Мезотелин-нацеленные вакцины от рака и их применение

Изобретение относится к биотехнологии. В данном изобретении раскрыты молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих модифицированный консенсусный мезотелиновый антиген. Описаны векторы, композиции и вакцины, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих модифицированный консенсусный мезотелиновый антиген. Раскрыты способы лечения субъекта с мезотелин-экспрессирующей опухолью и способы профилактики мезотелин-экспрессирующей опухоли. Раскрыт модифицированный консенсусный мезотелиновый антиген. Изобретение позволяет получить безопасные и эффективные вакцины в данной области, которые могут быть применены к мезотелин-экспрессирующим опухолям, обеспечивая таким образом лечение и способствуя выживанию субъектов, пораженных этими видами рака. 12 н. и 10 з.п. ф-лы, 22 ил., 17 табл., 7 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[1] Данная заявка претендует на приоритет и преимущество перед предварительной патентной заявкой Соединенных Штатов Америки № 62/598289, поданной 13 декабря 2017 г., раскрытие которой включено в настоящее описание в качестве ссылки во всей своей полноте.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[2] Данная заявка содержит перечень последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и включен в настоящее описание в качестве ссылки во всей своей полноте. Указанная ASCII-копия, созданная 11 декабря 2018 года, называется 104409_000444_sequence_listing.txt размером 8 223 байта.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[3] Настоящее изобретение относится к мезотелиновым антигенам и кодирующим их молекулам нуклеиновых кислот. Настоящее изобретение также относится к вакцинам, включающим антигены мезотелина и/или молекулы нуклеиновых кислот. Настоящее изобретение также относится к способам применения вакцин для индукции иммунных реакций и профилактики и/или лечения субъектов с мезотелин-экспрессирующими раковыми клетками.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[4] Рак продолжает быть основной причиной смерти в США и во всем мире. Рынок противораковых вакцин быстро растет. Эффективные противоопухолевые вакцины могут быть полезными для предотвращения роста опухоли и/или могут быть полезны в качестве более эффективной, менее токсичной альтернативы стандартному лечению пациентов на поздних стадиях рака. Антигеном, ассоциированным с раком и, следовательно, мишенью для противоопухолевых вакцин, является мезотелин.

[5] Мезотелин представляет собой белок с молекулярной массой 71 кДа, состоящий из двух субъединиц: фактора потенцирования мегакариоцитов размером 30 кДа и ГФИ-заякоренного, связанного с мембраной зрелого мезотелина размером 41 кДа. Не смотря на то, что функция мезотелина неизвестна, недавние исследования показывают, что мезотелин может играть роль в метастазировании рака яичника, связываясь с геном MUC16, который также экспрессируется в больших количествах на поверхности раковых клеток яичника. По данным Института здравоохранения (IHC), экспрессия мезотелина наблюдалась в 82-100% случаев серозных яичниковых карцином. Hassan, R. European journal of cancer 44, 46-53 (2008); Ordonez, N. G. The American journal of surgical pathology 27, 1418-1428 (2003). Мезотелин является привлекательной мишенью для противораковой терапевтической вакцины из-за его высокой экспрессии при раке яичников, а также из-за его связи с опухолевыми инвазиями.

[6] Вакцины для лечения и профилактики рака представляют большой интерес. Существующие вакцины, нацеленные на антигены опухолевых клеток, часто ограничены низкой экспрессией антигена in vivo. В связи с этим, остается потребность в разработке безопасных и эффективных вакцин в данной области, которые могут быть применены к мезотелин-экспрессирующим опухолям, обеспечивая таким образом лечение и способствуя выживанию субъектов, пораженных этими видами рака.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[7] В данном изобретении предложены молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, выбранных из группы, состоящей из: (а) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислоты 19-607 последовательности SEQ ID NO: 2; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент, включающий по меньшей мере 90% всей длины белка, содержащего аминокислоты 19-607 SEQ ID NO: 2; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, идентичный не менее, чем на 96% аминокислотам 19-607 последовательности SEQ ID NO: 2; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент, содержащий не менее 90% полной длины белка, идентичного аминокислотам 19-607 последовательности SEQ ID NO: 2 не менее, чем на 96%.

[8] В настоящем изобретении также предложены молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: нуклеотидов 55-1821 SEQ ID NO: 1; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% всей длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды 55-1821 SEQ ID NO: 1; (в) фрагмента, который, по меньшей мере, на 96% идентичен нуклеотидам 55-1821 SEQ ID NO: 1; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% всей длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 96% идентична нуклеотидам 55-1821 SEQ ID NO: 1.

[9] В настоящем документе предложены молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранные из группы, состоящей из: (а) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует SEQ ID NO: 2; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент, составляющий по меньшей мере 90% всей длины SEQ ID NO: 2; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, идентичный не менее, чем на 96% SEQ ID NO: 2; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, включающий не менее 90% всей длины белка, идентичного SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 96%.

[10] Также, в данном изобретении предложены молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранные из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 1; (б) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% всей длины SEQ ID NO: 1; (в) фрагмента, который не менее, чем на 96% идентичен SEQ ID NO: 1; и (г) фрагмента, содержащего не менее 90% всей длины последовательности нуклеиновой кислоты, идентичной последовательности SEQ ID NO: 1 по меньшей мере на 96%. В некоторых вариантах воплощения изобретения, молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, изложенную в SEQ ID NO: 1.

[11] Молекулы нуклеиновой кислоты, описанные в данном изобретении, могут быть встроены в вектор, такой как плазмида или вирусный вектор. Молекулы нуклеиновой кислоты, описанные в данном изобретении, могут быть встроены в вектор, такой как плазмида или вирусный вектор. В некоторых вариантах воплощения изобретения, вектор содержит молекулы нуклеиновой кислоты, включающие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранные из группы, состоящей из: (а) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислоты 19-607 SEQ ID NO: 2; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент, включающий по меньшей мере 90% всей длины белка, содержащего аминокислоты 19-607 SEQ ID NO: 2; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, идентичный аминокислотам 19-607 SEQ ID NO: 2 не менее, чем на 96%; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент, включающий по меньшей мере 90% полной длины белка, идентичный аминокислотам 19-607 SEQ ID NO: 2 не менее, чем на 96%. В дополнительных вариантах воплощения изобретения, вектор содержит молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранные из группы, состоящей из: нуклеотидов 55-1821 SEQ ID NO: 1; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% всей длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающего нуклеотиды 55-1821 SEQ ID NO: 1; (в) фрагмента, идентичного нуклеотидам 55-1821 SEQ ID NO: 1 по меньшей мере на 96%; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% всей длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая идентична нуклеотидам 55-1821 SEQ ID NO: 1 не менее, чем на 96%. И еще, в других вариантах воплощения изобретения, вектор содержит молекулы нуклеиновой кислоты, включающие одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, выбранных из группы, состоящей из: (а) последовательности нуклеиновых кислот, кодирующей SEQ ID NO: 2; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент, составляющий по меньшей мере 90% всей длины SEQ ID NO: 2; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 96% идентичен SEQ ID NO: 2; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, идентичного SEQ ID NO: 2 не менее, чем на 96%. В дополнительных вариантах воплощения изобретения, вектор содержит молекулы нуклеиновой кислоты, включающие одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, выбранных из группы, состоящей из: (а) SEQ ID NO: 1; (б) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% всей длины SEQ ID NO: 1; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 96% идентичен SEQ ID NO: 1; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% всей длины последовательности нуклеиновой кислоты, идентичной последовательности SEQ ID NO: 1 не менее, чем на 96%. В других вариантах воплощения изобретения, вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 1.

[12] В некоторых вариантах воплощения изобретения, описанные здесь нуклеиновые кислоты функционально связаны с регуляторным элементом. В некоторых вариантах воплощения изобретения, регуляторный элемент представляет собой промотор и/или сигнальную последовательность полиаденилирования. В других вариантах воплощения изобретения, промотор представляет собой промотор цитомегаловируса человека немедленно-раннего ответа (промотор hCMV). В других вариантах воплощения изобретения, сигнальная последовательность (сигнал) полиаденилирования является сигнальной последовательностью полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота (bGH поли-A).

[13] Также, в данном изобретении предложны и описаны композиции, содержащие одну или более молекул нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах воплощения изобретения, композиции содержат фармацевтически приемлемый носитель.

[14] Далее, в изобретении предложены антигенные мезотелиновые белки, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (а) аминокислот 19-607 SEQ ID NO: 2; (б) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% всей длины белка, содержащего аминокислоты 19-607 SEQ ID NO: 2; (в) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотам 19-607 SEQ ID NO: 2; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% всей длины аминокислотной последовательности, идентичной аминокислотам 19-607 SEQ ID NO: 2 не менее, чем на 95%.

[15] Далее, в изобретении предложены мезотелиновые антигенные белки, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 2; (б) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% всей длины SEQ ID NO: 2; (в) аминокислотной последовательности, которая идентична SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 96%; и (в) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% всей длины аминокислотной последовательности, идентичной SEQ ID NO: 2 не менее, чем на 96%. В некоторых вариантах воплощения изобретения, белок содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2.

[16] Также, в изобретении предложены вакцины, содержащие мезотелиновый антиген отличающийся тем, что данный антиген содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах воплощения изобретения, антиген кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1.

[17] Кроме того, в данном изобретении предложены вакцины, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, отличающуюся содержанием последовательности нуклеиновой кислоты, идентичной последовательности SEQ ID NO: 1 не менее, чем приблизительно 96% по всей длине нуклеиновой кислоты. Также предложены вакцины, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую мезотелиновый антиген, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную не менее, чем на приблизительно 96% по всей длине аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах изобретения последовательность молекулы нуклеиновой кислоты может содержать вектор экспрессии. Вакцины могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемый наполнитель. В некоторых вариантах воплощения изобретения, адъювант может быть дополнительно добавлен в вакцины. В некоторых вариантах воплощения изобретения, адъювант представляет собой ИЛ (IL)-12, ИЛ-15, ИЛ-28 или цитокин А5 (RANTES).

[18] Также в настоящем документе предложены вакцины, содержащие мезотелиновый антиген, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную последовательности SEQ ID NO: 2 по меньшей мере приблизительно на 90% по всей длине.

[19] Далее в изобретении предложены способы лечения субъекта с мезотелин-экспрессирующими раковыми клетками, включающие в себя введение терапевтически эффективного количества вакцины, описанной в данном изобретении. В некоторых вариантах воплощения изобретения, введение включает стадию электропорации. В других вариантах изобретения введение происходит в одном или более сайтах субъекта.

[20] Также в изобретении предложены способы вакцинации субъекта против мезотелин-экспрессирующих раковых клеток, включающие введение описанного в изобретении количества вакцины, эффективного для индукции гуморального иммунного ответа. В некоторых вариантах воплощения изобретения, введение включает стадию электропорации. В других вариантах воплощения изобретения, введение происходит в одном или более сайтах субъекта.

[21] В данном изобретении также предложены молекулы нуклеиновой кислоты для применения в качестве лекарственного средства, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (а) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует SEQ ID NO: 2; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент, составляющий по меньшей мере 90% всей длины SEQ ID NO: 2; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок по меньшей мере на 96% идентичный SEQ ID NO: 2; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, включающий по меньшей мере 90% всей длины белка, идентичного SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 96%. В некоторых вариантах воплощения изобретения, молекулы нуклеиновой кислоты, описанные в данном изобретении, предназначены для применения в качестве лекарственного средства при лечении рака. В некоторых вариантах воплощения изобретения, описанные здесь молекулы нуклеиновой кислоты предназначены для использования при приготовлении лекарственного средства. В некоторых вариантах воплощения изобретения, молекулы нуклеиновой кислоты, описанные в настоящем документе, предназначены для использования при приготовлении лекарственного средства для лечения рака.

[22] В данном изобретении также предложены молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 1; (б) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% всей длины SEQ ID NO: 1; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 96% идентичен SEQ ID NO: 1; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% всей длины последовательности нуклеиновой кислоты, идентичной последовательности SEQ ID NO: 1 не менее, чем на 96%. В некоторых вариантах воплощения изобретения, при использовании в качестве лекарственного средства, молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, изложенную в SEQ. ID № 1. В некоторых вариантах воплощения изобретения, молекулы нуклеиновой кислоты, описанные в настоящем документе, предназначены для применения в качестве лекарственного средства при лечении рака. В некоторых вариантах воплощения изобретения, молекулы нуклеиновой кислоты, описанные в настоящем документе, предназначены для использования при приготовлении лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления, изобретения, молекулы нуклеиновой кислоты, описанные в настоящем документе, предназначены для использования при приготовлении лекарственного средства для лечения рака.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

[23] ФИГ. 1 иллюстрирует поколение мезотелиновых мутантов.

[24] ФИГ. 2 схематическое изображение структуры белка-предшественника ГФИ-заякоренного мезотелина.

[25] ФИГ. 3 схема синтетического консенсусного мезотелина.

[26] ФИГ. 4 схематическое представление модифицированной конструкции (pGX0001).

[27] ФИГ. 5 схематическая карта плазмиды pGX1438.

[28] ФИГ. 6 результат вестерн-блота экспрессии синтетического консенсусного антигена мезотелина в клетках рабдомиосаркомы человека.

[29] ФИГ. 7A-7B иллюстрируют иммуногенность синтетического консенсусного мезотелина с использованием варианта воплощения изобретения.

[30] ФИГ. 8 иллюстрирует стратегию гейтинга проточной цитометрии с использованием варианта воплощения изобретения.

[31] ФИГ. 9A-9D иллюстрируют клеточные иммунные ответы, индуцированные pGX1430. На ФИГ. 9A показаны синтетические консенсусные мезотелин-индуцированные частоты ответов антиген-специфических CD4+ Т-клеток. На ФИГ. 9B показаны частоты синтетического консенсусного мезотелин-индуцированного ответа антиген-специфических CD8+ Т-клеток. На ФИГ. 9C показан цитокиновый профиль синтетических консенсусных мезотелин-специфических CD4+Т-клеток. На ФИГ. 9D показан цитокиновый профиль синтетических консенсусных мезотелин-специфических CD8+T-клеток.

[32] ФИГ. 10A-10D иллюстрируют цитолитический потенциал синтетических консенсусных мезотелин-специфических Т-клеток. ФИГ. 10А показывает частоту антиген-специфических CD4+CD107a+Т-клеток. ФИГ. 10B показывает частоту антиген-специфических CD8+CD107a+T-клеток. ФИГ. 10C показывает профиль цитокинов синтетических консенсусных мезотелин-специфических CD4+CD107a+T-клеток. ФИГ. 10D показывает профиль цитокинов синтетических консенсусных мезотелин-специфических CD8+CD107a+T-клеток.

[33] ФИГ. 11А-11С иллюстрируют мезотелин-специфические ИФНу СОЕ/10⁶ МКПК отдельных низших приматов с использованием варианта воплощения изобретения. ФИГ. 11А показывает только мезотелин, ФИГ. 11B показывает мезотелин с низкой дозой ИЛ-12 (0,04 мг) и ФИГ. 11C показывает мезотелин с высокой дозой ИЛ-12 (0,2 мг).

[34] ФИГ. 12A-12C показывают усредненные мезотелин-специфические ИФНy СОЕ/10⁶ МКПК с использованием варианта воплощения изобретения. ФИГ. 12А показывает только мезотелин, ФИГ. 12В показывает мезотелин с низкой дозой ИЛ-12 (0,04 мг) и ФИГ. 12С показывает мезотелин с высокой дозой ИЛ-12 (0,2 мг).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[35] Настоящее изобретение относится к вакцинам, содержащим антиген мезотелина. Мезотелин экспрессируется во многих опухолях. Соответственно, вакцины обеспечивают лечение рака или опухоли, экспрессирующей мезотелин. Вакцина, описанная в изобретении, может быть представлена в любой комбинации частных раковых антигенов для частной профилактики или лечения рака у субъекта, нуждающегося в лечении.

[36] Одним из способов создания нуклеиновой кислоты и ее кодирующей аминокислотной последовательности рекомбинантного ракового антигена является введение мутаций, изменяющих определенные аминокислоты в общей аминокислотной последовательности нативного ракового антигена. Хотя введение мутаций и не изменяет раковый антиген до такой степени, чтоб его нельзя было универсально применять к субъектам-млекопитающим, и, предпочтительно, субъектам-людям или собакам, но оно приводит к таким изменениям, при которых полученная аминокислотная последовательность нарушает толерантность организма или же считается чужеродным антигеном, и это необходимо для генерации иммунного ответа. Другим способом может быть создание консенсусного рекомбинантного ракового антигена, имеющего идентичность аминокислотной последовательности с соответствующим нативным антигеном рака по меньшей мере от 85% до 99%; с предпочтительной идентичностью последовательности по меньшей мере от 90% и до 98%; и еще более предпочтительной идентичностью последовательности по меньшей мере от 93% и до 98%; или даже наиболее предпочтительной идентичностью последовательности по меньшей мере от 95% и до 98%. В некоторых случаях, рекомбинантный раковый антиген идентичен относительно нативной аминокислотной последовательности антигена рака на 95, 96, 97, 98% или 99%. Нативный антиген рака является антигеном, обычно ассоциированным с конкретным типом рака или раковой опухоли. В зависимости от ракового антигена, консенсусная последовательность ракового антигена может встречаться у разных видов млекопитающих или внутри подтипов вида, или среди вирусных штаммов или серотипов. Некоторые раковые антигены не сильно отличаются от аминокислотной последовательности дикого типа ракового антигена. Некоторые раковые антигены имеют последовательности нуклеиновых кислот/аминокислот, которые настолько различаются между видами, что для них невозможно получить общую консенсусную последовательность. В этих случаях разрабатывают рекомбинантный раковый антиген, нарушающий толерантность и генерирующий иммунный ответ, и имеющий идентичность аминокислотной последовательности с соответствующим нативным антигеном рака по меньшей мере от 85% до 99%; с предпочтительной идентичностью последовательности по меньшей мере от 90% и до 98%; с более предпочтительной идентичностью последовательности по меньшей мере от 93% и до 98%; или даже с наиболее предпочтительной идентичностью последовательность по меньшей мере от 95% и до 98%. В некоторых случаях, рекомбинантный раковый антиген идентичен по аминокислотной последовательности соответствующему нативному антигену рака на 95, 96, 97, 98% или 99%. Вышеупомянутые подходы могут быть объединены таким образом, чтобы конечный рекомбинантный раковый антиген имел процентное сходство с аминокислотной последовательностью нативного ракового антигена так, как это обсуждалось выше.

[37] Мезотелиновый антиген может быть консенсусным мезотелиновым антигеном, частично полученным из разных видов или разных изоформ последовательностей мезотелина в пределах вида, и, таким образом, консенсусный антиген мезотелина не является нативным. Модификации могут включать мутации в связывающем домене MUC16 и/или ГФИ-связанном сигнальном участке, а так же добавление предшествующих лидерных последовательностей Козак и IgE к N-концу мезотелинового антигена.

[38] Синтетический мезотелин может индуцировать антиген-специфические Т-клеточные иммунные ответы и/или ответы с образованием высокого титра антител, тем самым вызывая или активируя иммунный ответ, направленный или реагирующий на рак или опухоль, экспрессирующую антиген. В некоторых вариантах воплощения изобретения, индуцированный или активированный иммунный ответ может быть клеточным, гуморальным или же, как клеточным, так и гуморальным иммунным ответом. В некоторых вариантах воплощения изобретения, индуцированный или активированный клеточный иммунный ответ может включать индукцию или секрецию интерферона-гамма (ИФНy) и/или фактора некроза опухоли альфа (ФНО-a). В других вариантах воплощения изобретения, индуцированный или активированный иммунный ответ может уменьшать или ингибировать один или более факторов иммуносупрессии, которые способствуют росту опухоли или рака, экспрессирующего антиген, например, факторы, подавляющие презентацию главного комплекса гистосовместимости (МНС), повышающие регуляцию антигенспецифических регуляторных Т-клеток (Tregs), PD-L1, FasL, цитокинов, таких как ИЛ-10 и трансформирующий ростовой фактор (TFG-β), опухолевых ассоциированных макрофагов, ассоциированных с опухолью фибробластов, растворимых факторов, продуцируемых иммуносупрессорными клетками, антигенов 4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA-4), PD -1, МЛСК, моноцитарных хемоатрактических белков (MCP-1) и молекул контрольных точек иммунного ответа, но, не ограничиваясь ими.

[39] Вакцина может быть дополнительно комбинирована с антителами к ингибиторам контрольных точек иммунного ответа, таким как PD-1 и PDL-1, для усиления стимуляции как клеточного, так и гуморального иммунного ответа. Использование антител против PD-1 или против PDL-1 не позволяет PD-1 или PDL-1 подавлять иммунные ответы Т-клеток и/или В-клеток. В целом, проектирование антигенов рака, распознаваемых иммунной системой, помогает преодолеть другие формы подавления иммунитета опухолевыми клетками, поэтому такие вакцины можно использовать в сочетании с терапией подавления или ингибирования (например, анти-PD-1 и анти-PDL-1 терапия антителами) для дальнейшего усиления Т-клеточного и/или В-клеточного иммунных ответов.

Определения

[40] Все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно известно специалистам в данной области техники, если не указано иное. В случае конфликта, настоящим документом с определениями включительно будут контролироваться предпочтительные способы и материалы, описанные ниже, хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в данном документе, так же могут использоваться на практике или при тестировании настоящего изобретения. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, упомянутые здесь, включены в качестве ссылки во всей их полноте. Материалы, способы и примеры, раскрытые в данном документе, являются только иллюстративными, а не ограничивающими. Используемая здесь терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления, а не для ограничения.

[41] Термины «содержит(ат)», «включает(ют)», «имеет(ют)», «имеющий», «могут», «состоит(ят)» и их варианты, используемые в настоящем документе, являются неограничивающими переходными фразами, терминами или словами, которые не исключают возможных дополнительных действий или структур. Союз «и» и артикли «а» и «the» (в оригинальном английском варианте) в единственном числе включают множественные отсылки, кроме случаев когда контекст явно указывает иное. В настоящем раскрытии изобретения также рассматриваются другие варианты воплощения изобретения, «содержащие», «состоящие из» и «состоящие, по существу из» представленных в данном документе вариантов воплощения или элементов, независимо от того, изложены они явно или нет.

[42] Для перечисления числовых диапазонов в настоящем документе предусматривается, что каждое промежуточное значение имеет ту же степень точности, что минимум и максимум приведенного диапазона. Например, очевидно, что в диапазоне 6-9 числа 6 и 9 дополняют числа 7 и 8, а в диапазоне 6.0-7.0 очевидно предусмотрен ряд чисел 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 и 7.0.

[43] Термин «адъювант», в контексте данного документа, означает любую молекулу, добавленную к вакцинам, описанным в настоящем документе, для усиления иммуногенности антигенов мезотелина и/или молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих антигены, как описано в данном документе.

[44] Термин «антитело», в контексте данного документа, означает антитело, принадлежащее к классам IgG, IgM, IgA, IgD или IgE или его фрагменты, или производные, включая Fab, F(ab’)2, Fd и одноцепочечные антитела, диатела, биспецифичные антитела, бифункциональные антитела и их производные. Антитело может быть антителом, выделенным из образца сыворотки млекопитающего, поликлональным антителом, аффинно-очищенным антителом или любой их смесью, которая проявляет достаточную специфичность связывания с желаемым эпитопом или полученной из него последовательностью.

[45] Термин «мезотелиновый антиген» относится к: белкам, имеющим мутированные аминокислотные последовательности мезотелина, включая аминокислоты 19-607 SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 2; соответствующим фрагментам длиной, указанной в данном документе, вариантам, а именно, белкам с последовательностями, идентичными SEQ ID NO: 2, указанном в данном документе, фрагментам вариантов длиной, указанной в данном документе, SEQ ID NO: 2; их фрагменты с длинами, изложенными здесь, вариантам, то есть белкам с последовательностями, идентичными указанному в данном документе SEQ ID NO: 2, фрагментам вариантов длиной, указанной в данном документе, и их комбинации. Антигены могут включать сигнальные пептиды, такие как пептиды других белков, но это необязательно.

[46] Термины «кодирующая последовательность» или «кодирующая нуклеиновая кислота», в контексте данного документа, изобретения означают нуклеиновые кислоты (молекулы РНК или ДНК), которые содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую белок. Кодирующая последовательность может дополнительно включать сигнальные последовательности инициации и терминации, функционально связанные с регуляторными элементами, включая сигнальные последовательности промотора и полиаденилирования, способные управлять экспрессией в клетках субъекта или млекопитающего, к которому применяют нуклеиновую кислоту.

[47] Термины «комплементарный» или «комплементарность», используемые в данном документе, означают, что нуклеиновая кислота может образовывать пары с другими нуклеиновыми кислотами, нуклеотидными аналогами или молекулами по правилу Уотсона-Крика (например, A-T/U и C-G) или Хугстина.

[48] Термины «консенсус» или «консенсусная последовательность», в контексте данного документа, означают полипептидную последовательность, основанную на анализе выравнивания множества последовательностей для одного и того же гена разных организмов. Могут быть получены последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие консенсусную полипептидную последовательность. Вакцины, содержащие белки, которые содержат консенсусные последовательности и/или молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие такие белки, могут быть использованы для индукции обширного иммунитета по отношению к антигену.

[49] Термин «постоянный ток», используемый в данном документе, описывает ток, который воспринимается или которому подвергается ткань или клетки, определяющие указанную ткань, в течение воздействия электрического импульса, доставляемого в ту же ткань. Электрический импульс подается от устройств электропорации (электропораторов, ЭП), описанных в данном документе. Плотность тока остается постоянной в указанной ткани в течение всего времени воздействия электрического импульса, поскольку устройство для электропорации, предложенное в настоящем документе, имеет элемент обратной связи, предпочтительно обладающий мгновенной обратной связью. Элемент обратной связи позволяет измерять сопротивление ткани (или клеток) на протяжении всего времени воздействия импульса и заставлять устройство электропорации измененять выходную электрическую мощность (например, увеличивать напряжение) таким образом, чтобы плотность тока в одной и той же ткани оставалась постоянной в течение всего времени воздействия электрического импульса (порядка микросекунд) и от импульса к импульсу. В некоторых вариантах воплощения изобретения, элемент обратной связи содержит контроллер.

[50] Термины «обратная связь по току» или «обратная связь», используемые в данном документе, могут использоваться взаимозаменяемо и могут означать активную реакцию предложенных устройств электропорации, которая включает в себя измерение тока в ткани между электродами и соответствующее изменение мощности, передаваемой устройством ЭП для поддержания плотности тока на постоянном уровне. Этот постоянный уровень задается пользователем до начала импульсного режима или процесса электротерапиии. Обратная связь может быть обеспечена компонентом электропоратора, например, контроллером, поскольку его электрическая цепь способна непрерывно контролировать ток в ткани между электродами, сравнивать этот контролируемый ток (или ток в ткани) с заданным током и непрерывно производить регулировку выходной мощности для поддержания контролируемого тока на заданных уровнях. Цикл обратной связи может быть мгновенным, поскольку он является аналоговой замкнутой обратной связью.

[51] Термин «децентрализованный ток», используемый в данном документе, может означать паттерн электрических токов, подаваемых из различных массивов игольчатых электродов электропораторов, описанных в данном документе, при этом паттерны минимизируют или предпочтительно устраняют возникновение теплового напряжения, связанного с электропорацией, в любой области электропорируемой ткани.

[52] Термины «электропорация», «электропермеабилизация» или «электрокинетическое усиление» («ЭП»), используемые в данном документе взаимозаменяемо, означают использование трансмембранного импульса электрического поля для индукции микроскопических отверстий (пор) в биомембране; их присутствие позволяет таким биомолекулам, как плазмиды, олигонуклеотиды, миРНК, лекарства, ионы и вода, проходить с одной стороны клеточной мембраны на другую.

[53] Термин «фрагмент», используемый в данном документе в отношении последовательностей нуклеиновой кислоты, означает последовательность нуклеиновой кислоты или ее часть, кодирующую полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего, перекрестно реагирующего с антигеном, описанным в данном документе. Под фрагментами могут понимать фрагменты ДНК, выбранные по меньшей мере из одной из различных нуклеотидных последовательностей, кодирующих фрагменты белка, изложенных ниже. Фрагменты могут содержать по меньшей мере 10% по меньшей мере 20% по меньшей мере 30% по меньшей мере 40% по меньшей мере 50% по меньшей мере 60% по меньшей мере 70% по меньшей мере 80% по меньшей мере 90%, или по меньшей мере, 95% от всей длины одной или более последовательностей нуклеиновых кислот, описанных в настоящем документе, за исключением любого добавленного гетерологичного сигнального пептида. В некоторых вариантах воплощения изобретения, фрагменты могут составлять по меньшей мере 90% по меньшей мере 91% по меньшей мере 92% по меньшей мере 93% по меньшей мере 94% по меньшей мере 95% по меньшей мере 96% по меньшей мере 97% по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% от всей длины одной или более последовательностей нуклеиновых кислот, указанных ниже, за исключением любого добавленного гетерологичного сигнального пептида.

[54] В некоторых вариантах воплощения изобретения, фрагменты могут составлять по меньшей мере 10% по меньшей мере 20% по меньшей мере 30% по меньшей мере 40% по меньшей мере 50% по меньшей мере 60% по меньшей мере 70% по меньшей мере 80% по меньшей мере на 90% или по меньшей мере 95% идентичности к одной или более последовательностям нуклеиновых кислот, описанным в настоящем документе, за исключением любого гетерологичного сигнального пептида. В некоторых вариантах воплощения изобретения, фрагменты могут быть по меньшей мере на 96% по меньшей мере на 97% по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичны одной или более последовательностям нуклеиновой кислоты, приведенным ниже, за исключением любого добавленного гетерологичного сигнального пептида.

[55] В дополнительных вариантах воплощения изобретения, фрагменты могут дополнительно содержать последовательность, кодирующую гетерологичный сигнальный пептид, который не учитывается при расчете процента идентичности. Фрагменты также могут содержать кодирующие последовательности для сигнального пептида, такого как сигнальный пептид иммуноглобулина, например сигнальный пептид IgE или IgG. Кодирующая последовательность, кодирующая N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, может быть связана с фрагментом кодирующей последовательности.

[56] В некоторых вариантах воплощения изобретения, фрагменты могут содержать по меньшей мере 1500 нуклеотидов или более , 1510 нуклеотидов или более, 1520 нуклеотидов или более, 1530 нуклеотидов или более, 1540 нуклеотидов или более, 1550 нуклеотидов или более, 1560 нуклеотидов или более, 1570 нуклеотидов или более, 1580 нуклеотидов или более, 1590 нуклеотидов или более, 1600 нуклеотидов или более, 1610 нуклеотидов или более, 1620 нуклеотидов или более, или 1630 нуклеотидов или более, 1640 нуклеотидов или более, 1650 нуклеотидов или более, 1660 нуклеотидов или более, 1670 нуклеотидов или более, 1680 нуклеотидов или более, 1690 нуклеотидов или более, 1700 нуклеотидов или более, 1710 нуклеотидов или более, 1720 нуклеотидов или более, 1730 нуклеотидов или более, 1740 нуклеотидов или более, 1750 нуклеотидов или более, 1760 нуклеотидов или более, 1770 нуклеотидов или более, 1780 нуклеотидов или более, 1790 нуклеотидов или более, 1800 нуклеотидов или более, 1810 нуклеотидов или более или 1820 нуклеотидов или более в по меньшей мере одной из последовательностей нуклеиновых кислот, указанных ниже.

[57] Термины «фрагмент» или «иммуногенный фрагмент» в отношении полипептидных последовательностей означают полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего, перекрестно реагирующий с антигеном, описанным в данном документе. Фрагменты могут быть полипептидными фрагментами, выбранными по меньшей мере из одной из различных аминокислотных последовательностей, описанных в настоящем документе. Фрагменты консенсусных белков могут составлять по меньшей мере 10% по меньшей мере 20% по меньшей мере 30% по меньшей мере 40% по меньшей мере 50% по меньшей мере 60% по меньшей мере 70% по меньшей мере 80% по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% от всей длины консенсусного белка, за исключением любого добавленного гетерологичного сигнального пептида. В некоторых вариантах раскрытия изобретения, фрагмент может содержать по меньшей мере 90% по меньшей мере 91% по меньшей мере 92% по меньшей мере 93% по меньшей мере 94% по меньшей мере 95% по меньшей мере 96% по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% от длины одной или более аминокислотных последовательностей, указанных ниже, за исключением любого добавленного гетерологичного сигнального пептида.

[58] В некоторых вариантах воплощения изобретения, фрагменты могут составлять по меньшей мере 10% по меньшей мере 20% по меньшей мере 30% по меньшей мере 40% по меньшей мере 50% по меньшей мере 60% по меньшей мере 70% по меньшей мере 80% по меньшей мере на 90% или по меньшей мере 95% идентичности к одной или более аминокислотным последовательностям, описанным в настоящем документе, за исключением любого гетерологичного сигнального пептида. В некоторых вариантах воплощения изобретения, фрагменты могут быть по меньшей мере на 96% по меньшей мере на 97% по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичны одной или более аминокислотным последовательностям, указанным ниже, за исключением любого добавленного гетерологичного сигнального пептида

[59] В дополнительных вариантах воплощения изобретения, фрагменты могут содержать последовательность, кодирующую гетерологичный сигнальный пептид, который не учитывается при расчете процента идентичности, но это необязательно. Фрагменты могут дополнительно содержать такой пептид, как сигнальный пептид иммуноглобулина, например сигнальный пептид IgE или IgG.

[60] В некоторых вариантах воплощения изобретения, фрагменты консенсусных белков могут содержать по меньшей мере 546 нуклеиновых кислот или более, 547 нуклеиновых кислот или более, 548 нуклеиновых кислот или более, 549 нуклеиновых кислот или более, 550 нуклеиновых кислот или более, 551 нуклеиновых кислот или более, 552 нуклеиновых кислот или более, 553 нуклеиновых кислот или более, 554 нуклеиновых кислот или более, 555 нуклеиновых кислот или более, 556 нуклеиновых кислот или более, 557 нуклеиновых кислот или более, 558 нуклеиновых кислот или более, 559 нуклеиновых кислот или более, 560 нуклеиновых кислот или более, 561 нуклеиновых кислот или более, 562 нуклеиновых кислот или более, 563 нуклеиновых кислот или более, 564 нуклеиновых кислот или более, 565 нуклеиновых кислот или более, 566 нуклеиновых кислот или более, 567 нуклеиновых кислот или более, 568 нуклеиновых кислот или более, 569 нуклеиновых кислот или более, 570 нуклеиновых кислот или более, 571 нуклеиновых кислот или более, 572 нуклеиновых кислот или более, 573 нуклеиновых кислот или более, 574 нуклеиновых кислот или более, 575 нуклеиновых кислот или более, 576 нуклеиновых кислот или более, 577 нуклеиновых кислот или более, 578 нуклеиновых кислот или более, 579 нуклеиновых кислот или более, 580 нуклеиновых кислот или более, 581 нуклеиновых кислот или более, 582 нуклеиновых кислот или более, 583 нуклеиновых кислот или более, 584 нуклеиновых кислот или более, 585 нуклеиновых кислот или более, 586 нуклеиновых кислот или более, 587 нуклеиновых кислот или более, 588 нуклеиновых кислот или более, 589 нуклеиновых кислот или более, 590 нуклеиновых кислот или более, 591 нуклеиновых кислот или более, 592 нуклеиновых кислот или более, 593 нуклеиновых кислот или более, 594 нуклеиновых кислот или более, 595 нуклеиновых кислот или более, 596 нуклеиновых кислот или более, 597 нуклеиновых кислот или более, 598 нуклеиновых кислот или более, 599 нуклеиновых кислот или более, 600 нуклеиновых кислот или более, 601 нуклеиновых кислот или более, 602 нуклеиновых кислот или более, 603 нуклеиновых кислот или более, 604 нуклеиновых кислот или более, 605 нуклеиновых кислот или более, 606 нуклеиновых кислот или более, 607 нуклеиновых кислот, описанной в данном документе последовательности белка.

[61] Используемый в данном документе термин «генетическая конструкция» относится к молекулам ДНК или РНК, которые содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую белок. Кодирующая последовательность включает сигналы инициации и терминации, функционально связанные с регуляторными элементами, включая сигнал промотора и полиаденилирования, способный управлять экспрессией в клетках субъекта, к которому применяют молекулу нуклеиновой кислоты. Используемый в данном документе термин «экспрессируемая форма» относится к генной конструкции, которая содержит необходимые регуляторные элементы, функционально связанные с кодирующей белок последовательностью таким образом, что кодирующая последовательность будет экспрессироваться при присутствии в клетке субъекта.

[62] Используемый в данном документе термин «гомология» относится к степени комплементарности. Может быть частичная гомология или полная гомология (то есть идентичность). Частично комплементарная последовательность, которая, как минимум, частично ингибирует гибридизацию полностью комплементарной последовательности с нуклеиновой кислотой-мишенью, называется функциональным термином «гомологичная, по существу». При использовании термина «по существу, гомологичный» в отношении двухцепочечной последовательности нуклеиновой кислоты, такой как кДНК или геномный клон, так, как он используется в настоящем документе, термин относится к зонду, который может гибридизоваться с цепью двухцепочечной последовательности нуклеиновой кислоты в условия низкой жесткости. При использовании термина «по существу, гомологичный» в отношении последовательности одноцепочечной нуклеиновой кислоты так, как он используется в настоящем документе, термин относится к зонду, который может гибридизоваться (то есть быть комплементом) с одноцепочечной матричной последовательностью нуклеиновой кислоты в условиях низкой жесткости.

[63] Используемые в данном документе термины «идентичный» или «идентичность» относительно двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов означают, что последовательности имеют определенный процент остатков, одинаковых в указанной области. Процент может быть рассчитан путем оптимального выравнивания двух последовательностей, сравнения двух последовательностей в указанной области, определения количества позиций, в которых одинаковый остаток встречается в обеих последовательностях для получения количества совпадающих позиций, деления количества совпавших позиций на общее количество позиций в указанной области и умножение результата на 100 для получения процента идентичности последовательности. В тех случаях, когда две последовательности имеют разную длину или выравнивание приводит к одному или более ступенчатым разрывам и указанная область сравнения включает только одну последовательность, при вычислении, остатки одной последовательности включаются в знаменатель, но не в числитель. При сравнении ДНК и РНК тимин (T) и урацил (U) можно считать эквивалентными. Идентификация может быть выполнена вручную или с помощью компьютерного алгоритма для последовательности, такого как BLAST или BLAST 2.0.

[64] Термин «импеданс», используемый в данном документе, может использоваться при рассмотрении в деталях механизма обратной связи и может быть преобразован в текущее значение в соответствии с законом Ома для сравнения с заданным параметром тока.

[65] Термин «иммунный ответ», в контексте данного документа, означает активацию иммунной системы хозяина, например, млекопитающего, в ответ на введение антигена. Иммунный ответ может быть в форме клеточного или гуморального ответа, или в обеих формах.

[66] Термины «нуклеиновая кислота» или «олигонуклеотид» или «полинуклеотид», в контексте данного документа, означают по меньшей мере два нуклеотида ковалентно связанных друг с другом. Изображение одной цепи также определяет последовательность комплементарной цепи. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает комплементарную цепь изображенной одиночной цепи. Многие варианты нуклеиновой кислоты могут быть использованы для той же цели, что и приведенная нуклеиновая кислота. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает идентичные, по существу, нуклеиновые кислоты и их дополнения. Одиночная цепь также включает зонд, который может гибридизоваться с последовательностью-мишенью при жестких условиях гибридизации. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает зонд, который гибридизуется в жестких условиях гибридизации.

[67] Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными, или могут содержать части как двухцепочечной, так и одноцепочечной последовательности. Нуклеиновая кислота может быть ДНК, как геномной, так и кДНК, РНК или гибридной, где нуклеиновая кислота может содержать комбинации дезоксирибо- и рибонуклеотидов и комбинации оснований, включая урацил, аденин, тимин, цитозин, гуанин, инозин, ксантин, гипоксантин, изоцитозин и изогуанин. Нуклеиновые кислоты могут быть получены методами химического синтеза или рекомбинантными методами.

[68] Термин «Функционально связанный», в контексте данного документа, означает, что экспрессия гена находится под контролем промотора, с которым он пространственно связан. Промотор может быть расположен на 5 '-(слева) или 3'- (справа) конце подконтрольного гена. Расстояние между промотором и геном может быть приблизительно таким же, как расстояние между этим промотором и геном, который он контролирует и откуда происходит. Как уже известно в данной области техники, изменение этого расстояния может быть осуществлено без потери функции промотора.

[69] Термины «пептид», «белок» или «полипептид», в контексте данного документа, могут означать связанную последовательность аминокислот и могут быть природными, синтетическими или модифицированными, или комбинированными из природных и синтетических.

[70] Термин «промотор», в контексте данного документа, означает синтетическую или полученную в природе молекулу, которая способна придавать, активировать или усиливать экспрессию нуклеиновой кислоты в клетке. Промотор может содержать одну или более специфических регуляторных транскрипционных последовательностей для дополнительного усиления экспрессии и/или изменения пространственной экспрессии и /или временной экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке. Промотор также может содержать дистальные энхансерные или репрессорные элементы, которые могут находиться на расстоянии до нескольких тысяч пар оснований от стартового сайта транскрипции. Промотор может быть получен из источников, включая вирусные, бактериальные, грибковые, растительные, насекомые и животные. Промотор может регулировать экспрессию генного компонента конститутивно или дифференциально по отношению к клетке, ткани или органу, в котором происходит экспрессия, или относительно стадии развития, на которой происходит экспрессия, или в ответ на внешние раздражители, такие как физиологические стрессы, патогены, ионы металлов или возбуждающие агенты. Типичные примеры промоторов включают промотор бактериофага Т7, промотор бактериофага Т3, промотор SP6, оператор-промотор lac, промотор tac, поздний промотор SV40, ранний промотор SV40, промотор RSV-LTR, промотор CMV IE, ранний промотор SV40 или поздний промотор SV40, промотор CMV IE и промотор цитомегаловируса человека немедленно-раннего ответа (hCMV). В некоторых вариантах воплощения изобретения, промотор представляет собой промотор hCMV.

[71] Термины «сигнальный пептид» и «лидерная последовательность» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к аминокислотной последовательности, которая может быть связана с аминогруппой на конце белка, изложенного в данном документе. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности обычно направляют локализацию белка. Используемые здесь сигнальные пептиды/лидерные последовательности оптимально облегчают секрецию белка из клетки, в которой он продуцируется. При секреции из клетки, сигнальные пептиды/лидерные последовательности часто отщепляются от остатка белка, обычно называемого зрелым белком. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности связаны на амино-конце (то есть на N-конце) белка.

[72] Термин «жесткие условия гибридизации», в контексте данного документа, означает условия, при которых первая последовательность нуклеиновой кислоты (например, зонд) будет гибридизоваться со второй последовательностью нуклеиновой кислоты (например, мишенью) в сложной смеси нуклеиновых кислот. Жесткие условия зависят от последовательности и будут разными в разных обстоятельствах. Жесткие условия могут быть выбраны приблизительно на 5-10°C ниже, чем температура плавления (Tm) для конкретной последовательности при определенном pH ионной силы. Tm может быть температурой (при определенной ионной силе, pH и концентрации нуклеинов), при которой 50% зондов, комплементарных мишени, гибридизуются с последовательностью-мишенью в равновесии (так как последовательности мишени присутствуют в избытке, при Tm, 50% зондов равновесно связаны). При жестких условиях концентрация соли может составлять менее, чем приблизительно 1,0 М иона натрия, например, концентрация приблизительно 0,01-1,0 М иона натрия (или других солей) при рН 7,0-8,3, и температура, по меньшей мере, приблизительно 30°С для коротких зондов (например, приблизительно 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60°С для длинных зондов (например, больше, чем приблизительно 50 нуклеотидов). Жесткие условия также могут быть достигнуты благодаря добавлению дестабилизирующих агентов, таких как формамид. При селективной или специфической гибридизации, положительный сигнал может по меньшей мере в 2-10 раз превышать фоновую гибридизацию. Примерные жесткие условия гибридизации включают следующие: 50% формамид, 5x стандартный солевой раствор и 1% СДС, инкубирование при 42°C или 5x стандартный солевой раствор, 1% СДС, инкубирование при 65°C, с отмывкой в 0,2x стандартном солевом растворе и 0,1% СДС при 65°С.

[73] Термин «субъект» в данном описании может означать млекопитающее, которому необходима или требуется иммунизация, описанными здесь вакцинами. Млекопитающее может быть человеком, низшим приматом, таким как шимпанзе, собакой, кошкой, лошадью, коровой, мышью или крысой.

[74] Термин «существенно комплементарный», используемый в данном документе, означает, что первая последовательность составляет по меньшей мере 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86. , 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% идентичности комплементу второй последовательности покрывая участок из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540 или более нуклеотидов или аминокислот, или что две последовательности гибридизуются в жестких условиях гибридизации.

[75] Термин «сущетсвенно идентичный», используемый в данном документе, означает, что первая и вторая последовательности составляют по меньшей мере 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% идентичности покрывая участок из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540 или более нуклеотидов, или аминокислот, или по отношению к нуклеиновым кислотам, если первая последовательность является, по существу, комплементарной комплементу второй последовательности.

[76] Термины «лечить», «лечение», «лечащий», используемые в данном документе, могут означать защиту животного от заболевания посредством средств предотвращения, подавления, угнетения или полного устранения заболевания. Профилактика заболевания включает введение вакцины, описанной в настоящем изобретении, животному до начала заболевания. Подавление заболевания включает введение вакцины, описанной в настоящем изобретении, животному после индукции заболевания, но до его клинического проявления. Подавление заболевания включает введение вакцины, описанной в настоящем изобретении, животному после клинического проявления заболевания.

[77] Термин «вариант», используемый в данном документе в отношении нуклеиновой кислоты, означает (i) часть или фрагмент указанной нуклеотидной последовательности; (ii) комплемент эталонной нуклеотидной последовательности или ее части; (iii) нуклеиновую кислоту, которая существенно идентична указанной нуклеиновой кислоте или ее комплементу; или (iv) нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях с указанной нуклеиновой кислотой, ее комплементом или последовательностью, существенно ей идентичной.

[78] Термин «вариант», используемый в данном документе в отношении пептида или полипептида, означает пептид или полипептид, который отличается по аминокислотной последовательности вставкой, делецией или консервативной заменой аминокислот, но сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность. Вариант также может означать белок с аминокислотной последовательностью, которая существенно идентична эталонному белку с аминокислотной последовательностью, которая сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность. Консервативное замещение аминокислоты, то есть замена аминокислоты другой аминокислотой со схожими свойствами (например, гидрофильностью, степенью и распределением заряженных областей), как известно, в данной области техники обычно включает незначительные изменения. Эти незначительные изменения могут быть идентифицированы, частично, с учетом гидропатического индекса аминокислот, что является известным в данной области техники. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982). Гидропатический индекс аминокислоты основан на учете ее гидрофобности и заряда. В данной области техники известно, что аминокислоты с подобными гидропатическими индексами могут быть замещены друг другом с одновременным сохранением функции белка. В одном аспекте, аминокислоты, имеющие гидропатические индексы ± 2, являются замещенными. Гидрофильность аминокислот также может быть использована для выявления замещений с сохранением биологической функции. Рассмотрение гидрофильности аминокислот в отношении пептида позволяет рассчитать наибольшую локальную среднюю гидрофильность этого пептида, что является полезным оценочным критерием, который, как упоминалось, хорошо коррелирует с антигенностью и иммуногенностью. Патент США № 4554101 полностью включен в данный документ в качестве ссылки. Замена аминокислот, имеющих сходные значения гидрофильности, может привести к сохранению пептидами биологической активности, например иммуногенности, подразумеваемой данной областью техники. Для замены можно использовать аминокислоты, имеющие значения гидрофильности в пределах ± 2 друг для друга. На индекс гидрофобности и значение гидрофильности аминокислот влияет определенная боковая цепь этой аминокислоты. В соответствии с этим наблюдением считается, что аминокислотные замены, совместимые с биологической функцией, зависят от относительного сходства аминокислот и, в частности, от боковых цепей этих аминокислот, что проявляется в гидрофобности, гидрофильности, заряде, размере и других свойствах.

[79] Вариант может быть последовательностью нуклеиновой кислоты, которая практически идентична по всей длине полной последовательности гена или ее фрагмента. Последовательность нуклеиновой кислоты может составлять 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичность по всей длине генной последовательности или ее фрагмента. Вариант может быть аминокислотной последовательностью, которая существенно идентична по всей длине аминокислотной последовательности или ее фрагмента. Аминокислотная последовательность может составлять 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности или ее фрагмента.

[80] Термин «вектор», в контексте дпнного документа, означает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую источник репликации. Вектор может быть вирусным вектором, бактериофагом, бактериальной искусственной хромосомой или дрожжевой искусственной хромосомой. Вектор может быть вектором ДНК или РНК. Вектор может быть самореплицирующимся внехромосомным вектором и, оптимально, представляет собой плазмиду ДНК. Вектор может содержать или включать одну или более гетерологичных последовательностей нуклеиновых кислот.

Вакцина

[81] В настоящем документе предложены вакцины, содержащие мезотелиновый антиген или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую мезотелиновый антиген, согласно настоящему описанию. В некоторых вариантах воплощения изобретения, вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих мезотелиновый антиген, согласно настоящему описанию. В некоторых вариантах воплощения изобретения, вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислоты 19-607 SEQ ID NO: 2; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% всей длины белка, содержащего аминокислоты 19-607 SEQ ID NO: 2; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, который по меньшей мере на 96% идентичен аминокислотам 19-607 SEQ ID NO: 2; и/или последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент, включающий по меньшей мере 90% всей длины белка, идентичного по меньшей мере на 96% аминокислотам 19-607 SEQ ID NO: 2.

[82] В некоторых вариантах воплощения изобретения, вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую SEQ ID NO: 2; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фрагмент, составляющий по меньшей мере 90% длины SEQ ID NO: 2; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, идентичный SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 96%; и или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фрагмент, включающий по меньшей мере 90% всей длины белка, идентичный SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 96%.

[83] В некоторых вариантах воплощения изобретения, вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, включающих нуклеотиды 55-1821 SEQ ID NO: 1; фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% всей длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающий нуклеотиды 55-1821 SEQ ID NO: 1; фрагмент, идентичный нуклеотидам 55-1821 SEQ ID NO: 1 по меньшей мере на 96%; и/или фрагмент, включающий по меньшей мере 90% всей длины последовательности нуклеиновой кислоты, идентичной нуклеотидам 55-1821 SEQ ID NO: 1 по меньшей мере на 96%.

[84] В некоторых вариантах воплощения изобретения, вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, включающих SEQ ID NO: 1; фрагмент, составляющий не менее 90% всей длины SEQ ID NO: 1; фрагмент, который по меньшей мере на 96% идентичен SEQ ID NO: 1; и/или фрагмент, включающий по меньшей мере 90% всей длины последовательности нуклеиновой кислоты, идентичной последовательности SEQ ID NO: 1 по меньшей мере на 96%.

[85] В некоторых вариантах воплощения изобретения, вакцина содержит антиген MUC16, отличающийся содержанием аминокислоты 19-607 SEQ ID NO: 2; фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% от всей длины белка, содержащего аминокислоты 19-607 SEQ ID NO: 2; аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотам 19-607 SEQ ID NO: 2; и/или фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% всей длины аминокислотной последовательности, идентичной аминокислотам 19-607 SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 95%.

[86] В некоторых вариантах воплощения изобретения, вакцина содержит антиген MUC16, отличающийся содержанием антигена SEQ ID NO: 2; фрагмент, составляющий по меньшей мере 90% длины SEQ ID NO 2; аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 96% идентична SEQ ID NO: 2; и/или фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% от всей длины белка, идентичный SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 96%.

[87] Вакцины могут вызывать иммунный ответ субъекта по отношению к антигену. Иммунный ответ может быть терапевтическим или профилактическим. Вакцины могут быть использованы для защиты от рака, такого как мезотелин-экспрессирующий рак или опухоль. Вакцины могут быть использованы для предотвращения и/или лечения мезотелин-экспрессирующей опухоли у нуждающегося в этом субъекта. Вакцины могут вызывать клеточные и/или гуморальные ответы по отношению к мезотелину и мезотелин-экспрессирующим опухолям. В одном варианте воплощения изобретения, вакцины могут быть использованы для защиты от, предотвращения и/или лечения, или индукции клеточного и/или гуморального ответа по отношению к мезотелин-экспрессирующим клеткам рака яичников, а именно, мезотелин-экспрессирующим клеткам эпителиального рака яичников, и если быть более точным, то мезотелин-экспрессирующим клеткам серозного рака яичников.

[88] Разработка противораковой вакцины, описанной в данном изобретении, включает идентификацию ракового антигена, например мезотелина, который не распознается иммунной системой и является аберрантно экспрессируемым аутоантигеном. Для распознавания иммунной системой, идентифицированный раковый антиген заменяется с аутоантигена на чужеродный антиген. Переконструирование нуклеиновой кислоты и аминокислотных последовательностей рекомбинантного ракового антигена с нативных на чужеродный антиген нарушает толерантность антигена в иммунной системе. Для нарушения толерантности, к раковому антигену могут быть применены несколько способов переконструирования, описанные ниже.

[89] Рекомбинантный раковый антиген вакцины не распознается как нативный, тем самым нарушая толерантность. Нарушение толерантности может индуцировать антиген-специфические ответы Т-клеток и/или высокий титр антител, вызывая или активируя иммунный ответ, направленный или реагирующий на рак или опухоль, экспрессирующую антиген. В некоторых вариантах воплощения изобретения, вызванный или активированный иммунный ответ может быть клеточным, гуморальным или как клеточным, так и гуморальным. В некоторых вариантах воплощения изобретения, вызванный или активированный клеточный иммунный ответ может включать индукцию или секрецию интерферона-гамма (ИФНy) и/или фактора некроза опухоли альфа (ФНО-a). В других вариантах воплощения изобретения, вызванный или активированный иммунный ответ может уменьшать или ингибировать один или более факторов иммуносупрессии, способствующих росту опухоли или рака, экспрессирующего антиген, например, факторов, подавляющих презентацию главного комплекса гистосовместимости (МНС), усиливающих антиген-специфичные регуляторные Т-клетки (Tregs), PD-L1, FasL, цитокинов, таких как ИЛ-10 и трансформирующий ростовой фактор TFG-β, ассоциированных с опухолью макрофагов, ассоциированных с опухолью фибробластов, растворимых факторов, продуцируемых иммуносупрессорными клетками, CTLA-4, PD-1 , МЛСК, MCP-1 и молекул иммунных контрольных точек, но, не ограничиваясь ими.

[90] Вакцина может быть ДНК-вакциной. ДНК-вакцины раскрыты в патентах США № 5,593,972, 5739118, 5817637, 5830876, 5,962,428, 5,981,505, 5,580,859, 5,703,055 и 5,676,594, ссылки на которые полностью включены в настоящее описание. В некоторых вариантах воплощения изобретения, молекула нуклеиновой кислоты может содержать вектор экспрессии. ДНК-вакцина может дополнительно содержать элементы или реагенты, препятствующие ее интеграции в хромосому.

[91] Вакцина может включать РНК, кодирующую раковый антиген. РНК-вакцина может быть введена в клетку.

[92] Вакцина может быть аттенуированной живой вакциной, вакциной, с использованием рекомбинантных векторов доставки антигена, субъединичной вакциной и гликопротеиновой вакциной, например, вакциной, описанной в патентах США № 4510245; 4797368; 4722848; 4790987; 4920209; 5017487; 5077044; 5110587; 5112749; 5174993; 5223424; 5225336; 5240703; 5242829; 5294441; 5294548; 5310668; 5387744; 5389368; 5424065; 5451499; 5,453,364; 5462734; 5470734; 5474935; 5482713; 5591439; 5643579; 5650309; 5698202; 5955088; 6034298; 6042836; 6,156,319 и 6,589,529, ссылка на каждый из которых включена в данный документ, но, не ограничиваясь ими.

[93] В некоторых вариантах воплощения изобретения, вакцина на основе нуклеиновой кислоты может дополнительно содержать молекулярный адъювант, в некоторых случаях молекулярным адъювантов могут быть ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-28, ИЛ-31, ИЛ-33 и/или RANTES, и в некоторых случаях молекулярный адъювант является ингибитором контрольной точки, включая антицитотоксический антиген 4 Т-лимфоцитов (CTLA-4), анти-запрограммированный рецептор смерти-1 (PD-1) и антилимфоцитарный ген активации (LAG- 3). Кодирующая последовательность для ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-28 и/или RANTES может быть включена в одну или более молекул нуклеиновой кислоты, содержащих кодирующую последовательность для одного или более антигенов. Кодирующая последовательность для ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-28, ИЛ-31, ИЛ-33 и /или RANTES может кодироваться вакциной, состоящей из нуклеиновой кислоты, в общей плазмиде, или последовательность может быть включена в отдельную молекулу нуклеиновой кислоты, например, отдельную плазмиду.

[94] Вакцина, описанная в настоящем изобретении, может обладать свойствами, необходимыми для эффективных вакцин, такими как безопасность, когда сама вакцина не способна вызывать заболевание или смерть; защита от болезней; индукция нейтрализующего антитела; индукция защитного Т-клеточного ответа; и обеспечение простоты применения, небольшое количество побочных эффектов, биологическая стабильность и низкая стоимость дозы. Вакцина, содержащая раковый антиген, может иметь некоторые или все эти особенности, как оговорено ниже.

[95] Вакцина может дополнительно содержать один или более ингибиторов одной или более молекул иммунной контрольной точки (то есть ингибитор иммунной контрольной точки). Молекулы иммунной контрольной точки описаны ниже более подробно. Ингибитором иммунной контрольной точки является любая нуклеиновая кислота или белок, который предотвращает подавление любого компонента в иммунной системе, такого как презентация комплекса гистосовместимости MHC, презентация и/или дифференцировка Т-клеток, презентация и/или дифференцировка В-клеток, любой цитокин, хемокин или сигнал пролиферации и/или дифференцировки иммунных клеток. Кроме того, ниже более подробно описано, что вакцина может быть дополнительно скомбинирована с антителами к ингибиторам контрольной точки, таким как PD-1 и PDL-1, для усиления стимуляции как клеточного, так и гуморального иммунного ответа. Использование антител против PD-1 или против PDL-1 не позволяет PD-1 или PDL-1 подавлять ответы Т-клеток и/или В-клеток.

Антиген

[96] Как описано выше, вакцина может содержать антиген или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген. Антигеном может быть мезотелин, его фрагмент, его вариант или их комбинация.

[97] Мезотелин представляет собой белок размером 71 кДа, который расщепляется на два продукта: потенцирующий фактор мегакариоцитов размером 30 кДа и ГФИ-заякоренный связанный с мембраной зрелый мезотелин размером 41 кДа. Функция мезотелина неизвестна, однако недавние исследования показывают, что мезотелин может играть роль в метастазировании рака яичника, связываясь с MUC16, который также высоко экспрессируется на поверхности раковых клеток яичника. Согласно данным Института здравоохранения (IHC), экспрессия мезотелина наблюдалась в 82-100% серозных яичниковых карцином. Hassan, R. European journal of cancer 44, 46-53 (2008); Ordonez, N. G. The American journal of surgical pathology 27, 1418-1428 (2003).

[98] Соответственно, вакцина может быть использована для лечения субъектов, страдающих от мезотелин-экспрессирующего рака или опухолей. В некоторых вариантах воплощения изобретения, рак представляет собой рак яичника. Антиген мезотелина может отличаться от нативного, «нормального» мезотелина и, таким образом, обеспечивать терапию или профилактику опухоли, экспрессирующей мезотелиновый антиген. Соответственно, в данном документе предложены последовательности мезотелинового антигена, которые отличаются от нативного гена мезотелина (то есть рекомбинантные или мутированные гены, или последовательности мезотелина).

[99] Предложены молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие вышеописанные гетерологичные последовательности. Предложены молекулы нуклеиновой кислоты, состоящие из вышеописанных гетерологичных последовательностей. В некоторых вариантах воплощения изобретения, молекулы нуклеиновой кислоты содержат одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (а) нуклеотидов 55-1821 SEQ ID NO: 1; (б) фрагмента, содержащего нуклеотиды 55-1821 SEQ ID NO: 1 по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% по всей длине молекулы нуклеиновой кислоты; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 96, 97, 98% или 99% идентичен нуклеотидам 55-1821 SEQ ID NO: 1; и (г) фрагмента, включающего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% всей длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая идентична нуклеотидам 55-1821 SEQ ID NO: по меньшей мере на 96, 97, 98% или 99%. В некоторых вариантах воплощения изобретения, молекулы нуклеиновой кислоты содержат одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 1; (б) фрагмента, включающего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% всей длины SEQ ID NO: 1; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 96, 97, 98% или 99% идентичен SEQ ID NO: 1; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% всей длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая идентична последовательности SEQ ID NO: 1 по меньшей мере на 96, 97, 98% или 99%. В некоторых вариантах воплощения изобретения, молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, изложенную в SEQ ID NO: 1.

[100] В данном документе предложены последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие мезотелиновые антигены. В некоторых вариантах изобретения, молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более нуклеиновых кислот, выбраны из (а) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислоты 19-607 SEQ ID NO: 2; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% всей длины белка содержащего аминокислоты 19-607 из SEQ ID NO: 2; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 96, 97, 98% или 99% идентичен аминокислотам 19-607 SEQ ID NO: 2; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, включающий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% всей длины белка, идентичный аминокислотам 19-607 SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 96%, 97%, 98% или 99%. В некоторых вариантах изобретения молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбраны из группы, состоящей из: (а) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID NO: 2; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент, включающий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% всей длины SEQ ID NO: 2; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, идентичный SEQ ID NO:2 по меньшей мере на 96, 97, 98% или 99% ; и (d), последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% всей длины белка, идентичный SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99%.

[101] Изолированные молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие вышеописанные гетерологичные последовательности, могут быть включены в векторы, такие как плазмиды, вирусные векторы и другие формы молекул нуклеиновой кислоты, как приведено ниже.

[102] Предложены молекулы белка, содержащие описанные выше гетерологичные аминокислотные последовательности. предложены молекулы белка, состоящие из описанных выше гетерологичных аминокислотных последовательностей. В данном документе предложены белки и полипептиды, включающие вышеописанные последовательности. Белки и полипептид могут называть мезотелиновыми антигенами и мезотелиновыми иммуногенами. Мезотелиновые антигены способны вызывать иммунный ответ против антигена мезотелин-экспрессирующих опухолей. В некоторых вариантах воплощения изобретения, белки, содержащие аминокислотную последовательность, выбраны из группы, состоящей из: (а) аминокислот 19-607 из SEQ ID NO: 2; (б) фрагмента, содержащего аминокислоты 19-607 SEQ ID NO: 2 по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% от всей длины белка; (в) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотам 19-607 SEQ ID NO: 2; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% всей длины аминокислотной последовательности, идентичной аминокислотам 19-607 SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 96, 97, 98% или 99%. В некоторых вариантах воплощения изобретения, белки, содержащие аминокислотную последовательность, выбраны из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 2; (б) фрагмента, включающего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% всей длины SEQ ID NO: 2; (в) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 2; и (в) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% всей длины аминокислотной последовательности, идентичной SEQ ID NO: 2 не менее, чем на 96, 97, 98% или 99%,. В некоторых вариантах воплощения изобретения, белок содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2.

[103] В одном аспекте изобретения, желательно обеспечение улучшения транскрипции и трансляции с помощью консенсусного антигена, включая наличие одного или более пунктов из перечисленных: лидерной последовательности с низким содержанием GC для улучшения транскрипции; стабильности мРНК и оптимизации кодонов; и, насколько это возможно, устранения мотивов последовательности действующей в цис-положении (то есть внутренних TATA-боксов).

[104] Мезотелиновый антиген может быть консенсусной антигенной (или иммуногенной) последовательностю, происходящей из двух или более видов. Консенсусный мезотелиновый антиген может содержать одну или более мутаций, которые могут включать замену одной или более аминокислот в связывающем домене MUC-16. Одна или более мутаций могут включать мутации нуклеиновых кислот, приводящие к замене тирозина на аланин. Одна или более мутаций могут включать замену одной или более аминокислот в ГФИ-заякоренном сигнале. Одна или более мутаций могут включать замену серина на треонин и/или треонина на валин. Соответственно, в некоторых вариантах воплощения изобретения, одна или более мутаций могут заменять 1, 2 или 3 аминокислоты в сигнале связывания мезотелина MUC16 и/или сигнала ГФИ-якоря.

[105] Мезотелиновый антиген может включать модификации для улучшения экспрессии. Модификация может включать оптимизацию кодонов, оптимизацию РНК, добавление последовательности Козак (например, GCCACC) для увеличения инициации трансляции и/или добавление лидерной последовательности иммуноглобулина для повышения иммуногенности мезотелинового антигена. Мезотелиновый антиген может содержать сигнальный пептид, такой как сигнальный пептид иммуноглобулина, например, сигнальный пептид иммуноглобулина E (IgE) или иммуноглобулина G (IgG), но, не ограничиваясь ими.

Вакцина в комбинации с ингибитором иммунной контрольной точки

[106] Вакцина может дополнительно содержать один или более ингибиторов одной или более молекул иммунной контрольной точки (то есть ингибитора иммунной контрольной точки). Молекулы иммунной контрольной точки описаны ниже более подробно. Ингибитором иммунной контрольной точки является любая нуклеиновая кислота или белок, предотвращающий подавление любого компонента иммунной системы, такого как антигенпрезентующий комплекс MHC, презентация и/или дифференцировка Т-клеток, презентация и/или дифференцировка В-клеток, любой цитокин, хемокин или сигнальниый путь пролиферация и/или дифференцировки иммунных клеток.

[107] Таким ингибитором может быть последовательность нуклеиновой кислоты, аминокислотная последовательность, малая молекула или их комбинация. Последовательность нуклеиновой кислоты может быть ДНК, РНК, кДНК, их вариантом, их фрагментом или их комбинацией. Нуклеиновая кислота также может включать дополнительные последовательности, кодирующие последовательности линкера или экспрессирующего маркера, связанные с ингибитором иммунной контрольной точки пептидной связью. Малой молекулой может быть молекула с небольшим молекулярным весом, например, менее 800 Дальтон, органическое или неорганическое соединение, которое может служить субстратом фермента, лиганд (или его аналог), связанный с белком или нуклеиновой кислотой, или регулятор биологического процесса. Аминокислотная последовательность может быть белком, пептидом, его вариантом, его фрагментом или их комбинацией.

[108] В некоторых вариантах воплощения изобретения, ингибитор иммунной контрольной точки может быть одной или более последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующих антитело, его вариант, его фрагмент или их комбинацию. В других вариантах воплощения изобретения, ингибитор иммунной контрольной точки может быть антителом, его вариантом, его фрагментом или их комбинацией.

a. Молекула имунной контрольной точки

[109] Молекула иммунной контрольной точки может быть последовательностью нуклеиновой кислоты, аминокислотной последовательностью, небольшой молекулой или их комбинацией. Последовательность нуклеиновой кислоты быть ДНК, РНК, кДНК, их вариантом, их фрагментом или их комбинацией. Нуклеиновая кислота также может включать дополнительные последовательности, которые кодируют последовательности линкера или экспрессирующего маркера, которые связаны с ингибитором иммунной контрольной точки пептидной связью. Малой молекулой может быть молекула с небольшим молекулярным весом, например, менее 800 Дальтон, органическое или неорганическое соединение, которое может служить субстратом фермента, лиганд (или его аналог), связанный с белком или нуклеиновой кислотой, или регулятор биологического процесса. Аминокислотная последовательность может быть белком, пептидом, его вариантом, его фрагментом или их комбинацией.

(1) PD-1 и PD-L1

[110] Молекула иммунной контрольной точки может программировать белок клеточной гибели-1 (PD-1), лиганд программированной клеточной гибели-1 (PD-L1), его фрагмент, его вариант или их комбинацию. PD-1 представляет собой белок клеточной поверхности, кодируемый геном PDCD1. PD-1 является членом суперсемейства иммуноглобулинов и экспрессируется на Т-клетках и про-В-клетках и, таким образом, способствует участию и/или дифференцировке этих клеток. В частности, PD-1 является мембранным белком типа 1 семейства регуляторов Т-клеток CD28/CTLA-4 и отрицательно регулирует сигналы рецептора Т-клеток (TCR), тем самым отрицательно регулируя иммунные ответы. PD-1 может отрицательно регулировать ответы CD8+T-клеток и, таким образом, ингибировать опосредованную CD8 цитотоксичность и усиливать рост опухоли.

[111] PD-1 имеет два лиганда, PD-L1 и PD-L2, которые являются членами семейства B7. PD-L1 активируется на макрофагах и дендритных клетках (ДК) в ответ на обработку ЛПС и ГМ-КСФ, а также на T-клетках и B-клетках при передаче рецепторами сигналов TCR и B-клеток. PD-L1 экспрессируется многими линиями опухолевых клеток, включая миеломы, мастоцитомы и меланомы.

b. Антитело молекулы анти-имунной контрольной точки

[112] Как описано выше, ингибитор иммунной контрольной точки может быть антителом. Антитело может связываться или реагировать с антигеном (т.е. молекулой иммунной контрольной точки, описанной выше). Соответственно, антитело может рассматриваться как антитело молекулы анти-иммунной контрольной точки или антитело молекулы иммунной контрольной точки. Антитело может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащейся в документе.

[113] Антитело может включать полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи. Полипептид тяжелой цепи может включать регион вариабельной тяжелой цепи (VH) и/или по меньшей мере один регион константной тяжелой цепи (CH). По меньшей мере, один константный регион тяжелой цепи может включать константный регион тяжелой цепи-1 (CHI), константный регион тяжелой цепи-2 (CH2) и константный регион тяжелой цепи-3 (CH3), и/или шарнирный регион.

[114] В некоторых вариантах воплощения изобретения, полипептид тяжелой цепи может включать регион VH и регион CHI. В других вариантах воплощения изобретения, полипептид тяжелой цепи может включать регион VH, регион CHI, шарнирный регион, регион CH2 и регион CH3.

[115] Полипептид тяжелой цепи может включать набор регионов, определяющих комплементарность («CDR»). Набор CDR может содержать три гипервариабельных региона VH региона. Исходя из N-конца полипептида тяжелой цепи, эти CDR обозначены как «CDR1», «CDR2» и «CDR3» соответственно. CDR1, CDR2 и CDR3 полипептида тяжелой цепи могут способствовать связыванию или распознаванию антигена.

[116] Полипептид легкой цепи может включать регион вариабельной легкой цепи (VL) и/или регион константной легкой цепи (CL). Полипептид легкой цепи может включать набор регионов, определяющих комплементарность («CDR»). Набор CDR может содержать три гипервариабельных региона VL региона. Исходя из N-конца полипептида легкой цепи, эти CDR обозначены как «CDR1», «CDR2» и «CDR3» соответственно. CDR1, CDR2 и CDR3 полипептида легкой цепи могут способствовать связыванию или распознаванию антигена.

[117] Антитело может содержать регион, определяющий комплементарность легкой цепи и тяжелой цепи («CDR»), соответственно, расположенный в каркасном участке тяжелой и легкой цепей («FR»), обеспечивая поддержку CDR и определяя пространственные отношения CDR относительно друг друга. Набор CDR может содержать три гипервариабельных участка V-области тяжелой или легкой цепи. Исходя из N-конца тяжелой или легкой цепи, эти области обозначены как «CDR1», «CDR2» и «CDR3» соответственно. Следовательно, антигенсвязывающий сайт может включать шесть CDR, включающих набор CDR каждой V-области тяжелой и легкой цепи.

[118] Антитело может быть иммуноглобулином (Ig). Ig может являться, например, IgA, IgM, IgD, IgE и IgG. Иммуноглобулин может включать полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи. Полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина может включать регион VH, регион CHI, шарнирный регион, регион CH2 и регион CH3. Полипептид легкой цепи иммуноглобулина может включать регион VL и регион CL.

[119] Кроме того, протеолитический фермент папаин предпочтительно расщепляет молекулы IgG с образованием нескольких фрагментов, два из которых (фрагменты F (ab)) содержат ковалентный гетеродимер, который включает интактный антигенсвязывающий сайт. Фермент пепсин способен расщеплять молекулы IgG с образованием нескольких фрагментов, включая фрагмент F (ab ') 2, который содержит оба антигенсвязывающих сайта. Соответственно, антитело может быть Fab или F (ab ') 2. Fab может включать полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи. Полипептид тяжелой цепи Fab может включать регион VH и регион CHI. Легкая цепь Fab может включать регион VL и регион CL.

[120] Антитело может быть поликлональным или моноклональным. Антитело может быть химерным, одноцепочечным антителом, антителом со зрелой аффинностью, человеческим антителом, гуманизированным антителом или полностью человеческим антителом. Гуманизированное антитело может быть антителом, полученным от вида не являющегося человеком, которое связывает желаемый антиген, имеющий одну или более областей, определяющих комплементарность (CDR) и каркасные участки молекулы иммуноглобулина человека.

(1) PD-1 Антитело

[121] Антитело молекулы анти-имунной контрольной точки может быть антителом анти-PD-1 (также называемым в настоящем документе «PD-1 антитело»), его вариант, его фрагмент или их комбинацию. Антитело анти-PD-1 может быть ниволумабом. Антитело анти- PD-1 может ингибировать активность PD-1, таким образом, вызывая, активируя или усиливая иммунный ответ против опухоли или рака и уменьшая рост опухоли.

(2) PD-L1 Антитело

[122] Антитело молекулы анти-имунной контрольной точки может быть анти-PD-L1 антителом (также обозначаемым здесь как «PD-L1 антитело»), его вариантом, его фрагментом или их комбинацией. Антитело анти-PD-L1 может ингибировать активность PD-L1, таким образом вызывая, активируя или усиливая иммунный ответ против опухоли или рака и уменьшая рост опухоли.

Вектор

[123] Вакцина может содержать один или более векторов, которые включают гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую мезотелиновый антиген. Один или более векторов могут быть способны экспрессировать антиген в количестве, эффективном для вызывания иммунного ответа у млекопитающего. Вектор может содержать гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген. Вектор может иметь последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую источник репликации. Вектор может быть плазмидой, бактериофагом, бактериальной искусственной хромосомой или дрожжевой искусственной хромосомой. Вектор может быть либо самореплицирующимся внехромосомным вектором, либо вектором, который интегрируется в геном хозяина.

[124] Один или более векторов могут быть экспрессирующей конструкцией, которая обычно является плазмидой, используемой для введения определенного гена в клетку-мишень. Как только вектор экспрессии оказывается внутри клетки, белок, кодируемый геном, начинает продуцироваться рибосомными внутриклеточными комплексами транскрипции и трансляции. Плазмиду часто конструируют так, чтобы она содержала регуляторные последовательности, действующие как энхансерные и промоторные регионы для обеспечения эффективной транскрипции гена, помещенного в экспрессирующий вектор. Векторы, описанные в настоящем изобретении, экспрессируют большие количества стабильной мессенджерной РНК и, как следствие, белков.

[125] Векторы могут включать сигналы экспрессии, такие как сильный промотор, сильный кодон терминации, регулирование расстояния между промотором и клонированным геном, вставка последовательности терминации транскрипции и PTIS (портативная последовательность инициации трансляции).

[126] Векторы могут содержать последовательности нуклеиновых кислот, функционально связанные с регуляторным элементом, таким как сигнал промотора или полиаденилирования. В некоторых вариантах воплощения изобретения, промотор является промотором цитомегаловируса человека немедленно-раннего ответа (промотор hCMV). В некоторых вариантах воплощения изобретения, сигнал полиаденилирования является сигнальной последовательностью полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота (bGH поли-A).

[127] Вектор может быть кольцевой плазмидой или линейной нуклеиновой кислотой. Кольцевая плазмида и линейная нуклеиновая кислота способны управлять экспрессией конкретной нуклеотидной последовательности в соответствующей клетке субъекта. Вектор может содержать промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью кодирующей антиген, и который может быть функционально связан с сигналами терминации. Вектор также может содержать последовательности, необходимые для правильной трансляции нуклеотидной последовательности, а также последовательности для клонирования и субклонирования вектора и его фрагментов. Вектор, содержащий целевую нуклеотидную последовательность, может быть химерным, что означает, что по меньшей мере один из его компонентов является гетерологичным по отношению, как минимум, к одному из других компонентов. Экспрессия нуклеотидной последовательности в кассете экспрессии может находиться под контролем конститутивного промотора или индуцибельного промотора, который инициирует транскрипцию только тогда, когда на клетку-хозяина воздействует какой-то конкретный внешний стимул. В случае многоклеточного организма, промотор также может быть специфичным для конкретной ткани или органа, или стадии развития.

[128] Вектор может быть плазмидой. Плазмида может использоваться для трансфекции клеток нуклеиновой кислотой, кодирующей антиген, которую культивируют трансформированные клетки-хозяева и поддерживают в условиях, подходящих для экспрессии антигена.

[129] Плазмида может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более различных антигенов, описанных выше, включая последовательности, кодирующие синтетический консенсусный антиген, способный вызывать иммунный ответ к антигену, фрагменты таких белков, варианты таких белков, фрагменты вариантов или слитые белки, состоящие из комбинаций консенсусных белков и/или фрагментов консенсусного белка, и/или вариантов консенсусного белка, и/или фрагментов вариантов консенсусных белков.

[130] В некоторых вариантах воплощения изобретения, плазмида может дополнительно содержать последовательность, кодирующую CCR20 отдельно или как часть одной из этих плазмид. Аналогично, плазмиды могут дополнительно содержать кодирующие последовательности для ИЛ-12, ИЛ-15 и/или ИЛ-28.

[131] Плазмида может дополнительно содержать кодон инициации, который может находиться выше кодирующей последовательности, и стоп-кодон, который может находиться ниже кодирующей последовательности. Кодоны инициации и стоп могут находиться в рамке считывания кодирующей последовательности.

[132] Плазмида также может содержать промотор, который функционально связан с кодирующей последовательностью. Промотор, функционально связанный с кодирующей последовательностью, может быть промотором вируса обезьяны 40 (SV40), промотором вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV), промотором вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), так и промотором вируса иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV), длинным терминальным повтором (LTR), промотором вируса Молони, промотором вируса птичьего лейкоза (ALV), промотором цитомегаловируса (ЦМВ), таким как промотор цитомегаловируса человека немедленно-раннего ответа (промотор hCMV), промотором вируса Эпштейна-Барра (EBV) или промотором вируса саркомы Рауса (RSV). Промотор также может быть промотором человеческого гена, такого как человеческий актин, человеческий миозин, человеческий гемоглобин, человеческий мышечный креатин или человеческий металлотионеин. Промотор также может быть тканеспецифичным промотором, таким как мышечный или кожный специфический промотор, природный или синтетический. Примеры таких промоторов описаны в публикации заявки на патент США №. US 20040175727, содержание которой полностью включено в настоящий документ.

[133] Плазмида также может содержать сигнал полиаденилирования, который может находиться ниже кодирующей последовательности. Сигнал полиаденилирования может быть сигналом полиаденилирования SV40, сигналом полиаденилирования LTR, сигналом полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота (bGH), сигналом полиаденилирования гормона роста человека (hGH), сигналом полиаденилирования человеческого β-глобина или сигналом полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота (bG поли-А). Сигнал полиаденилирования SV40 может быть сигналом полиаденилирования плазмиды pCEP4 (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния).

[134] Плазмида также может содержать энхансер перед кодирующей последовательностью. Энхансером может быть человеческий актин, человеческий миозин, человеческий гемоглобин, человеческий мышечный креатин или вирусный энхансер, например, CMV, FMDV, RSV или EBV. Усиления полинуклеотидной функции описаны в патентах США № 5593972, 5962248 и WO 94/016737, ссылки на содержание каждого из которых полностью включены в данный документ.

[135] Плазмида также может содержать точку начала репликации, происходящую от млекопитающих, для поддержания внехромосомной плазмиды и получения множества копий плазмиды в клетке. Плазмида может быть pVAXI, pCEP4 или pREP4 производства Invitrogen (Сан-Диего, Калифорния), которая может включать в себя источник репликации вируса Эпштейна-Барра и кодирующую область ядерного антигена EBNA-1, которая может производить высококопийную эписомальную репликацию без интеграции. Основой плазмиды может быть pAV0242. Плазмида может быть репликационно-дефектной плазмидой аденовируса типа 5 (Ad5).

[136] Плазмида также может содержать регуляторную последовательность, которая может хорошо подходить для экспрессии генов в той клетке, в которую вводится плазмида. Кодирующая последовательность может содержать кодон, который может обеспечить более эффективную транскрипцию кодирующей последовательности в клетке-хозяине.

[137] Кодирующая последовательность также может содержать лидерную последовательность иммуноглобулина (Ig). Лидерная последовательность может быть 5'-кодирующей последовательностью. Консенсусные антигены, кодируемые этой последовательностью, могут содержать N-концевую лидерную последовательность Ig, за которой следует консенсусный антигенный белок. Лидерной последовательностью N-концевого Ig может быть IgE или IgG.

[138] Плазмидой может быть pSE420 (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния), которая может быть использована для продуцирования белка в Escherichia coli (E.coli). Плазмида также может быть p-YES2 (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния), которая может быть использована для продуцирования белка в штаммах дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Плазмида также может иметь полную систему экспрессии бакуловируса MAXBAC™ (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния), которая может быть использована для продуцирования белка в клетках насекомых. Плазмида также может быть pcDNA I или pcDNA3 (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния), которые могут быть использованы для продуцирования белка в клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомячка (CHO). Плазмидой также может быть pGXOOl (Inovio), модифицированная из pVAXl (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс).

[139] Вектор может быть кольцевой плазмидой, которой можно трансформировать клетку-мишень путем интеграции в клеточный геном или оставить внехромосомно (например, автономно реплицирующаяся плазмида с источником репликации).

[140] Вектором может быть pVAX, pcDNA3.0 или provax, или любой другой экспрессирующий вектор, способный экспрессировать ДНК, кодирующую антиген и позволяющий клетке транслировать последовательность в антиген, распознаваемый иммунной системой.

[141] Также, в данном документе представлена линейная вакцина на основе нуклеиновых кислот или кассета с линейной экспрессией («LEC»), которую можно эффективно доставлять субъекту посредством электропорации и экспрессии одного или более желаемых антигенов. LEC может быть любой линейной ДНК, лишенной какого-либо фосфатного основания. ДНК может кодировать один или более антигенов. LEC может содержать промотор, интрон, стоп-кодон и/или сигнал полиаденилирования. Экспрессия антигена может контролироваться промотором. LEC может не содержать генов устойчивости к антибиотикам и/или фосфатного основания. LEC может не содержать других последовательностей нуклеиновых кислот, не связанных с желаемой экспрессией гена антигена.

[142] LEC может быть получен из любой плазмиды, способной к линеаризации. Плазмида может быть способной экспрессировать антиген. Плазмидой может быть pNP (Пуэрто-Рико/34) или pM2 (Новая Каледония/99). Плазмидой может быть WLV009, pVAX, pcDNA3.0 или provax, или любой другой вектор экспрессии, способный экспрессировать ДНК, кодирующую антиген, и позволяющий клетке транслировать последовательность в антиген, распознаваемый иммунной системой.

[143] LEC может быть pcrM2. LEC может быть pcrNP. pcrNP и pcrMR, которые могут быть получены из pNP (Пуэрто-Рико/34) и pM2 (Новая Каледония/99), соответственно.

[144] Вектор может содержать промотор. Промотор может быть любым промотором, способным управлять экспрессией гена и регулировать экспрессию выделенной нуклеиновой кислоты. Такой промотор представляет собой цис-действующий элемент последовательности, необходимый для транскрипции ДНК-зависимой РНК-полимеразой, которая транскрибирует последовательность антигена, описанную в настоящем документе. Выбор промотора, используемого для прямой экспрессии гетерологичной нуклеиновой кислоты, зависит от конкретного применения. Промотор может быть расположен приблизительно на том же расстоянии от начального сайта транскрипции в векторе, что и от начального сайта транскрипции в нативном гене. Тем не менее, изменение этого расстояния может быть внесено без потери функции промотора.

[145] Промотор может быть функционально связан с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген, и сигналами, необходимыми для эффективного полиаденилирования транскрипта, сайтов связывания рибосом и терминации трансляции.

[146] Промотор может быть CMV-промотором, промотором раннего ответа SV40, промотором позднего ответа SV40, металлотионеиновым промотором, промотором вируса опухоли молочной железы мыши, промотором вируса саркомы Рауса, промотором полиэдрина или другим промотором с доказанной эффективностью экспрессии в эукариотических клетках.

[147] Вектор может включать энхансер и интрон с функциональными донорными и акцепторными сайтами сплайсинга. Для обеспечения эффективной терминации, вектор может содержать регион терминации транскрипции ниже структурного гена. Терминальная область может быть получена из того же гена, что и последовательность промотора, или может быть получена из разных генов.

Способы подготовки вектора

[148] В настоящем документе предложены способы получения вектора, содержащего молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие обсуждаемый в данном документе мезотелиновый антиген. После заключительной стадии субклонирования в экспрессирующую плазмиду млекопитающего, вектор может быть использован для инокуляции клеточной культуры в крупномасштабном ферментере с использованием известных в данной области методов.

[149] Вектор, предназначенный для использования с устройствами электропорации, более подробно описанными ниже, может быть сконструирован или изготовлен с использованием комбинации известных устройств и технологий, однако более предпочтительным является изготовление с использованием оптимизированной технологии изготовления плазмид, описанной в публикации США № 2009/004716, поданной 23 мая 2008 года. В некоторых примерах, ДНК-плазмиды, использованные в данных исследованиях, могут быть сконструированы в концентрациях, превышающих или равных 10 мг/мл. Технологии изготовления также включают или объединяют различные устройства и протоколы, хорошо известные специалистам в данной области техники, в дополнение к технологиям, описанным в заявке США под серийным номером 60/939792, включая описанные в патенте США № 7,238,522, выданного 3 июля 2007 г. Упомянутые выше публикация и патент, а именно публикация США № 2009/004716 и патент США № 7,238,522, соответственно, включены полностью в данное изобретение.

Вспомогательные вещества и другие компоненты вакцины

[150] Вакцина может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый наполнитель. Фармацевтически приемлемый наполнитель может представлять собой функциональные молекулы, такие как переносчики, носители или разбавители. Фармацевтически приемлемый наполнитель может представлять собой агент, облегчающий трансфекцию, и может включать поверхностно-активные агенты, такие как иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS), неполный адъювант Фрейнда, аналог ЛПС, включая монофосфориллипид A, мурамилпептиды, аналоги хинона, везикулы, такие как сквален и сквален, гиалуроновая кислота, липиды, липосомы, ионы кальция, вирусные белки, полианионы, поликатионы или наночастицы, или другие известные агенты, облегчающие трансфекцию.

[151] Средство, облегчающее трансфекцию, представляет собой полианион, поликатион, включая поли-L-глутамат (LGS) или липид. Средство, облегчающее трансфекцию, представляет собой поли-L-глутамат, который может присутствовать в вакцине в концентрации менее 6 мг/мл. Облегчающий трансфекцию агент может также включать поверхностно-активные агенты, такие как иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS), неполный адъювант Фрейнда, аналог ЛПС, включая монофосфориллипид А, мурамилпептиды, аналоги хинона и везикулы, такие как сквален и сквален, и гиалуроновая кислота также может быть использованы в сочетании с генетическим конструктом. ДНК-плазмидные вакцины могут также включать агент, облегчающий трансфекцию, такой как липиды, липосомы, включая лецитиновые липосомы или другие липосомы, известные в данной области техники, в виде смеси ДНК-липосомы (см., например, W09324640), ионы кальция, вирусные белки, полианионы, поликатионы или наночастицы, или другие известные агенты, облегчающие трансфекцию. Агент, облегчающий трансфекцию, представляет собой полианион, поликатион, включая поли-L-глутамат (LGS), или липид. Концентрация трансфекционного агента в вакцине составляет менее 4 мг/мл, менее 2 мг/мл, менее 1 мг/мл, менее 0,750 мг/мл, менее 0,500 мг/мл, менее 0,250 мг/мл, менее 0,100 мг/мл, менее 0,050 мг/мл или менее 0,010 мг/мл.

[152] Фармацевтически приемлемый наполнитель может представлять собой один или более адъювантов. Адъювантами могут быть другие гены, которые экспрессируются в альтернативной плазмиде или доставляются в виде белков в комбинации с указанной выше плазмидой в составе вакцины. Один или более адъювантов могут быть выбраны из группы, состоящей из: CCL20, a-интерферона (ИФН-a), β-интерферона (ИФН-β), y-интерферона, тромбоцитарного фактора роста (PDGF), ФНОа, ФНОβ, GM-CSF, эпидермального фактора роста (EGF), хемоаттрактанта кожных Т-клеткок (CTACK), хемокина, экспрессируемого эпителиальным тимусом (TECK), эпителиального хемокина, связанного со слизистыми оболочками, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-28, ИЛ-31, ИЛ-33, МНС, CD80, CD86, ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-18, МСР-1, MIP-1a, MIP-1-, ИЛ-8, L-селектина, P-селектина, E-селектина, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95 , PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, мутантных форм ИЛ-18, CD40, CD40L, фактора роста сосудов, фактора роста фибробластов, ИЛ-7, фактора роста нервов, фактора роста эндотелия сосудов, Fas, рецептора TNF, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DRS, KILLER, TRA ИЛ-R2, TRICK2, DR6, каспазы ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65R el, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, неактивного NIK, SAP K, SAP-I, JNK, генов ответа на интерферон, NF-kβ, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, 0×40 , 0×40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAPI, TAP2, ИЛ-15, имеющих сигнальную последовательность или последовательность, которая кодирует удаленную сигнальную последовательность, с необязательным включением другого сигнального пептида, такого как пептид IgE или последовательность, кодирующую другой сигнальный пептид, такой как пептид IgE, его функциональные фрагменты или их комбинацию. Адъювантом может быть ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-28, CTACK, TECK, фактор роста, полученный из тромбоцитов (PDGF), ФНОa, TNFP, GM-CSF, эпидермальный фактор роста (EGF), ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-18 или их комбинация.

[153] В некоторых вариантах воплощения изобретения, адъювант может представлять собой один или более белков и/или молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют белки, выбранные из группы, состоящей из: CCL-20, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-28, CTACK, TECK, MEC или RANTES. Примеры конструкций и последовательностей ИЛ-12 раскрыты в заявке PCT №. PCT/US1997/019502 и соответствующей заявке, серийный номер США № 08/956 865 и предварительной заявке США № 61/569600, поданной 12 декабря 2011 г., ссылки на каждую из которых включены в настоящий документ. Примеры конструкций и последовательностей ИЛ-15 раскрыты в заявке PCT №. PCT/US04/18962 и в соответствующей заявке, серийный номер США 10/560,650, и в заявке PCT №. PCT/US07/00886 и в соответствующей заявке, серийный номер США 12/160,766, и в заявке PCT №. PCT/USI0/048827, ссылки на каждую из которых включены в настоящий документ. Примеры конструкций и последовательностей ИЛ-28 раскрыты в заявке PCT №. PCT/US09/039648 и соответствующей заявке, серийный номер США 12/936,192, ссылки на каждую из которых включены в настоящий документ. Примеры RANTES и других конструкций и последовательностей раскрыты в заявке PCT №. PCT/US1999/004332 и соответствующей заявке, серийный номер США 09/622452, ссылки на каждую из которых включены в настоящий документ. Другие примеры конструкций и последовательностей RANTES раскрыты в заявке PCT №. PCT/US 11/024098, ссылки на которую включены в настоящий документ. Примеры RANTES и других конструкций и последовательностей раскрыты в заявке PCT №. PCT/US1999/004332 и соответствующей заявке, серийный номер США 09/622452 ссылки на каждую из которых включены в настоящий документ. Другие примеры конструкций и последовательностей RANTES раскрыты в заявке PCT №. PCT/US11/024098, ссылки на которую включены в настоящий документ. Примеры хемокинов, конструкций и последовательностей CTACK, TECK и MEC раскрыты в заявке PCT №. PCT/US2005/042231 и соответствующей заявке, серийный номер США 11/719,646, ссылки на каждую из которых включены в настоящий документ. Примеры 0X40 и других иммуномодуляторов раскрыты в заявке США № 10/560653, ссылки на которую включены в настоящий документ. Примеры DR5 и других иммуномодуляторов раскрыты в заявке США № 09/622452 ссылки на которую включены в настоящий документ.

[154] Другие гены, которые могут быть использованы в качестве адъювантов, включают в себя те, которые кодируют: MCP-1, MIP-1a, MIP-lp, ИЛ-8, RANTES, L-селектин, P-селектин, E-селектин, CD34, GlyCAM-1. , MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, ИЛ-4, мутантные формы ИЛ-18, CD40, CD40L, фактор роста сосудов, фактор роста фибробластов, ИЛ-7, ИЛ-22, фактор роста нервов, фактор роста эндотелия сосудов, Fas, рецептор ФНО, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, каспазу ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1 , Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, неактивный NIK, SAP K, SAP-1, JNK, гены ответа на интерферон, NF-kβ, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, лиганд RANK, 0×40, 0×40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAPI, TAP2 и их функциональные фрагменты

[155] Вакцина может дополнительно включать способствующий генетической вакцине агент, описанный в заявке, серийный номер США 021 579, поданной 1 апреля 1994 г., ссылки на которую включены в настоящий документ.

[156] Вакцина может содержать антиген-кодирующий вектор в количестве от приблизительно 1 нанограмма до 100 миллиграммов; от приблизительно 1 микрограмма до приблизительно 10 миллиграммов; или предпочтительнее от приблизительно 0,1 микрограмма до приблизительно 10 миллиграммов; или более предпочтительнее от приблизительно 1 до приблизительно 2 мг. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения изобретения, вакцина, согласно настоящему изобретению, содержит от приблизительно 5 нанограмм до приблизительно 1000 микрограммов нуклеиновой кислоты. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения изобретения, вакцина может содержать от приблизительно 10 нанограмм до приблизительно 800 микрограммов нуклеиновой кислоты. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, вакцина может содержать от приблизительно 0,1 до приблизительно 500 мкг нуклеиновой кислоты. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения изобретения, вакцина может содержать от приблизительно 1 до приблизительно 350 мкг нуклеиновой кислоты. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения изобретения, вакцина может содержать от приблизительно 25 до приблизительно 250 микрограммов, от приблизительно 100 до приблизительно 200 микрограммов, от приблизительно 1 нанограмма до 100 миллиграммов; от приблизительно 1 микрограмма до приблизительно 10 миллиграммов; от приблизительно 0,1 микрограмма до приблизительно 10 миллиграммов; от приблизительно 1 до приблизительно 2 мг, от приблизительно 5 до приблизительно 1000 микрограмм, от приблизительно 10 до приблизительно 800 микрограмм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 500 микрограмм, от приблизительно 1 до приблизительно 350 микрограмм, от приблизительно 25 до приблизительно 250 микрограмм от приблизительно 100 до приблизительно 200 мкг антигена или его плазмиды.

[157] Вакцина может быть составлена в соответствии с применяемым способом введения. Фармацевтическая композиция для инъекционных вакцин может быть стерильной, апирогенной и не содержащей частиц. Можно использовать изотонический состав или раствор. Изотонические добавки могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Вакцина может содержать вазоконстриктор. Изотонические растворы могут включать забуференный фосфатом физиологический раствор. Вакцина может дополнительно содержать стабилизаторы, включая желатин и альбумин. Стабилизаторы могут обеспечивать стабильность состава при комнатной температуре или температуре окружающей среды в течение продолжительных периодов времени, включая LGS или поликатионы, или полианионы.

Фармацевтическая композиция вакцины

[158] Вакцина может быть в форме фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция может содержать вакцину. Фармацевтические композиции могут содержать от приблизительно 5 нанограмм (нг) до приблизительно 10 миллиграмм (мг) молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения изобретения, фармацевтические композиции, согласно настоящему изобретению, содержат от приблизительно 25 нг до приблизительно 5 мг молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения изобретения, фармацевтические композиции содержат от приблизительно 50 нг до приблизительно 1 мг молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения изобретения, фармацевтические композиции содержат от приблизительно 0,1 до приблизительно 500 микрограммов молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения изобретения, фармацевтические композиции содержат от приблизительно 1 до приблизительно 350 микрограммов молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения изобретения, фармацевтические композиции содержат от приблизительно 5 до приблизительно 250 микрограммов молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения изобретения, фармацевтические композиции содержат от приблизительно 10 до приблизительно 200 микрограммов молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения изобретения, фармацевтические композиции содержат от приблизительно 15 до приблизительно 150 микрограммов молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения изобретения, фармацевтические композиции содержат от приблизительно 20 до приблизительно 100 микрограммов молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения изобретения, фармацевтические композиции содержат от приблизительно 25 до приблизительно 75 микрограммов молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения изобретения, фармацевтические композиции содержат от приблизительно 30 до приблизительно 50 микрограммов молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения изобретения, фармацевтические композиции содержат от приблизительно 35 до приблизительно 40 микрограммов молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения изобретения, фармацевтические композиции содержат от приблизительно 100 до приблизительно 200 микрограммов молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения изобретения, фармацевтические композиции содержат от приблизительно 10 микрограммов до приблизительно 100 микрограммов молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 20 микрограммов до приблизительно 80 микрограммов молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения изобретения, фармацевтические композиции содержат от приблизительно 25 микрограммов до приблизительно 60 микрограммов молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения изобретения, фармацевтические композиции содержат от приблизительно 30 нг до приблизительно 50 микрограммов молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения изобретения, фармацевтические композиции содержат от приблизительно 35 нг до приблизительно 45 микрограммов молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения изобретения, фармацевтические композиции содержат от приблизительно 0,1 до приблизительно 500 микрограммов молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения изобретения, фармацевтические композиции содержат от приблизительно 1 до приблизительно 350 микрограммов молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения изобретения, фармацевтические композиции содержат от приблизительно 25 до приблизительно 250 микрограммов молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения изобретения, фармацевтические композиции содержат от приблизительно 100 до приблизительно 200 микрограммов молекулы нуклеиновой кислоты вакцины.

[159] В некоторых вариантах воплощения изобретения, фармацевтические композиции, согласно настоящему изобретению, содержат по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 нг молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения изобретения, фармацевтические композиции могут содержать по меньшей мере 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 или 1000 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения изобретения, фармацевтические композиции могут содержать по меньшей мере 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 или 10 мг или более молекулы нуклеиновой кислоты вакцины.

[160] В других вариантах воплощения изобретения, фармацевтическая композиция может включать до 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 нг молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения изобретения, фармацевтическая композиция может содержать до и включая 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75,80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195,200, 205, 210, 215,220, 225,230, 235, 240, 245,250, 255, 260,265, 270, 275, 280, 285,290, 295, 300,305,310, 315,320,325, 330, 335,340,345, 350,355, 360, 365, 370, 375,380, 385, 390,395,400, 405,410,415, 420, 425,430, 435, 440,445, 450, 455, 460, 465,470, 475, 480,485,490, 495,500,605, 610, 615,620, 625, 630,635, 640, 645, 650, 655,660, 665, 670, 675,680, 685,690,695, 700, 705,710, 715, 720,725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770,775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860,865,870,875,880,885,890,895.900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950,955, 960,965,970,975,980,985,990,995, или 1000 микрограмм молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения изобретения, фармацевтическая композиция может содержать до и включая 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 или 10 мг молекулы нуклеиновой кислоты вакцины.

[161] При составлении состава, фармацевтическая композиция может дополнительно содержать другие агенты в соответствии с используемым способом введения. В тех случаях, когда фармацевтические композиции представляют собой фармацевтические композиции для инъекций, они являются стерильными, апирогенными и не содержат твердых частиц. Предпочтительно использовать изотонический состав. Как правило, изотонические добавки могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. В некоторых случаях, предпочтительными являются изотонические растворы, такие как забуференный фосфатом физиологический раствор. Стабилизаторы включают желатин и альбумин. В некоторых вариантах воплощения изобретения, к препарату добавляют вазоконстрикторный агент.

[162] Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый наполнитель, как было указано выше. Например, фармацевтически приемлемый наполнитель может содержать функциональные молекулы, носители, адъюванты, транспортеры, разбавители или агенты, облегчающие трансфекцию, как было указано выше.

Способы вакцинации

[163] В настоящем документе предложены способы лечения и/или профилактики мезотелин-экспрессирующего рака, такого как рак яичника, но, не ограничиваясь им, с использованием фармацевтических составов, описанных выше. Здесь также описаны способы применения фармацевтических композиций, описанных выше, к субъекту для лечения и или профилактики мезотелин-экспрессирующего рака, такого как рак яичника, но, не ограничиваясь им. Здесь также описаны способы вакцинации субъекта. Также здесь описаны способы введения фармацевтических составов, описанных в изобретении, нуждающемуся в этом субъекту. Способы, описанные в изобретении, в совокупности называемые способами лечения с использованием фармацевтических составов, описанных в изобретении, могут включать введение одной или более вакцин, описанных в изобретении, нуждающемуся в этом субъекту, для индукции терапевтического и/или профилактического иммунного ответа. Вакцина может быть введена субъекту для модуляции активности иммунной системы субъекта и усиления иммунного ответа. Введение вакцины может происходить путем трансфекции раковых антигенов, как описано в изобретении, в виде молекулы нуклеиновой кислоты, экспрессируемой в клетке и доставляемой на поверхность клетки, после чего иммунная система распознает и индуцирует клеточный, гуморальный или клеточный и гуморальный ответ. Введение вакцины может быть использовано для индукции или активации иммунного ответа субъекта против мезотелина путем введения субъекту вакцины так, как это описано в настоящем документе.

[164] Вакцина может быть применена к субъекту для модулирования активности его иммунной системы, тем самым усиливая иммунный ответ. В некоторых вариантах изобретения, субъектом является млекопитающее. При введении вектора в клетки млекопитающего во время применения вакцины к млекопитающему, трансфицированные клетки будут экспрессировать и секретировать один или более раковых антигенов так, как описано в данном изобретении. Эти секретируемые белки или синтетические антигены будут распознаваться иммунной системой как чужеродные, что приведет к возникновению иммунного ответа, который может включать: антитела, полученные для одного или более раковых антигенов и Т-клеточный ответ, направленный конкретно против антигенов одного ракового заболевания или более. В некоторых примерах, у млекопитающего, вакцинированного вакцинами, обсуждаемыми в данном документе, будет развиваться примированная иммунная система, и при заражении одним или более антигенами рака, описанными в настоящем документе, примированная иммунная система позволит быстро избавиться от последующих раковых антигенов так, как описано в данном документе, одинаково, как через гуморальный, клеточный так и через клеточный и гуморальный иммунный ответ.

[165] Способы применения ДНК-вакцины, описанные в патентах США № 4945050 и 5036006, ссылки на оба патента включены в данный документ во всей своей полноте.

[166] Вакцина может быть введена млекопитающему для вызова у млекопитающего иммунного ответа. Млекопитающее может быть человеком, низшим приматом, коровой, свиньей, овцой, козой, антилопой, бизоном, водяным буйволом, быком, оленем, ежами, слонами, ламой, альпакой, мышами, крысами и, предпочтительно, человеком, коровой или свиньей, Для вызова иммунного ответа, вакцина также может быть введена субъекту, не являющемуся млекопитающим, например курице.

[167] Доза вакцины может составлять от 1 микрограмма до 10 мг активного компонента на килограмм (кг) массы тела во времени (компонент/кг массы тела/время) и может составлять от 20 микрограмм до 10 мг компонента/кг массы тела/времени. Вакцину можно применять каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31 день. Количество доз вакцины для эффективного лечения может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более доз.

Способ генерации иммунного ответа с помощью вакцины

[168] Вакцина может быть использована для генерирования иммунного ответа у субъекта, такого как млекопитающее или не-млекопитающее, включая терапевтический или профилактический иммунный ответ. Иммунный ответ может генерировать антитела и/или Т-клетки-киллеры, нацеленные на один или более раковых антигенов так, как описано в данном документе. Такие антитела и Т-клетки могут быть выделены.

[169] Некоторые варианты воплощения изобретения являются способами генерирования иммунных ответов против одного или более раковых антигенов так, как описано в данном документе, причем эти варианты воплощения включают применение вакцины к субъекту. Некоторые варианты воплощения изобретения представляют способы профилактической вакцинации субъекта против рака или опухоли, экспрессирующей один или более мезотелиновых антигенов, как описано выше, причем эти варианты воплощения включают применение вакцины. Некоторые варианты воплощения изобретения представляют способы терапевтической вакцинации субъекта, страдающего от мезотелин-экспрессирующего рака яичника или опухоли, причем эти варианты воплощения включают применение вакцины. До введения вакцины, диагностика рака яичника или опухоли, экспрессирующей один или более мезотелиновых антигенов, как описано в данном документе, может проводиться в обычном режиме.

Способ лечения рака с помощью вакцины

[170] Вакцина может быть использована для генерирования или индукции иммунного ответа у млекопитающего, реагирующего или направленного на мезотелин-экспрессирующий рак, такой как рак яичника, конкретнее, эпителиальный рак яичника, а именно, серозный рак яичника, но, не ограничиваясь ими. Вызванный иммунный ответ может предотвратить образование рака яичника или рост опухоли.

[171] Вызванный иммунный ответ может предотвращать и/или уменьшать метастазирование раковых или опухолевых клеток у субъекта с раком яичника. Соответственно, вакцина может быть использована как способ, лечащий и/или предотвращающий рак или опухоль у млекопитающего или субъекта с раковой болезнью, к которому применяют вакцину.

[172] В некоторых вариантах воплощения изобретения, применяемая вакцина может опосредовать выведение или предотвращать рост опухолевых клеток путем индуцирования (1) гуморального иммунитета посредством В-клеточных ответов для генерирования антител, блокирующих выработку моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 (МСР-1), тем самым замедляя миелоидные супрессорные клетки (МЛСК) и подавляя роста опухоли; (2) увеличения цитотоксических Т-лимфоцитов, таких как CD8 + (CTL), для атаки и уничтожения опухолевых клеток; (3) увеличения Т-хелперных ответов; (4) и усиления воспалительных реакций через ИФНγ и ФНО-a, или, предпочтительнее, индуцируя все из вышеперечисленного. Вакцина может увеличить безопухолевую выживаемость на 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44% и 45%. Вакцина может уменьшить опухолевую массу на 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 , 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59% и 60% после иммунизации. Вакцина может предотвращать и блокировать увеличение моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 (МСР-1), цитокина, секретируемого миелоидными клетками-супрессорами. Вакцина может увеличить опухолеспецифическую выживаемость на 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 , 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59% и 60% ,

[173] В некоторых вариантах воплощения изобретения, иммунный ответ может генерировать гуморальный и/или антигенспецифический цитотоксический Т-лимфоцитарный (ЦТЛ) иммунный ответ, не вызывающий повреждения или воспаления различных тканей или систем (например, головного мозга или неврологической системы и др.) у субъекта, к которому применяется вакцина.

[174] В некоторых вариантах воплощения изобретения, вакцина может быть применена периферически (более подробно описано ниже) для установления антиген-специфического иммунного ответа, нацеленного на раковые или опухолевые клетки или ткани, для выведения или устранения рака или опухоли, экспрессирующей один или более раковых антигенов, не повреждая и не вызывая заболевание или смерть субъекта, к которому применяют вакцину.

[175] Применяемая вакцина может усиливать клеточный иммунный ответ субъекта приблизительно 50-6000-кратно, приблизительно 50-500-кратно, приблизительно 50-5000-кратно, приблизительно 50-кратно, приблизительно 4500-кратно, приблизительно 100-1000-кратно, приблизительно 150-6000-кратно, приблизительно 200-6000-кратно, приблизительно 250-6000-кратно или приблизительно 300-кратно до 6000-кратно. В некоторых вариантах воплощения изобретения, вводимая вакцина может усиливать клеточный иммунный ответ у субъекта приблизительно 50- кратно, 100-кратно, 150-кратно, 200-кратно, 250-кратно, 300-кратно, 350-кратно, 400-кратно, 450-кратно, 500-кратно, 550-кратно, 600-кратно, 650-кратно, 700-кратно, 750-кратно, 800-кратно, 850-кратно, 900-кратно, 950-кратно, 1000-кратно, 1100-кратно, 1200-кратно, 1300-кратно, 1400-кратно, 1500-кратно, 1600-кратно, 1700-кратно, 1800-кратно, 1900-кратно, 2000-кратно, 2100-кратно, 2200-кратно, 2300-кратно, 2400-кратно, 2500-кратно, 2600-кратно, 2700-кратно, 2800-кратно, 2900-кратно, 3000-кратно, 3100-кратно, 3200-кратно, 3300-кратно, 3400-кратно, 3500-кратно, 3600-кратно, 3700-кратно, 3800-кратно, 3900-кратно, 4000-кратно, 4100-кратно, 4200-кратно, 4300-кратно, 4400-кратно, 4500-кратно, 4600-кратно, 4700-кратно, 4800-кратно, 4900-кратно, 5000-кратно, 5100-кратно, 5200-кратно, 5300-кратно, 5400-кратно, 5500-кратно, 5600-кратно, 5700-кратно, 5800-кратно, 5900-кратно, или 6000-кратно, по сравнению с клеточным иммунным ответом субъекта, к которому не применяли вакцину.

[176] Вводимая вакцина может увеличить уровни гамма-интерферона (IFN-γ) у субъекта приблизительно 50-6000-кратно, приблизительно 50-5500-кратно, приблизительно 50- 5000-кратно, приблизительно 50-4500-кратно, приблизительно 100-6000-кратно, приблизительно 150- 6000-кратно, приблизительно 200- 6000-кратно, приблизительно 250- 6000-кратно, или приблизительно 300- 6000-кратно. В некоторых вариантах воплощения изобретения, применяемая вакцина может повышать уровни IFN-γ у субъекта приблизительно 50-кратно, 100-кратно, 150-кратно, 200-кратно, 250-кратно, 300-кратно, 350-кратно, 400-кратно, 450-кратно, 500-кратно, 550-кратно, 600- кратно, 650-кратно, 700-кратно, 750-кратно, 800-кратно, 850-кратно, 900-кратно, 950-кратно, 1000-кратно, 1100- кратно, 1200-кратно, 1300-кратно, 1400-кратно, 1500-кратно, 1600-кратно, 1700-кратно, 1800-кратно, 1900-кратно, 2000-кратно, 2100-кратно, 2200-кратно, 2300-кратно, 2400-кратно, 2500-кратно, 2600-кратно, 2700-кратно, 2800-кратно, 2900-кратно, 3000-кратно, 3100-кратно, 3200-кратно, 3300-кратно, 3400-кратно, 3500-кратно, 3600-кратно, 3700-кратно, 3800-кратно, 3900-кратно, 4000-кратно, 4100-кратно, 4200-кратно, 4300-кратно, 4400-кратно, 4500-кратно, 4600-кратно, 4700-кратно, 4800-кратно, 4900-кратно, 5000-кратно, 5100-кратно, 5200-кратно, 5300-кратно, 5400-кратно, 5500-кратно, 5600-кратно, 5700-кратно, 5800-кратно, 5900-кратно, или 6000-кратно, по сравнению с уровнями IFN-γ у субъекта, к которому не применяли вакцину.

[177] Доза вакцины может составлять от 1 мкг до 10 мг активного компонента на килограмм (кг) массы тела во времени (компонент/кг массы тела/время) и может составлять от 20 микрограммов до 10 мг компонента/кг массы тела/время. Вакцину можно вводить каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31 день. Эффективное для лечения количество доз вакцины может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более доз.

[178] Вакцину или фармацевтическую композицию можно применять различными путями, включая пероральный, парентеральный, сублингвальный, трансдермальный, ректальный, трансмукозальный, местный, ингаляционный, через щеку, внутриплевральный, внутривенный, внутриартериальный, внутрибрюшинный, подкожный, внутримышечный, интраназальный, интратекальный и/или внутрисуставный, или их комбинации. Для ветеринарного использования, композицию можно применять в виде подходящей приемлемой композиции в соответствии с обычной ветеринарной практикой. Ветеринар может легко определить режим дозирования и путь применения, который наиболее подходит для конкретного животного. Вакцину можно применять с помощью традиционных шприцев, безигольных инъекционных устройств, «генных пушек с бомбардировкой микрочастицами» или других физических методов, таких как электропорация («ЭП»), «гидродинамический метод» или ультразвук.

[179] Вектор вакцины может быть введен млекопитающему с помощью нескольких хорошо известных технологий, включая инъекцию ДНК (также называемую ДНК-вакцинацией) с электропорацией и без нее in vivo, липосомную трансфекцию, трансфекцию с участием наночастиц и использование рекомбинантных векторов, таких как рекомбинантный аденовирус, рекомбинантный вирус, ассоциированный с аденовирусом, и рекомбинантная коровья оспа. Один или более раковых антигенов вакцины можно вводить путем инъекции ДНК вместе с электропорацией in vivo.

Электропорация

[180] Вакцину или фармацевтическую композицию можно вводить посредством процесса электропорации. Введение вакцины посредством электропорации может быть выполнено с использованием устройств электропорации, сконфигурированных для доставки импульса энергии в желаемую ткань млекопитающего, эффективного для образования обратимых пор в клеточных мембранах, где, предпочтительно, импульс энергии является постоянным током, отвечающим текущим вводным параметрам, заданным пользователем. Устройство электропорации может содержать компонент электропорации и набор электродов или рукоятку в сборе. Компонент электропорации может включать в себя или состоять из одного или более различных элементов устройств электропорации, в том числе: контроллера, генератора сигналов тока, тестера импеданса, регистратора сигналов, элемента ввода, элемента сообщения о состоянии, порта связи, компонента памяти, источника питания и выключателя. Электропорацию можно проводить с использованием устройства электропорации in vivo, например, системы CELLECTRA® EP (Inovio Pharmaceuticals, Inc., Блу-Белл, Пенсильвания) или электропоратора Eigen (Inovio Pharmaceuticals, Inc.) для облегчения трансфекции клеток плазмидой.

[181] Примеры устройств электропорации и способов электропорации, которые могут облегчать введение ДНК-вакцин, согласно настоящему изобретению, включают описанные в патенте США № 7245963, Draghia-Akli и др., патентной публикации США 2005/0052630, поданной Smith и др., ссылки на содержание которых в полном объеме включены в настоящее описание. Другие устройства электропорации и способы электропорации, которые можно использовать для облегчения введения ДНК-вакцин, включают в себя устройства, представленные в одновременно находящейся на рассмотрении и заявке того же заявителя на патент США, серийный № 11/874072, поданной 17 октября 2007 г., которая заявляет о преимуществе в соответствии с 35 USC 119 (e) для предварительных заявок США Сер. 60/852,149, поданной 17 октября 2006 года, и 60/978,982, поданной 10 октября 2007 года, включенных в настоящий документ в полном объеме.

[182] Патент США № 7245963, авторства Draghia-Akli и соавт. описывает модульные электродные системы и их использование для облегчения введения биомолекулы в клетки выбранной ткани организма или растения. Модульные электродные системы могут содержать множество игольчатых электродов; игл для подкожных инъекций; электрических разъемов, которые обеспечивают проводящую связь от программируемого импульсного контроллера постоянного тока к множеству игольчатых электродов; и источник питания. Оператор может обхватить множество игольчатых электродов, установленных на опорной конструкции, и плотно вставить их в выбранную ткань тела или растения. Затем биомолекулы вводят через подкожную иглу в выбранную ткань. Активируется программируемый контроллер импульсов постоянного тока, и электрический импульс постоянного тока подается на множество игольчатых электродов. Применяемый электрический импульс постоянного тока облегчает введение биомолекулы в ячейку между множества электродов. Ссылки на все содержание патента США № 7245963 полностью включены в настоящее описание изобретения.

[183] Патентная публикация США 2005/0052630, представленная Smith и соавт. описывает устройство электропорации, которое можно использовать для эффективного облегчения введения биомолекулы в клетки выбранной ткани организма или растения. Устройство электропорации содержит электрокинетическое устройство («устройство EKD»), работа которого задается внешним программным обеспечением или встроенным программным обеспечением. Устройство EKD генерирует серию программируемых шаблонных импульсов постоянного тока между массива электродов на основании пользовательского управления и введенных параметров импульсов, и позволяет хранить и получать данные о форме колебаний сигнала тока. Устройство электропорации также содержит сменный электродный диск, имеющий ряд игольчатых электродов, центральный канал для инъекционной иглы и съемный направляющий диск. Ссылки на все содержание патента США. 2005/0052630 полностью включены в настоящее описание изобретения.

[184] Электродный массив и способы, описанные в патентах США №7,245,963 и 2005/0052630 можно адаптировать для глубокого проникновения не только в такие ткани, как мышцы, но и в другие ткани или органы. Из-за конфигурации электродного массива, инъекционная игла также полностью вставляется в целевой орган, и инъекция вводится перпендикулярно целевой ткани в места, которые предварительно заданы электродами. Электроды описаны в патенте США № 7244563 и в патенте США 2005/005263, предпочтительно, являются длиной 20 мм и шириной 21 мм.

[185] Кроме того, в некоторых вариантах воплощения изобретения, которые включают устройства электропорации и их использование, присутствуют устройства электропорации, которые описаны в следующих патентах: патент США 5 273 525, выданный 28 декабря 1993 г., патенты США 6 110 161, выданный 29 августа 2000 г., 6 261 281 выданный 17 июля 2001 г. и 6 958 060, выданный 25 октября 2005 г., и патент США 6 939 862, выданный 6 сентября 2005 г. Кроме того, в настоящем документе рассматриваются патенты, охватывающие предмет, предоставленный в патенте США 6 697 669, выданном 24 февраля 2004 г., который касается введения ДНК с использованием любого из множества устройств и патент США 7,328,064, выданный 5 февраля 2008 г., на способ инъекции ДНК. Ссылки на вышеуказанные патенты включены в данное описание во всей их полноте.

Способы приготовления вакцины

[186] В настоящем документе предложены способы получения плазмидных ДНК, обсуждаемых в данном документе. После заключительной стадии субклонирования в экспрессирующую плазмиду млекопитающего, плазмидные ДНК могут быть использованы для инокуляции культуры клеток в крупномасштабном ферментере с использованием известных в данной области способов.

[187] ДНК-плазмиды, предназначенные для использования с устройствами электропорации, согласно настоящему изобретению, могут быть составлены или изготовлены с использованием комбинации известных устройств и методик, но, предпочтительно, они изготавливаются с использованием оптимизированной технологии изготовления плазмиды, которая описана в опубликованной заявке США №. 20090004716, которая была подана 23 мая 2007 года. В некоторых примерах, ДНК-плазмиды, использованные в этих исследованиях, могут быть составлены в концентрациях, превышающих или равных 10 мг/мл. Технологии производства также включают или охватывают различные устройства и протоколы, хорошо известные специалистам в данной области техники, в дополнение к тем, которые описаны в заявке США под серийным номером 60/939792, включая те, которые описаны в лицензированном патенте США №. 7,238,522, выданном 3 июля 2007 г. Вышеупомянутая заявка и патент, серийный номер США 60/939,792 и патент США № 7,238,522, соответственно, полностью включены в настоящий документ.

[188] Настоящее изобретение имеет множество аспектов, иллюстрируемых следующими примерами, но, не ограничиваясь ими.

ПРИМЕРЫ

[189] Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано в следующих примерах. Следует понимать, что, хотя эти примеры и указывают предпочтительные варианты воплощения изобретения, они приведены только в качестве иллюстрации. Специалист в данной области техники может определить основные характеристики этого изобретения используя приведенные выше обсуждения и данные примеры и, не отступая от сущности изобретения и объема, она может вносить различные изменения и модификации изобретения для его адаптации к различным применениям и условиям. Таким образом, различные модификации изобретения в дополнение показанным и описанным здесь, будут очевидны для специалистов в данной области техники из предшествующего описания. Такие модификации также попадают в объем прилагаемой формулы изобретения.

Пример 1: Генерация консенсусной последовательности мезотелина

[190] В GenBank были опубликованы три варианта мезотелина. Варианты 1 и 2 на 98% идентичны на нуклеотидном уровне, а вариант 3 представляет собой частичную последовательность с альтернативно-сплайсированным С-концом, нарушающим область заякоривания ГФИ. Указано, что все три варианта транскрипта экспрессируются раковыми клетками человека. На основании анализа последовательности, вакцина, нацеленная на вариант 1, также будет нацеливаться на большую часть последовательностей вариантов 2 и 3. Кроме того, вариант 1 является основным транскриптом, экспрессируемым в опухолях яичников. Поэтому вариант 1 был выбран в качестве мишени для вакцины.

[191] Для создания человеческого консенсусного мезотелина, из GenBank было скачано 14 последовательностей мезотелина (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Коды доступа GenBank для выбранных последовательностей мезотелина: NP_005814.2, BAA08419.1, AAH09272.1, AAV87530.1, AAH03512.1, XP_008959182.1, AAC50348.1, XP_009428309.1, XP_007978969.1, XP_011822299.1, XP_011817841.1, XP_011822298.1, XP_009193880.1 и XP_011817843.1.

[192] Консенсусная последовательность была создана с использованием программного пакета DNASTAR® Lasergene (версия 13.0.0.357). Последовательности мезотелина из GenBank были импортированы в MegAlign и выровнены с использованием программы выравнивания множественных последовательностей ClustalW. Полученная консенсусная последовательность мезотелина (SEQ ID NO: 1) имеет 95,8% гомологию с нативным мезотелином человека.

Пример 2: Введение мутаций для упразднения функции мезотелина

[193] Для упразднения потенциальной биологической функции вырабатываемого консенсусного белка мезотелина, была введена одна мутация, приводящая к устранению связывания MUC16/CA125. Кроме того, были введены две мутации, нарушающие привязку ГФИ. Обоснование введения этих мутаций описано ниже.

MUC16/CA125-связанная мутация

[194] Усеченный мутагенез использовали для идентификации сайта связывания мезотелина для MUC16/CA125 (ФИГ. 1). Как показано на ФИГ. 1, предшественник мезотелина (71 кДа) расщепляется на два продукта: потенцирующий фактор мегакариоцитов 30 кДа (MPF; остатки Ser34-Arg286) и, ГФИ-заякоренный, связанный с мембраной протеин зрелого мезотелина 41 кДа (светло-серый), начиная с Glu296. Область протеолитического расщепления (заштрихованная серым) содержит сайт расщепления фурином в Arg295 и другие сайты расщепления протеазой, включая сайт расщепления трипсином в Arg286. Указаны четыре предсказанных N-связанных гликана (черные «леденцы на палочке»; Asn57, Asn388, Asn488 и Asn515) на мезотелине. Усеченные мутанты (районы I, II, III, IAB, IBC, IA, IB и IC) генерировались в виде слитых белков Fc кролика для последовательного сужения CA125-связывающего домена мезотелина.

[195] Как показано на ФИГ. 5 (Kaneko et al., JBiol Chem, 2009 Feb 6; 284 (6): 3739-49), замена тирозина в положении 318 аланином (Y318A) полностью нарушает взаимодействие с CA125. Мутация аланина в Glu324 (E324A; KD 42,4 нМ) и Trp321 (W321A; KD 19,5 нМ) снижает связывание мезотелина с CA125. Мутация аланина в His354 (H354A) не изменяет мезотелин-CA125 взаимодействия (KD 2,71 нМ).

[196] И, как показано на ФИГ. 4 (Kaneko et al., J Biol Chem, 2009 Feb 6; 284 (6): 3739-49), вестерн-блот-анализ аланиновых мутантов в области IAB (296-359) демонстрирует дифференциальное связывание. Мутации аланина в Tyr318 (Y318A) и Glu324 (E324A) устраняют связывание мезотелина с CA125. Мутация аланина в Trp321 (W321A) частично снижает связывание мезотелина с CA125. Мутация аланина в His354 не изменяет мезотелин-CA125 взаимодействие.

[197] Наконец, как показано на ФИГ. 6 (Kaneko et al., J Biol Chem, 2009 Feb 6; 284 (6): 3739-49), для количественного измерения связывания CA125 использовали интенсивность флуоресценции (среднее геометрическое). Связывание полноразмерной зрелой формы мезотелина (FULL) с CA125 определяли, как 100%. Область I (296-390), область IAB (296-359) и мутант HAB4A IAB связывались с CA125 значительно сильнее, чем любые другие перечисленные фрагменты или мутанты (*, p <0,05). Мутация Y318A значительно снижает связывание по всей длине, по сравнению со зрелой формой мезотелина. Основываясь на этих результатах, мутация Y318A была введена в конечную синтетическую консенсусную последовательность мезотелина.

ГФИ-заякоренный сайт

[198] ГФИ-заякоренная сигнальная последовательность состоит из гидрофобной области, отделенной от сайта присоединения ГФИ (ко-сайта) гидрофильным регионом спейсера (ФИГ. 2). Сайт прикрепления является первым из трех смежных аминокислот, имеющих короткие боковые цепи. За ним должна следовать короткая спейсерная последовательность, которая обычно неструктурирована, а затем карбоксиконцевая гидрофобная сигнальная последовательность. (Mayor, S. & Riezman, H. Nature reviews. Molecular cell biology 5 (2004)). Ко-сайт мезотелина был мутирован с серина на треонина. Ко+2 мезотелина был мутирован с треонина на валин.

Как показано в таблице 1, синтетическая консенсусная белковая последовательность мезотелина имеет 95,2% идентичность с нативным мезотелином человека.

Таблица 1

Пример 3: Характеристика синтетического консенсуса мезотелинового конструкта

[199] Как только была получена синтетическая консенсусная последовательность мезотелиновой ДНК, для получения более высокого уровня экспрессии к N-концу были добавлены вышестоящая последовательность Козак и лидерная последовательность IgE. (Yang, J. S. et al. The Journal of infectious diseases 184, 809-816 (2001).). Кроме того, использование кодона гена было адаптировано к смещению кодонов генов Homo sapiens (Andre, S. et al. Journal of virology 72, 1497-1503 (1998); Demi, L. et al. Journal of virology 75, 10991-11001 (2001)). Также, оптимизацию РНК проводили таким образом, чтобы избегать областей с очень высоким (> 80%) или очень низким (<30%) содержанием GC-пар и мотивов цис-последовательностей, таких как внутренние боксы TATA, chi -сайты и сайты связывания рибосом (Muthumani, K. et al. Virology 314, 134-146 (2003); Muthumani, K. et al. Virology 314, 134-146 (2003)).

[200] Схематическое представление синтетической консенсусной конструкции мезотелина показано на ФИГ. 3. Звездочка (*) обозначает мутации отмены связывания MUC16 и прикрепления ГФИ. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 1) и аминокислота (SEQ ID NO: 2) синтетического консенсусного мезотелина представлены в таблице 16 и таблице 17 соответственно. Аннотация элементов SEQ ID NO: 2 и соответствующих аминокислотных положений представлена в Таблице 2.

Таблица 2

Описание	Аминокислотная позиция
Лидерная последовательность IgE	1-18
Мезотелин-кодирующий сайт	19-607
Мутация устранения связывания MUC16/CA125	Y303A
Мутация разрыва ГФИ-связывания	S583T
	T585V

[201] Для лучшего понимания возможных структурных эффектов белка в процессе синтеза синтетического консенсуса, была создана сравнительная модель молекулярного предшественника MPF и мезотелина. Несколько элементов вторичной структуры были использованы для выравнивания и генерации модели. Предсказанный сайт гликозилирования имеет правильную ориентацию на поверхности модели. Часть мезотелина в данной модели была экстраполирована из работы, проделанной Sathyanarayana и соавт. и была смоделирована, как серия повторений ARM. (Sathyanarayana, B. K., Hahn, Y. et al. BMC structural biology 9, 1 (2009)). Ссылка на Sathyanarayana не описывает места дисульфидной связи. Эта функция рассматривается в улучшенной модели и правильно ориентирована локально. Кроме того, на поверхности модели доступны потенциальные N-связанные гликозиды.

[202] Характеристики синтетического консенсусного мезотелина приведены в таблице 3.

Таблица 3

Характеристики	Синтетический консенсусный мезотелин
Идентичность с нативным мезотелином человека	95.2%
Идентичность с нативным мезотелином макаки-резус	90.3%
Идентичность с нативным мезотелином мыши	58.1%
Количество аимнокислотных мутаций (в соотношении с нативным человеческим)	28
Количество вставок мутаций (не-консенсусного происхождения)	3
Молекулярный вес	609 ак (67 KDa)
Длина кодирующей последовательности (п.н.)	1827

Пример 4: Конструкция и структура плазмиды

[203] Основой вектора является pGX0001, модифицированный экспрессирующий вектор pVAX1 размером 2998 п.н. под контролем промотора цитомегаловируса человека немедленно-раннего ответа (промотор hCMV). Исходный pVAXl был получен в компании Thermo Fisher Scientific. Основа вектора pGX0001 включает ген устойчивости к канамицину (KanR) и плазмидный источник репликации (pUC ori) для наработки. Эти элементы не функционируют в эукариотических клетках. Карта и описание модифицированного вектора экспрессии pVAXl (pGX0001) показана на ФИГ. 4.

[204] Для создания pGX0001 были внесены изменения в pVAXl. Эти модификации перечислены в Таблице 4, в связи с которыми не было обнаружено никаких проблем, касающихся амплификации плазмиды, транскрипции и трансляции антигена. При использовании pGX0001 в качестве основы, до настоящего времени не наблюдалось никаких дальнейших изменений в последовательности pGX0001. Пары оснований 2, 3 и 4 заменены с ACT на CTG в основе, предшествующей промотору ЦМВ.

Таблица 4

Модификация	Пары оснований	Описание
OG	241	В промоторе ЦМВ
OT	1158	Основа, ниже сигнальной последовательности полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота (bGH поли-A)
A> -	2092	Основа, ниже гена устойчивости к канамицину
C>T	2493	в плазмидном источнике репликации pUC (pUC ori)
G>C	2969	В самом конце pUC Ori выше сайта RNASeH

[205] Синтезированный синтетический консенсусный мезотелин разрезали рестриктазами BamHI и Xhol и клонировали в pGX0001 с экспрессионной кассетой, контролируемой промотором транскрипции цитомегаловируса немедленного-раннего ответа. Полученная плазмида была названа pGX1430. Для подтверждения правильности сборки плазмиды было выполнено ее секвенирование по всей длине, результат проанализирован и подтвержден двумя аналитиками. Принципиальная схема pGX1430 представлена на ФИГ. 5.

Пример 5: In Vitro экспрессия антигена

[206] Подтверждение экспрессии белка антигена вектором pGX1430 проводили вестерн-блоттингом. Клетки человеческой рабдомиосаркомы (RD) (ATCC, CCL-136), культивируемые в среде DMEM с 10% ФБС (ThermoFisher), трансфицировали векторами pGX1430 или pGX0001 (6 мкг/10 см²) с использованием турбофектина 8 (Origene). Через сорок восемь часов после трансфекции, клетки лизировали с использованием лизирующего буфера для клеток RIPA (ThermoFisher), лизат клеток собирали. После определения концентрации общего белка методом BCA (ThermoFisher), 15 пг клеточного лизата подвергали электрофорезу в 4-12% геле СДС-PAGE (ThermoFisher), определение проводили с использованием коммерческих анти-мезотелиновых антител (клон Cell Signaling Technology D4X7M) и визуализировали с помощью анти-кролиных антител IgG (Santa Cruz Biotech # sc-2004), конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP), с использованием системы для анализа вестерн-блота ECL (GE Healthcare). В качестве контроля загрузки, блоты повторно исследовали относительно экспрессии актина с использованием анти-3-актин моноклональных антител (Santa Cruz Biotech, клон C4).

[207] Размер предшественника мезотелина человека составляет 70 кДа с расщепленными гликозилированными формами 46-48 кДа, тогда как синтетический консенсусный предшественник мезотелина составляет 64,28 кДа с расщепленными гликозилированными формами 35-37 кДа. Как показано на ФИГ. 6, белковая полоса ожидаемой молекулярной массы была обнаружена для pGX1430 (64,28 кДа). Белковых полос в лунке с pGX0001 не было обнаружено. Были обнаружены анти-β-актиновые полосы одинаковой интенсивности, что указывало на загрузку одинакового количества белка в каждую лунку.

Пример 6: Иммуногенность синтетических консенсусных вакцинных конструкций мезотелина

Животные и иммунизации

[208] Самок мышей CB6F1 в возрасте 8 недель закупали в Jackson Laboratories. Все животные содержались в помещении с регулируемой температурой и сменой режима освещенности в BTS Research (Сан-Диего, Калифорния). Уход за животными осуществлялся в соответствии с руководящими принципами Национального института здравоохранения и Предложениями по уходу и использованию животных (ACUP) (BTS ACUP # 15-091). Мыши были разделены на пять групп, как показано в Таблице 5.

Таблица 5

Группа	n	Конструкт	Дозировка конструкта (мкг)	Объем введения (мкл)
1	4	pGX0001	30	30
2	8	pGX1430	10	30
3	8	pGX1430	20	30
4	8	pGX1430	30	30
5	8	pGX1430	50	30

[209] Мышей в иммунизированных группах вакцинировали указанными дозами pGX0001 или pGX1430 в соответствии с СОП R20-003147 CELLECTRA® 3P Mouse Treatment. Вкратце, плазмиды разводили в стерильной воде для инъекций (VetOne) так, чтобы указанная доза могла быть доставлена путем внутримышечной инъекции в переднюю мышцу большеберцовой кости при объеме инъекции 30 мкл. За каждой внутримышечной инъекцией немедленно следовала электропорация (ЕР) с использованием адаптивного устройства постоянного тока для электропорации CELLECTRA® 2000 с решеткой 3P (Inovio Pharmaceuticals). Устройство было настроено на подачу двух импульсов 0,1 А с шириной импульса 52 мс, с интервалом 1 секунда. Мыши получали 3 иммунизации в интервале 3 недель. Мышей умерщвляли через три недели после последней иммунизации, селезенки изымали для проведения исследования клеточного иммунного ответа. Никакую другую ткань не изымали.

Выделение лимфоцитов селезенки

[210] Спленоциты выделяли асептически и помещали в 5 мл среды R10 (среда 1640 Института памяти Роузвелла Парка, дополненная 10% эмбриональной бычьей сывороткой и 1% антибиотиком-антимикотиком). Спленоциты выделяли путем механического разрушения селезенки с использованием аппарата Stomacher (Seward Laboratory Systems Inc.), полученный продукт фильтровали с использованием сита для клеток диаметром 40 мкм (BD Falcon). Полученный продукт центрифугировали, осадок обрабатывали в течение 5 минут лизирующим буфером ACK (Lonza) для лизиса эритроцитов. Затем, спленоциты центрифугировали, промывали в ФСБ и ресуспендировали в среде R10, после чего их немедленно использовали для дальнейшего анализа.

Метод иммуноферментных пятен (ELISpot) ИФНy

[211] Для оценки антигенспецифических клеточных ответов мышей проводили анализ ELISpot (MabTech) ИФНy. Девяносто шесть луночных планшетов, предварительно покрытых антителами против мышиного ИФНy, промывали в ФСБ и блокировали в течение 2 часов при комнатной температуре с помощью полной культуральной среды (RPMI 1640 с добавлением 10% ФБС и антибиотиков). Лимфоциты селезенки ресуспендировали в среде R10 (а затем добавляли в трех повторах при исходном количестве 2×10⁵ клеток на лунку). Синтезировали набор пептидов (GenScript), каждый из которых содержал 15 аминокислотных остатков, перекрывающих 11 аминокислот, представляющих полную последовательность синтетического консенсусного белка мезотелина. Указанные наборы пептидов ресуспендировали в ДМСО (Sigma) и объединяли в два пептидных пула с пептидной концентрацией ~ 2 пг/мл. Пептидный пул содержал пептиды, соответствующие синтетическому консенсусному белку антигена мезотелина. Конкавалин А (Sigma) в концентрации 5 пг/мл использовали в качестве положительного контроля, а полную культуральную среду использовали в качестве отрицательного контроля. Планшеты инкубировали в течение 18 часов при 37°С в инкубаторе с 5% содержанием атмосферного СО₂. Затем добавляли биотинилированные анти-мышиные антитела к ИФНy (MabTech), планшеты инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Планшеты промывали и добавляли стрептавидин-ALP антитела (MabTech), после чего планшеты инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.

[212] Детекцию пятна выполняли в соответствии с инструкциями к набору от производителя (MabTech). Пятна на планшетах подсчитывали с использованием автоматического считывателя ELISPOT (Cellular Technology). Для отображения данных, среднее количество пятнообразующих единиц (СОЕ) было установлено как 1×10⁶ спленоцитов. Антигенспецифические ответы ИФНy ELISpot представлены числом пятнообразующих единиц ИФНy (СОЕ), которое на 1×10⁶ спленоцитов, больше, чем СОЕ в отрицательном контроле (только в среде).

[213] Иммуногенность синтетического консенсусного конструкта мезотелина оценивали для четырех дозировок (10 мкг, 20 мкг, 30 мкг и 50 мкг) с помощью ИФНy ELISpot и проточной цитометрии (n=8/группа). В качестве отрицательного контроля, мышей (n=4/группа) иммунизировали пустой плазмидной основой (pGX0001). По сравнению с мышами, вакцинированными отрицательным контролем, вакцинация синтетическим консенсусным мезотелином (pGX1430) вызывала клеточные иммунные ответы. Величина синтетической консенсусной специфической продукции мезотелина ИФНy, определенная ELISpot, была дозозависимой при дозах 10 и 20 пг (ФИГ.7A и ФИГ.7B) с аналогичным максимальным иммунным ответом, достигаемым при дозах 30 и 50 пг. В частности, синтетический консенсусный мезотелиновый ИФНy СОЕ составил 1345 ± 1290, 2241 ± 1721, 2242 ± 1932 и 2004 ± 674 при 10, 20, 30 и 50 пг соответственно. Ответ на консенсусный синтетический мезотелиновый ИФНy были значительно выше, чем ответ на наивный, при дозах 10 мкг (р=0,004), 20 мкг (р=0,004), 30 мкг (р=0,004) и 50 мкг (р=0,004) pGX1430. Ответы ИФНy суммированы в Таблице 6.

Таблица 6

Конструкт	Доза	Среднее СОЕ ± Станд. откл.	p-значение
pGX0001	30 пг	6 ± 7	n/a
pGX1430	10 пг	1345 ± 1290	0.004
	20 пг	2241± 1721	0.004
	30 пг	2242 ± 1932	0.004
50 пг	2004 ± 674	0.004
Статистическая значимость, принятая на уровне p <0,013. Указанные значения p относятся к наивным (иммунизированным pGX0001 мышам).

Проточная цитометрия

[214] Клеточные иммунные ответы, индуцированные синтетическим консенсусным мезотелином, были дополнительно охарактеризованы с использованием метода проточной цитометрии. 2×10⁶ спленоцитов, полученных от вакцинированных и наивных мышей, стимулировали сразу же после выделения синтетическими консенсусными пептидами мезотелина в течение 6 часов в присутствии анти-мышиных антител CD107a (BD Biosciences) к брефельдину A (BD Biosciences), монензину (BD Biosciences) и флуоресцин изотиоцианату (FITC). После стимуляции пептидами, спленоциты центрифугировали и ресуспендировали в растворе мышиных Fc-блокаторов BD (BD Biosciences) в количестве 20 мкл на лунку. Раствор Fc-блокатора используют при начальном разведении 1:40 в ФСБ и инкубируют при 4°С в течение 5 минут.

[215] После инкубации, оставшиеся внеклеточные антитела (в ФСБ) добавляют по 30 мкл на лунку и инкубируют при 4°С в течение 30 минут. После добавления внеклеточного красителя, конечный объем раствора в каждой лунке составляет 50 мкл, состоящий из Fc-блокатора в конечном разведении 1: 100 и внеклеточных антител в их соответствующих рабочих разведениях. Затем клетки окрашивают витальным красителем (Vivid, Thermo-Fisher) и следующими внеклеточными антителами: анти-мышиные CD3e АРС-Cy7, анти-мышиные CD4-PerCP-Cy5.5 и анти-мышиные CD8a АРС (BD Biosciences) антитела. Затем, внутриклеточные цитокины окрашивают следующими антителами: BV605 анти-мышиного ИФНy, APC-R700 анти-мышиного ИЛ-2 и PE анти-мышиного ФНО-a (BD Biosciences).

[216] Данные ICS были получены с помощью 10-цветного FACS CANTO (BD Biosciences), завершение анализа проводили с использованием FlowJo. Стратегия стробирующей проточной цитометрии показана на ФИГ. 8. Для присвоения клетке статуса антигенспецифичной с помощью проточной цитометрии, частота сообщаемого параметра должна превышать частоту параметра отрицательного контроля (только среды). Для идентифицирования клетки, как продуцирующей антигенспецифичный CD 107a, клетка также должна быть идентифицирована в качестве позитивной относительно антигенспецифической продукции ИФНy и/или ИЛ-2 и/или ФНОa булевым стробированием.

[217] Синтетический консенсусный мезотелин вызывал более устойчивые ответы в компартменте Т-клеток CD8 +, по сравнению с ответами в компартменте Т-клеток CD4 + (ФИГ. 9A-9D). Синтетический консенсусный мезотелин индуцировал частоту антиген-специфических ответов CD4+Т-клеток, которые были значительно более устойчивыми, чем наивные (0,09% ± 0,07%), группах дозировок пг (0,29% ± 0,20%) (р <0,004), 20 пг (0,50% ± 0,30). %) (p <0,004), 30 пг (0,42% ± 0,24%) (p <0,004) и 50 пг (0,38% ± 0,17%) (p <0,004) (ФИГ. 9A). Синтетический консенсусный ответ мезотелин-специфических CD4+Т-клеток был дозозависимым при дозах 10 и 20 пг, но не при дозах 30 и 50 пг, и состоял в основном из ИФНy-ИЛ-2-ФНОa +, ИФНy+ИЛ-2-ФНОa-, ИФНy-ИЛ-2+ФНОa+или ИФНy+ИЛ-2+ФНОa +, продуцирующих CD4+T-клетки (ФИГ. 9C). Частота антигенспецифических CD4+Т-клеток более подробно представлена в Таблице 7.

Таблица 7

Синтетический консенсусный мезотелин CD4+Т-клеток
Конструкт	Доза	%CD4+ ± Станд. откл.	p-значение
pGX0001	30 пг	0.09 ±0.07	n/a
pGX1430	10 пг	0.29 ±0.20	0.004
	20 пг	0.50 ±0.30	0.004
	30 пг	0.42 ± 0.24	0.004
50 пг	0.38 ±0.17	0.004
Статистическая значимость, принятая на уровне p <0,013. Указанные значения p относятся к наивным (иммунизированным pGX0001 мышам).

[218] Частота антиген-специфических CD8+T-клеток, индуцированных синтетическим консенсусным мезотелином, увеличилась, по сравнению с контролем, во всех дозовых группах (ФИГ. 9B). В частности, частота антиген-специфических CD8+Т-ответов в группах, иммунизированных 10 мкг (0,64% ± 0,42%) (р=0,016), 20 мкг (0,70% ± 0,48%) (р=0,028), 30 мкг (0,97% ± 0,96%) (р=0,008) и 50 пг (1,00% ± 0,22%) (р=0,004) pGX1430 была значительно более устойчивой при более высоких дозах, по сравнению с наивными (0,15% ± 0,04%). Синтетический консенсусный ответ мезотелин-специфических CD8+T-клеток увеличивался с увеличением дозы и состоял в основном из ИФНy+ИЛ-2-ФНОa-продуцирующих CD8+T-клеток (ФИГ. 9D). Частота антигенспецифических CD8+T-клеток более подробно описана в Таблице 8.

Таблица 8

Синтетический консенсусный мезотелин CD8+Т-клеток
Конструкт	Доза	%CD8+ ± Станд. Откл.	p-значение
pGX0001	30 пг	0.15 ±0.04	n/a
pGX1430	10 пг	0.64 ± 0.42	0.016
	20 пг	0.70 ± 0.48	0.028
	30 пг	0.97 ± 0.96	0.008
50 пг	1.00 ±0.22	0.004
Статистическая значимость, принятая на уровне p <0,013. Указанные значения p относятся к наивным (иммунизированным pGX0001мышам).

[219] Все дозы синтетического консенсусного мезотелина индуцировали частоту CD4+CD107a+T-клеток, которая была выше, чем у наивного (0,01% ± 0,01%). В частности, частота антиген-специфических CD4+CD107a+T-клеток составила 0,10% ± 0,11%, 0,20% ± 0,13%, 0,16% ± 0,13% и 0,15% ± 0,11% в дозовых группах 10 пг (р=0,004), 20 пг (р=0,004), 30 пг (р=0,016) и 50 пг (р=0,004) соответственно (ФИГ. 10А). Цитокиновый профиль синтетических консенсусных мезотелин-специфических CD4+CD107a+T-клеток был сходным в разных дозовых группах и состоял в основном из ИФНy+ИЛ-2+ФНОa +, ИФНy+ИЛ-2+ФНОa +, ИФНy+ИЛ-2+ ФНОa + (ФИГ 10C). Частота антиген-специфических CD4+T-клеток с цитолитическим потенциалом дополнительно детализирована в Таблице 9.

Таблица 9

Синтетический консенсусный мезотелин CD4+Т-клеток
Конструкт	Доза	%CD4+CD107a+ ± Станд. откл.	p-значение
pGX0001	30 пг	0.01 ± 0.01	n/a
pGX1430	10 пг	0.10 ±0.11	0.004
	20 пг	0.20 ±0.13	0.004
	30 пг	0.16 ±0.13	0.016
50 пг	0.15 ± 0.11	0.004
Статистическая значимость, принятая на уровне p <0,013. Указанные значения p относятся к наивным (иммунизированным pGX0001 мышам).

[220] Подобно количеству антиген-специфических CD8+T-клеток, синтетический консенсусный мезотелин индуцировал значительное изменение частоты CD8+CD107a+T-клеток среди всех групп, по сравнению с наивными (0,05% ± 0,02%) (ФИГ. 10C). В частности, частота антиген-специфических CD8+CD107a+T-клеток составляла 0,27% ± 0,22%, 0,57% ± 0,43%, 0,83% ± 0,85% и 0,90% ± 0,24% в дозовых группах 10 пг (р=0,008), 20 пг (р=0,028), 30 пг (р=0,004) и 50 пг (р=0,004) соответственно (ФИГ. 10А). Профиль цитокинов синтетических консенсусных мезотелин-специфических CD8+CD107a+T-клеток был сходным во всех дозовых группах, и большинство являлось ИФНy+ИЛ-2-ФНОa- (ФИГ.10D), за исключением группы, получавшей 10 пг, в которой профиль большинства состоял из ИФНy+ИЛ-2+ФНОa+и ИФНy+ИЛ- 2+ФНОa +. Частота антигенспецифических CD8+Т-клеток с цитолитическим потенциалом более подробно описана в Таблице 10.

Таблица 10

Synthetic Consensus Mesothelin CD8*CD107a*T cells

Синтетический консенсусный мезотелин CD8+Т-клеток
Конструкт	Доза	%CD8+CD107a+ ± Станд. откл.	p-значение
pGX0001	30 пг	0.05 ± 0.02	n/a
pGX1430	10 пг	0.27 ±0.22	0.008
	20 пг	0.57 ± 0.43	0.028
	30 пг	0.83 ± 0.85	0.004
50 пг	0.90 ± 0.24	0.004
Статистическая значимость, принятая на уровне p <0,013. Указанные значения p относятся к наивным (иммунизированным pGX0001 мышам).

[221] В целом, никаких существенных различий каких-либо представленных данных иммунных ответов между иммунизированными группами не было (то есть, результаты для 10 пг не были значительно ниже, чем для 50 пг и т.д.)

Статистический анализ

[222] Статистический анализ был выполнен с использованием IBM SPSS Statistics 22 (IBM Corporation). Во многих сравнениях, для данных не было продемонстрировано нормального распределения. По этой причине, для всех анализов использовался U-критерий Манна-Уитни, а для многократных сравнений - специальная поправка Бонферрони. Статистическая значимость установлена при p <0,013 (0,05/4 сравнения=0,0125).

Заключение

[223] Синтетический консенсусный мезотелин увеличивал частоту антиген-специфических CD4 +, CD4+CD107a+и CD8 +, CD8+CD107a+T-клеток, по сравнению с наивными, хотя величина ответа была намного более устойчивой в компартменте CD8+T-клеток.

Пример 7: Моновалентное исследование синтетического консенсусного мезотелина на низших приматах

[224] Для исследования потенциала синтетического консенсусного мезотелина отдельно и в сочетании с низкой и высокой дозами ИЛ-12, восемнадцать взрослых макак-резус, каждой из которых был присвоен уникальный идентифицирующий номер NHP, были разделены на 3 группы по 6 и иммунизированы pGX1430 следующим образом. Шесть животных были иммунизированы 3,0 мг pGX1430 (группа 1), шесть - 3,0 мг pGX1430 плюс 0,04 мг pGX6006 (выбранный резус ИЛ-12) в качестве адъюванта (группа 2) и шесть - 3,0 мг pGX1430 плюс 0,20 мг pGX6006 (выбранный резус ИЛ-12) в качестве адъюванта (группа 3), растворы готовили в стандартном солевом растворе для инъекционного объема 1,0 мл. Иммунизационные инъекции вводили на 0, 4, 8 и 12 неделе с необязательной пятой иммунизацией. Все иммунизации проводили внутримышечно с помощью устройства CELLECTRA® 2000 5P-IM EP с объемом инъекции 1 мл, со стерильной водой для инъекций, с чередованием контралатеральных конечностей. Условия ЭП были следующими: OpBlock 0070 - IM, 0,5 А, 3 импульса, 52 мс, 0,2 с между импульсами. Иммуногенность мезотелина оценивалась на 2, 6, 10 и 14 неделях.

[225] Идентификация животных, происхождение, пол и вес для групп 1-3 представлены в Таблице 11.

Таблица 11

Группа/доза	ID	Происхождение (если известно)	Пол	Вес (кг)
	6864	Китайский резус	Ж	4.5
	6870	Китайский резус	Ж	4.0
1	6876	Китайский резус	Ж	4.1
6882	Китайский резус	M	4.0
	6889	Китайский резус	M	4.4
	6896	Китайский резус	M	3.9
	6865	Китайский резус	Ж	4.7
	6871	Китайский резус	Ж	4.4
	6877	Китайский резус	Ж	4.4
2	6884	Китайский резус	M	4.3
	6890	Китайский резус	M	3.9
	6897	Китайский резус	M	3.8
	6866	Китайский резус	Ж	4.1
	6872	Китайский резус	Ж	4.4
3	6878	Китайский резус	Ж	4.2
	6885	Китайский резус	M	4.6
	6891	Китайский резус	M	4.6
	6898	Китайский резус	M	4.2

Изоляция МКПК

[226] Цельную кровь низших приматов собирали в пробирки для приготовления клеток с цитратом натрия (CPT BD Biosciences), содержащие антикоагулянт и гелевый барьер. Перед доставкой в течение ночи, цельную кровь после забора центрифугируют как можно быстрее (в течение 2 часов), для отделения и сконцентрирования МКПК. Эритроциты и нейтрофилы оседают на дно пробирок и удерживаются на месте гелевым барьером. Плазма и лимфоциты остаются выше гелевого барьера. Каждая пробирка для приготовления клеток (CPT) может вмещать ~ 8 мл крови и доставляться при комнатной температуре. По прибытии в доклиническую лабораторию в Сан-Диего, отцентрифугированные пробирки СРТ используют для изоляции МКПК. После лизиса эритроцитов аммонийно-хлоридно-калиевым (AХK) буфером, жизнеспособные клетки подсчитывали с использованием автоматического счетчика клеток Invitrogen CountessTM и ресуспендировали в полной питательной среде (RPMI 1640 с добавлением 10% ФБС, антибиотиков и β-меркаптоэтанола). После завершения анализов, описанных в этом отчете, оставшиеся МКПК были заморожены в средах для заморозки (10% ДМСО (Sigma) и 90% ФБС (Seradigm)) в криопробирках и долгое время хранились в жидком азоте.

Метод иммуноферментных пятен (ELISpot) ИФНy

[227] Для оценки антиген-специфических клеточных ответов, индуцированных вакциной, в каждый момент времени проводили анализ ELISpot ИФНy обезьян с изолированными МКПК и с использованием набора (MabTech IFNy ELISpotPro, # 3421M-2APW-10). Вкратце, 96-луночные планшеты, предварительно покрытые анти-обезъяньими ИФНy антителами (mAb MT126L), промывали в ФСБ и блокировали в течение 2 часов при комнатной температуре с использованием полной культуральной среды (RPMI 1640 с добавлением 10% ФБС, антибиотиков и β-меркаптоэтанола). МКПК низших обезьян были ресуспендированы в среде RIO, а затем добавлены в трех повторах с исходным количеством 2×10⁵ клеток на лунку. Был синтезирован набор пептидов (GenScript), каждый из которых содержал 15 аминокислотных остатков, с 11 перекрывающимися аминокислотами, представляющими целые последовательности синтетического консенсусного белка. Эти наборы пептидов ресуспендировали в ДМСО (Sigma) и объединяли с концентрацией приблизительно 2 пг/мл каждого соответствующего пептида в пулы. Все антигенспецифичные объединенные пептиды использовали в соотношении 1: 100, то есть в финальном разведении 1: 200 в каждой лунке в сочетании с МКПК. Было получено четыре пула для мезотелина.

[228] В качестве положительного контроля использовали анти-CD3 (mAh CD-2 Mabtech) и/или PMA (Sigma) с иономицином (Sigma). Полная культуральная среда R10 была использована в качестве отрицательного контроля. Планшеты инкубировали в течение приблизительно 18 часов при 37°С в инкубаторе с 5% атмосферного СО 2. После удаления клеток и добавления анти-обезъяньих- ALP-конъюгированных антител к ИФНy (MabTech Ab 7-B6-1-ALP), планшеты инкубируют в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем проводят сэндвич-иммуноферментный анализ с использованием субстратного раствора БХИВ/НСТ в соответствии с инструкциями производителя набора (MabTech). Сине-черный окрашенный осадок образует пятна, выявляющие каждую отдельную ИФНy-продуцирующую клетку. Затем пятна сканируются и подсчитываются анализатором и программным обеспечением CTL ImmunoSpot® (Cellular Technology), а качество контролируется обученным оператором. Ответы ИФНy выглядят, как пятнообразующие единицы (СОЕ) МКПК которые до 1×10⁵ больше, чем СОЕ в отрицательном контроле (только среда).

Иммунологические результаты

[229] Мезотелин-специфические ответы ИФНy показаны на ФИГ. 11 A -11 C для групп 1-3, в которых иммунизации проводили только мезотелином (ФИГ. 12A), мезотелином с низкой дозой ИЛ-12 (0,04 мг) (ФИГ. 11B) или мезотелином с высокой дозой ИЛ-12. (0,2 мг) (ФИГ. 11C). Результаты показывают ответ в каждый момент времени через 2 недели после введения дозы. В целом, все группы и отдельные животные показывали увеличение ответа к концу исследования через 2 недели после введения 4 дозы, по сравнению с исходными данными до иммунизации. ФИГ. 11 A-11C показывает тенденцию ИЛ-12, обеспечивающего адъювантный эффект для ответов ИФНy на синтетический консенсусный мезотелин через PD3.

[230] На ФИГ. 12A-12C изображены усредненные мезотелин-специфические ответы ИФНy с иммунизацией одним мезотелином (ФИГ. 12A), мезотелином с низкой дозой ИЛ-12 (0,04 мг) (ФИГ. 12B) или мезотелином с высокой дозой ИЛ-12 (0,2 мг) (ФИГ. 12C). ФИГ. 12A-12C показывают, что ИЛ-12 увеличивает величину, но не широту ответов ИФНy против синтетического консенсусного мезотелина.

Физиологические параметры

[231] Как показано в таблицах 12, 13 и 14, различия ни по одному из физиологических параметров, измеренных вследствие иммунизации для групп 1, 2 и 3, соответственно, не наблюдались. Не было отмечено существенных различий для эритроцитов, гематокритного числа, нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов (данные не предоставлены). Эти значения находятся в ожидаемых пределах для животных указанного вида, пола и возраста, подвергающихся аналогичным экспериментальным процедурам. Любые отклонения от заявленных нормальных диапазонов носят спорадический характер, присутствуют только для одного пола и не связаны с уровнями дозы или сроками.

Таблица 12

Группа 1	До вакцинации	После вакцинации	Норма
	Неделя 2	Неделя 6	Неделя 14
Лейкоциты (#/103/мл)	3.4*-11.9 (#6896, 6882)	3.3*-9.5 (#6896, 6882)	3.4*-12.6 (#6896, 6882)	4.0-15.0
Креатинин (мг/дл)	0.5-0.9	0.4-0.9	0.5-0.9	0.3-1.4
Азот мочевины в крови (мг/дл)	9-23	14-27	11-28	9-29
Щелочная фосфатаза (ед/л)	197-576	238-551	218-673	65-641
Аспартатаминотрансфераза (ед/л)	9*-23 (#6889, 6870, 6882)	7*-26 (#6889, 6870, 6882, 6864)	20*-44 (#6870)	23-175
Аланинаминотрансфераза (ед/л)	19-40	12*-28 (#6870)	8*-30 (#6889)	18-204
Общий биллирубин (мг /дл)	0.1-0.2	0.2-0.3	0.1-0.3	0.1-0.6

Примечание: вне нормы *

Таблица 13

Группа 2	До вакцинации	После вакцинации	Норма
	Неделя 2	Неделя 6	Неделя 14
Лейкоциты (#/103/мл)	5.9-16.2	5.1-9.2	7.1-11.9	4.0-15.0
Креатинин (мг/дл)	0.5-0.8	0.4-0.8	0.4-0.9	0.3-1.4
Азот мочевины в крови (мг/дл)	11-18	13-19	14-19	9-29
Щелочная фосфатаза (ед/л)	256-419	331-435	324-490	65-641
Аспартатаминотрансфераза (ед/л)	14*-29 (#6871, 6865, 6897, 6877)	15*-34 (#6871, 6865, 6897, 6877)	21*-34 (#6865)	23-175
Аланинаминотрансфераза (ед/л)	17*-43 (#6865)	17*-34 (#6865)	18-40	18-204
Общий биллирубин (мг /дл)	0.2	0.2-0.3	0.2-0.4	0.1-0.6

Примечание: вне нормы *

Таблица 14

Группа 3	До вакцинации	После вакцинации	Норма
	Неделя 2	Неделя 6	Неделя 14
Лейкоциты (#/103/мл)	5.3-13.7	3.8*-11.0 (#6885)	3.9*-16.5 (#6885)	4.0-15.0
Креатинин (мг/дл)	0.5-0.7	0.5-0.7	0.6-0.8	0.3-1.4
Азот мочевины в крови (мг/дл)	11-21	13-22	12-25	9-29
Щелочная фосфатаза (ед/л)	302-405	363-441	332-439	65-641
Аспартатаминотрансфераза (ед/л)	8*-31 (#6891, 6878, 6898)	6*-32 (#6891, 6898, 6872, 6885)	21*-43 (#6885, 6891)	23-175
Аланинаминотрансфераза (ед/л)	15*-34 (#6878)	15*-36 (#6885)	8*-33 (#6891)	18-204
Общий биллирубин (мг /дл)	0.1-0.2	0.1-0.2	0.1-0.2	0.1-0.6

Примечание: вне нормы *

[232] В течение исследования, не наблюдалось значительного изменения веса среди всех групп, при нормальном диапазоне 4-12, как показано ниже в Таблице 15.

Таблица 15

Группы	Вес (кг)
Месяц 1	Месяц 2	Месяц 3	Месяц 4	Месяц 5
4	4.12-5.38	3.94*-5.48 (#6882)	3.88*-5.56 (#6882)	4.0-5.9	3.94*-5.84 (#6882)
5	4.14-5.26	3.92*-5.34 (#6897)	3.88*-5.46 (#6897)	3.94*-5.24 (#6897)	3.88*-5.38 (#6897)
6	4.68-5.28	4.54-5.36	4.56-5.32	4.82-5.8	4.72-5.74

[233] В целом результаты показывают, что синтетический консенсусный мезотелин, применяемый отдельно, способен вызывать иммунный ответ у 100% низших приматов. Добавление адъюванта ИЛ-12 не демонстрировало значительного улучшения.

[234] Ясно, что вышеприведенное подробное описание и сопровождающие примеры являются просто иллюстративными и не должны рассматриваться, как ограничения объема изобретения, который определяется исключительно прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентах.

[235] Различные изменения и модификации приведенных вариантов воплощения изобретения очевидны для специалистов в данной области техники. Такие изменения и модификации приведенных вариантов воплощения изобретения, включая изменения, относящиеся к химическим структурам, заместителям, производным, промежуточным соединениям, синтезам, композициям, составам или способам применения изобретения, но, не ограничиваясь ими, могут быть сделаны без отклонения от сущности и объема изобретения.

Таблица 16: Синтетическая консенсусная мезотелиновая ДНК-кодирующая последовательность

SEQ ID №.

Последовательность

1

ATGGACTGGACATGGATTCTGTTTCTGGTCGCCGCCGCTACACGAGTGCATTCAAGCAGGGCTCTGGCAGGGGAGACTGGGCAGGAAGCAGCCCCACTGGACGGCGTGCTGGCAAACCCTCCCGATATCAGCTCCCTGAGCCCTAGACAGCTGCTGGGCTTCCCATGCGTGGAGGTGAGCGGCCTGTCCACCGAGAGGGTGCGCGAGCTGGCAGTGGCCCTGGCACAGAAGAATGTGAAGCTGTCCGCCGAGCAGCTGAGGTGCCTGGCACACAGGCTGTCTGAGCCACCCGAGGACCTGGATGCACTGCCACTGGACCTGCTGCTGTTCCTGAACCCCGATGCCTTTAGCGGCCCTCAGGCCTGTACAAGGTTCTTTTCCCGCGTGGCCAAGGCCAATGTGGACCTGCTGCCTAGGGGCGCCCCAGAGCGGCAGAGACTGCTGCCAGCCGCCCTGGCATGCTGGGGCGTGAGGGGCTCTCTGCTGAGCGAGGCAGACGTGCGCGCCCTGGGCGGCCTGGCCTGTGATCTGCCTGGCCGCTTTGTGGCCGAGTCTGCCGAGGTGCTGCTGCCAAGGCTGGTGAGCTGCCTGGGACCTCTGGACCAGGATCAGCAGGAGGCCGTGCGCGCCGCCCTGCAGGGCGGCGGCCCTCCCTACGGCCCTCCCTCTACCTGGTCTATCAGCACACTGGACGCACTGAGAGGCAGCCTGCCAGTGCTGGGACAGCCCGTGATCAGGTCCATCCCTCAGGGCATCCTGGCAGCATGGAGGCAGCGGAGCAGCCGGGACCCCTCCTGGAGGCAGCCAGAGAGAACCGTGCTGAGGCCTAGATTCCGGAGAGACGTGGAGAAGACAGCCTGTCCATCCGGCAAGAAGGTGCACGAGATCGATGAGTCTCTGATCTTTGCCAAGAAGTGGGAGCTGGAGGCATGCGTGGACGCCGCCCTGCTGGCAGCACAGATGGATAGAGTGAACGCCATCCCCTTCACCTACGAGCAGCTGGACGTGCTGAAGCACAAGCTGGATGAGCTGTACCCCCAGGGCTATCCTGAGAGCGTGACACAGCACCTGGGCTATCTGTTTCTGAAGATGTCTCCTGAGGACATCAGGAAGTGGAACGTGACCAGCCTGGAGACACTGAAGGCCCTGCTGGAGGTCAATAAGGGCCACGAGATGTCCCCACAGGTGGCCACCCTGATCGACAGGGTGGTGAAGGGCAGAGGCCAGCTGGACAAGGATACAGTGGATACCCTGACAGCCTTCTACCCAGGCTACCTGTGCTCCCTGTCTCCCGAGGAGCTGTCCTCTGTGCCACCCAGCTCCATCGGAGCCGTGCGGCCTCAGGACCTGGATACCTGCGACCCAAGACAGCTGGATGTGCTGTACCCCAAGGCCAGGCTGGCCTTCCAGAACATGAATGGCAGCGAGTATTTCGTGAAGATCCAGCCATTTCTGGGCGGCGCCCCAACCGAGGACCTGAAGGCCCTGTCCCAGCAGAACGTGTCTATGGACCTGGCCACCTTTATGAAGCTGCGCACAGATGCCGTGCTGCCACTGACAGTGGCAGAGGTGCAGAAGCTGCTGGGACCTCACGTGGAGGGCCTGAAGGCAGAGGAGAGGCACAGGCCCGTGCGGGACTGGATTCTGCGGCAGAGACAGGACGATCTGGATACCCTGGGACTGGGACTGCAGGGCGGCATCCCAAATGGCTATCTGGTGCTGGATCTGTCCGTGCGGGAGGCCCTGACAGGCGTGCCCTGCCTGCTGGGACCTGGACCTGTGCTGACTGTGCTGGCTCTGCTGCTGGCTTCAACACTGGCTTGATAA

Таблица 17: S Синтетическая консенсусная мезотелиновая последовательность белка

SEQ ID №.

Последовательность

2

MDWTWILFLVAAATRVHSSRALAGETGQEAAPLDGVLANPPDISSLSPRQLLGFPCVEVSGLSTERVRELAVALAQKNVKLSAEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRVAKANVDLLPRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCLGPLDQDQQEAVRAALQGGGPPYGPPSTWSISTLDALRGSLPVLGQPVIRSIPQGILAAWRQRSSRDPSWRQPERTVLRPRFRRDVEKTACPSGKKVHEIDESLIFAKKWELEACVDAALLAAQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVTQHLGYLFLKMSPEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRVVKGRGQLDKDTVDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIGAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQPFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSVREALTGVPCLLGPGPVLTVLALLLASTLA

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> INOVIO PHARMACEUTICALS, INC

YAN, Jian

SLAGER, Anna

GARMAN, Bradley

COOCH, Neil

<120> МЕЗОТЕЛИН-НАЦЕЛЕННЫЕ ВАКЦИНЫ ОТ РАКА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> INO-1002WO / 104409.000444

<150> US 62/598,289

<151> 2017-12-13

<160> 2

<170> Патентная версия 3.5

<210> 1

<211> 1827

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая консенсусная мезотелиновая ДНК-кодирующая

последовательность

<400> 1

atggactgga catggattct gtttctggtc gccgccgcta cacgagtgca ttcaagcagg 60

gctctggcag gggagactgg gcaggaagca gccccactgg acggcgtgct ggcaaaccct 120

cccgatatca gctccctgag ccctagacag ctgctgggct tcccatgcgt ggaggtgagc 180

ggcctgtcca ccgagagggt gcgcgagctg gcagtggccc tggcacagaa gaatgtgaag 240

ctgtccgccg agcagctgag gtgcctggca cacaggctgt ctgagccacc cgaggacctg 300

gatgcactgc cactggacct gctgctgttc ctgaaccccg atgcctttag cggccctcag 360

gcctgtacaa ggttcttttc ccgcgtggcc aaggccaatg tggacctgct gcctaggggc 420

gccccagagc ggcagagact gctgccagcc gccctggcat gctggggcgt gaggggctct 480

ctgctgagcg aggcagacgt gcgcgccctg ggcggcctgg cctgtgatct gcctggccgc 540

tttgtggccg agtctgccga ggtgctgctg ccaaggctgg tgagctgcct gggacctctg 600

gaccaggatc agcaggaggc cgtgcgcgcc gccctgcagg gcggcggccc tccctacggc 660

cctccctcta cctggtctat cagcacactg gacgcactga gaggcagcct gccagtgctg 720

ggacagcccg tgatcaggtc catccctcag ggcatcctgg cagcatggag gcagcggagc 780

agccgggacc cctcctggag gcagccagag agaaccgtgc tgaggcctag attccggaga 840

gacgtggaga agacagcctg tccatccggc aagaaggtgc acgagatcga tgagtctctg 900

atctttgcca agaagtggga gctggaggca tgcgtggacg ccgccctgct ggcagcacag 960

atggatagag tgaacgccat ccccttcacc tacgagcagc tggacgtgct gaagcacaag 1020

ctggatgagc tgtaccccca gggctatcct gagagcgtga cacagcacct gggctatctg 1080

tttctgaaga tgtctcctga ggacatcagg aagtggaacg tgaccagcct ggagacactg 1140

aaggccctgc tggaggtcaa taagggccac gagatgtccc cacaggtggc caccctgatc 1200

gacagggtgg tgaagggcag aggccagctg gacaaggata cagtggatac cctgacagcc 1260

ttctacccag gctacctgtg ctccctgtct cccgaggagc tgtcctctgt gccacccagc 1320

tccatcggag ccgtgcggcc tcaggacctg gatacctgcg acccaagaca gctggatgtg 1380

ctgtacccca aggccaggct ggccttccag aacatgaatg gcagcgagta tttcgtgaag 1440

atccagccat ttctgggcgg cgccccaacc gaggacctga aggccctgtc ccagcagaac 1500

gtgtctatgg acctggccac ctttatgaag ctgcgcacag atgccgtgct gccactgaca 1560

gtggcagagg tgcagaagct gctgggacct cacgtggagg gcctgaaggc agaggagagg 1620

cacaggcccg tgcgggactg gattctgcgg cagagacagg acgatctgga taccctggga 1680

ctgggactgc agggcggcat cccaaatggc tatctggtgc tggatctgtc cgtgcgggag 1740

gccctgacag gcgtgccctg cctgctggga cctggacctg tgctgactgt gctggctctg 1800

ctgctggctt caacactggc ttgataa 1827

<210> 2

<211> 607

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая консенсусная мезотелиновая протеин-кодирующая

последовательность

<400> 2

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Ser Arg Ala Leu Ala Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro

20 25 30

Leu Asp Gly Val Leu Ala Asn Pro Pro Asp Ile Ser Ser Leu Ser Pro

35 40 45

Arg Gln Leu Leu Gly Phe Pro Cys Val Glu Val Ser Gly Leu Ser Thr

50 55 60

Glu Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala Gln Lys Asn Val Lys

65 70 75 80

Leu Ser Ala Glu Gln Leu Arg Cys Leu Ala His Arg Leu Ser Glu Pro

85 90 95

Pro Glu Asp Leu Asp Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Leu Phe Leu Asn

100 105 110

Pro Asp Ala Phe Ser Gly Pro Gln Ala Cys Thr Arg Phe Phe Ser Arg

115 120 125

Val Ala Lys Ala Asn Val Asp Leu Leu Pro Arg Gly Ala Pro Glu Arg

130 135 140

Gln Arg Leu Leu Pro Ala Ala Leu Ala Cys Trp Gly Val Arg Gly Ser

145 150 155 160

Leu Leu Ser Glu Ala Asp Val Arg Ala Leu Gly Gly Leu Ala Cys Asp

165 170 175

Leu Pro Gly Arg Phe Val Ala Glu Ser Ala Glu Val Leu Leu Pro Arg

180 185 190

Leu Val Ser Cys Leu Gly Pro Leu Asp Gln Asp Gln Gln Glu Ala Val

195 200 205

Arg Ala Ala Leu Gln Gly Gly Gly Pro Pro Tyr Gly Pro Pro Ser Thr

210 215 220

Trp Ser Ile Ser Thr Leu Asp Ala Leu Arg Gly Ser Leu Pro Val Leu

225 230 235 240

Gly Gln Pro Val Ile Arg Ser Ile Pro Gln Gly Ile Leu Ala Ala Trp

245 250 255

Arg Gln Arg Ser Ser Arg Asp Pro Ser Trp Arg Gln Pro Glu Arg Thr

260 265 270

Val Leu Arg Pro Arg Phe Arg Arg Asp Val Glu Lys Thr Ala Cys Pro

275 280 285

Ser Gly Lys Lys Val His Glu Ile Asp Glu Ser Leu Ile Phe Ala Lys

290 295 300

Lys Trp Glu Leu Glu Ala Cys Val Asp Ala Ala Leu Leu Ala Ala Gln

305 310 315 320

Met Asp Arg Val Asn Ala Ile Pro Phe Thr Tyr Glu Gln Leu Asp Val

325 330 335

Leu Lys His Lys Leu Asp Glu Leu Tyr Pro Gln Gly Tyr Pro Glu Ser

340 345 350

Val Thr Gln His Leu Gly Tyr Leu Phe Leu Lys Met Ser Pro Glu Asp

355 360 365

Ile Arg Lys Trp Asn Val Thr Ser Leu Glu Thr Leu Lys Ala Leu Leu

370 375 380

Glu Val Asn Lys Gly His Glu Met Ser Pro Gln Val Ala Thr Leu Ile

385 390 395 400

Asp Arg Val Val Lys Gly Arg Gly Gln Leu Asp Lys Asp Thr Val Asp

405 410 415

Thr Leu Thr Ala Phe Tyr Pro Gly Tyr Leu Cys Ser Leu Ser Pro Glu

420 425 430

Glu Leu Ser Ser Val Pro Pro Ser Ser Ile Gly Ala Val Arg Pro Gln

435 440 445

Asp Leu Asp Thr Cys Asp Pro Arg Gln Leu Asp Val Leu Tyr Pro Lys

450 455 460

Ala Arg Leu Ala Phe Gln Asn Met Asn Gly Ser Glu Tyr Phe Val Lys

465 470 475 480

Ile Gln Pro Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Glu Asp Leu Lys Ala Leu

485 490 495

Ser Gln Gln Asn Val Ser Met Asp Leu Ala Thr Phe Met Lys Leu Arg

500 505 510

Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val Ala Glu Val Gln Lys Leu Leu

515 520 525

Gly Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala Glu Glu Arg His Arg Pro Val

530 535 540

Arg Asp Trp Ile Leu Arg Gln Arg Gln Asp Asp Leu Asp Thr Leu Gly

545 550 555 560

Leu Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn Gly Tyr Leu Val Leu Asp Leu

565 570 575

Ser Val Arg Glu Ala Leu Thr Gly Val Pro Cys Leu Leu Gly Pro Gly

580 585 590

Pro Val Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Leu Ala Ser Thr Leu Ala

595 600 605

<---

1. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антиген мезотелина, содержащая:

(a) последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислоты 19-607 SEQ ID NO: 2; или

(b) последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотам 19-607 SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 96%, где указанная аминокислотная последовательность содержит аланин в аминокислотном положении 303, треонин в аминокислотном положении 583 и валин в аминокислотном положении 585 относительно SEQ ID NO: 2.

2. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антиген мезотелина, содержащая:

(a) нуклеотиды 55-1821 SEQ ID NO: 1; или

(b) фрагмент, который по меньшей мере на 96% идентичен нуклеотидам 55-1821 SEQ ID NO: 1, где указанная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует аланин в аминокислотном положении 303, треонин в аминокислотном положении 583 и валин в аминокислотном положении 585 относительно SEQ ID NO: 2.

3. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антиген мезотелина, содержащая:

(a) последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует SEQ ID NO: 2; или

(b) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 96%, где указанная аминокислотная последовательность содержит аланин в аминокислотном положении 303, треонин в аминокислотном положении 583 и валин в аминокислотном положении 585 относительно SEQ ID NO: 2.

4. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антиген мезотелина, содержащая:

(a) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 1; или

(b) последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 96% идентична SEQ ID NO: 1, где указанная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует аланин в аминокислотном положении 303, треонин в аминокислотном положении 583 и валин в аминокислотном положении 585 относительно SEQ ID NO: 2.

5. Экспрессионный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-4.

6. Экспрессионный вектор по п. 4, где молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с регуляторным элементом, выбранным из промотора или сигнала полиаденилирования.

7. Экспрессионный вектор по п. 6, где промотор представляет собой промотор цитомегаловируса человека немедленно-раннего ответа (промотор hCMV).

8. Экспрессионный вектор по п. 6, где сигнал полиаденилирования является сигнальной последовательностью полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота (bGH поли-A).

9. Экспрессионный вектор по любому из пп. 5-8, где вектор является плазмидой.

10. Иммуногенная композиция, содержащая эффективное количество одной или более молекул нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-4 и фармацевтически приемлемый носитель.

11. Иммуногенная композиция, содержащая эффективное количество одного или более векторов по любому из пп. 5-9 и фармацевтически приемлемый носитель.

12. Антиген мезотелина, содержащий:

(a) аминокислоты 19-607 из SEQ ID NO: 2; или

(b) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотам 19-607 SEQ ID NO: 2, где указанная аминокислотная последовательность содержит аланин в аминокислотном положении 303, треонин в аминокислотном положении 583 и валин в аминокислотном положении 585 относительно SEQ ID NO: 2.

13. Антиген мезотелина, содержащий:

(a) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; или

(b) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 96% идентична SEQ ID NO: 2, где указанная аминокислотная последовательность содержит аланин в аминокислотном положении 303, треонин в аминокислотном положении 583 и валин в аминокислотном положении 585 относительно SEQ ID NO: 2.

14. Вакцина для лечения или предотвращения мезотелин-экспрессирующего рака, содержащая эффективное количество экспрессионного вектора по любому из пп. 5-9 и фармацевтически приемлемый эксципиент.

15. Вакцина по п. 14, которая дополнительно включает адъювант.

16. Вакцина по п. 15, где адъювант представляет собой ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-28 или RANTES.

17. Способ лечения субъекта с мезотелин-экспрессирующей раковой клеткой, включающий введение терапевтически эффективного количества вакцины по любому из пп. 14-16.

18. Способ по п. 17, где применение включает стадию электропорации.

19. Способ по п. 17, где применение происходит к одному или более сайтам субъекта.

20. Способ вакцинации субъекта против мезотелин-экспрессирующей раковой клетки, включающий применение количества вакцины по любому из пп. 14-16, эффективного для индукции гуморального иммунного ответа.

21. Способ по п. 20, где введение включает стадию электропорации.

22. Способ по п. 20, где введение происходит в одном или более сайтах субъекта.