Грызуны, характеризующиеся гуманизированным геном tmprss

Авторы патента:

ПУРСЕЛЛ НГАМБО Лиса (US)

ТАН Яцзюнь (US)

МУДЖИКА Александер О. (US)

C12N15/63 - введение чужеродного генетического материала с использованием векторов; векторы; использование их хозяев; регулирование экспрессии

A01K67/0275 - Выращивание или разведение животных, не отнесенное к другим рубрикам; новые породы животных (способы размножения или оплодотворения A61D 19/00; лекарственные препараты, содержащие сперму A61K 35/52; устройства для культивирования тканевых или животных клеток C12M 3/00; культивирование или сохранение тканевых или животных клеток C12N 5/00; получение мутаций или генная инженерия C12N 15/00)

A01K67/027 - новые породы позвоночных

Владельцы патента RU 2749715:

РЕГЕНЕРОН ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК. (US)

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к грызуну, который экспрессирует гуманизированный белок Tmprss, а также к его клетке и ткани. Также раскрыт эмбрион грызуна для получения грызуна, который экспрессирует гуманизированный белок Tmprss. Изобретение также относится к способу получения грызуна, имеющего гуманизированный ген Tmprss. Изобретение позволяет эффективно осуществлять оценку терапевтической эффективности соединения в лечении инфекции, вызванной вирусом гриппа. 7 н. и 25 з.п. ф-лы, 4 табл., 3 пр., 4 ил.

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

[001] Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США № 62/301023, поданной 29 февраля 2016 г., полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ

[002] Перечень последовательностей в виде текстового файла ASCII размером 275 Кб под названием 33093_10234US01_SequenceListing.txt, созданный 13 февраля 2017 г. и поданный в Ведомство по патентам и товарным знакам США через EFS-Web, включен в данный документ посредством ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[003] Трансмембранные сериновые протеазы II типа представляют собой семейство протеаз, характеризующихся N-концевым трансмембранным доменом (Bugge et al., J. Biol. Chem. 284 (35): 23177-23181, 2009; Hooper et al., J. Biol. Chem. 272(2): 857-860, 2001). Все члены данного семейство экспрессируются в виде одноцепочечных зимогенов и протеолитически активируются посредством расщепления в высококонсервативном мотиве R/(IV)VGG. Было показано, что один член семейства, трансмембранная протеаза 4 серинового типа (TMPRSS4), активирует эпителиальный натриевый канал (ENaC), регулирующий прохождение натрия и воды через эпителий (Guipponi et al. 2002 Hum. Mol. Genet. 11:2829; Vuagniaux et al. 2002 J. Gen. Physiol. 120:191). Протеолитические активаторы TMPRSS4 неизвестны; однако данные, доступные на сегодняшний день, позволяют предположить, что белок является самоактивируемым. В активированном состоянии каталитический домен TMPRSS4 сохраняет связь с N-концом белка посредством дисульфидной связи. Было показано, что TMPRSS4, TMPRSS2 и TMPRSS11D (или трипсиноподобная протеаза респираторного тракта человека; «HAT») расщепляют in vitro гемагглютинин вируса гриппа A (HA), который представляет собой первую необходимую стадию в жизненном цикле вируса. Данное расщепление является необходимым для активности HA, поскольку белок синтезируется в виде белка-предшественника (HA0) и требует расщепления до HA1 и HA2 для получения активности. Нокдаун TMPRSS4 посредством RNAi в клетках Caco-2 приводил к уменьшению распространения вируса. Кроме того, было показано, что в легких мышей, зараженных гриппом, сильно повышена экспрессия TMPRSS4 (Böttcher et al. 2006 J. Virol. 80:9896; Böttcher et al. 2009 Vaccine 27: 6324; Böttcher-Friebershäusser et al. 2010 J. Virol. 84: 5604; Bertam et al. 2010 J. Virol. 84:10016; Bertam et al. 2010 J. Virol. 84:10016; Böttcher-Friebershäusser et al. 2011 J. Virol. 85: 1554; Bahgat et al. 2011 Virol. J. 8:27).

[004] Разработка системы in vivo, например, модели инфекции на грызунах, необходима для того, чтобы определить и тестировать соединения, включая антитела, которые специфически целенаправленно воздействуют на трансмембранные сериновые протеазы человека II типа для лечения и предупреждения вирусной инфекции и других заболеваний.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[005] Настоящее изобретение охватывает понимание того, что для обеспечения систем in vivo для идентификации и разработки новых терапевтических средств необходимо получение с помощью генной инженерии животных, относящихся к грызунам. Например, настоящее изобретение охватывает понимание того, что грызуны, характеризующиеся гуманизированным геном Tmprss, необходимы для применения в идентификации и разработке терапевтических средств для лечения и предупреждения вирусных инфекций.

[006] В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрен грызун, геном которого содержит гуманизированный ген Tmprss, который содержит нуклеотидную последовательность эндогенного гена Tmprss грызуна и нуклеотидную последовательность родственного гена TMPRSS человека, где гуманизированный ген Tmprss находится под контролем регуляторной 5'-последовательности (регуляторных последовательностей), таких как промотор и/или энхансер(энхансеры) эндогенного гена Tmprss грызуна.

[007] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss у грызунов, раскрытых в данном документе, кодирует гуманизированный белок Tmprss, который содержит эктодомен, практически идентичный (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичный по последовательности) эктодомену белка TMPRSS человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss содержит цитоплазматический и трансмембранный участки, которые практически идентичны (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичны по последовательности) цитоплазматическому и трансмембранному участкам эндогенного белка Tmprss грызуна.

[008] В некоторых вариантах осуществления грызун, раскрытый в данном документе, содержит гуманизированный ген Tmprss, который содержит нуклеотидную последовательность эндогенного гена Tmprss грызуна и нуклеотидную последовательность родственного гена TMPRSS человека, где нуклеотидная последовательность родственного гена TMPRSS человека кодирует полипептид, практически идентичный (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичный по последовательности) эктодомену белка TMPRSS человека, кодируемого родственным геном TMPRSS человека. В некоторых вариантах осуществления грызун, раскрытый в данном документе, содержит гуманизированный ген Tmprss, который содержит нуклеотидную последовательность эндогенного гена Tmprss грызуна и нуклеотидную последовательность родственного гена TMPRSS человека, где нуклеотидная последовательность эндогенного гена Tmprss грызуна кодирует полипептид, практически идентичный (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичный по последовательности) цитоплазматическому и трансмембранному участкам эндогенного белка Tmprss грызуна, кодируемого эндогенным геном Tmprss грызуна.

[009] В некоторых вариантах осуществления грызун, раскрытый в данном документе, содержит гуманизированный ген Tmprss, расположенный в эндогенном локусе Tmprss грызуна, что является результатом замены непрерывной геномной последовательности эндогенного гена Tmprss грызуна непрерывной геномной последовательностью родственного гена TMPRSS человека. В конкретных вариантах осуществления непрерывная геномная последовательность родственного гена TMPRSS человека, которая является вставленной, содержит последовательности экзонов, кодирующих эктодомен, практически идентичный эктодомену белка TMPRSS человека, кодируемого геном TMPRSS человека. В некоторых вариантах осуществления непрерывная геномная последовательность родственного гена TMPRSS человека также содержит 3'-UTR родственного гена TMPRSS человека.

[0010] В некоторых вариантах осуществления грызун, раскрытый в данном документе, является гетерозиготным по гуманизированному гену Tmprss в эндогенном локусе Tmprss грызуна. В других вариантах осуществления грызун является гомозиготным по гуманизированному гену Tmprss в эндогенном локусе Tmprss грызуна.

[0011] В дополнительных вариантах осуществления грызун содержит два или более гуманизированных генов Tmprss в различных эндогенных локусах Tmprss грызуна, причем каждый эндогенный локус Tmprss грызуна гуманизирован с помощью соответствующего родственного гена TMPRSS человека; например, два или более гуманизированных генов Tmprss2, гуманизированных генов Tmprss4 и гуманизированных генов Tmprss11d.

[0012] В некоторых вариантах осуществления грызун, раскрытый в данном документе, содержит гуманизированный ген Tmprss2, который содержит нуклеотидную последовательность эндогенного гена Tmprss2 грызуна и нуклеотидную последовательность гена TMPRSS2 человека, где гуманизированный ген Tmprss2 находится под контролем промотора эндогенного гена Tmprss2 грызуна.

[0013] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss2 кодирует гуманизированный белок Tmprss2, который содержит эктодомен, практически идентичный (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичный по последовательности) эктодомену белка TMPRSS2 человека, кодируемого геном TMPRSS2 человека, применяемым в гуманизации. Белок TMPRSS2 человека содержит, в некоторых вариантах осуществления, аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную (например, по меньшей мере на 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичную) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss2 содержит эктодомен, практически идентичный (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичный) аминокислотной последовательности, состоящей из остатков W106 - G492 или C-концевых 387 аминокислот белка TMPRSS2 человека, изложенного под, например, SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss2 кодирует гуманизированный белок Tmprss2, который дополнительно содержит цитоплазматический и трансмембранный участки, которые практически идентичны (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичны) цитоплазматическому и трансмембранному участкам белка Tmprss2 грызуна, кодируемого эндогенным геном Tmprss2 грызуна, который подлежит гуманизации. Иллюстративный эндогенный белок Tmprss2 грызуна изложен под SEQ ID NO: 2.

[0014] В некоторых вариантах осуществления грызун содержит гуманизированный ген Tmprss2, который содержит нуклеотидную последовательность эндогенного гена Tmprss2 грызуна и нуклеотидную последовательность гена TMPRSS2 человека, где нуклеотидная последовательность гена TMPRSS2 человека кодирует эктодомен, практически идентичный (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичный по последовательности) эктодомену белка TMPRSS2 человека, кодируемого геном TMPRSS2 человека. В конкретных вариантах осуществления нуклеотидная последовательность гена TMPRSS2 человека представляет собой непрерывную геномную последовательность гена TMPRSS2 человека, содержащую область от кодирующего экзона 4 до стоп-кодона в кодирующем экзоне 13 гена TMPRSS2 человека. В конкретных вариантах осуществления непрерывная геномная последовательность гена TMPRSS2 человека дополнительно содержит 3'-UTR гена TMPRSS2 человека. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность эндогенного гена Tmprss2 грызуна, включенная в гуманизированный ген Tmprss2, кодирует цитоплазматический и трансмембранный участки, которые практически идентичны (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичны) цитоплазматическому и трансмембранному участкам эндогенного белка Tmprss2 грызуна, кодируемого эндогенным геном Tmprss2 грызуна.

[0015] В конкретных вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss2 содержит кодирующие экзоны 1-2 эндогенного гена Tmprss2 грызуна и область от кодирующего экзона 4 до кодирующего экзона 13 гена TMPRSS2 человека, где гуманизированный ген Tmprss2 кодирует гуманизированный белок Tmprss2, который содержит цитоплазматический и трансмембранный участки, которые практически идентичны цитоплазматическому и трансмембранному участкам белка Tmprss2 грызуна, кодируемого эндогенным геном Tmprss2 грызуна, и эктодомен, который практически идентичен эктодомену белка TMPRSS2 человека, кодируемого геном TMPRSS2 человека. Гуманизированный ген Tmprss2 содержит экзон 3, который, в некоторых вариантах осуществления, представляет собой кодирующий экзон 3 гена TMPRSS2 человека и, в других вариантах осуществления, представляет собой кодирующий экзон 3 эндогенного гена Tmprss2 грызуна. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss2 содержит экзон 3, который содержит 5'-участок кодирующего экзона 3 эндогенного гена Tmprss2 грызуна и 3'-участок кодирующего экзона 3 гена TMPRSS2 человека.

[0016] В некоторых вариантах осуществления грызун, раскрытый в данном документе, содержит гуманизированный ген Tmprss4, который содержит нуклеотидную последовательность эндогенного гена Tmprss4 грызуна и нуклеотидную последовательность гена TMPRSS4 человека, где гуманизированный ген Tmprss4 находится под контролем промотора эндогенного гена Tmprss4 грызуна.

[0017] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss4 кодирует гуманизированный белок Tmprss4, который содержит эктодомен, практически идентичный (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичный по последовательности) эктодомену белка TMPRSS4 человека, кодируемого геном TMPRSS4 человека, применяемым в гуманизации. Белок TMPRSS4 человека содержит, в некоторых вариантах осуществления, аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную (например, по меньшей мере на 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичную) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss4 содержит эктодомен, практически идентичный (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичный) аминокислотной последовательности, состоящей из остатков K54 - L437 или C-концевых 384 аминокислот белка TMPRSS4 человека, изложенного под, например, SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss4 кодирует гуманизированный белок Tmprss4, который дополнительно содержит цитоплазматический и трансмембранный участки, которые практически идентичны (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичны) цитоплазматическому и трансмембранному участкам белка Tmprss4 грызуна, кодируемого эндогенным геном Tmprss4 грызуна, который подлежит гуманизации. Иллюстративный эндогенный белок Tmprss4 грызуна изложен под SEQ ID NO: 9.

[0018] В некоторых вариантах осуществления грызун содержит гуманизированный ген Tmprss4, который содержит нуклеотидную последовательность эндогенного гена Tmprss4 грызуна и нуклеотидную последовательность гена TMPRSS4 человека, где нуклеотидная последовательность гена TMPRSS4 человека кодирует эктодомен, практически идентичный эктодомену белка TMPRSS4 человека, кодируемого геном TMPRSS4 человека. В конкретных вариантах осуществления нуклеотидная последовательность гена TMPRSS4 человека представляет собой непрерывную геномную последовательность, содержащую область от кодирующего экзона 4 до стоп-кодона в кодирующем экзоне 13 гена TMPRSS4 человека. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность эндогенного гена Tmprss4 грызуна, включенная в гуманизированный ген Tmprss4, кодирует цитоплазматический и трансмембранный участки, которые практически идентичны цитоплазматическому и трансмембранному участкам белка Tmprss4 грызуна, кодируемого эндогенным геном Tmprss4 грызуна.

[0019] В конкретных вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss4 содержит область от кодирующего экзона 1 до кодирующего экзона 3 эндогенного гена Tmprss4 грызуна и область от кодирующего экзона 4 до стоп-кодона в кодирующем экзоне 13 гена TMPRSS4 человека.

[0020] В некоторых вариантах осуществления грызун, раскрытый в данном документе, содержит гуманизированный ген Tmprss11d, который содержит нуклеотидную последовательность эндогенного гена Tmprss11d грызуна и нуклеотидную последовательность гена TMPRSS11D человека, где гуманизированный ген Tmprss11d находится под контролем промотора эндогенного гена Tmprss11d грызуна.

[0021] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss11d кодирует гуманизированный белок Tmprss11d, который содержит эктодомен, практически идентичный (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичный по последовательности) эктодомену белка TMPRSS11D человека, кодируемого геном TMPRSS11D человека, применяемым в гуманизации. Белок TMPRSS11D человека содержит, в некоторых вариантах осуществления, аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную (например, по меньшей мере на 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичную) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss11d содержит эктодомен, практически идентичный (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичный) аминокислотной последовательности, состоящей из остатков A42-I418 или 377 C-концевых аминокислот белка TMPRSS11D человека, изложенного в, например, SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss11d кодирует гуманизированный белок Tmprss11d, который дополнительно содержит цитоплазматический и трансмембранный участки, которые практически идентичны (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичны) цитоплазматическому и трансмембранному участкам эндогенного белка Tmprss11d грызуна, кодируемого эндогенным геном Tmprss11d грызуна, который подлежит гуманизации. Иллюстративный эндогенный белок Tmprss11d грызуна изложен под SEQ ID NO: 16.

[0022] В некоторых вариантах осуществления грызун содержит гуманизированный ген Tmprss11d, который содержит нуклеотидную последовательность эндогенного гена Tmprss11d грызуна и нуклеотидную последовательность гена TMPRSS11D человека, где нуклеотидная последовательность гена TMPRSS11D человека кодирует эктодомен, практически идентичный эктодомену белка TMPRSS11D человека, кодируемого геном TMPRSS11D человека. В конкретных вариантах осуществления нуклеотидная последовательность гена TMPRSS11d человека представляет собой непрерывную геномную последовательность, содержащую область от кодирующего экзона 3 до стоп-кодона в кодирующем экзоне 10 гена TMPRSS11D человека. В конкретных вариантах осуществления непрерывная геномная последовательность гена TMPRSS11D человека дополнительно содержит 3'-UTR гена TMPRSS11D человека. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность эндогенного гена Tmprss11d грызуна, включенная в гуманизированный ген Tmprss11d, кодирует цитоплазматический и трансмембранный участки, которые практически идентичны цитоплазматическому и трансмембранному участкам белка Tmprss11d грызуна, кодируемого эндогенным геном Tmprss11d грызуна.

[0023] В конкретных вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss11d содержит кодирующие экзоны 1-2 эндогенного гена Tmprss11d грызуна и область от кодирующего экзона 3 до кодирующего экзона 13 гена TMPRSS11D человека.

[0024] В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает выделенные клетку или ткань грызуна, в геноме которых содержится гуманизированный ген Tmprss, как описано в данном документе. В конкретных вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss выбран из группы, состоящей из гуманизированного гена Tmprss2, гуманизированного гена Tmprss4 и гуманизированного гена Tmprss11d.

[0025] В еще другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена эмбриональная стволовая клетка грызуна, в геноме которой содержится гуманизированный ген Tmprss, как описано в данном документе. В конкретных вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss выбран из группы, состоящей из гуманизированного гена Tmprss2, гуманизированного гена Tmprss4 и гуманизированного гена Tmprss11d.

[0026] В другом аспекте также предусмотрен эмбрион грызуна, полученный с помощью эмбриональной стволовой клетки грызуна, раскрытой в данном документе.

[0027] В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрен вектор на основе нуклеиновой кислоты, подходящий для применения в гуманизации эндогенного гена Tmprss у грызуна. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты Tmprss человека (например, геномную ДНК человека, кодирующую эктодомен белка TMPRSS человека), фланкированную гомологичным 5'-участком и гомологичным 3'-участком. Гомологичные 5'- и 3'-участки представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты, которые находятся в положениях 5' и 3' соответственно в отношении последовательности нуклеиновой кислоты Tmprss человека и являются гомологичными последовательностям геномной ДНК в эндогенном локусе Tmprss у грызуна, которые фланкируют геномную ДНК грызуна, кодирующую эктодомен родственного белка Tmprss грызуна. Таким образом, 5'- и 3'-гомологичные участки способны опосредовать гомологичную рекомбинацию и замену геномной ДНК грызуна, кодирующей эктодомен родственного белка Tmprss грызуна, последовательностью нуклеиновой кислоты Tmprss человека с образованием гуманизированного гена Tmprss, как описано в данном документе.

[0028] В дополнительном аспекте настоящее изобретение направлено на способ получения грызуна, в геноме которого содержится гуманизированный ген Tmprss. Способ включает модифицирование генома грызуна с заменой геномной последовательности эндогенного гена Tmprss грызуна на геномную последовательность родственного гена TMPRSS человека с образованием гуманизированного гена Tmprss.

[0029] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ получения грызуна (такого, как мышь или крыса), характеризующегося гуманизированным геном Tmprss, при этом способ включает стадии (a) вставки геномного фрагмента в эндогенный локус Tmprss грызуна в эмбриональной стволовой клетке грызуна, где геномный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность родственного гена TMPRSS человека, за счет чего обеспечивается образование гуманизированного гена Tmprss (такого, как описанный в данном документе); (b) получения эмбриональной стволовой клетки грызуна, содержащей гуманизированный ген Tmprss (a); и (c) получения грызуна с применением эмбриональной стволовой клетки грызуна из (b).

[0030] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss выбран из группы, состоящей из гуманизированного гена Tmprss2, гуманизированного гена Tmprss4 и гуманизированного гена Tmprss11d. В различных вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss кодирует гуманизированный белок Tmprss, который содержит эктодомен, практически идентичный (например, по меньшей мере на 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичный по последовательности) эктодомену белка TMPRSS человека, кодируемого геном TMPRSS человека, применяемым для гуманизации. В конкретных вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss содержит эктодомен белка TMPRSS человека, выбранного из группы, состоящей из белка TMPRSS2 человека, белка TMPRSS4 человека и белка TMPRSS11D человека. В конкретных вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss дополнительно содержит цитоплазматический и трансмембранный участки, которые практически идентичны цитоплазматическому и трансмембранному участкам белка Tmprss грызуна, кодируемого эндогенным геном Tmprss грызуна, который подлежит гуманизации.

[0031] В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ применения грызуна, раскрытого в данном документе, для оценки терапевтической эффективности соединения (например, кандидатных ингибиторов, которые специфически целенаправленно воздействуют на белок TMPRSS человека) в лечении вирусной инфекции гриппа. Способ может включать стадии получения грызуна, описанного в данном документе, введения грызуну вируса гриппа и кандидатного соединения и мониторинга наличия и тяжести инфекции, вызванной вирусом гриппа, у грызуна для определения терапевтической эффективности кандидатного лекарственного средства.

[0032] В некоторых вариантах осуществления вирус гриппа вводят грызуну до введения соединения. В других вариантах осуществления вирус гриппа вводят грызуну после введения соединения.

[0033] В некоторых вариантах осуществления кандидатное соединение представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфичный в отношении белка TMPRSS человека. В конкретных вариантах осуществления кандидатное соединение представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфичный в отношении белка TMPRSS человека, выбранного из группы, состоящей из белка TMPRSS2 человека, белка TMPRSS4 человека и белка TMPRSS11D человека.

[0034] Другие признаки, цели и преимущества настоящего изобретения очевидны из нижеследующего подробного описания. Следует, однако, понимать, что подробное описание, хоть и указывает на варианты осуществления настоящего изобретения, приведено только в целях иллюстрации, а не ограничения. Различные изменения и модификации в пределах объема настоящего изобретения станут очевидными специалистам в данной области из подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0035] Графические материалы, включенные в данный документ, которые содержат следующие фигуры, приведены только в иллюстративных целях, а не для ограничения.

[0036] Фигуры 1A-1D. Иллюстративная стратегия гуманизации Tmprss2 мыши.

[0037] На фигуре 1A без соблюдения масштаба показана схема геномной организации генов Tmprss2 мыши и TMPRSS2 человека. Экзоны представлены тонкими полосами, расположенными поперек геномных последовательностей, причем первый кодирующий экзон для обоих генов обозначен старт-кодоном «ATG» над экзоном и последний кодирующий экзон обозначен кодоном «Стоп» над экзоном. Указаны геномный фрагмент мыши размером приблизительно 25291 п. о., который должен быть удален, и геномный фрагмент человека размером 25091 п. о., который должен быть вставлен. Указаны местоположения зондов, использованных в анализе, описанном в примере 1. TM: трансмембранный домен; SRCR: домен, подобный богатому цистеином домену фагоцитарных рецепторов; LDLRa: рецептор липопротеинов низкой плотности класса А.

[0038] На фигуре 1B без соблюдения масштаба проиллюстрирован иллюстративный модифицированный BAC-вектор для гуманизации эндогенного гена Tmprss2 мыши вместе с соединительными последовательностями (SEQ ID NO: 22, 23 и 24).

[0039] На фигуре 1C проиллюстрирована без соблюдения масштаба гуманизированная аллель Tmprss2 после удаления кассеты устойчивости к неомицину вместе с соединительными последовательностями (SEQ ID NO: 22 и 25).

[0040] На фигуре 1D представлено выравнивание последовательностей белка TMPRSS2 человека (SEQ ID NO: 4), белка Tmprss2 мыши (SEQ ID NO: 2) и гуманизированного белка Tmprss2 («мутантного белка 7010») (SEQ ID NO: 7).

[0041] Фигуры 2A-2D. Иллюстративная стратегия гуманизации Tmprss4 мыши.

[0042] На фигуре 2A без соблюдения масштаба показана схема геномной организации генов Tmprss4 мыши и TMPRSS4 человека. Экзоны представлены тонкими полосами, расположенными поперек геномных последовательностей, причем первый экзон (также первый кодирующий экзон) для обоих генов обозначен старт-кодоном «ATG» над экзоном и последний кодирующий экзон обозначен кодоном «Стоп» над экзоном. Указаны геномный фрагмент мыши размером приблизительно 11074 п. о., который должен быть удален, и геномный фрагмент человека размером 14963 п. о., который должен быть вставлен. Указаны местоположения зондов, использованных в анализе, описанном в примере 2. TM: трансмембранный домен; SRCR: домен, подобный богатому цистеином домену фагоцитарных рецепторов; LDLRa: рецептор липопротеинов низкой плотности класса А.

[0043] На фигуре 2B без соблюдения масштаба проиллюстрирован иллюстративный модифицированный BAC-вектор для гуманизации эндогенного гена Tmprss4 мыши вместе с соединительными последовательностями (SEQ ID NO: 38, 39 и 40).

[0044] На фигуре 2C проиллюстрирована без соблюдения масштаба гуманизированная аллель Tmprss4 после удаления кассеты устойчивости к неомицину вместе с соединительными последовательностями (SEQ ID NO: 41 и 40).

[0045] На фигуре 2D представлено выравнивание последовательностей белка TMPRSS4 человека (SEQ ID NO: 11), белка Tmprss4 мыши (SEQ ID NO: 9) и гуманизированного белка Tmprss4 («мутантного белка 7224») (SEQ ID NO: 14).

[0046] Фигуры 3A-3D. Иллюстративная стратегия гуманизации Tmprss11d мыши.

[0047] На фигуре 3A без соблюдения масштаба показана схема геномной организации генов Tmprss11d мыши и TMPRSS11D человека. Экзоны представлены тонкими полосами, расположенными поперек геномных последовательностей, причем первый экзон (также первый кодонный экзон) для обоих генов обозначен старт-кодоном «ATG» над экзоном и последний кодирующий экзон обозначен кодоном «Стоп» над экзоном. Указаны геномный фрагмент мыши размером приблизительно 35667 п. о., который должен быть удален, и геномный фрагмент человека размером 33927 п. о., который должен быть вставлен. Указаны местоположения зондов, использованных в анализе, описанном в примере 3. TM: трансмембранный домен; SEA: домен, находящийся в белке спермы морского ежа, энтерокиназе и агрине.

[0048] На фигуре 3B без соблюдения масштаба проиллюстрирован иллюстративный модифицированный BAC-вектор для гуманизации эндогенного гена Tmprss11d мыши вместе с соединительными последовательностями (SEQ ID NO: 57, 58 и 59).

[0049] На фигуре 3C проиллюстрирована без соблюдения масштаба гуманизированная аллель Tmprss11 после удаления кассеты устойчивости к неомицину вместе с соединительными последовательностями (SEQ ID NO: 57 и 60).

[0050] На фигуре 3D представлено выравнивание последовательностей белка TMPRSS11D человека (SEQ ID NO: 18), белка Tmprss11d мыши (SEQ ID NO: 16) и гуманизированного белка Tmprss11d («мутантного белка 7226») (SEQ ID NO: 21).

[0051] На фигуре 4 показаны результаты эксперимента, демонстрирующие, что мыши MAID7225 HumInTMPRSS4 не отличались в своей восприимчивости к заражению высокими дозами тяжелого гриппа A H1N1 или тяжелого, адаптированного для мышей H3N2. Мыши MAID7225 HumIn TMRPSS4, которых заражали A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) (светло-серые круги, пунктирная линия), демонстрировали сходный уровень выживаемости при сравнении с мышами дикого типа (светло-серые квадраты, пунктирная линия). Аналогичным образом мыши MAID7225 HumIn TMRPSS4, которых заражали A/Aichi/02/1968-X31 (H3N2) (темно-серые треугольники, пунктирная линия), демонстрировали сходный уровень выживаемости при сравнении с мышами дикого типа (светло-серые перевернутые треугольники, пунктирная линия). Мышей инфицировали IN в 0 день или с помощью 1150 PFU A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1), или с помощью 10000 PFU A/Aichi/02/1968-X31 (H3N2). Контрольная группа включала неинфицированных мышей MAID7225 HumIn TMPRSS4, и дикого типа в качестве отрицательного контроля (черные ромбы, жирная линия).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ КОНКРЕТНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0052] Настоящее изобретение относится к генетически модифицированным грызунам (например, мышам и крысам), характеризующимся гуманизированным геном, кодирующим трансмембранные сериновые протеазы II типа (или «Tmprss» для трансмембранной протеазы/серина). Генетически модифицированные грызуны подходят для применения в скрининге кандидатных соединений, которые специфически целенаправленно воздействуют на молекулу TMPRSS человека для лечения и предупреждения заболеваний, таких как инфекция, вызванная вирусом гриппа. Соответственно, в настоящем изобретении предусмотрены генетически модифицированные грызуны, характеризующиеся гуманизированным геном Tmprss, клетки и ткани, выделенные из генетически модифицированных грызунов, способы и композиции для получения генетически модифицированных грызунов и применение генетически модифицированных грызунов для скрининга и тестирования терапевтических соединений. Различные варианты осуществления настоящего изобретения дополнительно описаны ниже.

Трансмембранные сериновые протеазы II типа («Tmprss»)

[0053] Трансмембранные сериновые протеазы II типа, также называемые в данном документе «Tmprss» в отношении молекул, отличных от молекул человека, или «TMPRSS» в отношении молекул человека («трансмембранные протеазы/серин»), представляют собой семейство белков, характеризующихся N-концевым трансмембранным доменом и C-концевым внеклеточным доменом сериновой протеазы. Были идентифицированы по меньшей мере 18 членов в семействе, которое распределено на четыре подсемейства (Bugge et al. (2009), выше). Все члены разделяют несколько общих структурных признаков, которые определяют семейство, включая (i) короткий N-концевой цитоплазматический домен, (ii) трансмембранный домен и (iii) эктодомен, который содержит домен протеазы и стеблевую область, которая связывает трансмембранный домен с доменом протеазы. Стеблевая область содержит комбинацию модульных структурных доменов шести разных типов: SEA-домен (белок спермы морского ежа/энтеропептидаза/агрин), домен фагоцитарных рецепторов группы A, LDLA-домен (рецептор липопротеинов низкой плотности класса A), CUB-домен (Cls/Clr эмбриональный фактор роста морских ежей, костный морфогенетический белок 1), MAM-домен (меприн/A5 антиген/рецепторная протеинфосфатаза мю) и Frizzled-домен. См. обзор Bugge et al. (2009), выше. Например, TMPRSS2 и TMPRSS4, оба из которых принадлежат к подсемейству гепсина/TMPRSS, характеризуются доменом фагоцитарных рецепторов группы A c предшествующим одним LDLA-доменом в стеблевой области. TMPRSS11D, также известный как «HAT» в отношении трипсиноподобной протеазы дыхательных путей человека, которая принадлежит к подсемейству HAT/DESC, характеризуется одним SEA-доменом. См. фигуру 1 Bugge et al. (2009), выше.

[0054] Трансмембранные сериновые протеазы II типа изначально продуцируются в виде неактивных проферментов, которым необходима активация посредством расщепления последующего основного аминокислотного остатка в консенсусном активационном мотиве, предшествующем домену протеазы. Некоторые из активированных протеаз остаются мембраносвязанными в результате дисульфидной связи между продоменом и доменом протеазы. Внеклеточные домены считаются критически важными для клеточной локализации, активации, ингибирования и/или субстратной специфичности таких протеаз (Bugge et al. (2009), выше; Szabo et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 40: 1297-1316 (2008)).

[0055] Была задокументирована различная биохимическая и патофизиологическая информация в отношении членов трансмембранных сериновых протеаз II типа. Было показано, что TMPRSS2, TMPRSS4 и TMPRSS11D расщепляют in vitro гемагглютинин вируса гриппа A (HA), который представляет собой первую необходимую стадию в жизненном цикле вируса. Предусмотрены генетически модифицированные животные, относящиеся к грызунам, характеризующиеся гуманизированным геном Tmprss, раскрытым в данном документе, пригодные для систем in vivo, которые обеспечивают обстоятельное понимание биологических функций молекул TMPRSS, а также скрининг терапевтических соединений, которые специфически целенаправленно воздействуют на молекулы TMPRSS человека.

[0056] Иллюстративные последовательности Tmprss, включая мышиные, человеческие и гуманизированные последовательности нуклеиновой кислоты и последовательности белка Tmprss, предусмотрены в настоящей заявке и обобщены в следующей таблице. Последовательности праймеров и зондов, применяемых в анализах, описанных в разделе примеров, и вставные соединительные последовательности иллюстративных гуманизированных аллелей Tmprss также включены в таблицу.

Краткое описание последовательностей

SEQ ID NO	Описание	Признаки
1	Tmprss2 Mus musculus, mRNA, NM_015775.2	Длина: 3175 п. о. CDS: 231-1703 Экзоны: 1-177; 178-245 (второй экзон и первый кодирующий экзон); 246-465; 466-552; 553-672; 673-799; 800-910; 911-954; 955-1123; 1124-1299; 1300-1395; 1396-1538; 1539-1691; 1692-3161.
2	Tmprss2 Mus musculus, белок	Длина: 490 ак
3	TMPRSS2 Homo sapiens, вариант транскрипта 2, mRNA, NM_005656.3	Длина: 3212 п. о. CDS: 135-1613 Экзоны: 1-78; 79-149 (второй экзон и первый кодирующий экзон); 150-372; 373-459; 460-579; 580-706; 707-817; 818-861; 862-1033; 1034-1209; 1210-1305; 1306-1448; 1449-1601; 1602-3204.
4	TMPRSS2 Homo sapiens, вариант транскрипта 2, белок	Длина: 492 ак Эктодомен: начинается с W106.
5	Геномный фрагмент Tmprss2 для гуманизации	Длина: 27947 п. о. 1-84: последовательность мыши 85-25175: последовательность человека (всего 25091 п. о.) 25176-27866: XhoI-LoxP-Cassette-loxP-ICeUI-NheI (всего 2691 п. о.) 27867-27947: последовательность мыши
6	Геномный фрагмент Tmprss2 для гуманизации с удаленной кассетой	Длина: 25333 п. о. 1-84: последовательность мыши 85-25175: последовательность человека (всего 25091 п. о.) 25176-25252: XhoI-loxP-ICeUI-NheI (77 п. о.) 25253-25333: последовательность мыши
7	Гуманизированный белок Tmprss2	Длина: 491 aк
8	Tmprss4 Mus musculus, mRNA, NM_145403.2	Длина: 2267 п. о. CDS: 289-1596 Экзоны: 1-291 (первый экзон и первый кодирующий экзон); 292-325; 326-439; 440-592; 593-722; 723-824; 825-865; 866-1025; 1026-1192; 1193-1291; 1292-1434; 1435-1584; 1585-2267.
9	Tmprss4 Mus musculus, белок	Длина: 435 ак
10	TMPRSS4 Homo sapiens, вариант транскрипта 4, mRNA, NM_001173551.1	Длина: 3543 п. о. CDS: 292-1599 Экзоны: 1-294 (первый экзон и первый кодирующий экзон); 295-328; 329-442; 443-595; 596-725; 726-827; 828-868; 869-1028; 1029-1195; 1196-1294; 1295-1437; 1438-1587; 1588-3529.
11	TMPRSS4 Homo sapiens, вариант транскрипта 4, белок	Длина: 437 aк Эктодомен: начинается с K54.
12	Геномный фрагмент Tmprss4 для гуманизации, содержащий кассету	Длина: 20078 п. о. 1-18: последовательность мыши 19-5014: SalI/XhoI-LoxP-hUbi-EM7-Neo-Pm-Cre-loxP-ICeuI-NheI (всего 4996 п. о.) 5015-19977: Последовательность человека (всего 14963 п. о.) 19978-20078: последовательность мыши
13	Геномный фрагмент Tmprss4 для гуманизации с удаленной кассетой	Длина: 15159 п. о. 1-18: последовательность мыши 19-95: SalI/XhoI-LoxP-ICeuI-NheI (всего 77 п. о.) 96-15058: Последовательность человека (всего 14963 п. о.) 15059-15159: последовательность мыши
14	Гуманизированный белок Tmprss4	Длина: 435 aк
15	Tmprss11d Mus musculus, mRNA, NM_145561.2	Длина: 2046 п. о. CDS: 36-1289 Экзоны: 1-43 (первый экзон и первый кодирующий экзон), 44-165, 166-284; 285-352; 353-507;508-546; 547-724; 725-984; 985-1127; 1128-2046.
16	Tmprss11d Mus musculus, белок	Длина: 417 aк
17	TMPRSS11D Homo sapiens, mRNA, NM_004262.2	Длина: 2800 п. о. CDS: 66-1322 Экзоны: 1-73 (первый экзон и первый кодирующий экзон); 74-195; 196-314; 315-382; 383-540; 541-579; 580-757; 758-1017; 1018-1160; 1161-2783.
18	TMPRSS11D Homo sapiens, белок	Длина: 418 aк Эктодомен: начинается с A42.
19	Геномный фрагмент Tmprss11d для гуманизации, содержащий кассету	Длина: 38992 1-19: последовательность мыши 20-33946: Последовательность ЧЕЛОВЕКА (всего 33927 п. о.) 33947-38942: XhoI-LoxP-hUbi-EM7-Neo-Pm-Cre-loxP-ICeuI-NheI (всего 4996 п. о.) 38943-38992: последовательность мыши
20	Геномный фрагмент Tmprss11d для гуманизации с удаленной кассетой	Длина: 34073 п. о. 1-19: последовательность мыши 20-33946: Последовательность человека (всего 33927 п. о.) 33947-34023: XhoI-LoxP-ICeuI-NheI (77 п. о.) 34024-34073: последовательность мыши
21	Гуманизированный белок Tmprss11d	418 aк
22	Соединительная 5'-последовательность мыши/5'-последовательность человека для гуманизации Tmprss2	5'-Последовательность мыши//5'-последовательность человека
23	Соединительная 3'-последовательность человека/последовательность кассеты для гуманизации Tmprss2	Последовательность человека//XhoI//кассета loxP
24	Соединительная последовательность кассеты/3'-последовательность мыши для гуманизации Tmprss2	Кассета (loxP)/ICEUI//NheI//мыши
25	Соединительная 3'-последовательность человека/loxP/3'-последовательность мыши для гуманизации Tmprss2	3'-Последовательность человека//XhoI//(loxP)/ICEUI//NheI//3'-последовательность мыши
26-37	Праймеры и зонды для анализов с приобретением аллели или потерей аллели для гуманизации Tmprss2	Таблица 1
38	Соединительная 5'-последовательность мыши/последовательность кассеты для гуманизации Tmprss4	5'-Последовательность мыши//SalI-XhoI// кассета (loxP)
39	Соединительная последовательность кассеты/5'-последовательность человека для гуманизации Tmprss4	Кассета (loxP)/ICEUI//NheI//5'-последовательность человека
40	Соединительная 3'-последовательность человека/3'-последовательность мыши для гуманизации Tmprss4	3'-последовательность человека/3'-последовательность мыши
41	Соединительная 5'-последовательность мыши/loxP/5'-последовательность человека для гуманизации Tmprss4	5'-последовательность мыши//SalI/XhoI//(loxP)/ICEUI//NheI//5'-последовательность человека
42-56	Праймеры и зонды для анализов с приобретением аллели или потерей аллели для гуманизации Tmprss4	Таблица 2
57	Соединительная 5'-последовательность мыши/5'-последовательность человека для гуманизации Tmprss11d	5'-последовательность мыши//5'-последовательность человека
58	Соединительная 3'-последовательность человека/последовательность кассеты для гуманизации Tmprss11d	3'-последовательность человека//XhoI//кассета (loxP)
59	Соединительная последовательность кассеты/3'-последовательность мыши для гуманизации Tmprss11d	Кассета (loxP)/ICEUI//NheI//3'-мыши
60	Соединительная 3'-последовательность человека/loxP/3'-последовательность мыши для гуманизации Tmprss11d	3'-Последовательность человека//XhoI//(loxP)/ICEUI//NheI//3'-последовательность мыши
61-72	Праймеры и зонды для анализов с приобретением аллели или потерей аллели для гуманизации Tmprss11d	Таблица 3

Гуманизированные животные Tmprss, относящиеся к грызунам

[0057] В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрены животные, относящиеся к грызунам, которые содержат в зародышевой линии гуманизированный ген Tmprss, кодирующий белок Tmprss человека.

[0058] Термин «гуманизированный», применяемый в контексте нуклеиновых кислот или белков, относится к нуклеиновым кислотам или белкам, чьи структуры (т.е. нуклеотидные или аминокислотные последовательности) содержат части, практически соответствующие или идентичные структурам конкретного гена или белка, обнаруженных в природе у животного, относящегося к грызунам, а также содержат части, отличающиеся от обнаруженных в релевантных гене или белке грызуна, и вместо этого более близко соответствующие или идентичные структурам, обнаруженным в соответствующем гене или белке человека. Грызун, содержащий гуманизированный ген или экспрессирующий гуманизированный белок, является «гуманизированным» грызуном.

[0059] В некоторых вариантах осуществления грызун по настоящему изобретению выбран из мыши, крысы и хомяка. В некоторых вариантах осуществления грызун по настоящему изобретению выбран из надсемейства Muroidea. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный грызун по настоящему изобретению принадлежит к семейству, выбранному из Calomyscidae (например, мышевидные хомячки), Cricetidae (например, хомяки, крысы и мыши Нового света, полевки), Muridae (настоящие мыши и крысы, песчанки, иглистые мыши, косматые хомяки), Nesomyidae (лазающие мыши, скальные мыши, белохвостые крысы, малагасийские крысы и мыши), Platacanthomyidae (например, колючие соневидные хомяки) и Spalacidae (например, слепыши, бамбуковые крысы и цокоры). В некоторых определенных вариантах осуществления генетически модифицированный грызун по настоящему изобретению выбран из настоящей мыши или крысы (семейство Muridae), песчанки, иглистой мыши и косматого хомяка. В некоторых определенных вариантах осуществления генетически модифицированная мышь по настоящему изобретению является представителем семейства Muridae.

[0060] В некоторых вариантах осуществления грызун, раскрытый в данном документе, содержит гуманизированный ген Tmprss в геноме, который содержит нуклеотидную последовательность эндогенного гена Tmprss грызуна и нуклеотидную последовательность гена TMPRSS человека, где нуклеотидная последовательность эндогенного гена Tmprss грызуна и нуклеотидная последовательность гена TMPRSS человека функционально связаны друг с другом так, что гуманизированный ген Tmprss кодирует белок Tmprss и находится под контролем 5'-регуляторного элемента(регуляторных элементов), таких как промотор и/или энхансер(энхансеры) эндогенного гена Tmprss грызуна.

[0061] Настоящее изобретение, в частности, направлено на гуманизацию с использованием схожей последовательности; другими словами, нуклеотидная последовательность эндогенного гена Tmprss грызуна функционально связана с нуклеотидной последовательностью родственного гена TMPRSS человека с образованием гуманизированного гена. Например, в некоторых вариантах осуществления, нуклеотидная последовательность эндогенного гена Tmprss2 грызуна функционально связана с нуклеотидной последовательностью гена TMPRSS2 человека с образованием гуманизированного гена Tmprss2. В других вариантах осуществления нуклеотидная последовательность эндогенного гена Tmprss4 грызуна функционально связана с нуклеотидной последовательностью гена TMPRSS4 человека с образованием гуманизированного гена Tmprss4. В еще других вариантах осуществления нуклеотидная последовательность эндогенного гена Tmprss11d грызуна функционально связана с нуклеотидной последовательностью гена TMPRSS11D человека с образованием гуманизированного гена Tmprss11d.

[0062] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный грызун по настоящему изобретению содержит гуманизированный ген Tmprss в своем геноме, где гуманизированный ген Tmprss кодирует гуманизированный белок Tmprss, который содержит эктодомен, практически идентичный эктодомену белка TMPRSS человека. Термин «эктодомен» относится к участку трансмембранного белка, который распространяется за пределы клеточной мембраны, т.е. к внеклеточному участку трансмембранного белка. Эктодомен молекулы TMPRSS содержит домен протеазы и стеблевую область, которая связывает трансмембранный домен с доменом протеазы. Под эктодоменом или полипептидом, который является «практически идентичным эктодомену белка TMPRSS человека», в некоторых вариантах осуществления подразумевается полипептид, который по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 95%, 99% или 100% идентичен по последовательности эктодомену белка TMPRSS человека; в некоторых вариантах осуществления полипептид, который отличается от эктодомена белка TMPRSS человека не более чем на 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту(аминокислот); в некоторых вариантах осуществления полипептид, который отличается от эктодомена белка TMPRSS человека только на N- или C- конце эктодомена, например, отсутствием аминокислот или наличием дополнительных аминокислот на N- или C-конце эктодомена; и в некоторых вариантах осуществления полипептид практически идентичен эктодомену белка TMPRSS человека. Под «по сути эктодоменом» белка TMPRSS человека подразумевают полипептид, который идентичен эктодомену или отличается от эктодомена отсутствием 1-5 (т.е. 1, 2, 3, 4 или 5) аминокислот или наличием дополнительных 1-5 аминокислот на N- или C-конце.

[0063] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss кодирует гуманизированный белок Tmprss, который дополнительно содержит цитоплазматический и трансмембранный участки, которые являются практически идентичными цитоплазматическому и трансмембранному участкам эндогенного белка Tmprss грызуна. Под цитоплазматическим и трансмембранным участками или полипептидами, которые «практически идентичны цитоплазматическому и трансмембранному участкам эндогенного белка Tmprss грызуна» в некоторых вариантах осуществления подразумевают полипептид, который по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 95%, 99% или 100% идентичен по последовательности цитоплазматическому и трансмембранному участкам эндогенного белка Tmprss грызуна; в некоторых вариантах осуществления - полипептид, который отличается от цитоплазматического и трансмембранного участков эндогенного белка Tmprss грызуна не более чем на 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту(аминокислот); в некоторых вариантах осуществления - полипептид, который отличается от цитоплазматического и трансмембранного участков эндогенного белка Tmprss грызуна только на C- конце, например, отсутствием аминокислот или наличием дополнительных аминокислот на C-конце трансмембранного домена; и в некоторых вариантах осуществления - полипептид, состоящий из цитоплазматического домена и по сути из трансмембранного домена эндогенного белка Tmprss грызуна. Под «по сути трансмембранным доменом» эндогенного белка Tmprss грызуна подразумевают полипептид, который идентичен трансмембранному домену или отличается от трансмембранного домена отсутствием 1-5 аминокислот или наличием дополнительных 1-5 аминокислот на C-конце.

[0064] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss в геноме генетически модифицированного грызуна содержит нуклеотидную последовательность эндогенного гена Tmprss грызуна и нуклеотидную последовательность родственного гена TMPRSS человека, где нуклеотидная последовательность родственного гена TMPRSS человека кодирует полипептид, практически идентичный эктодомену белка TMPRSS человека, кодируемого геном TMPRSS человека. В определенных вариантах осуществления нуклеотидная последовательность родственного гена TMPRSS человека в гуманизированном гене Tmprss кодирует эктодомен белка TMPRSS человека, кодируемого геном TMPRSS человека.

[0065] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss в геноме генетически модифицированного грызуна содержит нуклеотидную последовательность эндогенного гена Tmprss грызуна и нуклеотидную последовательность родственного гена TMPRSS человека, где нуклеотидная последовательность эндогенного гена Tmprss грызуна кодирует полипептид, практически идентичный цитоплазматическому и трансмембранному участкам эндогенного белка Tmprss грызуна, кодируемого геном Tmprss грызуна. В конкретных вариантах осуществления нуклеотидная последовательность эндогенного гена Tmprss грызуна, присутствующая в гуманизированном гене Tmprss, кодирует цитоплазматические и трансмембранные домены эндогенного белка Tmprss грызуна, кодируемого эндогенным геном Tmprss грызуна.

[0066] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss образован в результате замены нуклеотидной последовательности эндогенного гена Tmprss грызуна в эндогенном локусе Tmprss грызуна нуклеотидной последовательностью родственного гена TMPRSS человека.

[0067] В некоторых вариантах осуществления непрерывная геномная последовательность гена Tmprss грызуна в эндогенном локусе Tmprss грызуна была замещена непрерывной геномной последовательностью родственного гена TMPRSS человека с образованием гуманизированного гена Tmprss.

[0068] В конкретных вариантах осуществления непрерывная геномная последовательность гена TMPRSS человека, вставленная в эндогенный ген Tmprss грызуна, содержит экзоны, полностью или частично, гена TMPRSS человека, который кодирует эктодомен, который практически идентичен эктодомену белка TMPRSS человека, кодируемого геном TMPRSS человека.

[0069] В определенных вариантах осуществления геномная последовательность эндогенного гена Tmprss грызуна, которая остается в эндогенном локусе Tmprss грызуна после замены для гуманизации, функционально связана со вставленной непрерывной геномной последовательностью TMPRSS человека и кодирует цитоплазматический и трансмембранный участки, которые практически идентичны цитоплазматическому и трансмембранному участкам эндогенного белка Tmprss грызуна, кодируемого эндогенным геном Tmprss грызуна.

[0070] В случаях, когда эндогенный белок Tmprss и белок TMPRSS человека делят общие аминокислоты около точки соединения между трансмембранным доменом и эктодоменом, можно необязательно вставлять геномную последовательность TMPRSS человека, которая точно кодирует эктодомен белка TMPRSS человека. Можно вставить немного более длинную или более короткую геномную последовательность гена TMPRSS человека, которая кодирует по сути эктодомен белка TMPRSS человека, в функциональную связь с геномной последовательностью эндогенного гена Tmprss грызуна, которая кодирует цитоплазматический домен и по сути трансмембранный домен эндогенного белка Tmprss грызуна, таким образом, что гуманизированный белок Tmprss, кодируемый образованным в результате гуманизированным геном Tmprss, содержит эктодомен, который идентичен эктодомену белка TMPRSS человека, и трансмембранный домен, который идентичен трансмембранному домену эндогенного белка Tmprss грызуна.

[0071] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность гена TMPRSS человека, включенная в гуманизированный ген Tmprss, также содержит нетранслируемую 3'-область («UTR») гена TMPRSS человека. В определенных вариантах осуществления, кроме 3'-UTR гена TMPRSS человека, гуманизированный ген Tmprss также содержит дополнительную геномную последовательность человека из локуса гена TMPRSS человека, следующего за 3'-UTR TMPRSS человека. Дополнительная геномная последовательность человека может состоять по меньшей мере из 10-200 п. о., например, 50 п. о., 75 п. о., 100 п. о., 125 п. о., 150 п. о., 175 п. о., 200 п. о. или больше, находящихся в локусе гена TMPRSS человека непосредственно после 3'-UTR гена TMPRSS человека. В других вариантах осуществления нуклеотидная последовательность гена TMPRSS человека, присутствующая в гуманизированном гене Tmprss, не содержит 3'-UTR человека; вместо этого включена 3'-UTR эндогенного гена Tmprss грызуна и следует непосредственно за стоп-кодоном гуманизированного гена Tmprss. Например, гуманизированный ген Tmprss может содержать нуклеотидную последовательность эндогенного гена Tmprss грызуна, содержащую последовательности экзонов, кодирующие цитоплазматические и трансмембранные домены эндогенного белка Tmprss грызуна, за которой следует нуклеотидная последовательность гена TMPRSS человека, содержащая область от последовательностей экзонов, кодирующих эктодомен, до стоп-кодона белка TMPRSS человека с 3'-UTR эндогенного гена Tmprss грызуна, следующей непосредственно после стоп-кодона.

[0072] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss приводит к экспрессии кодируемого гуманизированного белка Tmprss у грызуна. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss экспрессируется по паттерну, сравнимому с соответствующим белком Tmprss грызуна или практически такому же, у контрольного грызуна (например, грызуна без гуманизированного гена Tmprss). В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss экспрессируется на уровне, сравнимом с уровнем соответствующего белка Tmprss грызуна или практически таком же, у контрольного грызуна (например, грызуна без гуманизированного гена Tmprss). В определенных вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss экспрессируется и выявляется на клеточной поверхности. В определенных вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss или растворимая форма (например, форма белка, характеризующаяся отсеченным эктодоменом) экспрессируется и выявляется в сыворотке крови грызуна, например, на уровне, сравнимом с уровнем соответствующего белка Tmprss грызуна или его растворимой формы или практически таком же, у контрольного грызуна. В контексте сравнения гуманизированного гена или белка у гуманизированного грызуна с эндогенным геном или белком грызуна у контрольного грызуна термин «сравнимый» означает, что сравниваемые молекулы или уровни могут не являться идентичными друг другу, но являться достаточно сходными для обеспечения возможности их сравнения, чтобы можно было сделать обоснованные выводы на основании наблюдаемых различий или сходств; и термин «практически такой же» в отношении уровней экспрессии означает, что сравниваемые уровни не отличаются друг от друга более чем на 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1%.

[0073] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение дополнительно предусматривает выделенную клетку или ткань животного, относящегося к грызунам, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетка выбрана из дендритной клетки, лимфоцита (например, B- или T-клетки), макрофага и моноцита. В некоторых вариантах осуществления ткань выбрана из жировой ткани, ткани мочевого пузыря, головного мозга, молочной железы, костного мозга, глаза, сердца, кишечника, почки, печени, легкого, лимфатического узла, мышцы, поджелудочной железы, плазмы крови, сыворотки крови, кожи, селезенки, желудка, вилочковой железы, яичка, яйцеклетки и их комбинации.

[0074] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрена эмбриональная стволовая клетка грызуна, геном которой содержит гуманизированный ген Tmprss, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления эмбриональная стволовая клетка грызуна представляет собой эмбриональную стволовую клетку мыши. В других вариантах осуществления эмбриональная стволовая клетка грызуна представляет собой эмбриональную стволовую клетку крысы. Эмбриональную стволовую клетку грызуна, содержащую гуманизированный ген Tmprss в своем геноме, можно применять для получения гуманизированного животного, относящегося к грызунам, дополнительно описанного ниже в данном документе.

[0075] В некоторых вариантах осуществления грызун, предусмотренный в данном документе, является гетерозиготным по гуманизированному гену Tmprss в своем геноме. В других вариантах осуществления грызун, предусмотренный в данном документе, является гомозиготным по гуманизированному гену Tmprss в своем геноме.

[0076] В определенных вариантах осуществления грызун содержит множество, т.е. два или более гуманизированных генов Tmprss в своем геноме. Другими словами, два или более разных эндогенных локусов Tmprss у грызуна были гуманизированы с применением нуклеотидных последовательностей родственных генов TMPRSS человека. Например, грызун был гуманизирован в двух или более локусов генов, выбранных из: Tmprss2, Tmprss4 и Tmprss11d.

[0077] Иллюстративные гуманизированные грызуны Tmprss2 (такие, как мыши), гуманизированные грызуны Tmprss4 (такие, как мыши) и гуманизированные грызуны Tmprss11d (такие, как мыши) дополнительно описаны ниже.

Гуманизированные грызуны Tmprss2

[0078] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен грызун, геном которого содержит гуманизированный ген Tmprss2, который содержит нуклеотидную последовательность эндогенного гена Tmprss2 грызуна и нуклеотидную последовательность гена TMPRSS2 человека, и который находится под контролем регуляторного 5'-элемента(регуляторных элементов), таких как промотор и/или энхансер(энхансеры) эндогенного гена Tmprss2 грызуна. Примеры грызунов включают мышей и крыс.

[0079] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss2 кодирует гуманизированный белок Tmprss2, который содержит эктодомен, практически идентичный эктодомену белка TMPRSS2 человека.

[0080] В конкретных вариантах осуществления белок TMPRSS2 человека имеет аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4.

[0081] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss2 содержит 387 C-концевых аминокислот белка TMPRSS2 человека, например, аминокислоты 106-492 белка TMPRSS2 человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss2 содержит эктодомен, который практически идентичен аминокислотной последовательности, состоящей из W106-G492 под SEQ ID NO: 4. В конкретных вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss2 содержит эктодомен, характеризующийся по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности, состоящей из W106-G492 под SEQ ID NO: 4; эктодомен, который отличается от аминокислотной последовательности, состоящей из W106-G492 под SEQ ID NO: 4, не более чем на 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту(аминокислот); или эктодомен, который отличается от аминокислотной последовательности, состоящей из W106-G492 под SEQ ID NO: 4, только на N- или C-конце эктодомена, например, отсутствием 1-5 аминокислот или наличием дополнительных 1-5 аминокислот на N- или C-конце.

[0082] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss2 дополнительно содержит цитоплазматический и трансмембранный участки, которые практически идентичны цитоплазматическому и трансмембранному участкам эндогенного белка Tmprss2 грызуна. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss2 дополнительно содержит трансмембранный домен и цитоплазматический домен эндогенного белка Tmprss2 грызуна.

[0083] В конкретных вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss2 содержит трансмембранный домен и цитоплазматический домен эндогенного белка Tmprss2 грызуна и эктодомен белка TMPRSS2 человека. В конкретных вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss2 кодирует гуманизированный белок Tmprss2, характеризующийся аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7.

[0084] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss2 образован в результате замены нуклеотидной последовательности эндогенного гена Tmprss2 грызуна в эндогенном локусе Tmprss2 грызуна нуклеотидной последовательностью гена TMPRSS2 человека.

[0085] В некоторых вариантах осуществления непрерывная геномная последовательность эндогенного гена Tmprss2 грызуна в эндогенном локусе Tmprss2 грызуна была замещена непрерывной геномной последовательностью гена TMPRSS2 человека с образованием гуманизированного гена Tmprss2.

[0086] В конкретных вариантах осуществления непрерывная геномная последовательность гена TMPRSS2 человека, вставленная в эндогенный ген Tmprss2 грызуна, содержит последовательности экзонов, т.е., экзоны, полностью или частично, гена TMPRSS2 человека, который кодируют эктодомен, который практически идентичен эктодомену белка TMPRSS2 человека, кодируемым геном TMPRSS2 человека. В случаях, когда эндогенный белок Tmprss2 и белок TMPRSS2 человека делят общие аминокислоты около точки соединения трансмембранного домена с эктодоменом, можно необязательно вставлять геномную последовательность TMPRSS2 человека, которая точно кодирует эктодомен белка TMPRSS2 человека, при этом можно применять немного более длинную или более короткую геномную последовательность TMPRSS2 человека, которая кодирует по сути эктодомен белка TMPRSS2 человека, чтобы получить гуманизированный белок Tmprss2, характеризующийся эктодоменом, который идентичен эктодомену белка TMPRSS2 человека.

[0087] В конкретных вариантах осуществления непрерывная геномная последовательность гена TMPRSS2 человека, вставляемая в эндогенный ген Tmprss2 грызуна, содержит по меньшей мере область от кодирующего экзона 4 до стоп-кодона в кодирующем экзоне 13 гена TMPRSS2 человека.

[0088] В определенных вариантах осуществления непрерывная геномная последовательность гена TMPRSS2 человека, вставляемая в эндогенный ген Tmprss2 грызуна, содержит интрон 3 и область от кодирующего экзона 4 до стоп-кодона в кодирующем экзоне 13 гена TMPRSS2 человека. В конкретных вариантах осуществления непрерывная геномная последовательность гена TMPRSS2 человека, вставляемая в эндогенный ген Tmprss 2 грызуна, содержит 3'-часть кодирующего экзона 3, интрон 3 и область от кодирующего экзона 4 до стоп-кодона в кодирующем экзоне 13 гена TMPRSS2 человека. В конкретных вариантах осуществления 3'-часть кодирующего экзона 3 гена TMPRSS2 человека, применяемая в гуманизации, составляет приблизительно 5-10 пар оснований в длину, т.е. приблизительно 5, 6, 7, 8, 9 или 10 пар оснований 3'-конца кодирующего экзона 3.

[0089] В некоторых вариантах осуществления непрерывная геномная последовательность гена TMPRSS2 человека, вставляемая в эндогенный ген Tmprss2 грызуна, также содержит 3'-UTR гена TMPRSS2 человека. В конкретных вариантах осуществления полный кодирующий экзон 13 гена TMPRSS2 человека включен в непрерывную геномную последовательность TMPRSS2 человека для гуманизации, которая содержит 3'-UTR гена TMPRSS2 человека. В конкретных вариантах осуществления непрерывная геномная последовательность гена TMPRSS2 человека содержит дополнительную геномную последовательность человека после 3'-UTR гена TMPRSS2 человека. Дополнительная геномная последовательность человека может представлять собой последовательность по меньшей мере из 10-200 п. о. или по меньшей мере из 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175 или 200 п. о., которая находится непосредственно после 3'-UTR гена TMPRSS2 человека в локусе TMPRSS2 человека.

[0090] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность эндогенного гена Tmprss2 грызуна, остающаяся в локусе гуманизированного Tmprss2, кодирует полипептид, который практически идентичен цитоплазматическому и трансмембранному участкам эндогенного белка Tmprss2 грызуна. В случаях, когда эндогенный белок Tmprss2 и белок TMPRSS2 человека делят общие аминокислоты около точки соединения трансмембранного домена с эктодоменом, можно необязательно сохранять эндогенную геномную последовательность Tmprss2 грызуна, которая точно кодирует трансмембранный домен эндогенного белка Tmprss2 грызуна, и можно сохранить немного более длинную или более короткую геномную последовательность Tmprss2 грызуна, которая кодирует по сути трансмембранный домен эндогенного белка Tmprss2 грызуна при замене для гуманизации, чтобы кодировать гуманизированный белок Tmprss2, характеризующийся трансмембранным доменом, который идентичен трансмембранному эндогенного белка Tmprss2 грызуна. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность эндогенного гена Tmprss2 грызуна, остающаяся в локусе гуманизированного Tmprss2, содержит экзоны 1-2 и 5'-часть кодирующего экзона 3 эндогенного гена Tmprss2 грызуна, где 5'-часть кодирующего экзона 3 представляет собой существенную часть экзона 3, состоящего из кодонов, например, полный кодирующий экзон 3, за исключением 5-10 пар оснований на 3'-конце кодирующего экзона 3.

[0091] В конкретных вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss2 содержит кодирующие экзоны 1-2, и 5'-часть кодирующего экзона 3 эндогенного гена Tmprss2 грызуна, и 3'-часть кодирующего экзона 3 и область от кодирующего экзона 4 до кодирующего экзона 13 гена TMPRSS2 человека, где гуманизированный ген Tmprss2 кодирует гуманизированный белок Tmprss2, который содержит цитоплазматический и трансмембранный участки, которые практически идентичны цитоплазматическому и трансмембранному участкам белка Tmprss2 грызуна, и эктодомен, который практически идентичен эктодомену белка TMPRSS2 человека. В определенных вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss2 кодирует гуманизированный белок Tmprss2, который содержит цитоплазматический домен и трансмембранный домены белка Tmprss2 грызуна, кодируемого эндогенным геном Tmprss2 грызуна, и эктодомен белка TMPRSS2 человека, кодируемого геном TMPRSS2 человека. В конкретных вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss2 кодирует гуманизированный белок Tmprss2, характеризующийся аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7.

[0092] В некоторых вариантах осуществления экзоны и интроны гена TMPRSS2 человека и гена Tmprss2 грызуна, применяемых в гуманизации, представляют собой находящиеся в SEQ ID NO: 1, 3 и 5-6.

[0093] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss2 приводит к экспрессии кодируемого гуманизированного белка Tmprss2 у грызуна. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss2 экспрессируется по паттерну, сравнимому с соответствующим белком Tmprss2 грызуна или практически такому же, у контрольного грызуна (например, грызуна без гуманизированного гена Tmprss2). В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss2 экспрессируется на уровне, сравнимом с соответствующим белком Tmprss2 грызуна или практически таком же, у контрольного грызуна (например, грызуна без гуманизированного гена Tmprss2). В определенных вариантах осуществления белок Tmprss2 человека экспрессируется и выявляется на клеточной поверхности. В определенных вариантах осуществления белок Tmprss2 человека или растворимая форма (например, форма белка, характеризующаяся отсеченным эктодоменом) экспрессируется и выявляется в сыворотке крови грызуна, например, на уровне, сравнимом с уровнем соответствующего белка Tmprss2 грызуна или его растворимой формы или практически таком же, у контрольного грызуна.

Гуманизированные грызуны Tmprss4

[0094] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен грызун, в геноме которого содержится гуманизированный ген Tmprss4, который содержит нуклеотидную последовательность эндогенного гена Tmprss4 грызуна и нуклеотидную последовательность гена TMPRSS4 человека, и который находится под контролем регуляторного 5'-элемента(регуляторных элементов), таких как промотор и/или энхансер(энхансеры) эндогенного гена Tmprss4 грызуна. Примеры грызунов включают мышей и крыс.

[0095] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss4 кодирует гуманизированный белок Tmprss4, который содержит эктодомен, практически идентичный эктодомену белка TMPRSS4 человека. В конкретных вариантах осуществления белок TMPRSS4 человека имеет аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 11.

[0096] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss4 содержит 384 C-концевых аминокислот белка TMPRSS4 человека, например аминокислоты 54-437 белка TMPRSS4 человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss4 содержит эктодомен, который практически идентичен аминокислотной последовательности, состоящей из K54-L437 под SEQ ID NO: 11. В конкретных вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss4 содержит эктодомен, характеризующийся по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности, состоящей из K54-L437 под SEQ ID NO: 11; эктодомен, который отличается от аминокислотной последовательности, состоящей из K54-L437 под SEQ ID NO: 11, не более чем на 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту(аминокислот); или эктодомен, который отличается от аминокислотной последовательности, состоящей из K54-L437 под SEQ ID NO: 11, только на N- или C-конце эктодомена, например, отсутствием 1-5 аминокислот или наличием дополнительных 1-5 аминокислот на N- или C-конце.

[0097] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss4 дополнительно содержит цитоплазматический и трансмембранный участки, которые практически идентичны цитоплазматическому и трансмембранному участкам эндогенного белка Tmprss4 грызуна. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss4 дополнительно содержит трансмембранный домен и цитоплазматический домен эндогенного белка Tmprss4 грызуна.

[0098] В конкретных вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss4 содержит трансмембранный домен и цитоплазматический домен эндогенного белка Tmprss4 грызуна и эктодомен белка TMPRSS4 человека. В конкретных вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss4 кодирует гуманизированный белок Tmprss4, характеризующийся аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 14.

[0099] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss4 образован в результате замены нуклеотидной последовательности эндогенного гена Tmprss4 грызуна в эндогенном локусе Tmprss4 грызуна нуклеотидной последовательностью гена TMPRSS4 человека.

[00100] В некоторых вариантах осуществления непрерывная геномная последовательность эндогенного гена Tmprss4 грызуна в эндогенном локусе Tmprss4 грызуна была замещена непрерывной геномной последовательностью гена TMPRSS4 человека с образованием гуманизированного гена Tmprss4.

[00101] В конкретных вариантах осуществления непрерывная геномная последовательность гена TMPRSS4 человека, вставленная в эндогенный ген Tmprss4 грызуна, содержит последовательности экзонов, т.е. экзоны, полностью или частично, гена TMPRSS4 человека, которые кодируют эктодомен, который практически идентичен эктодомену белка TMPRSS4 человека, кодируемому геном TMPRSS4 человека. В случаях, когда эндогенный белок Tmprss4 и белок TMPRSS4 человека делят общие аминокислоты около точки соединения трансмембранного домена с эктодоменом, можно необязательно вставлять геномную последовательность TMPRSS4 человека, которая точно кодирует эктодомен белка TMPRSS4 человека, при этом можно применять немного более длинную или более короткую геномную последовательность TMPRSS4 человека, которая кодирует по сути эктодомен белка TMPRSS4 человека, чтобы получить гуманизированный белок Tmprss4, характеризующийся эктодоменом, который идентичен эктодомену белка TMPRSS4 человека.

[00102] В конкретных вариантах осуществления непрерывная геномная последовательность гена TMPRSS4 человека, вставляемая в эндогенный ген Tmprss4 грызуна, содержит по меньшей мере область от кодирующего экзона 4 до стоп-кодона в кодирующем экзоне 13 гена TMPRSS4 человека.

[00103] В определенных вариантах осуществления непрерывная геномная последовательность гена TMPRSS4 человека, вставляемая в эндогенный ген Tmprss4 грызуна, содержит 3'-часть интрона 3 и область от кодирующего экзона 4 до стоп-кодона в кодирующем экзоне 13 гена TMPRSS4 человека. В конкретных вариантах осуществления 3'-часть интрона 3 гена TMPRSS4 человека, применяемая в гуманизации, составляет приблизительно 140-160 пар оснований в длину, т.е. приблизительно 140, 145, 150, 155, 160 пар оснований 3'-конца интрона 3.

[00104] В некоторых вариантах осуществления непрерывная геномная последовательность гена TMPRSS4 человека, вставляемая в эндогенный ген Tmprss4 грызуна, содержит 3'-UTR гена TMPRSS4 человека. В конкретных вариантах осуществления непрерывная геномная последовательность гена TMPRSS4 человека, вставляемая в эндогенный ген Tmprss4 грызуна, не содержит 3'-UTR гена TMPRSS4 человека и 3'-UTR эндогенного гена Tmprss4 грызуна, следующего непосредственно после стоп-кодона в гуманизированном гене Tmprss4.

[00105] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность эндогенного гена Tmprss4 грызуна, остающаяся в локусе гуманизированного Tmprss4, кодирует полипептид, который практически идентичен цитоплазматическому и трансмембранному участкам эндогенного белка Tmprss4 грызуна. В случаях, когда эндогенный белок Tmprss4 и белок TMPRSS4 человека делят общие аминокислоты около точки соединения трансмембранного домена с эктодоменом, можно необязательно сохранять эндогенную геномную последовательность Tmprss4 грызуна, которая точно кодирует трансмембранный домен эндогенного белка Tmprss4 грызуна, и можно сохранить немного более длинную или более короткую геномную последовательность Tmprss4 грызуна, которая кодирует по сути трансмембранный домен эндогенного белка Tmprss4 грызуна при замене для гуманизации, чтобы кодировать гуманизированный белок Tmprss4, характеризующийся трансмембранным доменом, который идентичен трансмембранному эндогенного белка Tmprss4 грызуна.

[00106] В конкретных вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss4 содержит кодирующие экзоны 1-3 эндогенного гена Tmprss4 грызуна и область от кодирующего экзона 4 до стоп-кодона кодирующего экзона 13 гена TMPRSS4 человека. В конкретных вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss4 содержит кодирующие экзоны 1-3 и 5'-часть интрона 3 эндогенного гена Tmprss4 грызуна и 3'-часть интрона 3 и область от кодирующего экзона 4 до стоп-кодона кодирующего экзона 13 гена TMPRSS4 человека. В определенных вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss4 кодирует гуманизированный белок Tmprss4, который содержит цитоплазматический домен и трансмембранный домен белка Tmprss4 грызуна, кодирумого эндогенным геном Tmprss4 грызуна, и эктодомен белка TMPRSS4 человека, кодируемого геном TMPRSS4 человека. В конкретных вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss4 кодирует гуманизированный белок Tmprss4, характеризующийся аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 14.

[00107] В некоторых вариантах осуществления экзоны и интроны гена TMPRSS4 человека и гена Tmprss4 грызуна, применяемые в гуманизации, представляют собой находящиеся в SEQ ID NO: 8, 10 и 12-13.

[00108] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss4 приводит к экспрессии кодируемого белка Tmprss4 человека у грызуна. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss4 экспрессируется по паттерну, сравнимому с соответствующим белком Tmprss4 грызуна или практически такому же, у контрольного грызуна (например, грызуна без гуманизированного гена Tmprss4, кодирующего гуманизированный белок Tmprss4). В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss4 экспрессируется на уровне, сравнимом с соответствующим белком Tmprss4 грызуна или практически таком же, у контрольного грызуна (например, грызуна без гуманизированного гена Tmprss4, кодирующего гуманизированный белок Tmprss4). В определенных вариантах осуществления белок Tmprss4 человека экспрессируется и выявляется на клеточной поверхности. В определенных вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss4 или растворимая форма (например, форма белка, характеризующаяся отсеченным эктодоменом) экспрессируется и выявляется в сыворотке крови грызуна, например, на уровне, сравнимом с уровнем соответствующего белка Tmprss4 грызуна или растворимой формы или практически таком же, у контрольного грызуна.

Гуманизированные грызуны Tmprss11d

[00109] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен грызун, геном которого содержит гуманизированный ген Tmprss11d, который содержит нуклеотидную последовательность эндогенного гена Tmprss11d грызуна и нуклеотидную последовательность гена TMPRSS11D человека, и который находится под контролем регуляторного 5'-элемента (регуляторных элементов), таких как промотор и/или энхансер(энхансеры) эндогенного гена Tmprss11d грызуна. Примеры грызунов включают мышей и крыс.

[00110] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss11d кодирует гуманизированный белок Tmprss11d, который содержит эктодомен, практически идентичный эктодомену белка TMPRSS11D человека.

[00111] В конкретных вариантах осуществления белок TMPRSS11D человека имеет аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 18.

[00112] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss11d содержит 377 C-концевых аминокислот белка TMPRSS11D человека, например, аминокислоты 42-418 белка TMPRSS11D человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss11d содержит эктодомен, который практически идентичен аминокислотной последовательности, состоящей из A42-I418 SEQ ID NO: 18. В конкретных вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss11d содержит эктодомен, характеризующийся по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности, состоящей из A42-I418 SEQ ID NO: 18; эктодомен, который отличается от аминокислотной последовательности, состоящей из A42-I418 SEQ ID NO: 18, не более чем на 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту (аминокислот); или эктодомен, который отличается от аминокислотной последовательности, состоящей из A42-I418 SEQ ID NO: 18, только на N- или C-конце, например, отсутствием 1-5 аминокислот или наличием дополнительных 1-5 аминокислот на N- или C-конце.

[00113] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss11d дополнительно содержит цитоплазматический и трансмембранный участки, которые практически идентичны цитоплазматическому и трансмембранному участкам эндогенного белка Tmprss11d грызуна. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss11d содержит трансмембранный домен и цитоплазматический домен эндогенного белка Tmprss11d грызуна.

[00114] В конкретных вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss11d содержит трансмембранный домен и цитоплазматический домен эндогенного белка Tmprss11d грызуна и эктодомен белка TMPRSS11D человека. В конкретных вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss11d кодирует гуманизированный белок Tmprss11d, характеризующийся аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 21.

[00115] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss11d образован в результате замены нуклеотидной последовательности эндогенного гена Tmprss11d грызуна в эндогенном локусе Tmprss11d грызуна нуклеотидной последовательностью гена TMPRSS11D человека.

[00116] В некоторых вариантах осуществления непрерывная геномная последовательность эндогенного гена Tmprss11d грызуна в эндогенном локусе Tmprss11d грызуна была замещена непрерывной геномной последовательностью гена TMPRSS11D человека с образованием гуманизированного гена Tmprss11d. В конкретных вариантах осуществления непрерывная геномная последовательность гена TMPRSS11D человека, вставленная в эндогенный ген Tmprss11d грызуна и содержит последовательности экзонов, т.е. экзоны, полностью или частично, гена TMPRSS11D человека, которые кодируют эктодомен, который практически идентичен эктодомену белка TMPRSS11D человека, кодируемого геном TMPRSS11D человека. В случаях, когда эндогенный белок Tmprss11d и белок TMPRSS11D человека делят общие аминокислоты около точки соединения трансмембранного домена с эктодоменом, можно необязательно вставлять геномную последовательность TMPRSS11D человека, которая точно кодирует эктодомен белка TMPRSS11D человека, при этом можно применять немного более длинную или более короткую геномную последовательность TMPRSS11D человека, которая кодирует по сути эктодомен белка TMPRSS11D человека, чтобы получить гуманизированный белок Tmprss11d, характеризующийся эктодоменом, который идентичен эктодомену белка TMPRSS11D человека.

[00117] В конкретных вариантах осуществления непрерывная геномная последовательность гена TMPRSS11D человека, вставленная в эндогенный ген Tmprss11d грызуна, содержит область по меньшей мере от кодирующего экзона 3 до стоп-кодона в кодирующем экзоне 10 гена TMPRSS11D человека.

[00118] В определенных вариантах осуществления непрерывная геномная последовательность гена TMPRSS11D человека, вставляемая в эндогенный ген Tmprss11d грызуна, содержит по меньшей мере 3'-часть интрона 2 и область от кодирующего экзона 3 до стоп-кодона в кодирующем экзоне 10 гена TMPRSS11D человека. В конкретных вариантах осуществления 3'-часть интрона 2 гена TMPRSS2 человека, применяемая в гуманизации, состоит из приблизительно 444 пар оснований в длину.

[00119] В некоторых вариантах осуществления непрерывная геномная последовательность гена TMPRSS11D человека, вставляемая в эндогенный ген Tmprss11d грызуна, содержит 3'-UTR гена TMPRSS11D человека. В конкретных вариантах осуществления полный кодирующий экзон 10 гена TMPRSS11D человека включен в непрерывную геномную последовательность TMPRSS11D человека для гуманизации, которая содержит 3'-UTR гена TMPRSS11D человека. В конкретных вариантах осуществления непрерывная геномная последовательность гена TMPRSS11D человека содержит дополнительную геномную последовательность человека после 3'-UTR гена TMPRSS11D человека. Дополнительная геномная последовательность человека может представлять собой последовательность из 10-200 п. о., 50-200 п. о. или приблизительно из 150, 160, 170, 180 п. о., которая находится непосредственно после 3'-UTR гена TMPRSS11D человека в локусе TMPRSS11D человека.

[00120] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность эндогенного гена Tmprss11d грызуна, остающаяся в гуманизированном локусе Tmprss11d, кодирует полипептид, который практически идентичен цитоплазматическому и трансмембранному участкам эндогенного белка Tmprss11d грызуна, кодируемого эндогенным геном Tmprss11d грызуна. В случаях, когда эндогенный белок Tmprss11d и белок TMPRSS11D человека делят общие аминокислоты около точки соединения трансмембранного домена с эктодоменом, можно необязательно сохранять эндогенную геномную последовательность Tmprss11d грызуна, которая точно кодирует трансмембранный домен эндогенного белка Tmprss11d грызуна, и можно сохранить немного более длинную или более короткую геномную последовательность Tmprss11d грызуна, которая кодирует по сути трансмембранный домен эндогенного белка Tmprss11d грызуна при замене для гуманизации, чтобы кодировать гуманизированный белок Tmprss11d, характеризующийся трансмембранным доменом, который идентичен трансмембранному эндогенного белка Tmprss11d грызуна.

[00121] В конкретных вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss11d содержит кодирующие экзоны 1-2 эндогенного гена Tmprss11d грызуна и область от кодирующего экзона 3 до кодирующего экзона 10 гена TMPRSS11D человека. В определенных вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss11d кодирует гуманизированный белок Tmprss11d, который содержит цитоплазматический домен и трансмембранный домен белка Tmprss11d грызуна, кодируемый эндогенным геном Tmprss11d грызуна, и эктодомен белка TMPRSS11D человека, кодируемого геном TMPRSS11D человека. В конкретных вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss11d кодирует гуманизированный белок Tmprss11d, характеризующийся аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 21.

[00122] В некоторых вариантах осуществления экзоны и интроны гена TMPRSS11D человека и гена Tmprss11d грызуна, применяемые в гуманизации, представляют собой находящиеся в SEQ ID NO: 15, 17 и 19-20.

[00123] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген Tmprss11D приводит к экспрессии кодируемого гуманизированного белка Tmprss11d у грызуна. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss11d экспрессируется по паттерну, сравнимому с соответствующим белком Tmprss11d грызуна или практически такому же, у контрольного грызуна (например, грызуна без гуманизированного гена Tmprss11d, кодирующего гуманизированный белок Tmprss11d). В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss11d экспрессируется на уровне, сравнимом с соответствующим белком Tmprss11d грызуна или практически таком же, у контрольного грызуна (например, грызуна без гуманизированного гена Tmprss11d, кодирующего гуманизированный белок Tmprss11d). В определенных вариантах осуществления белок Tmprss11d человека экспрессируется и выявляется на клеточной поверхности. В определенных вариантах осуществления гуманизированный белок Tmprss11d или растворимая форма (например, форма белка, характеризующаяся отсеченным эктодоменом) экспрессируется и выявляется в сыворотке крови грызуна, например, на уровне, сравнимом с уровнем соответствующего белка Tmprss11d грызуна или растворимой формы или практически таком же, у контрольного грызуна.

Способы получения гуманизированных животных Tmprss, относящихся к грызунам

[00124] Дополнительные аспекты настоящего изобретения направлены на способы получения гуманизированных грызунов Tmprss, описанных выше, а также векторов на основе нуклеиновой кислоты и эмбриональных стволовых клеток, отличных от человеческих, подходящих для применения в получении гуманизированного грызуна Tmprss.

[00125] Грызунов, предусмотренных в данном документе, можно получать с применением способов, известных из уровня техники. В иллюстративных вариантах осуществления клон бактериальной искусственной хромосомы (BAC), несущий ген Tmprss грызуна, можно модифицировать с применением бактериальной гомологичной рекомбинации и технологии VELOCIGENE® (см., например, U.S. 6586251 и Valenzuela et al. (2003), High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659). В результате нуклеотидная последовательность Tmprss грызуна была удалена из исходного клона BAC и была вставлена нуклеотидная последовательность Tmprss человека, что привело к образованию модифицированного клона BAC, несущего гуманизированный ген Tmprss, фланкированный гомологичными 5'-и 3'-участками грызуна. Модифицированный клон BAC при достижении линеаризации можно вводить в эмбриональную стволовую клетку (ES) грызуна посредством, например, электропорации. Как клетки ES мыши, так и клетки ES крысы были описаны в уровне техники. См., например, US 7576259, 7659442, 7294754 и 2008-0078000 A1 (которые включены в данный документ посредством ссылки), в которых описаны клетки ES мыши и способ VELOCIMOUSE® для получения генетически модифицированной мыши; US 2014/0235933 A1, US 2014/0310828 A1, Tong et al. (2010) Nature 467:211-215, and Tong et al. (2011) Nat Protoc. 6(6): doi:10.1038/nprot.2011.338 (которые включены в данный документ посредством ссылки), где описаны клетки ES крысы и способы получения генетически модифицированной крысы.

[00126] Можно выбрать клетки ES, характеризующиеся гуманизированным геном Tmprss интегрированным в геном. В некоторых вариантах осуществления клетки ES, характеризующиеся гуманизированным геном Tmprss, интегрированным в эндогенный локус Tmprss грызуна, можно выбрать на основании результатов анализов потери аллели грызуна и/или приобретения аллели человека. Выбранные клетки ES затем применяют в качестве донорных клеток ES для инъекции в эмбрион на стадии развития, предшествующей моруле (например, эмбрион на стадии 8 клеток) путем применения способа VELOCIMOUSE® (см., например, US 7576259, US 7659442, US 7294754 и US 2008-0078000 A1), или способов, описанных в US 2014/0235933 A1 и US 2014/0310828 A1. Эмбрион, содержащий донорные клетки ES, инкубируют до стадии бластоцисты и затем имплантируют суррогатной матери, чтобы получить грызуна F0, полностью полученного из донорных клеток ES. Детенышей грызунов, несущих гуманизированный ген Tmprss, можно идентифицировать посредством генотипирования ДНК, выделенной из отрезанных фрагментов хвостов потери аллели грызуна и/или приобретения аллели человека.

[00127] Грызунов, гетерозиготных по гуманизированному гену Tmprss, можно скрещивать с получением гомозиготных грызунов. Грызунов, содержащих один гуманизированный ген Tmprss, можно скрещивать с грызунами, содержащими другой гуманизированный ген Tmprss, с получением грызунов, содержащих множество гуманизированных генов Tmprss. Например, грызунов, содержащих гуманизированный ген Tmprss2, можно скрещивать с грызунами, содержащими гуманизированный ген Tmprss4, с получением грызунов, содержащих гуманизированный ген Tmprss2 и гуманизированный ген Tmprss4.

Способы применения грызунов, характеризующихся гуманизированными генами Tmprss

[00128] Грызуны, раскрытые в данном документе, обеспечивают применимую систему in vivo и источник биологических материалов (например, клеток), экспрессирующих гуманизированные белки Tmprss человека для идентификации и тестирования соединений, которые специфически целенаправленно воздействуют на белки TMPRSS человека.

[00129] В одном аспекте грызуна, раскрытого в данном документе, применяют для определения способности кандидатного соединения, такого как ингибитор белка TMPRSS человека, лечить и/или предупреждать инфекцию, вызванную вирусом гриппа.

[00130] В некоторых вариантах осуществления грызуну, содержащему гуманизированный ген Tmprss и экспрессирующему белок Tmprss человека, раскрытые в данном документе, вводят кандидатное соединение перед экспериментальной инфекцией вирусом гриппа. Профилактическую эффективность соединения можно оценивать путем определения, демонстрирует ли грызун меньшее количество симптомов инфекции, вызванной вирусом гриппа, и/или их меньшую тяжесть и/или улучшенную жизнеспособность по сравнению с контрольным грызуном (контрольными грызунами).

[00131] В других вариантах осуществления грызуну, содержащему гуманизированный ген Tmprss и экспрессирующему белок Tmprss человека, содержащий эктодомен белка TMPRSS человека, вводят кандидатный ингибитор этого белка TMPRSS человека после экспериментальной инфекции вирусом гриппа. Эффективность лечения с помощью кандидатного ингибитора можно оценивать путем определения, демонстрирует ли грызун меньшее количество симптомов инфекции, вызванной вирусом гриппа, и/или их меньшую тяжесть и/или улучшенную жизнеспособность по сравнению с контрольным грызуном (контрольными грызунами).

[00132] Подходящие контрольные грызуны включают, например, грызунов, содержащих гуманизированный ген Tmprss, не подвергавшихся экспериментальной инфекции; и грызунов, содержащих гуманизированный ген Tmprss, подвергавшихся экспериментальной инфекции без введения какого-либо соединения; и грызунов, содержащих гуманизированный ген Tmprss, подвергавшихся экспериментальной инфекции и введению соединения, известного как терапевтически эффективное.

[00133] Соединения, которые можно оценивать с помощью способов по настоящему изобретению, включают кандидатные ингибиторы TMPRSS, например низмолекулярный ингибитор протеазы, ингибитор на основе нуклеиновых кислот (например, siRNA, рибозим, антисмысловая конструкция и т.д.), антигенсвязывающий белок (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент) или блокирующий пептид/пептидный ингибитор. Ингибитор TMPRSS может функционировать путем ингибирования или снижения способности белка TMPRSS протеолитически расщеплять белок-предшественник гемагглютинина (HA0) на субъединицы HA1 и HA2.

[00134] В некоторых вариантах осуществления кандидатный ингибитор представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Как моноклональные, так и поликлональные антитела подходят для целей настоящего изобретения. В конкретных вариантах осуществления антитело специфически связывает белок TMPRSS и ингибирует протеазную активность данного белка TMPRSS и практически не ингибирует протеазную активность другого белка TMPRSS. Например, ингибитор, представляющий собой антитело к TMPRSS2, специфически связывает белок TMPRSS2 и ингибирует протеазную активность белка TMPRSS2 и не оказывает эффекта на протеолитическую активность TMPRSS4 или TMPRSS11D, или снижает протеолитическую активность TMPRSS4 или TMPRSS11D не более чем на 25% (например, на 20%, 15%, 10%, 5% или меньше) по сравнению с неингибиторной контрольной молекулой, протестированной в идентичных или практически идентичных условиях эксперимента.

[00135] В некоторых вариантах осуществления ингибитор представляет собой антитело к TMPRSS2 или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления ингибитор представляет собой антитело к TMPRSS4 или его антигенсвязывающий фрагмент. В других вариантах осуществления ингибитор представляет собой антитело к TMPRSS11D или его антигенсвязывающий фрагмент.

[00136] Экспериментальную инфекцию, вызванную вирусом гриппа, можно индуцировать и контролировать, следуя известным протоколам. См., например, US 2013/0273070 A1. Например, животным, относящимся к грызунам, вирус гриппа можно ввести интраназально. Инфицированных животных можно оценивать с помощью определения симптомов и тяжести инфекции. Например, животных можно анализировать по (1) изменению массы тела и выживаемости, (2) клеточным изменениям посредством проточной цитометрии, (3) иммунохимии, окрашиваний PAS и H&E целых легких и (4) уровням цитокинов в сыворотке крови. Контрольные животные, про которых известно, что они восприимчивы к вирусу, демонстрируют существенное увеличение уровня дендритных клеток, грипп-позитивных альвеолярных макрофагов, нейтрофилов или эпителиальных клеток в легких и уровней IFNγ по сравнению с неинфицированными животными.

ПРИМЕРЫ

[00137] Следующие примеры приведены для того, чтобы обеспечить специалистов в данной области описанием того, как создавать и применять способы и композиции по настоящему изобретению, и не предназначены для ограничения объема того, что авторы настоящего изобретения рассматривают в качестве своего изобретения. Если не указано иное, температура указана по Цельсию, а давление является атмосферным или близким к нему.

Пример 1. Гуманизация эндогенного гена Tmprss2

[00138] В данном примере показаны иллюстративные способы гуманизации эндогенного гена, кодирующего Tmprss2 у грызуна (например, мыши). Способы, описанные в данном примере, при необходимости можно применять для гуманизации эндогенного гена Tmprss2 грызуна с применением любой последовательности человека или комбинации последовательностей человека (или фрагментов последовательностей).

[00139] Нацеливающий вектор для гуманизации эндогенного гена Tmprss2 конструировали с применением клонов бактериальной искусственной хромосомы (BAC) и технологии VELOCIGENE® (см., например, патент США № 6586251 и Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659; включенные в данный документ посредством ссылки).

[00140] Вкратце, клон бактериальной искусственной хромосомы (BAC) мыши bMQ-264A15, содержащий ген Tmprss2 мыши, применяли и модифицировали следующим образом. Получали фрагмент ДНК, содержащий гомологичную нуклеотидную 5'-последовательность мыши, геномную ДНК TMPRSS2 человека, состоящую из приблизительно 25091 п. о. (содержащую последние 7 п. о. кодирующего экзона 3, интрон 3 и область от кодирующего экзон 4 до кодирующего экзона 13 (включая 3'-UTR, которая представляет собой часть кодирующего экзона 13) гена TMPRSS2 человека), самоудаляющуюся кассету устойчивости к неомицину, состоящую из приблизительно 2691 п. о., и гомологичную 3'-последовательность мыши. Данный фрагмент ДНК применяли для модификации клона BAC bMQ-264A15 посредством гомологичной рекомбинации в бактериальных клетках. В результате геномный фрагмент Tmprss2 мыши (состоящий из приблизительно 25291 п. о.), кодирующий эктодомен в клоне BAC, замещали геномным фрагментом TMPRSS2 человека, состоящим из приблизительно 25091 п. о., после которого расположена самоудаляющаяся кассета устойчивости к неомицину, состоящая из приблизительно 2691 п. о. В частности, геномный фрагмент Tmprss2 мыши, который замещали, содержал последние 7 п. о. кодирующего экзона 3, интрон 3 и область от кодирующего экзона 4 до стоп-кодона в кодирующем экзоне 13 гена Tmprss2 мыши (фигуры 1A-1B). Геномный фрагмент TMPRSS2 человека, который вставляли, содержал последние 7 п. о. кодирующего экзона 3, интрон 3 и область от кодирующего экзона 4 до кодирующего экзона 13 гена TMPRSS2 человека (включая 3'-UTR TMPRSS2 человека) и геномную 3'-последовательность человека, состоящую из 131 п. о., после 3'-UTR TMPRSS2 человека (фигуры 1A-1B). Полученный модифицированный клон BAC содержал в направлении от 5’ до 3' (i) гомологичный 5'-участок, содержащий приблизительно 12 т. о. геномной ДНК мыши, содержащей 5'-UTR Tmprss2 мыши, экзон 1 Tmprss2 мыши (некодирующий), кодирующие экзоны 1-3 (за исключением последних 7 п. о. кодирующего экзона 3); (ii) геномный фрагмент TMPRSS2 человека, состоящий из приблизительно 25091 п. о., содержащий последние 7 п. о. кодирующего экзона 3 человека, интрон 3, область от кодирующего экзона 4 до 13 человека (в том числе 3'-UTR TMPRSS2 человека) и геномную 3'-последовательность человека; (iii) самоудаляющуюся кассету устойчивости к неомицину, состоящую из приблизительно 2691 п. о., после которой расположен (iv) гомологичный 3'-участок мыши, составляющий 45 т. о., содержащий 3'-UTR Tmprss2 мыши, и остающуюся геномную ДНК в исходном клоне BAC. (См. фигуры 1A-1B.) Соединительные последовательности также изложены в нижней части фигуры 1B. Часть модифицированного клона BAC, содержащая геномный фрагмент TMPRSS2 человека и кассету устойчивости к неомицину, а также расположенные до и после соединительные вставки, изложена под SEQ ID NO: 5. Аминокислотная последовательность белка, кодируемого гуманизированным геном Tmprss2, изложена под SEQ ID NO: 7. Выравнивание данного гуманизированного белка Tmprss2 («мутантного белка 7010»), белка Tmprss2 мыши (SEQ ID NO: 2) и белка TMPRSS2 человека (SEQ ID NO: 4) показано на фигуре 1D.

[00141] Модифицированный клон BAC, содержащий гуманизированный ген Tmprss2, описанный выше, применяли для электропорации эмбриональных стволовых клеток (ES) мыши для создания модифицированных клеток ES, содержащих гуманизированный ген Tmprss2. Подвергнутые положительному целенаправленному воздействию клетки ES, содержащие гуманизированный ген Tmprss2, идентифицировали с помощью анализа (Valenzuela et al., выше), в котором выявляли наличие последовательностей TMPRSS2 человека (например, кодирующих экзонов 4-13 TMPRSS2 человека) и подтверждали потерю и/или сохранение последовательностей Tmprss2 мыши (например, потерю кодирующих экзонов 4-13 Tmprss2 мыши). В таблице 1 представлены праймеры и зонды, которые применяли для подтверждения гуманизации эндогенного гена Tmprss2, описанного выше (фигуры 1A-1B). Как только правильно подвергнутый целенаправленному воздействию клон клеток ES был выбран, селективную кассету устойчивости к неомицину можно вырезать путем введения рекомбиназы Cre, например, посредством электропорации. В качестве альтернативы селективную кассету устойчивости к неомицину можно удалять путем скрещивания потомства, полученного от клона ES, с делеторным грызуном, относящемуся к породе, которая экспрессирует рекомбиназу Cre. На фигуре 1C изображен гуманизированный локус Tmprss2 после делеции кассеты с соединительными последовательностями, показанными в нижней части фигуры 1C.

[00142] Выбранные клоны клеток ES (с кассетой или без нее) применяли для имплантации самкам мышей с применением способа VELOCIMOUSE® (см., например, патент США № 7294754 и Poueymirou et al., F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, 2007, Nature Biotech. 25(1):91-99) для получения выводка детенышей, содержащих в геноме гуманизированную аллель Tmprss2. Для мышей, несущих гуманизированную аллель Tmprss2, можно вновь проводить подтверждение и идентификацию путем генотипирования ДНК, выделенной из отрезанных фрагментов хвостов, с применением модификации анализа аллели (Valenzuela et al., выше), в котором выявляют наличие последовательностей гена TMPRSS2 человека. Детенышей генотипировали и отбирали когорты животных, гетерозиготных по гуманизированному локусу Tmprss2, для определения характеристик. Животных, гомозиготных по гуманизированному локусу Tmprss2, получали путем скрещивания гетерозиготных животных.

ТАБЛИЦА 1

Название	Праймер	Последовательность (5'–3')	SEQ ID NO
7010U	Прямой	GCCGTGACTGTGACCTTCTC	(SEQ ID NO:26)
7010U	Зонд (BHQ)	TGGAGGAGCCACCTGATGCCTC	(SEQ ID NO:27)
Обратный	GCCTTGCCCTCAATGGAAAC	(SEQ ID NO:28)
7010D	Прямой	GGTTGCACAGCAAGGAAGAAG	(SEQ ID NO:29)
7010D	Зонд (BHQ)	CCAGGAGTTCCTGTGAGCCTACCC	(SEQ ID NO:30)
Обратный	TGGAATGGAAGGAGCTGGAG	(SEQ ID NO:31)
7010hU	Прямой	GTCCCACCTCCTGCAACTG	(SEQ ID NO:32)
7010hU	Зонд (BHQ)	TGAGCCTTCCCATCAGCCTGGG	(SEQ ID NO:33)
Обратный	CCACAATGGCACATGGGTCTG	(SEQ ID NO:34)
7010hTD	Прямой	GGTGCTTGCTCCCCAAGA	(SEQ ID NO:35)
7010hTD	Зонд (BHQ)	CCTAAAAGGTGTTGTAATGG	(SEQ ID NO:36)
Обратный	GGCAATAAAGAAGGAAGACGTTTT	(SEQ ID NO:37)

Пример 2. Гуманизация эндогенного гена Tmprss4

[00143] В данном примере показаны иллюстративные способы гуманизации эндогенного гена, кодирующего Tmprss4 у грызуна (например, мыши). Способы, описанные в данном примере, при необходимости можно применять для гуманизации эндогенного гена Tmprss4 грызуна с применением любой последовательности человека или комбинации последовательностей человека (или фрагментов последовательностей).

[00144] Нацеливающий вектор для гуманизации эндогенного гена Tmprss4 конструировали с применением клонов бактериальной искусственной хромосомы (BAC) и технологии VELOCIGENE® (см., например, патент США № 6586251 и Valenzuela et al. (2003), выше).

[00145] Вкратце, клон бактериальной искусственной хромосомы (BAC) мыши RP23-71M15, содержащий ген Tmprss4 мыши, применяли и модифицировали следующим образом. Получали фрагмент ДНК, содержащий гомологичную нуклеотидную 5'-последовательность мыши, самоудаляющуюся кассету устойчивости к неомицину, состоящую из приблизительно 4996 п. о., геномную ДНК человека, состоящую из приблизительно 14963 п. о. (содержащую область от кодирующего экзона 4 до стоп-кодона в кодирующем экзоне 13 гена TMPRSS4 человека) и гомологичную 3'-последовательность мыши. Данный фрагмент ДНК применяли для модификации клона BAC RP23-71M15 путем гомологичной рекомбинации в бактериальных клетках. В результате геномный фрагмент (состоящий из приблизительно 11074 п. о.), кодирующий эктодомен, в клоне BAC замещали самоудаляющейся кассетой устойчивости к неомицину, состоящей из приблизительно 4996 п. о., после которой расположена геномная ДНК, состоящая из приблизительно 14963 п. о. В частности, геномный фрагмент мыши, который удаляли и замещали, содержал 130 п. о. 3'-части интрона 3 мыши, область от кодирующего экзона 4 до стоп-кодона в кодирующем экзоне 13 гена Tmprss4 мыши (фигуры 2A-2B). Геномный фрагмент человека, который вставляли, содержал 3'-часть интрона 3 TMPRSS4 человека, состоящую из приблизительно 150 п. о., и область от кодирующего экзона 4 до стоп-кодона в кодирующем экзоне 13 гена TMPRSS4 человека (фигуры 2A-2B). Полученный модифицированный клон BAC содержит в направлении от 5’ до 3' гомологичный 5'-участок мыши, содержащий приблизительно 44,8 т. о. геномной ДНК мыши (в том числе 5'-UTR Tmprss4 мыши, область от кодирующего экзона 1 до кодирующего экзона 3 Tmprss4 мыши, частично интрон 3 Tmprss4 мыши (без 130 п. о. 3'-части), самоудаляющуюся кассету устойчивости к неомицину, состоящую из приблизительно 4996 п. о., 3'-часть интрона 3 TMPRSS4 человека, состоящую из приблизительно 150 п. о., область от кодирующего экзона 4 до стоп-кодона в кодирующем экзоне 13 TMPRSS4 человека, после которой непосредственно расположена 3'-UTR Tmprss4 мыши и остающаяся геномная ДНК мыши в исходном клоне BAC (гомологичный 3'-участок мыши, состоящий в общем из приблизительно 118 т. о.). (См. фигуры 2A-2B.) Соединительные последовательности также изложены в нижней части фигуры 2B. Часть модифицированного клона BAC, содержащая кассету устойчивости к неомицину, геномный фрагмент TMPRSS4 человека, а также расположенные до и после соединительные вставки, изложена под SEQ ID NO: 12. Аминокислотная последовательность белка, кодируемого гуманизированным геном Tmprss4, изложена под SEQ ID NO: 14. Выравнивание данного гуманизированного белка Tmprss4 («мутантного белка 7224»), белка Tmprss4 мыши (SEQ ID NO: 9) и белка TMPRSS4 человека (SEQ ID NO: 11) показано на фигуре 2D.

[00146] Модифицированный клон BAC, содержащий гуманизированный ген Tmprss4, описанный выше, применяли для электропорации эмбриональных стволовых клеток (ES) мыши для получения модифицированных клеток ES, содержащих гуманизированный ген Tmprss4. Подвергнутые положительному целенаправленному воздействию клетки ES, содержащие гуманизированный ген Tmprss4, идентифицировали с помощью анализа (Valenzuela et al., выше), в котором выявляли наличие последовательностей TMPRSS4 человека (например, кодирующих экзонов 4-13 TMPRSS4 человека) и подтверждали потерю и/или сохранение последовательностей Tmprss4 мыши (например, потерю кодирующих экзонов 4-13 Tmprss4 мыши). В таблице 2 представлены праймеры и зонды, которые применяли для подтверждения гуманизации эндогенного гена Tmprss4, описанного выше (фигуры 2A-2B). Как только правильно подвергнутый целенаправленному воздействию клон клеток ES был выбран, селективную кассету устойчивости к неомицину можно вырезать путем введения рекомбиназы Cre, например, посредством электропорации. В качестве альтернативы селективную кассету устойчивости к неомицину можно удалять путем скрещивания потомства, полученного от клона ES, с делеторным грызуном, относящемуся к породе, которая экспрессирует рекомбиназу Cre. На фигуре 2C изображен гуманизированный локус Tmprss4 после делеции кассеты с соединительными последовательностями, показанными в нижней части фигуры 2C.

[00147] Выбранные клоны клеток ES (с кассетой устойчивости или без нее) применяли для имплантации самкам мышей с применением способа VELOCIMOUSE® (см., например, патент США № 7294754 и Poueymirou et al. (2007), выше) для создания выводка детенышей, содержащих в геноме гуманизированную аллель Tmprss4. Для мышей, несущих гуманизированную аллель Tmprss4, вновь проводили подтверждение и идентификацию путем генотипирования ДНК, выделенной из отрезанных фрагментов хвостов, с применением модификации анализа аллели (Valenzuela et al., выше), в котором выявляют наличие последовательностей гена TMPRSS4 человека. Детенышей генотипировали и отбирали когорты животных, гетерозиготных по гуманизированному локусу Tmprss4, для определения характеристик. Животных, гомозиготных по гуманизированному локусу Tmprss4, получали путем скрещивания гетерозиготных животных.

ТАБЛИЦА 2

Название	Праймер	Последовательность (5'–3')	SEQ ID NO

7224mTU Прямой GAGCAGGGCCATGACACAT (SEQ ID NO:42)

Зонд (BHQ) ACCATTAGATCCCAGCACTGGACA (SEQ ID NO:43)

Обратный AAACCCTTCCCGAGAGAGAA (SEQ ID NO:44)

7224mTU2	Прямой	GAGGAACACTGTGTCAAGGACTT	(SEQ ID NO:45)
7224mTU2	Зонд (BHQ)	CCTGAAAAGCCCGGAGTGGCAG	(SEQ ID NO:46)
Обратный	GGGCAGAGACCACATCTGA	(SEQ ID NO:47)
7224mTD	Прямой	GGAAGCCCTCTCTCGATACTTG	(SEQ ID NO:48)
7224mTD	Зонд (BHQ)	TTCTACCCTGAGGGCATGCAGC	(SEQ ID NO:49)
Обратный	TGGGATGTAGAAGGTTGTCAGA	(SEQ ID NO:50)
7224hTU	Прямой	CTGAGCCTGGAACTCACACATG	(SEQ ID NO:51)
7224hTU	Зонд (BHQ)	TCTGAGAGCCCAGCACTATCGCC	(SEQ ID NO:52)
Обратный	GCTGAGGGTCAGGCTTGAG	(SEQ ID NO:53)
7224hTD	Прямой	TCTGCAGGGTAGGGAGAGAAG	(SEQ ID NO:54)
7224hTD	Зонд (BHQ)	TGTTTCAGAAAAGGAAGACTCACGTTACA	(SEQ ID NO:55)
Обратный	GAGACCGATGAAGAGAAAGTCAGA	(SEQ ID NO:56)

Пример 3. Гуманизация эндогенного гена Tmprss11d

[00148] В данном примере показаны иллюстративные способы гуманизации эндогенного гена, кодирующего Tmprss11d у грызуна (например, мыши). Способы, описанные в данном примере, при необходимости можно применять для гуманизации эндогенного гена Tmprss11d грызуна с применением любой последовательности человека или комбинации последовательностей человека (или фрагментов последовательностей).

[00149] Нацеливающий вектор для гуманизации эндогенного гена Tmprss11d конструировали с применением клонов бактериальной искусственной хромосомы (BAC) и технологии VELOCIGENE® (см., например, патент США № 6586251 и Valenzuela et al. (2003), выше).

[00150] Вкратце, клон бактериальной искусственной хромосомы (BAC) мыши RP23-95N22, содержащий ген Tmprss11d мыши, применяли и модифицировали следующим образом. Получали фрагмент ДНК, содержащий гомологичную нуклеотидную 5'-последовательность мыши, геномную ДНК TMPRSS11D человека, состоящую из приблизительно 33927 п. о. (содержащую 444 п. о. на 3'-конце интрона 2 и область от кодирующего экзона 3 до кодирующего экзона 10 (в том числе 3'-UTR, которая представляет собой часть кодирующего экзона 10) гена TMPRSS11D человека), самоудаляющуюся кассету устойчивости к неомицину, состоящую из приблизительно 4996 п. о., и гомологичную 3'-последовательность мыши. Данный фрагмент ДНК применяли для модификации клона BAC RP23-95N22 путем гомологичной рекомбинации в бактериальных клетках. В результате геномный фрагмент Tmprss11d мыши (состоящий из приблизительно 35667 п. о.), кодирующий эктодомен в клоне BAC, замещали геномным фрагментом TMPRSS11D человека, состоящим из приблизительно 33927 п. о., после которого расположена самоудаляющаяся кассета устойчивости к неомицину, состоящая из приблизительно 4996 п. о. В частности, геномный фрагмент Tmprss11d мыши, который замещали, содержал 3'-часть интрона 2 и область от кодирующего экзона 3 до стоп-кодона в кодирующем экзоне 10 гена Tmprss11d мыши (фигуры 3A-3B). Геномный фрагмент TMPRSS11D человека, который вставляли, содержал 444 п. о. на 3'-конце интрона 2 и область от кодирующего экзона 3 до кодирующего экзона 10 гена TMPRSS11D человека (в том числе 3'-UTR TMPRSS11D человека) и геномную 3'-последовательность человека, состоящую из приблизительно 172 п. о., после 3'-UTR TMPRSS11D человека (фигуры 3A-3B). Полученный модифицированный клон BAC содержал в направлении от 5' до 3' (i) гомологичный 5'-участок мыши, содержащий приблизительно 143 т. о. геномной ДНК мыши, в том числе 5'-UTR Tmprss11d мыши, кодирующие экзоны 1-2 и 5'-часть интрона 2 Tmprss11d мыши; (ii) геномный фрагмент TMPRSS11D человека, содержащий 3'-часть интрона 2 и область от кодирующего экзона 3 до кодирующего экзона 10 (в том числе 3'-UTR) TMPRSS11D человека, и геномную 3'-последовательность человека; (iii) самоудаляющуюся кассету устойчивости к неомицину, состоящую из приблизительно 4996 п. о., после которой расположен (iv) гомологичный 3'-участок мыши, составляющий 10 т. о., содержащий 3'-UTR Tmprss11d мыши и остающуюся геномную ДНК мыши в исходном клоне BAC. (См. фигуры 3A-3B.) Соединительные последовательности также изложены в нижней части фигуры 3B. Часть модифицированного клона BAC, содержащая геномный фрагмент TMPRSS11D человека и кассету устойчивости к неомицину, а также расположенные до и после соединительные вставки, изложена под SEQ ID NO: 19. Аминокислотная последовательность белка, кодируемого гуманизированным геном Tmprss11d, изложена под SEQ ID NO: 21. Выравнивание данного гуманизированного белка Tmprss11d («мутантного белка 7226»), белка Tmprss11d мыши (SEQ ID NO: 16) и белка TMPRSS11D человека (SEQ ID NO: 18) показано на фигуре 3D.

[00151] Модифицированный клон BAC, содержащий гуманизированный ген Tmprss11d, описанный выше, применяли для электропорации эмбриональных стволовых клеток (ES) мыши для получения модифицированных клеток ES, содержащих гуманизированный ген Tmprss11d. Подвергнутые положительному целенаправленному воздействию клетки ES, содержащие гуманизированный ген Tmprss11d, идентифицировали с помощью анализа (Valenzuela et al., выше), в котором выявляли наличие последовательностей TMPRSS11D человека (например, кодирующих экзонов 3-10 TMPRSS11D человека) и подтверждали потерю и/или сохранение последовательностей Tmprss11d мыши (например, потерю кодирующих экзонов 3-10 Tmprss11d мыши). В таблице 3 представлены праймеры и зонды, которые применяли для подтверждения гуманизации эндогенного гена Tmprss11d, описанного выше (фигуры 3A-3B). Как только правильно подвергнутый целенаправленному воздействию клон клеток ES был выбран, селективную кассету устойчивости к неомицину можно вырезать путем введения рекомбиназы Cre, например, посредством электропорации. В качестве альтернативы селективную кассету устойчивости к неомицину можно удалять путем скрещивания потомства, полученного от клона ES, с делеторным грызуном, относящемуся к породе, которая экспрессирует рекомбиназу Cre. На фигуре 3C изображен гуманизированный локус Tmprss11d после делеции кассеты с соединительными последовательностями, показанными в нижней части фигуры 3C.

[00152] Выбранные клоны клеток ES (с кассетой или без нее) применяли для имплантации самкам мышей с применением способа VELOCIMOUSE® (см., например, патент США № 7294754 и Poueymirou et al. (2007), выше) для создания выводка детенышей, содержащих в геноме гуманизированную аллель Tmprss11d. Для мышей, несущих гуманизированную аллель Tmprss11d, вновь проводили подтверждение и идентификацию путем генотипирования ДНК, выделенной из отрезанных фрагментов хвостов, с применением модификации анализа аллели (Valenzuela et al., выше), в котором выявляют наличие последовательностей гена TMPRSS11D человека. Детенышей генотипировали и отбирали когорты животных, гетерозиготных по гуманизированному локусу Tmprss11d, для определения характеристик. Животных, гомозиготных по гуманизированному локусу Tmprss11d, получали путем скрещивания гетерозиготных животных.

ТАБЛИЦА 3
Название	Праймер	Последовательность (5'–3')	SEQ ID NO
7226mTU	Прямой	TCCTCTCCAGACAAGAAAGCT	(SEQ ID NO:61)
7226mTU	Зонд (BHQ)	TCATAGCAGCTTTCAAATCCTAAACGTTGA	(SEQ ID NO:62)
Обратный	TCGTGTGTAGCTGGTGAGTT	(SEQ ID NO:63)
7226mTD	Прямой	CATGCGATCACAGGAGGAGATC	(SEQ ID NO:64)
7226mTD	Зонд (BHQ)	AATTGGGCCCGAAGCCAGATGC	(SEQ ID NO:65)
Обратный	CGGAAGGCTTCTGTGACTTC	(SEQ ID NO:66)
7226hTU	Прямой	GTCTCCCACTTCTGACATAATGAAC	(SEQ ID NO:67)
7226hTU	Зонд (BHQ)	CCCAGTGTTAACCCTACATCTGGTTCC	(SEQ ID NO:68)
Обратный	TGGGAAGAGACTCTTGGACA	(SEQ ID NO:69)
7226hTD	Прямой	ATGAGCTCCTAGTACAGCTAAAGTT	(SEQ ID NO:70)
7226hTD	Зонд (MGB)	ATGCATGATCATCTATGCGTCAGAGC	(SEQ ID NO:71)
Обратный	TGCCCAGATGCAGGGAGTTAG	(SEQ ID NO:72)

Пример 4. Оценка группы 1 и группы 2 заражения вирусами гриппа A мышей Tmprss4 MAID7225 HumIn по сравнению с мышами дикого типа

[00153] Чтобы подтвердить применение гуманизированных грызунов Tmprss в качестве модели инфекции на животных, проводили эксперименты с оценкой выживаемости мышей MAID7225 HumIn TMPRSS4 по сравнению с мышами дикого типа (WT) из одного помета в группе 1 и группе 2 гриппа A в модели тяжелой инфекции гриппа.

[00154] Мыши MAID7225 HumIn TMPRSS4 являлись гомозиготными по гуманизированному гену Tmprss4 в их геноме, и их получали, как описано в примере 2. Вирусные штаммы, которые применяли в данных исследованиях, включали изолят исторического вируса гриппа A группы 1 A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) и изолят собственного адаптированного для мышей вируса гриппа A группы 2 A/Aichi/02/1968 (HA, NA) X-31 (H3N2). Все эксперименты выполняли на самцах и самках мышей MAID7225 HumIn TMPRSS4 или мышах WT из одного помета возрастом 6-8 недель. Мышей заражали с помощью 1150 бляшкообразующих единиц (PFU) A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) или 10000 PFU A/Aichi/02/1968-X31 (H3N2). В данных моделях выживаемости мышей заражали интраназально (IN) в день 0 после инфицирования (p.i.). Мышей взвешивали и наблюдали ежедневно до дня 14 p.i., и умерщвляли, когда они теряли 20% их первоначального веса. Результаты представляли в виде процента выживаемости (таблица 4).

Таблица 4

ID группы	Количество мышей в группе	Процент выживаемости (к-во выживших мышей/общее к-во мышей в группе)
Неинфицированный контроль (2 HumIn, 2 мыши WT)	4	100 (4/4)
TMPRSS4 WT; инфицированные H1_PR34	10	20 (2/10)
TMPRSS4 HumIn; инфицированные H1_PR34	8	25 (2/8)
TMPRSS4 WT; инфицированные H3_X31	9	11.1 (1/9)
TMPRSS4 HumIn; инфицированные H3_X31	8	25 (2/8)

[00155] Выживаемость мышей, характеризующихся TMPRSS4 MAID7225 HumIn, сравнивали с мышами WT одного помета после заражения как вирусом тяжелого гриппа A группы 1 [A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1)], так и адаптированным для мышей вируса тяжелого гриппа A группы 2 [A/Aichi/02/1968-X31 (H3N2)] (фигура 4). Выживаемость мышей, характеризующихся MAID7225 HumIn TMPRSS4, не отличались от мышей дикого типа, которых заражали либо H1N1 (25%; n=8 и 20%; n=10 соответственно), либо H3N2 (25%; n=8 и 11,1%; n=9 соответственно).

[00156] Публикации, веб-сайты и другие справочные материалы, упоминаемые в данном документе для описания предпосылок настоящего изобретения и для предоставления дополнительных подробностей, относящихся к его практическому осуществлению, включены в данный документ посредством ссылки.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> РЕДЖЕНЕРОН ФАРМАСЬИТИКАЛЗ, ИНК.

<120> ГРЫЗУНЫ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИЕСЯ ГУМАНИЗИРОВАННЫМ ГЕНОМ TMPRSS

<130> 33093PCT (10234WO01)

<150> 62/301023

<151> 29.02.2016

<160> 72

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 3175

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 1

gcctttcctg gccgttccct ccttctggcc gaggtgcctg cgtttagggg tgtcaccctg 60

gctcccggga cgccgcctcc ggagatttaa gcgagaactg gagtaggtcg tgtacttgga 120

gcggacgagg aagccaagag ctcggacaga ggcggagagg ggcgggaagc gcaacaggtc 180

acctggagga agccccatac tgacctcctc atgctgctga cacaggcagg atggcattga 240

actcagggtc acctccagga atcggacctt gctatgagaa ccacgggtat cagtctgagc 300

acatctgtcc tccgagacca ccagtggctc ccaatggcta caacttgtat ccagcccagt 360

actacccatc tccagtgcct cagtatgctc cgaggattac aacgcaagcc tcaacatctg 420

tcatccacac acatcccaag tcctcaggag cactgtgcac ctcaaagtct aagaaatcgc 480

tgtgtttagc cctcgccctg ggcactgtcc tcacgggagc tgctgtggct gctgtcttgc 540

tttggaggtt ctgggacagc aactgttcta cgtctgagat ggagtgtggg tcttcaggca 600

catgcatcag ctcttctctc tggtgtgacg gggtagcaca ttgtcccaac ggagaagatg 660

agaaccgttg tgttcgtctc tacggacaaa gcttcatcct ccaggtttac tcatctcaga 720

ggaaagcctg gtatcccgtg tgccaggatg attggagtga gagctacggg agagcagcat 780

gtaaagacat gggatacaag aacaattttt attctagcca agggatacca gaccagagcg 840

gggcaacgag ctttatgaag ctgaatgtga gctcaggcaa cgttgacctc tataaaaaac 900

tctaccacag tgactcatgt tcatcccgca tggtggtttc tttgcgctgt atagaatgcg 960

gggttcgctc agtgaaacgc cagagcagga ttgtgggtgg attgaatgcc tcaccaggag 1020

actggccctg gcaggtcagc ctgcacgtcc aaggcgtcca cgtctgcgga ggctccatca 1080

tcacccccga gtggattgtg acggccgccc actgtgtgga agaacccctc agcagcccga 1140

ggtactggac ggcatttgcg ggaattctga gacagtctct catgttctat ggaagtagac 1200

accaggtaga aaaagtaatt tcccatccaa attacgactc taagaccaag aataacgaca 1260

ttgctctcat gaagctgcag acacctttgg cttttaatga tctagtgaag ccagtgtgtc 1320

tgccgaaccc aggcatgatg ctagacctag accaggaatg ctggatttcg gggtgggggg 1380

ccacctatga gaaagggaag acctcggacg tgttgaatgc tgccatggta cccttgatcg 1440

agccctccaa atgtaatagt aaatacatat acaacaacct aatcacacca gccatgatct 1500

gtgccggctt cctccagggg tctgtcgact cttgccaggg agacagtgga gggccgctgg 1560

ttactttgaa gaatgggatc tggtggctga ttggggacac gagctggggc tcgggctgtg 1620

ccaaggcact cagacctgga gtatacggga acgtgacggt atttacagat tggatctacc 1680

agcaaatgag ggcgaacagc taatccacgt ggctttgtcc cagacttcct ttgtcttcaa 1740

caaccttctg caagaaaacc aagggcctga attttaactt cctgtgcaca atgtaccttt 1800

tgagatgatt cgaagggcct ttcactttta ttaaacagtg acttgtttga ctgtgctccc 1860

tggtcctgtg agggcttcag tgccccaccc ctgggccact tctgcagctc ccaccagaat 1920

ggatgaccag attctgttgg gtttgggcac atagggccaa aggcagagga gggtggcact 1980

ctcatgttgg aacttctttt gggctcatgc tcaggccttt tttggatcac taaggactat 2040

gacctctgag taacctgatg acctgagaaa gagtaaggag gccaggcagg gccttgggcc 2100

caggaacagg taccttgaga gtgagagcta cccattgcct gtggcctaaa tctgctgtgc 2160

aggttgggct ggtcatactg tcatgatttc attaacagcc tgggtgaaca tggctgggag 2220

taaagggctt gctctcctgc atgttgacat gacggccctt tccaagggtg atggaggctt 2280

tcccaagcta agggcctagg cagatctctc agagcaagaa gctaatgccg gcatgtccct 2340

tgggtgagct ctacatggtg ttattcagtc tggttcttgg ctccccacta ctgtttctct 2400

cagcctctca gagcctgaaa cttacctctt agctttggct acaggcatgg cctagtacct 2460

gatggagcct gtatagctca gctaatcaaa tggaggctca ggtccatcag aatcagggac 2520

ttgtgatttc agtcaccttg cttctgggtt gtgtttcttc tcttactacc tcactgcacc 2580

tggacactag agtggatgaa tgtctggagt tcacctgcat ttggactgtg tgattgtgcc 2640

tcagacacta gacctcttcc agatggttag gttgttctgt agactggcaa tgagattaga 2700

agttcctagc ttcagataaa gatgaaagag aggagatcat tgtcttctgt cttcttctgg 2760

ccctgggttt ataccaggaa agccatgcca gaattaccaa atatgaagta tgaatgtctt 2820

acccacggtg aggctctgcc tccttctctc tgcctggttc ttcagaaggc agtgaatggg 2880

tcataactgg gactccatct ttgctgggga aagtctccca cctagggaat ggttaccact 2940

ccatgtaaag aaaactccct catgcgtcct ctgggacctt cttagatgct gtaaggtacc 3000

tacatacaga ctaaatgtgc aagcaccttg aagtgtgaga acctgtcccc tccttagctc 3060

tccttgtctt tgctgttggt tggttatttc ctgctttgtg tctgttctga gctgtgagat 3120

tccactgtga aatatatgaa taaagtatat aattctttta aaaaaaaaaa aaaaa 3175

<210> 2

<211> 490

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 2

Met Ala Leu Asn Ser Gly Ser Pro Pro Gly Ile Gly Pro Cys Tyr Glu

1 5 10 15

Asn His Gly Tyr Gln Ser Glu His Ile Cys Pro Pro Arg Pro Pro Val

20 25 30

Ala Pro Asn Gly Tyr Asn Leu Tyr Pro Ala Gln Tyr Tyr Pro Ser Pro

35 40 45

Val Pro Gln Tyr Ala Pro Arg Ile Thr Thr Gln Ala Ser Thr Ser Val

50 55 60

Ile His Thr His Pro Lys Ser Ser Gly Ala Leu Cys Thr Ser Lys Ser

65 70 75 80

Lys Lys Ser Leu Cys Leu Ala Leu Ala Leu Gly Thr Val Leu Thr Gly

85 90 95

Ala Ala Val Ala Ala Val Leu Leu Trp Arg Phe Trp Asp Ser Asn Cys

100 105 110

Ser Thr Ser Glu Met Glu Cys Gly Ser Ser Gly Thr Cys Ile Ser Ser

115 120 125

Ser Leu Trp Cys Asp Gly Val Ala His Cys Pro Asn Gly Glu Asp Glu

130 135 140

Asn Arg Cys Val Arg Leu Tyr Gly Gln Ser Phe Ile Leu Gln Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Gln Arg Lys Ala Trp Tyr Pro Val Cys Gln Asp Asp Trp Ser

165 170 175

Glu Ser Tyr Gly Arg Ala Ala Cys Lys Asp Met Gly Tyr Lys Asn Asn

180 185 190

Phe Tyr Ser Ser Gln Gly Ile Pro Asp Gln Ser Gly Ala Thr Ser Phe

195 200 205

Met Lys Leu Asn Val Ser Ser Gly Asn Val Asp Leu Tyr Lys Lys Leu

210 215 220

Tyr His Ser Asp Ser Cys Ser Ser Arg Met Val Val Ser Leu Arg Cys

225 230 235 240

Ile Glu Cys Gly Val Arg Ser Val Lys Arg Gln Ser Arg Ile Val Gly

245 250 255

Gly Leu Asn Ala Ser Pro Gly Asp Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu His

260 265 270

Val Gln Gly Val His Val Cys Gly Gly Ser Ile Ile Thr Pro Glu Trp

275 280 285

Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Glu Pro Leu Ser Ser Pro Arg

290 295 300

Tyr Trp Thr Ala Phe Ala Gly Ile Leu Arg Gln Ser Leu Met Phe Tyr

305 310 315 320

Gly Ser Arg His Gln Val Glu Lys Val Ile Ser His Pro Asn Tyr Asp

325 330 335

Ser Lys Thr Lys Asn Asn Asp Ile Ala Leu Met Lys Leu Gln Thr Pro

340 345 350

Leu Ala Phe Asn Asp Leu Val Lys Pro Val Cys Leu Pro Asn Pro Gly

355 360 365

Met Met Leu Asp Leu Asp Gln Glu Cys Trp Ile Ser Gly Trp Gly Ala

370 375 380

Thr Tyr Glu Lys Gly Lys Thr Ser Asp Val Leu Asn Ala Ala Met Val

385 390 395 400

Pro Leu Ile Glu Pro Ser Lys Cys Asn Ser Lys Tyr Ile Tyr Asn Asn

405 410 415

Leu Ile Thr Pro Ala Met Ile Cys Ala Gly Phe Leu Gln Gly Ser Val

420 425 430

Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Thr Leu Lys Asn

435 440 445

Gly Ile Trp Trp Leu Ile Gly Asp Thr Ser Trp Gly Ser Gly Cys Ala

450 455 460

Lys Ala Leu Arg Pro Gly Val Tyr Gly Asn Val Thr Val Phe Thr Asp

465 470 475 480

Trp Ile Tyr Gln Gln Met Arg Ala Asn Ser

485 490

<210> 3

<211> 3212

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 3

gagtaggcgc gagctaagca ggaggcggag gcggaggcgg agggcgaggg gcggggagcg 60

ccgcctggag cgcggcaggt catattgaac attccagata cctatcatta ctcgatgctg 120

ttgataacag caagatggct ttgaactcag ggtcaccacc agctattgga ccttactatg 180

aaaaccatgg ataccaaccg gaaaacccct atcccgcaca gcccactgtg gtccccactg 240

tctacgaggt gcatccggct cagtactacc cgtcccccgt gccccagtac gccccgaggg 300

tcctgacgca ggcttccaac cccgtcgtct gcacgcagcc caaatcccca tccgggacag 360

tgtgcacctc aaagactaag aaagcactgt gcatcacctt gaccctgggg accttcctcg 420

tgggagctgc gctggccgct ggcctactct ggaagttcat gggcagcaag tgctccaact 480

ctgggataga gtgcgactcc tcaggtacct gcatcaaccc ctctaactgg tgtgatggcg 540

tgtcacactg ccccggcggg gaggacgaga atcggtgtgt tcgcctctac ggaccaaact 600

tcatccttca ggtgtactca tctcagagga agtcctggca ccctgtgtgc caagacgact 660

ggaacgagaa ctacgggcgg gcggcctgca gggacatggg ctataagaat aatttttact 720

ctagccaagg aatagtggat gacagcggat ccaccagctt tatgaaactg aacacaagtg 780

ccggcaatgt cgatatctat aaaaaactgt accacagtga tgcctgttct tcaaaagcag 840

tggtttcttt acgctgtata gcctgcgggg tcaacttgaa ctcaagccgc cagagcagga 900

ttgtgggcgg cgagagcgcg ctcccggggg cctggccctg gcaggtcagc ctgcacgtcc 960

agaacgtcca cgtgtgcgga ggctccatca tcacccccga gtggatcgtg acagccgccc 1020

actgcgtgga aaaacctctt aacaatccat ggcattggac ggcatttgcg gggattttga 1080

gacaatcttt catgttctat ggagccggat accaagtaga aaaagtgatt tctcatccaa 1140

attatgactc caagaccaag aacaatgaca ttgcgctgat gaagctgcag aagcctctga 1200

ctttcaacga cctagtgaaa ccagtgtgtc tgcccaaccc aggcatgatg ctgcagccag 1260

aacagctctg ctggatttcc gggtgggggg ccaccgagga gaaagggaag acctcagaag 1320

tgctgaacgc tgccaaggtg cttctcattg agacacagag atgcaacagc agatatgtct 1380

atgacaacct gatcacacca gccatgatct gtgccggctt cctgcagggg aacgtcgatt 1440

cttgccaggg tgacagtgga gggcctctgg tcacttcgaa gaacaatatc tggtggctga 1500

taggggatac aagctggggt tctggctgtg ccaaagctta cagaccagga gtgtacggga 1560

atgtgatggt attcacggac tggatttatc gacaaatgag ggcagacggc taatccacat 1620

ggtcttcgtc cttgacgtcg ttttacaaga aaacaatggg gctggttttg cttccccgtg 1680

catgatttac tcttagagat gattcagagg tcacttcatt tttattaaac agtgaacttg 1740

tctggctttg gcactctctg ccattctgtg caggctgcag tggctcccct gcccagcctg 1800

ctctccctaa ccccttgtcc gcaaggggtg atggccggct ggttgtgggc actggcggtc 1860

aagtgtggag gagaggggtg gaggctgccc cattgagatc ttcctgctga gtcctttcca 1920

ggggccaatt ttggatgagc atggagctgt cacctctcag ctgctggatg acttgagatg 1980

aaaaaggaga gacatggaaa gggagacagc caggtggcac ctgcagcggc tgccctctgg 2040

ggccacttgg tagtgtcccc agcctacctc tccacaaggg gattttgctg atgggttctt 2100

agagccttag cagccctgga tggtggccag aaataaaggg accagccctt catgggtggt 2160

gacgtggtag tcacttgtaa ggggaacaga aacatttttg ttcttatggg gtgagaatat 2220

agacagtgcc cttggtgcga gggaagcaat tgaaaaggaa cttgccctga gcactcctgg 2280

tgcaggtctc cacctgcaca ttgggtgggg ctcctgggag ggagactcag ccttcctcct 2340

catcctccct gaccctgctc ctagcaccct ggagagtgca catgcccctt ggtcctggca 2400

gggcgccaag tctggcacca tgttggcctc ttcaggcctg ctagtcactg gaaattgagg 2460

tccatggggg aaatcaagga tgctcagttt aaggtacact gtttccatgt tatgtttcta 2520

cacattgcta cctcagtgct cctggaaact tagcttttga tgtctccaag tagtccacct 2580

tcatttaact ctttgaaact gtatcatctt tgccaagtaa gagtggtggc ctatttcagc 2640

tgctttgaca aaatgactgg ctcctgactt aacgttctat aaatgaatgt gctgaagcaa 2700

agtgcccatg gtggcggcga agaagagaaa gatgtgtttt gttttggact ctctgtggtc 2760

ccttccaatg ctgtgggttt ccaaccaggg gaagggtccc ttttgcattg ccaagtgcca 2820

taaccatgag cactactcta ccatggttct gcctcctggc caagcaggct ggtttgcaag 2880

aatgaaatga atgattctac agctaggact taaccttgaa atggaaagtc atgcaatccc 2940

atttgcagga tctgtctgtg cacatgcctc tgtagagagc agcattccca gggaccttgg 3000

aaacagttgg cactgtaagg tgcttgctcc ccaagacaca tcctaaaagg tgttgtaatg 3060

gtgaaaacgt cttccttctt tattgcccct tcttatttat gtgaacaact gtttgtcttt 3120

ttttgtatct tttttaaact gtaaagttca attgtgaaaa tgaatatcat gcaaataaat 3180

tatgcaattt ttttttcaaa gtaaaaaaaa aa 3212

<210> 4

<211> 492

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Ala Leu Asn Ser Gly Ser Pro Pro Ala Ile Gly Pro Tyr Tyr Glu

1 5 10 15

Asn His Gly Tyr Gln Pro Glu Asn Pro Tyr Pro Ala Gln Pro Thr Val

20 25 30

Val Pro Thr Val Tyr Glu Val His Pro Ala Gln Tyr Tyr Pro Ser Pro

35 40 45

Val Pro Gln Tyr Ala Pro Arg Val Leu Thr Gln Ala Ser Asn Pro Val

50 55 60

Val Cys Thr Gln Pro Lys Ser Pro Ser Gly Thr Val Cys Thr Ser Lys

65 70 75 80

Thr Lys Lys Ala Leu Cys Ile Thr Leu Thr Leu Gly Thr Phe Leu Val

85 90 95

Gly Ala Ala Leu Ala Ala Gly Leu Leu Trp Lys Phe Met Gly Ser Lys

100 105 110

Cys Ser Asn Ser Gly Ile Glu Cys Asp Ser Ser Gly Thr Cys Ile Asn

115 120 125

Pro Ser Asn Trp Cys Asp Gly Val Ser His Cys Pro Gly Gly Glu Asp

130 135 140

Glu Asn Arg Cys Val Arg Leu Tyr Gly Pro Asn Phe Ile Leu Gln Val

145 150 155 160

Tyr Ser Ser Gln Arg Lys Ser Trp His Pro Val Cys Gln Asp Asp Trp

165 170 175

Asn Glu Asn Tyr Gly Arg Ala Ala Cys Arg Asp Met Gly Tyr Lys Asn

180 185 190

Asn Phe Tyr Ser Ser Gln Gly Ile Val Asp Asp Ser Gly Ser Thr Ser

195 200 205

Phe Met Lys Leu Asn Thr Ser Ala Gly Asn Val Asp Ile Tyr Lys Lys

210 215 220

Leu Tyr His Ser Asp Ala Cys Ser Ser Lys Ala Val Val Ser Leu Arg

225 230 235 240

Cys Ile Ala Cys Gly Val Asn Leu Asn Ser Ser Arg Gln Ser Arg Ile

245 250 255

Val Gly Gly Glu Ser Ala Leu Pro Gly Ala Trp Pro Trp Gln Val Ser

260 265 270

Leu His Val Gln Asn Val His Val Cys Gly Gly Ser Ile Ile Thr Pro

275 280 285

Glu Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Lys Pro Leu Asn Asn

290 295 300

Pro Trp His Trp Thr Ala Phe Ala Gly Ile Leu Arg Gln Ser Phe Met

305 310 315 320

Phe Tyr Gly Ala Gly Tyr Gln Val Glu Lys Val Ile Ser His Pro Asn

325 330 335

Tyr Asp Ser Lys Thr Lys Asn Asn Asp Ile Ala Leu Met Lys Leu Gln

340 345 350

Lys Pro Leu Thr Phe Asn Asp Leu Val Lys Pro Val Cys Leu Pro Asn

355 360 365

Pro Gly Met Met Leu Gln Pro Glu Gln Leu Cys Trp Ile Ser Gly Trp

370 375 380

Gly Ala Thr Glu Glu Lys Gly Lys Thr Ser Glu Val Leu Asn Ala Ala

385 390 395 400

Lys Val Leu Leu Ile Glu Thr Gln Arg Cys Asn Ser Arg Tyr Val Tyr

405 410 415

Asp Asn Leu Ile Thr Pro Ala Met Ile Cys Ala Gly Phe Leu Gln Gly

420 425 430

Asn Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Thr Ser

435 440 445

Lys Asn Asn Ile Trp Trp Leu Ile Gly Asp Thr Ser Trp Gly Ser Gly

450 455 460

Cys Ala Lys Ala Tyr Arg Pro Gly Val Tyr Gly Asn Val Met Val Phe

465 470 475 480

Thr Asp Trp Ile Tyr Arg Gln Met Arg Ala Asp Gly

485 490

<210> 5

<211> 27947

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантный полинуклеотид

<400> 5

gcagagtcta agaaatcgct gtgtttagcc ctcgccctgg gcactgtcct cacgggagct 60

gctgtggctg ctgtcttgct ttggaagttc agtaagtgca gggagcctcg atcccaccat 120

gtgctcctgc agtccccagt gctctgagcc agaccctgct ctctgggcta ttgagacctc 180

tggaggccct ccgtgaggtt cctctcttac ataacgaggc tgtctctctt cccttctctt 240

gtttagctat gagattgaca catcatgggg aaagcattta gaatgtaccc agtgctttgg 300

ggtgcttggt gccacccagc actgtgagca caggttcttc taccttgggg ccacacccag 360

ttacctgtat ctcactgcac agcagtggct gttggggacc aggcccaccc ctccatgtcc 420

cacctcctgc aactgcagcc tgagccttcc catcagcctg gggtggtgca gacccatgtg 480

ccattgtgga tccttcaagt tacctgtgtg gcagagagga cgtgtgagtg ccgtccaaac 540

ccaaacactg agagggtcct tcccattgcc cccacggaag taaggtgccc cagtgctaat 600

tccacttata cttgctggtg gcaaggacac ttctcctcct tattaaagtg ggggattggc 660

tgggtgaggt ggctcacgcc tgttatccca gcactttaag aggccaaggc aggtggacca 720

cctgaggtca ggagtttgag accacaagcc tggccaacat gttgaaactc catctctact 780

aaaaatacaa aaattagtca ggcgtggtgg cgtgcacctg taatcccagc tacttaggag 840

gctggggcag gaggatcact tgaacccagg agttggaggt tgcagtgagc caagattgtg 900

cccctgcact ccagcctggg tgacagaatg agacttcatc tcaaaaacaa aacaaaacaa 960

aacacagtgg ggccaggagt tggaggctgc agcgagctac agtaatgcca cggtgttcct 1020

cactccatga ggctcattgc gtttctcagc ctgaagggca cctctcttct gttttctctg 1080

caagtgggca gcaagtgctc caactctggg atagagtgcg actcctcagg tacctgcatc 1140

aacccctcta actggtgtga tggcgtgtca cactgccccg gcggggagga cgagaatcgg 1200

tgtggtgagt cagccttgac cttgggaagg gactcctctg ctcaccttgg agacagcagc 1260

cgggtccagg ggcctttggg tgactgggcc tggcgtgcgt ccagtacgct gacacatgat 1320

gtcattgaat ccctgctcca ggctgagccc tggggctcag agaggttgtg tttccggccc 1380

aacctcaccc agcaggtggg agatgacagg gccaccgagg actgtgtcat tggaaccaca 1440

cgtgctctga actgccacag gaagtcagtt aagatgagca aactgtttat aaagttggag 1500

atgcaggcta ggaacggtgg ctcatgcctg taatcccagc actttgggag gccgaggcag 1560

atggatcacc tgaggtcagg agtttgagac cagcctgacc aatatggtga aaccttatct 1620

ccactaaaaa tacaaaaatt agccaagcgc ggtggcgggt gcctgtaatt ccagctattc 1680

aggaggctga ggcaggagaa tcacttgaac ctgggaggcg gaggttgcag tgagctgaga 1740

tcacgccact gcattccagc ctgggagaca gagctggctc aaaaaataaa ttaattaatt 1800

aaaaacaaaa ttggagatgc actatgttat tttcaaaaca agctgccttt aaagatctat 1860

ctgttgtcac agggtgggct catctgtttc attttatttt ctgtggttta tctatttatt 1920

cattttaatg aactaggaag cattgctcct atttatggca taccacatga tgtttggata 1980

cgtgtatgcc tgtggcatgg ctaagtcaag ctagaacatg ggccttacct catatacgtg 2040

tcttattaag aacacataaa acctactctt gtagtgattt tcaaatatgc aacatatagt 2100

ttattaactg cagtcactat gatgtacaat agattgctcg aacttattcc tcctgtctaa 2160

ctaagatttt gtgacctctg accaacatct ccccagtgtt gtcacccccc gcccccagcc 2220

tctgatagct gcctttctac tctctgcttc tgtgagtttg atgtttatac attccacatg 2280

taagtggcct catgcagtgt ttctgtctct gtgtctggct tgttcactta gcgtaatgtc 2340

ctccagcttc atctatgttg ttggaaatga caggatttcc ttctttcttg tggctgaata 2400

gtattgcctt gtgcatatac accacatttt ctttatccct tcattcactg atggactctt 2460

aggttgatgt catgtcttgg ctgttgtgaa aaatgccgca gtgagcgtgg gcgtgcaggt 2520

ccctcttcaa cacacggatt tcctttcctt tggatataaa cccagcagtg agattgctgg 2580

atcacatggc agttctgttt ctcacctttt gaggaaactc catactgttt tccataatgg 2640

ctgtagcaac ttccactccc acccccacgg tgcaaagtct ccatttctct tctacaacct 2700

caccaactcc tgttattttc catctttctg atagtagcca tttgaagagg tatgagatga 2760

tacctcattg tggttttcat ttgcattttt atttgtattt ttcatgaatt tttgagggtg 2820

atttcaaggg tagttagtga ctcgaacagg gaaacgatcc tgagtatgag ggttgtgcta 2880

atcatccccc tcctgccagc tgcgtacgga atggggctct gcagatggca gggagctggc 2940

tcgtttctct ttaagagctg ccttttactt ttcttcctct tcctttaaaa cttatttcct 3000

ggccggacgc agtggctcat gcctgtaatc ccagcacttt gggaggccga ggtgggcgga 3060

tcacgaggtc aggaattcca gaccagcctg gccaacatgg tgaaaccccg tctctactaa 3120

aaatacaaaa attagccaga cgtggtggtg cgggcctata gtcccagcta ctcgggaggc 3180

tgaggcagga gaatcacttg aacctgggag gagggggttg cagtgagccg agattgcgcc 3240

actgcactcc agcctgggcg acagagccag actccatctc aaaaaacaaa aaaaagttat 3300

ttcccaagca cagccatgta ttccaggctt gtggatcagc gttggtggtg gtgtgtgctc 3360

tcatatctta gttccagcta agcacactct gacatgttta cactagaacc atttgttttt 3420

tctagaaata gaaatttcag aattgtagag tcagaggact taccagaaat ctcttaggta 3480

gttctcctcc cctccctcaa gtgcagtcct aacctcctgg agttttctgt agaaaccaca 3540

agcctcagag ctggccgaga attctagcca aagatttttc catgccaaag taatcccccc 3600

tctcctaagg gccatccttg gtggggactg gtttcctgtt aagccctcgc tgtcagtcct 3660

ggctgtggaa tttcctggtg aggagcactg gcccgtggag ctcggccctc gtgccggcct 3720

tgagcaggcc caagtgttcc gtgttcttga tacctttcct ccagcacagt cttgcttccc 3780

agaaaaaggt ttgcacttga aaatgatgca tttgctgatt aaacatagtt cttttgcttt 3840

atttggtttc taaaataaag tgggagtttt tgagattgag taacgtgagg ttaagatagc 3900

acgtggaatg gctttttctt ttctttctat tttttttttt tttttcctgg agacagggtt 3960

tcactctgtt gcccaggctg gagtgcagag gcatgaccat ggctcactgc aacttcgatg 4020

tcctggggtt aagcgatccc ccagcctcag ccccccaagt ggctgggact acaggtgctc 4080

gccaccacac ctggctaatt tttgtatttt ttgtagaaaa tgggtttcat caatgttgtc 4140

cagactggtc tcgaactcct gacctcaagc aattctcctg cctcagcctc ccagactgct 4200

gggattacag gcgtgaacta ccacgcctgg cctggaatgg cttttgatgt tctcctatgt 4260

gcacatgtgg gtgaataaac accaacaaag tccttatgtt acctgaagag ttgctctctt 4320

cttaatattt aagtcgtatt tatttaaata ctttaatagt tgtacactat taaagtatta 4380

ttaggtcaaa atcaaggaag tacaaaaggg tatgctgtga aaaatctctt cttccttgct 4440

ctgcttactt acctaccccg catcccccca tacaccccag acacacacac acacacacac 4500

acacacacac acacacgcat cactcccata catgcccacc tgtttaccag ccaatcacat 4560

ttcttggggc aactcatctg agttgcttct ctttccagag agtttttgca taaagaagca 4620

caggtatttc tgcgttacca tgaccctatt tcccagtggt tcctagccag ttgactctcc 4680

tgcactggat accatcctgg acagcattcc ttagggaaat gagccccctg ttttttccca 4740

ccatggcaca gttggtcctt tgcatggacg caccattatt gcccctgtct cttcttggtg 4800

gaccttaagg ttttctccat ccttttgctg taacacacac tgctccaagt gtgtgagcat 4860

atcagtagga aacgcttcca ggagtagaac tgctaggtca gagggcgtgt ggatctgtaa 4920

cctgacagac ctagaccggc ttcagtttgg ttttatccag tttccatatt gattattcat 4980

ataaaaggaa acagacaaac ataacgctgt gcatgtattc tctcttagac cagaacaggc 5040

atagggtgca cttttaattt gtccatttcg tagagtagaa attgtttttg ctgaaatgaa 5100

caccttagga tgctgaagaa tatgacccgt cccatggaaa acattcaaaa atgtgtgtag 5160

cgctttcttc ccaagggtgt gtgtgcgcat attttaacac taattcactt tctacttccg 5220

ttgctatcct ttctgtgagt ctttctcaga atctcagaaa agaaactaaa ttgttcactc 5280

tagttatcaa tgctgtactc tatacctgga atttgctaaa agggcagatt ttaagtattc 5340

tcaccacaga aaagagaaaa gaaaatggta attatgtgac gtggtggaca tgttaactag 5400

ctttattatg gtgagcattt cacagcggat atccagtcat cacgctgtac acattaaaca 5460

tgtacaattg ggtttttttg agacaaggtc tccttctgtc acccagtctg gagtgcagtg 5520

gctcagtcat ggctcattgc agcctcgacc tcctgggctc aatccatcct tccccctcag 5580

cctcctgaaa agctggggcc acaggcatgt accatcatgc caggctaatg catatatatt 5640

tatatttttt ggtggagatg gggttggtct cgaactctgg gctcaagtga tcctcccgcc 5700

ttgcccttcc aaagtgctga gattacaggc atgaaccaca gcaccaggcc tacatgtaaa 5760

atttttattt gtcaactata ctttgacaaa gctgagaaaa aaaatcctaa tatttaaaaa 5820

aaaaaaaaaa aggactagct tgagaccttt tccagctctc tggcttatca gctgccgtct 5880

cttccgggtg cagatagctg gaagggaaag aaaatcccta aaattaccca caagccaaga 5940

atgaagtgtc tccctttgag ccacagtggc agttttgttt ttaatcatag aagtgtattt 6000

tgagccgggt gtgctggctc acgcctgtaa tccccgcact ttgggaggcc gaggtggggg 6060

gcggaggggg tggggatcgc ctgaggtcag gagttcgaga ccagcctgac caacatggag 6120

aaaccccgtc tctactaaaa atacaaaatt agccggcgtg gtggtgcatg cctgtaatcc 6180

cagctactca tgaggctgag tcaggagaat ctcttgaacc caggaggtgg aggttgcggt 6240

gagctgagat catgccattg cactccagcc tgggaacaag aaaaaaaaag aagaagaaga 6300

agaagtgtat tcatttcagt tacttttaaa aaagtgaaca gactttatat tttagagcgg 6360

ttttaggttt acagaaaatg aaacagacag ggcagcgagc tccttgtact cctccccagc 6420

acacagttgc cctgttatga acatcccaca tcagtgctgt gcgttcatta acaccgatga 6480

acctgatgca tacattatga tgaactgaag tcctggactt caccctttct cttgtacagt 6540

tctgtgggat ttgacaaatg cataatgctg tacagccaca atgatagtat cgtccagagt 6600

agttctcctg ccttaaaacc tcttttgctg cacctgtttc tctctcccca ctcaccccag 6660

ctatctgatc ttcttagtgc ctccgaagtt ttggtctttt caggatgttg tagcgttgga 6720

atcatggagt atgtagcctt caccacatac accttccttc actttgttgg cttcctttac 6780

ttagtaatat gcattcaagt ttcctccatg ccttttcatg gcttgatagc tcatttcttt 6840

ttagcaccaa ataatattcc gttgtccaga tgtagcacaa tgtttatcca ttcatgtaac 6900

ctgtgaccga ctcacagata ggatgtggaa tcactcacca cagaggcatt agacaataat 6960

cagacccaag tcatttcatg ggggaacaag cccacaggta ccagactgtc cagtgagtca 7020

gggccactcg taggaagtaa gaagagaggc tagagcatag ccaggtcctc actttatact 7080

ttaagcccat gtgtatttct cccaaaccac acagcattgt ttccatgctt tcagctttgc 7140

atgaataacg tgatacttga acgcatcatt tatcacttgc tctctttccc acagcgctgt 7200

tttcaagctt cttcctgttc atgatgctct gcttaaccct taagctgcat gggattctgt 7260

tctgtgaata cgcccacccc atgtattatc ctgcccagca aaaagtcccc aaaactctgg 7320

atggtggtta cctctaggga gggagagaag agattgggaa tagggagcga cttcaacggt 7380

gtttgtaatg ttttgtttct ttaaataaaa gagctgagat catttcagca gaatgttgat 7440

ttagagtctc ctggacaatt tgttgctcaa agtgctctct taaagagcac tttaaaaaaa 7500

aaaacctttt atcttattat ttatttattt atttattgag acggagtttt gctctgtcac 7560

ccaggctgga gtggagtggt gtgatctcag ctcactgcaa cctttacctc ctgggttcaa 7620

gcaattcccc tgcctcagcc tcccaagtag gtgggattac agatgcgtgc caccacactt 7680

ggctaatttt tgcattttag tagagatcgg tttctccatg ttggccaggc tgatctcaaa 7740

cgcctgacct caggtgatct gcccgccttg gcctcccaaa gtgctggtat tacaggcgtg 7800

agctaccatg cctggcttat cttatatatt tttaaaaaca gcttattgag atctaattta 7860

tgtaccataa aattcaagta tataattcag tgcttttata tataaaacat atatatgaaa 7920

tagcttattg agatataatt ttttatataa aacagcttat tgatatgtaa tgtatgtacc 7980

ataaaattta aatatataat tcactggctt ttatatattc acgaatatgt gcaactatca 8040

ccacagtcaa ttttagcata ttttcatcag ctcataaaga aaccccaagc ccttgaacta 8100

tcaccccata tccctcctcc cagcccgtcc ctcctactca taagcaacca ctaatctact 8160

tagtgtctat agatttccta ctctaggcat tccatgtgag cgggatcatg caatacgtgg 8220

gctcacacaa tataagtggc attccatgtg agtcggctca tgcagtatgt ccggctcctt 8280

tcactgagca taaggtcttc agcactcatc caggttgcag cctgtgtctg aatttcattc 8340

cctcttctgg ctgaatcgta ttccattgtg tatcttggac atatcctatt ctgctcaccc 8400

agccgttggt gggcgtttgg agtgttttcg cctttcagct gttttaagag ggttgcagtg 8460

aacatttgta caagttttgg acccaatgcc tgttttcaat tctcttgtgt agagagcact 8520

ttttagcaga aaaagaatag atttgtggcc tccctttgtg tgcggtcagt gccttgagaa 8580

gagtgaactg tgctgccacc tccggagccg tggagagcgc ggggcttggg tagcagctag 8640

gacgatacaa gttgggacaa ggccaggtgc aatggctcac gcctgtaatt ccaacacttt 8700

gggagaccga ggcaggggga tcacctgagg tcaggagttc aagaccagcc tggccaacat 8760

ggtgaaaccc catctctaat aaaacagaaa aattaactgg acggggtggt ggacgcctgt 8820

aatcccagct actcgggagg ctgaggcagg agaatcactt gaacctggga ggcggaggct 8880

gcagtgagtg gagatcagac cactgcactt cagcctaggt gacagagcga gactccgtct 8940

caaaaaaaag aaaaaaaaag aaagaaactc atggataatc ctccctctcg tgcagttcgc 9000

ctctacggac caaacttcat ccttcaggtg tactcatctc agaggaagtc ctggcaccct 9060

gtgtgccaag acgactggaa cgagaactac gggcgggcgg cctgcaggga catgggctat 9120

aagtgagtat ggggcagcac ccgccgagtg acagtaacag acagcagaaa cacgagaaga 9180

ccctctctct gcctccctgt gaaagcaccg gcacatgagt gctggggaca attgtcacct 9240

tccaaaagct gagccctata accagcaggt ggaatttgtc ctgctagggc tgtgcccagc 9300

acacagacct tggctcactg ccaccttgcc ctgcctcctc cttggcctct atagactcct 9360

ggttgctcgg gagtgcccag tgctgtggtc atctggtcag aggggtaggc tgagggcgtt 9420

aggtgcctct ttttccaagg tgcctctcag ccagggtcca ttcacctccc tgggtagagg 9480

ttggaccaga acagctggcg aggagggttg ggctggggag agcagcagag acaaatcctg 9540

tgccagtttc acttcattcg ggagccatgg aagccttttg agctggggag agaatcaatc 9600

aatcagactg atacttaaaa aatgtcattc ctgctcgtag ctctgaggga aggtgggaag 9660

gcttaacagg gtgtgtgtcg cctgacagtg attcctaacg ggggtggggc ggtggttacc 9720

atttaccagc actgcctggg gagatgcggc agccctcagg catcggggga gagggtggta 9780

ggatgctact gccactttgt tttccatggg agggtcccca ggtgatttct atgcaacttt 9840

agggtattca atatgccagt tttcagaatg aattaccact cggtgagaaa gttggcatct 9900

tagctagtca ctgtgacatc cctaaacagc aggggtgaat tacacagcaa agccccccca 9960

tcacagtcca ggaacctggt ggaattgata actggggcca tgttaacatc tgtacctttt 10020

attagattaa atgtgtgtat gattatacaa tcctatgtcc ttctcatagt ttcttgatcc 10080

taacctggat aagaaacacg accaatgaag gaattttgtc tgacacttta gggttattga 10140

atcgaaaaat cgttacaata ttctagcact tggttagaac gtgtgatttt ttttcctaaa 10200

tgctaaggtt tttccctctt attctgaatg tcgtatgagc ggtattatga catagtatag 10260

gatttgtgtt tgcttatgcc ttaaccatta tcacaaataa ggttttcttt tttaggaata 10320

atttttactc tagccaagga atagtggatg acagcggatc caccagcttt atgaaactga 10380

acacaagtgc cggcaatgtc gatatctata aaaaactgta ccacaggtat gcagcaattt 10440

cttcttgaaa aattttggaa tgaaatcaac taggagacac catggggaat cgttgtcctg 10500

agtctgattt ctctgagctg caatactcgg tctggatggg ttttgcattg ggaggagatt 10560

agagtctgac caggcctggt tactctaagc agcccttggt ttattcatag gaagtggctg 10620

aggtttctct gctatttcat tttcagcctc taccgtctgc ccttgttggt agcggctcac 10680

acttgcaaca tcgacattca actctattta gttttctttc ctcttcagac atttagaggt 10740

gtacctattt tgtcagggcg tggttctagg aatccaagat aatgtctcag tgtcccagcc 10800

agggtgaccg gctcattcca gtttgccagg gacttcactg gcttgagcaa gggaagtcct 10860

gctccattcc aggcagctgg gctggctggt cccgttagcc ccaaccccgg gacagcagtg 10920

ccagagggtg ctctgtgagg gatgggcagc attctggcgg cctgggaatg agttgtggtg 10980

tttccagggg gtagaagtgg gtacaagcca caggtcacat gatgagtggc tgacctggct 11040

gggagggcag aagaggggat ggacttaggc tcttcctttt gctttgcaca tatttaggat 11100

gtttgcagac ttgctatgat tgttgctgtt atgtgttttc tgatgtgaaa gatacacagt 11160

gtcctttgcc catgagctct ccttgcctcc caggtcccca gggcttatgc ctggtgtcta 11220

ggcatcacct ccctgcctgc caggtgccag gtgctgcatt tcgggggagg atgaactaat 11280

caccccgcgc cacctttcct ctgagtggga gcctggggca ggtttgcatt cctggaggcc 11340

gctggtggag gggtctgggg gcctgacttc cactgcagcc tgctgtcctg gggaatgtgg 11400

cagggcaagc ccagtgggga gggctgtgca cggccaggtg cacccatcaa aacagcaggg 11460

ctgcggtttg tccctgtgga gaagctaaac acagctgcct gggcactttg taaatgctga 11520

gtggttcttt gtctttctgg gttacacacg gaatcaggga gccaagtcca gccgggcagg 11580

gacgggggga ggggaggagg tgctgccgtc ccttggcaag agccttggga actcacaagg 11640

aggctggagg gcttggaaga aagaagagaa ggccattgtc tggtaggctc tattctatct 11700

cggtggtggt ggtgggggga ggcgcacttc ttttcctctt tctgtgcagc agttgccctt 11760

tgatgcctga gttcttggct tgttttctgt cgggcttctg tgaataacca catgtgccct 11820

ggcgctgtga ccacacaggg ctatccctac cgaccttagg attcttagga aatgtcttct 11880

cttaaagggg acatgtcttc acttggccgt gtcagtgccc cagagccaga gtccacctgg 11940

aatgcacctg tagtcactga gaacccgggg ggtgtgcctt agtaagaagg tgtcaggaag 12000

gacctattat tgtagggcct gggctcctgc aaggtggttt gggggtggtt ggaggaagca 12060

gagatttgct ctggattgga tgctgtcagg aagcaggggt aattctgtga ggctgcttta 12120

ttattttttt tctaggagga ggttggaatg aggctaggct aaagctgtga ttggtaaaga 12180

aacgtccgtc gctcaagtta gccaggacag gaggagacat cagatcgtga ttttgtggtt 12240

gtgagcacaa ggttcctgtt ctgtctgttc agacatcatt tcggaggagg ctccttgtgt 12300

cttgccccat ctcaggcatg gaggggccta gtccgatatt gacgctcagt gaaataattc 12360

aggttccgca gagcacacgg cccagctatc agggcgggcc agctctgcat gccaggggcc 12420

gcgtcttccc ttctcagcat agcctgggaa attcactgca ggacaaaatg catcagttac 12480

ttcctcttca tccataacct gggatgtttg actcccaaat gagtaactct tacgtttctt 12540

ctaatcctag ggaaactatt ggttatattg ctttcaacac tacaaattta aagcagttat 12600

aggagcccag aggtttccaa atggcttcct taaaaattag aagatgattt taaattccaa 12660

gaggaaaaac aaaactagca ttattgtata cttaccctca caaccgtcct aggagctggt 12720

acaattttaa gagaggttaa gtaacttgcc caaggtcaca ctgtggggat gtgagccgcg 12780

taccttggct cagtgtctgg tctttgccac tgtccctata tggatttact taccttattg 12840

gagttgtaac tagcagaccc ttctatgtct cagaagacag gagagggaac atcggaagaa 12900

atgactgatt tctaagcatg tgagaggcag gtgactccgc actatcgtga ccagaatttc 12960

ccctgttctt tttgcagtga tgcctgttct tcaaaagcag tggtttcttt acgctgtata 13020

ggtaagttca tctggagtcc cccttttgat acttctaact aggaaaagct ctctactttc 13080

agaacagtac tccctgtgtc tctgggggcg tgggagggaa gaaggtgggg tcacgggttg 13140

gaatgtgccc agcggcgtct cgctctttcc aaggagctcc tggtttagat ttccatggcc 13200

tgtagacacc ttcagccttg ggtccaaggg acaccccctg agatcaggca cgctcaagaa 13260

gctgacaaag ccctacactt tatgccaccc atgagctgga ggcccggcag gtctctttct 13320

ccagaaagca aaggggggtg gcgttagtga gccctggcag ccacctaacg tggacttgga 13380

gcatctgcgg ggctgtggtc cagcaccacc gtgtggccac caggtgctca tcagccagtg 13440

ggacccggga ggagggacaa gaccagagaa caacagtgct cttgcctctt ctctcctgaa 13500

ttttggacgg tggcttagac ttgggtgtcc ccatctctgt gtttagagtg cttacagttt 13560

ccaaactgtt tgcaaatgtg gaagccaccg tccctctcct ctgggatggc ccagtgctgt 13620

cgtggggccg tggtcctgag ctcagctttt catttgaaga ggtggaagga gctgacaccg 13680

tcccatcccg gcagggctgg ctcaggtctt ctttaggtcc tgagtggggg tccagcacag 13740

ccccaagggt gcgtggcacc cgccctgccc tctgcccatg cactcatctc ctggtggaga 13800

agacactcac acacaggaag cagggaaggc agcagacctc actcacccct caccccctca 13860

ctcaccccct actcaccccc tcaacctctc attcaccacc caccccctcg ccccctcact 13920

caccccctca ctccctcaac cctcactcac ctcctcactc cctcaaccct cactcacctc 13980

ctcacctcct cactctcccc ctcatccctc cctcacccca ccccgtcacc tcctcactca 14040

cctcctcacc ccctcactca cccttcaccc cctcactcac cacctcacct cctcactcac 14100

cccctactca acccctcatt cacccctcac cccctcactc acccctgcac cccctcactc 14160

accccttcat ccactcaccc acctgctcac ctcctcactc aacccctcac cccctcacta 14220

atccctcact ccctcacccc ctcacgccct cactcacacc ttcacctcct cactcacccc 14280

ctcaccccct caacccctta cttaccccct cactcatccc ttcacccctc actcaccccc 14340

tctctcaccc attcaccccc tcactcatgc cttcaccccc tcactcacct cctcactcac 14400

accttcaccc ctcagtcacc ccctcactca ccccttcacc ccctcaatca tgccttcact 14460

ccctcactca ccccttcacc ctctgaatta ctccctcatc ccctcactca ccccctcact 14520

caccccttca ccccctcacc caccacctca cccacccctc acccaccccc tcacctcctt 14580

acccctcacc cccctcactc acccctcacc ccctcactca ccacctcacc cacccctcac 14640

ccaccccctc actcactccc tcatcccctc actcaccccc tcaccccctc actcaccccc 14700

tcacccaccc ctcacccacc ccctcacccc ctcactcacc ccttcacccc ctcactcacc 14760

ccctcactca ccccttcacc ccctcactca ccacctcacc cacccctcac ccaccccctc 14820

actcactccc tcaccccctc actcaccccc tcaccccctc actcaccccc tcatctcctc 14880

actcaccccc tcacctcctc actcacccgc tcacctcctc actcaccccc tcgccccctc 14940

actcacccct caccccctca ccccctcact cacccctcac cccctcgccc cctcactcac 15000

cccctcgccc cctcactcac ccctcacccc ctcaccccct cactcatccc ctcacctcct 15060

cactcacccc ctcacctcct cactcacccc ctcacctcct cactcacccc ctcacctcct 15120

cacccacccc ctcactcact ccctcacccc ctcaccccct cactcacccc ctcacctcct 15180

cactcacccc ctcacctcct cacccacccc ctcactcact ccctcacccc ctcaccccct 15240

cactcacccc ctcacctcct cactcacccc ctcacctcct cactcacccc ctcacctcct 15300

cactcatgcc ctcaccccct cactcaccct ttcacctcct tgctcatccc ctcacttacc 15360

ccctcacttc gtcaatcacc cccccacctc gtcaatcacc ccctcacctt ttcactcacc 15420

ccctcactca cccccttact tcctcactta cctcctcacc ccccactcac cccctcaccc 15480

cccactcacc ccctcacccc acactcaccc cctcaccccc cactcacccc ctcacccctc 15540

tcacctcctc actcaccccc tcacctcctc acttatcccc tcaccccctc aattaccccc 15600

tcaccccctc aattactccc tcatcctttc aattacccac tcaccccctc acctcctcac 15660

tcctcactca ctccctcact caccccttca ccttctcact cacctcctcg tctcctcacc 15720

ccctcactca cttccagccc tgcccctccc atcttccttt tctttgtgtg agaatctggg 15780

gtccctgagt ggtgtcagtc cctccaagac tcaaggagtc cccagggcct tgttatccag 15840

aacaccccca cctgggtccc gggagacccc atgggatcac aggagtgttc agggaagtgg 15900

tgcttcctgg gtctgggtgg gctggagggg catcctccct tccccaagag gagaccccca 15960

ggagccccct aagtccatcc ccagcagtgg tgcccctgcc ctgtccttgc agcctgggag 16020

acccttggga ggggcgggcg ctgggtggct gggcggcttc tgctggtctc accccactgg 16080

cctcctgttt gtcatcctca gcctgcgggg tcaacttgaa ctcaagccgc cagagcagga 16140

ttgtgggcgg cgagagcgcg ctcccggggg cctggccctg gcaggtcagc ctgcacgtcc 16200

agaacgtcca cgtgtgcgga ggctccatca tcacccccga gtggatcgtg acagccgccc 16260

actgcgtgga aaagtatgcc aggggcggcg cgggccgggt gggggctcag ggctggccta 16320

cagccaccct gtgaccttga gcaggtctca acccttgcag ccccggcatc cttgtgttta 16380

aatggggaga gtattgcacc tgcttcctag ggctgtgaga catcaagtgc gctcatgcca 16440

ggcagtgcat ggctgtatgc actgagtgtc ccctgcacgc agggcacagg gtgcaggtgg 16500

aacattctcc acgatgtcgc cgtgaccagc gttccttcca gccactgtcc tctgagctct 16560

gtcctgccct tgagcaaagc ccctgccccc tgaggtatcc tgtctccggg acgctagtcc 16620

caggagaggg cacactcaga caggcttcag gctgccctgc tggaaggtcc ctggggttaa 16680

gcgttcttgg ccacagcatt gctcatgcag agggttaggt aggggtgagg ctagccgtga 16740

cagtattagc atttatggac gctaccaccc cctccccttt tccttaaaca catagtgctt 16800

ttggtcacat gctgctttgg aggaggcctc acttggcgga tgtatttttc tgccttagag 16860

agaggctgaa ctgggtttga ctgttggccc agccctctct tgctgcgtgc ccttagacga 16920

ttcactcaac gtctctgatc catggcatgt acaactataa gatgggcatg cccttctcct 16980

ctcgggctgt tatgaaggtc aaggaagcaa gggctgttac ccaagggtgc tcccttctct 17040

ccccctcttc acacccccag gtgctctggg ccctctagga actgggtttc tctcaagggc 17100

tgttacccaa gggtgctccc ttctctcccc ctcttcacac cactgggtgc tctgggccca 17160

ctaggagctg ggattctctt aagagggaaa ctcttggata aaggaaatgg tttgattgat 17220

atcggacaag tctgttcatt agtatccatt tattaagcac ctaccatgtg ccaggaaatg 17280

ctttggcgta caaaggaaaa taagggccag tcctgctaga aatggccttg aaaccccagg 17340

gagggatgtc ggcccattgt gggtgctgca gattccttga aggtgatgca agagccagaa 17400

agaaggatga tgtggggggc tgaggcaggg agtcggggtt gggggagtgt gggggagaag 17460

gggagaccga gcacctcttc cactatctcc ctgtgtggtt tttggtgaac catcctgcct 17520

ctgggtgtct tgcctccagc ttctgacgtt ggaagttcat ccactgagag ctctgtgttt 17580

atggctctga gatactgagt ccttcttctc tcccagacct cttaacaatc catggcattg 17640

gacggcattt gcggggattt tgagacaatc tttcatgttc tatggagccg gataccaagt 17700

agaaaaagtg atttctcatc caaattatga ctccaagacc aagaacaatg acattgcgct 17760

gatgaagctg cagaagcctc tgactttcaa cggtacgtgt ggctcaggct tggcaagcag 17820

gttggcagaa tcttaaagag atgttgattg gaaatgacac ttgtgctatg ccaaatggaa 17880

gggaggcatt tgcgttgagc gagggtagcg tgcagcgggt ggccaatggg agaggctcac 17940

agaggctaag agcacctgcc gcattttggg ggaggcagca gccaccacat ctgttctgta 18000

ctgtactgag tggtggtgat tcaagccagg catggaaaag gctagaacag ggctttccca 18060

ctgcagcacc cttgacatct gggtggttct ctgttgtagg gctctcttgt gccttgtagg 18120

atgtttaaca gcgtccccag cctctaccca ctggaggcca gtagctacca agctgtgaca 18180

accagtgttg cctgctgaca ttgccaaaca tccgctttga ggcaaagtca cttccagttg 18240

agaactactg gcctaaaatg tgtaaagatc cttgattttt aaagatacat tctaaaacca 18300

agttgcttaa ttcaggacaa acatgctttc tcttagcctc ttattcggtc ccactctggt 18360

ccatccaagg gtctggaatg ttctagcccc atgtggatac agaagaagca aaacctcagc 18420

cctccctaca gcatgtctgt attcacattg ggaaatggtt cacatataga agagcgaatg 18480

cctgagcaat ggcgtggtgc ctctggggcg aaagctgact ccattgactc catcggcttt 18540

ttggctgttg cctcctgtgt gtctttcccg tcttgatcac ctggagatat gtaattttgg 18600

aagcagagct agcaaataat tcctcttata agcagagcta gcaaataatt ctacttataa 18660

gtagcataac gtcttgcctg ccagaaggag aggtctggca gggggagaaa gtgagaatgt 18720

gggacttgtt gggatgcagg gtcctctggg cagggtggcc agggtgccag gcccagcagc 18780

ctgcatgtgg gaaggccagg tggagacata ggtgataccc gcctggctca ctgtgttttc 18840

tcttcttgaa acagacctag tgaaaccagt gtgtctgccc aacccaggca tgatgctgca 18900

gccagaacag ctctgctgga tttccgggtg gggggccacc gaggagaaag gtgaggctgc 18960

tcctgggcac acaggactgc agggcccaca gatggagcat tgggttcgga agtgggaggt 19020

ccaggtttta atcccagttc tactactcaa tgactggatg actttggttg attcccccag 19080

tccttgtgcc tcagtttctc catctgctaa gtgggagaaa tcctgcccag cctacctaat 19140

acactgtgtt cttatcgtga tcacacagag cagcatgtgg aatggctttt gaagtatctg 19200

ggccatacga gtttagaggt gcaggatctc ctgtgttgca ctcattgtga gtttagagct 19260

gccctggaga tcccaccaag gcctgcgtgg ctgagtgaca gggggcttgg tgaggacggg 19320

catcctggac ccatggtggc cacatctaag cctgtcctct gccctgataa ccacagagag 19380

aggctctctc cacccacttc ctttgcaatc tgcatttctc tctgacagtc tttcaaatga 19440

agggagcctg gctgcttcat ttttatggag ggttggaagt gcttagtggc aggcacaaag 19500

gttcatttta catattgttt atatccttct caaaagcgtc taggccatac agacaacaaa 19560

tcctttcaaa caaggggaaa agtacaaagg ttgggtgatt tctggggagc gtcagggaag 19620

gtagtggggg gcatcctggc tcctcatcag cagaaactta ctacagtaga gccacaggct 19680

gggcaaaaga cctcatggaa tccaagatga agggaatatc gacaaatatt tgtgcgcacc 19740

tgcacctagt acaggctggg tgctactcag gtgctgggaa tgcagaagtg aacagagtaa 19800

gacaaatgtc tctgctgtca ggagctttac ctctcttctg gatgtcggtg gtggggacgg 19860

ggcaggtgtg gtcagacaga tgggagacaa acaactgagc gaggtacttc caaacatctg 19920

agggtgggga tcacaaggtc ccggctattt tgaaggggtg gtcaggaaag gcttctcgga 19980

agaggtggca tttgagctga gactcaaatg gcaaaaatgt gtacacatca aaaaggctag 20040

tgcatgtatc ttcaggtgtg gtcaaggggc caaggaggtg ggctggggcc agattgcata 20100

ggtccttgtg gattatggtg aagacaccag cttctcatct gcttgaggtg gggagatcgt 20160

gagccgggga gtgccatgat ctggcagctg cgtggggagt ggggatgaat ggatggagac 20220

gaggatgatg gtgacaagtc cattgctgtg gttccttgag acaggaagcc agctcatagc 20280

agagtgcggg cgtggatgtg aagagatgag ggtacactag ggctagagcc accagactta 20340

ctgatgggtt gcatgtctgt gggagagaga gtgagaagtc agggacgatg gctttccact 20400

ctgtggctga agccccaggg tggcgggtgg tgccattttt caagccagga aatattggtt 20460

ggtgagaatt tggggtggga gaaggtgtga cggagggttc tggttttgca cactaagccc 20520

acggtgccca gaagatgccc gaggggaggc agcaaagcga gagtgggaaa tgcagaggtg 20580

gcaagtgcag gccgtgtctt gagaagctct aatgtgcagg ggagccgaga agcaggcggc 20640

ctagggaggg tcacgtgtgc tccagaagag tgtgtgcatg ccagagggga aacaggcgcc 20700

tgtgtgtcct gggtggggtt cagtgaggag tgggaaattg gttcagcaga accaagccgt 20760

tgggtgaata agagggggat tccatggcac tgatagagcc ctatagtttc agagctggga 20820

atttctttcc ctgaagctga actccagagc tgcattcagc acaggcaccg ccagttgtaa 20880

ggagaatcca ggtttcccag gagaggggtt ggtgctggga tgagctgacc ggggcagggc 20940

tggaaaatag ggctgtgacc atctgtgtag tgcgtgtgga ggtctcaggg agggaagtgt 21000

gctctccctg cgagagctgc aggcaacact gggagctcaa caagtctccc tgtccttagg 21060

gaagacctca gaagtgctga acgctgccaa ggtgcttctc attgagacac agagatgcaa 21120

cagcagatat gtctatgaca acctgatcac accagccatg atctgtgccg gcttcctgca 21180

ggggaacgtc gattcttgcc aggtaattca acatttttat tctacctttg gtccttacca 21240

gatcctactg aaccccccat gagagagagg gcattcttgg ggtcagcaga gcctcctcag 21300

tgacacggag ccagctcggg gcagtcatgg gaagtgacgg ccacaaacag tgcgaacgct 21360

tctggtggca gaaggaagta cagtcaacaa atcacacaca ccctctgaaa aaccggtatt 21420

tggtaaaagt gccagtggaa cagaaacaag tatttagact attttaaatt atgaacggca 21480

atttatttag taacttttag cttgaacaga ttaaaattca ggatgggggc tatctctttg 21540

ggggttacat ctctgttacc atcacccctt gatggtggag attcgaagcc cacacagtca 21600

ctcgtaactc acactgcgac ccccgccccc caactcctct aggcctggtc agtggtgtgc 21660

ggcagattgt gacttgattt tctgctctct gtaccttgct gtgtcccaca gggtgacagt 21720

ggagggcctc tggtcacttc gaagaacaat atctggtggc tgatagggga tacaagctgg 21780

ggttctggct gtgccaaagc ttacagacca ggagtgtacg ggaatgtgat ggtattcacg 21840

gactggattt atcgacaaat gagggtaact atcctgtcct ccttctgact gtgttctccg 21900

attcctcgag ccaaagccag acatctgtta ggcgtggttc tgctgctgga agctgactgg 21960

tgaccactgg tcagcatgaa gcaaactctg cttcctccag ccacagcccc atccccccag 22020

tgtccaccca ttgcccattg cctctcactg gcttcacttg catatttccc ctggtgtttg 22080

gatgaaaagc gctggggctc agcttgtgtg aaattccttg gtgctctgcc aaccacactt 22140

cgttctggct cagctgactc agctgttcca cccaggccac ctcacatcaa actttttttt 22200

tttttttttg agatggagtc tcactgtgtc gcccaggctg gagtgcagtg gcacaatctc 22260

gactcactgc aacctttgcc tcctgggttc aagtgattct cctgcctcag cctcccaagt 22320

agctgggact acaggcatgc gccaccacgc ccagctactt tttgtatttt tagtagagat 22380

ggggtttctc catgttggcc aggctggtct cgaagccctg acctcaggtg attcacccac 22440

ctcagcctcc cacagtgctg ggattacaag tgtgaaccac ggtgcccggc ctcacatgaa 22500

acttttgatt tatagagagc agagggaaga gccggctgtg cccatccttt tctggggcca 22560

tcgagtggct cctgggcagc ccccaaggtt aggaagggca ggagcagcca gggttctctg 22620

atgccccaga ctcaagcacg agggaaggtc tcaggggttc catgtgagcc tcatggatgt 22680

ctctgcttag cagagccctg gctttgggca ttgtccagat agggggtgag aaccagatct 22740

tctcatctcc aggacctcag acgtatagtt ttctcagatt tctgtgcttt ctggggctgg 22800

gctactagtg gaagaaagca gtctattctg tcttctccca aatctcccag atgcccagtc 22860

tgttgaagga ggagcagaac cagggggcct ttcccgctga ggcccgacct gtgtctcctt 22920

caaatgacac gcgggactca gggccttccc atgaccatgg ggcccagggg gcgtcacctg 22980

gcccagggcc cagtgctaga aacagatgac cccaggagga ggaggcaggg caggagggaa 23040

gctggcaggg ctgggatggt cagccaggct gaggggcgga ctcgcaccag gatggagcta 23100

ggaaatgatc caggtgtgtt tggcggctgc aggtgggtcc gcatggctgt gcagggaggg 23160

aagggctgcg tggcaggaga gcagccgggg gaggcccaga ctctgctgaa gagatgcctg 23220

ttgtgccggc ctccacatcc gctgcccgct ccttccggag ctcctgcccc gccatgctca 23280

gcctgactct gaccaacacg ttggagagaa gaatgatccc tttgtgctat taagcttgct 23340

tatttggttt ctaagtgctt catgcgaacc tagaggaaaa aattattttc cacctttgtt 23400

tgtcttaaga aaataacaca cttttttttt tcctatttga acaggcagac ggctaatcca 23460

catggtcttc gtccttgacg tcgttttaca agaaaacaat ggggctggtt ttgcttcccc 23520

gtgcatgatt tactcttaga gatgattcag aggtcacttc atttttatta aacagtgaac 23580

ttgtctggct ttggcactct ctgccattct gtgcaggctg cagtggctcc cctgcccagc 23640

ctgctctccc taaccccttg tccgcaaggg gtgatggccg gctggttgtg ggcactggcg 23700

gtcaagtgtg gaggagaggg gtggaggctg ccccattgag atcttcctgc tgagtccttt 23760

ccaggggcca attttggatg agcatggagc tgtcacctct cagctgctgg atgacttgag 23820

atgaaaaagg agagacatgg aaagggagac agccaggtgg cacctgcagc ggctgccctc 23880

tggggccact tggtagtgtc cccagcctac ctctccacaa ggggattttg ctgatgggtt 23940

cttagagcct tagcagccct ggatggtggc cagaaataaa gggaccagcc cttcatgggt 24000

ggtgacgtgg tagtcacttg taaggggaac agaaacattt ttgttcttat ggggtgagaa 24060

tatagacagt gcccttggtg cgagggaagc aattgaaaag gaacttgccc tgagcactcc 24120

tggtgcaggt ctccacctgc acattgggtg gggctcctgg gagggagact cagccttcct 24180

cctcatcctc cctgaccctg ctcctagcac cctggagagt gcacatgccc cttggtcctg 24240

gcagggcgcc aagtctggca ccatgttggc ctcttcaggc ctgctagtca ctggaaattg 24300

aggtccatgg gggaaatcaa ggatgctcag tttaaggtac actgtttcca tgttatgttt 24360

ctacacattg ctacctcagt gctcctggaa acttagcttt tgatgtctcc aagtagtcca 24420

ccttcattta actctttgaa actgtatcat ctttgccaag taagagtggt ggcctatttc 24480

agctgctttg acaaaatgac tggctcctga cttaacgttc tataaatgaa tgtgctgaag 24540

caaagtgccc atggtggcgg cgaagaagag aaagatgtgt tttgttttgg actctctgtg 24600

gtcccttcca atgctgtggg tttccaacca ggggaagggt cccttttgca ttgccaagtg 24660

ccataaccat gagcactact ctaccatggt tctgcctcct ggccaagcag gctggtttgc 24720

aagaatgaaa tgaatgattc tacagctagg acttaacctt gaaatggaaa gtcatgcaat 24780

cccatttgca ggatctgtct gtgcacatgc ctctgtagag agcagcattc ccagggacct 24840

tggaaacagt tggcactgta aggtgcttgc tccccaagac acatcctaaa aggtgttgta 24900

atggtgaaaa cgtcttcctt ctttattgcc ccttcttatt tatgtgaaca actgtttgtc 24960

tttttttgta tcttttttaa actgtaaagt tcaattgtga aaatgaatat catgcaaata 25020

aattatgcaa tttttttttc aaagtaacta ctgcatcttt gaagttctgc ctggtgagta 25080

ggaccagcct ccatttcctt ataagggggt gatgttgagg ctgctggtca gaggaccaaa 25140

ggtgaggcaa ggccagactt ggtgctcctg tggttctcga gataacttcg tataatgtat 25200

gctatacgaa gttatatgca tggcctccgc gccgggtttt ggcgcctccc gcgggcgccc 25260

ccctcctcac ggcgagcgct gccacgtcag acgaagggcg cagcgagcgt cctgatcctt 25320

ccgcccggac gctcaggaca gcggcccgct gctcataaga ctcggcctta gaaccccagt 25380

atcagcagaa ggacatttta ggacgggact tgggtgactc tagggcactg gttttctttc 25440

cagagagcgg aacaggcgag gaaaagtagt cccttctcgg cgattctgcg gagggatctc 25500

cgtggggcgg tgaacgccga tgattatata aggacgcgcc gggtgtggca cagctagttc 25560

cgtcgcagcc gggatttggg tcgcggttct tgtttgtgga tcgctgtgat cgtcacttgg 25620

tgagtagcgg gctgctgggc tggccggggc tttcgtggcc gccgggccgc tcggtgggac 25680

ggaagcgtgt ggagagaccg ccaagggctg tagtctgggt ccgcgagcaa ggttgccctg 25740

aactgggggt tggggggagc gcagcaaaat ggcggctgtt cccgagtctt gaatggaaga 25800

cgcttgtgag gcgggctgtg aggtcgttga aacaaggtgg ggggcatggt gggcggcaag 25860

aacccaaggt cttgaggcct tcgctaatgc gggaaagctc ttattcgggt gagatgggct 25920

ggggcaccat ctggggaccc tgacgtgaag tttgtcactg actggagaac tcggtttgtc 25980

gtctgttgcg ggggcggcag ttatggcggt gccgttgggc agtgcacccg tacctttggg 26040

agcgcgcgcc ctcgtcgtgt cgtgacgtca cccgttctgt tggcttataa tgcagggtgg 26100

ggccacctgc cggtaggtgt gcggtaggct tttctccgtc gcaggacgca gggttcgggc 26160

ctagggtagg ctctcctgaa tcgacaggcg ccggacctct ggtgagggga gggataagtg 26220

aggcgtcagt ttctttggtc ggttttatgt acctatcttc ttaagtagct gaagctccgg 26280

ttttgaacta tgcgctcggg gttggcgagt gtgttttgtg aagtttttta ggcacctttt 26340

gaaatgtaat catttgggtc aatatgtaat tttcagtgtt agactagtaa attgtccgct 26400

aaattctggc cgtttttggc ttttttgtta gacgtgttga caattaatca tcggcatagt 26460

atatcggcat agtataatac gacaaggtga ggaactaaac catgggatcg gccattgaac 26520

aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact 26580

gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc 26640

gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg 26700

cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg 26760

tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt 26820

catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc 26880

atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag 26940

cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg 27000

ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac ggcgatgatc 27060

tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt 27120

ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg 27180

ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt 27240

acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct 27300

tctgagggga tccgctgtaa gtctgcagaa attgatgatc tattaaacaa taaagatgtc 27360

cactaaaatg gaagtttttc ctgtcatact ttgttaagaa gggtgagaac agagtaccta 27420

cattttgaat ggaaggattg gagctacggg ggtgggggtg gggtgggatt agataaatgc 27480

ctgctcttta ctgaaggctc tttactattg ctttatgata atgtttcata gttggatatc 27540

ataatttaaa caagcaaaac caaattaagg gccagctcat tcctcccact catgatctat 27600

agatctatag atctctcgtg ggatcattgt ttttctcttg attcccactt tgtggttcta 27660

agtactgtgg tttccaaatg tgtcagtttc atagcctgaa gaacgagatc agcagcctct 27720

gttccacata cacttcattc tcagtattgt tttgccaagt tctaattcca tcagacctcg 27780

acctgcagcc cctagataac ttcgtataat gtatgctata cgaagttatg ctagtaacta 27840

taacggtcct aaggtagcga gctagctcca cgtggctttg tcccagactt cctttgtctt 27900

caacaacctt ctgcaagaaa accaagggcc tgaattttaa cttcctg 27947

<210> 6

<211> 25333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантный полинуклеотид

<400> 6