Набор олигонуклеотидов и способ мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для выявления рнк sars-cov-2

Изобретение относится к области медицины и молекулярной биологии, а именно к молекулярно-генетической диагностике COVID-19 на основе выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2. Синтезированные олигонуклеотидые праймеры и флуоресцентные зонды являются комплементарными исключительно нуклеотидной последовательности (ORF1ab и N участка) генома коронавируса SARS-CoV-2 и человеческого гена ABL1. А также разработан способ детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2 с помощью мультиплексной ПЦР-РВ, основанной на амплификации ORF1ab и N участков гена коронавируса SARS-CoV-2 и человеческой РНК гена ABL1 в качестве внутреннего контроля. Изобретение позволяет достоверно подтвердить клинический диагноз COVID-19 с минимальным количеством исследуемого материала, 10 мкл, путем контроля качества отбора пробы и выделения РНК по амплификации РНК человеческого гена ABL1 и определения присутствия/отсутствия РНК коронавируса SARS-CoV-2 по амплификации относительно контрольных образцов. 2 н.п. ф-лы, 5 ил., 6 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к области медицины и молекулярной биологии, а именно к молекулярно-генетической диагностике COVID-19 на основе выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 в биологическом материале пациентов с подозрением на COVID-19.

В конце декабря 2019 г. в городе Ухань (КНР) были отмечены первые случаи пневмонии, возбудителем которой оказался новый коронавирус 2019-nCoV. В начале февраля 2020 г. международный комитет по таксономии вирусов дал официальное название новому коронавирусу, как SARS-CoV-2 {Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2), а заболевание получило название COVID-19 (Coronavirus disease 2019).

Выявление РНК вируса SARS-CoV-2 основано на постановке полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с обратной транскрипцией и рекомендовано Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в качестве молекулярно-генетического метода диагностики COVID-19 [1].

Известен «Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса» [2], состоящий из 6 пар синтетических олигонуклеотидов. Однако, предлагаемый набор имеет ряд недостатков, заключающихся в том, что все 6 пар предлагаемых синтетических олигонуклеотидов являются специфичными только одному ORF1b участку генома коронавируса SARS-CoV-2 и предназначены для анализа ПЦР реакции по температуре плавления ПЦР продукта с присутствием интеркалирующего красителя SYBR Green или методом горизонтального гель-электрофореза. Таким образом, они не соответствуют критериям, рекомендованным ВОЗ для выявления РНК SARS-CoV-2 методом ПЦР-РВ. Также представленный способ обладает относительно низкой чувствительностью.

Известен «Способ выявления кДНК коронавируса SARS-CoV-2 с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции» [3]. Вышеуказанный способ имеет ряд недостатков, а именно: способ имеет низкую чувствительность, обусловленную электрофоретической детекцией ПЦР продуктов в 1,5%-ном агарозном геле, также отсутствует возможность контроля эффективности прохождения ПЦР реакции, что отражено на рисунке 1 в описании к изобретению, где количество ПЦР продукта значительно меньше в реакции с праймерами на участок ORF1ab по сравнению с праймерами на участок N1. Кроме того, имеется высокий риск контаминации при работе с ПЦР продуктом на этапах электрофоретической детекции и необходимость наличия достаточного количества исходного материала, так как реакция для исследования одного образца должна проходить в 4-х отдельных пробирках.

Известен метод обнаружения коронавируса [4]. Основным недостатком предложенного способа обнаружения коронавируса является низкая чувствительность, обусловленная использованием для визуализации продукта амплификации тест полосок (из фильтровальной бумаги или хитозана, пропитанных стрептавидином) по сравнению с рекомендованной ВОЗ.

Известны «Тест-система и способ для выявления РНК коронавируса SARS-COV-2, вируса-возбудителя коронавирусного заболевания 2019 COVID-19 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (варианты)» [5]. Основным недостатком описанного способа является использование в качестве положительного контроля праймеров специфичных для мРНК человеческих генов GAPDH (SBT0014 и SBT0015) и АСТВ (SBT0011 и SBT0012), амплифицирующих в реакции ПЦР также геномные последовательности ДНК GAPDH (NG_007073.2) и АСТВ (NG 007992.1). Учитывая, что в исходном материале мРНК всегда присутствуют примеси человеческой ДНК, использование этих праймеров в качестве внутреннего контроля прохождения реакции обратной транскрипции (получения кДНК) не корректно. Более того, сравнение уровней экспрессии GAPDH в 72 различных тканях человека показало относительно низкую экспрессию его в органах дыхательной системы [6].

Также, Ishige Т. и соавторами была опубликована статья о высокочувствительной мультиплексной RT-PCR для молекулярной диагностики COVID-19 в клинических лабораториях с использованием ранее известных праймеров, в том числе для человеческой мРНК гена ABL1 [7]. Однако, нуклеотидные последовательности праймеров и зонда для мРНК ABL1, заимствованные из работ Beillard, Е и соавторов, могут также амплифицировать геномную нуклеотидную последовательность ABL1 человека [8] и не эффективны для контроля прохождения реакции обратной транскрипции.

Основной задачей, решаемой настоящим изобретением является синтез специфичных синтетических олигонуклеотидов и флуоресцентных зондов, амплифицирующих в реакции ПЦР-РВ только нуклеотидные последовательности генома коронавируса SARS-CoV-2 и человеческой мРНК со стабильной экспрессией в различных клетках человека. А также разработка способа мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для выявления РНК SARS-CoV-2, гарантирующего надежный результат анализов по двум областям генома коронавируса, и не имеющего перечисленных выше недостатков.

Поставленная задача решается данной группой изобретений. В рамках данной разработки сконструированы синтетические олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды с оригинальной нуклеотидной последовательностью специфичной двум (ORFlab и N) генам SARS-CoV-2 и разработан надежный способ мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для выявления РНК SARS-CoV-2. Разработанный способ из-за мультиплексности (все реакция по трем каналам проходят в одной пробирке с 10 мкл кДНК) процесса амплификации требует малое количество исследуемого материала и содержит в качестве внутреннего контроля синтезированные олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентный зонд человеческого гена ABL1, позволяющие контролировать качество и количество исследуемого образца, при этом не имеет риска контаминации при использовании.

Технический результат изобретения заключается в расширении арсенала средств молекулярно-генетической диагностики коронавирусной болезни COVID-19, а также в повышении достоверности и надежности диагностики новой инфекции, за счет гарантированного определения наличия в образце достаточного количества генетического материала человека.

Дополнительным техническим результатом является возможность проведения анализа с относительно низким количеством исследуемого материала за счет совмещенности ПЦР-РВ в одной пробирке, и использования внутреннего контроля определения высококопийной мРНК человека, позволяющий оценить наличие человеческого биологического материала в мазке и, таким образом, исключить ложно-отрицательные результаты, связанные с некачественным взятием мазка или попыткой фальсификации пробы.

Сущность изобретения пояснена на графических материалах: Фиг. 1 - где число циклов (Ct) и кривые накопления продуктов мультиплексной ПЦР-РВ представлены по трем разным каналам детекции: человеческой кДНК ABL1 в желтом (RG) и генов ORF1ab и гена N коронавируса SARS-CoV-2 в оранжевом (ROX) и красном каналах (Су5); Фиг. 2 - Схематическое представление графических кривых и пороговых циклов мультиплексной ПЦР-РВ по трем каналам амплификации и варианты интерпретации результатов анализа;

Фиг. 3 - Графики кривых мультиплексной ПЦР-РВ и значение пороговых циклов человеческого гена ABL1 и ORFlab коронавируса SARS-CoV-2 в материале от пациентов с COVID-19 и здоровых доноров;

Фиг. 4 - Графики кривых ПЦР-РВ и значение пороговых циклов человеческого гена ABL1 и ORF1ab коронавируса SARS-CoV-2

Примечание:

№536 и 537 образцы мазков, взятых из носовой полости и ротоглотки пациентов с подозрением на COVID-19,

ПКО - положительный контрольный образец, содержащий кДНК SARS-CoV-2, выделенную из мазка носовой полости пациента с COVID-19,

ОКО - отрицательный контрольный образец, содержащий кДНК ABL1, выделенную из мазка носовой полости здорового человека;

Фиг. 5 - Хроматограмма прямого секвенирования по Сэнгеру ORFla участка генома SARS-CoV-2.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей нуклеотидов, комплементарных участкам генома коронавируса SARS-CoV-2 (NC_045512.2) и ABL1 (NM_005157.6):

SEQ ID NO: 1 последовательность нуклеотидов комплементарная 3211-3234 нуклеотидам генома коронавируса SARS-CoV-2;

SEQ ID NO: 2 последовательность нуклеотидов комплементарная 3307-3328 нуклеотидам генома коронавируса SARS-CoV-2;

SEQ ID NO: 3 последовательность нуклеотидов комплементарная 3240-3262 нуклеотидам генома коронавируса SARS-CoV-2;

SEQ ID NO: 4 последовательность нуклеотидов комплементарная 28715-28734 нуклеотидам генома коронавируса SARS-CoV-2;

SEQ ID NO: 5 последовательность нуклеотидов комплементарная 28774-28793 нуклеотидам генома коронавируса SARS-CoV-2;

SEQ ID NO:6 последовательность нуклеотидов комплементарная 28735-28759 нуклеотидам генома коронавируса SARS-CoV-2;

SEQ ID NO:7 последовательность нуклеотидов комплементарная 684-703 нуклеотидам мРНК ABL1;

SEQ ID NO: 8 последовательность нуклеотидов комплементарная 748-768 нуклеотидам мРНК ABL1;

SEQ ID NO: 9 последовательность нуклеотидов комплементарная 777-796 нуклеотидам мРНК ABL1;

Конкретная реализация заявляемого изобретения представлена созданием синтетических олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов для детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2, комплементарных уникальным нуклеотидным последовательностям генов коронавируса SARS-CoV-2, нуклеотидные последовательности которых представлены в таблице 1, и мРНК человеческого гена ABL1, нуклеотидные последовательности которого представлены в таблице 2, а также разработкой способа мультиплексной ПЦР-РВ.

Способ выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 с помощью мультиплексной ПЦР-РВ осуществляется с использованием разработанных олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов (таблица 1), 10^х ПЦР буфера, смеси четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, MqCl₂, Taq полимеразы, положительного (ПКО) и отрицательного (ОКО) контрольных образцов, внутреннего контроля, в виде олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентного зонда человеческого гена ABL1 (таблица 2). Перечень, концентрация и объем компонентов представлены в таблице 3.

Сущность группы изобретений пояснена примерами конкретной реализации, которые не ограничивают объем изобретения. Пример 1. Постановка мультиплексной ПЦР-РВ.

Выявление РНК коронавируса SARS-CoV-2 осуществляют с помощью мультиплексной ПЦР-РВ в одной пробирке, способ включает следующие этапы.

Отбор исследуемого материала. Исследуемый материал отбирается из носоглотки или ротоглотки с использованием специальных тампонов и полным соблюдением требований безопасности при работе с инфекционными агентами 2-3 группы патогенности.

Выделение РНК исследуемого материала. Выделение РНК из содержимого осуществляется общепринятым стандартным методом с использованием реагентов, предназначенных для этой цели.

Получение кДНК исследуемого материала. Получение кДНК осуществляется путем реакции обратной транскрипции (ОТ) общепринятым стандартным методом с наборами реагентов, предназначенных для этой цели. Для проведения реакции необходима РНК исследуемого образца в объеме по крайней мере 10 мкл.

Проведение реакции. Компоненты реакционной смеси и их количество для одной реакции мультиплексной ПЦР-РВ представлены в таблице 3. Для одной реакции мультиплексной ПЦР-РВ с объемом 25 мкл готовят смесь раствора 1 (смесь праймеров и флуоресцентных зондов для ORF1ab и N генов коронавируса SARS-CoV-2 и человеческого гена ABL1) и раствора 2 (10х ПЦР буфер, эквивалентная смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, Taq-полимераза, MqCl₂ 25 мМ) по 7,5 мкл каждого, соответственно. Смесь реагентов готовят с учетом еще двух (ПКО и ОКО) контрольных образцов. В микропробирки с реагентами для исследуемых образцов вносят по 10 мкл кДНК, а в микропробирки для ПКО и ОКО вносят по 10 мкл положительный и отрицательный контрольные образцы. Мультиплексную ПЦР-РВ проводят в амплификаторе "Rotor-Gene Q" («Qiagen», USA) или CFX96 Touch ("Bio-Rad" США) в температурном профиле: 95°С - 600 с, 45 циклов 95°С - 20 с, 60°С -45 с.

Интерпретация результатов мультиплексной ПЦР-РВ. Принцип оценки анализа заключается в определение значений порогового числа (Ct) циклов амплификации по каждому из трех каналов (Фиг. 1). Критерии оценки представлены в таблице 4 и пояснены на Фиг. 2.

Пример 2. Поступили образцы мазков №536 и №537 из носоглотки от двух пациентов с подозрением на COVID-19. Выделение РНК в объеме 30 мкл и получение кДНК осуществлено с использованием набора реагентов для выделения РНК «Амплисорб» и «Reverta L» компании Интерлабсервис (Россия), согласно инструкции производителя.

Далее собрана реакционная смесь в объеме 25 мкл для мультиплексной ПЦР-РВ в соответствии с таблицей 3.

Мультиплексная ПЦР-РВ осуществлена в амплификаторе «Rotor-Gene Q («Qiagen», USA) в температурном профиле: 95°С - 600 с, 45 циклов 95°С -20 с, 60°С-45 с.

Обработанные результаты представлены на Фиг 4.

Интерпретация результатов. Образцы мазков №536 и №537 содержат достаточное количество исходного материала, на что указывает значение Ct амплификации РНК человеческого гена ABL1 в контрольных (ПКО и ОКО) и анализируемом образце, по желтому (yellow) каналу. В оранжевом (orange) и красном (red) канале отражается Ct ORFlab и N генов коронавируса SARS-CoV-2 в исследуемом и ПКО образцах. Результат мультиплексной ПЦР-РВ показал присутствие РНК коронавируса SARS-CoOV-2 в исследуемых образцах.

Пример 3. Для проверки аналитической возможности предлагаемого способа из мазков носоглотки и ротоглотки 32 пациентов с COVID-19 и 22 здоровых доноров крови были выделены РНК и ДНК. Все образцы предварительно анализированы с использованием набора реагентов "ПЦР-РВ -2019-nCov" (ФГБУ "48 ЦНИИ" МО РФ) на наличия РНК SARS-COV-2. Выделение РНК и получения кДНК осуществлено с использованием набора реагентов "РИБО-преп" и "Реверта-L" ("Интерлабсервис" Россия), согласно инструкции производителя. Мультиплексная ПЦР-РВ проведена на амлификаторе "Rotor-Gene Q" («Qiagen», USA) в режиме: 95°С - 600 с, 45 циклов 95°С - 20 с, 60°С - 45 с. Среднее значение пороговых циклов (Ct) в условиях конкурентной амплификации по различным каналам приведены в таблице 5.

Как видно, из таблицы 5, разработанный набор синтетических олигонуклеотидов и флюоресцентных зондов для контрольного гена является исключительно РНК специфичным, что делает возможными его применение в качестве внутреннего контроля прохождения реакции обратной транскрипции.

Пример 4. Специфичность набора предлагаемых синтетических олигонуклеотидов и флюоресцентых зондов исключительно в отношении РНК вируса SARS-CoV-2 была проверена методом прямого секвенирования по Сэнгеру полученных продуктов мультиплексной ПЦР-РВ с использованием праймеров представленных в таблице 6.

Таблица 6. Нуклеотидные последовательности синтетических олигонуклеотидных праймеров для секвенирования участка генов ORFlab и N коронавируса SARS-CoV-2

Хроматограмма прямого секвенирования по Сэнгеру ORF1a участка генома SARS-CoV-2 представлена на Фиг. 5. Согласно сравнению с базой данных ttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/coronaviras/genomes/прочитанные нуклеотидные последовательности 100% соответствуют только различным изолятам SARS-CoV-2.Таким образом, изобретение позволяет достоверно подтвердить клинический диагноз COVID-19 путем контроля качества отбора пробы и выделения РНК по амплификации РНК человеческого гена ABL1 и присутствия/отсутствия РНК коронавируса SARS-CoV-2 относительно контрольных образцов и может быть использовано в молекулярно-генетической диагностике.

Пример 5. Специфичность предлагаемого способа ПЦР-РВ исследовали на образцах мазков из носоглотки 133 пациентов с клиническим диагнозом COVID-19, подтвержденным зарегистрированными в РФ наборами для выявления коронавируса SARS-CoV-2 компании «BIONEER» (Южная Корея) и ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России (Россия). Контрольной группой послужили 69 образцов мазков из носоглотки и ротоглотки здоровых доноров крови, SARS-CoV-2 негативность которых также подтверждена вышеуказанными наборами. Специфичность способа оказалась равной 98,5% (SARS-CoV-2 положительными были 131 из 133 образцов). Результаты части исследований представлены на Фиг 3.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Набор олигонуклеотидов и способ мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для выявления РНК SARS-CoV-2»:

1. https://www.whojnt/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/laboratory-guidance.

2. Патент RU 2720713 «Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса», C12Q 1/6806, опубликован 12.05.2020 г.

3. Патент RU 2727054 «Способ выявления кДНК коронавируса SARS-CoV-2 с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции», C12Q 1/6806, опубликован 17.07.2020 г.

4. Патент US 10689716 «Materials and methods for detecting coronavirus», C12Q 1/68, C12Q1/70, опубликован 23.06.2020 г.

5. Патент RU 2731390 «Тест-система и способ для выявления РНК коронавируса SARS-COV-2, вируса-возбудителя коронавирусного заболевания 2019 COVID-19, методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Варианты)», C12Q 1/6806, опубликован 02.09.2020 г.

6. Barber RD, Harmer DW, Coleman RA, Clark BJ. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiol Genomics. 2005;21(3):3 89-395. doi:10.1152/physiolgenomics.00025.2005.

7. Ishige T, Murata S, Taniguchi T, Miyabe A, Kitamura K, Kawasaki K, Nishimura M, Igari H, Matsushita K. Highly sensitive detection of SARS-CoV-2 RNA by multiplex rRT-PCR for molecular diagnosis of COVID-19 by clinical laboratories. Clin Chim Acta. 2020 Aug;507:139-142. doi: 10.1016/j.cca.2020.04.023. Epub 2020 Apr 23. PMID: 32335089; PMCID: PMC7179514.

8. Beillard, E., Pallisgaard, N., van der Velden, V. et al. Evaluation of candidate control genes for diagnosis and residual disease detection in leukemic patients using 'real-time' quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RQ-PCR) - a Europe against cancer program. Leukemia 17, 2474-2486 (2003). https://doi.org/10.1038/sj.leu.2403136.

--->

Перечень последовательностей

<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный

медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства

здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ гематологии" Минздрава

России)

Federal Governmental Budgetary Institution «National Research Center for

Hematology»

<120> Набор олигонуклеотидов и способ мультиплексной полимеразной цепной

реакции в режиме реального времени для выявления РНК SARS-CoV-2

<160> 9

<210> 1

<211> 24

<212> RNA

<213> Betacoronavirus

<400> 1

TGATAGTCAA CAAACTGTTG GTCA

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> Betacoronavirus

<400> 2

CTGAACAACT GGTGTAAGTT CC

<210> 3

<211> 23

<212> RNA

<213> Betacoronavirus

<400> 3

ACGGCAGTGA GGACAATCAG ACA

<210> 4

<211> 20

<212> RNA

<213> Betacoronavirus

<400> 4

ACCCGCAATC CTGCTAACAA

<210> 5

<211> 20

<212> RNA

<213> Betacoronavirus

<400> 5

CTGCGTAGAA GCCTTTTGGC

<210> 6

<211> 25

<212> RNA

<213> Betacoronavirus

<400> 6

TGCTGCAATC GTGCTACAAC TTCCT

<210> 7

<211> 20

<212> RNA

<213> Homo

<400> 7

CGCTGAGATA CGAAGGGAGG

<210> 8

<211> 20

<212> RNA

<213> Homo

<400> 8

ATGATGAACC AACTCGGCCA

<210> 9

<211> 20

<212> RNA

<213> Homo

<400> 9

CGTCTCCTCC GAGAGCCGCT

<---

1. Набор синтетических олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов, комплементарных нуклеотидной последовательности генов ORF1ab и N коронавируса SARS-CoV-2, для использования в способе мультиплексной ПЦР-РВ для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2:

ORF1ab_Fv: 5'-TGATAGTCAACAAACTGTTGGTCA-3';

ORF1ab_Rv: 5'-CTGAACAACTGGTGTAAGTTCC-3';

ORF1ab_Pr: FAM 5'-ACGGCAGTGAGGACAATCAGACA-3' BQH1;

N_Fv: 5'-ACCCGCAATCCTGCTAACAA-3';

N_Rv: 5'-CTGCGTAGAAGCCTTTTGGC-3';

N_Pr: ROX 5'-TGCTGCAATCGTGCTACAACTTCCT-3' BQH2.

2. Способ мультиплексной ПЦР-РВ для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 с использованием набора синтетических олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов по п.1, 10х ПЦР буфера, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, Taq-полимеразы, MqCl₂, внутреннего контроля качества и количества исследуемого образца в виде, при этом реакция проходит в одной пробирке с кДНК в объеме 10 мкл анализируемого синтетических олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентного зонда, комплементарных нуклеотидной последовательности человнческой мРНК гена ABL1:

ABL1_Fv: 5'-CGCTGAGATACGAAGGGAGG-3';

ABL1_Rv: 5'-ATGATGAACCAACTCGGCCA-3';

ABL1_Pr: R6G 5'-CGTCTCCTCCGAGAGCCGCT-3' BQH1;

характеризующийся также тем, что реакция проходит в одной пробирке.