Адаптированный для морских свинок штамм эзмс 2020 вируса эбола-заир, предназначенный для проведения доклинических испытаний медицинских средств защиты в отношении геморрагической лихорадки эбола

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Штамм ЭЗМС 2020 вируса Эбола-Заир, адаптированный для морских свинок, обладающий способностью вызывать выраженное заболевание с проявлением геморрагического синдрома, зарегистрирован в Национальной коллекции штаммов вирусов геморрагических лихорадок I группы патогенности ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России под регистрационным номером НКВ-26. Изобретение обеспечивает проведение доклинических испытаний медицинских средств защиты в отношении геморрагической лихорадки Эбола. 2 з.п. ф-лы, 6 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области микробиологии, а именно вирусологии, и представляет собой адаптированный для морских свинок штамм ЭЗМС 2020 вируса Эбола-Заир - возбудителя геморрагической лихорадки Эбола.

Изобретение может быть использовано в вирусологических и иммунологических исследованиях для выявления эффективности медицинских средств защиты в отношении геморрагической лихорадки Эбола при проведении доклинических испытаний.

Геморрагическая лихорадка, вызванная вирусом Эбола (семейство Filoviridae, род Ebolavirus) является особо опасным вирусным инфекционным заболеванием, характеризующимся летальным исходом в 50-90% случаев [Duraffour, S. How to treat Ebolavirus infections? A lesson from the field. [Text] / S. Duraffour, D. Malvy, D. Sissoko [et al.] // Curr. Opin. Virol. 2017; 24: 9-15. doi: 10.1016/j.coviro.2017.03.003; Feldmann, H. Ebola virus: From discovery to vaccine [Text] / H. Feldmann; S. Jones; H.D. Klenk; H.J. Schnittler // Nat. Rev. Immunol. 2003; 3: 677-685; Hunt, C.L. Filovirus entry: a novelty in the viiralfusion world [Text] / C.L. Hunt, N.J. Lennenmann, W. Maury // Viruses 2012; 4:258-275; Kibuuka, H. Safety and immunogenicity of Ebola virus and Marburg virus glycoprotein DNA vaccines assessed separately and concomitantly in healthy Ugandan adults: a phase Ib, randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial [Text] / H. Kibuuka, N. Bercowitz, M. Millard [et al.] //Lancet. 2015; 385: 1545-1554; Rojek, A. Insights from clinical research completed during the West Africa Ebola virus disease epidemic [Text] / A. Rojek, P. Horby, J. Dunning // Lancet Infect Dis. 2017; 17: e280-e292. doi: 10.1016/S1473-3099(17)30234-7].

Первые эпидемические вспышки геморрагической лихорадки Эбола практически одновременно были зарегистрированы в 1976 г. в Заире и Судане.

В декабре 2013 г. - мае 2016 г. в Западной Африке произошла крупнейшая эпидемия лихорадки Эбола за всю историю наблюдений. Общее количество заболевших (подтвержденные случаи) с декабря 2013 г. по июнь 2016 г. составило 28652, из них погибло 11325 человек [Rojek, A. Insights from clinical research completed during the West Africa Ebola virus disease epidemic [Text] / A. Rojek, P. Horby, J. Dunning // Lancet Infect Dis. 2017; 17: e280-e292. doi: 10.1016/S1473-3099(17)30234-7; Center for Disease Control and Prevention.2014 Ebola Outbreak in West Africa - Case Counts [Internet]. 2014 [cited 2016 Sep 15]. Электронный ресурс: http://www.cdc.gov/vhf/ebola/outbreaks/2014-west-africa/case-counts. html.].

В ходе эпидемической вспышки 2013-2016 гг. зарегистрированы случаи завоза заболевания в неэндемичные регионы, в том числе и в Западную Европу и США.

Вирус Эбола-Заир является представителем рода Ebolavirus семейства Filoviridae. Вирион вируса Эбола содержит нефрагментированную «минус» РНК, содержащую приблизительно 19 тыс нуклеотидных остатков и кодирующую 7 структурных и 1 неструктурный белок. Порядок генов на геноме: 3'-концевая лидерная область, гены нуклеопротеина, вирусных белков VP35, VP40, гликопротеина, VP30, VP24, L (РНК-зависимая РНК-полимераза), 5'-концевой нетранслируемый участок. Функции белков: NP - нуклеопротеин, VP35 - кофактор полимеразы, VP40 - основной матричный белок, GP - гликопротеин, VP30 - активатор транскрипции, VP24 - минорный матричный белок, L - РНК-зависимая РНК-полимераза. Нуклеопротеин, белки VP30, VP35 и L - ассоциированы с вирусной геномной РНК в рибонуклеопротеиновый комплекс. L белок и белок VP35 образуют полимеразный комплекс, который транскрибирует и реплицирует вирусный геном [Albarino, C.G. Genomic analysis of filoviruses associated with four viral hemorrhagic fever outbreaks in Uganda and the Democratic Republic of the Congo in 2012 [Text] / C.G. Albarino, T.Shoemaker, M.L Khristova [et al.] // Virology. 2013; 442: 97-100.].

Вирусные белки играют ключевую роль во взаимодействии вирус-хозяин при Эбола-вирусной инфекции, соответствующие гены при этом могут подвергаться селективному давлению. Гликопротеин вируса Эбола индуцирует разрушение эндотелиальных клеток и цитотоксичность в кровеносных сосудах [Yang, Z.Y. Identification of the Ebola virus glycoprotein as main viral determinant of vascular cell cytotoxicity and injury [Text] / Z.Y. Yang, H.J. Duckers, N.J Sullivan., [et al.] //Nat Med.- 2000;. 6: 886-889.] и опосредует вхождение в хозяйскую клетку. Мутации в гене белка VP24 ассоциированы с адаптацией вируса Эбола к различным хозяевам [Volchkov, V.E. Processing of Ebola virus glycoprotein be polyprotein convertase furin / V.E. Volchkov, F H. Eldmann, V.A. Volchkova, H.D. Klenk [Text] // PNAS USA. 1998;. 95: 5762-5767.]. Белки NP и VP40 вызывают сильный иммунный ответ (индуцирование формирования специфических иммуноглобулинов изотипа IgG). Мутации в гене белка VP24 ассоциированы с адаптацией вируса Эбола к различным хозяевам [Albarino, C.G. Genomic analysis of filoviruses associated with four viral hemorrhagic fever outbreaks in Uganda and the Democratic Republic of the Congo in 2012 [Text] / C.G. Albarino, T.Shoemaker, M.L Khristova [et al.] // Virology. 2013; 442: 97-100].

Вспышка 2013-2016 гг. явилась мощным побудительным фактором для разработки новых средств профилактики и лечения геморрагической лихорадки Эбола, в том числе вакцин нового поколения; препаратов на основе вирусспецифических гуманизированных моноклональных антител (МКАт) к вирусу Эбола новых классов неспецифических средств медицинской защиты.

Обычно используемая схема отбора препаратов для профилактики и лечения вирусных инфекционных заболеваний на этапе in vivo включает в себя:

- испытания in vivo на мелких лабораторных животных;

- испытания in vivo на животных, адекватно моделирующих соответствующие признаки заболевания человека при экспериментальной инфекции.

Как правило, проведение испытаний на заключительном этапе целесообразно проводить только при получении положительных результатов при испытаниях in vivo на мелких лабораторных животных. Испытания in vivo на мелких лабораторных животных являются важным промежуточным звеном между относительно дешевыми скрининговыми испытаниями in vitro и дорогостоящими испытаниями на низших приматах (животных, моделирующих соответствующие признаки заболевания человека при экспериментальной инфекции Эбола).

В исследованиях с вирусом Эбола используют различные виды низших приматов и грызунов. В настоящее время считают, что среди животных с полноценным иммунным статусом летальные модели для вируса Эбола (дикий тип) ограничены низшими приматами, для которых характерно тяжелое течение заболевания, заканчивающееся гибелью. Однако проведение работ с этими лабораторными животными, инфицированными возбудителями I группы патогенности, связано с высоким риском для персонала лабораторий и с высокими экономическими затратами при проведении исследований на предварительных этапах. Поэтому данных лабораторных животных целесообразно использовать лишь на заключительных стадиях доклинической оценки.

При предварительных испытаниях на мелких лабораторных животных необходимо провести выбор штамма вируса, его адаптацию к чувствительной лабораторной модели, выбор способа инфицирования.

Из мелких лабораторных животных в качестве лабораторной модели при исследованиях, проводимых с возбудителями особо опасных вирусных геморрагических лихорадок, наиболее часто используют морских свинок. Однако инфицирование данных лабораторных животных дикими штаммами возбудителей арена- и филовирусных геморрагических лихорадок, как правило, приводит к слабовыраженным признакам заболевания (низкий уровень вирусемии, отсутствие выраженной лихорадки и проявлений геморрагического синдрома). Гибель животных носит спорадический характер, зависимость «доза - эффект» отсутствует.

Целью настоящего изобретения является создание адаптированного для морских свинок штамма вируса Эбола-Заир, предназначенного для проведения доклинических испытаний медицинских средств защиты (МСЗ) в отношении геморрагической лихорадки Эбола.

Для решения указанной задачи были проведены следующие исследования:

- обогатительный пассаж штамма Заир вируса Эбола-Заир через игрунков обыкновенных (Callithrix jacchus);

- последовательные пассажи полученного вируссодержащего материала через печень морских свинок с определением доли погибших животных и времени гибели после инфицирования (диапазон варьирования и средняя величина показателя);

- определение у культуры, прошедшей 5 последовательных пассажей через печень морских свинок, для которой установлена 100% гибель инфицированных животных, показателей подлинности (по результатам обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в реальном времени) и молекулярно-генетических маркеров вирулентности, установленных в результате секвенирования геномной РНК полученного штамма ЭЗМС 2020 вируса Эбола-Заир;

- определение для штамма ЭЗМС 2020 вируса Эбола-Заир величины ЛД₅₀ для морских свинок при внутрибрюшинном инфицировании (далее ЛД₅₀ МСВБ);

- определение для штамма ЭЗМС 2020 вируса Эбола-Заир величины ЛД₅₀ МСВБ, выраженной в БОЕ, с обоснованием возможности расчета инфицирующей дозы, укладывающейся в диапазон 10…30 ЛД₅₀, традиционно используемый при проведении доклинических испытаний МСЗ.

Сущность изобретения заключается в получении при проведении пассажей штамма Заир вируса Эбола-Заир (1 обогатительный пассаж через игрунков и 5 последовательных пассажей через печень морской свинки), штамма ЭЗМС 2020 вируса Эбола-Заир, адаптированного к морским свинкам и вызывающего у них зависимую от вводимой дозы гибель.

Адаптированный для морских свинок штамм вируса Эбола-Заир (с определенными генетическими маркерами вирулентности), вызывающий у данных лабораторных животных зависимую от вводимой дозы гибель, в РФ аналогов не имеет.

Техническим результатом настоящего изобретения является:

- установление зависимости «доза - эффект» при экспериментальной инфекции лихорадки Эбола у морских свинок при инфицировании их культурой штамма ЭЗМС 2020 вируса Эбола-Заир, что определяет возможность корректного расчета величины ЛД₅₀ МСВБ и возможность точного задания заражающих доз, используемых при проведении доклинических испытаний МСЗ (укладывающихся в диапазон 10…30 ЛД₅₀), выраженных в ЛД₅₀ для морских свинок при данном способе инфицирования;

- определение при использовании адаптированного к морским свинкам варианта штамма ЭЗМС 2020 вируса Эбола-Заир величины ЛД₅₀ МСВБ, выраженной в БОЕ, что дает возможность быстрого установления реальной величины инфицирующих доз, используемых при проведении экспериментов;

- методическое обеспечение проведения доклинических испытаний разрабатываемых МСЗ по отношению к лихорадке Эбола.

Указанный технический результат достигается за счет способности полученного штамма ЭЗМС 2020 вируса Эбола-Заир вызывать у морских свинок зависимую от вводимой дозы гибель. Генотипические изменения штамма ЭЗМС 2020 по сравнению с исходным штаммом Заир вируса Эбола-Заир подтверждены результатами секвенирования геномной РНК.

При получении адаптированных для лабораторных животных генетически измененных вариантов возбудителей особо опасных арена- и филовирусных геморрагических лихорадок используется универсальная схема, включающая:

- выбор исходного штамма возбудителя;

- выбор культуры возбудителя, используемой при получении адаптированного варианта;

- проведение последовательных пассажей через орган-мишень лабораторного животного с определением показателей, косвенно характеризующих изменение вирулентности;

- установление количества пассажей необходимого для достижения заданного уровня вирулентности для выбранной лабораторной модели при конкретном способе инфицирования;

- комплексное сравнение характеристик исходного штамма и адаптированного варианта.

По данным литературы, для доклинической оценки МСЗ в отношении лихорадки Эбола в исследованиях наиболее часто используют следующие штаммы вируса Эбола-Заир (как наиболее патогенного для человека представителя рода Ebolavirus):

- штамм Заир 76 или штамм Mayinga, выделенные в ходе эпидемии ЗВВЭ в Заире в 1976 г.;

- штамм Киквит-95, выделенный в ходе эпидемии ЗВВЭ в Заире (г. Киквит) в 1995 г.;

- штамм Макона, выделенный в ходе вспышки 2013-2016 гг. в Западной Африке.

В настоящее время считают, что эффективность разрабатываемых защитных препаратов целесообразно испытывать при использовании штамма, выделенного в ходе вспышки [Sewlall, N.H. Clinical features and patient management of Lujo hemorrhagic fever [Text] / N.H. Sewlall, G. Richards, A. Duse, R. Swanepoel, J. Paweska [et al.] // PLoS Negleted Trop Dis. 2014;Vol. 8, Iss. 11: e3233.].

При получении адаптированного для морских свинок штамма вируса Эбола-Заир в качестве исходного нами был использован штамм Заир, депонированный в Национальной коллекции возбудителей геморрагических лихорадок I группы патогенности ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России.

Некоторые характеристики исходного штамма Заир вируса Эбола-Заир представлены в таблице 1.

Следующим этапом проводимых нами исследований стал выбор культуры возбудителя, используемой при получении адаптированного варианта.

При получении варианта вируса Эбола-Заир, адаптированного для морских свинок, мы исходили из предположения, что в процессе традиционно используемой при проведении данной процедуры схемы проведения серийных пассажей через печень инфицированных животных происходит селективный отбор уже существующего в популяции дикого типа вируса варианта, обладающего выраженной патогенностью для морских свинок.

Концентрация указанного варианта пропорциональна концентрации общей популяции биологически активного вируса в исследуемой вируссодержащей культуре.

Эксперименты по воспроизведению экспериментальной геморрагической лихорадки Эбола у игрунков обыкновенных (Callithrix jacchus), характеризующихся массой тела, сопоставимой с массой морской свинки (350…400 г), и высокой восприимчивостью к заражению вирусами «дикого типа», адекватно моделирующих симптомы заболевания человека, показали, что уровень накопления возбудителя в органе-мишени (печень) примерно на порядок выше, чем при использовании традиционно используемых видов низших приматов. Последующие эксперименты были проведены исходя из предположения, что концентрация вирулентного для морских свинок изолята также будет на порядок выше, чем для дикого типа вируса.

Данные, полученные при проведении серийных пассажей через печень морских свинок культуры штамма Заир вируса Эбола-Заир, прошедшего 1 пассаж через печень Callithrix jacchus, представлены в таблице 2.

Как следует из данных, представленных в таблице 2, проведение 5 последовательных пассажей через печень морских свинок культуры штамма Заир вируса Эбола, прошедшего 1 пассаж через печень Callithrix jacchus, оказалось достаточным для получения варианта, вызывающего 100% гибель морских свинок при высоких заражающих дозах. Поскольку при проведении последующего (VI) пассажа через печень морских свинок мы наблюдали некоторое снижение уровня накопления биологически активного вируса, в качестве исходной культуры для дальнейшей наработки биомассы материала адаптированного для морских свинок варианта вируса Эбола-Заир следует использовать культуру, полученную при проведении пассажа V.

Нами были определены молекулярно-биологические маркеры вирулентности полученного адаптированного для морских свинок варианта вируса Эбола-Заир. С этой целью нами проведено секвенирование геномной РНК адаптированного варианта и исходного штамма Заир вируса Эбола-Заир. Данный процесс включал в себя пробоподготовку вируссодержащих культур для выделения геномной РНК, выделение геномной РНК, проведение реакции обратной транскрипции для получения ДНК-копии геномной РНК, проведение амплификации выбранных фрагментов кДНК геномной РНК, определение первичной структуры нуклеотидной последовательности выбранных фрагментов кДНК по Сенгеру.

Современный вариант данного метода основан на электрофоретическом разделении продуктов сиквенсной реакции, представляющих собой набор фрагментов ДНК различной длины, полученных случайным встраиванием в синтезируемую цепь флуоресцентно-меченых дидезоксирибонуклеотидов, что приводит к остановке синтеза данного фрагмента. Различная длина полученных фрагментов обуславливает их различную подвижность в специальном полимере в условиях капиллярного электрофореза. Регистрация аналитического сигнала одновременно по четырем каналам детекции, соответствующим определенным нуклеотидам, позволяет установить первичную последовательность ДНК. Разделение продуктов сиквенсной реакции происходит методом капиллярного электрофореза в специальных автоматических приборах, к которым относится используемый в наших экспериментах генетический анализатор «Нанофор-05» (ИАП РАН, Россия). Обработку и анализ полученной информации проводили, используя пакеты компьютерных программ DNAStar и Oligo 4.0 в соответствии с рекомендациями разработчика.

При проведении секвенирования геномных РНК адаптированного варианта и исходного штамма Заир вируса Эбола выявлены несинонимические (приводящие к замене кодируемой аминокислоты замены), нуклеотидные замены, представленные в таблице 3.

Как следует из данных, представленных в таблице 3, молекулярно-биологические маркеры вирулентности полученного адаптированного для морских свинок варианта вируса Эбола-Заир представляют собой пять несинонимических замен в нуклеотидной последовательности геномной РНК в генах белков VP24 C-G (позиции 10097, 10325, 10444) и L (позиции 12206 и 12435).

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что в результате проведения одного обогатительного пассажа исходной культуры штамма Заир вируса Эбола через печень Callithrix jacchus и 5 последовательных пассажей через печень морских свинок был получен адаптированный к последним животным вариант штамма Заир вируса Эбола, вызывающий их 100% гибель. Результаты сравнения некоторых характеристик для исходного штамма и адаптированного варианта, получившего название штамм ЭЗМС 2020 вируса Эбола-Заир, представлены в таблице 4.

У морских свинок, инфицированных адаптированным вариантом вируса, регистрировали лихорадку (температура тела более 40,0°С) с 6 по 13 сутки после заражения. У животных регистрировали проявления геморрагического синдрома. При введении адаптированного к морским свинкам возбудителя срок их гибели зависел от вводимой дозы. Средняя продолжительность жизни морских свинок после внутрибрюшинного введения штамма ЭЗМС 2020 вируса Эбола-Заир в дозе 15 ЛД₅₀ МСВБ, составила 10,5±1,0 суток. Другие характеристики штамма ЭЗМС 2020 достоверно не отличались от таковых для штамма Заир вируса Эбола-Заир.

Для получения культуры штамма ЭЗМС 2020 вируса Эбола-Заир, предназначенной для сохранения генотипа возбудителя, проводили высушивание сублимационным методом 10% суспензии печени погибших морских свинок с исходной биологической активностью 2,0⋅10⁸ БОЕ⋅мл^-1 на 10% растворе сахарозы в дистиллированной воде с добавлением 10% желтка свежего куриного яйца.

Высушивание и паспортизацию культуры адаптированного штамма ЭЗМС 2020 вируса Эбола-Заир проводили по общепринятым методикам [Здродовский П.Ф., Соколов М.И. Руководство по лабораторной диагностике вирусных и риккетсиозных болезней. - М.: Медицина, 1965].

Биологическая активность высушенной культуры адаптированного штамма ЭЗМС 2020 вируса Эбола-Заир при титровании на монослойной культуре клеток GMK-AH-l(D) по методу негативных колоний составила 6⋅10⁶ БОЕ⋅мл^-1. Бактериальная и грибковая микрофлоры в сухом материале, оцененные с использованием тиогликолевой среды, отсутствовали.

Проведение последующего обогатительного пассажа через печень морских свинок подтвердила стабильность свойств полученной культуры штамма ЭЗМС 2020 вируса Эбола-Заир. Клинические признаки заболевания, доля погибших морских свинок (100%) после внутрибрюшинного заражения освеженной культурой адаптированного варианта (6 пассаж) в те же сроки после заражения, что и у животных, инфицированных материалом 5 пассажа, подтверждают, что снижения вирулентности вируса через 1,5 лет хранения не произошло. При последующем изучении полученного материала установлено отсутствие достоверных различий по показателям величины ЛД₅₀ МСВБ, выраженной в БОЕ.

Проведенные исследования позволили подтвердить возможность получения адаптированных к морским свинкам отдельных штаммов филовирусов.

Использование полученного штамма ЭЗМС 2020 вируса Эбола-Заир позволяет проводить доклинические испытания медицинских средств защиты против лихорадки Эбола с получением статистически достоверной информации при использовании морских свинок в качестве мелких лабораторных животных.

Предлагаемое изобретение является новым, поскольку из общедоступных сведений в Российской Федерации не известен штамм вируса Эбола-Заир, адаптированный для морских свинок с установленными молекулярно-генетическими маркерами вирулентности, позволяющий проводить доклинические испытания медицинских средств защиты (МСЗ) против лихорадки Эбола с получением статистически достоверной информации при использовании морских свинок в качестве мелких лабораторных животных.

Предлагаемое изобретение имеет изобретательский уровень, поскольку предлагаемая схема получения адаптированного для морских свинок варианта возбудителя, включающая проведение обогатительного пассажа через печень игрунков Callithrix jacchus, с последующими пассажами через печень морских свинок обеспечивает получение адаптированного для морских свинок варианта штамма Заир вируса Эбола после проведения 5-ти последовательных пассажей через печень данных животных. Для установления молекулярно-генетических маркеров вирулентности определены несинонимические замены в геноме адаптированного штамма ЭЗМС 2020 по сравнению с исходным штаммом Заир вируса Эбола-Заир.

Предлагаемое изобретение промышленно применимо, поскольку для его реализации может быть использовано типовое оборудование, а также широко распространенные в вирусологических и молекулярно-генетических исследованиях реактивы и материалы.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующим примерами.

Пример выполнения 1. Определение защитной эффективности препарата моноклональных антител (МКАт) против вируса Эбола для экстренной профилактики лихорадки Эбола (доклинические испытания).

При изучении эффективности МСЗ при проведении доклинических испытаний необходимо точное попадание в выбранный диапазон заражающей дозы для инфицирования экспериментальных лабораторных животных (обычно используемый диапазон 10…30 ЛД₅₀ для данного вида животных при данном способе инфицирования).

Для определения величины ЛД₅₀ МСВБ, выраженной в БОЕ проводят титрование одной и той же культуры штамма ЭЗМС 2020 вируса Эбола-Заир на культуре клеток GMK-AH-1 (Д) по методу негативных колоний под агаровым покрытием и на морских свинках при внутрибрюшинном инфицировании. Расчет биологической активности вируса, выраженной в ЛД₅₀ МСВБ⋅мл^-1, проводят по методу Кербера в модификации И.П. Ашмарина [Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - Л.: Гос. изд. мед. лит., 1962. - 180 с.].

При использовании 10-кратного шага разведения инфицирующего материала ошибку метода определения можно с достаточно высоким уровнем точности можно определить по формуле:

где

n - количество животных, используемых на одно разведение вируссодержащего материала.

При обычно используемой для проведения титрования величины n=4 величина S=0,5lg, что в переводе на натуральные числа составляет значение .

Концентрацию вируса Эбола-Заир в исследуемой пробе, выраженную в БОЕ⋅мл^-1, рассчитывают по формуле:

где

А - количество БОЕ в 1 мл пробы, БОЕ⋅мл^-1;

а - средневзвешенное количество бляшек во флаконе, шт.;

bⁿ - кратность наивысшего разведения;

Величину а рассчитывают по формуле:

где

b^k bⁿ - кратность разведения исследуемого материала;

с - объем инокулята, мл;

а^к aⁿ - среднее количество негативных колоний в разведениях b^-k b^-n.

Ошибка величины A (S₂) не превышает 0,1lg в переводе на натуральные числа

Величину ЛД₅₀ МСВБ, выраженную в БОЕ, определяют по формуле

где

А_(МСВБ) - биологическая активность, выраженная в ЛД₅₀ МСВБ⋅мл^-1;

А_(БОЕ) - биологическая активность, выраженная в БОЕ⋅мл^-1; Суммарную ошибку (S) при определении величины ЛД₅₀ МСВБ, выраженной в БОЕ, определяют по формуле:

При определенных выше значениях S₁ и S₂ величина S, выраженная в натуральных числах, составляет

Таким образом, для того чтобы с максимальной точностью попасть в требуемый диапазон 10…30 ЛД₅₀ МСВБ, необходимо в качестве расчетной концентрации использовать величину √10×30=17 ЛД₅₀, умноженное на значение ЛД₅₀ МСВБ выраженное в БОЕ.

Полученные показатели позволяют с удовлетворительным уровнем точности рассчитать величину заражающей дозы при инфицировании лабораторных животных.

Испытуемых морских свинок случайным образом распределяют на 4 группы. В день проведения опыта животным 1 и 2 групп внутрибрюшинно вводят 0,5 мл БФР, животным 3 и 4 групп внутрибрюшинно вводят штамм ЭЗМС 2020 вируса Эбола-Заир в расчетное дозе от 10 до 30 ЛД₅₀ МСВБ на животное.

Через 2 часа животным групп 2 и 4 внутримышечно вводят 0,5 мл МКАт к вирусу Эбола. Наблюдение за инфицированными животными проводят в течение 21 суток.

Типичные результаты эксперимента, обычно наблюдаемые при использовании МКАт к вирусу Эбола с обратной величиной титра вируснейтрализующих антител более 2560, представлены в таблице 5.

Как следует из данных, представленных в таблице 5, не менее 65% животных, которым были введены МКАт против вируса Эбола, были защищены от гибели при инфицировании штаммом ЭЗМС 2020 вируса Эбола-Заир в расчетной дозе 17 ЛД₅₀ МСВБ.

Пример выполнения 2. Определение защитной эффективности МКАт против вируса Эбола при введении по различным лечебным схемам.

Морских свинок инфицируют штаммом ЭЗМС 2020 вируса Эбола-Заир в расчетной дозе 17 ЛД₅₀ МСВБ. Методология расчета инфицирующей дозы - см. пример 1.

В зависимости от количества испытуемых схем введения МКАт из стада животных случайным образом формируют потребное количество групп. Возможная схема проведения опыта представлена в таблице 6.

Данные, представленные в таблицах 5 и 6, могут быть использованы при проведении заключительной стадии доклинических испытаний - проведение экспериментов на низших приматах (животных, адекватно моделирующих соответствующие признаки заболевания человека лихорадкой Эбола).

1. Адаптированный для морских свинок штамм ЭЗМС 2020 вируса Эбола-Заир, предназначенный для проведения доклинических испытаний медицинских средств защиты в отношении геморрагической лихорадки Эбола, учетный номер НКВ-26, хранится в Национальной коллекции штаммов вирусов геморрагических лихорадок I группы патогенности ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России.

2. Штамм по п. 1, отличающийся тем, что при сохранении основных биологических характеристик исходного штамма Заир имеет несинонимические нуклеотидные замены в генах структурных белков VP24 C-G и L, обуславливающие способность вызывать выраженное заболевание с проявлением геморрагического синдрома и зависимой от инфицирующей дозы гибели морских свинок при внутрибрюшинном инфицировании.

3. Штамм по п. 1, отличающийся тем, что он адаптирован к морским свинкам и позволяет использовать их в качестве мелких лабораторных животных при проведении доклинической оценки эффективности медицинских средств защиты в отношении лихорадки Эбола.