Применение 1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламина для торможения развития атеросклероза в эксперименте
Владельцы патента RU 2746321:
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр реабилитации и курортологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НМИЦ РК» Минздрава России) (RU)
Изобретение относится к медицине, фармакологии и биологии и касается применения 1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламина формулы:
в качестве средства, угнетающего общую (суммарную) активность лизосомального липолитического фермента - кислой фосфолипазы А1. Изобретение позволяет расширить арсенал средств против гиперлипидемий, для предотвращения атеросклеротических поражений кровеносных сосудов. 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 пр.
Изобретение относится к медицине, фармакологии и биологии и может быть использовано для повышения устойчивости сосудистой системы к холестерину при развитии гиперлипидемии в условиях патогенеза атеросклеротических поражений.
Известно, что на раннем этапе атерогенеза происходит активация эндотелия, который выделяет на своей поверхности адгезионные молекулы для моноцитов, нейтрофилов и лейкоцитов крови и продуцирует хемоаттрактанты, привлекающие моноциты в интиму сосудов. Моноциты, мигрирующие в субэндотелиальное пространство, дифференцируются в макрофаги, которые выступают как катализаторы образования окисленных липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), миграции и пролиферации гладкомышечных клеток из мышечной оболочки в интиму. Частицы модифицированных ЛПНП предпочтительно захватываются с помощью специфических рецепторов макрофагами, которые трансформируются в пенистые клетки. Активированные макрофаги, продуцирующие металлопротеиназы и коллагеназу, в определенных ситуациях способствуют распаду коллагена в бляшке и возникновению такого грозного осложнения, как разрыв бляшки, образование тромба и развитие инфаркта миокарда. Таким образом, обосновано, что макрофаги играют ключевую роль в развитии атеросклеротических повреждений (см. М.И. Душкин. Макрофаги и атеросклероз: патофизиологические и терапевтические аспекты. // Бюлл. СО РАМН, (2006); №2 (120), с.47-55). Доказано, что фосфолипазы являются биомаркерами активности атеросклеротического процесса, эффективности проводимой терапии как у больных атеросклерозом, так и у больных с осложнениями атеросклероза, в частности ишемической болезни сердца – ИБС (стенокардией напряжения II ФК) (см. С.Н. Богданова. Клинико-экспериментальное изучение влияния фактора питания на активность лизосомальных гидролаз тромбоцитов и мононуклеарных лейкоцитов при атеросклерозе. Автореф. дисс. канд., (1992), 28 с; Е.Н. Данковцев, Д.А. Затейщиков. Биомаркеры в кардиологии: липопротеинассоциированная фосфолипаза А2 //Фарматека (2007); №15 (149) Кардиология, Неврология, с.22-28).
Липидный профиль в значительной мере определяется состоянием макрофагов, их ферментативными реакциями. В этом плане заслуживают внимания исследования и разработки средств, изменяющих активность липаз макрофагов, в частности кислой фосфолипазы А1 (кФЛА1) (КФ 3.1.1.32) при оптимальном значении pH - 4,0, вызывающей деградацию структуры фосфолипидов, отщепляя ацильные остатки от углеродных атомов C1 в молекуле лецитина и других фосфолипидах, с образованием промежуточных продуктов гидролиза – лизолецитина и лизофосфолипидов, обладающих сильным мембранотоксическим действием (см. А.А. Покровский, В.А. Тутельян. Лизосомы. - Наука, 1976, 380 с.; X. Брокерхоф, Р. Дженсен Липолитические ферменты, пер. с англ., М., 1978, с.242-356). В литературе имеются сведения о возможности снижении общей (суммарной) активности кФЛА1 различными химическими соединениями (см.Н.Б. Губергриц. «Эссенциале форте Н», «Эссенциале Н» в гепатологии и гастроэнтерологии. Сучасна гастроентерологiя, №5 (43), 2008 р. с.79-89). Однако существует потребность в поиске и внедрении в практику новых диагностических и лекарственных средств, обладающих указанной активностью.
Выявленное изменение активности кФЛА1 можно рассматривать как компенсаторную реакцию ферментных систем на фоне преобладания процессов неспецифического нерегулируемого эндоцитоза модифицированных липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) или надмолекулярных ЛПНП-содержащих комплексов, когда специфический рецепторопосредованный путь эндоцитоза ЛПНП ингибируется по принципу обратной связи высокими концентрациями этерифицированного холестерина (ЭХС) (см. Погожева А.В. Сердечно-сосудистые заболевания, М., 2005 г., 205 с.). При этом в условиях субстратного насыщения может возникнуть относительная недостаточность отдельных лизосомальных ферментов, расщепляющих ЭХС, что приводит к аккумуляции ЭХС и триглицеридов в клетках и повышению риска развития атеросклероза (см. Нагорнев В.А. Патогенез атеросклероза. СПб: ″Хромис″, 2006).
Таким образом, влияние реакции кислой фосфолипазы А1 на деятельность субклеточных структур при развитии атеросклероза вызывает необходимость поиска и внедрения в практику новых диагностических и лекарственных средств, обладающих способностью изменять активность липаз микрофагов.
В качестве ближайшего аналога может быть указан источник: Расулов М.М., Воронков М.Г., Стороженко П.А., Мирскова А.Н., Снисаренко Т.А., Абзаева К.А., Ваганов М.А. и др. Применение комплекса трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метил-феноксиацетатом) цинка (цитриминана) для снижения общей активности кислой фосфолипазы А1 // Патент на изобретение RU № 2545888 С1, опубл. 10.04.2015.
Комплекс трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка (цитримин или цинкатран) обладает широким спектром терапевтического действия и отвечает формуле:
(НОСН2СН2)3N・Zn(ООССН2OС6Н4СН3-2)2,
цитримин имеет следующий вид:
К недостатку прототипа можно отнести небольшой эффект угнетения активности фосфолипазы.
Заявляемое изобретение относится к приоритетному направлению развития науки и технологий «Биомедицинские и ветеринарные технологии жизнеобеспечения и защиты человека и животных» [см. Алфавитно- предметный указатель к Международной патентной классификации по приоритетным направлениям развития науки и технологий / Ю.Г. Смирнов, Е.В. Скиданова, С.А. Краснов. – М.: ПАТЕНТ, 2008. – с.15].
Задача настоящего изобретения состоит в разработке нового средства, которое возможно применить для снижения общей активности кислой фосфолипазы А1.
Технический результат – расширение арсенала средств, обладающих свойством снижать общую активность кислой фосфолипазы А1 за счет выявленной новой биологической активности 1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламина.
Поставленная задача решается тем, что в качестве средства, понижающего общую активность кислой фосфолипазы А1, предлагается использовать синтезированное ранее (см. Воронков М.Г., Адамович С.Н. и др. Синтез новых биологически активных O-гидрометаллоатранов //ЖОХ, 2009, т.79, №1, С.162-163), биологически активное соединение – 1-(герматран-1-ил)-1- оксиэтиламин, который имеет формулу:
1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламин имеет следующий вид:
Известно, что 1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламин обладает адаптогенным действием [cм. Жигачёва И.В. Бинюков В.И., Миль Е.М., Генерозова И.П., Расулов М.М. Влияние германийорганического соединения на функциональное состояние митохондрий растительного и животного происхождения // Научный альманах (Биологические науки)2015,N 7(9), 955-966].
1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламин может быть использован в клинической медицине для создания препаратов, обладающих антигиперлипидемическим действием и не имеющих побочных эффектов.
Заявляемая биологическая активность 1-(герматран-1-ил)-1- оксиэтиламина в качестве средства, обладающего свойством снижать общую активность кислой фосфолипазы А1 не была известна и в литературе не описана.
Впервые показано, что введение 1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламина снижает активность лизосомального липолитического фермента кислой ФЛА1.
Предлагается применение 1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламина в качестве средства, угнетающего общую (суммарную) активность лизосомального липолитического фермента кислой фосфолипазы А1.
При этом 1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламин может применяться в виде раствора в официальном растворе 0,9% натрия хлорида или в воде для инъекций, официальной дистиллированной воде.
При этом раствор может содержать 5-20 мас.% 1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламина.
Активное вещество может применяться в дозе 5,0 мг/кг массы животного.
При разработке изобретения авторы использовали различные растворители для получения средства для воздействия на активность кислой ФЛА1. Были испытаны различные растворы на водной основе, в частности раствор вышеуказанного активного вещества в воде для инъекций, официальной дистиллированной воде и в официальном 0,9% растворе натрия хлорида. При этом во всех случаях были получены аналогичные результаты. Следует отметить, что нами исследовались полученные таким образом растворы с различной концентрацией активного вещества – 1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламина (5%, 10%, 20%, 50%, 70%). При этом положительные эффекты от их использования, отмеченные ниже, значимо не различались. В исследованиях использовали различные дозы активного вещества: от 0,1 мг/кг до 20 мг/кг массы животного. Эффект угнетения активности фермента кФЛА1 присутствовал во всех случаях и был прямо пропорционален дозе используемого активного вещества. Соответственно, для достижения указанного нами технического результата важным является как таковое новое свойство данного соединения, а не его доза или конкретный водный растворитель. Поэтому ниже, в примере, приведен для демонстрации только опыт с использованием активного вещества в дозе 5,0 мг/кг ежедневно. В данном случае применяли раствор активного вещества, который приготовляли ex tempore, используя официальную дистиллированную воду, смешивая с ней активное вещество.
Возможность осуществления изобретения может быть проиллюстрирована представленным ниже примером.
Пример
Эксперименты проводили на кроликах Шиншилла с исходной массой тела 1,8-2,0 кг в соответствии с «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации». Правила утверждены приказом Министерства здравоохранения РФ от 19.06.2003 г №267 (Правила лабораторной практики в Российской Федерации Министерства здравоохранения РФ Приказ от 19 июня 2003 года № 267 http:// www. kodeks.ru (24 апреля 2010г)). Животных содержали в соответствии с правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемыми для экспериментальных и иных научных целей. По окончании эксперимента животным проводили эвтаназию цервикальной дислокацией 5-го позвонка, соблюдая правила «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986).
1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламин смешивали «еx tempore» до полного растворения в официальной дистиллированной воде.
Комплекс трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка (цитримин, аналог) так же смешивали «ex tempore» до полного растворения в официальной дистиллированной воде.
Гиперлипидемию вызывали методом Н.Н.Аничкова-С.С.Халатова (известная экспериментальная модель атеросклероза).
Животных группировали по 10 голов следующим образом:
1) группа опыта, которым вводили внутримышечно свежеприготовленный раствор 1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламина в официальной дистиллированной воде с дозой активного вещества 5,0 мг/кг ежедневно в течение 2 месяцев.
2) группа плацебо-контроля, которым вводили внутримышечно эквиобъёмное количество официального 0,9% раствора натрия хлорида ежедневно в течение 2 месяцев.
3) группа животных, получавших внутримышечно свежеприготовленный раствор (в официальной дистиллированной воде) аналога – трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка в дозе активного вещества 5,0 мг/кг ежедневно в течение 2 месяцев.
Эталоном служили данные, полученные у интактных кроликов.
За 12 часов до забоя животных лишали пищи.
Под тиопенталовым наркозом вскрывали брюшную полость, перед выделением тщательно перфузируя печень охлажденным физиологическим раствором (0,9% хлорида натрия). Гомогенизацию печени проводили в стеклянном гомогенизаторе Поттера в течение 90 с при скорости вращения пестика 200g при поступательном движении стеклянного стакана гомогенизатора вверх-вниз. В качестве суспендирующей среды использовали 0,25М раствор сахарозы pH 7,4 с 1 мМ ЭДТА. Конечное разведение гомогенатов печени соответствовало 1:20 (вес : объем). Супернатант использовали для дальнейшего исследования активности кислой ФЛА1. Активность кислой ФЛА1 определяли радиометрическим методом (см. W. Stoffel, U. Trabert, Studies on the occurrence and properties of lisosomal phospholipases A1 and A2 and the degradation of phosphatidic acid in rat liver lysosomes//Hoppe Seylers Z. Fhysiol. Chem. - 1969. - Bd. 350. - S. 836-844), с использованием в качестве субстрата синтезированный ранее 1-ацил-2(1-14С)-олеоил-глицеро-3,sn-фосфорилхолин (A.F. Robertson, W.E.M. Leuds Positional specificities in phospholipid hydroly-ses//Biochemistry (Wash.). - 1962. - Vol.1. - P.804-810). Инкубационная смесь содержала 150 нМ меченого лецитина, 160 мкМ 0,1 N ацетатного буфера (pH 4,5) и источник ферментов в конечном объеме 1,3 мл. Инкубацию проводили на водяной вибробане в течение 30 мин при 37°C. Реакцию останавливали добавлением 3 мл смеси хлороформ:метанол (1:2 об/об) и немедленно экстрагировали по методу Клайера и Дайера. Продукты реакции разделяли с помощью тонкослойной хроматографии в закрепленном слое силикагеля на стеклянных пластинах размером 20/20 см в системе растворителей хлороформ:метанол:вода (65:25:4). Фракции лизолицетина, лецитина и жирных кислот экстрагировали смесью хлороформ:метанол при объемном соотношении 1:2. Экстракты помещали во флаконы с 10 мл сцинциляционной жидкости, содержащей в 100 мл толуола особой чистоты 5 г 2,5-дифенилоксазола и 300 мг 1,4 бис/2-(5-фенилоксазолил)-бензола. Радиоактивность измеряли на сцинтилляционном счетчике «Rackbeta 1215» ЛКБ (Швеция). Об активности кислой ФЛА1 судили по образованию меченого лизолицетина, получившегося в результате воздействия этих ферментов на 1-ацил-2(1-14С)-олеоил-глицеро-3, sn-фосфорилхолин. Активность ФЛА1 выражали в мкМ продукта в мин/1 г белка.
Статистическую обработку данных проводили методом Стьюдента. Данные представляли в виде средних и стандартных значений ошибки – М и m, соответственно. Для относительных величин рассчитывали 95% доверительные интервалы. Достоверными считали различия при р ≤ 0,05 (см. Петри А., Сэбин К., 2009).
Результаты.
Выявлено, что при применении 1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламина в ткани печени снижается уровень холестерола и общих липидов, а именно: при ежедневном введении водного раствора 1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламина в дозе активного вещества 5,0 мг/кг в течение 2 месяцев у животных выявлено достоверное снижение показателей липидного обмена, при этом активность кислой ФЛА1 в печени достоверно снижается по сравнению с контролем, приближается к эталонному показателю и меньше по сравнению с эффектом аналога – цитримина (таблица 1).
Корреляционный анализ выявил связь средней силы между уровнем активности кФЛА1 и показателями липидного обмена в печени после введения 1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламина (таблица 2).
Использование цитримина (аналога) также приводит к снижению активности кФЛА1. Однако, применение в течение 2 месяцев 1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламина вызывает более выраженное снижение показателей липидного обмена, следовательно, подтверждает его более высокую активность по сравнению с цитримином (аналогом) по снижению общей активности кислой фосфолипазы А1 – фермента, демонстрирующего активность атеросклеротического, гиперлипидемического процесса.
Изобретение позволит создать на основе 1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламина новые фармакологические препараты для понижения суммарной активности кислой фосфолипазы А1 и предотвращения склеротических поражений кровеносных сосудов.
Таблица 1.
Показатели липидного обмена при применении водного раствора 1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламина
| Показатели | Печень |
| Эталон - интактные | |
| Липиды общие (мМ/л) | 0,22±0,013 |
| Холестерол (мМ/л) | 0,12±0,01 |
| Триацилглицерины (мМ/л) | 0,36±0,01 |
| β- липопротеины (мМ/л) | 0,2+0,002 |
| Кислая фосфолипаза А1 (мкМ/мин/ на 1г белка) | 0,9±0,04 |
| Плацебо - контроль | |
| Липиды общие (мМ/л) | 1,4±0,09 ** |
| Холестерол (мМ/л) | 1,5±0,9 ** |
| Триацилглицерины (мМ/л) | 1,1±0,1 ** |
| β- липопротеины (мМ/л) | 1,8±0,1 ** |
| Кислая фосфолипаза А1 (мкМ/мин/ на 1г белка) | 4,1±0,2** |
| Аналог – цитримин в дозе 5,0 мг/кг | |
| Липиды общие (ммоль/л) | 0,6±0,05* |
| Холестерол (ммоль/л) | 0,26±0,05* |
| Триацилглицерины (ммоль/л) | 0,5±0,067* |
| β- липопротеины (ммоль/л) | 0,36±0,002* |
| Кислая фосфолипаза А1 (мкМ/мин/ на 1г белка) | 1,3±0,1* |
| Опыт 1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламин в дозе 5,0 мг/кг | |
| Липиды общие (мМ/л) | 0,23±0,01* |
| Холестерол (мМ/л) | 0,19±0,05* |
| Триацилглицерины (мМ/л) | 0,27±0,03* |
| β- липопротеины (мМ/л) | 0,28±0,01* |
| Кислая фосфолипаза А1 (мкМ/мин/ на 1г белка) | 0,97±0,03* |
Примечание : * - p<0.05 по отношению к контролю;
** - p<0.05 по отношению к эталону.
Таблица 2.
Коэффициенты корреляции (r) активности кислой ФЛА1 в печени с показателями липидного обмена при применении водного раствора 1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламина
| Энзим | Липиды общие | Холестерол |
Триацил -
глицерины |
β–липо-протеины |
| кФЛА1 | r=0,37 | r=0,38 | r=0,46 | r=0,48 |
1. Применение 1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламина формулы:
в качестве средства, угнетающего общую (суммарную) активность лизосомального липолитического фермента - кислой фосфолипазы А1.
2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что 1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламин используют в виде водного раствора в официальном растворе 0,9% натрия хлорида или в воде для инъекций, официальной дистиллированной воде.
3. Применение по п. 1 или 2, отличающееся тем, что 1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламин используют в виде раствора, содержащего 5-20 мас.% активного вещества.
4. Применение по п. 3, отличающееся тем, что применяют раствор, содержащий активное вещество 1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламин в дозе 5,0 мг/кг массы животного.
