2005, Elsevier; Kononen et al., 1198; Nature Medicine.

В некоторых воплощениях образец опухолевой ткани заключает в себе (i) общую первичную опухоль (как целое), (ii) образец ткани из центра опухоли, (iii) образец ткани из ткани, непосредственно окружающей опухоль, которую более специфически можно назвать «инвазивным краем» опухоли, (iv) кусочки лимфоидной ткани в непосредственной близости от опухоли, (v) лимфоузлы, расположенные в самой тесной близости от опухоли, (vi) образец опухолевой ткани, взятый перед операцией (например, для наблюдения за пациентом после лечения), и (vi) образец из отдаленного метастаза.

При использовании в настоящем описании термин «инвазивный край» имеет свое обычное значение в технике и относится к клеточной среде, окружающей опухоль. В некоторых воплощениях образец опухолевой ткани, независимо от того, получен ли он из центра опухоли, из инвазивного края опухоли или из ближайших лимфоузлов, включает кусочки или слои ткани, которая извлечена из центра опухоли, из инвазивного края, окружающего опухоль, включая ткань после хирургической резекции опухоли или после взятия образца ткани для биопсии, для дополнительного количественного определения одного или нескольких биологических маркеров, особенно методами гистологии или иммуногистохимии, методами цитометрии и методами анализа экспрессии генов или белка, включая геномный и протеомный анализ. Конечно, образец опухолевой ткани можно подвергнуть различным хорошо известным методам подготовки и хранения (например, методам фиксации, хранения, замораживания и т.д.). Образец может быть свежим, замороженным, фиксированным (например, фиксированным в формалине) или залитым (например, залитым парафином). В некоторых воплощениях, когда выполняют количественное определение числа дренирующих опухоль лимфатических узлов в резецированной опухоли, образец опухолевой ткани получают из указанной резецированной опухоли, и он включает центр опухоли и, необязательно, инвазивный край опухоли. В указанных воплощениях количественное определение маркера иммунного адаптивного ответа обычно выполняют методами иммуногистохимии (ИГХ), как описано далее. В некоторых воплощениях, когда выполняют количественное определение числа дренирующих опухоль лимфатических узлов, определение проводят по изображениям, образец опухолевой ткани получают из биопсии. В указанных воплощениях количественное определение маркера иммунного адаптивного ответа обычно выполняют путем определения уровня экспрессии по меньшей мере одного гена.

Как правило, образец опухоли можно выбрать из группы, включающей (i) общую первичную опухоль (как целое), (ii) образец ткани из центра опухоли, (iii) образец ткани из ткани, непосредственно окружающей опухоль, которую более специфически можно назвать «инвазивным краем» опухоли, (iv) лимфоузлы, расположенные в самой тесной близости от опухоли или третичной структуре, вызванной опухолью, (v) биопсию опухоли, выполненную в любое время и обычно перед операцией, и (vi) образец из отдаленного метастаза.

В предпочтительном воплощении два или больше биологических маркеров определяют количественно в центре опухоли и/или в инвазивном крае опухоли.

Образец может быть свежим, замороженным, фиксированным (например, фиксированным в формалине) или залитым (например, залитым парафином). В предпочтительном воплощении образец опухоли получают из биопсии, выполненной в опухоли пациента.

Примером является эндоскопическая биопсия, выполняемая в кишечнике пациента, страдающего от колоректального рака или с подозрением на колоректальный рак.

Как предполагается в настоящем описании, «биологический маркер» состоит из любого детектируемого, поддающегося измерению и количественному определению параметра, который является показателем статуса иммунного ответа больного раком против опухоли.

Биологические маркеры также включают наличие ряда или плотность клеток из иммунной системы в месте опухоли.

Биологические маркеры также включают наличие или количество специфических белков, продуцируемых клетками иммунной системы в месте опухоли.

Биологические маркеры также включают наличие или количество любого биологического материала, который является показателем уровня экспрессии генов, имеющих отношение к появлению специфического иммунного ответа реципиента в месте опухоли. Таким образом, биологические маркеры включают в месте опухоли наличие или количество мессенджерной РНК (мРНК), транскрибированной из геномной ДНК, кодирующей белки, которые специфически продуцируются клетками из иммунной системы.

Таким образом, биологические маркеры включают поверхностные антигены, которые специфически экспрессируются клетками из иммунной системы, в том числе, В-лимфоцитами, Т-лимфоцитами, моноцитами/макрофагами, дендритными клетками, NK клетками, NKT клетками и NK-DC клетками, которые восполняются в опухолевой ткани или в непосредственной близости от нее, в том числе, в инвазивном крае опухоли и в ближайших лимфоузлах, или, с другой стороны, мРНК, кодирующую указанные поверхностные антигены.

Как пояснение, поверхностные антигены, представляющие интерес, используемые в качестве биологических маркеров, включают CD3, CD4, CD8 и CD45RO, которые экспрессируются T-клетками или субпопуляциями T-клеток.

Например, если в качестве биологического маркера используют экспрессию антигена CD3 или экспрессию его мРНК, количественное определение этого биологического маркера на стадии а) способа согласно изобретению является показателем уровня адаптивного иммунного ответа пациента, включающего все Т-лимфоциты и NKT клетки.

Например, если в качестве биологического маркера используют экспрессию антигена CD8 или экспрессию его мРНК, количественное определение этого биологического маркера на стадии а) способа согласно изобретению является показателем уровня адаптивного иммунного ответа пациента, включающего цитотоксические Т-лимфоциты.

Например, если в качестве биологического маркера используют экспрессию антигена CD45RO или экспрессию его мРНК, количественное определение этого биологического маркера на стадии а) способа согласно изобретению является показателем уровня адаптивного иммунного ответа пациента, включающего Т-лимфоциты памяти или эффекторные Т-лимфоциты памяти.

Еще как пример, белки, используемые в качестве биологических маркеров, также включают цитолитические белки, специфично продуцировнные клетками из иммунной системы, подобные перфорину, гранулизину и также гранзиму-В.

Во многих заявках на патент описывается большое число биологических маркеров, показывающих статус иммунного ответа, которые можно использовать в способах по изобретению.

Типично можно использовать биологические маркеры, показывающие статус иммунного ответа, описанные в WO2015007625, WO2014023706, WO2014009535, WO2013186374, WO2013107907, WO2013107900, WO2012095448, WO2012072750 и WO2007045996 (все включены в настоящее описание в качестве ссылок).

Типично можно определить количественно комбинацию из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 и 50 различных биологических маркеров, предпочтительно комбинацию из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 биологических маркеров и предпочтительнее комбинацию из 2, 3, 4, 5 или 6 биологических маркеров.

В предпочтительном воплощении биологические маркеры, показывающие статус иммунного ответа, являются маркерами, описанными в WO2007045996.

Типично биологические маркеры, которые можно использовать, являются клеточной плотностью клеток из иммунной системы.

В предпочтительном воплощении два или больше биологических маркеров включают плотность клеток CD3+, плотность клеток CD8+, плотность клеток CD45RO+, плотность клеток GZM-B+ и/или плотность В-клеток.

В наиболее предпочтительном воплощении два или больше биологических маркеров включают плотность клеток CD3+ и плотность клеток CD8+, плотность клеток CD3+ и плотность клеток CD45RO+, плотность клеток CD3+ и плотность клеток GZM-B+, плотность клеток CD8+ и плотность клеток CD45RO+, плотность клеток CD8+ и плотность клеток GZM-B+ или плотность клеток CD45RO+ и плотность клеток GZM-B+.

Также можно измерить плотность В-клеток (см. WO2013107900 и WO2013107907).

Также можно измерить плотность DC-клеток (см. WO2013107907).

В предпочтительном воплощении плотность клеток из иммунной системы определяют количественно в центре опухоли и/или в инвазивном крае опухоли.

В наиболее предпочтительном воплощении два или больше биологических маркеров включают плотность клеток CD3+ в центре опухоли, плотность клеток CD8+ в центре опухоли, плотность клеток CD3+ в инвазивном крае опухоли и плотность клеток CD8+ в инвазивном крае опухоли.

Плотность можно измерить в «холодном пятне», т.е., в участках образца опухоли, где плотность наименьшая, или в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 «холодных пятнах», соответствующих 2-10 участкам с самой низкой плотностью.

Плотность также можно измерить в «горячем пятне», т.е., в участках образца опухоли, где плотность наибольшая, или в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 «горячих пятнах», соответствующих 2-10 участкам с самой высокой плотностью.

Также можно определить среднюю плотность во всем образце опухоли.

Типично для количественного определения иммунных клеток в образце опухоли можно использовать метод, раскрытый в WO2013186374.

При использовании в настоящем описании термин «маркер» включает любой детектируемый, поддающийся измерению или количественному определению параметр, который является показателем статуса адаптивного иммунного ответа субъекта. Маркер становится «биологическим маркером» с целью осуществления способа по настоящему изобретению, когда обнаруживается хорошая статистическая корреляция между (i) повышением или снижением количественного значения указанного маркера и (ii) временем выживания, фактически наблюдаемым среди пациентов. Для вычисления коэффициента корреляции для каждого испытываемого маркера и, таким образом, определения статистической значимости указанного маркера как «биологического маркера» согласно изобретению можно использовать любой статистический метод, известный специалистам в данной области техники. Как пример, можно использовать статистические методы с использованием кривых Каплана-Мейера и/или одномерный анализ с использованием логрангового критерия и/или модели Кокса пропорциональных рисков, как показано в настоящем описании в примерах. Любой маркер, для которого определено Р-значение меньше 0,05, и даже предпочтительно меньше 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6 или 10^-7 (согласно одномерному и многомерному анализу (например, логранговому критерию или критерию Кокса, соответственно)), составляет «биологический маркер», применимый в способе прогнозирования рака по изобретению. В некоторых воплощениях маркер включает или наличие ряда или плотность клеток из иммунной системы. В некоторых воплощениях маркер включает наличие или количество белков, специфически продуцируемых клетками из иммунной системы. В некоторых воплощениях маркер включает наличие или количество любого биологического материала, который является показателем уровня генов, связанных с появлением специфического иммунного ответа у реципиента. Так, в некоторых воплощениях маркер включает наличие или количество мессенджерной РНК (мРНК), транскрибированной из геномной ДНК, кодирующей белки, которые специфически продуцируются клетками из иммунной системы. В некоторых воплощениях маркер включает поверхностные антигены, которые специфически экспрессируются клетками из иммунной системы, в том числе, В-лимфоцитами, Т-лимфоцитами, моноцитами/макрофагами, дендритными клетками, NK клетками, NKT клетками и NK-DC клетками, или, с другой стороны, мРНК, кодирующую указанные поверхностные антигены. Когда способ по настоящему изобретению выполняют с более чем одним биологическим маркером, число различных биологических маркеров, которые определяют количественно на стадии а), обычно составляет менее 100 различных маркеров и в большинстве воплощений менее 50 различных маркеров. Число различных биологических маркеров, которое необходимо для получения точного и надежного прогноза с использованием способа по настоящему изобретению, может значительно изменяться согласно типу метода количественного определения. Как пример, высокая статистическая значимость может быть найдена с комбинацией небольшого числа биологических маркеров, когда способ по настоящему изобретению выполняют in situ иммуногистохимической детекцией белковых маркеров, представляющих интерес, в частности, когда определение количества указанных маркеров выполняют отдельно как в центре опухоли (СТ), так и в инвазивном крае (IM). Как пример, высокую статистическую значимость получают только с одним маркером или с комбинацией двух маркеров, как раскрыто в примере. Как другой пример, высокую статистическую значимость также обнаруживают с небольшим числом биологических маркеров, когда способ по настоящему изобретению выполняют путем анализа экспрессии генов генов-маркеров, представляющих интерес. Без желания привязываться к какой-либо определенной теории, авторы изобретения полагают, что высокая статистическая значимость (значение Р меньше 10^-3) достигается, когда способ по настоящему изобретению выполняют, используя для количественного определения биологических маркеров анализ экспрессии генов, и используя комбинацию из десяти различных биологических маркеров и предпочтительнее, комбинацию из пятнадцати различных биологических маркеров и наиболее предпочтительно из двадцати или больше различных биологических маркеров. В некоторых воплощениях определяют уровень 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 маркеров. В настоящем описании название каждого из различных биологических маркеров, представляющих интерес, соотносится с общепризнанным названием соответствующего гена, которое находится в общепризнанных базах данных последовательностей генов и последовательностей белков, в том числе, в базе данных от HUGO Gene Nomenclature Committee. В настоящем описании название каждого из различных биологических маркеров, представляющих интерес, также может соотносится с общепризнанным названием соответствующего гена, которое находится в общепризнанной базе данных последовательностей генов и последовательностей белков Genbank. Через эти общепризнанные базы данных последовательностей специалист в данной области техники может восстановить нуклеотидные и аминокислотные последовательности, соответствующие каждому биологическому маркеру, представляющему интерес, описанному в настоящем описании.

Биологические маркеры, показывающие статус иммунного ответа, могут включать уровень экспрессии одного или нескольких генов или соответствующие белки, перечисленные в таблице 9 в WO2007045996, которые представляют собой 18s, ACE, ACTB, AGTR1, AGTR2, APC, APOA1, ARF1, AXIN1, BAX, BCL2, BCL2L1, CXCR5, BMP2, BRCA1, BTLA, C3, CASP3, CASP9, CCL1, CCL11, CCL13, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL5, CCL7, CCL8, CCNB1, CCND1, CCNE1, CCR1, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCRL2, CD154, CD19, CD1a, CD2, CD226, CD244, PDCD1LG1, CD28, CD34, CD36, CD38, CD3E, CD3G, CD3Z, CD4, CD40LG, CD5, CD54, CD6, CD68, CD69, CLIP, CD80, CD83, SLAMF5, CD86, CD8A, CDH1, CDH7, CDK2, CDK4, CDKN1A, CDKN1B, CDKN2A, CDKN2B, CEACAM1, COL4A5, CREBBP, CRLF2, CSF1, CSF2, CSF3, CTLA4, CTNNB1, CTSC, CX3CL1, CX3CR1, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL9, CXCR3, CXCR4, CXCR6, CYP1A2, CYP7A1, DCC, DCN, DEFA6, DICER1, DKK1, Dok-1, Dok-2, DOK6, DVL1, E2F4, EBI3, ECE1, ECGF1, EDN1, EGF, EGFR, EIF4E, CD105, ENPEP, ERBB2, EREG, FCGR3A,, CGR3B, FN1, FOXP3, FYN, FZD1, GAPD, GLI2, GNLY, GOLPH4, GRB2, GSK3B, GSTP1, GUSB, GZMA, GZMB, GZMH, GZMK, HLA-B, HLA-C, HLA-, MA, HLA-DMB, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DPA1, HLA-DQA2, HLA-DRA, HLX1, HMOX1, HRAS, HSPB3, HUWE1, ICAM1, ICAM-2, ICOS, ID1, ifna1, ifna17, ifna2, ifna5, ifna6, ifna8, IFNAR1, IFNAR2, IFNG, IFNGR1, IFNGR2, IGF1, IHH, IKBKB, IL10, IL12A, IL12B, IL12RB1, IL12RB2, IL13, IL13RA2, IL15, IL15RA, IL17, IL17R, IL17RB, IL18, IL1A, IL1B, IL1R1, IL2, IL21, IL21R, IL23A, IL23R, IL24, IL27, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL31RA, IL4, IL4RA, IL5, IL6, IL7, IL7RA, IL8, CXCR1, CXCR2, IL9, IL9R, IRF1, ISGF3G, ITGA4, ITGA7, интегрин альфа E (антиген CD103, лимфоцит слизистой человека, антиген 1; альфа-полипептид), ген hCG33203, ITGB3, JAK2, JAK3, KLRB1, KLRC4, KLRF1, KLRG1, KRAS, LAG3, LAIR2, LEF1, LGALS9, LILRB3, LRP2, LTA, SLAMF3, MADCAM1, MADH3, MADH7,MAF, MAP2K1, MDM2, MICA, MICB, MKI67, MMP12, MMP9, MTA1, MTSS1, MYC, MYD88, MYH6, NCAM1, NFATC1, NKG7, NLK, NOS2A, P2X7, PDCD1, PECAM-, CXCL4, PGK1, PIAS1, PIAS2, PIAS3, PIAS4, PLAT, PML, PP1A, CXCL7, PPP2CA, PRF1, PROM1, PSMB5, PTCH, PTGS2, PTP4A3, PTPN6, PTPRC, RAB23, RAC/RHO, RAC2, RAF, RB1, RBL1, REN, Drosha, SELE, SELL, SELP, SERPINE1, SFRP1, SIRP бета 1, SKI, SLAMF1, SLAMF6, SLAMF7, SLAMF8, SMAD2, SMAD4, SMO, SMOH, SMURF1, SOCS1, SOCS2, SOCS3, SOCS4, SOCS5, SOCS6, SOCS7, SOD1, SOD2, SOD3, SOS1, SOX17, CD43, ST14, STAM, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, STAT6, STK36, TAP1, TAP2, TBX21, TCF7, TERT, TFRC, TGFA, TGFB1, TGFBR1, TGFBR2, TIM-3, TLR1, TLR10, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TNF, TNFRSF10A, TNFRSF11A, TNFRSF18, TNFRSF1A, TNFRSF1B, OX-40, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFSF10, TNFSF6, TOB1, TP53, TSLP, VCAM1, VEGF, WIF1, WNT1, WNT4, XCL1, XCR1, ZAP70 и ZIC2.

В настоящем описании название каждого из генов, представляющих интерес, соотносится с общепризнанным названием соответствующего гена, которое находится в общепризнанных базах данных последовательностей генов и последовательностей белков, в том числе, в базе данных от HUGO Gene Nomenclature Committee. В настоящем описании название каждого из генов, представляющих интерес, также может соотносится с общепризнанным названием соответствующего гена, которое находится в общепризнанной базе данных последовательностей Genbank. Через эти общепризнанные базы данных последовательностей специалист в данной области техники может восстановить нуклеиновую кислоту для каждого гена, представляющего интерес, описанного в настоящем описании.

В предпочтительном воплощении биологические маркеры, показывающие статус иммунного ответа, являются маркерами, описанными в WO2014023706 (включенной в настоящее описание в качестве ссылки).

По этому воплощению в способе по изобретению оценивают уровень экспрессии EL₁ отдельного гена, характеризующего адаптивный иммунный ответ человека, и отдельного гена, характеризующего иммунносупрессорный ответ человека (пару генов). Предпочтительно используют один-три гена каждого вида и предпочтительнее один или два гена каждого. Ограниченное число генов каждого вида обеспечивает хорошие и надежные результаты и является простым для осуществления. В особенности, одно контрольное значение является достаточным для каждого из двух генов. Чем выше число генов, тем более усложненным является контрольное значение. Примеры определения контрольных значений приводятся в настоящем описании далее.

Использование более одного генов или двух пар генов является более трудным для осуществления и более дорогостоящим и затратным по времени, но однако дает другие преимущества. Например, если оценка уровня экспрессии одного гена является ошибочной, общий результат компенсируется за счет резерва других генов того же вида (адаптивного иммунного ответа или иммунносупрессорного ответа человека).

При использовании в настоящем описании выражение «ген, характеризующий адаптивный иммунный ответ» относится к любому гену, который экспрессируется клеткой, которая является действующим элементом адаптивного иммунного ответа в опухоли, или которая вносит вклад в урегулирование адаптивного иммунного ответа в опухоли. Адаптивный иммунный ответ, также называемый «приобретенным иммунным ответом», включает антигензависимую стимуляцию подтипов Т-клеток, активацию В-клеток и продуцирование антител. Например, клетки адаптивного иммунного ответа включают, но без ограничения, цитотоксические Т-клетки, Т-клетки памяти, клетки Th1 и Th2, активированные макрофаги и активированные дендритные клетки, NK клетки и NKT клетки. Соответственно, ген, характеризующий адаптивный иммунный ответ, обычно можно выбрать из кластера совместно модулированных генов для адаптивного иммунитета Th1, для цитотоксической реакции или для анамнестической реакции, и он может кодировать поверхностный маркер Т-клетки, интерлейкин (или рецептор интерлейкина) или хемокин (или хемокиновый рецептор).

В отдельном воплощении ген, характеризующий адаптивный иммунный ответ, выбирают из группы, включающей

- семейство хемокинов и хемокиновых рецепторов, включающее CXCL13, CXCL9, CCL5, CCR2, CXCL10, CXCL11, CXCR3, CCL2 и CX3CL1,

- семейство цитокинов, включающее IL15,

- семейство TH1, включающее IFNG, IRF1, STAT1, STAT4 и TBX21

- семейство мембранных рецепторов лимфоцитов, включающее ITGAE, CD3D, CD3E, CD3G, CD8A, CD247, CD69 и ICOS,

- семейство цитотоксичных молекул, включающее GNLY, GZMH, GZMA, GZMB, GZMK, GZMM и PRF1,

и киназу LTK.

Такие гены или соответствующие белки как предпочтительные, поскольку они обеспечивают наилучшие результаты по реакции пациента на лечение, как видно далее из таблицы 5, приводятся в таблице 1.

Таблица 1

CCL5

CCR2

CD247

CD3E

CD3G

CD8A

CX3CL1

CXCL11

GZMA

GZMB

GZMH

GZMK

IFNG

IL15

IRF1

ITGAE

PRF1

STAT1

TBX21

При использовании в настоящем описании выражение «ген, характеризующий иммунносупрессорный ответ» относится к любому гену, который экспрессируется клеткой, которая является действующим элементом иммунносупрессорного ответа в опухоли, или которая вносит вклад в урегулирование иммунносупрессорного ответа в опухоли. Например, иммунносупрессорный ответ включает

- совместное ингибирование антигензависимой стимуляции подтипов С-клеток: гены CD276, CTLA4, PDCD1, CD274, TIM-3 или VTCN1 (B7H4),

- инактивацию макрофагов и дендритных клеток и инактивацию NK клеток: гены TSLP, CD1A или VEGFA

- экспрессию маркера раковых стволовых клеток, дифференцировку и/или онкогенез: PROM1, IHH.

- экспрессию иммунносупрессорных белков, продуцируемых в среде, окружающей опухоль: гены PF4, REN, VEGFA.

Например, клетки иммунносупрессорного ответа включают незрелые дендритные клетки (CD1A), регуляторные T-клетки (клетки Treg) и клетки Th17, экспрессирующие ген IL17A.

Соответственно, ген, характеризующий адаптивный иммунный ответ, обычно можно выбрать из группы совместно модулированных генов адаптивного иммунного ответа, в то время как гены супрессии иммунного ответа могут быть представлены инактивацией иммунных клеток (например, дендритных клеток) и могут вносить вклад в индукцию иммунносупрессорного ответа.

В отдельном воплощении гены или соответствующие белки, характеризующие иммунносупрессорный ответ, выбирают из группы, включающей гены, приведенные в таблице 2 ниже.

Таблица 2

CD274

CTLA4

IHH

IL17A

PDCD1

PF4

PROM1

REN

TIM-3

TSLP

VEGFA

Указанные гены являются предпочтительными, поскольку они обеспечивают наилучшие результаты по реакции пациента на лечение.

В предпочтительных условиях для осуществления изобретения ген, характеризующий адаптивный иммунный ответ, выбирают из группы, включающей GNLY, CXCL13, CX3CL1, CXCL9, ITGAE, CCL5, GZMH, IFNG, CCR2, CD3D, CD3E, CD3G, CD8A, CXCL10, CXCL11, GZMA, GZMB, GZMK, GZMM, IL15, IRF1, LTK, PRF1, STAT1, CD69, CD247, ICOS, CXCR3, STAT4, CCL2 и TBX21, и ген, характеризующий иммуносупрессорный ответ, выбирают из группы, включающей PF4, REN, VEGFA, TSLP, IL17A, PROM1, IHH, CD1A, CTLA4, PDCD1, CD276, CD274, TIM-3 и VTCN1 (B7H4).

Поскольку некоторые гены находят важными чаще, когда комбинируют один адаптивный ген и один иммуносупрессорный ген, наиболее предпочтительными генами являются

- гены, характеризующие адаптивный иммунный ответ: CD3G, CD8A, CCR2 и GZMA;

- гены, характеризующие иммуносупрессорный ответ: REN, IL17A, CTLA4 и PDCD1.

При других предпочтительных условиях осуществления изобретения ген, характеризующий адаптивный иммунный ответ, и ген, характеризующий иммуносупрессорный ответ, выбирают, соответственно, из групп, включающих гены из таблиц 1 и 2, приведенных выше.

Предпочтительными комбинациями двух пар генов (всего 4 генов) являются

- CCR2, CD3G, IL17A и REN и

- CD8A, CCR2, REN и PDCD1.

Точный выбор генов, отбираемых для применения в настоящем способе, может зависеть от типа лечения, предполагаемого для пациента. Например, гены, выбранные из группы, включающей CX3CL1 IL15, CD247, CD3G, CD8A, PRF1, CCL5 и TBX21 для иммуносупрессорного ответа, предпочтительно, CX3CL1 и IL15, и ген CTLA4 для адаптивного иммунного ответа, будут предпочтительными, когда для пациента предполагается лечение с использованием лекарственного средства, такого как моноклональные антитела, действующие путем активации иммунной системы, такие как ипилимумаб, также известный как MDX-010 или MDX-101, имеющийся на рынке как Yervoy®.

Гены, выбранные из группы, включающей IL15 и GZMA для адаптивного иммунного ответа и ген VEGFA для иммуносупрессорного ответа, будут предпочтительными, когда для пациента предполагается лечение, такое как антитела, которые ингибируют сосудистый эндотелиальный фактор роста А (VEGF-A), такие как бевацизумаб, имеющися на рынке как авастин®,

Подобные соображения применяют, например, для пары генов GZMA - PDCD1 (также обозначаемого как CD279), когда для пациента предполагается лечение, такое как антитела, которые таргетируют PD-1, такие как BMS-936558.

В предпочтительном воплощении биологическими маркерами, показывающими статус иммунного ответа, являются маркеры, описанные в WO2014009535 (включенной в настоящее описание в качестве ссылки).

Биологические маркеры, показывающие статус иммунного ответа, могут включать уровень экспрессии одного или нескольких генов из группы, включающей CCR2, CD3D, CD3E, CD3G, CD8A, CXCL10, CXCL11, GZMA, GZMB, GZMK, GZMM, IL15, IRF1, PRF1, STAT1, CD69, ICOS, CXCR3, STAT4, CCL2 и TBX21.

В предпочтительном воплощении биологическими маркерами, показывающими статус иммунного ответа, являются маркеры, описанные в WO2012095448 (включенной в настоящее описание в качестве ссылки).

Биологические маркеры, показывающие статус иммунного ответа, могут включать уровень экспрессии одного или нескольких генов из группы, включающей GZMH, IFNG, CXCL13, GNLY, LAG3, ITGAE, CCL5, CXCL9, PF4, IL17A, TSLP, REN, IHH, PROM1 и VEGFA.

В предпочтительном воплощении биологическими маркерами, показывающими статус иммунного ответа, являются маркеры, описанные в WO2012072750 (включенной в настоящее описание в качестве ссылки).

Биологические маркеры, показывающие статус иммунного ответа, могут включать уровень экспрессии кластера мРНК, включающего miR.609, miR.518c, miR.520f, miR.220a, miR.362, miR.29a, miR.660, miR.603, miR.558, miR519b, miR.494, miR.130a или miR.639.

Общие способы количественного определения биологических маркеров

Любой из способов, известных специалисту в данной области техники для количественного определения биологического маркера типов клеток, типа белка или типа нуклеиновой кислоты, можно использовать для выполнения способа прогнозирования при раке по изобретению. Таким образом, можно легко применить любые стандартные и нестандартные (появляющиеся) методы, хорошо известные в технике для детекции и количественного определения белка или нуклеиновой кислоты в образце.

Экспрессию биологического маркера по изобретению можно оценить любым из многих хорошо известных способов детекции экспрессии транскрибированной нуклеиновой кислоты или белка. Неограничивающие примеры таких способов включают иммунологические способы детекции секретированных белков, белков клеточной поверхности, цитоплазматических или нуклеарных белков, методы очистки белков, анализы функционирования или активности белков, методы гибридизации нуклеиновых кислот, методы обратной транскрипции нуклеиновых кислот и методы амплификации нуклеиновых кислот.

В одном предпочтительном воплощении экспрессию маркера оценивают с использованием антитела (например, радиомеченного, меченного хромофором антитела, антитела с полимерным каркасом или меченного ферментом), производного антитела (например, антитела, конъюгированного с субстратом или с белком или лигандом пары белок-лиганд {например, биотин-стрептавидин}) или фрагмента антитела (например, одноцепочечного антитела, изолированного гипервариабельного домена антитела и т.д.), которые специфически связываются с маркерным белком или его фрагментом, включая маркерный белок, который подвергся полностью или частично его нормальной посттрансляционной модификации.

В некоторых воплощениях биологический маркер или набор биологических маркеров можно определить количественно с помощью любого из методов иммуногистохимии, известных в технике.

Обычно для дальнейшего анализа один тонкий срез опухоли сначала инкубируют с меченными антителами, направленными против одного биологического маркера, представляющего интерес. После промывки меченные антитела, которые связаны с указанным биологическим маркером, представляющим интерес, обнаруживают соответствующим методом, в зависимости от вида метки, которую несет антитело, например. радиоактивной, флуоресцетной или ферментной метки. Могут быть выполнены несколько мечений одновременно.

Иммуногистохимия обычно включает следующие стадии: i) фиксирование образца опухолевой ткани в формалине, ii) заливку указанного образца опухолевой ткани парафином, iii) нарезание указанного образца опухолевой ткани на срезы для окрашивания, iv) инкубацию указанных срезов с партнером по связыванию, специфическим для белка иммунной контрольной точки, представляющего интерес, v) ополаскивание указанных срезов, vi) инкубацию указанного среза с вторичным антителом, обычно биотинилированным, и vi) обнаружение комплекса антиген-антитело обычно с помощью авидин-биотин-пероксидазного комплекса. Соответственно, образец опухолевой ткани сначала инкубируют с партнерами по связыванию, имеющими белок иммунной контрольной точки, представляющий интерес. После промывки меченные антитела, которые связаны с белком иммунной контрольной точки, представляющим интерес, обнаруживают соответствующим методом, в зависимости от вида метки, которую несет антитело, например, радиоактивной, флуоресцетной или ферментной метки. Могут быть выполнены несколько мечений одновременно. С другой стороны, в способе по настоящему изобретению можно использовать вторичное антитело в сочетании с системой амплификации (для усиления сигнала окрашивания) и ферментными молекулами. Такие сопряженные вторичные антитела коммерчески доступны, например, от Dako, система EnVision. Можно использовать контрастное окрашивание, например, гематоксилином и эозином, DAPI, Hoechst. Можно выполнять другие методы окрашивания, используя любой подходящий метод или систему, что может быть очевидно для специалиста в данной области техники, включая автоматизированные, полуавтоматческие или ручные системы.

Например, к антителу можно присоединить одну или несколько меток, посредством чего создается возможность детекции белка-мишени (т.е., биологических маркеров). Примеры меток включают радиоактивные изотопы, флуорофоры, лиганды, хемилюминесцентные вещества, ферменты и их комбинации. Неограничивающие примеры меток, которые можно конъюгировать с первичными и/или вторичными аффинными лигандами, включают флуоресцентные красители или металлы (например, флуоресцеин, родамин, фикоэритрин, флуоресцамин), хромоформные красители (например, родопсин), хемилюминесцентные соединения (например, люминал, имидазол) и биолюминесцентные белки (например, люциферин, люциферазу), гаптены (например, биотин). Ряд других применимых люминофоров и хромофоров описан в Stryer L (1968), Science, 162:526-533, и в Brand L and Gohlke J. R. (1972), Annu. Rev. Biochem., 41:843-868. Аффинные лиганды также можно пометить ферментами (например, пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой, бета-лактамазой), радиоизотопами (например, ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S или ¹²⁵I) и частицами (например, золота). Различные типы меток можно конъюгировать с аффинным лигандом с использованием различных химических реакций, например, реакцией по аминогруппе или реакцией по тиольной группе. Однако можно использовать другие реакционноспособные группы, чем аминные или тиольные, например, альдегидные, карбоксильные и глутаминовые. В технике известны различные ферментативные методы окрашивания для детекции белка, представляющего интерес. Например, взаимодействия с ферментами можно визуализировать с использованием различных ферментов, таких как пероксидаза, щелочная фосфатаза, или различных хромогенов, таких как DAB, AEC или Fast Red. В некоторых воплощениях метка представляет собой квантовую точку. Например, квантовые точки (Qdot) становятся все более применимыми в увеличивающемся списке применений, включая иммуногистохимию, проточную цитометрию и анализы на планшетах, и поэтому могут использоваться в связи с настоящим изобретением. Qdot нанокристаллы имеют уникальные оптические свойства, включая чрезвычайно яркий сигнал для чувствительности и количественного определения, и высокую фотостабильность для получения изображения и анализа. Требуется один источник возбуждения, и увеличивающийся ряд конъюгатов делает их полезными в широком интервале применений на основе клеток. Qdot биоконъюгаты характеризуются квантовыми выходами, сравнимыми с самыми яркими доступными традиционными красителями. Кроме того, такие флуорофоры на основе квантовых точек поглощают в 100-1000 раз больше света, чем традиционные красители. Испускание из нижележащих квантовых точек является узким и симметричным, что означает, что перекрытие с другими цветами минимизировано, что приводит к минимальному просачиванию в соседние каналы детекции и ослаблению перекрестных помех, несмотря на тот факт, что одновременно можно использовать много других цветов. В других примерах антитело может быть конъюгировано с пептидами или белками, которые можно обнаружить через меченного партнера по связыванию или антитело. В непрямом ИГХ анализе необходимо вторичное антитело или второй партнер по связыванию для детекции связывания первого партнера по связыванию, так как он не является меченным.

В некоторых воплощениях получают изображение каждого из полученных окрашенных образцов с использованием системы для визуализации обнаруживаемого сигнала и получения изображения, такого как цифровое изображение окрашивания. Методы получения изображения хорошо известны специалисту в данной области техники. Например, как только образец окрашен, можно использовать любой оптический или неоптический формирователь изображения для детекции красителя или биомаркерной метки, такой как, например, прямые или инвертированные микроскопы, сканирующие конфокальные микроскопы, камеры, сканирующие или туннельные электронные микроскопы, сканирующие зондовые микроскопы и ИК-приемники изображения. В некоторых примерах изображение может быть получено в цифровой форме. Затем полученные изображения можно использовать для количественного или полуколичественного определения количества белка иммунной контрольной точки в образце или абсолютного числа клеток, положительных для маркера, представляющего интерес, или поверхности клеток, положительных для маркера, представляющего интерес. В технике доступны различные автоматизированные системы обработки образцов, окрашивания и анализа, подходящие для применения с ИГХ. Такие системы могут включать автоматизированное окрашивание и сканирование на микроскопах, компьютерный анализ образцов, сравнение ряда срезов (для контроля за изменением в ориентации и размере образца), формирование цифровых сообщений и хранение и отслеживание образцов (таких как слайды, на которых размещены тканевые срезы). Коммерчески доступны системы получения клеточных изображений, которые объединяют обычные оптические микроскопы и цифровые системы обработки изображений для выполнения количественного анализа на клетках и тканях, включая иммуноокрашенные образцы. См., например, систему CAS-200 (Becton, Dickinson & Co.). В частности, детекцию можно осуществить вручную или с помощью методов обработки изображений, включающих компьютерные процессоры и программное обеспечение. С использованием такого программного обеспечения, например, изображения можно формировать, калибровать, стандартизировать и/или проверять на основании факторов, включающих, например, качество окрашивания или интенсивность окрашивания, с использованием процедур, известных специалисту в данной области техники (см., например, опубликованную заявку на патент США № US20100136549). Изображение можно анализировать количественно или полуколичественно и оценить на основании интенсивности окрашивания образца. Количественный или полуколичественный гистохимический анализ относится к способу сканирования и оценки образцов, которые подверглись гистохимической обработке, для идентификации и количественного определения наличия специфического биомаркера (например, белка иммунной контрольной точки). В количественных или полуколичественных методах можно использовать программное обеспечение обработки изображений для детекции плотности окрашивания или количества окрашивания, или визуальные методы детекции окрашивания человеком, когда обученный оператор оценивает результаты в цифрах. Например, изображения можно анализировать количественно с использованием алгоритмов подсчета пикселей и картины узнавания тканей (например, программы Aperio Spectrum, автоматизированная платформа для количественного анализа (платформа AQUA®), или Tribvn с Ilastic и программой Calopix), и других стандартных методов, которыми количественно или полуколичественно измеряют степень окрашивания; см., например, пат. США № 8023714; пат. США № 7257268; пат. США № 7219016; пат. США № 7646905; опубликованные заявки на патент США № US20100136549 и 20110111435; Camp et al. (2002), Nature Medicine, 8: 1323-1327; Bacus et al. (1997), Analyt. Quant. Cytol. Histol., 19: 316-328). Можно вычислить и оценить отношение сильного положительного окрашивания (например, коричневого окрашивания) к сумме всех окрашенных областей. Определяют количество детектируемого биомаркера (т.е., белка иммунной контрольной точки) и приводят в виде процента от положительных пикселей и/или оценки. Например, количество можно определить в виде процента положительных пикселей. В некоторых примерах количество определяют в виде процента окрашенной площади, например, процента положительных пикселей. Например, образец может иметь по меньшей мере или примерно по меньшей мере или примерно 0, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или больше положительных пикселей по сравнению с общей окрашенной площадью. Например, количество можно определить в виде абсолютного числа клеток, положительных для маркера, представляющего интерес. В некоторых воплощениях образцу дается оценка, которая является численным представлением интенсивности или количества гистохимического окрашивания образца, и представляет собой количество биомаркера-мишени (например, белка иммунной контрольной точки), присутствующего в образце. Значения оптической плотности или процента площади можно привести в баллах по шкале, например, шкале целых чисел.

Таким образом, в некоторых воплощениях способ по настоящему изобретению включает стадии, заключающиеся в i) предоставлении одного или нескольких иммуноокрашенных слоев среза ткани, полученных с помощью автоматизированной системы окрашивания слайдов с использованием партнера по связыванию, способного селективно взаимодействовать с биологическим маркером, ii) обработке для оцифровки слайдов со стадии i) путем захвата сканированием высокого разрешения, iii) детекции слоя среза ткани на цифровом изображении, iv) предоставлении размерной эталонной сетки с равномерно распределенными ячейками, имеющими одинаковую поверхность, причем указанная сетка адаптирована к размеру анализируемого среза ткани, и v) детекции, количественном определении и измерении интенсивности или абсолютного числа окрашенных клеток в каждой ячейке.

Методы мультиплексного анализа тканей особенно применимы для количественного определения нескольких иммунных белков контрольной точки в образце опухолевой ткани. Такие методы должны позволять измерять по меньшей мере пять или по меньшей мере десять или больше биомаркеров из одного образца опухолевой ткани. Кроме того, преимуществами метода являются сохранение локализации биомаркера и способность распознавать присутствие биомаркеров в раковых и нераковых клетках. Такие методы включают указания по иммуногистохимии слоев (L-IHC), сканированию экспрессии по слоям (LES) или мультиплесному иммуноблоттингу тканей (MTI), например, в пат. США №№ 6602661, 6969615, 7214477 и 7838222; публ. заявки на патент США № 2011/0306514 (включенных в настоящее описание в качестве ссылок); и в Chung & Hewitt, Meth. Mol. Biol., Prot. Blotting Detect, Kurlen & Scofield, eds. 536: 139-148, 2009, причем в каждой ссылке указывается, что можно использовать до 8, до 9, до 10, до 11 или больше изображений среза ткани на слоистых и блоттированных мембранах, бумаге, фильтрах и т.п.. Мембраны с покрытием, применимые для проведения способа L-IHC/MTI, доступны от 20/20 GeneSystems, Inc. (Rockville, MD).

В некоторых воплощениях способ L-IHC/MT можно выполнить на любом из нескольких образцов ткани, свежем или сохраненном. Образцы включают толстоигольную биопсию, которую обычно фиксируют в 10% нормальном забуференном формалине и обрабатывают в отделении патологии. Стандартные срезы ткани толщиной пять мкм нарезают из тканевых блоков на заряженные слайды, которые используют для L-IHC. Таким образом, L-IHC позволяет проверить несколько маркеров в срезе ткани путем получения копий молекул, перенесенных из среза ткани на мембраны с покрытием с множественной биоаффиностью для получения по существу копий «изображений» ткани. В случае парафинового среза срез ткани депарафинируют так, как известно в технике, например, воздействуя на срез ксиленом или заменителем ксилена, таким как NEO-CLEAR®, и улучшают растворами в этаноле. Срез можно обработать протеиназой, такой как папаин, трипсин, протеназа К и т.п.. Затем стопку с мембранным субстратом, включающую например, несколько слоев толщиной 10 мкм с покрытием на полимерной основе, с порами диаметром 0,4 мкм с каналами сквозь стопку для молекул ткани, таких как белки, помещают на срез ткани. Формируют движение жидкости и молекул ткани по существу перпендикулярно к поверхности мембраны. Сэндвич из среза, мембран, бумажных прокладок, абсорбентной бумаги взвешивают, и затем его можно подвергнуть нагреванию для облегчения движения молекул из ткани в мембранную стопку. Часть белков из ткани захватывается в стопке на каждой из мембран с биоаффинным покрытием (доступных от 20/20 GeneSystems, Inc. Rockville, MD). Таким образом, каждая мембрана включает копию ткани и может быть исследована на иной биомаркер с использованием стандартных методов иммуноблоттинга, что допускает неограниченное расширение маркерного профиля при выполнении на одном срезе ткани. Так как количество белка может быть меньше на мембранах в стопке более удаленных от ткани, что может возникать, например, из-за различных количеств молекул в образце ткани, различной подвижности молекул, высвобожденных из образца ткани, различной аффинности связывания молекул с мембранами, длине переноса и так далее, в процедуру можно включить нормализацию величин, текущего контроля, оценки уровней переноса молекул ткани и т.п., для коррекции изменений, которые происходят в пределах, между и среди мембран и возможности прямого сравнения информации в пределах, между и среди мембран. Поэтому можно определить общий белок на мембране с использованием, например, любых средств для количественного определения белка, таких как биотинилирование доступных молекул, таких как белки, с использованием стандартного реагента и способа, и затем обнаружить связанный биотин, воздействуя на мембрану меченным авидином или стрептавидином; красителем для белков, таким как Blot fastStain, понсо красный, синий блестящий и т.д., известным в технике.

В некоторых воплощениях в способах по настоящему изобретению используют для определения биомеркеров технологию Multiplex Tissue Imprinting (MTI), причем в способе сохраняют хорошую ткань биопсии за счет возможности определять несколько биомаркеров, в некоторых случаях по меньшей мере шесть биомаркеров.

В некоторых воплощениях существуют альтернативные системы мультиплексного анализа тканей, которые также можно использовать как часть настоящего изобретения. Одним из таких методов является масс-спектрометрия на основе аналитической системы мониторинга выбранных реакций (SRM) ("Liquid Tissue", доступная от OncoPlexDx (Rockville, MD)). Этот метод описан в пат. США № 7473532.

В некоторых воплощениях в способах по настоящему изобретению используют метод мультиплексной ИГС, разработанный GE Global Research (Niskayuna, NY). Этот метод описан в публ. заявок на патент США №№ 2008/0118916 и 2008/0118934. В данном случае выполняют последовательный анализ на биологических образцах, содержащих несколько мишеней, включающий стадии связывания флуоресцентного зонда с образцом с последующей детекцией сигнала, последующую инактивацию зонда путем связывания с другой мишенью, детекцию и инактивацию, и продолжение этого процесса до тех пор, пока не будут обнаружены все мишени.

В некоторых воплощениях мультиплексное получение изображений ткани можно выполнить при использовании флуоресценции (например, флуорофора или квантовых точек), где сигнал можно измерить с помощью системы мультиспектральной визуализации. Мультиспектральная визуализация является методом, в котором собирают спектроскопические данные в каждом пикселе изображения, и полученные данные анализируют с помощью программы обработки спектральных изображений. Например, система может получить ряд изображений при различных длинах волн, которые можно выбрать автоматически и непрерывно, и затем использовать с аналитической программой, созданной для работы с такими данными. Так, система может получить количественную информацию от нескольких красителей одновременно, даже когда спектры красителей в значительной степени перекрываются, или когда они локализованы вместе или находятся в образце в одной и той же точке, при условии, что спектральные кривые различаются. Многие биологические материалы являются аутофлуоресцетными или испускают свет с более низкой энергией, когда возбуждаются светом с более высокой энергией. Такой сигнал может привести к менее контрастным изображениям и данным. Камеры высокой чувствительности без способности к мультиспектральной визуализации только усиливают сигнал аутофлуоресценции вместе с сигналом флуоресценции. Мультиспектральная визуализация может не смешивать или отделить аутофлуоресценцию от ткани и посредством этого повысить достижимое соотношение сигнал-шум. Коротко, количественное определение можно выполнить, выполняя следующие стадии: i) предоставление микрочипа опухолевой ткани (ТМА), полученной от пациента, ii) затем образцы ТМА окрашивают антиантителами, имеющими специфичность белка(ов) иммунной контрольной точки, представляющего(их) интерес, iii) затем ТМА слайд окрашивают маркером эпителиальных клеток в помощь автоматизированной сегментации опухоли и стромы, iv) затем слайд ТМА сканируют с использованием системы мультиспектральной визуализации, v) сканированные изображения обрабатывают с использованием программы автоматизированного анализа изображений (например, Perkin Elmer Technology), которая дает возможность детекции, количественного определения и сегментации специфических тканей через мощные алгоритмы распознавания конфигурации. Алгоритм машинного обучения обычно предварительно связывают с сегментом опухоли из стромы и идентифицируют меченные клетки.

Определение уровня экспрессии гена в образце опухоли, полученном от пациента, можно выполнить с помощью ряда методов, хорошо известных в технике.

Типично уровень экспрессии гена оценивают путем определения количества мРНК, продуцированной этим геном.

Способы определения количества мРНК хорошо известны в технике. Например, сначала экстрагируют нуклеиновую кислоту, содержащуюся в образце (например, клетке или ткани, полученной от пациента), согласно стандартным способам, например, с использованием литических ферментов или химических растворов, или экстрагируют смолами, связывающими нуклеиновую кислоту, следуя инструкциям изготовителя. Затем экстрагированную таким образом мРНК детектируют гибридизацией (например, анализом нозерн-блоттингом) и/или амплификацией (например, ОТ-ПЦР). Предпочтительно выполняют количественную или полуколичественную ОТ-ПЦР. Особенно предпочтительна количественная или полуколичественная ОТ-ПЦР в реальном времени.

Другие методы амплификации включают лигазную цепную реакцию (ЛЦР), опосредованную транскрипцией амплификацию (ОТА), амплификацию с замещением цепи (SDA) и амплификацию на основе последовательности нуклеиновой кислоты (NASBA), количественное секвенирование РНК нового поколения (NGS).

Нуклеиновая(ые) кислота(ы), содержащая(ие) по меньшей мере 10 нуклеотидов и имеющая(ие) последовательность, комплементарную или гомологичную мРНК, представляющей интерес, находит(ят) применение в настоящем изобретении а качестве зонда(ов) для гибридизации или праймера(ов) для амплификации. Понятно, что такие нуклеиновые кислоты необязательно полностью идентичны, но обычно по меньшей мере на 80% идентичны гомологичному участку сравнимого размера, предпочтительнее, идентичны на 85% и даже предпочтительнее идентичны на 90-95%. В некоторых воплощениях для детекции гибридизации будет выгодно использовать нуклеиновые кислоты в комбинации с соответствующими средствами, такими как детектируемая метка. В технике известны самые различные соответствующие индикаторы, включая флуоресцентные, радиоактивные, ферментные или другие лиганды (например, авидин/биотин).

Зонды типично включают одноцепочечные нуклеиновые кислоты длиной от 10 до 1000 нуклеотидов, например, от 10 до 800, предпочтительнее от 15 до 700, обычно от 20 до 500 нуклеотидов. Праймеры обычно представляют собой более короткие одноцепочечные нуклеиновые кислоты длиной от 10 до 25 нуклеотидов, созданные для полной или почти полной совместимости с нуклеиновой кислотой, представляющей интерес, которую амплифицируют. Зонды и праймеры являются «специфическими» для нуклеиновых кислот, с которыми их гибридизируют, т.е., их предпочтительно гибридизируют в жестких условиях гибридизации (соответствующих самой высокой температуре плавления Tm, например, 50% формамид, 5x или 6x SCC, SCC представляет собой 0,15 M NaCl, 0,015 M цитрата Na).

Нуклеиновые кислоты, которые можно использовать в качестве праймеров или зондов в вышеуказанной амплификации и способе детекции, могут быть собраны в виде набора. Такой набор включает консенсусные праймеры и молекулярные зонды. Предпочтительный набор также включает компоненты, необходимые для определения того, происходит ли амплификация. Набор также может включать, например, буферы для ПЦР и ферменты; положительные контрольные последовательности, праймеры, регулирующие реакцию, и инструкции по амплификации и детекции специфических последовательностей.

В отдельном воплощении экспрессию биологического маркера по изобретению можно оценить путем мечения биомаркера (в его ДНК, РНК или белке) цифровым олигонуклеотидным штрихкодом и измерить или подсчитать число штрихкодов.

В отдельном воплощении способы по изобретению включают стадии предоставления всех РНК, экстрагированных из скопления клеток, и осуществления амплификации РНК и гибридизации со специфическими зондами, предпочтительнее, с помощью количественной или полуколичественной ОТ-ПЦР.

Зонды получают с использованием методов, которые можно использовать для детекции нуклеиновых кислот, таких как процедуры гибридизации in situ (ISH) (например, флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), хромогенная гибридизация in situ (СISH) и гибридизация in situ с серебром (SISH) или сравнительная геномная гибридизация (CGH).

Гибридизация in situ (ISH) включает введение в контакт образца, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты-мишени (например, последовательность геномной нуклеиновой кислоты-мишени) в контексте препарата метафазных или интерфазных хромосом (такого как образец клеток или ткани, заключенный в слайде), с меченным зондом, способным специфически гибридизировать или специфическим для последовательности нуклеиновой кислоты-мишени (например, последовательности геномной нуклеиновой кислоты-мишени). Слайды необязательно предварительно обрабатывают, например, для удаления парафина или других материалов, которые могут препятствовать равномерной гибридизации. Обрабатывают как образец, так и зонд, например, путем нагревания для денатурации двухцепочечных нуклеиновых кислот. Зонд (в подходящем буфере для гибридизации) и образец объединяют в условиях и в течение времени, достаточного для возможности осуществления гибридизации (типично до достижения равновесия). Хромосомный препарат промывают для удаления избытка зонда, и выполняют детекцию специфической метки хромосомы-мишени с использованием стандартных методов.

Например, биотинилированный зонд можно обнаружить с использованием меченного флуоресцеином авидина или авидина-щелочной фосфатазы. В случае детекции хромофора его можно обнаружить непосредственно, или образцы можно инкубировать, например, с авидином, конъюгированным с флуоресцеин-изотиоцианатом (ФИТЦ). При необходимости можно осуществить амплификацию сигнала ФИТЦ c конъюгированными с биотином козьими антителами против авидина, промывку и вторую амплификацию с ФИТЦ-конъюгированным авидином. Для детекции с помощью ферментативной активности образцы можно инкубировать, например, со стрептавидином, промыть, инкубировать с биотин-конъюгированной щелочной фосфатазой, снова промыть и предварительно уравновесить (например, в буфере для щелочной фосфатазы (АР)). В отношении общего описания процедур гибридизации in situ см., например, пат. США № 4888278.

В технике известно много процедур для FISH, CISH и SISH. Например, процедуры для выполнения FISH описаны в пат. США №№ 5447841, 5472842 и 5427932; и, например, в Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 2934-2938, 1986; Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 9138-9142, 1988; и Lichter et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 9664-9668, 1988. CISH описан в, например, Tanner et al., Am. J. Pathol., 157: 1467-1472, 2000, и пат. США № 6942970. Другие методы детекции приводятся в пат. США № 6280929.

Многие реагенты и схемы детекции можно использовать в сочетании с процедурами FISH, CISH и SISH для улучшения чувствительности, разрешения или других желательных свойств. Как обсуждалось выше, зонды, меченные флуорофорами (включая флуоресцентные красители и QUANTUM DOT®), можно обнаружить прямо визуально, когда выполняют FISH. С другой стороны, зонд можно пометить нефлуоресцентной молекулой, такой как гаптен (такой как следующие соединения как неограничивающие примеры: биотин, дигоксигенин, DNP и различные оксазолы, пиразолы, тиазолы, нитроарилы, бензофураны, тритерпены, мочевины, тиомочевины, ротеноны, кумарин, соединения на основе кумарина, подофиллотоксин, соединения на основе подофиллотоксина, и их комбинации), лиганд или другая частица, которая детектируется косвенно. Затем можно детектировать зонды, меченные такими нефлуоресцентными молекулами (и последовательности нуклеиновых кислот-мишеней, с которыми они связываются), путем контактирования образца (например, образца клеток или ткани, с которым связывается зонд) с меченным реагентом для детекции, таким как антитело (или рецептор или другой специфический партнер по связыванию), специфическое для выбранного гаптена или лиганда. Реагент для детекции можно пометить флуорофором (например, QUANTUM DOT®) или другой обнаруживаемой косвенно частицей, или можно ввести в контакт с одним или несколькими другими специфическими агентами связывания (например, вторичными или специфическими антителами), которые можно пометить флуорофором.

В других примерах зонд или специфический агент связывания (такой как антитело, например, первичное антитело, рецептор или другой агент связывания) метят ферментом, который способен превращать флуорогенную или хромогенную композицию в детектируемый сигнал флуоресценции, окраски или обнаруживаемый иначе (например, как при выпадении частиц металла в SISH). Как показано выше, фермент можно присоединить к соответствующему зонду или реагенту для детекции непосредственно или косвенно через линкер. Примеры подходящих реагентов (например, реагентов для связывания) и химических технологий (например, линкера и химических технологий присоединения) описаны в публикациях заявок на патент США №№ 2006/0246524, 2006/0246523 и 2007/0117153.

Специалистам в данной области техники следует иметь в виду, что путем соответствующего выбора пар меченных зондспецифических агентов связывания можно создавать мультиплексные схемы детекции для облегчения детекции нескольких последовательностей-мишеней нуклеиновых кислот (например, геномных последовательностей-мишеней нуклеиновых кислот) в одном анализе (например, в одном образце клеток или ткани или в больше, чем в одном, образцах клеток или ткани). Например, первый зонд, который соответствует первой последовательности-мишени, можно пометить первым гаптеном, таким как биотин, в то время как второй зонд, который соответствует второй последовательности-мишени, можно пометить вторым гаптеном, таким как DNP. После предоставления образца воздействию зондов связанные зонды можно обнаружить путем контактирования образца с первым специфическим агентом для связывания (в данном случае авидином, меченным первым флуорофором, например, первым спектрально отличающимся QUANTUM DOT®, например, который испускает 585 нм) и вторым специфическим агентом для связывания (в данном случае антителом против DNP или фрагментом антитела, меченным вторым флуорофором (например, вторым спектрально отличающимся QUANTUM DOT®, например, который испускает 705 нм). Другие пары зонд/агент для связывания можно добавить в схему мультиплексной детекции с использованием других спектрально отличающихся флуорфоров. Можно представить многие прямые и косвенные вариации (например, в одну стадию, две стадии или больше), которые все являются подходящими в контексте раскрытых зондов и анализов.

Зонды типично включают одноцепочечные нуклеиновые кислоты с 10-1000 нуклеотидами в длину, например, от 10 до 800, предпочтительнее от 15 до 700, обычно от 20 до 500. Праймеры обычно являются более короткими одноцепочечными нуклеиновыми кислотами с 10-25 нуклеотидами в длину, созданными для полной или почти полной совместимости с нуклеиновой кислотой, представляющей интерес, которую амплифицируют. Зонды и праймеры являются «специфическими» для нуклеиновых кислот, с которыми их гибридизируют, т.е., их предпочтительно гибридизируют в жестких условиях гибридизации (соответствующих самой высокой температуре плавления Tm, например, 50% формамид, 5x или 6x SCC, SCC представляет собой 0,15 M NaCl, 0,015 M цитрата Na).

Нуклеиновые кислоты, используемые как праймеры или зонды в вышеуказанной амплификации и способе детекции, могут быть собраны в виде набора. Такой набор включает консенсусные праймеры и молекулярные зонды. Предпочтительный набор также включает компоненты, необходимые для определения того, происходит ли амплификация. Набор также может включать, например, буферы для ПЦР и ферменты; положительные контрольные последовательности, праймеры, регулирующие реакцию, и инструкции по амплификации и детекции специфических последовательностей.

В отдельном воплощении способы по изобретению включают стадии предоставления всех РНК, экстрагированных из скопления клеток, и осуществления амплификации РНК и гибридизации со специфическими зондами, предпочтительнее, с помощью количественной или полуколичественной ОТ-ПЦР.

В другом предпочтительном воплощении уровень экспрессии определяют анализом с ДНК-чипом. Такой ДНК-чип или микроматрица нуклеиновых кислот состоит из различных нуклеотидных зондов, которые химически присоединены к субстрату, который может представлять собой микрочип, предметное стекло или микросферическую гранулу. Микрочип может состоять из полимеров, пластиков, смол, полисахаридов, диоксида кремния или материалов на основе диоксида кремния, металлов, неорганических стекол или нитроцеллюлозы. Зонды включают нуклеиновую кислоту, такую как кДНК, или олигонуклеотиды, которые могут состоять из примерно 10 - примерно 60 пар оснований. Для того, чтобы определить уровень экспрессии, образец от испытываемого субъекта, необязательно, сначала подвергают обратной транскрипции, метят и вводят в контакт с микрочипом и условиях гибридизации, что ведет к образованию комплексов между нуклеиновыми кислотами-мишенями, которые комплементарны последовательностям зондов, присоединенных к поверхности микрочипа. Затем меченные гибридизированные комплексы детектируют количественно или полуколичественно. Мечения можно достигнуть различными методами, например, используя радиоактивное или флуоресцентное мечение. Специалисту в данной области техники доступны многие варианты технологии гибридизации на микрочипах (см., например, обзор Hoheisel, Nature Reviews, Genetics, 2006, 7: 200-210).

Уровень экспрессии гена можно выразить как абсолютный уровень экспрессии или нормализованный уровень экспрессии. Оба типа значений можно использовать в способе по настоящему изобретению. Уровень экспрессии гена предпочтительно выражают как нормализованный уровень экспрессии, когда в качестве метода оценки уровня экспрессии используют количественную ПЦР, поскольку небольшие различия в начале эксперимента могут дать огромные различия после нескольких циклов.

Обычно уровни экспрессии нормализуют, корректируя абсолютный уровень экспрессии гена путем сравнения его экспрессии с экспрессией гена, который не является релевантным для определения стадии рака у пациента, например, гена «домашнего хозяйства», который экспрессируется конститутивно. Подходящие для нормализации гены включают гены «домашнего хозяйства», такие как гены актина АСТВ, рибосомный ген 18S, GUSB, PGK1 и TFRC. Такая нормализация позволяет сравнивать уровень экспрессии для одного образца, например, образца от пациента, с уровнем экспрессии для другого образца или сравнивать образцы из различных источников.

В настоящем описании название каждого гена, представляющего интерес, соотносится с общепризнанным названием соответствующего гена, которое находят в общепризнанных базах данных последовательностей генов и последовательностей белков, в том числе, в базе данных от HUGO Gene Nomenclature Committee. В настоящем описании название каждого из генов, представляющих интерес, также может соотноситься с общепризнанным названием соответствующего гена, которое находится в общепризнанной базе данных последовательностей Genbank. Через эти общепризнанные базы данных последовательностей специалист в данной области техники может восстановить нуклеиновую кислоту для каждого гена, представляющего интерес, описанного в настоящем описании.

Способ прогнозирования для рака по изобретению можно выполнить с помощью комбинации предоставленных генов, которая включает по меньшей мере один ген, характеризующий адаптивный иммунный ответ, и по меньшей мере один ген, характеризующий иммуносупрессорный ответ. Число генов, которые можно использовать в способе по настоящему изобретению, ограничивается только числом различных биологических генов, представляющих интерес, которые практически доступны на момент выполнения способа. Соответственно, в одном воплощении количественно определяют комбинацию из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 и 50 различных генов, предпочтительно комбинацию и 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 генов, и предпочтительнее комбинацию из 2, 3, 4, 5 или 6 генов. Однако число комбинированных генов, которые требуются для достижения высокой статистической значимости (например, значение. P меньше 10^-3), будет зависеть от метода, используемого для количественного определения комбинации генов. Число генов, используемых в качестве генов, характеризующих адаптивный иммунный ответ, и число генов, используемых в качестве генов, характеризующих иммунусупрессорный ответ, может быть одинаковым или различным.

В предпочтительных условиях осуществления изобретения используют примерно сбалансированное число генов каждого вида (адаптивного иммунного ответа и иммунусупрессорного ответа), например, по 2 каждого или 5 одного вида и 6 другого вида.

Определение уровня экспрессии гена в образце опухоли, полученном от пациента, можно осуществить с помощью ряда методов, хорошо известных в технике.

Типично уровень экспрессии гена оценивают путем определения количества мРНК, продуцируемой этим геном. Поэтому предметом настоящей заявки является способ скрининга больных раком, определенным выше, включающий определение уровня экспрессии ELA одного или нескольких генов, характеризующих адаптивный иммунный ответ у человека, или уровня экспрессии ELI одного или нескольких генов, характеризующих иммуносупрессорный ответ у человека, путем определения количества мРНК, соответствующей указанным генам.

Способы определения количества мРНК хорошо известны в технике. Например, сначала экстрагируют нуклеиновую кислоту, содержащуюся в образцах (например, клетке или ткани, полученной от пациента), согласно стандартным способам, например, с использованием литических ферментов или химических растворов, или экстрагируют смолами, связывающими нуклеиновую кислоту, следуя инструкциям изготовителя. Затем экстрагированную таким образом мРНК детектируют гибридизацией (например, анализом нозерн-блоттингом) и/или амплификацией (например, ОТ-ПЦР). Предпочтительно выполняют количественную или полуколичественную ОТ-ПЦР. Особенно предпочтительна количественная или полуколичественная ОТ-ПЦР в реальном времени.

Другие методы амплификации включают лигазную цепную реакцию (ЛЦР), опосредованную транскрипцией амплификацию (ОТА), амплификацию с замещением цепи (SDA) и амплификацию на основе последовательности нуклеиновой кислоты (NASBA), количественное секвенирование РНК нового поколения (NGS).

Нуклеиновая(ые) кислота(ы), включающая(ие) по меньшей мере 10 нуклеотидов и имеющя(ие) последовательность, комплементарную или гомологичную мРНК, представляющей интерес, находит(ят) применение в настоящем изобретении а качестве зонда(ов) для гибридизации или праймера(ов) для амплификации. Понятно, что такие нуклеиновые кислоты необязательно полностью идентичны, но обычно по меньшей мере на 80% идентичны для гомологичного участка сравнимого размера, предпочтительнее, идентичны на 85% и даже предпочтительнее идентичны на 90-95%. В некоторых воплощениях для детекции гибридизации будет выгодно использовать нуклеиновые кислоты в комбинации с соответствующими средствами, такими как детектируемая метка. В технике известны самые различные соответствующие индикаторы, включая флуоресцентные, радиоактивные, ферментные или другие лиганды (например, авидин/биотин).

Зонды типично включают одноцепочечные нуклеиновые кислоты длиной от 10 до 1000 нуклеотидов, например, от 10 до 800, предпочтительнее от 15 до 700, обычно от 20 до 500 нуклеотидов. Праймеры обычно представляют собой более короткие одноцепочечные нуклеиновые кислоты длиной от 10 до 25 нуклеотидов, созданные для полной или почти полной совместимости с нуклеиновой кислотой, представляющей интерес, которую амплифицируют. Зонды и праймеры являются «специфическими» для нуклеиновых кислот, с которыми их гибридизируют, т.е., их предпочтительно гибридизируют в жестких условиях гибридизации (соответствующих самой высокой температуре плавления Tm, например, 50% формамид, 5x или 6x SCC, SCC представляет собой 0,15 M NaCl, 0,015 M цитрата Na).

Нуклеиновые кислоты, которые можно использовать в качестве праймеров или зондов в вышеуказанной амплификации и способе детекции, могут быть собраны в виде набора. Такой набор включает консенсусные праймеры и молекулярные зонды. Предпочтительный набор также включает компоненты, необходимые для определения того, происходит ли амплификация. Набор также может включать, например, буферы для ПЦР и ферменты; положительные контрольные последовательности, праймеры, регулирующие реакцию, и инструкции по амплификации и детекции специфических последовательностей.

В отдельном воплощении способы по изобретению включают стадии предоставления всех РНК, экстрагированных из скопления клеток, и осуществления амплификации РНК и гибридизации со специфическими зондами, предпочтительнее, с помощью количественной или полуколичественной ОТ-ПЦР.

Зонды получают с использованием методов, которые можно использовать для детекции нуклеиновых кислот, таких как процедуры гибридизации in situ (ISH) (например, флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), хромогенная гибридизация in situ (СISH) и гибридизация in situ с серебром (SISH) или сравнительная геномная гибридизация (CGH).

Гибридизация in situ (ISH) включает введение в контакт образца, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты-мишени (например, последовательность геномной нуклеиновой кислоты-мишени) в контексте препарата метафазных или интерфазных хромосом (такого как образец клеток или ткани, заключенный в слайде), с меченным зондом, способным специфически гибридизировать или специфическим для последовательности нуклеиновой кислоты-мишени (например, последовательности геномной нуклеиновой кислоты-мишени). Слайды необязательно предварительно обрабатывают, например, для удаления парафина или других материалов, которые могут препятствовать равномерной гибридизации. Обрабатывают как образец, так и зонд, например, путем нагревания для денатурации двухцепочечных нуклеиновых кислот. Зонд (в подходящем буфере для гибридизации) и образец объединяют в условиях и в течение времени, достаточных для возможности осуществления гибридизации (типично для достижения равновесия). Хромосомный препарат промывают для удаления избытка зонда, и выполняют детекцию специфической метки хромосомы-мишени с использованием стандартных методов.

Например, биотинилированный зонд можно обнаружить с использованием меченного флуоресцеином авидина или авидина-щелочной фосфатазы. В случае детекции хромофора его можно обнаружить непосредственно, или образцы можно инкубировать, например, с авидином, конъюгированным с флуоресцеин-изотиоцианатом (ФИТЦ). При необходимости можно осуществить амплификацию сигнала ФИТЦ путем инкубации c конъюгированными с биотином козьими антителами против авидина, промывку и вторую амплификацию с ФИТЦ-конъюгированным авидином. Для детекции с помощью ферментативной активности образцы можно инкубировать, например, со стрептавидином, промыть, инкубировать с биотин-конъюгированной щелочной фосфатазой, снова промыть и предварительно уравновесить (например, в буфере для щелочной фосфатазы (АР)). В отношении общего описания процедур гибридизации in situ см., например, пат. США № 4888278.

В технике известно много процедур для FISH, CISH и SISH. Например, процедуры для выполнения FISH описаны в пат. США №№ 5447841, 5472842 и 5427932; и, например, в Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 2934-2938, 1986; Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 9138-9142, 1988; и Lichter et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 9664-9668, 1988. CISH описан в, например, Tanner et al., Am. J. Pathol., 157: 1467-1472, 2000, и пат. США № 6942970. Другие методы детекции приводятся в пат. США № 6280929.

Многие реагенты и схемы детекции можно использовать в сочетании с процедурами FISH, CISH и SISH для улучшения чувствительности, разрешения или других желательных свойств. Как обсуждалось выше, зонды, меченные флуорофорами (включая флуоресцентные красители и QUANTUM DOT®), можно обнаружить прямо визуально, когда выполняют FISH. С другой стороны, зонд можно пометить нефлуоресцентной молекулой, такой как гаптен (такой как следующие соединения как неограничивающие примеры: биотин, дигоксигенин, DNP и различные оксазолы, пиразолы, тиазолы, нитроарилы, бензофураны, тритерпены, мочевины, тиомочевины, ротеноны, кумарин, соединения на основе кумарина, подофиллотоксин, соединения на основе подофиллотоксина, и их комбинации), лиганд или другая частица, которая детектируется косвенно. Затем можно детектировать зонды, меченные такими нефлуоресцентными молекулами (и последовательности нуклеиновых кислот-мишеней, с которыми они связываются), путем контактирования образца (например, образца клеток или ткани, с которым связывается зонд) с меченным реагентом для детекции, таким как антитело (или рецептор или другой специфический партнер по связыванию), специфическое для выбранного гаптена или лиганда. Реагент для детекции можно пометить флуорофором (например, QUANTUM DOT®) или другой обнаруживаемой косвенно частицей, или можно ввести в контакт с одним или несколькими другими специфическими агентами связывания (например, вторичными или специфическими антителами), которые можно пометить флуорофором.

В других примерах зонд или специфический связывающий агент (такой как антитело, например, первичное антитело, рецептор или другой связывающий агент) метят ферментом, который способен превращать флуорогенную или хромогенную композицию в детектируемый сигнал флуоресценции, цвета или обнаруживаемый иначе (например, как при выпадении поддающихся детекции частиц металла в SISH). Как показано выше, фермент можно присоединить к соответствующему зонду или реагенту для детекции непосредственно или косвенно через линкер. Примеры подходящих реагентов (например, реагентов для связывания) и химических технологий (например, линкера и химических технологий присоединения) описаны в публикациях заявок на патент США №№ 2006/0246524, 2006/0246523 и 2007/0117153.

Специалистам в данной области техники следует иметь в виду, что путем соответствующего выбора пар меченный зонд-специфический связывющий агент можно создавать мультиплексные схемы детекции для облегчения детекции нескольких последовательностей нуклеиновых кислот-мишеней (например, последовательностей геномных нуклеиновых кислот-мишеней) в одном анализе (например, в одном образце клеток или ткани или в нескольких, более одного, образцах клеток или ткани). Например, первый зонд, который соответствует первой последовательности-мишени, можно пометить первым гаптеном, таким как биотин, в то время как второй зонда, который соответствует второй последовательности-мишени, можно пометить вторым гаптеном, таким как DNP. После предоставления образца воздействию зондов связанные зонды можно обнаружить путем контактирования образца с первым специфическим связывающим агентом (в данном случае авидином, меченным первым флуорофором, например, первым спектрально отличающимся QUANTUM DOT®, например, который испускает 585 нм) и вторым специфическим связывающим агентом (в данном случае антителом против DNP или фрагментом антитела, меченным вторым флуорофором (например, вторым спектрально отличающимся QUANTUM DOT®, например, который испускает 705 нм). Другие пары зонд/связывающий агент можно добавить в схему мультиплексной детекции с использованием других спектрально отличающихся флуорфоров. Можно представить многие прямые и косвенные вариации (например, в одну стадию, две стадии или больше), которые все являются подходящими в контексте раскрытых зондов и анализов.

Зонды типично включают одноцепочечные нуклеиновые кислоты длиной от 10 до 1000 нуклеотидов, например, от 10 до 800, предпочтительнее от 15 до 700, обычно от 20 до 500. Праймеры обычно являются более короткими одноцепочечными нуклеиновыми кислотами длиной от 10 до 25 нуклеотидов, созданными для полной или почти полной совместимости с нуклеиновой кислотой, представляющей интерес, которую амплифицируют. Зонды и праймеры являются «специфическими» для нуклеиновых кислот, с которыми их гибридизируют, т.е., их предпочтительно гибридизируют в жестких условиях гибридизации (соответствующих самой высокой температуре плавления Tm, например, 50% формамид, 5x или 6x SCC, SCC представляет собой 0,15 M NaCl, 0,015 M цитрата Na).

Нуклеиновые кислоты, используемые как праймеры или зонды в вышеуказанной амплификации и способе детекции, могут быть собраны в виде набора. Такой набор включает консенсусные праймеры и молекулярные зонды. Предпочтительный набор также включает компоненты, необходимые для определения того, происходит ли амплификация. Набор также может включать, например, буферы для ПЦР и ферменты; положительные контрольные последовательности, праймеры, регулирующие реакцию, и инструкции по амплификации и детекции специфических последовательностей.

В отдельном воплощении способы по изобретению включают стадии предоставления всех РНК, экстрагированных из скопления клеток, и осуществления амплификации РНК и гибридизации со специфическими зондами, предпочтительнее, с помощью количественной или полуколичественной ОТ-ПЦР.

В другом предпочтительном воплощении уровень экспрессии определяют анализом с ДНК-чипом. Такой ДНК-чип или микроматрица нуклеиновых кислот состоит из различных нуклеотидных зондов, которые химически присоединены к субстрату, который может представлять собой микрочип, предметное стекло или микросферическую гранулу. Микрочип может состоять из полимеров, пластиков, смол, полисахаридов, диоксида кремния или материалов на основе диоксида кремния, металлов, неорганических стекол или нитроцеллюлозы. Зонды включают нуклеиновую кислоту, такую как кДНК, или олигонуклеотиды, которые могут состоять из примерно 10 - примерно 60 пар оснований. Для того, чтобы определить уровень экспрессии, образец от испытываемого субъекта, необязательно, сначала подвергают обратной транскрипции, метят и вводят в контакт с микрочипом и условиях гибридизации, что ведет к образованию комплексов между нуклеиновыми кислотами-мишенями, которые комплементарны последовательностям зондов, присоединенных к поверхности микрочипа. Затем меченные гибридизированные комплексы детектируют количественно или полуколичественно. Мечения можно достигнуть различными методами, например, используя радиоактивное или флуоресцентное мечение. Специалисту в данной области техники доступны многие варианты технологии гибридизации на микрочипах (см., например, обзор Hoheisel, Nature Reviews, Genetics, 2006, 7: 200-210).

Уровень экспрессии гена можно выразить как абсолютный уровень экспрессии или нормализованный уровень экспрессии. Оба типа значений можно использовать в способе по настоящему изобретению. Уровень экспрессии гена предпочтительно выражают как нормализованный уровень экспрессии, когда в качестве метода оценки уровня экспрессии используют количественную ПЦР, поскольку небольшие различия в начале эксперимента могут дать огромные различия после нескольких циклов.

Обычно уровни экспрессии нормализуют, корректируя абсолютный уровень экспрессии гена путем сравнения его экспрессии с экспрессией гена, который не является релевантным для определения стадии рака у пациента, например, гена «домашнего хозяйства», который экспрессируется конститутивно. Подходящие для нормализации гены включают гены «домашнего хозяйства», такие как гены актина АСТВ, рибосомный ген 18S, GUSB, PGK1 и TFRC. Такая нормализация позволяет сравнивать уровень экспрессии для одного образца, например, образца от пациента, с уровнем экспрессии для другого образца или сравнивать образцы из различных источников.

Противораковое лечение

Вследствие этого способ по настоящему изобретению дает возможность определить, среди прочего, новую группу пациентов, которые до сих пор не идентифицировались, т.е., пациентов, у которых можно успешно излечить рак противораковым лечением.

Противораковое лечение может состоять из радиотерапии, химиотерапии или иммунотерапии. Лечение может состоять из адъювантной терапии (т.е., лечения после хирургической резекции первичной опухоли) или неоадъювантной терапии (т.е., лечения до хирургической резекции первичной опухоли).

Вследствие этого настоящее изобретение относится к химиотерапевтическому средству, радиотерапевтическому средству или иммунотерапевтическому средству, предпочтительно последнему, для применения при лечении больного раком в стадии I-III, которого считают хорошим респондентом лечения в соответствии с вышеуказанным способом по изобретению.

Термин «химиотерапевтическое средство» относится к химическим соединениям, которые эффективно ингибируют рост опухоли. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилолмеламин; ацетогенины (в особенности буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; СС-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелизин); криптофицины (особенно криптофицин 1 и криптофицин 8); дуластатин; дуокармицин (включая минтетические аналоги KW-2189 и CBI-TMI); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин А; спонгистатин; азотистые аналоги горчичного газа, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новэмбихин, фенэстерин, преднимустин, трофосфамид, урацил мустард; нитромочевины, такие как кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как ендииновые антибиотики (например, калихеамицин, в особенности. калихеамицин (11 и калихеамицин 211, см., например, Agnew. Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994); динемицин, включая динемицин А; эсперамицин (esperamicin); а также неокарциностатиновый хромофор и родственные хромопротеиновые енедииновые антибиотические хромофоры), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, канниномицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин (включая морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 3-пирролинодоксорубицин и деоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, иданрубицин, марселломицин, митомицины, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептомгрин (streptomgrin), стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пуринов, такие как флударабин, 6-меркатопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидинов, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, азацитидин, 5-FU; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадреналиновые препараты, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; пополнитель фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамид; аминолевулиновую кислоту; амсакрин; бестрабуцил; bisantrene; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; diaziquone; элфлонитин; эллиптиния ацетат; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидамин; мейтанзиноиды, такие как мейтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопидамил; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK®; разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогеннаний (spirogennanium); тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2’,2’-трихлортриэтиламин; трихотецены (в особенности токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндезин; декарбазин; манномустин; митобромтол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозил («Ara-C»); циклофосфамид; тиотепу; таксоиды, например, паклитаксел (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.].) и доксетаксел (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платину; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин C; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навелбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселоду; ибандронат; CPT-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноевую кислоту; капецитабин и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеуказанных соединений. В это определение также включаются антигормональные средства, которые действуют как регуляторы или ингибиторы действия гормонов на опухолях, такие как антиэстрогены, включая, например, тамоксифен, ралоксифен, ингибирующие ароматазу 4(5)-имидазолы, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен (фарестон); и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерлин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеуказанных соединений.

Термин «иммунотерапевтическое средство», используемый в настоящем описании, относится к соединению, композиции или лечению, которое косвенно или прямо усиливает, стимулирует или повышает иммунный ответ организма против раковых клеток, и/или которое уменьшает побочное действие других противораковых терапий. Таким образом, иммунотерапия является терапией, которая прямо или косвенно стимулирует или усиливает ответы иммунной системы на раковые клетки и/или ослабляет побочное действие, которое может быть вызвано другими противораковыми средствами. Иммунотерапию в технике также называют иммунологической терапией, биологической терапией, терапией, модифицирующей биологический ответ, и биотерапией. Примеры обычных иммунотерапевтических средств, известных в технике, включают, но без ограничений, цитокины, вакцины против рака, моноклональные антитела и нецитокиновые адъюванты. С другой стороны, иммунотерапевтическое лечение может состоять во введении пациенту некоего количества иммунных клеток (Т-клеток, NK клеток, дендритных клеток, В-клеток…).

Иммунотерапевтические средства могут быть неспецифическими, т.е., поддерживающими иммунную систему в целом, так что человеческий организм становится более сильным в борьбе с растущими и распространяющимися раковыми клетками, или они могут быть специфическими, т.е., нацеленными на сами раковые клетки. В схемах приема иммунотерапевтических средств может быть скомбинировано применение неспецифических и специфических иммунотерапевтических средств.

Неспецифические иммунотерапевтические средства представляют собой вещества, которые стимулируют или косвенно улучшают иммунную систему. Неспецифические иммунотерапевтические средства используют одни как основную терапию для лечения от рака, а также как дополнение к основной терапии, в таком случае неспецифическое иммунотерапевтическое средство функционирует как адъювант для усиления эффективности других терапий (например, вакцин от рака). Неспецифические иммунотерапевтические средства в таком последнем контексте также могут функционировать как уменьшающие побочное действие других терапий, например, подавления деятельности костного мозга, вызываемого некоторыми химиотерапевтическими средствами. Неспецифические иммунотерапевтические средства могут действовать на ключевые клетки иммунной системы и вызывать вторичные ответы, такие как повышенное продуцирование цитокинов и иммуноглобулинов. С другой стороны, средства сами могут включать цитокины. Неспецифические иммунотерапевтические средства, как правило, классифицируют как адъюванты цитокины и адъюванты нецитокины.

Ряд цитокинов нашел применение при лечении любого рака как общие неспецифические иммунотерапии, созданные для поддержания иммунной системы, или адъюванты, предоставляемые с другими терапиями. Подходящие цитокины включают, но без ограничения, интерфероны, интерлейкины и колониестимулирующие факторы.

Интерфероны (IFN), рассматриваемые в настоящем изобретении, включают обычные типы IFN - IFN-альфа (IFN-α), IFN-бета (IFN-β) и IFN-гамма (IFN-γ). IFN могут действовать непосредственно на раковые клетки, например, замедляя их рост, промотируя их развитие в клетки с более нормальным поведением и/или повышая их продуцирование антигенов, которые делают раковые клетки такими, что иммунная система их легче узнает и разрушает. IFN также могут действовать на раковые клетки косвенно, например, замедляя ангиогенез, поддерживая иммунную систему и/или стимулируя естественные клетки-киллеры (NK-клетки), Т-клетки и макрофаги. Рекомбинатный IFN-альфа доступен коммерчески как роферон (Roche Pharmaceuticals) и интрон A (Schering Corporation). Применение IFN-альфа, одного или в комбинации с другими иммунотерапевтическими или химиотерапевтическими средствами, показало эффективность при лечении различных раков, включая меланому (включая метастатическую меланому), рак почек (включая метастатический рак почек), рак молочной железы, рак предстательной железы и рак шейки матки (включая метастатический рак шейки матки).

Интерлейкины, рассматриваемые настоящим изобретением, включают IL-2, IL-4, IL-11 и IL-12. Примеры коммерчески доступных рекомбинантных интерлейкинов включают пролейкин® (IL-2; Chiron Corporation) и неумегу® (IL-12; Wyeth Pharmaceuticals). Zymogenetics, Inc. (Seattle, Wash.), в настоящее время испытывает рекомбинантную форму IL-21, которая также рассматривается для применения в комбинации по настоящему изобретению. Интерлейкины, одни или в комбинации с другими иммунотерапевтическими или химиотерапевтическими средствами, показали эффективность при лечении различных раков, включая рак почек (включая метастатический рак почек), рак яичников (включая рецидивирующий рак яичников), рак шейки матки (включая метастатический рак шейки матки), рак молочной железы, колоректальный рак, рак легких, рак головного мозга и рак предстательной железы.

Интерлейкины также показывают хорошую активность в комбинации с IFN-альфа при лечении различных раковых заболеваний (Negrier et al., Ann. Oncol., 2002, 13(9): 1460-8; Touranietal, J. Clin. Oncol., 2003, 21(21): 398794).

Колониестимулирующие факторы (КСФ), рассматриваемые в настоящем изобретении, включают гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ или филграстим), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ или сарграмостим) и эритропоэтин (эпоэтин-альфа, дарбэпоэтин). Лечение одним или несколькими факторами роста может способствовать стимуляции образования новых клеток крови у пациентов, подвергающихся традиционной химиотерапии. Соответственно, лечение КСФ может быть полезным для ослабления побочного действия, связанного с химиотерапией, и может допустить применение более высоких доз химиотерапевтических средств. Коммерчески доступны различные рекомбинантные колониестимулирующие факторы, например, нейпоген® (Г-КСФ; Amgen), неуласта (пэлфиграстим; Amgen), лейкин (ГМ-КСФ; Berlex), прокрит (эритропоэтин; Ortho Biotech), эпоген (эритропоэтин; Amgen), аранесп (эритропоэтин). Показана эффективность колониестимулирующих факторов при лечении рака, в том числе, меланомы, колоректального рака (включая метастатический колоректальный рак) и рака легких.

Адъюванты нецитокины, подходящие для применения в комбинациях по настоящему изобретению, включают, но без ограничения, левамизол, гидроксид алюминия (алум), палочку Кальметта-Герена (ACG), неполный адъювант Фрейнда (IFA), QS-21, DETOX, каплевидный гемоцианин морского блюдечка (KLH) и динитрофенил (DNP). Адъюванты нецитокины в комбинации с другими иммуно- и/или химиотерапевтическими препаратами показывают эффективность против различных раковых заболеваний, включая, например, рак толстой кишки и колоректальный рак (левамизол); меланому (BCG и QS-21); рак почек и рак мочевого пузыря (BCG).

Кроме того, что иммунотерапевтические средства имеют специфические и неспецифические мишени, они могут быть активными, т.е., стимулировать собственный иммунный ответ организма, или они могут быть пассивными, т.е., включать компоненты иммунной системы, которые генерированы вне организма.

Пассивная специфическая иммунотерапия обычно включает применение одного или нескольких моноклональных антител, которые являются специфическими для определенного антигена, обнаруженного на поверхности раковой клетки, или которые являются специфическими для определенного фактора роста клеток. Моноклональные антитела можно использовать при лечении рака рядом способов, например, усиливать иммунный ответ субъекта на специфический тип рака, препятствовать росту раковых клеток путем нацеливания на факторы роста специфических клеток, таких как клетки, участвующие в ангиогенезе, или путем усиления доставки других противораковых средств к раковым клеткам, когда они связаны или конъюгированы с такими средствами, как химиотерапевтические средства, радиоактивные частицы или токсины.

Моноклональные антитела, используемые в настоящее время в качестве противораковых иммунотерапевтических средств, которые подходят для включения в комбинации по настоящему изобретению, включают, но без ограничения, ритуксимаб (ритуксан®), трастузумаб (герцептин®), ибритумомаб тиуксетан (зевалин®), тозитумумаб (бексар®), цетуксимаб (С-225, эрбитукс®), бевацизумаб (авастин®), гемтузумаб озогамицин (милотарг®), алемтузимаб (кампат®) и BL22. Моноклональные антитела используют при лечении широкого ряда раковых заболеваний, включая рак молочной железы (включая запущенный метастатический рак молочной железы), колоректальный рак (включая запущенный и/или метастатический колоректальный рак), рак яичников, рак легких, рак предстательной железы, рак шейки матки, меланому и опухоли головного мозга. Другие примеры включают антитела против CTLA4 (например, ипилимумаб), антитела против PD1, антитела против PDL1, антитела против TIM3, антитела против LAG3, антитела против B7H3, антитела против B7H4 или антитела против B7H6.

Моноклональные антитела можно использовать одни или в комбинации с другими иммунотерапевтическими средствами или химиотерапевтическими средствами.

Активная специфическая иммунотерапия типично включает использование вакцин против рака. Разработаны вакцины против рака, которые включают целые раковые клетки, части раковых клеток или один или несколько антигенов, полученных из раковых клеток. Вакцины против рака, одни или в комбинации с одним или несколькими иммуно- или химиотерапевтическими средствами, исследуют при лечении нескольких типов рака, включая меланому, рак почек, рак яичников, рак молочной железы, колоректальный рак и рак легких. Неспецифические иммунотерапевтические препараты применяют в комбинации с вакцинами против рака для того, чтобы усилить иммунный ответ организма.

Иммунотерапевтическое лечение может состоять из адаптивной иммунотерапии, как описано в Nicholas P. Restifo, Mark E. Dudley and Steven A. Rosenberg, «Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response», Nature Reviews Immunology, Volume 12, April 2012). При адаптивной иммунотерапии лимфоциты из кровотока пациента или лимфоциты из инфильтратов опухоли выделяют in vitro, активируют лимфокинами, такими как IL-2, или просачивают с генами для некроза опухоли и снова вводят (readministered) (Rosenberg et al., 1988; 1989). Наиболее предпочтительно, активированные лимфоциты являются собственными клетками пациента, которые ранее выделили из крови или образца опухоли и активировали (или «развили») in vitro. Такая форма иммунотерапии вызвала несколько случаев регресса меланомы и рака почек.

Термин «радиотерапевтическое средство», используемый в настоящем описании, как предполагается, относится к любому радиотерапевтическому средству, известному специалисту в данной области техники, для эффективного лечения или уменьшения интенсивности рака, без ограничения. Например, радиотерапевтическое средство может представлять собой средство, такое как препараты, вводимые при брахитерапии или радионуклеидной терапии. Такие методы необязательно могут также включать введение одной или нескольких дополнительных противораковых терапий, таких как, но без ограничения, химиотерапии и/или другая радиотерапия.

В предпочтительном воплощении противораковое лечение является лечением с блокадой контрольных точек противораковым иммунотерапевтическим средством.

Используемое в настоящем описании выражение «блокада контрольных точек противораковым иммунотерапевтическим средством» или «ингибирование иммунных контрольных точек» (оба выражения будут использоваться как взаимозаменяемые) имеет свое обычное значение в технике и относится к любому соединению, ингибирующему функцию белка иммунных контрольных точек. Ингибирование включает снижение функции и полную блокаду. Предпочтительными ингибиторами иммунных контрольных точек являются антитела, которые специфически узнают белки иммунных контрольных точек. Известен ряд ингибиторов иммунных контрольных точек, и по аналогии с этими известными ингибиторами белков контрольных точек в (ближайшем) будущем могут быть разработаны другие ингибиторы иммунных контрольных точек. Ингибиторы иммунных контрольных точек включают пептиды, антитела, молекулы нуклеиновых кислот и небольшие молекулы. В частности, ингибитор иммунных контрольных точек по настоящему изобретению вводят для усиления пролиферации, миграции, персистентности и/или цитотоксической активности CD8+ Т-клеток у субъекта и, в частности, инфильтрации опухоли CD8+ Т-клетками субъекта. При использовании в настоящем описании термин «CD8+ Т-клетки» имеет свое обычное значение в технике и относится к подмножеству Т-клеток, которые экспрессируют CD8 на своей поверхности. Они ограничиваются ГКГС класса I и функционируют как цитотоксические Т-клетки. «CD8+ Т-клетки» также называют цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL), Т-клетками-киллерами, цитолитическими Т-клетками или киллерными Т-клетками. Антигены CD8 являются членами супергенного семейства иммуноглобулинов и являются ассоциативными элементами узнавания во взаимодействиях, ограниченных главным комплексом гистосовместимости класса I. Способность ингибитора иммунных контрольных точек усиливать киллерную активность CD8 Т-клеток можно определить любым анализом, известным в технике. Обычно указанный анализ является анализом in vitro, в котором CD8+ Т-клетки вводят в контакт с клетками-мишенями (например, клетками-мишенями, которые узнаются и/или лизируются CD8+ Т-клетками). Например, ингибитор иммунных контрольных точек по настоящему изобретению можно выбрать по способности усиливать специфический лизис CD8+ Т-клетками более, чем примерно на 20%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50% или больше от специфического лизиса, полученного при том же эффекторе: отношении клеток-мишеней к CD8+ Т-клеткам или CD8 Т-клеточным линиям, которые введены в контакт с ингибитором иммунных контрольных точек по настоящему изобретению, примеры протоколов для классических анализов на цитотоксичность являются обычными.

Типично противораковое иммунотерапевтическое средство для блокады контрольных точек представляет собой средство, которое блокирует иммуносупрессорный рецептор, экспрессированный путем активации Т-лимфоцитов, такой как ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами белок 4 (CTLA4) и запрограммированной гибелью клеток 1 (PDCD1, более известный как PD-1), или NK клетками подобно различным членам семейства иммунолобулиноподобных рецепторов клеток-киллеров (KIR), или средство, которое блокирует основные лиганды таких рецепторов, таких как лиганд PD-1 CD274 (более известный как PD-L1 или B7-H1).

Типично противораковое иммунотерапевтическое средство для блокады контрольных точек представляет собой антитело.

В некоторых воплощениях иммунотерапевтическое средство для блокады контрольных точек представляет собой антитело, выбранное из группы, включающей антитела против CTLA4, антитела против PD1, антитела против PDL1, антитела против PDL2, антитела против TIM-3, антитела против LAG3, антитела против IDO1, антитела против TIGIT, антитела против B7H3, антитела против B7H4, антитела против BTLA и антитела против B7H6.

Примеры антител против CTLA-4 описаны в патентах США №№ 5811097, 5811097, 5855887, 6051227, 6207157, 6682736, 6984720 и 7605238. Одним из антител против CDLA-4 является тремелимумаб (тицилимумаб, CP-675206). В некоторых воплощениях антителом против CTLA-4 является ипилимумаб (также известный как 10D1, MDX-D010) - полноразмерное человеческое моноклональное антитело IgG, которое связывается с CTLA-4.

Примеры антител к PD-1 и PD-L1 описаны в патентах США №№ 7488802, 7943743, 8008449, 8168757, 8217149, опубликованных заявках на патент PCT №№ WO03042402, WO2008156712, WO2010089411, WO2010036959, WO2011066342, WO2011159877, WO2011082400 и WO2011161699. В некоторых воплощениях блокаторы PD-1 включают антитела против PD-L1 В некоторых других воплощениях блокаторы PD-1 включают антитела против PD-1 и подобных связывающих белков, такие как ниволумаб (MDX 1106, BMS 936558, ONO 4538) - семейство человеческих антител IgG4, которые связываются с и блокируют активацию PD-1 его лигандами PD-Ll и PD-L2; лпмбролизумаб (MK-3475 или SCH 900475) - гуманизированное моноклональное антитело IgG4 против PD-1; CT-011 - гуманизированное антитело, которое связывает PD-1; AMP-224 представляет собой слитый белок B7-DC; часть Fc антитела; BMS-936559 (MDX- 1105-01) для блокады PD-L1 (B7-H1).

Другие ингибиторы иммунных контрольных точек включают ингибиторы гена 3 активации лимфоцитов (LAG-3), такие как IMP321 - растворимый слитый белок Ig (Brignone et al., 2007, J. Immunol., 179: 4202-4211).

Другие ингибиторы иммунных контрольных точек включают ингибиторы В7, такие как ингибиторы B7-H3 и B7-H4, в частности, антитело против B7-H3 MGA271 (Loo et al., 2012, Clin. Cancer Res., July 15 (18) 3834).

Также включаются ингибиторы TIM3 (T-клеточный домен иммуноглобулина и домен муцина 3) (Fourcade et al., 2010, J. Exp. Med., 207: 2175-86, и Sakuishi et al., 2010, J. Exp. Med., 207: 2187-94). Используемый в настоящем описании термин «TIM-3» имеет свое обычное значение в технике и относится к молекуле 3, содержащей домен Т-клеточного иммуноглобулина и муцина. Природным лигандом TIM-3 является галектин 9 (Gal9). Соответственно, термин «ингибитор TIM-3», используемый в настоящем описании, относится к соединению, веществу или композиции, которые могут ингибировать функцию TIM-3. Например, ингибитор может ингибировать экспрессию или активность TIM-3, модулировать или блокировать сигнальный путь TIM-3 и/или блокировать связывание TIM-3 с галектином-9. Антитела, имеющие специфичность к TIM-3, хорошо известны в технике и типично являются антителами, описанными в WO2011155607, WO2013006490 и WO2010117057. В некоторых воплощениях ингибитором иммунных контрольных точек является ингибитор индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO), предпочтительно ингибитор IDO1. Примеры ингибиторов IDO описаны в WO 2014150677. Примеры ингибиторов IDO включают, без ограничения, 1-метилтриптофан (IMT), β-(3-бензофуранил)аланин, β-(3-бензо(b)тиенил)аланин), 6-нитротриптофан, 6-фтортриптофан, 4-метилтриптофан, 5-метилтриптофан, 6-метилтриптофан, 5-метокситриптофан, 5-гидрокситриптофан, индол-3-карбинол, 3,3'-дииндолилметан, галлат эпигалокатехина, 5-Br-4-Cl-индоксил-1,3-диацетат, 9-винилкарбазол, ацеметацин, 5-бромтриптофан, 5-броминдоксилдиацетат, 3-аминонафтойную кислоту, дитиокарбамат пирролидина, 4-фенилимидазол, производное брассинина, производное тиогидантоина, производное β-карболина или производное брассилексина. Предпочтительно ингибитор IDO выбирают из 1-метилтриптофана, β-(3-бензофуранил)аланина, 6-нитро-L-триптофана, 3-аминонафтойной кислоты и β-[3-бензо(b)тиенил]аланина или его производного или пролекарства.

В некоторых воплощениях ингибитором иммунных контрольных точек является антитело против TIGIT (домен T-клеточного иммуноглобулина и ITIM).

В предпочтительном воплощении противораковое иммунотерапевтическое средство для блокады иммунных контрольных точек представляет собой антитело, блокирующее CTLA4, такое как иплимумаб, или антитело, блокирующее PD-1, такое как нивомумаб или пембролизумаб, или их комбинация.

Далее изобретение будет поясняться с помощью приведенных фигур и примера. Этот пример и фигуры никоим образом не следует интерпретировать как ограничивающие объем настоящего изобретения.

ФИГУРЫ

Фигура 1 представляет собой схематическую иллюстрацию системы для осуществления изобретения.

Фигура 2 представляет собой блок-схему, поясняющую пример процедуры для осуществления изобретения.

Фигура 3 представляет собой кривую Каплана-Мейера для 5 предварительно установленных контрольных среднеарифметических значений процентиля.

ПРИМЕР

Контрольную группу пациентов с колоректальным раком в стадии I/II/III (n=539) анализируют согласно алгоритмическому методу оценки. Слайды целых опухолей окрашивают антителами к CD3 и CD8. С использованием программы цифрового анализа патологии и изображения определяют инвазивный край (IM) опухоли и середину (центр) опухоли (СТ). Определяют количественно плотность CD3 и CD8 в участках СТ и IM (клетки/мм²). Распределение по всей плотности или всем маркерам показывают на графиках и приводят в таблице. Получают соответствующие процентили (т.е., ступеньки с 5% интервалом). Вычисляют средние значения плотности 4 биомаркеров с весом 1 для каждого биомаркера, в примере, иллюстрированном в таблице ниже. Кривые Каплана-Мейера для каждой группы показаны на фигуре 3, причем 5 категорий групп (10, 11, 12, 13, 14) соответствуют средним значениям процентиля 0-10%, 10-25%, 25-75%, 75-95%, 95-100%, соответственно.

В следующих далее таблицах иллюстрируется пример вычисления среднеарифметического значения процентилей для гипотетического пациента.

Среднеарифметическое значение процентиля для гипотетического пациента может составлять примерно 47,5. Гипотетического пациента можно классифицировать как относящегося к группе 12.

Эксперименты такого же типа выполняют с 21 биологическим маркером, которые являются уровнями экспрессии 21 гена из группы, включающей CCR2, CD3D, CD3E, CD3G, CD8A, CXCL10, CXCL11, GZMA, GZMB, GZMK, GZMM, IL15, IRF1, PRF1, STAT1, CD69, ICOS, CXCR3, STAT4, CCL2 и TBX21, и с 15 биологическими маркерами, которые являются уровнями экспрессии 15 генов из группы, включающей GZMH, IFNG, CXCL13, GNLY, LAG3, ITGAE, CCL5, CXCL9, PF4, IL17A, TSLP, REN, IHH, PROM1 и VEGFA.

Весьма точные результаты получают путем вычисления значения медианы процентиля.

ССЫЛКИ

По ходу настоящей заявки в различных ссылках описывается уровень техники, к которой относится настоящее изобретение. Все эти работы полностью включены в настоящее изобретение в качестве ссылок.

1. Способ in vitro прогнозирования времени выживания пациента, страдающего от солидного рака, включающий следующие стадии:

а) детекция и количественное определение двух или больше биологических маркеров, показывающих статус иммунного ответа указанного пациента против указанного рака, причем детектируют in vitro каждый биологический маркер, показывающий статус иммунного ответа, и определяют количественно в образце опухоли, полученном от указанного пациента;

b) сравнение каждой из величин, полученных на стадии а) для указанных двух или больше биологических маркеров, с распределением величин, полученных для каждого из указанных двух или больше биологических маркеров от контрольной группы пациентов, страдающих от указанного рака;

с) определение для каждой величины, полученной на стадии а) для указанных двух или больше биологических маркеров, процентиля распределения, которому соответствуют величины, полученные на стадии а);

d) вычисление среднеарифметического значения или медианы процентиля биологических маркеров, определенных на стадии с); и

е) сравнение среднеарифметического значения или медианы процентиля, полученных на стадии d), с предварительно установленным контрольным среднеарифметическим значением или предварительно установленной контрольной медианой процентиля, которые коррелируют с временем выживания.

2. Способ оценки in vitro восприимчивости пациента, страдающего от солидного рака, к противораковому лечению, который включает следующие стадии:

а) детекция и количественное определение двух или больше биологических маркеров, показывающих статус иммунного ответа указанного пациента против указанного рака, причем детектируют in vitro каждый биологический маркер, показывающий статус иммунного ответа, и определяют количественно в образце опухоли, полученном от указанного пациента;

b) сравнение каждой из величин, полученных на стадии а) для указанных двух или больше биологических маркеров, с распределением величин, полученных для каждого из указанных двух или больше биологических маркеров от контрольной группы пациентов, страдающих от указанного рака;

с) определение для каждой величины, полученной на стадии а) для указанных двух или больше биологических маркеров, процентиля распределения, которому соответствуют величины, полученные на стадии а);

d) вычисление среднеарифметического значения или медианы процентиля биологических маркеров, определенных на стадии с); и

е) сравнение среднеарифметического значения или медианы процентилей, полученных на стадии d), с предварительно установленным контрольным среднеарифметическим значением или предварительно установленной контрольной медианой процентиля, которые коррелируют с реакцией на указанное противораковое лечение.

3. Способ по п.1 или 2, причем указанный солидный рак представляет собой колоректальный рак, рак молочной железы, рак легких, рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, рак яичников или рак предстательной железы.

4. Способ по п.3, причем солидный рак представляет собой колоректальный рак.

5. Способ по любому из пп.1-4, причем два или больше биологических маркеров включают клеточную плотность клеток из иммунной системы.

6. Способ по п.5, причем два или больше биологических маркеров включают плотность CD3+ клеток, плотность CD8+ клеток, плотность CD45RO+ клеток, плотность GZM-B+ клеток, плотность B-клеток и/или плотность DC клеток.

7. Способ по п.6, причем два или больше биологических маркеров включают плотность CD3+ клеток и плотность CD8+ клеток, плотность CD3+ клеток и плотность CD45RO+ клеток, плотность CD3+ клеток и плотность GZM-B+ клеток, плотность CD8+ клеток и плотность CD45RO+ клеток, плотность CD8+ клеток и плотность GZM-B+ клеток или плотность CD45RO+ клеток и плотность GZM-B+ клеток.

8. Способ по любому из пп.5-7, причем плотность клеток из иммунной системы определяют количественно в центре опухоли и/или в инвазивном крае опухоли.

9. Способ по п.8, причем два или больше биологических маркеров включают плотность CD3+ клеток в центре опухоли, плотность CD8+ клеток в центре опухоли, плотность CD3+ клеток в инвазивном крае и плотность CD8+ клеток в инвазивном крае.

10. Способ по любому из пп.5-9, причем плотность измеряют в участке образца опухоли, где плотность является наименьшей.

11. Способ по любому из пп.5-9, причем плотность измеряют в участке образца опухоли, где плотность является наибольшей.

12. Способ по любому из пп.1-11, причем два или больше биологических маркеров включают уровень экспрессии одного или нескольких генов из группы, включающей CCR2, CD3D, CD3E, CD3G, CD8A, CXCL10, CXCL11, GZMA, GZMB, GZMK, GZMM, IL15, IRF1, PRF1, STAT1, CD69, ICOS, CXCR3, STAT4, CCL2 и TBX21.

13. Способ по любому из пп.1-12, причем два или больше биологических маркеров включают уровень экспрессии одного или нескольких генов из группы, включающей GZMH, IFNG, CXCL13, GNLY, LAG3, ITGAE, CCL5, CXCL9, PF4, IL17A, TSLP, REN, IHH, PROM1 и VEGFA.

14. Способ по любому из пп.1-12, причем два или больше биологических маркеров включают уровень экспрессии по меньшей мере одного гена, характеризующего адаптивный иммунный ответ человека, и уровень экспрессии по меньшей мере одного гена, характеризующего иммуносупрессорный ответ человека.

15. Способ по п.14, причем по меньшей мере одни ген, характеризующий адаптивный иммунный ответ человека, выбирают из группы, включающей

CCL5

CCR2

CD247

CD3E

CD3G

CD8A

CX3CL1

CXCL11

GZMA

GZMB

GZMH

GZMK

IFNG

IL15

IRF1

ITGAE

PRF1

STAT1

TBX21

и указанный по меньшей мере одни ген, характеризующий иммуносупрессорный ответ человека, выбирают из группы, включающей

CD274

CTLA4

IHH

IL17A

PDCD1

PF4

PROM1

REN

TIM-3

TSLP

VEGF

16. Способ по любому из предшествующих пунктов, где каждый из биологических маркеров является нуклеиновой кислотой.

17. Способ по любому из предшествующих пунктов, где каждый биологический маркер детектируется посредством гибридизации мРНК и/или амплификации.

18. Способ по любому из пп.1-15, где каждый из биологических маркеров является белком.

19. Способ по любому из пп.1-15 и 18, где каждый биологический маркер детектируется посредством иммуногистохимии.