Способ создания кольцевой формы ngs библиотеки для высокопроизводительного секвенирования на платформах технологии dnbseq

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ создания кольцевой формы NGS библиотеки для высокопроизводительного секвенирования на платформах технологии DNBSEQ, включающий следующие этапы: смешивание NGS библиотеки и сплинт-олигонуклеотида; лигирование концов фрагментов ДНК ферментом ДНК-лигазой; деградацию ДНК, находящейся не в кольцевой форме, ферментами экзонуклеазы; очистку полученных кольцевых фрагментов ДНК. При этом смешивание NGS библиотеки и сплинт-олигонуклеотида проводят в растворе, содержащем NaCl в концентрации 10 мМ. Перед этапом лигирования концов фрагментов ДНК осуществляют температурную обработку реакционной смеси по следующей программе: при температуре 95°С в течение 2 минут, при температуре 65°С в течение 2 минут, при температуре 40°С в течение 2 минут и при температуре 4°С в течение не менее 1 минуты. Длительность этапа лигирования концов фрагментов ДНК составляет не менее 1 часа при температуре 37°С. Изобретение позволяет снизить необходимое количество ДНК NGS библиотеки на подготовку ее к секвенированию на платформах DNBSEQ путем использования оптимизированного химического состава и оригинальных программ температурного режима; улучшить качества NGS библиотеки и получаемых данных секвенирования за счет сокращения количества циклов ПЦР в ходе создания NGS библиотеки. 1 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для приготовления образцов для высокопроизводительного секвенирования ДНК на платформах технологии DNBSEQ фирмы MGI.

Высокопроизводительное секвенирование (NGS) требует подготовки т.н. NGS библиотеки - фрагментов ДНК типичной длины 200-500 п.н. исследуемого генома, фланкированных определенными

последовательностями (адаптерами). Это относится к наиболее востребованным методам секвенирования короткой длины прочтения: секвенирование синтезом, используемое в инструментах Illumina (регистрация каждого присоединенного нуклеотида по временной метке) (Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. Bentley et al., 2008 Nov 6; 456(7218):53-9); секвенирование лигированием (принцип комплементарности цепей ДНК), используемое в инструменте SOLiD Life Technologies Thermo Fisher Scientific (Massively parallel signature sequencing. Methods Mol Biol. Zhou et al., 2006. 331:285-311), а также в более новых инструментах MGI (cPAS-based sequencing on the BGISEQ-500 to explore small non-coding RNAs. Clinical Epigenetics. Fehlmann et al., 2016 November 21; 8, 123).

Само приготовление библиотек имеет общий порядок действий, не зависит от технологии секвенирования, однако последний шаг до непосредственного считывания нуклеотидных последовательностей прибором, называемый подготовкой NGS-библиотеки к секвенированию, производится по-разному в зависимости от технологии секвенирования.

В платформах Illumina библиотеку денатурируют в растворе щелочи, после чего наносят на подложку проточной ячейки, в которой происходит секвенирование. На подложке каждая молекула копируется множество раз (амплифицируется) в т.н. кластеры, с которых потом происходит считывание флуоресцентного сигнала в ходе секвенирования (WO 1998044151 (А1), GLAXO GROUP LTD et al., 08.10.1998).

В платформе DNBSEQ фирмы MGI, библиотеку также подвергают множественному копированию для формирования похожих на кластеры повторяющихся последовательностей каждой молекулы NGS библиотеки: это происходит в ходе репликации по типу катящегося кольца Rolling Circle Amplification (RCA). Получающиеся ДНК молекулы являются множественными копиями фрагментов библиотеки, они наносятся на проточную ячейку, и они являются источником флуоресцентного сигнала в ходе секвенирования. Для осуществления RCA необходимо иметь фрагменты NGS библиотеки в кольцевом виде, т.е. соединить два конца каждого одноцепочечного фрагмента ДНК библиотеки в непрерывную молекулу ДНК. Так как изначально NGS библиотека имеет линейную форму, ДНК библиотеки переводится в кольцевой вид ферментативной реакцией, производящей лигирование концов некоторой доли молекул из всего образца. Реакция называется циркуляризацией NGS-библиотеки. В зависимости от технологии этой реакции доля фрагментов образца, подвергнутого циркуляризации, может отличаться.

Известен следующий способ создания кольцевых форм библиотек для NGS (WO 2007133831 (А2), COMPLETE GENOMICS INC et al., 22.11.2007). Он предлагает использовать несколько методов циркуляризации NGS-библиотеки, каждый из которых имеет недостатки. Так, первый предлагаемый метод подразумевает, что на NGS библиотеку доращивается дополнительная последовательность поли-Аденинов. Длину наращиваемого поли-А невозможно контролировать, что приводит к общей низкой эффективности циркуляризации.

Кроме того, достраиваемые фрагменты уменьшают возможность секвенирования фрагмента ДНК, относящегося непосредственно к образцу, что снижает количество данных получаемых в секвенировании в сравнении с другими методами.

Вторым методом предлагается иммобилизовать фрагменты библиотеки, что приводит к потере большого количества образца (более 90%).

В еще одном способе предлагается использовать длинный (более 40 нуклеотидов), соединяющий два конца каждого фрагмента, олигонулеотид (т.н. сплинт), что является неэффективным с точки зрения дороговизны используемого сплинт олигонуклеотида. При этом отсутствует какая-либо гибридизация сплинт олигонуклеотида с фрагментами NGS библиотеки. Это приводит к тому, что требуется большое количество NGS библиотеки, около 10 пмоль, что как минимум 10 раз превышает требования других известных методов.

Известен способ создания библиотек в кольцевой форме, используемый самой компанией MGI (ЕР 3192877 (A1), BGI SHENZHEN СО LTD, 19.07.2017). Метод описывает процесс перевода NGS библиотеки в кольцевую форму как часть процесса создания NGS библиотеки из стартового материала РНК. В данном способе эффективность циркуляризации не превышает 15% и, как следствие, требуется сравнительно большое для NGS секвенирования (около 400 нг, или около 1 пмоль) количество ДНК библиотеки.

Кроме того, перед процессом циркуляризации в способе вынужденно выполняется процесс изоляции одноцепочечной ДНК (одной из двух цепей каждого фрагмента NGS библиотеки) путем иммобилизации одной из цепей на магнитных частицах. Это является дополнительным шагом, который приводит к частичной потере образца в ходе очистки на магнитных частицах. Прототипом патентуемого изобретения является метод создания кольцевой формы NGS-библиотек с помощью двойного лигирования адаптеров компании MGI (ЕР3207169 (B1), MGI TECH СО LTD, 01.07.2020).

Циркуляризация в нем осуществляется в 5 этапов. Начинается процесс либо с денатурации NGS библиотеки, либо с изоляции одной из ДНК цепей каждого фрагмента NGS библиотеки. Далее, оставшиеся ДНК цепи каждого фрагмента смешиваются с сплинт-олигонуклеотидом. Сплинт имеет комплементарность к обоим концам одноцепочечного фрагмента NGS библиотеки и призван повысить эффективность замыкания ДНК фрагмента в кольцо. Далее, в реакционную смесь добавляется фермент ДНК лигаза и концы фрагмента NGS библиотеки лигируются друг с другом, переводя часть фрагментов NGS библиотеки в кольцевой вид. Далее, в раствор добавляются экзонуклеазы, деградирующие любую ДНК в некольцевой форме, т.е. те фрагменты ДНК, которые не были переведены в кольцевой вид. Наконец, идет очистка кольцевой ДНК от реакционной смеси, после которой получается очищенная от ферментов и солей NGS библиотека в кольцевой форме.

Минусом прототипа является необходимость модифицировать одну из цепей фрагментов NGS библиотеки биотином, чтобы селективно отбирать только одну из цепей каждого фрагмента NGS библиотеки. Способ также обладает низкой эффективностью циркуляризации и необходимостью создания большого количества NGS библиотеки из большого количества исходного материала: в примерах использовалось по 3 мкг ДНК на каждую NGS библиотеку. Кроме того, метод приводит к созданию больших молекул за счет лигирования фрагментов библиотеки друг с другом, вплоть до размера 50-250 тысяч пар нуклеотидов.

Нами поставлена задача повысить эффективность процесса циркуляризации NGS библиотеки и уменьшить требуемое для одной реакции количество NGS библиотеки. Это позволит снизить требования к количеству ДНК на всех предыдущих этапах, и как следствие, улучшить качество образца и получаемых в ходе секвенирования данных.

Это особенно важно для таких применений NGS как секвенирования экзома и транскриптома человека, где лишние ПЦР циклы в ходе создания NGS библиотеки сильно снижают качество получаемого результата.

Кроме того, нами поставлена задача: разработать способ создания кольцевой формы NGS библиотеки, позволяющий использовать доступные реагенты и ферменты любого производителя, работать не с помощью закрытых коммерческих наборов (MGI), а с любыми, в том числе, более бюджетными, аналогами ферментов и химических реактивов.

Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в:

снижении необходимого количества ДНК NGS библиотеки на подготовку ее к секвенированию на платформах DNBSEQ путем использования оптимизированного химического состава и оригинальных программ температурного режима;

улучшении качества NGS библиотеки и получаемых данных секвенирования за счет сокращения количества циклов ПЦР в ходе создания NGS-библиотеки.

Нами предложено введение новых этапов в процесс циркуляризации NGS-библиотеки, изменение состава реакционной смеси, температурных режимов и их длительности.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Способ создания кольцевой формы NGS библиотеки для высокопроизводительного секвенирования на платформах технологии DNBSEQ включает следующие этапы: смешивание NGS библиотеки и сплинт-олигонулкеотида; лигирование концов фрагментов ДНК ферментом ДНК-лигазой; деградацию ДНК, находящейся не в кольцевой форме, ферментами экзонуклеазы; очистку полученных кольцевых фрагментов ДНК. При этом смешивание NGS библиотеки и сплинт-олигонулкеотида проводят в растворе, содержащем NaCl в концентрации 10 мМ. Перед этапом лигирования концов фрагментов ДНК осуществляют температурную обработку реакционной смеси по следующей программе: при температуре 95°С в течение 2 минут, при температуре 65°С в течение 2 минут, при температуре 40°С в течение 2 минут и при температуре 4°С в течение не менее 1 минуты Длительность этапа лигирования концов фрагментов ДНК составляет не менее 1 часа при температуре 37°С.

Способ осуществляют следующим образом.

Для перевода NGS библиотеки в кольцевую форму (циркуляризации) используются следующие расходные материалы:

- Пробирки на 1,5 мл без ДНКаз;

- Штативы под 1,5 мл пробирки;

- Микропробирки LoBind 1,5 мл (Eppendorf) или аналоги;

- 96% этанол;

- Носы с фильтрами 2-20, 20-300, 300-1200 типа Vertex (SSI) или аналоги.

- AMPure ХР магнитные частицы или аналогичные им

- Набор для Qubit ssDNA или аналоги

- Сплинт олигонулеотид 5'-GCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGG-3'

- LowTE буфер

- NaCl раствор 200 мМ

- Лигаза Т4 из расчета 200 ед/мкл с рабочим буфером

- Exo I и Exo III нуклеазы

- ЭДТА 0.5 Μ раствор

- Вода mQ качества

- Лед в форме

- Носы к автоматическим пипеткам выбранного производителя

Для циркуляризации используются следующее оборудование:

- Термоциклер ПЦР под 0.2 мл пробирки;

- Qubit 2+ версии (Life Technologies) или аналог;

- Центрифуга и Вортекс Microspin FV-2400 (Biosan) или аналог;

- Автоматические пипетки Eppendorf в диапазоне объемов от 0,5 до 10 мкл, от 2 до 20 мкл, от 200 до 200 мкл, от 100 до 1000 мкл или аналоги с носами на пипетки (к ним необходимы носики с фильтрами);

Протокол проведения циркуляризации заключается в следующих шагах:

1. Добавить в ПЦР пробирку нужное кол-во ДНК библиотеки (протестировано на 15-600 нг) объемом V мкл до 30 мкл.

2. Добавить 38 - V мкл (до общего объема 38 мкл) Low ТЕ буфера.

3. Добавить 2 мкл 200 мМ раствора NaCl.

4. Добавить 1 мкл 100 мкМ раствора сплинт олигонуклеотида.

5. Перемешать и поставить на программу гибридизации:

1. 95°С 2 минуты,

2. 65°С 2 минуты,

3. 40°С 2 минуты,

4. 4°С хранение.

6. Когда температура опустится до 4°С, переместить образцы на 4°С или на лед на не менее чем 1 минуту.

7. Сбросить капли на микроцентрифуге.

8. На льду добавить 5 мкл 10х буфера для лигирования, 4 мкл Лигазы Т4 (200 ед/мкл), перемешать пипетированием, коротко центрифугировать.

9. Поставить в термоциклер на 37°С на не менее чем 1 час.

10. Достать, сбросить капли на микроцентрифуге.

11. Добавить не менее 6 ед. Exo I и не менее 30 ед. Exo III нуклеаз, соответственно, перемешать пипетированием.

12. Поставить в термоциклер на 37°С на 30 минут.

13. Добавить 2 мкл 0.5 Μ раствора ЭДТА, перемешать, перенести в 1.5 пробирку.

14. Добавить 120 мкл магнитных частиц (AMPure ХР или аналог).

15. 10 минут инкубации на комнатной температуре, поставить на магнитный штатив, отобрать супернатант.

16. 2 раза промыть 200 мкл 80% этанола на магнитном штативе, отобрать этанол, высушить в течение 5 минут с открытой крышкой.

17. Добавить 20 мкл mQ воды, перемешать, инкубировать 10 минут на столе.

18. Перенести на магнитный штатив, отобрать 18 мкл супернатанта, перенести в новую пробирку.

19. Измерить концентрацию с помощью набора Qubit ssDNA, в зависимости от количества библиотеки в реакции, взять 2 мкл или более.

20. Посчитать соотношение общего количества одноцепочечной ДНК к изначальному количеству добавленной библиотеки в нг. Нормальным выходом является показатель выше 15%.

Пример.

В таблице приведены результаты циркуляризации методом, описанным в предлагаемом способе (предлаг.цирк.) и методом, предлагаемым производителем MGI их коммерческим набором (MGI цирк.). Для одних и тех же образцов приведены: количество ДНК NGS библиотеки, добавленной в реакцию для ее перевода в кольцевую форму (вход, нг); кол-во кольцевой ДНК NGS библиотеки, полученной из добавленной, после реакции циркуляризации (выход, нг); эффективность циркуляризации, доля переведенной в кольцевую форму ДНК, измеренной в процентах. Видно, что в каждом образце эффективность циркуляризации, сделанной в соответствии с предлагаемым способом, минимум в 2 раза выше эффективности циркуляризации, выполненной по способу-прототипу. Кроме того, количество ДНК в предлагаемом методе было 30 нг, т.е. около 0.1-0.2 пмоль фрагментов NGS библиотеки (в зависимости от средней длины фрагментов). Это как минимум в 5 раз меньше 1 пмоль, требуемого для цикруляризации по способу-прототипу. Таким образом, для каждой NGS-библиотеки из примера, требуемое количество библиотеки, необходимой для секвенирования, понижается минимум в 10 раз за счет предлагаемого метода циркуляризации.

Таким образом, представленные данные подтверждают повышение эффективности циркуляризации, снижение необходимого количества NGS библиотеки для проведения циркуляризации, уменьшение требований к количеству NGS библиотеки, необходимой для секвенирования, в результате использования предлагаемого способа.

Способ создания кольцевой формы NGS библиотеки для высокопроизводительного секвенирования на платформах технологии DNBSEQ, включающий смешивание NGS библиотеки и сплинт-олигонуклеотида; лигирование концов фрагментов ДНК ферментом ДНК-лигазой; деградацию ДНК, находящейся не в кольцевой форме, ферментами экзонуклеазы; очистку полученных кольцевых фрагментов ДНК, отличающийся тем, что смешивание NGS библиотеки и сплинт-олигонуклеотида проводят в растворе, содержащем NaCl в концентрации 10 мМ; перед этапом лигирования концов фрагментов ДНК осуществляют температурную обработку реакционной смеси по следующей программе: при температуре 95°С в течение 2 минут, при температуре 65°С в течение 2 минут, при температуре 40°С в течение 2 минут и при температуре 4°С в течение не менее 1 минуты; а длительность этапа лигирования концов фрагментов ДНК составляет не менее 1 часа при температуре 37°С.