Композиции и способы для эффективного нацеливания трансгенов

Изобретение относится к области биохимии, в частности к молекуле рекомбинантной ДНК для придания растению толерантности к гербициду дикамбе или ингибитору PPO. Также раскрыты ДНК-конструкция и клетка трансгенного растения, содержащие указанную молекулу ДНК; вектор, содержащий указанную ДНК-конструкцию; трансгенное растение, часть трансгенного растения, трансгенное семя, содержащие указанную молекулу ДНК. Раскрыты способы получения указанного растения; экспрессии дикамба-монооксигеназы (DMO) и протопорфириногеноксидазы (PPO) с помощью указанной молекулы ДНК; способ предотвращения роста сорняков с помощью указанной молекулы ДНК. Изобретение позволяет эффективно бороться с сорняками. 11 н. и 20 з.п. ф-лы, 18 табл., 1 ил., 8 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] В настоящей заявке заявлен приоритет по предварительной заявке на патент США №62/270180, поданной 21 декабря 2015 года, и по предварительной заявке на патент США №62/364715, поданной 20 июля 2016 года, которые включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0002] Данное изобретение в целом относится к отраслям сельского хозяйства, биотехнологии растений и молекулярной биологии. Более конкретно, данное изобретение относится к композициям и способам получения трансгенных растений, демонстрирующих толерантность или резистентность к гербицидам.

Включение перечня последовательностей

[0003] Перечень последовательностей в машиночитаемой форме подан с данной заявкой в электронном формате и включен в данную заявку посредством ссылки в полном объеме. Перечень последовательностей, содержащийся в файле под названием MONS389WO_ST25.txt, размером 122 килобайта (измерено в операционной системе MS Windows), был создан 19 декабря 2016 года.

Описание предшествующего уровня техники

[0004] Продуцирование новых трансгенных растений обеспечивает возможность существенного усовершенствования сельскохозяйственных культур, демонстрирующих полезные характеристики, такие как повышенная толерантность к гербицидам, получая таким образом более эффективные стратегий борьбы с сорняками. Однако, при том, что белки, пригодные для получения полезных характеристик сельскохозяйственных культур, являются известными, эффективная субклеточная локализация (известная как нацеливание) и процессинг этих рекомбинантных белков в трансгенных клетках растений все еще представляют значительные трудности. Поэтому существует потребность в новых транзитных пептидах, способных эффективно локализовать рекомбинантные белки в клетках растений.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0005] Один аспект изобретения относится к молекуле рекомбинантной ДНК, содержащей последовательность ДНК, кодирующую транзитный пептид хлоропласта (CTP), функционально связанную с последовательностью ДНК, кодирующей дикамба-монооксигеназу (DMO) или протопорфириногеноксидазу (PPO), при этом CTP содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения последовательность ДНК, кодирующая CTP, содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7-14. В других вариантах осуществления данного изобретения DMO или PPO содержит полипептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18-27 и 40-59. В одном варианте осуществления данного изобретения последовательность ДНК DMO или PPO содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 28-37 и 61-102. В конкретных вариантах осуществления данного изобретения DMO или PPO определяют как белок толерантности к гербициду, который способен придавать толерантность к гербициду при экспрессии в клетке растения. В конкретных вариантах осуществления данного изобретения белок толерантности к гербициду представляет собой белок DMO, а CTP содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3, или белок толерантности к гербициду представляет собой белок PPO, а CTP содержит выбранную последовательность из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и 2.

[0006] В другом аспекте данного изобретения предлагается конструкция ДНК, содержащая молекулу рекомбинантной ДНК, как описано в данном изобретении, функционально связанную с гетерологичным промотором, функциональным в клетке растения.

[0007] В еще одном аспекте данного изобретения предлагается трансгенное растение, клетка растения, часть растения или семя, трансформированные рекомбинантной молекулой ДНК по данному изобретению. В конкретных вариантах осуществления данного изобретения растение представляет собой однодольное растение. Однодольные растения, которые можно применять в данном изобретении, включают, но не ограничиваются ими, растения кукурузы или пшеницы. В другом варианте осуществления данного изобретения растение представляет собой двудольное растение. Двудольные растения, которые можно применять в данном изобретении, включают, но не ограничиваются ими, растения сои, хлопчатника, или растения рода Brassica (рода капусты).

[0008] В еще одном аспекте предлагается молекула рекомбинантной ДНК по данному изобретению, которая присутствует в неживом материале растения. В одном примере клетки растения находятся в пределах объема данного изобретения, когда они содержат рекомбинантную молекулу ДНК по данному изобретению. В одном варианте осуществления данного изобретения такие клетки растения могут быть регенерируемыми клетками растений или могут быть нерегенерируемыми клетками растений, которые не могут быть регенерированы в растение.

[0009] В еще одном аспекте данного изобретения предлагаются способы продуцирования товарных продуктов, которые содержат обнаруживаемое количество молекулы рекомбинантной ДНК по данному изобретению, включая продукты, полученные таким образом. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения товарные продукты, предлагаемые в данном изобретении, включают нежизнеспособные семена или их части, обезвоженную ткань растения, замороженную ткань растения, обработанную ткань растения, муку крупного помола, муку тонкого помола, хлопья, отруби и волокна. Товарные продукты могут быть жизнеспособными или нежизнеспособными. Нежизнеспособные товарные продукты включают, но не ограничиваются этим, нежизнеспособные семена и зерна; обработанные семена, части семян и части растений; обезвоженная ткань растения, замороженная ткань растения и обработанная ткань растения. Товарные продукты по данному изобретению содержат обнаруживаемое количество рекомбинантной молекулы ДНК, как описано в данном документе. Способы обнаружения молекулы рекомбинантной ДНК по данному изобретению хорошо известны в данной области техники.

[0010] В следующем аспекте данного изобретения предлагается способ продуцирования толерантного к гербицидам растения, включающий следующие этапы: а) трансформация клетки растения с конструкцией ДНК по данному изобретению и b) регенерация растения из трансформированной клетки растения, которая содержит указанную конструкцию ДНК. В одном варианте осуществления способа регенерированное растение является толерантным к гербициду, выбранному из группы, состоящей из дикамбы и ингибитора PPO.

[0011] В еще одном аспекте данного изобретения предлагается способ продуцирования толерантного к гербициду растения, включающий следующие этапы: а) скрещивание родительского растения, содержащего молекулу рекомбинантной ДНК по данному изобретению, с самим собой или со вторым растением для получения одного или большего количества растений потомства; и b) отбор растения потомства, содержащего указанную молекулу ДНК. В одном варианте осуществления способа растение потомства является толерантным к гербициду, выбранному из группы, состоящей из дикамбы и ингибитора PPO.

[0012] В еще одном аспекте данного изобретения предлагается способ экспрессии PPO или DMO в клетке, включающий введение рекомбинантной молекулы ДНК по данному изобретению в клетку растения. В одном варианте осуществления данного изобретения введение молекулы рекомбинантной ДНК включает трансформацию клетки растения.

[0013] В другом аспекте данного изобретения предлагается способ контроля роста сорняков в среде выращивания сельскохозяйственных культур, включающий следующие этапы: а) посадка растения или семян по данному изобретению в среду выращивания сельскохозяйственных культур; и b) применение в среде выращивания сельскохозяйственных культур количества гербицида дикамба или ингибитора PPO, эффективного для контроля роста сорняков. В конкретных вариантах осуществления данного изобретения применение гербицида производится до или после всхода. В одном варианте осуществления данного изобретения количество гербицида не повреждает растение или семя. В некоторых вариантах осуществления указанного способа растение или семя представляют собой однодольное растение или семя, такие как растение или семя кукурузы или пшеницы. В других вариантах осуществления данного изобретения растение или семя представляют собой двудольное растение или семя, такие как соя, хлопчатник или растения рода Brassica (рода капусты). В других вариантах осуществления данного изобретения гербицид представляет собой дикамбу или ингибитор РРО.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0014] Фигура 1. Трансгенные растения кукурузы F1, экспрессирующие H_N10 (SEQ ID NO: 43), функционально связанный с APG6 (SEQ ID NO: 1) или 12G088600TP (SEQ ID NO: 38), после обработки гербицидом в количестве 0,036 фунта активного ингредиента S-3100 на акр (фунт аи/акр), применяемого в V2, затем - в V4, а затем - V8.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0015] SEQ ID NO: 1 представляет собой аминокислотную последовательность CTP белого и бледно-зеленого Arabidopsis thaliana (APG6).

[0016] SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность аминоконцевого оптимизированного варианта APG6 CTP SEQ ID NO: 1.

[0017] SEQ ID NO: 3 представляет собой аминокислотную последовательность белка теплового шока 90 кДа (CR88) CTP Arabidopsis thaliana.

[0018] SEQ ID NO: 4 представляет собой аминокислотную последовательность Ph. ShkG-CTP4 CTP.

[0019] SEQ ID NO: 5 представляет собой аминокислотную последовательность Ps. RbcS-3C CTP.

[0020] SEQ ID NO: 6 представляет собой аминокислотную последовательность Os.Waxy CTP.

[0021] SEQ ID NO: 7-11 представляют собой последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие APG6 CTP SEQ ID NO: 1, оптимизированные для однодольной или двудольной экспрессии.

[0022] SEQ ID NO: 12 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую APG6 CTP SEQ ID NO: 2.

[0023] SEQ ID NO: 13 и 14 представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие At.CR88 CTP, оптимизированные для двудольной или однодольной экспрессии, соответственно.

[0024] SEQ ID NO: 15-17 представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие SEQ ID NO: 4-6 соответственно.

[0025] SEQ ID NO: 18-27 представляют собой аминокислотные последовательности, кодирующие варианты дикамба-монооксигеназы (DMO).

[0026] SEQ ID NO: 28-37 представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты DMO SEQ ID NO: 18-27 соответственно.

[0027] SEQ ID NO: 38 представляет собой аминокислотную последовательность транзитного пептида хлоропласта 12G088600TP хлопчатника, оптимизированную для двудольной экспрессии.

[0028] SEQ ID NO: 39 представляет собой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие SEQ ID NO: 38.

[0029] SEQ ID NO: 40 представляет собой аминокислотную последовательность H_N90.

[0030] SEQ ID NO: 41 представляет собой аминокислотную последовательность H_N20.

[0031] SEQ ID NO: 42 представляет собой аминокислотную последовательность H_N60.

[0032] SEQ ID NO: 43 представляет собой аминокислотную последовательность H_N10.

[0033] SEQ ID NO: 44 представляет собой аминокислотную последовательность H_N30.

[0034] SEQ ID NO: 45 представляет собой аминокислотную последовательность H_N40.

[0035] SEQ ID NO: 46 представляет собой аминокислотную последовательность H_N50.

[0036] SEQ ID NO: 47 представляет собой аминокислотную последовательность H_N70.

[0037] SEQ ID NO: 48 представляет собой аминокислотную последовательность H_N100.

[0038] SEQ ID NO: 49 представляет собой аминокислотную последовательность H_N110.

[0039] SEQ ID NO: 50-56 представляют собой аминокислотные последовательности, не содержащие стартовый метионин, соответствующий SEQ ID NO: 40, 41, 43, 44, 45, 46 и 48 соответственно.

[0040] SEQ ID NO: 57-58 представляют собой аминокислотные варианты SEQ ID NO: 50.

[0041] SEQ ID NO: 59 представляет собой аминокислотный вариант SEQ ID NO: 56.

[0042] SEQ ID NO: 60 представляет собой аминокислотную последовательность протопорфириногеноксидазы из Amaranthus tuberculatus (щирица) (WH_PPO).

[0043] SEQ ID NO: 61-70 представляют собой нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 40-49 соответственно, кодон-оптимизированные для экспрессии E. coli.

[0044] SEQ ID NO: 71-80 представляют собой нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 40-49 соответственно, кодон-оптимизированные для двудольной экспрессии.

[0045] SEQ ID NO: 81-87 представляют собой нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 50-56 соответственно, кодон-оптимизированные для двудольной экспрессии.

[0046] SEQ ID NO: 88 и 91 представляют собой нуклеотидные варианты SEQ ID NO: 50 и 51, соответственно.

[0047] SEQ ID NO: 89, 90 и 92 представляют собой нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 57-59, соответственно.

[0048] SEQ ID NO: 93-102 представляют собой нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 40-49 соответственно, кодон-оптимизированные для однодольной экспрессии.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0049] Транзитные пептиды хлоропласта (CTP), локализующие белки толерантности к гербицидам в клетках, известны в данной области техники, но степень эффективной субклеточной локализации и процессинга для любой комбинации CTP и белка толерантности к гербициду трудно спрогнозировать. Локализация и процессинг определяют уровень экспрессии и функцию белка толерантности к гербициду и, таким образом, влияют на фенотип толерантности к гербициду трансгенной клетки, растения или семени, содержащих указанный белок. В трансгенных растениях были проанализированы различные CTP с применением пригодных белков толерантности к гербицидам, включая дикамба-монооксигеназы (DMO) и протопорфириногеноксидазы (PPO). Однако часто наблюдали слабый или неполный процессинг и локализацию белка.

[0050] Данное изобретение преодолевает эти препятствия, обеспечивая новые молекулы рекомбинантной ДНК, способные обеспечить улучшенную локализацию и процессинг хлоропласта, а также композиции и способы их применения. Молекулы рекомбинантной ДНК по данному изобретению содержат последовательность ДНК, кодирующую CTP, функционально связанный с DMO или PPO. Молекулы рекомбинантной ДНК по данному изобретению обеспечивают локализацию хлоропласта DMO или PPO и повышенную толерантность к гербициду дикамба или PPO в растениях, содержащих молекулы рекомбинантной ДНК.

[0051] В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагаются молекулы рекомбинантной ДНК, содержащие последовательность ДНК, кодирующую CTP, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3, функционально связанную с последовательностью ДНК, кодирующей белок толерантности к гербициду. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагаются молекулы рекомбинантной ДНК, содержащие последовательности ДНК, кодирующие CTP, такие как CTP, имеющие последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3, функционально связанную с последовательностью ДНК, кодирующей белок DMO, например, белок DMO, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18-27. В дополнительных вариантах осуществления данного изобретения предлагаются молекулы рекомбинантной ДНК, содержащие последовательности ДНК, кодирующие CTP, такие как CTP, имеющие последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3, функционально связанную с последовательностью ДНК, кодирующей белок PPO, такой как белок PPO, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40-60.

Молекулы рекомбинантной ДНК

[0052] В данном контексте термин «рекомбинантный» относится к неприродной (-ому) ДНК, полипептиду, белку, клетке, семени или растению, которое (-ая, -ый) является результатом генной инженерии и как таковое (-ая, -ой) обычно не встречается в природе, и которое (-ая, -ый) был создан в результате вмешательства человека. «Рекомбинантная молекула ДНК» представляет собой молекулу ДНК, содержащую последовательность ДНК, которая не встречается в природе, и как таковая является результатом вмешательства человека, например, молекула ДНК, состоящая из комбинации по меньшей мере двух молекул ДНК, гетерологичных друг другу. Примером рекомбинантной молекулы ДНК является молекула ДНК, кодирующая CTP, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3, функционально связанную с последовательностью ДНК, кодирующей белок DMO, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18-27. Примеры белков DMO приведены в Таблице 1 ниже.

Таблица 1. Дикамба-монооксигеназы (DMO)

БЕЛОК SEQ ID NO	ДНК SEQ ID NO	Длина белка	Прогнозируемое положение 2	Прогнозируемое положение 3	Прогнозируемое положение 112	Использование кодонов
18	28	340	Leu	Thr	Trp	двудольный
19	29	339	Thr	Phe	Trp (в 111)	двудольный
20	30	340	Leu	Thr	Trp	однодольный
21	31	340	Ala	Thr	Cys	двудольный
11	32	340	Leu	Thr	Cys	двудольный
23	33	340	Ala	Thr	Cys	бактериальный
24	34	340	Ala	Thr	Trp	двудольный
25	35	340	Ala	Thr	Trp	однодольный
26	36	340	Leu	Thr	Cys	двудольный
27	37	340	Leu	Thr	Trp	двудольный

[0053] Другим примером рекомбинантной молекулы ДНК является молекула ДНК, кодирующая CTP, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3, функционально связанную с последовательностью ДНК, кодирующей белок PPO, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40-60. Рекомбинантной клеткой, семенем или растением является клетка, семя или растение, содержащее трансгенную ДНК, например, трансгенную клетку, семя, растение или часть растения, содержащую рекомбинантную молекулу ДНК по данному изобретению. Примеры белков PPO приведены в Таблице 2 ниже.

Таблица 2. Протопорфириногеноксидазы (PPO)

PPO	Белок SEQ ID NO	Бактериальная ДНК SEQ ID NO	Двудольная оптимизированная ДНК SEQ ID NO	Однодольная оптимизированная ДНК SEQ ID NO
H_N10	43, 52	64	74, 83	96
H_N20	41, 51	62	72, 82, 91	94
H_N30	44, 53	65	75, 84	97
H_N40	45, 54	66	76, 85	98
H_N50	46, 55	67	77, 86	99
H_N60	42	63	73	95
H_N70	47	68	78	100
H_N90	40, 50, 57, 58	61	71, 81, 88, 89, 90	93
H_N100	48, 56, 59	69	79, 87, 92	101
H_N110	49	70	80	102
WH_PPO	60	н/д	н/д	н/д

[0054] Примеры последовательностей CTP, которые можно применять в соответствии с данным изобретением, приведены в Таблице 3 ниже.

Таблица 3. Транзитные пептиды хлоропласта (CTP)

CTP	Белок SEQ ID NO	ДНК SEQ ID NO	Использование кодонов
APG6	1	7, 10, 11	однодольный
8, 9	двудольный
N-opt APG6	2	12	двудольный
At.CR88	3	13	двудольный
14	однодольный
Ph. ShkG-CTP4	4	15	однодольный
Ps. RbcS-3C	5	16	двудольный
Os.Waxy	6	17	однодольный
12G088600TP	38	39	двудольный

[0055] В данном контексте термин «выделенная молекула ДНК» означает, что молекула ДНК присутствует отдельно или в комбинации с другими композициями, но не находится в своей естественной среде. Например, молекула рекомбинантной ДНК, содержащая белок-кодирующую последовательность и гетерологичную последовательность CTP, представляет собой выделенную молекулу ДНК, когда она присутствует в геноме трансгенного растения, клетки или семени, поскольку компоненты этой молекулы рекомбинантной ДНК находятся не их естественной среде (т. е. геноме организма, в котором каждый компонент был впервые обнаружен). Молекула рекомбинантной ДНК, присутствующая в геноме трансгенного растения, представляет собой выделенную молекулу ДНК при том условии, что молекула рекомбинантной ДНК не была естественным образом обнаружена в этом геноме растения и поэтому является выделенной из ее естественной окружающей среды

[0056] В данном контексте термин «генная инженерия» относится к созданию ДНК, белка или организма, которые обычно не встречаются в природе, посредством вмешательства человека. Генную инженерию можно использовать для получения ДНК, полипептида, белка, клетки, семени или растений, которые были сконструированы и созданы в лаборатории с применением одного или большего количества методов биотехнологии, таких как молекулярная биология, биохимия белков, бактериальная трансформация и трансформация растений. Например, генную инженерию можно использовать для создания химерного гена, содержащего молекулу ДНК, кодирующую CTP, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3, функционально связанной с белком DMO, содержащим последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18-27 и необязательно может дополнительно содержать гетерологичный промотор, функциональный в клетке растения. В другом примере, генную инженерию можно использовать для создания химерного гена, содержащего молекулу ДНК, кодирующую CTP, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3, функционально связанный с белком PPO, содержащим последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40-60 и необязательно может дополнительно содержать гетерологичный промотор, функциональный в клетке растения. Такой химерный ген может быть получен с помощью одного или большего количества методов молекулярной биологии, таких как клонирование генов, лигирование ДНК и синтез ДНК.

[0057] Термин «трансген» относится к молекуле ДНК, искусственно встраиваемой в геном организма в результате вмешательства человека, например, с помощью способов трансформации растений. В данном контексте термин «трансгенный» означает, включающий трансген, например, «трансгенное растение» относится к растению, содержащему трансген в своем геноме, и «трансгенный признак» относится к характеристике или фенотипу, выраженному или предоставленному присутствием трансгена, встроенного в геном растения. В результате таких геномных изменений трансгенное растение является чем-то значительно отличным от родственного растения дикого типа, а трансгенный признак представляет собой признак, который естественным образом не обнаруживается у растения дикого типа. Трансгенные растения по данному изобретению содержат рекомбинантную молекулу ДНК, предложенную в данном изобретении.

[0058] В данном контексте термин «гетерологичный» относится к взаимосвязи между двумя или более материалами, полученными из разных источников и, таким образом, обычно не связанными в природе. Например, белок DMO является гетерологичным по отношению к функционально связанному CTP, если такая комбинация обычно не встречается в природе. В другом примере рекомбинантная молекула ДНК, кодирующая CTP, функционально связанный с белком DMO, является гетерологичной по отношению к функционально связанному промотору, который является функциональным в клетке растения, если такая комбинация обычно не встречается в природе. Конкретная рекомбинантная молекула ДНК также может быть гетерологичной по отношению к клетке, семени или организму, в который она вставлена, когда она не будет встречаться в естественной среде в этой конкретной клетке, семени или организме.

[0059] В данном контексте термин «молекула ДНК, кодирующая белок» или «молекула ДНК, кодирующая полипептид» относится к молекуле ДНК, которая кодирует белок или полипептид, такой как белок или полипептид, для обеспечения толерантности к гербицидам или борьбы с насекомыми. Термин «последовательность ДНК, кодирующая белок» или «последовательность, кодирующая полипептид» означает последовательность ДНК, которая кодирует белок или полипептид. «Последовательность» означает последовательное расположение нуклеотидов или аминокислот. Границы последовательности, кодирующей белок, или последовательности, кодирующей полипептид, обычно определяются стартовым кодоном трансляции на 5'-конце и стоп-кодоном трансляции на 3'-конце. Молекула, кодирующая белок, или молекула, кодирующая полипептид, может содержать последовательность ДНК, кодирующую белковую или полипептидную последовательность. В данном контексте термин «экспрессия трансгена», «экспрессирование трансгена», «экспрессия белка», «экспрессия полипептида», «экспрессирование белка» и «экспрессирование полипептида» означает продуцирование белка или полипептида в процессе транскрипции молекулы ДНК в матричную РНК (мРНК) и трансляции мРНК в полипептидные цепи, которые могут быть в конечном счете свернуты в белки. Молекула ДНК, кодирующая белок, или молекула ДНК, кодирующая полипептид, может быть функционально связана с гетерологичным промотором в конструкции ДНК, для применения в экспрессии белка или полипептида в клетке, трансформированной рекомбинантной молекулой ДНК. В данном контексте термин «функционально связанный» означает две молекулы ДНК, связанные таким образом, что одна молекула может влиять на функцию другой. Функционально-связанные молекулы ДНК могут быть частью одной непрерывной молекулы и могут быть или не быть смежными. Например, промотор функционально связан с молекулой ДНК, кодирующей белок, или молекулой ДНК, кодирующей полипептид, в конструкции ДНК, где две молекулы ДНК расположены таким образом, что промотор может влиять на экспрессию трансгена.

[0060] Молекулы рекомбинантной ДНК по данному изобретению включают последовательность ДНК, кодирующую DMO, функционально связанную с последовательностью CTP. В данном контексте термин «дикамба-монооксигеназа» или «DMO» означает оксигеназу, способную ферментативно катализировать деградацию дикамбы (3,6-дихлор-о-анизиновая кислота) до 3,6-дихлорсалициловой кислоты (3,6-DCSA), такой как дикамба-монооксигеназа, кодируемая геном деметилазы (dmo) из Stenotrophomonas maltophilia. Дикамба-монооксигеназы известны в данной области техники и включают белковые последовательности, представленные как SEQ ID NO: 18-27, и идентифицированы в Таблице 1.

[0061] Молекулы рекомбинантной ДНК по данному изобретению включают последовательность ДНК, кодирующую PPO, функционально связанную с последовательностью CTP. В данном контексте термин «протопорфириногеноксидаза» или «PPO» означает оксидазу, способную ферментативно превращать протопорфириноген IX в протопорфирин IX. Протопорфириногеноксидазы известны в данной области техники и включают белковые последовательности, представленные в виде SEQ ID NO: 40-60, и идентифицированы в Таблице 2.

[0062] Молекулы рекомбинантной ДНК по данному изобретению включают последовательность ДНК, кодирующую последовательность CTP, функционально связанную с предложенными в данном изобретении молекулами ДНК, кодирующими белок, посредством чего CTP облегчает локализацию рекомбинантной белковой молекулы внутри клетки. CTP также известны в данной области техники как сигнальные последовательности, последовательности нацеливания, пептиды нацеливания и последовательности локализации. Хлоропласты также известны в данной области техники как пластиды. Способствуя локализации белка внутри клетки, CTP обеспечивает локализацию белка в хлоропласте для оптимальной активности фермента и может увеличить накопление рекомбинантного белка и защитить белок от протеолитического расщепления. Процесс, при котором CTP типично отщепляется от белка при транслокации в хлоропласт, также называется прооцессингом. Процессинг CTP может быть полным (что означает, что полный CTP отщепляется от аминотерминального конца белка), неполным (это означает, что одна или большее количество аминокислот CTP остаются на аминотерминальном конце белка), или приводит к удалению одной или большего количества аминокислот из аминотерминального конца белка. Полный процессинг CTP из белка DMO повышает уровень накопления белка, тем самым повышая толерантность к дикамбе и снижая уровни поражения в трансгенных клетках, семенах или организме после применения гербицида. CTP представлены как SEQ ID NO: 1-6 и 38 и идентифицированы в Таблице 3. Последовательность ДНК, кодирующая каждый CTP, оптимизированный для экспрессии в двудольных и однодольных, представлена как SEQ ID NO: 7-17 и 39.

[0063] Рекомбинантные молекулы ДНК согласно данному изобретению могут быть синтезированы и модифицированы с помощью способов, известных в данной области техники, полностью или частично, особенно там, где желательно получить последовательности, пригодные для манипуляций с ДНК (такие как сайты распознавания рестрикционных ферментов или сайты клонирования на основе рекомбинации), предпочтительные по отношению к растению последовательности (например, использование кодонов растений или консенсусных последовательностей Козак) или последовательности, пригодные для конструирования конструкции ДНК (такие как спейсерные или линкерные последовательности). Молекулы рекомбинантной ДНК по данному изобретению включают вырожденные последовательности ДНК, кодирующие ту же аминокислотную последовательность, что и последовательность ДНК, представленная в данном изобретении. Вырожденные последовательности ДНК можно получить с помощью способов, известных в данной области техники, и таблицы кодонов ДНК. Данное изобретение включает в себя рекомбинантные молекулы ДНК и белки, имеющие по меньшей мере 85% идентичности последовательности, по меньшей мере 90% идентичности последовательности, по меньшей мере 95% идентичности последовательности, по меньшей мере 96% идентичности последовательности, по меньшей мере 97% идентичности последовательности, по меньшей мере 98% идентичности последовательности, и по меньшей мере 99% идентичности последовательности с любой из рекомбинантных молекул ДНК или полипептидных последовательностей, представленных в данном изобретении. Например, молекула рекомбинантной ДНК по данному изобретению может содержать последовательность ДНК, имеющую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7-14 или последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 28-37 и 61-102. Молекула рекомбинантной ДНК по данному изобретению может кодировать последовательность белка, имеющую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности последовательности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3; или последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18-27 и 40-59.

[0064] В данном контексте термин «процент идентичности последовательности» или «% идентичности последовательности» относится к проценту идентичных нуклеотидов или аминокислот в эталонной («запрос») линейной полинуклеотидной или полипептидной последовательности (или ее комплементарной цепи) по сравнению с тестовой («субъект») последовательностью (или ее комплементарной цепью), когда две последовательности оптимально выровнены (с соответствующими нуклеотидными или аминокислотными вставками, делециями или пробелами, составляющими менее 20 процентов эталонной последовательности в окне сравнения). Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания окна сравнения хорошо известно специалистам в данной области техники и может быть выполнено с помощью таких инструментов, как алгоритм локальной гомологии Смита и Уотермана, алгоритм выравнивания гомологии Нидлмана и Вунша, способ поиска схожести Пирсона и Липмана, а также с помощью компьютеризированных реализаций этих алгоритмов, таких как GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA, которые доступны в составе пакета программного обеспечения Sequence Analysis GCG® Wisconsin Package® (Accelrys Inc.,Сан-Диего, Калифорния), MEGAlign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St.,Madison, WI 53715), и MUSCLE (версия 3.6) (Edgar, Nucleic Acids Research 32(5): 1792-7, 2004) с параметрами по умолчанию. «Доля идентичности» для выровненных сегментов тестовой последовательности и эталонной последовательности представляет собой количество идентичных компонентов, которые являются общими для двух выровненных последовательностей, деленное на общее количество компонентов в сегменте эталонной последовательности, то есть всю эталонную последовательность или меньшую определенную часть эталонной последовательности. Процент идентичности последовательности представлен как доля идентичности, умноженная на 100. Сравнение одной или более последовательностей может производится с полноразмерной последовательностью или ее частью, или более длинной последовательностью.

[0065] В данном контексте термин «конструкция ДНК» представляет собой рекомбинантную молекулу ДНК, содержащую две или большее количество гетерологичных последовательности ДНК. Конструкции ДНК являются пригодными для экспрессии трансгена и могут быть включены в векторы и плазмиды. Конструкции ДНК могут быть применены в векторах с целью трансформации, что представляет собой введения гетерологичной ДНК в клетку-хозяина, для получения трансгенных растений и клеток, и как таковые могут также содержаться в пластидной ДНК или геномной ДНК трансгенного растения, семени, клетки или части растения. В данном контексте термин «вектор» означает любую рекомбинантную молекулу ДНК, которую можно применить для трансформации растения. Рекомбинантные молекулы ДНК, как указано в перечне последовательностей, могут быть, например, вставлены в вектор как часть конструкции, имеющей рекомбинантную молекулу ДНК, функционально связанную с элементом экспрессии гена, который функционирует в растении, с целью влияния на экспрессию белка, кодируемого рекомбинантной молекулой ДНК. Способы конструирования конструкций ДНК и векторов хорошо известны в данной области техники. Компоненты конструкции ДНК или вектора, содержащего конструкцию ДНК, обычно включают, но не ограничиваются ими, один или большее количество из следующих элементов: промотор для экспрессии функционально связанной ДНК, функционально связанную молекулу ДНК, кодирующую белок, и 3'-нетранслируемую область. Элементы экспрессии генов, пригодные при осуществлении данного изобретения, включают, но не ограничиваются ими, один или большее количество элементов следующего типа: промотор, 5'-нетранслируемая область, энхансер, лидер, действующий в цис-положении элемент, интрон, 3'-нетранслируемая область и один или большее количество селектируемых маркерных трансгенов.

[0066] Указанные конструкции ДНК по данному изобретению могут включать промотор, функционально связанный с кодирующей белок молекулой ДНК, предложенной в данном изобретении, посредством чего промотор стимулирует экспрессию молекулы рекомбинантного белка. Промоторы, которые применяются при осуществлении данного изобретения, включают те, которые функционируют в клетке для экспрессии функционально связанного полинуклеотида, например, промотор бактерии или растения. Промоторы растения разнообразны и хорошо известны в данной области техники и включают те, которые являются индуцибельными, вирусными, синтетическими, конститутивными, регулируемыми по времени, регулируемыми в пространстве и/или регулируемыми по времени и в пространстве.

[0067] В данном контексте термин «отрицательный контроль» и «положительный контроль» означает экспериментальный контроль, предназначенный для целей сравнения. Например, растение из группы отрицательного контроля или растение из группы положительного контроля в анализе трансгенного растения может представлять собой растение того же типа, что и экспериментальное растение (тестируемое растение), но которое не содержит трансгенной вставки, рекомбинантной молекулы ДНК или конструкции ДНК экспериментального растения. Примером контрольного растения, пригодного для сравнения с трансгенными растениями кукурузы, является нетрансгенная кукуруза LH244 (патент США №6252148), или нетрансгенная кукуруза 01DKD2 (патент США №7166779); для сравнения с трансгенными растениями сои- нетрансгенная соя A3555 (патент США №7700846), или нетрансгенная соя A3244 (патент США №5659114, PVP 9600246); для сравнения с трансгенными растениями канолы или Brassica napus - разновидность 65037 линии Restorer нетрансгенной Brassica napus; для сравнения с трансгенными растениями пшеницы - зародышевая плазма Samson (PVP 1994) разновидности нетрансгенной пшеницы; а для сравнения с трансгенными растениями хлопчатника - нетрансгенная DP393 (патент США №6930228 PVP 200400266).

Трансгенные растения

[0068] Аспект данного изобретения включает трансгенные растительные клетки, трансгенные растительные ткани, трансгенные растения и трансгенные семена, которые содержат рекомбинантные молекулы ДНК, предложенные в данном изобретении. Эти клетки, ткани, растения и семена, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК, демонстрируют толерантность к гербицидам.

[0069] Вставку трансгенной ДНК (известной как «трансген») в геном растения можно осуществить путем трансформации растения и приводит к созданию новой трансгенной геномной молекулярной последовательности, известной как «трансформант». Каждый трансформант является уникальным, и определенная последовательность ДНК трансформанта является специфичной для определенного трансформанта. Подходящие способы трансформации клеток растения-хозяина для применения в данном изобретении включают практически любой способ, с помощью которого ДНК может быть введена в клетку (например, когда конструкция рекомбинантной ДНК стабильно интегрируется в хромосому растения) и который хорошо известный в данной области техники. Конструкция рекомбинантной ДНК, применяемая в иллюстративных способах введения конструкции рекомбинантной ДНК в растения, включает системы трансформации Agrobacterium и бомбардировки частицами ДНК, обе из которых хорошо известны специалистам в данной области техники. Другим иллюстративным способом введения конструкции рекомбинантной ДНК в растения является встраивание конструкции рекомбинантной ДНК в геном растения в заранее определенном месте с помощью способов сайт-направленной интеграции. Сайт-направленная интеграция может быть выполнена с помощью любого способа, известного в данной области техники, например, с применением нуклеаз с цинковыми пальцами, сконструированных или нативных мегануклеаз, TALE-эндонуклеаз или эндонуклеаз с РНК-управлением (например, системы CRISPR/Cas9). Трансгенные растения затем могут быть регенерированы из трансформированной растительной клетки с помощью методов культивирования растительных клеток. Трансгенное растение, гомозиготное по трансгену (т. е. имеющее две аллельные копии определенного трансгена), может быть получено путем самоопыления (самооплодотворения) трансгенного растения, которое содержит единственный аллель трансгена, например, растение R0, с целью получения семян R1. Одна четвертая часть полученных семян R1 будет гомозиготной по трансгену. Растения, выращенные из прорастающих семян R1, могут быть протестированы на зиготность, как правило, с помощью анализа SNP, секвенирования ДНК или анализа термической амплификации, что позволяет различать гетерозиготы и гомозиготы, и называется анализом зиготности.

[0070] Растения, семена, части растений, ткани растений и клетки, предложенные в данном изобретении, проявляют толерантность к гербициду дикамба. Дикамбу можно вносить на участок произрастания растений, содержащий растения и семена, предложенные в данном изобретении, в качестве способа борьбы с сорняками, включая предотвращение роста сорняков. Растения и семена, предлагаемые в данном изобретении, содержат признак толерантности к гербициду, и как таковые являются толерантными к применению дикамбы. Может быть рекомендовано применение гербицида в коммерческом количестве (1X), или в любой его части, или в любой его кратности, такой как в два раза больше чем рекомендуемое коммерческое количество (2X). Количество применяемой дикамбы может быть выражено в виде кислотного эквивалента на фунт на акр (фунт к.э./акр) или кислотного эквивалента на грамм на гектар (грам к.э. /га). Участок произрастания растений может содержать или не содержать сорняки во время применения гербицида. Гербицидно-эффективная доза дикамбы для применения на участке с целью борьбы с сорняками должна составлять от около 0,1X до около 30X количества, указанного на этикетке в течение вегетационного периода. 1X количество, указанное на этикетке дикамбы составляет 0,5 фунта к.э./акр. Количества гербицидов могут быть преобразованы между английским и метрическим измерением следующим образом: (фунт аи/акр)*1,12=(кг аи/га) и (кг аи/га)*0,89=(фунт аи/акр).

[0071] Растения, семена, части растений, ткани растений и клетки могут проявлять толерантность к одному или большему количеству ингибиторов PPO, называемым гербицидами PPO. Один или большее количество гербицидов PPO можно вносить на участок произрастания растений, содержащий растения и семена, предложенные в данном изобретении, в качестве способа борьбы с сорняками, включая предотвращение роста сорняков. Растения и семена, предлагаемые в данном изобретении, содержат признак толерантности к гербициду, и как таковые являются толерантными к применению одного или большего количества гербицидов PPO. Может быть рекомендовано применение гербицида в коммерческом количестве (1X), или в любой его части, или в любой его кратности, такой как в два раза больше чем рекомендуемое коммерческое количество (2X). Участок произрастания растений может содержать или не содержать сорняки во время применения гербицида. Гербицидно-эффективная доза гербицида PPO для применения на участке с целью борьбы с сорняками должна составлять от около 0,1X до около 30X количества, указанного на этикетке, в течение вегетационного периода. Гербициды PPO хорошо известны в данной области техники и являются коммерчески доступными. Примеры гербицидов PPO включают, но не ограничиваются ими, дифениловые эфиры (такие как ацифлуорфен, его соли и сложные эфиры, аклонифен, бифенокс, его соли и сложные эфиры, этоксифен, его соли и сложные эфиры, фторнитрофен, фурилоксифен, галогенофен, хлометоксифен, фторгликофен, его соли и сложные эфиры, лактофен, его соли и сложные эфиры, оксифлуорфен и фомеафен, его соли и сложные эфиры); тиадиазолы (такие как флутиацет-метил и тидиазимин); пиримидиндионы или фенилурацилы (такие как бензфендизон, бутафенацил, этил [3-2-хлор-4-фтор-5- (1-метил-6-трифторметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3-ил) фенокси] -2-пиридилокси] ацетат (имеет регистрационный номер CAS 353292-31-6 и упоминается в данном документе как S-3100), флупропацил, сафлуфенацил и тиафенацил); фенилпиразолы (такие как флюазолат, пирафлуфен и пирафлуфен-этил); оксадиазолы (такие как оксадиаргил и оксадиазон); триазолиноны (такие как азафенидин, бенкарбазон, карфентразон, его соли и сложные эфиры и сульфантразон); оксазолидиндионы (такие как пентоксиназон); N-фенилфталимиды (такие как цинидон-этил, флумикларат, флумихлорак-пентил и флумиоксазин); производные бензоксазинона (такие как 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифлуоро-3,4-дигидро-3-оксо-4-проп-2-инил-2H-1,4-бензоксазин-6-ил)-1,3,5-триазин-2,4-дион); флуфенпир и флуфенпир-этил; пираклонил; и профлуазол.

[0072] Применение гербицидов может быть последовательным или гербицид может быть смешан в цистерне с одним, двумя или комбинацией нескольких гербицидов или любим другим совместимым гербицидом. Многократное применение одного гербицида, или двух или более гербицидов, в комбинации или отдельно, может быть использовано в течение вегетационного периода на участках, содержащих трансгенные растения согласно данному изобретению, для борьбы с широким спектром двудольных сорняков, однодольных сорняков или тех и тех, например, два применения (таких как применение перед посадкой растений и применение после появления всходов, или применение перед появлением всходов и применение после появления всходов), или три применения (такие как применения для перед посадкой растений, применения перед появлением всходов и применение после появления всходов, или применение перед появлением всходов и два применения после появления всходов).

[0073] В данном контексте термин «толерантность» или «толерантность к гербицидам» означает способность растения, семени или клетки противостоять токсическому воздействию гербицида при его внесении. Толерантность к гербициду растения, семени, ткани растения, части растения или клетки можно измерить, сравнивая растение, семя, ткань растения, часть растения или клетку с подходящим экспериментальным контролем. Например, толерантность к гербицидам можно измерить или оценить путем нанесения гербицида на растение, содержащее рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую белок, способный придавать толерантность к гербициду (тестируемое растение), и на растение того же вида, не содержащее рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую белок, способный придавать толерантность к гербициду (растение из группы отрицательного контроля), а затем сравнить поражение двух растений, при этом на толерантность к гербициду тестируемого растения указывает снижение показателя пораженности по сравнению с показателем пораженности растения из группы отрицательного контроля. Гербицидо-толерантное растение, семя, ткань растения, часть растения или клетки проявляют уменьшенный ответ на токсические эффекты гербицида по сравнению с растением, семенем, тканью растения, частью растения или клеткой из группы отрицательного контроля. В данном контексте термин «признак толерантности к гербициду» представляет собой трансгенный признак, придающий растению улучшенную толерантность к гербициду по сравнению с растением из группы отрицательного контроля.

[0074] Трансгенные растения, потомство, семена, клетки растений и части растений согласно данному изобретению могут также содержать один или большее количество дополнительных трансгенных признаков. Дополнительные трансгенные признаки могут быть внесены путем скрещивания растения, содержащего трансген, содержащий рекомбинантные молекулы ДНК, предложенные в данном изобретении, с другим растением, содержащим дополнительный трансгенный признак (признаки). В данном контексте термин «скрещивание» означает размножение двух отдельных растений для получения потомства растений. Таким образом, два трансгенных растения могут быть скрещены для получения потомства, которое содержит трансгенные признаки. В данном контексте термин «потомство» означает потомство любого поколения родительского растения, при этом трансгенное потомство содержит конструкцию ДНК, предложенную в данном изобретении, унаследованную, по меньшей мере, от одного родительского растения. В альтернативном варианте, дополнительный трансгенный признак (признаки) может быть введен путем совместной трансформации конструкции ДНК для этого дополнительного трансгенного признака (признаков) с конструкцией ДНК, содержащей рекомбинантные молекулы ДНК, предложенные в данном изобретении (например, со всеми конструкциями ДНК, представленными как часть того же вектора, примененного для трансформации растений) или путем введения дополнительного признака (признаков) в трансгенное растение, содержащее конструкцию ДНК, предложенную в данном изобретении, или наоборот (например, применяя любой из способов трансформации растений к трансгенному растению или клетке растения). Такие дополнительные трансгенные признаки включают, но не ограничиваются ими: повышенную резистентность к насекомым, повышенную эффективность использования воды, повышенную урожайность, повышенную устойчивость к засухе, повышенное качество семян, улучшенные питательные качества, производство семян гибрида, а также толерантность к гербицидам, при этом признак измеряется относительно растения дикого типа. Такие дополнительные трансгенные признаки известны специалистам в данной области техники; например, перечень таких признаков предоставляется Службой инспекции здоровья животных и растений (APHIS) Министерства сельского хозяйства США (USDA).

[0075] Трансгенные растения и потомство, которые содержат трансгенный признак, предложенный в данном изобретении, могут быть использованы с любыми способами скрещивания, которые широко известны в данной области техники. В линиях растений, содержащих два или большее количество трансгенных признаков, трансгенные признаки могут быть независимо сегрегирующими, сцепленными или комбинацией обоих в линиях растений, содержащих три или большее количество трансгенных признаков. Рассматривается также обратное скрещивание с родительским растением, и скрещивание с нетрансгенным растением, а также вегетативное размножение. Описания способов скрещивания, которые обычно применяются для различных признаков и культур, хорошо известны специалистам в данной области техники. Для подтверждения присутствия трансгена(-ов) в конкретном растении или семени может быть выполнено множество анализов. Такие анализы включают, например, молекулярно-биологические анализы, такие как саузерн- и нозерн- блотинги, ПЦР и секвенирование ДНК; биохимические анализы, такие как обнаружение присутствия белкового продукта, например, иммунологическими способами (ИФА и вестерн-блоты) или с помощью ферментной функции; анализы части растений, такие как анализ листьев или корней; а также анализ фенотипа всего растения. Для анализа процессинга CTP в конкретном трансгенном растении или семени анализы, такие как расщепляющее секвенирование по Эдману или анализ масс-спектрометрии, могут быть выполнены на рекомбинантном белке DMO или PPO, полученном из трансгенной клетки, растения или семени, а полученные в результате данные последовательности сравнивали с данными белка DMO или PPO, соответственно.

[0076] Интрогрессия трансгенного признака в генотип растения достигается в результате процесса конверсии обратного скрещивания. Генотип растения, в который был интрогрессирован трансгенный признак, можно назвать преобразованным с помощью обратного скрещивания генотипом, линией, инбредом или гибридом. Подобным же образом генотип растения, лишенный желаемого трансгенного признака, можно назвать непреобразованным генотипом, линией, инбредом или гибридом.

[0077] В данном контексте термин «содержащий» означает «включающий, но не ограничивающийся этим».

Примеры

[0078] Следующие примеры включены для демонстрации вариантов осуществления данного изобретения. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, в свете настоящего описания, что в конкретных предложенных вариантах осуществления данного изобретения можно совершить многие изменения, при этом по-прежнему получится сходный или аналогичный результат, без отступления от объема и концепции изобретения. Более конкретно, будет очевидно, что некоторые агенты, которые являются химически или физиологически родственными, могут быть заменены описанными в данном документе агентами с получением того же или сходного результата. Все таковые сходные замены и модификации, очевидные специалистам в данной области техники, считаются не выходящими за пределы объема и концепции данного изобретения.

Пример 1. Экспрессия CTP-DMO и локализация в протопластах сои

[0079] Анализ протопластов сои применяли для оценки относительной эффективности нацеливания хлоропласта рекомбинантного белка, содержащего один из пяти CTP, функционально связанных с последовательностью DMO (SEQ ID NO: 27). Для контроля распределения цитозоля и хлоропласта рекомбинантного белка, в кассету, кодирующую рекомбинантную комбинацию CTP и DMO (обозначенную в данном документе как CTP-DMO), добавляли последовательность, кодирующую зеленый флуоресцентный белок, в результате чего зеленый флуоресцентный белок сливался с карбокситерминальным концом DMO.

[0080] Протопласты получали из семядолей бобов (зародышевая плазма A3244). Собирали незрелые семенные стручки сои и семена (длиной 4-6 мм) удаляли с помощью стерильных методик. Семядоли из каждого семени удаляли вручную, поперечно нарезали на кусочки толщиной 1 мм и инкубировали в буфере CPW (рН 5,8) с 0,7 М маннита в течение 1 часа при 24-26° С в темноте при встряхивании при 40 об/мин. Затем буфер удаляли и заменяли на ферментный буфер (4% целлюлаза 'onozuka' R-10, 2% гемицеллулаза, 0,3% макерозим R-10, в буфере CPW (рН 5,8, с 0,49 М маннита). Ткань семядоли инкубировали на ротационном шейкере при 50 об /мин при 24-26°С в течение 2 часов. В конце этой инкубации протопласты сои высвобождали из ткани семядолей, вручную осуществляя вихревые движения пластинки и фильтруя суспензию через двойной слой из нейлоновой сетки 60 мкм в коническую пробирку объемом 50 мл. Протопласты осторожно однократно промывали с последующим ресуспендированием и центрифугированием. Конечный осадок ресуспендировали в буфере (4 мМ MES, рН 5,7, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2, 0,5 М маннита) и оставляли на 1 час на льду. Затем протопласты центрифугировали, а осадок ресуспендировали в буфере для трансформации (0,4 М маннитола, 15 мМ MgCl2, 4 мМ MES, рН 5,7). Объем корректировали для получения 1 × 10 000 000 протопластов/мл. Трансформацию осуществляли путем смешивания 12,5 мкг ДНК для каждой конструкции. ДНК аккуратно объединяли с 1,5 × 1 000 000 протопластов с последующим добавлением эквивалентного объема ПЭГ-буфера. Смесь инкубировали в течение 5 минут, затем медленно разбавляли 300 мкл буфера W5 (154 мМ NaCl, 125 мМ CaCl₂; 5 мM KCl; 2 мM MES, pH 5,7). Смесь инкубировали 5-10 минут и затем медленно добавляли 900 мкл буфера W5. Протопласты осаждали и ресуспендировали в буфере WI (0,5 М маннита, 4 мМ MES (рН 5,7), 20 мМ KCl) и инкубировали при температуре 24-26°C в темноте. Микроскопический анализ проводили с применением лазерного сканирующего микроскопа Zeiss LSM510 META (Carl Zeiss MicroImaging, Inc., Торнвуд, штат Нью-Йорк), оснащенный криптон-аргоновым ионным (458, 488 нм) лазером, зеленым (543 нм) гелий-неоновым лазером и набором красных фильтров FITC и Texas. Получение и анализ изображений выполняли с помощью ZEN 2012 v. 8. 1 (Carl Zeiss MicroImaging, Inc., Торнвуд, штат Нью-Йорк) и 40X водного 1. 2 светосильного объектива. Используемые длины волн возбуждения составляли 488 нм (GFP) и 543 нм (автофлуоресценция хлоропласта), а эмиссионные фильтры были 500-530 нм (GFP) и 630-700 нм (автофлуоресценция хлоропласта). В каждой конструкции оценивали по меньшей мере 50 отдельных клеток на предмет локализации конструкции: цитозоль, пластида, или и цитозоль и пластида. Результаты, которые регистрировались как процент клеток, имеющих белок, локализованный в цитозоле или пластиде (или и в цитозоле и в пластиде) от общего количества анализируемых клеток, представлены в Таблице 4.

Таблица 4. Анализ нацелевания на протопласты сои

CTP	Общее количество подсчитанных клеток	Цитозоль	Цитозоль и пластида	Пластида
APG6 (SEQ ID NO: 1)	58	0	0	100%
At.CR88 (SEQ ID NO: 3)	53	0	6%	94%
A	53	0	21%	79%
В	54	0	91%	9%
C	56	0	82%	18%
нет	55	100%	0	0

[0081] Из пяти проанализированных комбинаций CTP-DMO только APG6 CTP (SEQ ID NO: 1) обуславливала наличие 100% клеток, демонстрирующих локализацию белка исключительно в пластиде. At.CR88 CTP (SEQ ID NO: 3) обуславливала наличие 94% клеток, демонстрирующих локализацию белка исключительно в пластиде и 6% клеток, демонстрирующих локализацию белка в цитозоле и пластиде. 'A' CTP обуславливала наличие 79% клеток, демонстрирующих локализацию белка исключительно в пластидах, и 21% клеток, демонстрирующих локализацию белка в цитозоле и пластиде. 'B' CTP обуславливала наличие 9% клеток, демонстрирующих локализацию белка исключительно в пластидах, и 91% клеток, демонстрирующих локализацию белка в цитозоле и пластидах. 'C' CTP обуславливала наличие 18% клеток, демонстрирующих локализацию белка исключительно в пластидах, и 82% клеток, демонстрирующих локализацию белка в цитозоле и пластидах. Без CTP, белок присутствовал только в цитозоле. Эти результаты указывают на то, что комбинация APG6 CTP является эффективной для нацеливания CTP-DMO на пластиды на 100%, а At.CR88 CTP является эффективной для нацеливания CTP-DMO на пластиды на 94%.

Пример 2. Процессинг CTP-DMO в трансгенной пшенице

[0082] Трансгенные растения пшеницы, трансформированные конструкцией ДНК, содержащей молекулу рекомбинантной ДНК, кодирующую один из четырех отдельных CTP, функционально связанную с DMO, применяли для оценки экспрессии белка и для определения процессинга CTP.

[0083] Трансгенные растения пшеницы получали с помощью четырех различных векторов трансформации растений, каждый из которых содержал конструкцию ДНК, содержащую один из четырех различных CTP, функционально связанную с DMO, функционально связанного с промотором. Предварительно культивированные незрелые эмбрионы из пшеницы зародышевой плазмы Samson (PVP 1994) трансформировали с применением Agrobacterium tumefaciens для получения трансгенных ростков с помощью способов, известных специалистам в данной области техники. Образцы листьев отбирали для молекулярного анализа с целью подтверждения количества копий трансгена в геноме каждого уникального трансформанта, при этом растения R0 с одной копией трансгена самоопылялись, после чего собирали семена R1.

[0084] Семена (50 г) измельчали до порошка, который затем добавляли в 250 мл экстракционного буфера (1 × TBE (89 мМ Трис-борат, 2 мМ ЭДТК, рН 8,4), 200 мМ NaCl, 10% глицерин, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF), 5 мМ бензамидина, 2 мМ дитиотреитола (DTT), ингибиторы протеазы cOmplete™ (Roche Diagnostics Corporation, Индианаполис, штат Индиана)) и гомогенизировали с помощью Polytron® (VWR, Раднор, штат Пенсильвания) в течение около 20 секунд, затем инкубировали при встряхивании при 4°C в течение 1-2 часов. Смесь центрифугировали при 4°C в течение 25 мин при 9000 об/мин и супернатант осаждали последовательно с помощью 10% и 55% насыщенного сульфата аммония (AS), причем каждую стадию осаждения центрифугировали при 18000 об/мин в течение 20 минут. Сгусток из осадка 10% AS удаляли.

[0085] Сгусток из 10-55% фракции растворяли в 30 мл ФСБ (0,1 М фосфата натрия, 0,15 М NaCl) с 1 таблеткой ингибиторов протеазы cOmplete™. Растворенный сгусток центрифугировали и супернатант фильтровали через мембрану 0,22 мкм. Сыворотки с козьим поликлональным антителом против DMO смешивали с 1:1 суспензией белковой A/G агарозной смолы Pierce™ (ThermoFischer Scientific, Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк), через 1,5 часа белковую A/G агарозную смолу, нагруженную анти-DMO Ab, промывали 3 раза ФСБ и добавляли к около 30 мл 10% -55% AS фильтрованной фракции. После инкубации смолу центрифугировали и промывали 3 раза ФСБ, затем ресуспендировали в 1 мл ФСБ и переносили в микроцентрифужную пробирку и снова осаждали центрифугованием.

[0086] Конечный сгусток ресуспендировали в буфере 2X Laemmli, кипятили в течение 5 минут и образцы проганяли в 10% геле ДСН-ПААГ в трис-глициновом буфере при 185 В (постоянный ток). Белки в геле ДСН-ПААГ переносили на PVDF-мембрану с помощью буфера для переноса CAPS в течение 30 мин при 4°C и 100 В. Белки, связанные с мембраной PDVF, окрашивали голубым Кумасси в течение около 30 секунд, а полосу, соответствующую каждому из белков DMO в 10% -55% AS фракции, вырезали из пятна (блота) PVDF и применяли для анализа аминоконцевой последовательности белка. Аминоконцевое секвенирование белка проводили с помощью автоматизированного химического анализа расщепления по Эдману, причем каждый анализ проводили в течение 15 циклов с использованием автоматизированного химического анализа расщепления по Эдману. Для анализа и контроля с помощью программного обеспечения Procise Control (версия 2. 1) (ThermoFischer Scientific, Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк) применяли систему секвенирования Applied Biosystems 494 Procise® (Applied Biosystems 494 Procise® Sequencing System) с микроградиентным насосом 14°C и детектором Perkin Elmer серии 200 UV/Vis (Perkin Elmer Series 200 UV/Vis Detector). Хроматографические данные собирали с помощью программного обеспечения для анализа секвенирования белка SequencePro® (версия 2. 1). Идентичность констатировали для каждого белка, если наблюдали по меньшей мере 8 аминокислот, согласующихся с прогнозированной последовательностью ожидаемого белка. Результаты аминоконцевого секвенирования представлены в Таблице 5.

Таблица 5. Аминоконцевое секвенирование рекомбинантного белка

Тестируемый трансформант	CTP	DMO	Процессинг CTP-DMO
2	APG6 (SEQ ID NO: 1)	DMO (SEQ ID NO: 18)	DMO+1
3	At.CR88 (SEQ ID NO: 3)	DMO (SEQ ID NO: 18)	DMO и DMO+1
1	CTP4 (SEQ ID NO: 4)	DMO (SEQ ID NO: 19)	DMO+12
2	Os.Waxy (SEQ ID NO: 6)	DMO (SEQ ID NO: 18)	DMO+10 и DMO-1

[0087] Идентификаторы DMO, DMO+1, DMO+10 и DMO+12 применяли для обозначения того, что в результате секвенирования белка на аминотерминальном конце DMO после процессинга оставалось 0, 1, 10 или 12 аминокислот CTP, соответственно. Идентификатор DMO-1 применяли для обозначения того, что первый метионин DMO удалялся после процессинга. Два уникальных трансформанта тестировали на предмет CTP APG6 (SEQ ID NO: 1), функционально связанной с DMO (SEQ ID NO: 18). Оба образца продемонстрировали одну аминокислоту CTP, оставшуюся на аминотерминальном конце DMO после процессинга (DMO+1). Два уникальных объекта анализировали на предмет At.CR88 CTP (SEQ ID NO: 3), функционально связанной с DMO (SEQ ID NO: 18). Все три образца продемонстрировали либо отсутствие, либо одну аминокислоту CTP, оставшуюся на аминотерминальном конце DMO после процессинга (DMO и DMO+1). Трансформант, протестированный из CTP4 (SEQ ID NO: 4), функционально связанного с DMO (SEQ ID NO: 19), продемонстрировал двенадцать аминокислот CTP, оставшихся на аминотерминальном конце DMO после процессинга (DMO+12). Два уникальных трансформанта тестировали на предмет Os.Waxy CTP (SEQ ID NO: 6), функционально связанной с DMO (SEQ ID NO: 18). Один образец продемонстрировал десять аминокислот CTP, оставшихся на аминотерминальном конце DMO после процессинга (DMO+10), и один образец продемонстрировал удаление первого метионина DMO после процессинга (DMO-1). Эти результаты указывают на то, что CTP APG6 и At.CR88 CTP эффективно процессируются из DMO при экспрессии в трансгенных растениях.

Пример 3. Экспрессия CTP-DMO в трансгенной Brassica napus

[0088] Способность конструкций ДНК, содержащих рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую один из трех отдельных CTP, функционально связанный с DMO, обеспечивать толерантность к дикамбе, оценивали с помощью трансгенных растений Brassica napus.

[0089] Трансгенные растения Brassica napus получали с помощью трех различных векторов трансформации растений, каждый из которых содержал конструкцию ДНК, содержащую один из трех различных CTP, функционально связанный с DMO, функционально связанного с промотором. Разновидность 65037 линии Restorer Brassica napus применяли для Agrobacterium-опосредованной трансформации и выращивали растения R0 в теплице. Уникальные трансформанты скринировали на предмет числа копий трансгена. Растения R0 с одной копией трансгена подвергали самоопылению, после чего собирали семена R1.

[0090] Толерантность к дикамбе оценивали с применением растений R0 с одной копией трансгена с векторным остовом или двумя копиями трансгена. Толерантность к дикамбе определяли при показателе пораженности 20% растения или менее, обусловленного дикамбой в условиях теплицы. Трансформанты R0 в горшках разделяли на три группы, а дикамбу (Clarity®) применяли в одном из трех количеств: (1) дикамбу не применяли, (2) 1 фунт к.э./акр дикамбы (количество 2X), или (3) 2 фунта к.э./акр дикамбы (количество 4X). Трансгенные растения опрыскивали, а оценку пораженности проводили через 21 день. Растения, содержащие комбинацию ʺAʺ CTP, функционально связанную с DMO (SEQ ID NO: 21), не продемонстрировали каких-либо трансформантов, толерантных к дикамбе. Растения, содержащие RbcS CTP (SEQ ID NO: 5), функционально связанную с DMO (SEQ ID NO: 21), продемонстрировали 8 из 9 трансформантов, характеризующихся толерантностью к дикамбе в количестве 2Х, и 7 из 7 трансформантов, характеризующихся толерантностью к дикамбе в количестве 4Х. Растения, содержащие APG6 CTP (SEQ ID NO: 1), функционально связанную с DMO (SEQ ID NO: 20), продемонстрировали 7 из 14 трансформантов, характеризующихся толерантностью к дикамбе в количестве 2Х, и 6 из 18 трансформантов, характеризующихся толерантностью к дикамбе в количестве 4Х. Результаты приведены в Таблице 6.

Таблица 6. Толерантность растений рода капусты (Brassica napus) R0 к дикамбе

CTP	DMO	Трансформанты с толерантностью к 2X	Трансформанты с толерантностью к 4X
APG6 (SEQ ID NO: 1)	SEQ ID NO: 20	7/14	6/18
RbcS (SEQ ID NO: 5)	SEQ ID NO: 21	8 /9	7/7
A (Конструкция 7)	SEQ ID NO: 21	0	0

[0091] Толерантность к дикамбе оценивали на растениях R0 с одной копией трансгена. В теплице растения опрыскивали дикамбой (Clarity) в количестве 1 фунт к.э./акр (количество 2Х), а толерантность к дикамбе оценивали через 14-21 день. Растения, содержащие комбинацию APG6 CTP, функционально связанную с DMO (SEQ ID NO: 20), продемонстрировали 13 трансформантов из 31, характеризующихся толерантностью к дикамбе. Растения, содержащие RbcS CTP, функционально связанную с DMO (SEQ ID NO: 21), продемонстрировали 13 трансформантов из 17, характеризующихся толерантностью к дикамбе. Растения, содержащие ʺAʺ CTP, функционально связанную с DMO (SEQ ID NO: 21), продемонстрировали 7 трансформантов из 18, характеризующихся толерантностью к дикамбе. Результаты приведены в Таблице 7.

Таблица 7. Толерантность растений рода капусты (Brassica napus) R0 к дикамбе

CTP	DMO	Трансформанты с толерантностью к 2X
APG6 (SEQ ID NO: 1)	SEQ ID NO: 20	13/31
RbcS (SEQ ID NO: 5)	SEQ ID NO: 21	13/17
A (Конструкция 7)	SEQ ID NO: 21	7/18

[0092] Десять семян от каждого из 28 растений R1, содержащих CTP APG6, функционально связанную с DMO (SEQ ID NO: 20) (APG6+DMO), и десять семян от каждого из 17 растений R1, содержащих RbcS CTP, функционально связанную с DMO (SEQ ID NO: 21 ) (RbcS+DMO), выращивали в теплице. Растения опрыскивали дикамбой в количестве 2 фунта к.э./акр (4X) в день посадки, затем - 1 фунт к.э./акр (2X) дикамбы в фазе V3 и 1 фунт к.э./акр дикамбы(2X) при первом цветении (цветение определяли как > 90% растений, имеющих бутоны, и около 25% растений, имеющих по меньше мере один открытый цветок). Оценку пораженности проводили через семь дней после каждого опрыскивания и выражали в виде процентного показателя пораженности по сравнению с группами с контрольным опрыскиванием. Среди растений, содержащих APG6+DMO, было в общей сложности 9 потомков от 2 трансформантов с показателем пораженности дикамбой ≤ 20% в каждом из трех периодов оценки. Среди растений, содержащих RbcS+DMO, зарегистрировано 77 растений среди 16 трансформантов с толерантностью к дикамбе менее 20% в каждом из трех периодов оценки.

[0093] Белок характеризовали с применением листьев, собранных от трансформантов R0. Ткань листьев измельчали в жидком азоте и экстрагировали двумя объемами 2X буфера Лэммли (BioRad, Геркулес, штат Калифорния), содержащим 10% 2-меркаптоэтанола и 5 мМ DTT. Образцы кипятили и 10 мкл загружали в 4-20% готовый гель Criterion™ (BioRad, Геркулес, штат Калифорния) и анализировли в буфере Трис/глицин/SDS при 250 В в течение 45 минут. Белок в геле переносили на мембрану PVDF при 400 мА в течение 30 минут в буфере Трис/глицин, содержащем 20% метанола. Белок DMO обнаруживали с применением поликлональной кроличьей антисыворотки анти-DMO и HRP-конъюгированного анти-кроличьего вторичного антитела. Сигнал обнаруживали с применением хемилюминесцентного набора SuperSignal™ West Pico (Thermo Fisher Scientific, Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк). Для каждого из трех трансформантов, содержащих APG6-DMO, регистрировали одну полосу около 38 кДа, которая имела ожидаемый размер для полностью процессированного белка DMO. Для каждого из шести трансформантов, содержащих RbcS-DMO, регистрировали две полосы около 38 кДа и около 41 кДа. Полоса 41 кДа соответствует DMO+27, и о ней ранее сообщалась в сое, содержащей RbcS-DMO (патент США №7838729). Регистрировали очень низкий уровень экспрессии белка DMO во всех трансформантах, содержащих ʺAʺ CTP-DMO, а сигнал, обнаруженный после длительного воздействия, представлял собой полосу около 50 кДа и полосу около 39 кДа. Полоса 50 кДа приближалась к ожидаемому размеру непроцессированного ʺAʺ CTP-DMO. Эти результаты показывают, что APG6-DMO продуцирует одну полосу ожидаемого размера, соответствующую полностью процессированному DMO.

[0094] Рекомбинантный белок очищали из ткани листьев растений R0, содержащих APG6-DMO или RbcS-DMO. Анализ аминоконцевой последовательности проводили с помощью описанного химического анализа расщепления по Эдману. Анализ аминоконцевой последовательности подтвердил наличие DMO аминоконцевых последовательностей DMO+27 и DMO-1, присутствующих в растениях, содержащих RbcS-DMO, соответствующих размеру полос DMO, регистрируемых при анализе вестерн-блот. Анализ аминоконцевой последовательности подтвердил наличие только DMO-аминоконцевых последовательностей DMO+1, присутствующих в растениях, содержащих APG6-DMO, соответствующих размеру полос DMO, регистрируемых при анализе вестерн-блот. Этот результат подтверждает, что применение APG6 CTP приводит к полному процессингу функционально связанного DMO в растениях.

Пример 4. Экспрессия CTP-DMO в трансгенной кукурузе

[0095] Экспрессия конструкций ДНК, содержащих рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую один из двух отдельных CTP, функционально связанный с DMO, анализировали в трансгенных клетках и растениях кукурузы.

[0096] Транзиентную трансформацию протопласта мезофилла кукурузы применяли для оценки относительной экспрессии DMO двух комбинаций CTP-DMO. Указанные конструкции ДНК были идентичны, за исключением того, что CTP, функционально связанный с DMO (SEQ ID NO: 18), представлял собой либо APG6 (SEQ ID NO: 1), либо CTP4 (SEQ ID NO: 4). Протопласты получали в основном так, как описано в Примере 1. После трансформации клетки собирали, а уровни белка DMO определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Протеин из четырех трансформированных образцов протопластов измеряли для каждой комбинации CTP-DMO в нанограммах (нг) DMO на миллиграмм (мг) общего белка. Протопласты, трансформированные APG6-DMO, имели приблизительно в 4 раза более высокие уровни DMO по сравнению с протопластами, трансформированными CTP4-DMO. Данные представлены в Таблице 8.

[0097] Трансгенные растения кукурузы получали с применением указанных конструкций ДНК, и выращивали растения R0. Образцы листьев собирали из растений R0, представляющих восемь уникальных однокопийных трансформантов, и применяли для количественного ИФА с целью измерения уровней DMO. Экспрессия DMO в ткани листьев R0 была приблизительно в 4 раза выше у трансформантов, содержащих APG6-DMO, по сравнению с трансформантами, содержащими CTP4-DMO. Данные представлены в Таблице 8.

[0098] Аминоконцевое секвенирование проводили для DMO, экспрессируемого в трансгенных растениях кукурузы. Белок очищали из трансгенных растений кукурузы, экспрессирующих CTP4-DMO или APG6-DMO, и готовили для расщепляющего секвенирования по Эдману, по существу, как описано в Примере 2. Анализ аминоконцевой последовательности подтвердил наличие DMO аминоконцевых последовательностей DMO+6, DMO+7 и DMO+12 в растениях, содержащих CTP4-DMO. Анализ аминоконцевой последовательности подтвердил наличие DMO аминоконцевых последовательностей DMO and DMO+1 в растениях, содержащих APG6-DMO. Эти результаты показывают, что процессинг CTP является более полным с APG6 по сравнению с CTP4, о чем свидетельствует меньшее количество аминокислот CTP, оставшихся на аминотерминальном конце DMO. Данные представлены в Таблице 8.

Таблица 8. Экспрессия белка DMO в кукурузе

CTP	Уровни DMO протопласта (нг/мг) (СО)	Уровни DMO растения R0 (нг/мг) (СО)	Процессинг CTP-DMO
APG6 (SEQ ID NO: 1)	12,44 (1,91)	5,44 (0,82)	DMO и DMO+1
CTP4 (SEQ ID NO: 4)	3,10 (0,64)	1,19 (0,55)	DMO+12, DMO+7 и DMO+6

[0099] Трансгенную кукурузу генерировали посредством трансформации, опосредованной Agrobacterium, с помощью способов, известных специалистам в данной области техники, с конструкцией ДНК, содержащей молекулу рекомбинантной ДНК, кодирующую APG6-DMO или CTP4-DMO. Толерантность к дикамбе оценивали в испытании в поле для трансгенных гибридных растений F1. Испытание в поле включало четыре обработки в двух местах с двумя повторениями каждая. Четыре обработки были следующие: (1) дикамба (Clarity®), применяемая в количестве 2 фунта к.э./акр (4X) в фазе V2, затем - V4, и затем - V8; (2) дикамба, применяемая в количестве 4 фунта к.э./акр (8X) в фазе V2, затем - V4, и затем - V8; (3) дикамба, применяемая в количестве 8 фунтов к.э./акр (16X) в фазе V2, затем - V4, и затем - V8; и (4) дикамба, применяемая в количестве 16 фунтов к.э./акр (32X) в фазе V2, затем - V4, и затем - V8. Пораженность культур оценивали через десять дней после обработки и определяли как процент пораженных культур на V-фазу (CIPV2, CIPV4 или CIPV8). В конце сезона зерно собирали, а урожай измеряли в бушелях/акр. Как для оценки пораженности в фазах CIPV, так и для оценки пораженнности урожая рассчитывали наименьшую значимую разницу (НЗР) с вероятностью 5% (р=0,05). Самые высокие количества дикамбы (16X и 32X), наносимые на гибридные растения F1, содержащие APG6-DMO, обуславливали несколько меньшее вегетативное поражение и более высокий урожай зерна по сравнению с растениями, содержащими CTP4-DMO. Данные представлены в Таблице 9.

Таблица 9. Испытание в поле гибридного растения F1 на предмет пораженности, вызванной дикамбой, и урожайности

Дикамба	CTP-DMO	CIPV2 (НЗР=0,05)	CIPV4 (НЗР=0,05)	CIPV8 (НЗР=0,05)	Урожайность бу/акр (НЗР=0,05)
	CTP4-DMO	0,75 (4,7)	0,75 (7,1)	4,25 (4,6)	239,13 (21,17)
	APG6-DMO	0,75 (4,7)	2 (7,1)	3 (4,6)	231,99 (21,17)
Отрицательный контроль	40,63 (4,7)	45 (7,1)	49,38 (4,6)	58,25 (21,17)
	CTP4-DMO	2 (5,4)	1,25 (6,6)	7,5 (5,3)	232,87 (17,11)
	APG6-DMO	1,5 (5,4)	2 (6,6)	7,5 (5,3)	230,44 (17,11)
Отрицательный контроль	46,875 (5,4)	65 (6,6)	80 (5,3)	5,69 (17,11)
	CTP4-DMO	2,5 (8,4)	4 (5,3)	15 (6,7)	206,63 (28,15)
	APG6-DMO	1,5 (8,4)	4 (5,3)	11,25 (6,7)	242,37 (28,15)
Отрицательный контроль	73,125 (8,4)	81,25 (5,3)	87,375 (6,7)	3,51 (28,15)
	CTP4-DMO	6,25 (4,8)	8,75 (3,1)	16,25 (0)	199,8 (18,35)
	APG6-DMO	2 (4,8)	5,75 (3,1)	17,5 (0)	212,34 (18,35)
Отрицательный контроль	82,5 (4,8)	90,625 (3,1)	99,5 (0)	5,03 (18,35)

Пример 5. Экспрессия CTP-DMO в трансгенном хлопчатнике и сое

[00100] APP6 CTP оптимизировали для повышения эффективности трансляции белка (синтез белка) и увеличения накопления белка. Оптимизированная композиция APG6 CTP (SEQ ID NO: 2) характеризуется изменением аминокислоты треонина (Т) на серин (S) в положениях 3 и 4 APP6 CTP (SEQ ID NO: 1). Были созданы конструкции ДНК для сравнения двух CTP, каждый из которых является функционально связанным с DMO в сое.

[00101] Трансгенные растения сои создавали с помощью двух конструкций ДНК, которые были идентичны, за исключением APG6 CTP. Первая конструкция ДНК содержала APG6 (SEQ ID NO: 1), функционально связанный с DMO (SEQ ID NO: 18). Вторая конструкция ДНК содержала оптимизированный APG6 (SEQ ID NO: 2), функционально связанный с DMO (SEQ ID NO: 18). Каждую конструкцию ДНК применяли для трансформации сои A3555 с помощью способов трансформации, опосредованных Agrobacterium. После трансформации, трансгенные растения R0, содержащие одну копию трансгена, идентифицировали с помощью анализа ПЦР. Растения R0 с одной копией трансгена выращивали в теплице, а семена R1 собирали. Десять семян R1 на один трансформант для 4 трансформантов, сгенерированных с помощью каждой из двух конструкций ДНК, и семена AG3555 высаживали для оценки толерантности культуры к послевсходовой обработке дикамбой в стандартных тепличных условиях выращивания. Дикамбу (Clarity) применяли в фазе V4 в количестве 1120 г аи/га. Оценку пораженности культуры проводили через 10 дней после обработки. Образцы листьев от толерантных к дикамбе растений сои отбирали для измерений уровня рекомбинантного белка и анализа аминоконцевой последовательности. Уровень белка DMO, определяемый с помощью ИФА, составлял 13,35 ± 2,7 нг/мг для однокопийных растений R1 трансгенной сои, толерантных к дикамбе, с APG6 CTP (SEQ ID NO: 1), функционально связанной с DMO (SEQ ID NO: 18). Уровень белка DMO, определяемый с помощью ИФА, составлял 18,55 ± 3,1 нг/мг для однокопийных растений R1 трансгенной сои, толерантных к дикамбе, с оптимизированной APG6 CTP (SEQ ID NO: 2). В ткани листьев сои A3555 из группы отрицательного контроля никакого белка DMO не обнаруживали. Показатель пораженности, обусловленной дикамбой, у однокопийных растений R1 трансгенной сои с APG6 CTP (SEQ ID NO: 1), функционально связанной с DMO (SEQ ID NO: 18), определяли на уровне 3,6%. Показатель пораженности, обусловленной дикамбой, у однокопийных растений R1 трансгенной сои с оптимизированной APG6 CTP (SEQ ID NO: 2), функционально связанной с DMO (SEQ ID NO: 18), определяли на уровне 2,7%. У сои A3555 из группы отрицательного контроля показатель пораженности, обусловленных дикамбой, составил 99,8%. Образцы листьев от однокопийных растений R1 трансгенной сои, толерантных к дикамбе, применяли для аминоконцевого секвенирования (как описано в Примерах 2 и 4). Анализ аминоконцевой последовательности подтвердил, что процессинг APG6-DMO и оптимизированной APG6-DMO приводит к полному процессингу CTP из аминоконца белка DMO. Уровни DMO, показатель пораженности, обусловленной дикамбой, и процессинг APG6-DMO продемонстрировали, что как APG6, так и оптимизированный APG6, если они функционально связаны с DMO, обеспечивают толерантность к дикамбе, и оба CTP подвергаются полному процессингу в растениях. Данные представлены в Таблице 10.

Таблица 10. Тестирование сои R1 в теплице

CTP	Уровни DMO листьев (нг/мг)	Пораженность, вызванная дикамбой фаза V4	APG6-DMO процессинг
APG6 SEQ ID NO: 1	13,35 ± 2,7	3,6%	DMO
Оптимизированный APG6 SEQ ID NO: 2	18,55 ± 3,1	2,7%	DMO
Отрицательный контроль A3555	Не обнаружено	99,8%	неприменимо

[00102] Трансгенные растения хлопчатника создавали с помощью двух конструкций ДНК, которые были идентичны, за исключением APG6 CTP. Первая конструкция ДНК содержала APG6 (SEQ ID NO: 1), функционально связанный с DMO (SEQ ID NO: 18). Вторая конструкция ДНК содержала оптимизированную APG6 CTP (SEQ ID NO: 2), функционально связанную с DMO (SEQ ID NO: 18). Каждую конструкцию ДНК трансформировали в хлопчатник с помощью способов трансформации, опосредованных Agrobacterium, и известных в данной области техники. После трансформации, трансгенные растения хлопчатника R0, содержащие одну копию трансгена, идентифицировали с помощью анализа ПЦР, выращивали в теплице, и собирали семена R1. Десять семян R1 на один трансформант для 10 трансформантов для каждой конструкции и семена хлопчатника DP393 высаживали для оценки толерантности культуры к послевсходовой обработке дикамбой. Дикамбу (Clarity) применяли в фазе V4 в количестве 1120 г аи/га. Процентную оценку пораженности культуры проводили через 9 дней после обработки. Образцы листьев толерантных растений хлопчатника использовали для измерения уровня белка и анализа аминоконцевой последовательности APG6-DMO и оптимизированной APG6-DMO. Уровень белка DMO, определяемый с помощью ИФА, составил 176,2 ± 103 нг/мг для однокопийных растений R1 трансгенного хлопчатника, толерантных к дикамбе, с APG6 CTP (SEQ ID NO: 1), функционально связанной с DMO (SEQ ID NO: 18). Уровень белка DMO, определяемый с помощью ИФА, составил 136,5 ± 58,6 нг/мг для однокопийных растений R1 трансгенного хлопчатника, толерантных к дикамбе, с оптимизированной APG6 CTP (SEQ ID NO: 2). В ткани листьев хлопчатника DP393 из группы отрицательного контроля никакого белка DMO не обнаруживали. Показатель пораженности, обусловленной дикамбой, у однокопийных растений R1 трансгенного хлопчатника с APG6 CTP (SEQ ID NO: 1), функционально связанной с DMO (SEQ ID NO: 18), определяли на уровне 2,6%. Показатель пораженности, обусловленной дикамбой, у однокопийных растений R1 трансгенного хлопчатника с оптимизированной APG6 CTP (SEQ ID NO: 2), функционально связанной с DMO (SEQ ID NO: 18), определяли на уровне 2,2%. Показатель пораженности хлопчатника DP393 из группы отрицательного контроля составил 85%. Образцы листьев от однокопийных растений R1, толерантных к дикамбе, применяли для аминоконцевого секвенирования (как описано в Примерах 2 и 4). Анализ аминоконцевой последовательности подтвердил, что процессинг APG6-DMO и оптимизированной APG6-DMO приводит к полному процессингу CTP из аминоконца белка DMO. Уровни экспрессии белка DMO, показатель пораженности, обусловленной дикамбой, и процессинг APG6-DMO и оптимизированной APG6-DMO продемонстрировали, что как APG6, так и оптимизированный APG6, если они функционально связаны с DMO, обеспечивают толерантность к дикамбе, и оба CTP подвергаются полному процессингу в растениях. Данные представлены в Таблице 11.

Таблица 11. Тестирование хлопчатника R1 в теплице

CTP	Уровни DMO листьев (нг/мг)	Пораженность, вызванная дикамбой, % фаза V4	Процессинг APG6-DMO
APG6 (SEQ ID NO: 1)	176,2 ± 103	2,6%	DMO
Оптимизированный APG6 (SEQ ID NO: 2)	136,5 ± 58,6	2,2%	DMO
Отрицательный контроль DP393	Не обнаружено	85%	неприменимо

Пример 6. Экспрессия CTP-PPO в трансгенной кукурузе

[00103] Новые PPO, которые являются толерантными к гербицидам PPO, идентифицировали с помощью скрининговой системы, использующей гербициды и бактерии. Эта скрининговая система анализировала рост нокаутного штамма E. coli в жидкой среде LB с гербицидом PPO для идентификации PPO, которые не чувствительны к гербициду PPO.

[00104] Нокаутный штамм E. coli трансформировали бактериальным экспрессионным вектором, содержащим подтвержденную активность PPO и культивировали в жидкой среде LB. К среде добавляли очищенную кристаллическую форму одного из пяти различных гербицидов PPO (ацифлуорфен (1 мМ), флумиоксазин (0,5 мМ), лактофен (0,5 мМ), фомесафен (1 мМ) и S-3100 (100 мкМ), представляющей три разных химических подкласса PPO. Рекомбинантные белки экспрессировали и измеряли темпы роста E. coli Кривые роста (OD600) анализировали для разных вариантов в присутствии и отсутствии гербицидов PPO в выбранных моментах времени от момента времени "0" до момента времени "24 часа". Рост трансформированного нокаутного штамма E. coli в среде LB в присутствии гербицида PPO указывает на то, что ген, применяемый для трансформации E. coli, кодировал невосприимчивую к гербицидам протопорфириногеноксидазу (iPPO).

[00105] Обнаружено, что десять PPO, представленные как SEQ ID NO: 40-49, обеспечивают нормальные темпы роста на нокаутного штамма E. coli в среде LB в присутствии гербицида PPO, что указывает на то, что эти белки представляют собой невосприимчивые к гербицидам протопорфириногеноксидазы (iPPO). Нокаутный штамм E. coli, экспрессирующий WH_PPO (SEQ ID NO: 60), был чувствителен ко всем пяти гербицидам PPO, подтверждая то, что анализ был способен различать чувствительные и нечувствительные PPO для каждого из гербицидов.

[00106] Были созданы четыре вектора трансформации растений для экспрессии PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43) в условиях поля. Конструкции трансформации 1 и 11 имели такую же комбинацию промотора плюс лидер плюс интрон, ту же последовательность 3'UTR, тот же PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43), но отличались последовательностями CTP и применялись для трансформации сои. Конструкции трансформации 6 и 16 имели такую же комбинацию промотора плюс лидер плюс интрон, ту же последовательность 3'UTR, тот же PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43), но отличались последовательностями CTP и применялись для трансформации кукурузы. В Таблице 12 представлена конфигурация конструкций трансформации растений PPO H_N10.

Таблица 12. Конфигурация конструкции с PPO H_N10

Трансформация культуры	Конструкция	CTP	CTP SEQ ID NO
Соя и хлопчатник	1	APG6	SEQ ID NO: 1
Соя	11	12G088600TP	SEQ ID NO: 38
Кукуруза	6	APG6	SEQ ID NO: 1
16	12G088600TP	SEQ ID NO: 38

[00107] Ферменты PPO экспрессировали в трансгенных растениях кукурузы, а трансгенные растения анализировали на предмет толерантности к гербициду PPO. Были сконструированы векторы трансформации растений, содержащие рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую один из ферментов PPO, представленные как SEQ ID NO: 40-59. Последовательность ДНК, кодирующая фермент РРО, может включать на 5'-конце кодон для метионина, обычно известный как стартовый кодон, или этот кодон можно исключить с целью облегчения функциональной связи последовательности транзитного пептида хлоропластаста с 5'-концом кодирующей последовательности. Примеры белковых последовательностей фермента PPO, содержащих метионин на аминоконце, представлены как SEQ ID NO: 40-49. Примеры белковых последовательностей фермента PPO, не содержащих метионин на аминоконце, представлены как SEQ ID NO: 50-59. Для трансформации растений, нуклеотидные последовательности, кодирующие предполагаемые ферменты РРО, оптимизировали кодоном с целью либо двудольной, либо двудольной экспрессии. В Таблице 2 представлены SEQ ID NO, соответствующие белковым и нуклеотидным последовательностям ферментов PPO в векторах трансформации.

[00108] При тестировании кукурузы в условиях поля кукурузу (LH244) трансформировали, применяя Agrobacterium tumefaciens и стандартные способы, известные в данной области техники. Трансгенные растения F1, полученные в результате ауткроссинга однокопийных растений R0, экспрессирующих H_N10 (SEQ ID NO: 43) в одной из двух конфигураций конструкции, были протестированы в теплице на предмет толерантности к гербициду. Растения обрабатывали гербицидом S-3100 в количестве 40 г/га в фазе роста V3, и через семь дней после обработки оценивали показатель пораженности. Среди трансгенных растений кукурузы, экспрессирующих H_N10 (SEQ ID NO: 43) в конфигурации конструкции 6 (APG6 (SEQ ID NO: 1), функционально связанной с PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43)), получили 13 из 18 трансформантов, продуцирующих растения с высокой толерантностью (10% или меньше поражений), тогда как в результате применения конфигурации конструкции 16 (12G088600TP (SEQ ID NO: 38), функционально связанной с PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43)), не получили трансформантов, продуцирующих растения с высокой толерантностью.

[00109] Трансгенные растения F1, полученные в результате ауткроссинга однокопийных растений R0, экспрессирующих H_N10 (SEQ ID NO: 43) в одной из двух конфигураций конструкции (конструкции 6 и 16), были протестированы в поле на предмет толерантности к гербициду. Эта популяция F1 была сегрегированной (50% гемизиготных и 50% нулевых), причем селекцию для трансгенных растений до оценки пораженности не проводили. Ожидается, что общий средний показатель пораженности для такой популяции будет выше, чем для гомогенной трансгенной популяции, поскольку нетрансгенные растения среди трансгенных растений обнаружить трудно. Испытания проводили в двух местах с двумя повторениями и 3 обработками на каждую конструкцию. В качестве отрицательного контроля применяли нетрансгенные растения кукурузы. Обработки с нанесением гербицидов проводили следующим образом: Обработку 1 осуществляли гербицидом S-3100 в количестве 0,036 фунтов аи/акр, наносимым в V2, затем - в V4, а затем - V8; Обработку 2осуществляли гербицидом S-3100 в количестве 0. 072 фунтов аи/акр, наносимым в V2, затем - в V4, а затем - V8; Обработку 3осуществляли гербицидом S-3100 в количестве 0. 144 фунтов аи/акр, наносимым в V2, затем - в V4, а затем - V8. Процентный показатель пораженности культуры оценивали в фазе роста V2 (CIPV2) и в фазе роста V4 (CIPV4) на 5-7 день после обработки (ошибка V2 и ошибка V4 составляют половину наименьшей значимой разницы (НЗР)). Оценку пораженности культуры комбинировали для обоих мест. Все нетрансгенные растения и растения с трансформантами, генерируемыми с помощью конструкции 16 (12G088600TP (SEQ ID NO: 38), функционально связанной с PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43)), продемонстрировали показатель пораженности от 94,6 до 99,5% после применения гербицида как в фазе V2, так и в фазе V4 для каждой из трех обработок. Все растения с трансформантами, генерируемыми с помощью конструкции 6 (APG6 (SEQ ID NO: 1), функционально связанной с PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43)), продемонстрировали только 30% -50% пораженность после применения гербицида в фазе V2 и отсутствие пораженности после применения гербицида в фазе V4. Данные представлены в Таблице 13.

Таблица 13. Полевое испытание эффективности кукурузы F1, содержащей PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43)

Обра-ботка	Конструкция	CTP	CTP SEQ ID NO	CIPV2	CIPV4	Ошибка V2	Ошибка V4
Обр 1	отрицательный контроль	н/д	н/д	94,6	99	8,6	1,2
	6	APG6	1	37,5	0	8,6	1,2
16	12G088600TP	38	96,3	98,5	8,6	1,2
Обр 2	отрицательный контроль	н/д	н/д	99,5	99,5	5,4	0
	6	APG6	1	37,5	0	5,4	0
16	12G088600TP	38	99,5	99,5	5,4	0
Обр 3	отрицательный контроль	н/д	н/д	99,5	99,5	0	0
	6	APG6	1	50	0	0	0
16	12G088600TP	38	99,5	99,5	0	0

[00110] Данные исследований трансгенной кукурузы F1 в теплице и в поле продемонстрировали, что APG6 (SEQ ID NO: 1), функционально связанный с PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43)), приводил к снижению показателей пораженности при экспрессии в трансгенных растениях по сравнению с показателями пораженности, наблюдаемыми, когда 12G088600TP (SEQ ID NO: 38), функционально связанный с PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43), экспрессировался в трансгенных растениях. См. Фигуру 1.

[00111] Были созданы векторы трансформации растений для экспрессии в условиях поля либо PPO H_N40 (SEQ ID NO: 54), либо PPO H_N90 (SEQ ID NO: 50), функционально связанных с APG6 (SEQ ID NO: 1), CTP D или CTP E. Кукурузу (01DKD2) трансформировали, применяя Agrobacterium tumefaciens и стандартные способы, известные в данной области техники. Образцы листьев, взятые из полученных растений R0, анализировали с помощью ПЦР для определения количества копий трансгенной вставки. Растения R0, каждое из которых содержало уникальный трансформант, опрыскивали гербицидом S-3100 в количестве 40 г аи/га или 80 г аи/га приблизительно в фазе роста V5, и через 4-7 дней после обработки осуществляли оценку пораженности. Регистрировали количество растений с ≤10% пораженностью (высокая толерантность) или ≤20% пораженностью (толерантность) от общего количества орошенных растений. Растения, которые были определены как однокопийные трансформанты и после опрыскивания характеризовались пораженностью ≤20%, подвергались самоопылению и ауткроссингу. Данные представлены в Таблице 14.

Таблица 14. Оценка толерантности трансгенной кукурузы к гербицидам CTP-PPO

Конфигурация конструкции	CTP	PPO	Количество S-3100 (г аи/га)	≤ 10% пораженность	≤ 20% пораженность
17	APG6	H_N40	80	42/112 (37,5%)	65/112 (58%)
17	D	H_N40	80	0/46 (0%)	1/46 (2,2%)
17	E	H_N40	40	0/101 (0%)	13/101 (12,9%)
17	APG6	H_N90	40	55/112 (49,1%)	63/112 (56,3%)
18	APG6	H_N40	80	45/112 (40,2%)	66/112 (58,9%)
18	E	H_N40	40	9/112 (8%)	36/112 (32,1%)
19	APG6	H_N40	80	12/56 (21,4%)	23/56 (41,1%)
19	E	H_N40	40	3/112 (2,7%)	9/112 (8,0%)

[00112] Полученные результаты демонстрируют, что APG6 (SEQ ID NO: 1) последовательно продуцировал более высокую толерантность к гербицидам по сравнению с растениями, трансформированными CTP D или CTP E, когда они функционально связаны с H_N40 (SEQ ID NO: 54) или H_N90 (SEQ ID NO: 50). APG6, когда он являлся функционально связанным с H_N40, приводил к тому, что от 21,4% до 40,2% трансгенных растений характеризовались высокой толерантностью, и от 41,1% до 58,9% трансгенных растений были толерантными к S-3100 при применении в количестве 80 г аи/га. APG6, когда он являлся функционально связанным с H_N90, приводил к тому, что 49,1% трансгенных растений характеризовались высокой толерантностью, и 56,3% трансгенных растений были толерантными к S-3100 при применении в количестве 40 г аи/га. CTP D, когда он являлся функционально связанным с H_N40, приводил к тому, что 0% трансгенных растений характеризовались высокой толерантностью, и 2,2% были толерантными к S-3100 при применении в количестве 80 г аи/га. CTP E, когда он являлся функционально связанным с H_N40, приводил к тому, что от 0% до 8% трансгенных растений характеризовались высокой толерантностью, и 12. 9% to 32. 1% были толерантными к S-3100 при применении более низкого количества гербицида 40 г аи/га.

[00113] Трансгенную гибридную кукурузу F1, экспрессирующую APG6, функционально связанный с PPO H_N10, оценивали на предмет толерантности к семи различным гербицидам PPO: S-3100, фомесафену, ацифлуорфену, лактофену, флумиоксазину, сульфентразону, и сафлюфенацилу. Собранные вместе семена, представляющее 5 уникальных трансформантов, высаживали в горшки в теплице вместе с гибридным семенами кукурузы в качестве отрицательного контроля.

[00114] Для анализа довсходовой толерантности к гербицидам, гербициды PPO применяли индивидуально в одном из двух количеств с шестью повторениями на обработку следующим образом: S-3100 (80 или 160 г аи/га), фомесафен (Рефлекс®, 840 или 1680 г аи/га), флумиоксазин (Валор® SX, 210 или 420 г аи/га), сульфантразон (Спартан® 4L, 840 или 1680 г аи/га) и сафлуфенацил (Шарпен®, 200 или 400 г аи/га). Растения оценивали на предмет процентного показателя пораженности культуры через 20 дней после обработки, а семена кукурузы были включены в качестве отрицательного контроля. Трансгенные растения с APG6, функционально связанным с PPO H_N10, характеризовались показателем пораженности для различных применений гербицидов PPO до появления всходов в пределах от 0% до 5,8%, что указывает на то, что APG6, функционально связанный с PPO H_N10, обеспечивает отличную довсходовую толерантность кукурузы при обоих количествах гербицидов для всех пяти гербицидов PPO. Растения кукурузы из группы отрицательного контроля характеризовались показателем пораженности от 17,5% до 94,2%, за исключением применения сафлуфенацила, что было ожидаемым, поскольку этот гербицид продается для применения на обычных растениях кукурузы. Данные со стандартной ошибкой, обозначенной как +/-, представлены в Таблице 15.

Таблица 15. Показатели пораженности кукурузы в результате довсходового применения гербицидов PPO

№ Обр	Химическое вещество	Количество (г аи/га)	% пораженности в группе отрицательного контроля	% пораженности PPO H_N10
1	S-3100	80	19,2% +/- 2. 39	3,3% +/- 1,67
2	160	20,8% +/- 8,31	4,2% +/- 1,54
3	Фомесафен	840	75,8% +/- 5,83	4,2% +/- 1,54
4	1680	94,2% +/- 1,54	5,8% +/- 0,83
5	Флумиоксазин	210	30% +/- 6,32	1,7% +/- 1,05
6	420	60,8% +/- 6,38	2,5% +/- 1,71
7	Сульфентразон	840	17,5%+/- 11,6	0% +/- 0
8	1680	20% +/- 11,11	0% +/- 0
9	Сафлуфенацил	200	0% +/- 0	0% +/- 0
10	400	0,8% +/- 0,83	0,8% +/- 0,83

[00115] Для анализа послеовсходовой (от V3 до V4) толерантности к гербицидам, гербициды PPO применяли индивидуально в одном из трех количеств с шестью повторениями на обработку следующим образом: S-3100 (40, 80 или 160 г аи/га), фомесафен (Рефлекс®, 420, 840 или 1680 г аи/га), ацифлуорфен (Ультра Блазер®, 420, 840 или 1680 г аи/га), лактофен (Кобра®, 220, 440 или 880 г аи/га), флумиоксазин (Валор® SX, 105, 210 или 420 г аи/га), сульфантразон (Спартан® 4L, 420, 840 или 1680 г аи/га) и сафлуфенацил (Шарпен®, 100, 200 или 400 г аи/га). Растения оценивали на предмет процентного показателя пораженности культуры через 14 дней после обработки, а обычное гибридное семя кукурузы было включено в качестве отрицательного контроля. Трансгенные растения с APG6, функционально связанным с PPO H_N10, характеризовались процентным показателем пораженности для различных применений гербицидов PPO после появления всходов в пределах от 0,5% до 5,8%, за исключением применения фомесафена в количестве 1680 г аи/га, при котором процентный показатель пораженности составил 13,8%, что указывает на то, что APG6, функционально связанный с PPO H_N10, обеспечивает отличную послевсходовую толерантность кукурузы при всех количествах гербицидов для всех семи гербицидов PPO. Растения кукурузы из группы отрицательного контроля характеризовались процентным показателем пораженности от 36,7% до 100%. Данные со стандартной ошибкой, обозначенной как +/-, представлены в Таблице 16.

Таблица 16. Показатели пораженности кукурузы в результате послевсходового применения гербицидов PPO

Гербицид PPO	Количество (г аи/га)	% пораженности в группе отрицательного контроля	% пораженности PPO H_N10
S-3100	40	100% +/- 0	1,80% +/- 0,87
	80	100% +/- 0	3,80% +/- 0,83
160	100% +/- 0	3,80% +/- 0,98
Фомесафен	420	98,50% +/- 0,81	2,30% +/- 0,8
	840	100% +/- 0	4,70% +/- 0,8
1680	100% +/- 0	13,80% +/- 1,54
Ацифлуорфен	420	84,20% +/- 5,69	1,80% +/- 0,87
	840	87,50% +/- 2,14	4,70% +/- 0,8
1680	95,50% +/- 1,38	5,30% +/- 0,61
Лактофен	220	58,30% +/- 3,07	1% +/- 0,63
	440	59,20% +/- 2,71	2,20% +/- 1,01
880	61,70% +/- 6,54	5,80% +/- 0,98
Флумиоксазин	105	51,70% +/- 3,07	1% +/- 0,63
	210	69,20% +/- 6,38	1,30% +/- 0,88
420	68,30% +/- 2,79	1,80% +/- 0,87
Сульфентразон	420	61,70% +/- 5,43	0,50% +/- 0,5
	840	79,20% +/- 5,97	1% +/- 0,63
1680	84,20% +/- 3,27	2,70% +/- 0,92
Сафлуфенацил	100	43,30% +/- 2,11	0,80% +/- 0,83
	200	36,70% +/- 2,11	1,30% +/- 0,88
400	53,30% +/- 2,11	1,80% +/- 0,87

Пример 7. Экспрессия CTP-PPO в трансгенной сое

[00116] Ферменты PPO, функционально связанные с различными СТР, экспрессировали в трансгенных растениях сои, а трансгенные растения анализировали на предмет толерантности к гербициду PPO.

[00117] Были созданы векторы трансформации растений для экспрессии в условиях поля 12G088600TP (SEQ ID NO: 38), функционально связанного с PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43), или APG6 (SEQ ID NO: 1), функционально связанного с PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43). Сою A3555 трансформировали с помощью этих векторов трансформации растений и Agrobacterium tumefaciens, применяя при этом стандартные способы, известные в данной области техники. Регенерированные R0 трансгенные ростки выращивали в теплице, подвергали самоопылению, и собирали семена R1. Трансгенные растения R1 опрыскивали в теплице, применяя одну из трех обработок гербицидом в фазе V4 и R1: (1) 5 г аи/га S-3100, (2) 10 г аи/га S-3100, или (3) 30 г аи/га S-3100. Оценку пораженности культуры проводили через 10 дней после обработки. Трансгенные растения, экспрессирующие APG6 (SEQ ID NO: 1), функционально связанный с PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43), характеризовались показателем пораженности от 4,2%, 7,8% и 9,4% в фазе V4 и 3%, 6,5% до 15,7% в фазе R1, при применении количества гербицида 5, 10 и 30 г аи/га, соответственно. Трансгенные растения, экспрессирующие 12G088600TP (SEQ ID NO: 38), функционально связанный с PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43), характеризовались средним показателем пораженности от 82,7%, 92,7% до 98,2% при применении количества гербицида 5, 10 и 30 г аи/га, соответственно, и не доживали до проведения оценки в фазе R1. Растения из группы отрицательного контроля характеризовались сходными средним показателем пораженности 89%, 98% и 100% при применении количества гербицида 5, 10 и 30 г аи/га, соответственно, и не доживали до проведения оценки в фазе R1. Данные представлены в Таблице 17.

Таблица 17. Тестирование воздействия гербицидов PPO на сою R1

Конструкция	Количество S-3100	Пораженность в фазе V4	Пораженность в фазе R1
APG6+H_N10	5 г/га	4,2%	3%
APG6+H_N10	10 г/га	7,8%	6,5%
APG6+H_N10	30 г/га	9,4%	15,7%
12G088600TP+H_N10	5 г/га	82,7%	не доступно
12G088600TP+H_N10	10 г/га	92,7%	не доступно
12G088600TP+H_N10	30 г/га	98,2%	не доступно
Отрицательный контроль	5 г/га	89%	не доступно
Отрицательный контроль	10 г/га	98%	не доступно
Отрицательный контроль	30 г/га	100%	не доступно

[00118] Были созданы векторы трансформации растений для экспрессии в условиях поля PPO H_N90 (SEQ ID NO: 47), функционально связанного с одним из трех разных CTP, APG6 (SEQ ID NO: 1) CTP F и CTP H. Сою A3555 трансформировали с помощью этих векторов трансформации растений и Agrobacterium tumefaciens, применяя при этом стандартные способы, известные в данной области техники. Регенерированные трансгенные ростки R0 выращивали в теплице, а образцы листьев, взятые из полученных растений R0, анализировали с помощью ПЦР для идентификации растений, содержащих одну трансформанта. Трансгенные однокопийные растения R0, каждое из которых представляет собой уникальный трансформант, опрыскивали в теплице гербицидом S-3100 в количестве 20 г аи/га, применяемым приблизительно в фазе V3. Оценку пораженности проводили через 14 дней после обработки и выражали количеством растений, признанных высокотолерантными (≤10% пораженность) или толерантными (≤20% пораженность). Среди трансгенных растений, экспрессирующих APG6 (SEQ ID NO: 1), функционально связанный с PPO H_N90 (SEQ ID NO: 47), получили 21,4% уникальных высокотолерантных трансформантов и 57,1% толерантных трансформантов. Среди трансгенных растений, экспрессирующих CTP F, функционально связанный с PPO H_N90 (SEQ ID NO: 47), получили 11,7% уникальных высокотолерантных трансформантов и 41,1% толерантных трансформантов. Среди трансгенных растений, экспрессирующих CTP H, функционально связанный с PPO H_N90 (SEQ ID NO: 47), не получили ни одного уникального высокотолерантного либо толерантного трансформанта. Данные представлены в Таблице 18.

Таблица 18. Оценка эффективности S-3100 для сои R0

CTP	PPO	≤ 10% пораженность	≤ 20% пораженность
APG6	H_N90	3/14 (21,4%)	8/14 (57,1%)
F	H_N90	2/17 (11,7%)	7/17 (41,1%)
H	H_N90	0/22 (0%)	0/22 (0%)

[00119] Эти данные продемонстрировали, что специфический CTP, который функционально связан с ферментом PPO, имеет решающее значение для достижения толерантности к гербициду, тем самым демонстрируя важность выбора CTP и неожиданного превосходства CTP APG6 по сравнению с другими CTP для применения при продуцировании толерантных к гербицидам трансгенных растений.

Пример 8. Экспрессия CTP-PPO в трансгенном хлопчатнике

[00120] Были созданы векторы трансформации растений для экспрессии APG6 (SEQ ID NO: 1), функционально связанного с PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43), в трансгенных растениях хлопчатника, после чего трансгенные растения были проанализированы на предмет толерантности к гербицидам РРО. Хлопчатник DP393 трансформировали с помощью этих векторов трансформации растений и Agrobacterium tumefaciens, применяя при этом стандартные способы, известные в данной области техники. Регенерированные трансгенные ростки R0 выращивали в теплице, а образцы листьев, взятые из полученных растений R0, анализировали с помощью ПЦР для идентификации растений, содержащих одну трансформанта. Трансгенные однокопийные растения R0, каждое из которых представляет собой уникальный трансформант, опрыскивали в теплице гербицидом S-3100 в количестве 20 г аи/га, применяемым в фазе V2. Кроме того, трансгенные мультикопийные растения (≥2 копии/растение) опрыскивали в теплице гербицидом S-3100 в количестве 20 г аи/га, применяемым в фазе V2. Оценку пораженности проводили через три дня после обработки.

Отрицательный контроль, хлопчатник DP393, характеризовался 100% пораженностью через три дня после обработки гербицидом S-3100 в количестве 20 г аи/га. Напротив, у 21 однокопийного растения R0 средний показатель пораженности составил 26,7%. Распределение пораженности для 21 однокопийного растения R0 было следующим: 3 растения не имели поражений; 3 растения имели 10% пораженность; 3 растения имели 15% пораженность; 2 растения имели 20% пораженность; 7 растений имели 30% пораженность; и 3 растения имели 40% пораженность. Среди мультикопийных растений R0, 14 растений подвергались обработке гербицидом, при средний показатель пораженности составил 10,4%. Распределение пораженности для 14 мультикопийных растении было следующим: 5 растений не имели поражений; 3 растения имели 5% пораженность; 1 растение имело 10% пораженность; 2 растения имели 15% пораженность; 1 растение имело 20% пораженность; 1 растение имело 30% пораженность; и 1 растение имело 40% пораженность. Эти данные демонстрируют, что трансгенный хлопчатник R0, экспрессирующий APG6 (SEQ ID NO: 1), функционально связанный с PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43), характеризуется толерантностью к применению гербицида S-3100 в количестве 20 г аи/га, применяемого в фазе V2.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Monsanto Technology LLC

<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ЭФФЕКТИВНОГО НАЦЕЛИВАНИЯ ТРАНСГЕНОВ

<130> MONS:389wo

<150> US 62/270,180

<151> 2015-12-21

<150> US 62/364,715

<151> 2016-07-20

<160> 102

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 68

<212> PRT

<213> Arabidopsis thalinana

<400> 1

Met Ala Thr Ala Thr Thr Thr Ala Thr Ala Ala Phe Ser Gly Val Val

1 5 10 15

Ser Val Gly Thr Glu Thr Arg Arg Ile Tyr Ser Phe Ser His Leu Gln

20 25 30

Pro Ser Ala Ala Phe Pro Ala Lys Pro Ser Ser Phe Lys Ser Leu Lys

35 40 45

Leu Lys Gln Ser Ala Arg Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Arg Pro Phe

50 55 60

Val Val Arg Cys

65

<210> 2

<211> 68

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 2

Met Ala Ser Ser Thr Thr Thr Ala Thr Ala Ala Phe Ser Gly Val Val

1 5 10 15

Ser Val Gly Thr Glu Thr Arg Arg Ile Tyr Ser Phe Ser His Leu Gln

20 25 30

Pro Ser Ala Ala Phe Pro Ala Lys Pro Ser Ser Phe Lys Ser Leu Lys

35 40 45

Leu Lys Gln Ser Ala Arg Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Arg Pro Phe

50 55 60

Val Val Arg Cys

65

<210> 3

<211> 61

<212> PRT

<213> Arabidopsis thalinana

<400> 3

Met Ala Pro Ala Leu Ser Arg Ser Leu Tyr Thr Ser Pro Leu Thr Ser

1 5 10 15

Val Pro Ile Thr Pro Val Ser Ser Arg Leu Ser His Leu Arg Ser Ser

20 25 30

Phe Leu Pro His Gly Gly Ala Leu Arg Thr Gly Val Ser Cys Ser Trp

35 40 45

Asn Leu Glu Lys Arg Cys Asn Arg Phe Ala Val Lys Cys

50 55 60

<210> 4

<211> 72

<212> PRT

<213> Petunia hybrida

<400> 4

Met Ala Gln Ile Asn Asn Met Ala Gln Gly Ile Gln Thr Leu Asn Pro

1 5 10 15

Asn Ser Asn Phe His Lys Pro Gln Val Pro Lys Ser Ser Ser Phe Leu

20 25 30

Val Phe Gly Ser Lys Lys Leu Lys Asn Ser Ala Asn Ser Met Leu Val

35 40 45

Leu Lys Lys Asp Ser Ile Phe Met Gln Lys Phe Cys Ser Phe Arg Ile

50 55 60

Ser Ala Ser Val Ala Thr Ala Cys

65 70

<210> 5

<211> 57

<212> PRT

<213> Pisum sativum

<400> 5

Met Ala Ser Met Ile Ser Ser Ser Ala Val Thr Thr Val Ser Arg Ala

1 5 10 15

Ser Arg Gly Gln Ser Ala Ala Met Ala Pro Phe Gly Gly Leu Lys Ser

20 25 30

Met Thr Gly Phe Pro Val Arg Lys Val Asn Thr Asp Ile Thr Ser Ile

35 40 45

Thr Ser Asn Gly Gly Arg Val Lys Cys

50 55

<210> 6

<211> 77

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 6

Met Ala Ala Leu Thr Thr Ser Gln Leu Ala Thr Ser Ala Thr Gly Phe

1 5 10 15

Gly Ile Ala Asp Arg Ser Ala Pro Ser Ser Leu Leu Arg His Gly Phe

20 25 30

Gln Gly Leu Lys Pro Arg Ser Pro Ala Gly Gly Asp Ala Thr Ser Leu

35 40 45

Ser Val Thr Thr Ser Ala Arg Ala Thr Pro Lys Gln Gln Arg Ser Val

50 55 60

Gln Arg Gly Ser Arg Arg Phe Pro Ser Val Val Val Cys

65 70 75

<210> 7

<211> 204

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 7

atggccaccg ccaccactac cgccaccgct gcgttctccg gcgtggtgag cgtcggcact 60

gagacgcgca ggatctactc cttcagccac ctccagcctt ctgctgcgtt ccccgctaag 120

ccgtcttcgt tcaagagcct gaagctgaaa cagtccgcac gccttacccg gcgcctggac 180

cataggccat tcgttgtcag gtgc 204

<210> 8

<211> 204

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 8

atggcgacgg ctacgacgac tgctacggcg gcgtttagtg gtgtagtcag tgtaggaacg 60

gagactcgaa ggatttattc gttttctcat cttcaacctt ctgcggcttt tccggcgaag 120

cctagttcct tcaaatctct caaattaaag cagagcgcga ggctcacacg gcggcttgat 180

catcggccgt tcgttgtccg atgt 204

<210> 9

<211> 204

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 9

atggctactg ctactaccac agctaccgct gcattctctg gtgttgtgag tgttggaacc 60

gagacacgta gaatttactc tttctcacac ttgcaaccta gcgcagcctt ccctgccaag 120

ccatcatcct ttaagtcctt gaagctgaaa cagtcggcga ggcttacgag gcgcctcgat 180

catagaccct ttgtggtccg atgc 204

<210> 10

<211> 204

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 10

atggcaaccg cgactaccac cgcaacggca gctttctccg gggtagtttc agtcgggacg 60

gaaacccgca ggatctattc gttcagccat ttgcaacctt ccgcggcctt tcccgccaaa 120

ccctcgtctt ttaaatcgct gaaactcaaa cagtcagcac ggttgacccg aagattggac 180

caccgcccat ttgtagtgag gtgc 204

<210> 11

<211> 204

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 11

atggccacgg ccacgaccac ggcaacagcg gccttttcgg gcgttgtatc cgtcgggaca 60

gaaaccagac gcatatatag cttctcacac ctgcaaccta gtgccgcttt tccggccaaa 120

cctagctcgt ttaaatcgct gaagctcaaa cagagcgctc ggttaactag acgactggac 180

cataggccat ttgtcgtccg ctgc 204

<210> 12

<211> 204

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 12

atggcttcct ccacgacgac tgctacggcg gcgtttagtg gtgtagtcag tgtaggaacg 60

gagactcgaa ggatttattc gttttctcat cttcaacctt ctgcggcttt tccggcgaag 120

cctagttcct tcaaatctct caaattaaag cagagcgcga ggctcacacg gcggcttgat 180

catcggccgt tcgttgtccg atgt 204

<210> 13

<211> 183

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 13

atggctcctg ctttgagtag aagtctctac acatctcctt tgacttcagt tccaatcact 60

cctgtctctt ctcgtctctc tcatctgaga agctcgtttc tcccacacgg cggcgcttta 120

agaaccggcg tttcgtgtag ctggaatctc gaaaagagat gtaaccgatt cgccgtgaag 180

tgt 183

<210> 14

<211> 183

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 14

atggctccgg ctctcagccg ctccctctac accagccctc tcacctccgt gcccatcacc 60

ccggtgtcct cccgcctctc ccacctccgc tcctccttcc tccctcacgg cggcgcgctc 120

cgcaccggcg tgtcctgctc ctggaacctg gagaagcgct gcaaccgctt cgccgtgaag 180

tgc 183

<210> 15

<211> 216

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 15

atggcccaga tcaacaacat ggcccagggc atccagaccc tgaaccctaa ctctaacttc 60

cacaagccgc aagtgcccaa gtctagctcc ttcctcgtgt tcggctccaa gaagctcaag 120

aatagcgcca attccatgct ggtcctgaag aaagactcga tcttcatgca gaagttctgc 180

tcctttcgca tcagtgcttc ggttgcgact gcctgc 216

<210> 16

<211> 171

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 16

atggcttcta tgatatcctc ttccgctgtg acaacagtca gccgtgcctc tagggggcaa 60

tccgccgcaa tggctccatt cggcggcctc aaatccatga ctggattccc agtgaggaag 120

gtcaacactg acattacttc cattacaagc aatggtggaa gagtaaagtg c 171

<210> 17

<211> 231

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 17

atggcggctc tcaccacgtc ccagctcgcc acctcggcca ccggcttcgg catcgccgac 60

aggtcggcgc cgtcgtcgct gctccgccac gggttccagg gcctcaagcc ccgcagcccc 120

gccggcggcg acgcgacgtc gctcagcgtg acgaccagcg cgcgcgcgac gcccaagcag 180

cagcggtcgg tgcagcgtgg cagccggagg ttcccctccg tcgtcgtgtg c 231

<210> 18

<211> 340

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 18

Met Leu Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu

1 5 10 15

Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu

20 25 30

Ala Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile

35 40 45

Cys Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly

50 55 60

His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln

65 70 75 80

Cys Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn

85 90 95

Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Trp

100 105 110

Pro Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly

115 120 125

Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val

130 135 140

Asp Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His

145 150 155 160

Ala Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg

165 170 175

Leu Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met

180 185 190

Lys Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg

195 200 205

Gly Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys

210 215 220

Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro

225 230 235 240

Lys Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu

245 250 255

Thr Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly

260 265 270

Ile Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln

275 280 285

Ala Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg

290 295 300

Arg Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys

305 310 315 320

Asp Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln

325 330 335

Leu Glu Ala Ala

340

<210> 19

<211> 339

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 19

Met Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu Glu

1 5 10 15

Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu Ala

20 25 30

Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile Cys

35 40 45

Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly His

50 55 60

Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln Cys

65 70 75 80

Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn Val

85 90 95

Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Trp Pro

100 105 110

Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly Cys

115 120 125

Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val Asp

130 135 140

Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His Ala

145 150 155 160

Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg Leu

165 170 175

Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met Lys

180 185 190

Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg Gly

195 200 205

Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys Val

210 215 220

Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro Lys

225 230 235 240

Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu Thr

245 250 255

Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly Ile

260 265 270

Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln Ala

275 280 285

Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg Arg

290 295 300

Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys Asp

305 310 315 320

Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln Leu

325 330 335

Glu Ala Ala

<210> 20

<211> 340

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 20

Met Leu Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu

1 5 10 15

Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu

20 25 30

Ala Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile

35 40 45

Cys Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly

50 55 60

His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln

65 70 75 80

Cys Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn

85 90 95

Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Trp

100 105 110

Pro Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly

115 120 125

Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val

130 135 140

Asp Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His

145 150 155 160

Ala Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg

165 170 175

Leu Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met

180 185 190

Lys Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg

195 200 205

Gly Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys

210 215 220

Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro

225 230 235 240

Lys Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu

245 250 255

Thr Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly

260 265 270

Ile Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln

275 280 285

Ala Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg

290 295 300

Arg Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys

305 310 315 320

Asp Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln

325 330 335

Leu Glu Ala Ala

340

<210> 21

<211> 340

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 21

Met Ala Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu

1 5 10 15

Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu

20 25 30

Ala Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile

35 40 45

Cys Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly

50 55 60

His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln

65 70 75 80

Cys Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn

85 90 95

Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Cys

100 105 110

Pro Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly

115 120 125

Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val

130 135 140

Asp Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His

145 150 155 160

Ala Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg

165 170 175

Leu Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met

180 185 190

Lys Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg

195 200 205

Gly Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys

210 215 220

Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro

225 230 235 240

Lys Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu

245 250 255

Thr Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly

260 265 270

Ile Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln

275 280 285

Ala Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg

290 295 300

Arg Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys

305 310 315 320

Asp Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln

325 330 335

Leu Glu Ala Ala

340

<210> 22

<211> 340

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 22

Met Leu Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu

1 5 10 15

Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu

20 25 30

Ala Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile

35 40 45

Cys Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly

50 55 60

His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln

65 70 75 80

Cys Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn

85 90 95

Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Cys

100 105 110

Pro Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly

115 120 125

Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val

130 135 140

Asp Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His

145 150 155 160

Ala Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg

165 170 175

Leu Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met

180 185 190

Lys Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg

195 200 205

Gly Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys

210 215 220

Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro

225 230 235 240

Lys Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu

245 250 255

Thr Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly

260 265 270

Ile Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln

275 280 285

Ala Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg

290 295 300

Arg Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys

305 310 315 320

Asp Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln

325 330 335

Leu Glu Ala Ala

340

<210> 23

<211> 340

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 23

Met Ala Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu

1 5 10 15

Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu

20 25 30

Ala Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile

35 40 45

Cys Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly

50 55 60

His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln

65 70 75 80

Cys Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn

85 90 95

Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Cys

100 105 110

Pro Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly

115 120 125

Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val

130 135 140

Asp Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His

145 150 155 160

Ala Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg

165 170 175

Leu Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met

180 185 190

Lys Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg

195 200 205

Gly Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys

210 215 220

Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro

225 230 235 240

Lys Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu

245 250 255

Thr Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly

260 265 270

Ile Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln

275 280 285

Ala Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg

290 295 300

Arg Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys

305 310 315 320

Asp Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln

325 330 335

Leu Glu Ala Ala

340

<210> 24

<211> 340

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 24

Met Ala Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu

1 5 10 15

Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu

20 25 30

Ala Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile

35 40 45

Cys Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly

50 55 60

His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln

65 70 75 80

Cys Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn

85 90 95

Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Trp

100 105 110

Pro Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly

115 120 125

Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val

130 135 140

Asp Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His

145 150 155 160

Ala Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg

165 170 175

Leu Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met

180 185 190

Lys Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg

195 200 205

Gly Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys

210 215 220

Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro

225 230 235 240

Lys Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu

245 250 255

Thr Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly

260 265 270

Ile Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln

275 280 285

Ala Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg

290 295 300

Arg Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys

305 310 315 320

Asp Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln

325 330 335

Leu Glu Ala Ala

340

<210> 25

<211> 340

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 25

Met Leu Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu

1 5 10 15

Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu

20 25 30

Ala Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile

35 40 45

Cys Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly

50 55 60

His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln

65 70 75 80

Cys Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn

85 90 95

Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Cys

100 105 110

Pro Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly

115 120 125

Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val

130 135 140

Asp Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His

145 150 155 160

Ala Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg

165 170 175

Leu Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met

180 185 190

Lys Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg

195 200 205

Gly Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys

210 215 220

Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro

225 230 235 240

Lys Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu

245 250 255

Thr Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly

260 265 270

Ile Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln

275 280 285

Ala Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg

290 295 300

Arg Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys

305 310 315 320

Asp Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln

325 330 335

Leu Glu Ala Ala

340

<210> 26

<211> 340

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 26

Met Ala Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu

1 5 10 15

Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu

20 25 30

Ala Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile

35 40 45

Cys Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly

50 55 60

His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln

65 70 75 80

Cys Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn

85 90 95

Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Trp

100 105 110

Pro Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly

115 120 125

Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val

130 135 140

Asp Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His

145 150 155 160

Ala Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg

165 170 175

Leu Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met

180 185 190

Lys Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg

195 200 205

Gly Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys

210 215 220

Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro

225 230 235 240

Lys Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu

245 250 255

Thr Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly

260 265 270

Ile Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln

275 280 285

Ala Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg

290 295 300

Arg Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys

305 310 315 320

Asp Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln

325 330 335

Leu Glu Ala Ala

340

<210> 27

<211> 340

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 27

Met Leu Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu

1 5 10 15

Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu

20 25 30

Ala Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile

35 40 45

Cys Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly

50 55 60

His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln

65 70 75 80

Cys Val His Asn Pro Leu Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn

85 90 95

Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Trp

100 105 110

Pro Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly

115 120 125

Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val

130 135 140

Asp Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His

145 150 155 160

Ala Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg

165 170 175

Leu Glu Arg Glu Val Ile Lys Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met

180 185 190

Lys Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg

195 200 205

Gly Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys

210 215 220

Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro

225 230 235 240

Lys Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu

245 250 255

Thr Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly

260 265 270

Ile Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln

275 280 285

Ala Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg

290 295 300

Arg Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys

305 310 315 320

Asp Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln

325 330 335

Leu Glu Ala Ala

340

<210> 28

<211> 1023

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 28

atgctcactt tcgttagaaa cgcttggtac gttgctgcac ttcctgagga gttgagcgag 60

aagcctctag gaagaactat cctcgatact ccactagctc tctatcgtca acctgacgga 120

gttgtcgctg ccctgcttga tatttgtccg catcgcttcg ctccgttgag tgacggtatt 180

ctagtcaacg gacatctcca gtgtccatat cacggtctgg aatttgacgg aggtggccag 240

tgtgtccaca acccgcacgg caacggagcc cgccctgctt ctctgaacgt gcgatcattc 300

cctgtcgtgg aaagagacgc attgatctgg atctggcctg gagatccagc actcgcagat 360

cccggtgcta tccctgactt tgggtgtcgt gttgatccag cttaccgtac tgtcggaggt 420

tacggtcacg tggactgcaa ctacaagctc cttgtggata acctcatgga tcttggacac 480

gctcagtacg tgcaccgcgc taacgcccaa acagacgcct tcgatagact tgagcgtgag 540

gtgatcgttg gcgacggcga gatccaggcg ctcatgaaga tccctggtgg cacaccctca 600

gttctcatgg ctaagttctt gcgtggtgct aacacaccag ttgacgcctg gaacgacatc 660

cggtggaata aggtgtcggc tatgctgaac ttcatcgcgg tcgcgccgga agggacgccg 720

aaggagcagt caatccactc ccgaggaacc catatcctta ctcctgagac cgaggcaagc 780

tgccattact tcttcggtag ttcccgcaac ttcggtatag acgatccaga gatggacggt 840

gttctcagga gctggcaagc tcaagccctg gtgaaggagg acaaagtggt cgttgaagct 900

atcgaaaggc ggagggctta cgtcgaagcg aacgggatca gacccgccat gttgtcctgc 960

gacgaggcag ccgtcagggt atccagggag attgagaagc tcgaacaact agaagcggcg 1020

tga 1023

<210> 29

<211> 1020

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 29

atgaccttcg tccgcaatgc ctggtatgtg gcggcgctgc ccgaggaact gtccgaaaag 60

ccgctcggcc ggacgattct cgacacaccg ctcgcgctct accgccagcc cgacggtgtg 120

gtcgcggcgc tgctcgacat ctgtccgcac cgcttcgcgc cgctgagcga cggcatcctc 180

gtcaacggcc atctccaatg cccctatcac gggctggaat tcgatggcgg cgggcagtgc 240

gtccataacc cgcacggcaa tggcgcccgc ccggcttcgc tcaacgtccg ctccttcccg 300

gtggtggagc gcgacgcgct gatctggatc tggcccggcg atccggcgct ggccgatcct 360

ggggcgatcc ccgacttcgg ctgccgcgtc gatcccgcct atcggaccgt cggcggctat 420

gggcatgtcg actgcaacta caagctgctg gtcgacaacc tgatggacct cggccacgcc 480

caatatgtcc atcgcgccaa cgcccagacc gacgccttcg accggctgga gcgcgaggtg 540

atcgtcggcg acggtgagat acaggcgctg atgaagattc ccggcggcac gccgagcgtg 600

ctgatggcca agttcctgcg cggcgccaat acccccgtcg acgcttggaa cgacatccgc 660

tggaacaagg tgagcgcgat gctcaacttc atcgcggtgg cgccggaagg caccccgaag 720

gagcagagca tccactcgcg cggtacccat atcctgaccc ccgagacgga ggcgagctgc 780

cattatttct tcggctcctc gcgcaatttc ggcatcgacg atccggagat ggacggcgtg 840

ctgcgcagct ggcaggctca ggcgctggtc aaggaggaca aggtcgtcgt cgaggcgatc 900

gagcgccgcc gcgcctatgt cgaggcgaat ggcatccgcc cggcgatgct gtcgtgcgac 960

gaagccgcag tccgtgtcag ccgcgagatc gagaagcttg agcagctcga agccgcctga 1020

<210> 30

<211> 1023

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 30

atgctcacct tcgttaggaa cgcctggtac gtcgccgctc tccctgagga gctgagcgag 60

aagcccttgg gtcgcaccat cctagacact ccgttagccc tttaccgcca gcctgacggc 120

gtagtggcgg ccctgcttga catctgcccg cataggttcg ctccgctcag cgacggcatc 180

ctcgtcaacg ggcatcttca gtgcccgtac cacgggctgg aatttgacgg cggtgggcag 240

tgtgtccaca acccgcacgg caacggcgca cggccagctt ccctcaacgt taggtcgttc 300

cctgttgtcg agcgcgacgc actgatctgg atctggcctg gcgacccagc tctggccgat 360

ccaggagcca ttcccgactt cggttgccgc gtggacccag cctatcggac ggtcggcggt 420

tacgggcacg tcgattgtaa ctataagctc cttgtggaca accttatgga tttgggccac 480

gctcagtacg tgcaccgggc taacgctcag actgacgcct ttgaccgtct cgaaagggag 540

gtcatcgtcg gcgacggaga gattcaggcg ctgatgaaga tccctggagg cacgccctct 600

gtgctcatgg cgaagtttct cagaggcgcg aacacgcccg tggacgcctg gaacgacatc 660

cgctggaata aggtctccgc gatgctgaac ttcatcgccg ttgcgcccga gggcacaccc 720

aaagagcagt caatccacag cagagggacc catattctta caccggaaac cgaggctagt 780

tgccactact tcttcggctc gtcacggaat ttcgggatag acgatccgga gatggacggt 840

gttcttcgat cttggcaagc gcaagctctc gtcaaggaag ataaggtggt cgtggaggct 900

atcgagcgta ggcgcgccta cgttgaggcg aacggtatta ggcccgcgat gctgtcctgc 960

gacgaggccg cagttagagt gtcgcgcgag atagaaaagc tggagcagct agaggccgcc 1020

tga 1023

<210> 31

<211> 1023

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 31

atggccactt tcgttagaaa cgcttggtac gttgctgcac ttcctgagga gttgagcgag 60

aagcctctag gaagaactat cctcgatact ccactagctc tctatcgtca acctgacgga 120

gttgtcgctg ccctgcttga tatttgtccg catcgcttcg ctccgttgag tgacggtatt 180

ctagtcaacg gacatctcca gtgtccatat cacggtctgg aatttgacgg aggtggccag 240

tgtgtccaca acccgcacgg caacggagcc cgccctgctt ctctgaacgt gcgatcattc 300

cctgtcgtgg aaagagacgc attgatctgg atctgccctg gagatccagc actcgcagat 360

cccggtgcta tccctgactt tgggtgtcgt gttgatccag cttaccgtac tgtcggaggt 420

tacggtcacg tggactgcaa ctacaagctc cttgtggata acctcatgga tcttggacac 480

gctcagtacg tgcaccgcgc taacgcccaa acagacgcct tcgatagact tgagcgtgag 540

gtgatcgttg gcgacggcga gatccaggcg ctcatgaaga tccctggtgg cacaccctca 600

gttctcatgg ctaagttctt gcgtggtgct aacacaccag ttgacgcctg gaacgacatc 660

cggtggaata aggtgtcggc tatgctgaac ttcatcgcgg tcgcgccgga agggacgccg 720

aaggagcagt caatccactc ccgaggaacc catatcctta ctcctgagac cgaggcaagc 780

tgccattact tcttcggtag ttcccgcaac ttcggtatag acgatccaga gatggacggt 840

gttctcagga gctggcaagc tcaagccctg gtgaaggagg acaaagtggt cgttgaagct 900

atcgaaaggc ggagggctta cgtcgaagcg aacgggatca gacccgccat gttgtcctgc 960

gacgaggcag ccgtcagggt atccagggag attgagaagc tcgaacaact agaagcggcg 1020

tga 1023

<210> 32

<211> 1023

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 32

atgctcactt tcgttagaaa cgcttggtac gttgctgcac ttcctgagga gttgagcgag 60

aagcctctag gaagaactat cctcgatact ccactagctc tctatcgtca acctgacgga 120

gttgtcgctg ccctgcttga tatttgtccg catcgcttcg ctccgttgag tgacggtatt 180

ctagtcaacg gacatctcca gtgtccatat cacggtctgg aatttgacgg aggtggccag 240

tgtgtccaca acccgcacgg caacggagcc cgccctgctt ctctgaacgt gcgatcattc 300

cctgtcgtgg aaagagacgc attgatctgg atctgccctg gagatccagc actcgcagat 360

cccggtgcta tccctgactt tgggtgtcgt gttgatccag cttaccgtac tgtcggaggt 420

tacggtcacg tggactgcaa ctacaagctc cttgtggata acctcatgga tcttggacac 480

gctcagtacg tgcaccgcgc taacgcccaa acagacgcct tcgatagact tgagcgtgag 540

gtgatcgttg gcgacggcga gatccaggcg ctcatgaaga tccctggtgg cacaccctca 600

gttctcatgg ctaagttctt gcgtggtgct aacacaccag ttgacgcctg gaacgacatc 660

cggtggaata aggtgtcggc tatgctgaac ttcatcgcgg tcgcgccgga agggacgccg 720

aaggagcagt caatccactc ccgaggaacc catatcctta ctcctgagac cgaggcaagc 780

tgccattact tcttcggtag ttcccgcaac ttcggtatag acgatccaga gatggacggt 840

gttctcagga gctggcaagc tcaagccctg gtgaaggagg acaaagtggt cgttgaagct 900

atcgaaaggc ggagggctta cgtcgaagcg aacgggatca gacccgccat gttgtcctgc 960

gacgaggcag ccgtcagggt atccagggag attgagaagc tcgaacaact agaagcggcg 1020

tga 1023

<210> 33

<211> 1023

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 33

atggccacct tcgtccgcaa tgcctggtat gtggcggcgc tgcccgagga actgtccgaa 60

aagccgctcg gccggacgat tctcgacaca ccgctcgcgc tctaccgcca gcccgacggt 120

gtggtcgcgg cgctgctcga catctgtccg caccgcttcg cgccgctgag cgacggcatc 180

ctcgtcaacg gccatctcca atgcccctat cacgggctgg aattcgatgg cggcgggcag 240

tgcgtccata acccgcacgg caatggcgcc cgcccggctt cgctcaacgt ccgctccttc 300

ccggtggtgg agcgcgacgc gctgatctgg atctgtcccg gcgatccggc gctggccgat 360

cctggggcga tccccgactt cggctgccgc gtcgatcccg cctatcggac cgtcggcggc 420

tatgggcatg tcgactgcaa ctacaagctg ctggtcgaca acctgatgga cctcggccac 480

gcccaatatg tccatcgcgc caacgcccag accgacgcct tcgaccggct ggagcgcgag 540

gtgatcgtcg gcgacggtga gatacaggcg ctgatgaaga ttcccggcgg cacgccgagc 600

gtgctgatgg ccaagttcct gcgcggcgcc aatacccccg tcgacgcttg gaacgacatc 660

cgctggaaca aggtgagcgc gatgctcaac ttcatcgcgg tggcgccgga aggcaccccg 720

aaggagcaga gcatccactc gcgcggtacc catatcctga cccccgagac ggaggcgagc 780

tgccattatt tcttcggctc ctcgcgcaat ttcggcatcg acgatccgga gatggacggc 840

gtgctgcgca gctggcaggc tcaggcgctg gtcaaggagg acaaggtcgt cgtcgaggcg 900

atcgagcgcc gccgcgccta tgtcgaggcg aatggcatcc gcccggcgat gctgtcgtgc 960

gacgaagccg cagtccgtgt cagccgcgag atcgagaagc ttgagcagct cgaagccgcc 1020

tga 1023

<210> 34

<211> 1023

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 34

atggccactt tcgttagaaa cgcttggtac gttgctgcac ttcctgagga gttgagcgag 60

aagcctctag gaagaactat cctcgatact ccactagctc tctatcgtca acctgacgga 120

gttgtcgctg ccctgcttga tatttgtccg catcgcttcg ctccgttgag tgacggtatt 180

ctagtcaacg gacatctcca gtgtccatat cacggtctgg aatttgacgg aggtggccag 240

tgtgtccaca acccgcacgg caacggagcc cgccctgctt ctctgaacgt gcgatcattc 300

cctgtcgtgg aaagagacgc attgatctgg atctggcctg gagatccagc actcgcagat 360

cccggtgcta tccctgactt tgggtgtcgt gttgatccag cttaccgtac tgtcggaggt 420

tacggtcacg tggactgcaa ctacaagctc cttgtggata acctcatgga tcttggacac 480

gctcagtacg tgcaccgcgc taacgcccaa acagacgcct tcgatagact tgagcgtgag 540

gtgatcgttg gcgacggcga gatccaggcg ctcatgaaga tccctggtgg cacaccctca 600

gttctcatgg ctaagttctt gcgtggtgct aacacaccag ttgacgcctg gaacgacatc 660

cggtggaata aggtgtcggc tatgctgaac ttcatcgcgg tcgcgccgga agggacgccg 720

aaggagcagt caatccactc ccgaggaacc catatcctta ctcctgagac cgaggcaagc 780

tgccattact tcttcggtag ttcccgcaac ttcggtatag acgatccaga gatggacggt 840

gttctcagga gctggcaagc tcaagccctg gtgaaggagg acaaagtggt cgttgaagct 900

atcgaaaggc ggagggctta cgtcgaagcg aacgggatca gacccgccat gttgtcctgc 960

gacgaggcag ccgtcagggt atccagggag attgagaagc tcgaacaact agaagcggcg 1020

tga 1023

<210> 35

<211> 1023

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 35

atgctcacct tcgtccgcaa tgcctggtat gtggcggcgc tgcccgagga actgtccgaa 60

aagccgctcg gccggacgat tctcgacaca ccgctcgcgc tctaccgcca gcccgacggt 120

gtggtcgcgg cgctgctcga catctgtccg caccgcttcg cgccgctgag cgacggcatc 180

ctcgtcaacg gccatctcca atgcccctat cacgggctgg aattcgatgg cggcgggcag 240

tgcgtccata acccgcacgg caatggcgcc cgcccggctt cgctcaacgt ccgctccttc 300

ccggtggtgg agcgcgacgc gctgatctgg atctgtcccg gcgatccggc gctggccgat 360

cctggggcga tccccgactt cggctgccgc gtcgatcccg cctatcggac cgtcggcggc 420

tatgggcatg tcgactgcaa ctacaagctg ctggtcgaca acctgatgga cctcggccac 480

gcccaatatg tccatcgcgc caacgcccag accgacgcct tcgaccggct ggagcgcgag 540

gtgatcgtcg gcgacggtga gatacaggcg ctgatgaaga ttcccggcgg cacgccgagc 600

gtgctgatgg ccaagttcct gcgcggcgcc aatacccccg tcgacgcttg gaacgacatc 660

cgctggaaca aggtgagcgc gatgctcaac ttcatcgcgg tggcgccgga aggcaccccg 720

aaggagcaga gcatccactc gcgcggtacc catatcctga cccccgagac ggaggcgagc 780

tgccattatt tcttcggctc ctcgcgcaat ttcggcatcg acgatccgga gatggacggc 840

gtgctgcgca gctggcaggc tcaggcgctg gtcaaggagg acaaggtcgt cgtcgaggcg 900

atcgagcgcc gccgcgccta tgtcgaggcg aatggcatcc gcccggcgat gctgtcgtgc 960

gacgaagccg cagtccgtgt cagccgcgag atcgagaagc ttgagcagct cgaagccgcc 1020

tga 1023

<210> 36

<211> 1023

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 36

atggccacct tcgttaggaa cgcctggtac gtcgccgctc tccctgagga gctgagcgag 60

aagcccttgg gtcgcaccat cctagacact ccgttagccc tttaccgcca gcctgacggc 120

gtagtggcgg ccctgcttga catctgcccg cataggttcg ctccgctcag cgacggcatc 180

ctcgtcaacg ggcatcttca gtgcccgtac cacgggctgg aatttgacgg cggtgggcag 240

tgtgtccaca acccgcacgg caacggcgca cggccagctt ccctcaacgt taggtcgttc 300

cctgttgtcg agcgcgacgc actgatctgg atctggcctg gcgacccagc tctggccgat 360

ccaggagcca ttcccgactt cggttgccgc gtggacccag cctatcggac ggtcggcggt 420

tacgggcacg tcgattgtaa ctataagctc cttgtggaca accttatgga tttgggccac 480

gctcagtacg tgcaccgggc taacgctcag actgacgcct ttgaccgtct cgaaagggag 540

gtcatcgtcg gcgacggaga gattcaggcg ctgatgaaga tccctggagg cacgccctct 600

gtgctcatgg cgaagtttct cagaggcgcg aacacgcccg tggacgcctg gaacgacatc 660

cgctggaata aggtctccgc gatgctgaac ttcatcgccg ttgcgcccga gggcacaccc 720

aaagagcagt caatccacag cagagggacc catattctta caccggaaac cgaggctagt 780

tgccactact tcttcggctc gtcacggaat ttcgggatag acgatccgga gatggacggt 840

gttcttcgat cttggcaagc gcaagctctc gtcaaggaag ataaggtggt cgtggaggct 900

atcgagcgta ggcgcgccta cgttgaggcg aacggtatta ggcccgcgat gctgtcctgc 960

gacgaggccg cagttagagt gtcgcgcgag atagaaaagc tggagcagct agaggccgcc 1020

tga 1023

<210> 37

<211> 1020

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 37

atgctcactt tcgttagaaa cgcttggtac gttgctgcac ttcctgagga gttgagcgag 60

aagcctctag gaagaactat cctcgatact ccactagctc tctatcgtca acctgacgga 120

gttgtcgctg ccctgcttga tatttgtccg catcgcttcg ctccgttgag tgacggtatt 180

ctagtcaacg gacatctcca gtgtccatat cacggtctgg aatttgacgg aggtggccag 240

tgtgtccaca acccgctcgg caacggagcc cgccctgctt ctctgaacgt gcgatcattc 300

cctgtcgtgg aaagagacgc attgatctgg atctggcctg gagatccagc actcgcagat 360

cccggtgcta tccctgactt tgggtgtcgt gttgatccag cttaccgtac tgtcggaggt 420

tacggtcacg tggactgcaa ctacaagctc cttgtggata acctcatgga tcttggacac 480

gctcagtacg tgcaccgcgc taacgcccaa acagacgcct tcgatagact tgagcgtgag 540

gtgatcaaag gcgacggcga gatccaggcg ctcatgaaga tccctggtgg cacaccctca 600

gttctcatgg ctaagttctt gcgtggtgct aacacaccag ttgacgcctg gaacgacatc 660

cggtggaata aggtgtcggc tatgctgaac ttcatcgcgg tcgcgccgga agggacgccg 720

aaggagcagt caatccactc ccgaggaacc catatcctta ctcctgagac cgaggcaagc 780

tgccattact tcttcggtag ttcccgcaac ttcggtatag acgatccaga gatggacggt 840

gttctcagga gctggcaagc tcaagccctg gtgaaggagg acaaagtggt cgttgaagct 900

atcgaaaggc ggagggctta cgtcgaagcg aacgggatca gacccgccat gttgtcctgc 960

gacgaggcag ccgtcagggt atccagggag attgagaagc tcgaacaact agaagcggcg 1020

<210> 38

<211> 35

<212> PRT

<213> Gossypium raimondii

<400> 38

Met Leu Asn Ile Ala Pro Ser Cys Val Leu Ala Ser Gly Ile Ser Lys

1 5 10 15

Pro Val Thr Lys Met Ala Ser Thr Glu Asn Lys Asp Asp His Ser Ser

20 25 30

Ala Lys Arg

35

<210> 39

<211> 105

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 39

atgcttaaca ttgcgccgag ttgtgttttg gccagcggga tctctaagcc cgtgaccaag 60

atggctagca cggagaacaa ggacgaccac agcagcgcca agagg 105

<210> 40

<211> 179

<212> PRT

<213> Enterobacter cloacae

<400> 40

Met Lys Ala Leu Val Leu Tyr Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr His Ala

1 5 10 15

Ile Ala Ser Tyr Ile Ala Ser Cys Met Lys Glu Lys Ala Glu Cys Asp

20 25 30

Val Ile Asp Leu Thr His Gly Glu His Val Asn Leu Thr Gln Tyr Asp

35 40 45

Gln Val Leu Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe Asn Ala Val

50 55 60

Leu Asp Lys Phe Ile Lys Arg Asn Val Asp Gln Leu Asn Asn Met Pro

65 70 75 80

Ser Ala Phe Phe Cys Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg

85 90 95

Thr Pro Gln Thr Asn Pro Tyr Val Arg Lys Phe Leu Leu Ala Thr Pro

100 105 110

Trp Gln Pro Ala Leu Cys Gly Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro

115 120 125

Arg Tyr Arg Trp Ile Asp Lys Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Met

130 135 140

Thr Gly Gly Glu Thr Asp Thr Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp

145 150 155 160

Glu Gln Val Lys Lys Phe Ala Glu Asp Phe Ala Lys Leu Ser Tyr Lys

165 170 175

Lys Ala Leu

<210> 41

<211> 178

<212> PRT

<213> Pantoea ananatis

<400> 41

Met Lys Ala Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Gln Lys

1 5 10 15

Ile Ala Ser Ala Ile Ala Asp Glu Ile Lys Gly Gln Gln Ser Cys Asp

20 25 30

Val Ile Asn Ile Gln Asp Ala Lys Thr Leu Asp Trp Gln Gln Tyr Asp

35 40 45

Arg Val Leu Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe Gln Pro Val

50 55 60

Val Asn Glu Phe Val Lys His Asn Leu Leu Ala Leu Gln Gln Arg Val

65 70 75 80

Ser Gly Phe Phe Ser Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg

85 90 95

Ser Pro Glu Thr Asn Ala Tyr Thr Val Lys Phe Leu Ala Gln Ser Pro

100 105 110

Trp Gln Pro Asp Cys Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Tyr Tyr Pro

115 120 125

Arg Tyr Arg Trp Phe Asp Arg Val Met Ile Gln Phe Ile Met Arg Met

130 135 140

Thr Gly Gly Glu Thr Asp Ala Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp

145 150 155 160

Gln Gln Val Gln Arg Phe Ala Arg Asp Phe Ala Gln Leu Pro Gly Lys

165 170 175

Ser Tyr

<210> 42

<211> 177

<212> PRT

<213> Pantoea stewardii

<400> 42

Met Lys Ala Leu Ile Leu Tyr Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Arg Lys

1 5 10 15

Ile Ala Ser Ser Ile Ala Asp Val Ile Arg Gln Gln Gln Gln Cys Asp

20 25 30

Val Leu Asn Ile Lys Asp Ala Ser Leu Pro Asp Trp Ala Gln Tyr Asp

35 40 45

Arg Val Leu Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe Gln Pro Val

50 55 60

Val Asp Lys Phe Val Lys Gln His Leu His Glu Leu Gln Gln Arg Thr

65 70 75 80

Ser Gly Phe Phe Ser Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg

85 90 95

Ser Pro Glu Thr Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Phe Leu Ala His Ser Pro

100 105 110

Trp Gln Pro Asp Cys Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Tyr Tyr Pro

115 120 125

Arg Tyr Arg Trp Phe Asp Arg Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Met

130 135 140

Thr Gly Gly Glu Thr Asp Ser Thr Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp

145 150 155 160

Gln Gln Val Ser Thr Phe Ala Asn Asp Phe Ala Gln Leu Pro Gly Lys

165 170 175

Ser

<210> 43

<211> 181

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 43

Met Lys Thr Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Arg Glu

1 5 10 15

Ile Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Leu Gly Ile Gln Ala

20 25 30

Asp Val Ala Asn Val His Arg Ile Glu Glu Pro Gln Trp Glu Asn Tyr

35 40 45

Asp Arg Val Val Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Tyr His Ser

50 55 60

Ala Phe Gln Glu Phe Val Lys Lys His Ala Thr Arg Leu Asn Ser Met

65 70 75 80

Pro Ser Ala Phe Tyr Ser Val Asn Leu Val Ala Arg Lys Pro Glu Lys

85 90 95

Arg Thr Pro Gln Thr Asn Ser Tyr Ala Arg Lys Phe Leu Met Asn Ser

100 105 110

Gln Trp Arg Pro Asp Arg Cys Ala Val Ile Ala Gly Ala Leu Arg Tyr

115 120 125

Pro Arg Tyr Arg Trp Tyr Asp Arg Phe Met Ile Lys Leu Ile Met Lys

130 135 140

Met Ser Gly Gly Glu Thr Asp Thr Arg Lys Glu Val Val Tyr Thr Asp

145 150 155 160

Trp Glu Gln Val Ala Asn Phe Ala Arg Glu Ile Ala His Leu Thr Asp

165 170 175

Lys Pro Thr Leu Lys

180

<210> 44

<211> 178

<212> PRT

<213> Erwinia toletana

<400> 44

Met Lys Ala Leu Ile Leu Phe Ser Ser Arg Glu Gly Gln Thr Arg Glu

1 5 10 15

Ile Ala Ser Tyr Ile Ala Asn Ser Ile Lys Glu Glu Met Glu Cys Asp

20 25 30

Val Phe Asn Ile Leu Arg Val Glu Gln Ile Asp Trp Ser Gln Tyr Asp

35 40 45

Arg Val Leu Ile Gly Gly Ser Ile His Tyr Gly His Phe His Pro Ala

50 55 60

Val Ala Lys Phe Val Lys Arg His Leu His Glu Leu Gln Gln Arg Ser

65 70 75 80

Ser Gly Phe Phe Cys Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Ala Asp Lys Arg

85 90 95

Thr Pro Gln Thr Asn Ala Tyr Met Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ser Pro

100 105 110

Trp Gln Pro Asp Cys Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Thr

115 120 125

Arg Tyr Arg Trp Phe Asp Arg Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Met

130 135 140

Thr Gly Gly Glu Thr Asp Thr Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp

145 150 155 160

Thr Gln Val Ala Arg Phe Ala Gln Glu Phe Ala His Leu Pro Gly Lys

165 170 175

Thr Gln

<210> 45

<211> 179

<212> PRT

<213> Pectobacterium carotovorum

<400> 45

Met Lys Ala Leu Ile Val Phe Ser Ser Arg Asp Gly Gln Thr Arg Ala

1 5 10 15

Ile Ala Ser Tyr Ile Ala Asn Thr Leu Lys Gly Thr Leu Glu Cys Asp

20 25 30

Val Val Asn Val Leu Asn Ala Asn Asp Ile Asp Leu Ser Gln Tyr Asp

35 40 45

Arg Val Ala Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly Arg Phe His Pro Ala

50 55 60

Val Asn Gln Phe Ile Arg Lys His Leu Thr Ser Leu Gln Gln Leu Pro

65 70 75 80

Ser Ala Phe Phe Ser Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg

85 90 95

Thr Ile Gln Thr Asn Ala Tyr Thr Arg Lys Phe Leu Leu Asn Ser Pro

100 105 110

Trp Gln Pro Asp Leu Cys Cys Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro

115 120 125

Arg Tyr Arg Trp Phe Asp Arg Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Ile

130 135 140

Thr Gly Gly Glu Thr Asp Ser Thr Lys Glu Ile Glu Tyr Thr Asp Trp

145 150 155 160

Gln Gln Val Ala Arg Phe Ala Gln Asp Phe Ala Gln Leu Ala Ala Lys

165 170 175

Asn Pro Ala

<210> 46

<211> 179

<212> PRT

<213> Shimwellia blattae

<400> 46

Met Lys Thr Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr His Lys

1 5 10 15

Ile Ala Arg His Ile Ala Gly Val Leu Glu Glu Gln Gly Lys Ala Cys

20 25 30

Glu Leu Val Asp Leu Leu Gln Pro Gly Glu Pro Asp Trp Ser Thr Val

35 40 45

Glu Cys Val Val Leu Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe His Lys

50 55 60

Ser Phe Ile Arg Phe Val Asn Thr His Ala Gln Arg Leu Asn Asn Met

65 70 75 80

Pro Gly Ala Leu Phe Thr Val Asn Leu Val Ala Arg Lys Pro Glu Lys

85 90 95

Gln Ser Pro Gln Thr Asn Ser Tyr Thr Arg Lys Phe Leu Ala Ala Ser

100 105 110

Pro Trp Gln Pro Gln Arg Cys Gln Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr

115 120 125

Pro Arg Tyr Ser Trp Tyr Asp Arg Met Met Ile Arg Leu Ile Met Lys

130 135 140

Met Ala Gly Gly Glu Thr Asp Thr Arg Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp

145 150 155 160

Trp Gln Ser Val Thr Arg Phe Ala Arg Glu Ile Ala Gln Leu Pro Gly

165 170 175

Glu Thr Arg

<210> 47

<211> 178

<212> PRT

<213> Pantoea stewardii

<400> 47

Met Lys Ala Leu Ile Leu Phe Ser Ser Arg Asp Gly Gln Thr Gln Leu

1 5 10 15

Ile Ala Ser Ser Ile Ala Lys Glu Leu Glu Gly Lys Gln Ala Cys Asp

20 25 30

Val Leu Asn Ile Leu Asp Thr Thr Asn Val Glu Trp Thr Gln Tyr Asp

35 40 45

Arg Val Leu Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe His Pro Ala

50 55 60

Val Ala Glu Phe Val Lys Arg His Gln Arg Glu Leu Gln Gln Arg Ser

65 70 75 80

Ser Gly Phe Phe Ser Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg

85 90 95

Ser Pro Glu Thr Asn Ala Tyr Thr Ala Lys Phe Leu Asn Gln Ser Pro

100 105 110

Trp Gln Pro Asp Cys Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro

115 120 125

Arg Tyr Arg Trp Phe Asp Arg Ile Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Met

130 135 140

Thr Gly Gly Glu Thr Asp Ser Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp

145 150 155 160

Gln Gln Val Thr Arg Phe Ala Gln Glu Phe Ala Arg Leu Pro Gly Lys

165 170 175

Thr Ser

<210> 48

<211> 180

<212> PRT

<213> Enterobacter cloacae

<400> 48

Met Lys Thr Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Arg Glu

1 5 10 15

Ile Ala Ala Phe Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Gln Gly Ile Tyr Ala

20 25 30

Asp Val Ile Asn Leu Asn Arg Thr Glu Glu Ile Ala Trp Gln Glu Tyr

35 40 45

Asp Arg Val Val Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe His Pro

50 55 60

Ala Val Asp Arg Phe Val Lys Lys His Thr Glu Thr Leu Asn Ser Leu

65 70 75 80

Pro Gly Ala Phe Phe Ser Val Asn Leu Val Ala Arg Lys Ala Glu Lys

85 90 95

Arg Thr Pro Gln Thr Asn Ser Tyr Thr Arg Lys Phe Leu Leu Asn Ser

100 105 110

Pro Trp Lys Pro Ala Ala Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr

115 120 125

Pro Arg Tyr Arg Trp Tyr Asp Arg Phe Met Ile Arg Leu Ile Met Lys

130 135 140

Met Thr Gly Gly Glu Thr Asp Thr Arg Lys Glu Val Val Tyr Thr Asp

145 150 155 160

Trp Ser Gln Val Ala Ser Phe Ala Arg Glu Ile Val Gln Leu Thr Arg

165 170 175

Ser Ser Arg Leu

180

<210> 49

<211> 177

<212> PRT

<213> Enterobacter mori

<400> 49

Met Lys Ile Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Arg Glu

1 5 10 15

Ile Ala Ala Ser Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Gln Ala Phe Asp Val

20 25 30

Asp Val Val Asn Leu His Arg Ala Glu Asn Ile Ala Trp Glu Glu Tyr

35 40 45

Asp Gly Val Val Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe His Ser

50 55 60

Thr Leu Asn Ser Phe Val Lys Lys His Gln Gln Ala Leu Lys Lys Leu

65 70 75 80

Pro Gly Ala Phe Tyr Ser Val Asn Leu Val Ala Arg Lys Pro Glu Lys

85 90 95

Arg Thr Pro Gln Thr Asn Ser Tyr Thr Arg Lys Phe Leu Leu Asp Ser

100 105 110

Pro Trp Gln Pro Asp Leu Ser Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr

115 120 125

Pro Arg Tyr Asn Trp Tyr Asp Arg Ile Met Ile Arg Leu Ile Met Lys

130 135 140

Ile Thr Gly Gly Glu Thr Asp Thr Arg Lys Glu Val Val Tyr Thr Asp

145 150 155 160

Trp Gln Gln Val Thr His Phe Ala His Glu Ile Val Gln Leu Val Arg

165 170 175

Lys

<210> 50

<211> 178

<212> PRT

<213> Enterobacter cloacae

<400> 50

Lys Ala Leu Val Leu Tyr Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr His Ala Ile

1 5 10 15

Ala Ser Tyr Ile Ala Ser Cys Met Lys Glu Lys Ala Glu Cys Asp Val

20 25 30

Ile Asp Leu Thr His Gly Glu His Val Asn Leu Thr Gln Tyr Asp Gln

35 40 45

Val Leu Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe Asn Ala Val Leu

50 55 60

Asp Lys Phe Ile Lys Arg Asn Val Asp Gln Leu Asn Asn Met Pro Ser

65 70 75 80

Ala Phe Phe Cys Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg Thr

85 90 95

Pro Gln Thr Asn Pro Tyr Val Arg Lys Phe Leu Leu Ala Thr Pro Trp

100 105 110

Gln Pro Ala Leu Cys Gly Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro Arg

115 120 125

Tyr Arg Trp Ile Asp Lys Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Met Thr

130 135 140

Gly Gly Glu Thr Asp Thr Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp Glu

145 150 155 160

Gln Val Lys Lys Phe Ala Glu Asp Phe Ala Lys Leu Ser Tyr Lys Lys

165 170 175

Ala Leu

<210> 51

<211> 177

<212> PRT

<213> Pantoea ananatis

<400> 51

Lys Ala Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Gln Lys Ile

1 5 10 15

Ala Ser Ala Ile Ala Asp Glu Ile Lys Gly Gln Gln Ser Cys Asp Val

20 25 30

Ile Asn Ile Gln Asp Ala Lys Thr Leu Asp Trp Gln Gln Tyr Asp Arg

35 40 45

Val Leu Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe Gln Pro Val Val

50 55 60

Asn Glu Phe Val Lys His Asn Leu Leu Ala Leu Gln Gln Arg Val Ser

65 70 75 80

Gly Phe Phe Ser Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg Ser

85 90 95

Pro Glu Thr Asn Ala Tyr Thr Val Lys Phe Leu Ala Gln Ser Pro Trp

100 105 110

Gln Pro Asp Cys Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Tyr Tyr Pro Arg

115 120 125

Tyr Arg Trp Phe Asp Arg Val Met Ile Gln Phe Ile Met Arg Met Thr

130 135 140

Gly Gly Glu Thr Asp Ala Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp Gln

145 150 155 160

Gln Val Gln Arg Phe Ala Arg Asp Phe Ala Gln Leu Pro Gly Lys Ser

165 170 175

Tyr

<210> 52

<211> 180

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 52

Lys Thr Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Arg Glu Ile

1 5 10 15

Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Leu Gly Ile Gln Ala Asp

20 25 30

Val Ala Asn Val His Arg Ile Glu Glu Pro Gln Trp Glu Asn Tyr Asp

35 40 45

Arg Val Val Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Tyr His Ser Ala

50 55 60

Phe Gln Glu Phe Val Lys Lys His Ala Thr Arg Leu Asn Ser Met Pro

65 70 75 80

Ser Ala Phe Tyr Ser Val Asn Leu Val Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg

85 90 95

Thr Pro Gln Thr Asn Ser Tyr Ala Arg Lys Phe Leu Met Asn Ser Gln

100 105 110

Trp Arg Pro Asp Arg Cys Ala Val Ile Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro

115 120 125

Arg Tyr Arg Trp Tyr Asp Arg Phe Met Ile Lys Leu Ile Met Lys Met

130 135 140

Ser Gly Gly Glu Thr Asp Thr Arg Lys Glu Val Val Tyr Thr Asp Trp

145 150 155 160

Glu Gln Val Ala Asn Phe Ala Arg Glu Ile Ala His Leu Thr Asp Lys

165 170 175

Pro Thr Leu Lys

180

<210> 53

<211> 177

<212> PRT

<213> Erwinia toletana

<400> 53

Lys Ala Leu Ile Leu Phe Ser Ser Arg Glu Gly Gln Thr Arg Glu Ile

1 5 10 15

Ala Ser Tyr Ile Ala Asn Ser Ile Lys Glu Glu Met Glu Cys Asp Val

20 25 30

Phe Asn Ile Leu Arg Val Glu Gln Ile Asp Trp Ser Gln Tyr Asp Arg

35 40 45

Val Leu Ile Gly Gly Ser Ile His Tyr Gly His Phe His Pro Ala Val

50 55 60

Ala Lys Phe Val Lys Arg His Leu His Glu Leu Gln Gln Arg Ser Ser

65 70 75 80

Gly Phe Phe Cys Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Ala Asp Lys Arg Thr

85 90 95

Pro Gln Thr Asn Ala Tyr Met Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ser Pro Trp

100 105 110

Gln Pro Asp Cys Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Thr Arg

115 120 125

Tyr Arg Trp Phe Asp Arg Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Met Thr

130 135 140

Gly Gly Glu Thr Asp Thr Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp Thr

145 150 155 160

Gln Val Ala Arg Phe Ala Gln Glu Phe Ala His Leu Pro Gly Lys Thr

165 170 175

Gln

<210> 54

<211> 178

<212> PRT

<213> Pectobacterium carotovorum

<400> 54

Lys Ala Leu Ile Val Phe Ser Ser Arg Asp Gly Gln Thr Arg Ala Ile

1 5 10 15

Ala Ser Tyr Ile Ala Asn Thr Leu Lys Gly Thr Leu Glu Cys Asp Val

20 25 30

Val Asn Val Leu Asn Ala Asn Asp Ile Asp Leu Ser Gln Tyr Asp Arg

35 40 45

Val Ala Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly Arg Phe His Pro Ala Val

50 55 60

Asn Gln Phe Ile Arg Lys His Leu Thr Ser Leu Gln Gln Leu Pro Ser

65 70 75 80

Ala Phe Phe Ser Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg Thr

85 90 95

Ile Gln Thr Asn Ala Tyr Thr Arg Lys Phe Leu Leu Asn Ser Pro Trp

100 105 110

Gln Pro Asp Leu Cys Cys Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro Arg

115 120 125

Tyr Arg Trp Phe Asp Arg Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Ile Thr

130 135 140

Gly Gly Glu Thr Asp Ser Thr Lys Glu Ile Glu Tyr Thr Asp Trp Gln

145 150 155 160

Gln Val Ala Arg Phe Ala Gln Asp Phe Ala Gln Leu Ala Ala Lys Asn

165 170 175

Pro Ala

<210> 55

<211> 178

<212> PRT

<213> Shimwellia blattae

<400> 55

Lys Thr Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr His Lys Ile

1 5 10 15

Ala Arg His Ile Ala Gly Val Leu Glu Glu Gln Gly Lys Ala Cys Glu

20 25 30

Leu Val Asp Leu Leu Gln Pro Gly Glu Pro Asp Trp Ser Thr Val Glu

35 40 45

Cys Val Val Leu Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe His Lys Ser

50 55 60

Phe Ile Arg Phe Val Asn Thr His Ala Gln Arg Leu Asn Asn Met Pro

65 70 75 80

Gly Ala Leu Phe Thr Val Asn Leu Val Ala Arg Lys Pro Glu Lys Gln

85 90 95

Ser Pro Gln Thr Asn Ser Tyr Thr Arg Lys Phe Leu Ala Ala Ser Pro

100 105 110

Trp Gln Pro Gln Arg Cys Gln Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro

115 120 125

Arg Tyr Ser Trp Tyr Asp Arg Met Met Ile Arg Leu Ile Met Lys Met

130 135 140

Ala Gly Gly Glu Thr Asp Thr Arg Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp

145 150 155 160

Gln Ser Val Thr Arg Phe Ala Arg Glu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu

165 170 175

Thr Arg

<210> 56

<211> 179

<212> PRT

<213> Enterobacter cloacae

<400> 56

Lys Thr Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Arg Glu Ile

1 5 10 15

Ala Ala Phe Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Gln Gly Ile Tyr Ala Asp

20 25 30

Val Ile Asn Leu Asn Arg Thr Glu Glu Ile Ala Trp Gln Glu Tyr Asp

35 40 45

Arg Val Val Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe His Pro Ala

50 55 60

Val Asp Arg Phe Val Lys Lys His Thr Glu Thr Leu Asn Ser Leu Pro

65 70 75 80

Gly Ala Phe Phe Ser Val Asn Leu Val Ala Arg Lys Ala Glu Lys Arg

85 90 95

Thr Pro Gln Thr Asn Ser Tyr Thr Arg Lys Phe Leu Leu Asn Ser Pro

100 105 110

Trp Lys Pro Ala Ala Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro

115 120 125

Arg Tyr Arg Trp Tyr Asp Arg Phe Met Ile Arg Leu Ile Met Lys Met

130 135 140

Thr Gly Gly Glu Thr Asp Thr Arg Lys Glu Val Val Tyr Thr Asp Trp

145 150 155 160

Ser Gln Val Ala Ser Phe Ala Arg Glu Ile Val Gln Leu Thr Arg Ser

165 170 175

Ser Arg Leu

<210> 57

<211> 178

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 57

Lys Ala Leu Val Leu Tyr Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr His Ala Ile

1 5 10 15

Ala Ser Tyr Ile Ala Ser Cys Met Lys Glu Lys Ala Glu Cys Asp Val

20 25 30

Ile Asp Leu Thr His Gly Glu His Val Asn Leu Thr Gln Tyr Asp Gln

35 40 45

Val Leu Ile Gly Ala Asn Ile Arg Tyr Gly His Phe Asn Ala Val Leu

50 55 60

Asp Lys Phe Ile Lys Arg Asn Val Asp Gln Leu Asn Asn Met Pro Ser

65 70 75 80

Ala Phe Phe Cys Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg Thr

85 90 95

Pro Gln Thr Asn Pro Tyr Val Arg Lys Phe Leu Leu Ala Thr Pro Trp

100 105 110

Gln Pro Ala Leu Cys Gly Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro Arg

115 120 125

Tyr Arg Trp Ile Asp Lys Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Met Thr

130 135 140

Gly Gly Glu Thr Asp Thr Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp Glu

145 150 155 160

Gln Val Lys Lys Phe Ala Glu Asp Phe Ala Lys Leu Ser Tyr Lys Lys

165 170 175

Ala Leu

<210> 58

<211> 172

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 58

Lys Ala Leu Val Leu Tyr Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr His Ala Ile

1 5 10 15

Ala Ser Tyr Ile Ala Ser Cys Met Lys Glu Lys Ala Glu Cys Asp Val

20 25 30

Ile Asp Leu Thr His Gly Glu His Val Asn Leu Thr Gln Tyr Asp Gln

35 40 45

Val Leu Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe Asn Ala Val Leu

50 55 60

Asp Lys Phe Ile Lys Arg Asn Val Asp Gln Leu Asn Asn Met Pro Ser

65 70 75 80

Ala Phe Phe Cys Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg Thr

85 90 95

Pro Gln Thr Asn Pro Tyr Val Arg Lys Phe Leu Leu Ala Thr Pro Trp

100 105 110

Gln Pro Ala Leu Cys Gly Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro Arg

115 120 125

Tyr Arg Trp Ile Asp Lys Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Met Thr

130 135 140

Gly Gly Glu Thr Asp Thr Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp Glu

145 150 155 160

Gln Val Lys Lys Phe Ala Glu Asp Phe Ala Lys Leu

165 170

<210> 59

<211> 179

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 59

Lys Thr Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Arg Glu Ile

1 5 10 15

Ala Ala Phe Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Gln Gly Ile Tyr Ala Asp

20 25 30

Val Ile Asn Leu Asn Arg Thr Glu Glu Ile Ala Trp Gln Glu Tyr Asp

35 40 45

Arg Val Val Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe His Pro Ala

50 55 60

Val Asp Arg Phe Val Lys Lys His Thr Glu Thr Leu Asn Ser Leu Pro

65 70 75 80

Gly Ala Phe Phe Ser Val Asn Leu Val Ala Arg Lys Ala Glu Lys Arg

85 90 95

Thr Pro Gln Thr Asn Ser Tyr Thr Arg Lys Phe Leu Leu Asn Ser Pro

100 105 110

Trp Lys Pro Ala Ala Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro

115 120 125

Arg Tyr Arg Trp Tyr Asp Arg Phe Met Ile Arg Leu Ile Met Lys Met

130 135 140

Thr Gly Gly Glu Thr Asp Thr Arg Lys Glu Val Val Tyr Thr Asp Trp

145 150 155 160

Ser Gln Ile Ala Ser Phe Ala Arg Glu Ile Val Gln Leu Thr Arg Ser

165 170 175

Ser Arg Leu

<210> 60

<211> 504

<212> PRT

<213> Amaranthus tuberculatus

<400> 60

Met Gly Asn Ile Ser Glu Arg Glu Glu Pro Thr Ser Ala Lys Arg Val

1 5 10 15

Ala Val Val Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Lys Leu

20 25 30

Lys Ser His Gly Leu Ser Val Thr Leu Phe Glu Ala Asp Ser Arg Ala

35 40 45

Gly Gly Lys Leu Lys Thr Val Lys Lys Asp Gly Phe Ile Trp Asp Glu

50 55 60

Gly Ala Asn Thr Met Thr Glu Ser Glu Ala Glu Val Ser Ser Leu Ile

65 70 75 80

Asp Asp Leu Gly Leu Arg Glu Lys Gln Gln Leu Pro Ile Ser Gln Asn

85 90 95

Lys Arg Tyr Ile Ala Arg Asp Gly Leu Pro Val Leu Leu Pro Ser Asn

100 105 110

Pro Ala Ala Leu Leu Thr Ser Asn Ile Leu Ser Ala Lys Ser Lys Leu

115 120 125

Gln Ile Met Leu Glu Pro Phe Leu Trp Arg Lys His Asn Ala Thr Glu

130 135 140

Leu Ser Asp Glu His Val Gln Glu Ser Val Gly Glu Phe Phe Glu Arg

145 150 155 160

His Phe Gly Lys Glu Phe Val Asp Tyr Val Ile Asp Pro Phe Val Ala

165 170 175

Gly Thr Cys Gly Gly Asp Pro Gln Ser Leu Ser Met His His Thr Phe

180 185 190

Pro Glu Val Trp Asn Ile Glu Lys Arg Phe Gly Ser Val Phe Ala Gly

195 200 205

Leu Ile Gln Ser Thr Leu Leu Ser Lys Lys Glu Lys Gly Gly Glu Asn

210 215 220

Ala Ser Ile Lys Lys Pro Arg Val Arg Gly Ser Phe Ser Phe Gln Gly

225 230 235 240

Gly Met Gln Thr Leu Val Asp Thr Met Cys Lys Gln Leu Gly Glu Asp

245 250 255

Glu Leu Lys Leu Gln Cys Glu Val Leu Ser Leu Ser Tyr Asn Gln Lys

260 265 270

Gly Ile Pro Ser Leu Gly Asn Trp Ser Val Ser Ser Met Ser Asn Asn

275 280 285

Thr Ser Glu Asp Gln Ser Tyr Asp Ala Val Val Val Thr Ala Pro Ile

290 295 300

Arg Asn Val Lys Glu Met Lys Ile Met Lys Phe Gly Asn Pro Phe Ser

305 310 315 320

Leu Asp Phe Ile Pro Glu Val Thr Tyr Val Pro Leu Ser Val Met Ile

325 330 335

Thr Ala Phe Lys Lys Asp Lys Val Lys Arg Pro Leu Glu Gly Phe Gly

340 345 350

Val Leu Ile Pro Ser Lys Glu Gln His Asn Gly Leu Lys Thr Leu Gly

355 360 365

Thr Leu Phe Ser Ser Met Met Phe Pro Asp Arg Ala Pro Ser Asp Met

370 375 380

Cys Leu Phe Thr Thr Phe Val Gly Gly Ser Arg Asn Arg Lys Leu Ala

385 390 395 400

Asn Ala Ser Thr Asp Glu Leu Lys Gln Ile Val Ser Ser Asp Leu Gln

405 410 415

Gln Leu Leu Gly Thr Glu Asp Glu Pro Ser Phe Val Asn His Leu Phe

420 425 430

Trp Ser Asn Ala Phe Pro Leu Tyr Gly His Asn Tyr Asp Ser Val Leu

435 440 445

Arg Ala Ile Asp Lys Met Glu Lys Asp Leu Pro Gly Phe Phe Tyr Ala

450 455 460

Gly Asn His Lys Gly Gly Leu Ser Val Gly Lys Ala Met Ala Ser Gly

465 470 475 480

Cys Lys Ala Ala Glu Leu Val Ile Ser Tyr Leu Asp Ser His Ile Tyr

485 490 495

Val Lys Met Asp Glu Lys Thr Ala

500

<210> 61

<211> 537

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 61

atgaaagcgc tggtgctgta tagcacccgc gatggccaga cccatgcgat tgcgagctat 60

attgcgagct gcatgaaaga aaaagcggaa tgcgatgtga ttgatctgac ccatggcgaa 120

catgtgaacc tgacccagta tgatcaggtg ctgattggcg cgagcattcg ctatggccat 180

tttaacgcgg tgctggataa atttattaaa cgcaacgtgg atcagctgaa caacatgccg 240

agcgcgtttt tttgcgtgaa cctgaccgcg cgcaaaccgg aaaaacgcac cccgcagacc 300

aacccgtatg tgcgcaaatt tctgctggcg accccgtggc agccggcgct gtgcggcgtg 360

tttgcgggcg cgctgcgcta tccgcgctat cgctggattg ataaagtgat gattcagctg 420

attatgcgca tgaccggcgg cgaaaccgat accagcaaag aagtggaata taccgattgg 480

gaacaggtga aaaaatttgc ggaagatttt gcgaaactga gctataaaaa agcgctg 537

<210> 62

<211> 534

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 62

atgaaagcgc tgattctgtt tagcacccgc gatggccaga cccagaaaat tgcgagcgcg 60

attgcggatg aaattaaagg ccagcagagc tgcgatgtga ttaacattca ggatgcgaaa 120

accctggatt ggcagcagta tgatcgcgtg ctgattggcg cgagcattcg ctatggccat 180

tttcagccgg tggtgaacga atttgtgaaa cataacctgc tggcgctgca gcagcgcgtg 240

agcggctttt ttagcgtgaa cctgaccgcg cgcaaaccgg aaaaacgcag cccggaaacc 300

aacgcgtata ccgtgaaatt tctggcgcag agcccgtggc agccggattg ctgcgcggtg 360

tttgcgggcg cgctgtatta tccgcgctat cgctggtttg atcgcgtgat gattcagttt 420

attatgcgca tgaccggcgg cgaaaccgat gcgagcaaag aagtggaata taccgattgg 480

cagcaggtgc agcgctttgc gcgcgatttt gcgcagctgc cgggcaaaag ctat 534

<210> 63

<211> 531

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 63

atgaaagcgc tgattctgta tagcacccgc gatggccaga cccgcaaaat tgcgagcagc 60

attgcggatg tgattcgcca gcagcagcag tgcgatgtgc tgaacattaa agatgcgagc 120

ctgccggatt gggcgcagta tgatcgcgtg ctgattggcg cgagcattcg ctatggccat 180

tttcagccgg tggtggataa atttgtgaaa cagcatctgc atgaactgca gcagcgcacc 240

agcggctttt ttagcgtgaa cctgaccgcg cgcaaaccgg aaaaacgcag cccggaaacc 300

aacgcgtata cccagaaatt tctggcgcat agcccgtggc agccggattg ctgcgcggtg 360

tttgcgggcg cgctgtatta tccgcgctat cgctggtttg atcgcgtgat gattcagctg 420

attatgcgca tgaccggcgg cgaaaccgat agcaccaaag aagtggaata taccgattgg 480

cagcaggtga gcacctttgc gaacgatttt gcgcagctgc cgggcaaaag c 531

<210> 64

<211> 546

<212> ДНК

<213> Escherichia coli

<400> 64

gtgaaaacat taattctttt ctcaacaagg gacggacaaa cgcgcgagat tgcctcctac 60

ctggcttcgg aactgaaaga actggggatc caggcggatg tcgccaatgt gcaccgcatt 120

gaagaaccac agtgggaaaa ctatgaccgt gtggtcattg gtgcttctat tcgctatggt 180

cactaccatt cagcgttcca ggaatttgtc aaaaaacatg cgacgcggct gaattcgatg 240

ccgagcgcct tttactccgt gaatctggtg gcgcgcaaac cggagaagcg tactccacag 300

accaacagct acgcgcgcaa gtttctgatg aactcgcaat ggcgtcccga tcgctgcgcg 360

gtcattgccg gggcgctgcg ttacccacgt tatcgctggt acgaccgttt tatgatcaag 420

ctgattatga agatgtcagg cggtgaaacg gatacgcgca aagaagttgt ctataccgat 480

tgggagcagg tggcgaattt cgcccgagaa atcgcccatt taaccgacaa accgacgctg 540

aaataa 546

<210> 65

<211> 534

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 65

atgaaagcgc tgattctgtt tagcagccgc gaaggccaga cccgcgaaat tgcgagctat 60

attgcgaaca gcattaaaga agaaatggaa tgcgatgtgt ttaacattct gcgcgtggaa 120

cagattgatt ggagccagta tgatcgcgtg ctgattggcg gcagcattca ttatggccat 180

tttcatccgg cggtggcgaa atttgtgaaa cgccatctgc atgaactgca gcagcgcagc 240

agcggctttt tttgcgtgaa cctgaccgcg cgcaaagcgg ataaacgcac cccgcagacc 300

aacgcgtata tgcgcaaatt tctgctgcag agcccgtggc agccggattg ctgcgcggtg 360

tttgcgggcg cgctgcgcta tacccgctat cgctggtttg atcgcgtgat gattcagctg 420

attatgcgca tgaccggcgg cgaaaccgat accagcaaag aagtggaata taccgattgg 480

acccaggtgg cgcgctttgc gcaggaattt gcgcatctgc cgggcaaaac ccag 534

<210> 66

<211> 537

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 66

atgaaagcgc tgattgtgtt tagcagccgc gatggccaga cccgcgcgat tgcgagctat 60

attgcgaaca ccctgaaagg caccctggaa tgcgatgtgg tgaacgtgct gaacgcgaac 120

gatattgatc tgagccagta tgatcgcgtg gcgattggcg cgagcattcg ctatggccgc 180

tttcatccgg cggtgaacca gtttattcgc aaacatctga ccagcctgca gcagctgccg 240

agcgcgtttt ttagcgtgaa cctgaccgcg cgcaaaccgg aaaaacgcac cattcagacc 300

aacgcgtata cccgcaaatt tctgctgaac agcccgtggc agccggatct gtgctgcgtg 360

tttgcgggcg cgctgcgcta tccgcgctat cgctggtttg atcgcgtgat gattcagctg 420

attatgcgca ttaccggcgg cgaaaccgat agcaccaaag aaattgaata taccgattgg 480

cagcaggtgg cgcgctttgc gcaggatttt gcgcagctgg cggcgaaaaa cccggcg 537

<210> 67

<211> 537

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 67

atgaagacct tgatcctatt ctccaccagg gacggccaaa cacacaagat cgcaaggcac 60

atcgcaggag tcctcgaaga gcaggggaag gcctgcgagt tggtcgatct gttacagccc 120

ggcgaaccag actggagtac cgttgaatgc gtcgttctag gggccagcat tagatatggt 180

cacttccata agtctttcat caggttcgta aacactcacg cgcagcgctt gaataatatg 240

ccaggcgccc ttttcacagt taacttagtc gcccgaaagc ccgagaagca gagtccacag 300

acgaactctt acacccgcaa gtttctcgcc gcctcccctt ggcagccaca gcgatgccaa 360

gttttcgcgg gcgctttgag gtaccctagg tactcgtggt acgacagaat gatgatacgt 420

ttgataatga agatggccgg gggcgagact gacacaagga aggaggttga gtacactgac 480

tggcagtcgg tgactcggtt cgcgagggag atcgctcagc tgccgggaga gacgcgg 537

<210> 68

<211> 534

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 68

atgaaagcgc tgattctgtt tagcagccgc gatggccaga cccagctgat tgcgagcagc 60

attgcgaaag aactggaagg caaacaggcg tgcgatgtgc tgaacattct ggataccacc 120

aacgtggaat ggacccagta tgatcgcgtg ctgattggcg cgagcattcg ctatggccat 180

tttcatccgg cggtggcgga atttgtgaaa cgccatcagc gcgaactgca gcagcgcagc 240

agcggctttt ttagcgtgaa cctgaccgcg cgcaaaccgg aaaaacgcag cccggaaacc 300

aacgcgtata ccgcgaaatt tctgaaccag agcccgtggc agccggattg ctgcgcggtg 360

tttgcgggcg cgctgcgcta tccgcgctat cgctggtttg atcgcattat gattcagctg 420

attatgcgca tgaccggcgg cgaaaccgat agcagcaaag aagtggaata taccgattgg 480

cagcaggtga cccgctttgc gcaggaattt gcgcgcctgc cgggcaaaac cagc 534

<210> 69

<211> 540

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 69

atgaaaaccc tgattctgtt tagcacccgc gatggccaga cccgcgaaat tgcggcgttt 60

ctggcgagcg aactgaaaga acagggcatt tatgcggatg tgattaacct gaaccgcacc 120

gaagaaattg cgtggcagga atatgatcgc gtggtgattg gcgcgagcat tcgctatggc 180

cattttcatc cggcggtgga tcgctttgtg aaaaaacata ccgaaaccct gaacagcctg 240

ccgggcgcgt tttttagcgt gaacctggtg gcgcgcaaag cggaaaaacg caccccgcag 300

accaacagct atacccgcaa atttctgctg aacagcccgt ggaaaccggc ggcgtgcgcg 360

gtgtttgcgg gcgcgctgcg ctatccgcgc tatcgctggt atgatcgctt tatgattcgc 420

ctgattatga aaatgaccgg cggcgaaacc gatacccgca aagaagtggt gtataccgat 480

tggagccagg tggcgagctt tgcgcgcgaa attgtgcagc tgacccgcag cagccgcctg 540

<210> 70

<211> 531

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 70

atgaaaattc tgattctgtt tagcacccgc gatggccaga cccgcgaaat tgcggcgagc 60

ctggcgagcg aactgaaaga acaggcgttt gatgtggatg tggtgaacct gcatcgcgcg 120

gaaaacattg cgtgggaaga atatgatggc gtggtgattg gcgcgagcat tcgctatggc 180

cattttcata gcaccctgaa cagctttgtg aaaaaacatc agcaggcgct gaaaaaactg 240

ccgggcgcgt tttatagcgt gaacctggtg gcgcgcaaac cggaaaaacg caccccgcag 300

accaacagct atacccgcaa atttctgctg gatagcccgt ggcagccgga tctgagcgcg 360

gtgtttgcgg gcgcgctgcg ctatccgcgc tataactggt atgatcgcat tatgattcgc 420

ctgattatga aaattaccgg cggcgaaacc gatacccgca aagaagtggt gtataccgat 480

tggcagcagg tgacccattt tgcgcatgaa attgtgcagc tggtgcgcaa a 531

<210> 71

<211> 540

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 71

atgaaggcct tggtactgta ctcgacgcgg gacggccaga cccacgcaat tgcttcatac 60

atcgcctcct gcatgaagga gaaggccgaa tgcgacgtga tcgacctcac ccacggggag 120

cacgtgaacc tcacccaata cgatcaggtg ctaatcggtg cgagtattcg ttacggccac 180

ttcaacgccg tgcttgacaa gttcatcaag agaaacgtgg atcagctgaa caacatgcca 240

agcgcgttct tctgcgtaaa cctcacagca aggaagcccg agaagcgtac tccccagaca 300

aacccttatg tccgaaaatt cttgcttgct accccctggc agcccgcgtt gtgcggagtg 360

ttcgcagggg cccttcggta cccgcgatac cggtggatcg acaaggtgat gatccagcta 420

ataatgcgga tgactggggg agagacagac acgagcaagg aggtcgagta cacggattgg 480

gagcaggtta agaagttcgc ggaggatttt gcaaagctat cgtacaagaa ggccctctag 540

<210> 72

<211> 537

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 72

atgaaggcct tgatcctgtt ctctacacgc gacggacaga cacagaagat cgcatctgcc 60

atcgctgatg agataaaggg gcagcaatcg tgcgacgtga ttaacataca ggatgccaaa 120

accctcgact ggcagcagta cgaccgggta ctcatcggcg cctccattcg ttacgggcat 180

ttccagcccg ttgtgaatga gtttgtcaag cacaacctct tggccctaca gcagagagtt 240

tccggattct tctccgtgaa cttgacagcc cgaaagccag agaagcggag ccccgagact 300

aacgcttata cagtcaaatt cttggcgcag tcaccctggc aaccggactg ctgcgctgtt 360

tttgcggggg ccctgtacta cccacggtac cggtggttcg atagggtgat gatacagttc 420

ataatgcgaa tgacgggggg agagaccgac gcatcgaaag aggtggagta cactgactgg 480

cagcaggtgc agcggttcgc gcgagacttc gcgcagttac cgggtaagtc ctactga 537

<210> 73

<211> 534

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 73

atgaaggcgc tgatcttgta ctcaaccagg gacggtcaga ctcgcaagat tgcaagtagc 60

attgcggacg tcatcaggca gcagcagcag tgcgacgtct taaacattaa agacgcatca 120

cttcctgact gggcccaata tgaccgagtg ctcatcggag ctagcatccg ttacgggcat 180

ttccagcccg ttgtagacaa gttcgtgaag cagcacttgc acgagcttca gcagcggacc 240

tccggcttct tctccgtgaa cctgacggcg aggaagcctg aaaaaaggag ccctgagacc 300

aatgcctaca cccagaaatt cttggcgcac tccccttggc agcccgattg ctgtgccgtt 360

ttcgcggggg ccctttacta ccccaggtac cgttggttcg accgggtgat gatccagttg 420

attatgcgca tgactggtgg agagaccgac tctaccaagg aagtggagta cactgactgg 480

cagcaggtga gtaccttcgc caacgatttt gcccagcttc caggcaagag ctaa 534

<210> 74

<211> 546

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 74

atgaagacct tgattctatt ctccacaagg gacggccaga ctagggagat cgcttcctac 60

ctggccagcg agctaaagga gcttggcatt caggcagacg tggctaacgt gcaccgaatt 120

gaggagccgc agtgggagaa ctacgatcgg gtcgtgatcg gcgccagcat ccggtatgga 180

cactaccaca gcgcgttcca ggagttcgtg aaaaagcacg cgacccgtct gaatagcatg 240

ccatcagcgt tctactcggt caacctcgtg gctcgtaagc ccgagaagcg gacaccccag 300

accaactcgt atgccaggaa gttccttatg aactcgcagt ggcgaccgga ccgctgcgcg 360

gtgatcgccg gtgcgctcag gtaccctcgt tataggtggt acgacaggtt tatgattaaa 420

cttataatga aaatgagcgg cggagagacc gacaccagaa aagaggtggt ttacacagac 480

tgggagcagg tagcaaactt cgctagggag attgctcacc tcaccgacaa gccgaccttg 540

aagtaa 546

<210> 75

<211> 537

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 75

atgaaggccc ttatactgtt cagttccaga gaaggccaga cgagggagat agcgagttac 60

attgccaact cgataaagga ggaaatggaa tgcgacgtgt tcaacatcct tcgtgtggag 120

cagatcgact ggtctcaata cgaccgcgtc ctgatcgggg gctcgataca ctacggccat 180

ttccacccag cggtggcaaa atttgtcaag aggcacctcc atgagttgca acagaggtct 240

tccggctttt tctgcgtcaa cctgacggcc aggaaggccg acaagcggac tccccagacc 300

aatgcctaca tgagaaagtt cttgttgcag tccccatggc aacccgattg ctgcgccgtg 360

tttgcggggg cccttaggta cacccgttac aggtggttcg acagggtaat gattcagctg 420

atcatgagga tgacgggcgg agagactgac acatcgaagg aggtggagta cacagactgg 480

acgcaggtcg cccgcttcgc gcaggagttc gcccatttgc ccggcaaaac tcagtga 537

<210> 76

<211> 540

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 76

atgaaggctc ttatcgtatt ctcttcgagg gatggccaaa cccgagcgat cgcgtcttat 60

attgctaata ccctcaaagg gaccctagag tgcgacgtcg tcaacgtcct caatgctaac 120

gacattgatt tgagccagta cgaccgtgtg gccattggcg cctccattcg ctacgggagg 180

ttccacccag ctgttaacca gtttatccgg aagcacctta cgagcctcca gcagctacca 240

tctgcgttct tctccgtgaa cctcacagct cggaagcccg agaagaggac tatacaaacc 300

aacgcgtaca ctaggaagtt tctactgaac tcgccgtggc agccggacct gtgctgcgtg 360

ttcgcgggag cccttcgcta tccccgttac aggtggtttg accgagtgat gattcaactc 420

ataatgcgca taacgggggg cgagacagac tccaccaagg agatcgagta caccgactgg 480

cagcaggtcg cgcgattcgc ccaggatttt gcacagcttg ccgcaaagaa cccggcatga 540

<210> 77

<211> 540

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 77

atgaagacct tgatcctatt ctccaccagg gacggccaaa cacacaagat cgcaaggcac 60

atcgcaggag tcctcgaaga gcaggggaag gcctgcgagt tggtcgatct gttacagccc 120

ggcgaaccag actggagtac cgttgaatgc gtcgttctag gggccagcat tagatatggt 180

cacttccata agtctttcat caggttcgta aacactcacg cgcagcgctt gaataatatg 240

ccaggcgccc ttttcacagt taacttagtc gcccgaaagc ccgagaagca gagtccacag 300

acgaactctt acacccgcaa gtttctcgcc gcctcccctt ggcagccaca gcgatgccaa 360

gttttcgcgg gcgctttgag gtaccctagg tactcgtggt acgacagaat gatgatacgt 420

ttgataatga agatggccgg gggcgagact gacacaagga aggaggttga gtacactgac 480

tggcagtcgg tgactcggtt cgcgagggag atcgctcagc tgccgggaga gacgcggtag 540

<210> 78

<211> 537

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 78

atgaaggccc taattttatt cagtagtagg gacggccaga cccagcttat agcatcgtct 60

atcgccaagg agctcgaagg gaagcaggcg tgcgacgtgt tgaatatcct cgacacgact 120

aatgtggagt ggacccagta cgaccgcgtg ctgattggag catccatccg gtacgggcac 180

tttcaccctg cggtcgccga gttcgtaaag cgtcaccagc gagagctaca gcagagaagt 240

agtggctttt tctctgtgaa cttgacggcc cgtaagccgg aaaagaggtc ccccgagact 300

aacgcctata ccgccaagtt ccttaaccaa agtccatggc agcctgactg ttgcgctgtg 360

ttcgctgggg ctttgcgata ccctcggtac cgctggttcg acagaattat gatccagcta 420

atcatgcgga tgactggggg tgagacagat tcttcaaagg aggtcgagta caccgactgg 480

cagcaggtga cccgcttcgc gcaagagttc gccaggcttc cgggaaagac cagttga 537

<210> 79

<211> 543

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 79

atgaagaccc taatactgtt ctctacccgc gacgggcaga caagggagat cgccgcgttc 60

cttgcctcgg agctgaagga gcaggggatt tacgctgacg tcataaacct taaccggacg 120

gaggagatag cttggcagga gtatgataga gtcgtaatcg gggcgtcgat ccgatacggg 180

catttccacc ctgctgtcga ccgcttcgtg aagaagcaca cagagacact caactcactg 240

cccggcgcct ttttctctgt aaaccttgtt gcccggaaag ccgagaagag aacgccgcag 300

acgaactcat acaccaggaa gttcctatta aacagcccgt ggaagccagc ggcctgcgcg 360

gtctttgctg gggccctccg ctaccctaga taccgctggt acgacaggtt catgatacga 420

ctgattatga aaatgacagg cggggagacg gatacccgaa aggaggtagt ctacactgac 480

tggtcgcagg tcgcgtcgtt tgccagagag atagtccagt tgaccaggtc atcgcgcttg 540

tga 543

<210> 80

<211> 534

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 80

atgaagatat taatcctttt ctccacccgt gacggccaaa cccgtgagat tgcggcgtcc 60

ttggcgtccg aactcaagga gcaggcattc gacgtggacg tcgtcaacct tcaccgggcc 120

gagaacatcg catgggagga gtacgacggt gttgtcatcg gagcgtccat caggtacggc 180

cactttcata gtaccctgaa ctcatttgtc aagaagcatc agcaggctct taagaagctt 240

cccggggctt tctacagcgt gaacctcgtc gcccggaagc ctgagaagcg cacaccgcag 300

accaatagct acacccgcaa gttcctcttg gattccccgt ggcagcccga cctttcagcc 360

gtgttcgccg gggcactcag gtaccctcgg tacaattggt acgaccgtat catgattaga 420

cttatcatga agattacagg cggcgagact gataccagga aggaagtagt ctacacagac 480

tggcagcagg tcactcactt tgctcacgag atcgtccagc tcgtgcggaa gtag 534

<210> 81

<211> 537

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 81

aaggccttgg tactgtactc gacgcgggac ggccagaccc acgcaattgc ttcatacatc 60

gcctcctgca tgaaggagaa ggccgaatgc gacgtgatcg acctcaccca cggggagcac 120

gtgaacctca cccaatacga tcaggtgcta atcggtgcga gtattcgtta cggccacttc 180

aacgccgtgc ttgacaagtt catcaagaga aacgtggatc agctgaacaa catgccaagc 240

gcgttcttct gcgtaaacct cacagcaagg aagcccgaga agcgtactcc ccagacaaac 300

ccttatgtcc gaaaattctt gcttgctacc ccctggcagc ccgcgttgtg cggagtgttc 360

gcaggggccc ttcggtaccc gcgataccgg tggatcgaca aggtgatgat ccagctaata 420

atgcggatga ctgggggaga gacagacacg agcaaggagg tcgagtacac ggattgggag 480

caggttaaga agttcgcgga ggattttgca aagctatcgt acaagaaggc cctctag 537

<210> 82

<211> 534

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 82

aaggccttga tcctgttctc tacacgcgac ggacagacac agaagatcgc atctgccatc 60

gctgatgaga taaaggggca gcaatcgtgc gacgtgatta acatacagga tgccaaaacc 120

ctcgactggc agcagtacga ccgggtactc atcggcgcct ccattcgtta cgggcatttc 180

cagcccgttg tgaatgagtt tgtcaagcac aacctcttgg ccctacagca gagagtttcc 240

ggattcttct ccgtgaactt gacagcccga aagccagaga agcggagccc cgagactaac 300

gcttatacag tcaaattctt ggcgcagtca ccctggcaac cggactgctg cgctgttttt 360

gcgggggccc tgtactaccc acggtaccgg tggttcgata gggtgatgat acagttcata 420

atgcgaatga cggggggaga gaccgacgca tcgaaagagg tggagtacac tgactggcag 480

caggtgcagc ggttcgcgcg agacttcgcg cagttaccgg gtaagtccta ctga 534

<210> 83

<211> 543

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 83

aagaccttga ttctattctc cacaagggac ggccagacta gggagatcgc ttcctacctg 60

gccagcgagc taaaggagct tggcattcag gcagacgtgg ctaacgtgca ccgaattgag 120

gagccgcagt gggagaacta cgatcgggtc gtgatcggcg ccagcatccg gtatggacac 180

taccacagcg cgttccagga gttcgtgaaa aagcacgcga cccgtctgaa tagcatgcca 240

tcagcgttct actcggtcaa cctcgtggct cgtaagcccg agaagcggac accccagacc 300

aactcgtatg ccaggaagtt ccttatgaac tcgcagtggc gaccggaccg ctgcgcggtg 360

atcgccggtg cgctcaggta ccctcgttat aggtggtacg acaggtttat gattaaactt 420

ataatgaaaa tgagcggcgg agagaccgac accagaaaag aggtggttta cacagactgg 480

gagcaggtag caaacttcgc tagggagatt gctcacctca ccgacaagcc gaccttgaag 540

taa 543

<210> 84

<211> 534

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 84

aaggccctta tactgttcag ttccagagaa ggccagacga gggagatagc gagttacatt 60

gccaactcga taaaggagga aatggaatgc gacgtgttca acatccttcg tgtggagcag 120

atcgactggt ctcaatacga ccgcgtcctg atcgggggct cgatacacta cggccatttc 180

cacccagcgg tggcaaaatt tgtcaagagg cacctccatg agttgcaaca gaggtcttcc 240

ggctttttct gcgtcaacct gacggccagg aaggccgaca agcggactcc ccagaccaat 300

gcctacatga gaaagttctt gttgcagtcc ccatggcaac ccgattgctg cgccgtgttt 360

gcgggggccc ttaggtacac ccgttacagg tggttcgaca gggtaatgat tcagctgatc 420

atgaggatga cgggcggaga gactgacaca tcgaaggagg tggagtacac agactggacg 480

caggtcgccc gcttcgcgca ggagttcgcc catttgcccg gcaaaactca gtga 534

<210> 85

<211> 537

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 85

aaggctctta tcgtattctc ttcgagggat ggccaaaccc gagcgatcgc gtcttatatt 60

gctaataccc tcaaagggac cctagagtgc gacgtcgtca acgtcctcaa tgctaacgac 120

attgatttga gccagtacga ccgtgtggcc attggcgcct ccattcgcta cgggaggttc 180

cacccagctg ttaaccagtt tatccggaag caccttacga gcctccagca gctaccatct 240

gcgttcttct ccgtgaacct cacagctcgg aagcccgaga agaggactat acaaaccaac 300

gcgtacacta ggaagtttct actgaactcg ccgtggcagc cggacctgtg ctgcgtgttc 360

gcgggagccc ttcgctatcc ccgttacagg tggtttgacc gagtgatgat tcaactcata 420

atgcgcataa cggggggcga gacagactcc accaaggaga tcgagtacac cgactggcag 480

caggtcgcgc gattcgccca ggattttgca cagcttgccg caaagaaccc ggcatga 537

<210> 86

<211> 537

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 86

aagaccttga tcctattctc caccagggac ggccaaacac acaagatcgc aaggcacatc 60

gcaggagtcc tcgaagagca ggggaaggcc tgcgagttgg tcgatctgtt acagcccggc 120

gaaccagact ggagtaccgt tgaatgcgtc gttctagggg ccagcattag atatggtcac 180

ttccataagt ctttcatcag gttcgtaaac actcacgcgc agcgcttgaa taatatgcca 240

ggcgcccttt tcacagttaa cttagtcgcc cgaaagcccg agaagcagag tccacagacg 300

aactcttaca cccgcaagtt tctcgccgcc tccccttggc agccacagcg atgccaagtt 360

ttcgcgggcg ctttgaggta ccctaggtac tcgtggtacg acagaatgat gatacgtttg 420

ataatgaaga tggccggggg cgagactgac acaaggaagg aggttgagta cactgactgg 480

cagtcggtga ctcggttcgc gagggagatc gctcagctgc cgggagagac gcggtag 537

<210> 87

<211> 540

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 87

aagaccctaa tactgttctc tacccgcgac gggcagacaa gggagatcgc cgcgttcctt 60

gcctcggagc tgaaggagca ggggatttac gctgacgtca taaaccttaa ccggacggag 120

gagatagctt ggcaggagta tgatagagtc gtaatcgggg cgtcgatccg atacgggcat 180

ttccaccctg ctgtcgaccg cttcgtgaag aagcacacag agacactcaa ctcactgccc 240

ggcgcctttt tctctgtaaa ccttgttgcc cggaaagccg agaagagaac gccgcagacg 300

aactcataca ccaggaagtt cctattaaac agcccgtgga agccagcggc ctgcgcggtc 360

tttgctgggg ccctccgcta ccctagatac cgctggtacg acaggttcat gatacgactg 420

attatgaaaa tgacaggcgg ggagacggat acccgaaagg aggtagtcta cactgactgg 480

tcgcaggtcg cgtcgtttgc cagagagata gtccagttga ccaggtcatc gcgcttgtga 540

<210> 88

<211> 537

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 88

aaggccttgg tactgtactc gacgcgggac ggccagaccc acgcaattgc ttcatacatc 60

gcctcctgca tgaaggagaa ggccgaatgc gacgtgatcg acctcaccca cggggagcac 120

gtgaacctca cccaatacga tcaggtgcta atcggtgcga gtattcgtta cggccacttc 180

aacgccgtgc ttgacaagtt catcaagaga aacgtggatc agctgaacaa catgccaagc 240

gcgttcttct gcgtaaacct cacggcaagg aagcccgaga agcgtactcc ccagacaaac 300

ccttatgtcc gaaaattctt gcttgctacc ccctggcagc ccgcgttgtg cggagtgttc 360

gcaggggccc ttcggtaccc gcgataccgg tggatcgaca aggtgatgat ccagctaata 420

atgcggatga ctgggggaga gacagacacg agcaaggagg tcgagtacac ggattgggag 480

caggttaaga agttcgcgga ggattttgca aagctatcgt acaagaaggc cctctag 537

<210> 89

<211> 537

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 89

aaggccttgg tactgtactc gacgcgggac ggccagaccc acgcaattgc ttcatacatc 60

gcctcctgca tgaaggagaa ggccgaatgc gacgtgatcg acctcaccca cggggagcac 120

gtgaacctca cccaatacga tcaggtgcta atcggtgcga atattcgtta cggccacttc 180

aacgccgtgc ttgacaagtt catcaagaga aacgtggatc agctgaacaa catgccaagc 240

gcgttcttct gcgtaaacct cacagcaagg aagcccgaga agcgtactcc ccagacaaac 300

ccttatgtcc gaaaattctt gcttgctacc ccctggcagc ccgcgttgtg cggagtgttc 360

gcaggggccc ttcggtaccc gcgataccgg tggatcgaca aggtgatgat ccagctaata 420

atgcggatga ctgggggaga gacagacacg agcaaggagg tcgagtacac ggattgggag 480

caggttaaga agttcgcgga ggattttgca aagctatcgt acaagaaggc cctctag 537

<210> 90

<211> 537

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 90

aaggccttgg tactgtactc gacgcgggac ggccagaccc acgcaattgc ttcatacatc 60

gcctcctgca tgaaggagaa ggccgaatgc gacgtgatcg acctcaccca cggggagcac 120

gtgaacctca cccaatacga tcaggtgcta atcggtgcga gtattcgtta cggccacttc 180

aacgccgtgc ttgacaagtt catcaagaga aacgtggatc agctgaacaa catgccaagc 240

gcgttcttct gcgtaaacct cacagcaagg aagcccgaga agcgtactcc ccagacaaac 300

ccttatgtcc gaaaattctt gcttgctacc ccctggcagc ccgcgttgtg cggagtgttc 360

gcaggggccc ttcggtaccc gcgataccgg tggatcgaca aggtgatgat ccagctaata 420

atgcggatga ctgggggaga gacagacacg agcaaggagg tcgagtacac ggattgggag 480

caggttaaga agttcgcgga ggattttgca aagctatagt acaagaaggc cctctag 537

<210> 91

<211> 534

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 91

aaggccttga tcctgttctc tacacgcgac ggacagacac agaagatcgc atctgccatc 60

gctgatgaga taaaggggca gcaatcgtgc gacgtgatta acatacagga tgccaaaacc 120

ctcgactggc agcagtacga ccgggtactc atcggcgcct ccattcgtta cgggcatttc 180

cagcccgttg tgaatgagtt tgtcaagcac aacctcttgg ccctacagca gagagtttcc 240

ggattcttct ccgtgaactt gacagcccga aagccagaga agcggagccc cgagactaac 300

gcttatacag tcaaattctt ggcgcagtca ccctggcaac cggactgctg cgctgttttt 360

gcgggggccc tgtactaccc acggtaccgg tggttcgata gggtgatgat acagttcata 420

atgcgaatga cgggggggga gaccgacgca tcgaaagagg tggagtacac tgactggcag 480

caggtgcagc ggttcgcgcg agacttcgcg cagttaccgg gtaagtccta ctga 534

<210> 92

<211> 540

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 92

aagaccctaa tactgttctc tacccgcgac gggcagacaa gggagatcgc cgcgttcctt 60

gcctcggagc tgaaggagca ggggatttac gctgacgtca taaaccttaa ccggacggag 120

gagatagctt ggcaggagta tgatagagtc gtaatcgggg cgtcgatccg atacgggcat 180

ttccaccctg ctgtcgaccg cttcgtgaag aagcacacag agacactcaa ctcactgccc 240

ggcgcctttt tctctgtaaa ccttgttgcc cggaaagccg agaagagaac gccgcagacg 300

aactcataca ccaggaagtt cctattaaac agcccgtgga agccagcggc ctgcgcggtc 360

tttgctgggg ccctccgcta ccctagatac cgctggtacg acaggttcat gatacgactg 420

attatgaaaa tgacaggcgg ggagacggat acccgaaagg aggtagtcta cactgactgg 480

tcgcagatcg cgtcgtttgc cagagagata gtccagttga ccaggtcatc gcgcttgtga 540

<210> 93

<211> 540

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 93

atgaaggcgc tcgtgctcta cagcacacgc gacggccaga ctcatgcgat cgcctcttac 60

atcgcgtcct gtatgaagga gaaggccgag tgcgacgtca tcgatctcac gcacggggag 120

cacgtgaatc ttacgcagta cgaccaagtg ctgataggcg cctctatccg ttacggccat 180

tttaacgccg tcctcgacaa attcatcaag cgcaatgtag accagctgaa caacatgccc 240

tccgcgttct tttgcgtgaa cctgacggct cggaagcctg agaagcgaac acctcagacc 300

aacccatacg tgcggaaatt cctactcgca acgccatggc agcccgccct gtgcggggtt 360

ttcgcagggg cgctacgcta tccgcgttac cgctggatcg ataaggtgat gatccagcta 420

ataatgcgca tgaccggcgg cgagacagac acatcgaagg aagtcgaata cacagactgg 480

gaacaggtga agaagtttgc agaggatttc gccaagctct catacaaaaa ggcattgtga 540

<210> 94

<211> 537

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 94

atgaaggcgc ttatactgtt ctcgacacgc gacggtcaga cgcagaaaat cgcctcagcc 60

atcgccgacg agatcaaggg ccagcagagc tgcgatgtga tcaatattca ggacgccaaa 120

actctcgact ggcagcagta tgaccgcgtg ctcattggcg catcaatccg ctacgggcat 180

ttccagccag tcgtcaatga gtttgtgaaa cataacctct tggcattgca gcagcgggtg 240

tctggcttct tctccgtgaa ccttacagct agaaaaccag agaagcggtc gcccgagact 300

aacgcctaca ccgttaagtt ccttgcgcag tcaccgtggc agcctgattg ctgcgcggtc 360

ttcgccgggg cactgtacta ccctcgatac cggtggtttg atagggtaat gatccagttc 420

ataatgcgca tgaccggtgg ggagaccgac gcaagtaaag aagttgagta cacggattgg 480

cagcaggtgc aaaggttcgc acgcgacttc gcgcagctcc cgggcaagtc ttactga 537

<210> 95

<211> 534

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 95

atgaaagccc tgatcctcta ttccaccagg gacggccaga cccgcaagat agcctcctcc 60

atcgctgatg tcatccgcca gcagcagcag tgcgacgttt taaacattaa ggacgcttca 120

ctgcctgatt gggcccagta tgaccgcgtc ctgatcggcg cgtcgattcg gtacggccac 180

ttccagcctg tggttgacaa gttcgtcaag cagcacctgc atgagctgca gcagcgaact 240

agcgggttct tcagtgtgaa cctgacagct agaaagcccg aaaagagatc cccagaaacc 300

aacgcctata cgcagaaatt ccttgctcac tcaccctggc agcctgactg ttgtgccgtc 360

ttcgcgggcg ccttgtacta tccccgctac cgctggttcg atagggtgat gatccagctg 420

attatgagaa tgacgggagg ggagaccgat tcgaccaagg aggtagagta cactgactgg 480

caacaggtgt caactttcgc aaacgacttc gcacaactac ccggtaagtc ttga 534

<210> 96

<211> 546

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 96

atgaaaaccc taatactgtt ctcgacccgc gacggccaga cgcgtgagat tgcgagctac 60

ctggcctccg agctcaagga gctggggatc caagccgatg tcgcgaacgt gcaccgcatt 120

gaggagccgc agtgggagaa ttacgatcgc gttgtgatag gggccagcat ccgctatggc 180

cactaccact cggcctttca ggagtttgta aagaaacacg ccacaagatt aaactccatg 240

cctagcgcct tctactccgt caaccttgtc gcgcgcaagc cggagaagcg gacacctcag 300

acgaactcct acgcgcggaa gttcctgatg aacagccagt ggcggccgga cagatgtgct 360

gttattgcgg gagccctgag atacccgagg taccggtggt acgataggtt tatgattaaa 420

cttattatga agatgtctgg tggggagact gacaccagga aggaggtggt atatacagac 480

tgggagcagg tcgccaattt cgctcgggaa atcgcgcatc tgacagacaa gcctacactg 540

aagtag 546

<210> 97

<211> 537

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 97

atgaaggccc tgatcctctt tagctctagg gagggccaga cccgcgagat cgcgtcatat 60

atcgcgaatt ccataaagga ggagatggag tgcgatgtgt ttaacatcct tagggtggag 120

caaatagact ggtctcagta tgaccgtgtg ctcatagggg ggagcatcca ctacggccac 180

tttcacccgg ccgtggcgaa attcgtcaag cgacacctcc acgagcttca gcagcgctcc 240

tcagggttct tctgcgtcaa cctgacagca agaaaggcag ataaacgcac cccgcagacg 300

aacgcctaca tgaggaagtt ccttctgcag tctccttggc agcccgattg ctgcgcggtg 360

ttcgccggtg cactgcgcta tacgcgctat agatggtttg atagagtcat gattcagctc 420

atcatgcgga tgaccggcgg ggaaacggat actagtaagg aggtggagta cacggactgg 480

acccaggtgg cacgtttcgc ccaggagttt gcacatcttc ctgggaagac ccaatga 537

<210> 98

<211> 540

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 98

atgaaggcgc taattgtgtt cagctccagg gatggccaga cgagggctat agcatcctat 60

atcgccaata ccttgaaagg aacgctcgag tgtgacgtgg tcaacgtctt gaacgccaat 120

gacattgacc tttcccagta cgaccgagtt gccataggcg cgtcgatccg ctacgggcga 180

tttcaccctg cagtcaacca gtttatacgg aagcatttga cctcgctgca gcagctcccg 240

tcagccttct tctctgtgaa tttaaccgcg cggaagcctg agaaacggac gatccaaaca 300

aacgcctata cccgaaagtt cctcctgaac agcccatggc agccagacct gtgctgtgtc 360

ttcgccggcg cgttgcggta tccccgctac aggtggttcg atagagtgat gatccagctc 420

atcatgagga tcaccggggg agagaccgat agtaccaagg agatcgagta cacggactgg 480

cagcaggtgg ctcgcttcgc ccaggacttc gctcagttgg ccgcaaagaa tccagcataa 540

<210> 99

<211> 540

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 99

atgaagacac tgatcctgtt ctcgactcga gatggccaga ctcataaaat tgcgcgccac 60

attgcggggg tcctggagga gcagggcaaa gcgtgcgagc tcgtggactt actccagccc 120

ggggagccgg actggagcac ggtggagtgc gtcgttctgg gcgcttccat acgttacggg 180

catttccaca aaagtttcat ccggttcgtc aacacccacg ctcaacggct gaacaacatg 240

cctggcgcgc tattcactgt taacttagtg gctcgtaagc ccgagaagca gtctccgcag 300

actaactcct acacaaggaa atttctagca gcaagcccat ggcaaccgca gcggtgccag 360

gtgttcgctg gagctctgcg ctatcctagg tacagttggt acgacagaat gatgatacgg 420

ttgattatga agatggcagg cggggagacg gacaccagga aagaggtcga atacactgac 480

tggcaatcag tcactcggtt tgctagagag atcgcgcaat taccaggtga gacgcggtaa 540

<210> 100

<211> 537

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 100

atgaaggctc tcatactgtt cagctcgaga gacgggcaga cccagctgat cgcctcctcc 60

atagcaaagg agctagaggg caagcaagcc tgcgacgtgc tcaatattct cgacacaacc 120

aacgtggagt ggactcagta cgacagagtc ctaatcggcg cgtccatcag atacggccac 180

ttccatcccg ccgtcgctga attcgtgaaa cgccaccagc gtgagctcca gcagcgcagc 240

agcggcttct tcagcgtgaa tcttactgcg agaaagccgg aaaagcggag tcccgagact 300

aacgcttata cggcaaagtt cctcaaccaa tctccctggc aaccagactg ctgtgccgtg 360

ttcgctgggg cactgaggta tccgcgctat cggtggttcg atagaatcat gatacagctg 420

ataatgcgta tgactggtgg ggagacggat tccagtaaag aggtagagta tactgattgg 480

cagcaggtca ctaggttcgc gcaggagttt gctaggctgc cgggcaagac atcctga 537

<210> 101

<211> 543

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 101

atgaaaacct taatcttgtt cagcacccgc gacggccaga cgcgtgaaat cgcagcgttc 60

ctcgcttcgg agctcaagga acagggaatt tacgccgacg tcattaacct aaaccgtacc 120

gaagagattg cgtggcagga gtatgaccgc gtggtgattg gcgcttctat ccgctatggc 180

cacttccacc cggctgttga ccggttcgtg aagaagcaca cggagacctt gaactcactg 240

ccgggggcat tctttagcgt aaatctggtg gcgcgcaagg ccgagaagcg caccccccag 300

acgaacagct acacccgcaa atttttactt aactccccat ggaaacctgc ggcctgcgca 360

gtgttcgcag gagctctccg ctatcctcgc tatcgatggt acgatcggtt catgattcgg 420

ctgattatga aaatgacggg cggcgagacg gatacgcgaa aggaagttgt ctacactgac 480

tggtcccagg tggcctcgtt tgcaagggag atcgtacagc tcactcgatc tagtaggctc 540

tga 543

<210> 102

<211> 534

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 102

atgaagattc tcatcttatt ttccacccga gacggccaaa cccgcgagat tgcggcgtcc 60

ctcgcctccg agttgaagga gcaggcgttt gatgtggatg tggtcaacct ccaccgcgca 120

gaaaacatag cgtgggagga gtacgatggg gtcgtcatcg gagcgtcaat ccgctacgga 180

catttccact caacgctgaa ttcatttgtg aagaagcacc aacaagcgct caagaagctg 240

cccggagcat tctacagcgt caacctcgtg gctcggaagc cggaaaagcg caccccgcaa 300

acaaacagct acacacgcaa gtttctgctc gactcgccct ggcaacccga cctgagtgcc 360

gttttcgccg gggcactgcg ctatccccgt tacaactggt acgatcgcat aatgattcga 420

ctgatcatga agattacagg cggggaaacc gatactcgga aggaggtggt gtatacagac 480

tggcagcagg ttacccactt cgcccacgag atcgtccagc tcgttcgtaa gtga 534

<---

1. Молекула рекомбинантной ДНК для придания толерантности к гербициду дикамбе или ингибитору PPO, который применяется к растению, содержащая последовательность ДНК, кодирующую транзитный пептид хлоропласта (CTP), функционально связанную с последовательностью ДНК, кодирующей дикамба-монооксигеназу (DMO) или протопорфириногеноксидазу (PPO), при этом CTP содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3.

2. Молекула рекомбинантной ДНК по п. 1, отличающаяся тем, что последовательность ДНК, кодирующая CTP, содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7-14.

3. Молекула рекомбинантной ДНК по п. 1, отличающаяся тем, что DMO или PPO содержит полипептидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18-27 и 40-59.

4. Молекула рекомбинантной ДНК по п. 3, отличающаяся тем, что последовательность ДНК, кодирующая DMO или PPO, содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 28-37 и 61-102.

5. Молекула рекомбинантной ДНК по п. 1, отличающаяся тем, что CTP является функционально связанным с белком DMO, при этом CTP содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3.

6. Молекула рекомбинантной ДНК по п. 1, отличающаяся тем, что CTP является функционально связанным с белком PPO и CTP содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и 2.

7. Конструкция ДНК для придания толерантности к гербициду дикамбе или ингибитору PPO, который применяется к растению, содержащая молекулу ДНК по п. 1, функционально связанную с гетерологичным промотором, функциональным в клетке растения.

8. Трансгенное растение, содержащее молекулу ДНК по п. 1, отличающееся тем, что указанное трансгенное растение проявляет толерантность к гербициду дикамбе или ингибитору PPO.

9. Клетка трансгенного растения, содержащая молекулу ДНК по п. 1, отличающаяся тем, что указанная клетка трансгенного растения проявляет толерантность к гербициду дикамбе или ингибитору PPO.

10. Часть трансгенного растения, содержащая молекулу ДНК по п. 1, отличающаяся тем, что указанная часть трансгенного растения проявляет толерантность к гербициду дикамбе или ингибитору PPO.

11. Трансгенное семя, содержащее молекулу ДНК по п. 1, отличающееся тем, что указанное трансгенное семя проявляет толерантность к гербициду дикамбе или ингибитору PPO.

12 Клетка трансгенного растения по п. 9, отличающаяся тем, что растение является однодольным растением.

13. Клетка трансгенного растения по п. 9, отличающаяся тем, что растение представляет собой растение кукурузы или пшеницы.

14. Клетка трансгенного растения по п. 9, отличающаяся тем, что растение является двудольным растением.

15. Клетка трансгенного растения по п. 9, отличающаяся тем, что растение представляет собой растение сои, хлопчатника или рода капусты (Brassica).

16. Способ получения растения с толерантностью к гербициду дикамбе или ингибитору PPO, который применяется к растению, включающий следующие этапы:

a) трансформирование клетки растения указанной конструкцией ДНК по п. 7 и

b) регенерирование растения из трансформированной клетки растения, которая содержит указанную конструкцию ДНК.

17. Способ получения растения с толерантностью к гербициду дикамбе или ингибитору PPO, который применяется к растению, включающий следующие этапы:

a) введение молекулы ДНК по п.1 в растение;

b) скрещивание указанного растения с самим собой или со вторым растением для получения одного или большего количества растений потомства и

c) отбор растения потомства, содержащего указанную молекулу ДНК.

18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что растение потомства является толерантным к гербициду, выбранному из группы, состоящей из дикамбы и ингибитора PPO.

19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что растение потомства является толерантным к гербициду - ингибитору PPO, выбранному из группы, состоящей из S-3100, фомесафена, ацифлуорфена, лактофена, флумиоксазина, сульфантразона и сафлуфенацила.

20. Способ экспрессии дикамба-монооксигеназы (DMO), включающий введение молекулы ДНК по п. 1 в клетку растения.

21. Способ экспрессии протопорфириногеноксидазы (PPO), включающий введение молекулы ДНК по п. 1 в клетку растения.

22. Способ по п. 21, отличающийся тем, что введение включает трансформацию клетки растения.

23. Способ по п. 22, в котором введение включает трансформацию клетки растения.

24. Способ предотвращения роста сорняков в среде выращивания сельскохозяйственных культур, включающий следующие этапы:

а) посадка растения или семени по п. 8 в среду выращивания сельскохозяйственных культур и

b) применение в среде выращивания сельскохозяйственных культур такого количества гербицида дикамба или ингибитора PPO, которое является эффективным для контроля роста сорняков.

25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что гербицид не поражает растение или семя.

26. Способ по п. 24, отличающийся тем, что растение или семя представляют собой однодольное растение или семя.

27. Способ по п. 26, отличающийся тем, что растение представляет собой растение кукурузы или пшеницы.

28. Способ по п. 24, отличающийся тем, что растение или семя представляет собой двудольное растение или семя.

29. Способ по п. 28, отличающийся тем, что растение представляет собой растение сои, хлопчатника или растение рода капусты (Brassica).

30. Способ по п. 24, отличающийся тем, что указанный гербицид представляет собой дикамбу.

31. Способ по п. 24, отличающийся тем, что указанный гербицид представляет собой ингибитор PPO.