Универсальный рекомбинантный вектор psvo и плазмидные генетические конструкции psvo-gluc и psvo-vic, обеспечивающие синтез и секрецию целевых белков в клетках дрожжей вида kluyveromyces lactis и полученные с использованием указанного универсального вектора

Авторы патента:

Ельчанинов Вадим Валентинович (RU)

Щербаков Дмитрий Николаевич (RU)

Беленькая Светлана Валерьевна (RU)

Бондарь Александр Анатольевич (RU)

C12N15/86 - вирусные векторы

C12N15/00 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

Владельцы патента RU 2754229:

Общество с ограниченной ответственностью "Малое инновационное предприятие "Сырные технологии" (ООО "МИП "Сырные технологии") (RU)

Изобретение относится к молекулярной генетике и биотехнологии, а именно к универсальному рекомбинантному вектору, который используют для получения плазмидных генетических конструкций, обеспечивающих синтез и секрецию целевых рекомбинантных белков в клетках дрожжей вида Kluyveromyces lactis. ниверсальный рекомбинантный вектор pSVO имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 1 и содержит элементы в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 1г. Плазмидная генетическая конструкция pSVO-Gluc обеспечивает синтез и секрецию целевого белка люциферазы из Gaussia princeps в клетках дрожжей вида Kluyveromyces lactis, имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 2 и содержит элементы в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 2. Плазмидная генетическая конструкция pSVO-Vic обеспечивает синтез и секрецию целевого белка прохимозина альпака в клетках дрожжей вида Kluyveromyces lactis, имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 3 и содержит элементы в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 5. Техническим результатом заявляемого изобретения является создание универсального рекомбинантного вектора pSVO и плазмидных генетических конструкций pSVO-Gluc и pSVO-Vic, обеспечивающих синтез и секрецию целевых белков в клетках дрожжей вида Kluyveromyces lactis и полученных с использованием указанного универсального вектора. 3 н.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 3 пр.

Изобретение относится к универсальному рекомбинантному вектору, который используют для получения плазмидных генетических конструкций, обеспечивающих синтез и секрецию целевых рекомбинантных белков в клетках дрожжей вида Kluyveromyces lactis и может быть использовано в молекулярной генетике и биотехнологии.

Уровень техники. Более 30 лет дрожжи Kluyveromyces lactis использовались для продукции гетерологичных белков (Van Ooyen A. J. J. et al. Heterologous protein production in the yeast Kluyveromyces lactis. FEMS yeast research 2006; 6; 3: 381-392; Spohner S.C. et al. Kluyveromyces lactis: an emerging tool in biotechnology 2016. J Biotechnol 222:104-116). K. lactis имеет множество свойств, которые делают этот организм привлекательным для продукции белка; он легко поддается генетическим манипуляциям, имеет секвенированный геном (Dujon В. et al. Genome evolution in yeasts. Nature 2004; 430:35-44; Chuzel L. et al. Complete genome sequence of Kluyveromyces lactis strain GG799, a common yeast host for heterologous protein expression. Genome Announc 2017; 5:e00623-17), имеет отрицательный Крэбтри метаболизм (Gonzalez-Siso М.I. et al. Respirofermentative metabolism in Kluyveromyces lactis: insights and perspectives. Enzyme Microb Technol 2000; 26:699-705; Merico A. et al. The oxygen level determines the fermentation pattern in Kluyveromyces lactis. FEMS Yeast Res 2009; 9:749-756). Kluyveromyces lactis можно культивировать с использованием простых питательных сред. На сегодняшний момент при помощи в K. lactis получено более 100 гетерологичных белков (Van Ooyen A. J. J. et al. Heterologous protein production in the yeast Kluyveromyces lactis. FEMS yeast research 2006; 6; 3: 381-392; Spohner S. С.et al. Kluyveromyces lactis: an emerging tool in biotechnology 2016. J Biotechnol 222:104-116). Кроме того, K. lactis имеет долгую историю безопасного использования в пищевой промышленности и считается безопасным (GRAS) микроорганизмом (Coenen Т.М. et al. Safety evaluation of a lactase enzyme preparation derived from Kluyveromyces lactis. Food Chem Toxicol 2000; 38:671-677).

В совокупности эти особенности сделали K. lactis удобной дрожжевой системой продукции белков как для лабораторных, так и для промышленных процессов. Несмотря на долгую историю этого организма как системы экспрессии, только небольшое количество промоторов было использовано для экспрессии чужеродные гены в K. lactis (Van Ooyen A. J. J. et al. Heterologous protein production in the yeast Kluyveromyces lactis. FEMS yeast research 2006; 6; 3: 381-392; Spohner S.C. et al. Kluyveromyces lactis: an emerging tool in biotechnology 2016. J Biotechnol 222:104-116). Кроме того, для этих дрожжей не описано ни одного регулируемого промотора, который функционирует с такой же эффективностью и жесткой регуляцией, как индуцируемый метанолом промотор АОХ1 (Tschopp J. F. et al. Expression of the lacZ gene from two methanol-regulated promoters in Pichia pastoris. Nucleic Acids Res 1987; 15:3859-3876) из Pichia pastoris. Чаще всего для экспрессии чужеродных генов в K. lactis используют промотор LAC4 (PLAC4), сильный промотор, регулирующий экспрессию гена эндогенной - галактозидазы (Lac4p) в ответ на добавление лактозы или галактозы. Таким образом, все еще существует потребность в разработке вектора в обеспечивающего эффективную и регулируемую экспрессию генов, для производства гетерологичных белков в любом масштабе.

Ближайшие аналоги. Известна коммерческая плазмида pKLAC2. компании NEB (США), представляющая собой экспрессионный вектор, способный к репликации как в Е. coli, так и к стабильной интеграции в геном дрожжей Kluyveromyces lactis. pKLAC2 содержит универсальный сайт множественного клонирования (MCS). После трансформации компетентных клеток K. lactis pKLAC2 интегрируется в хромосому K. lactis в локусе LAC4. Для отбора клонов используется селекционный маркер ацетамидаза (amdS), синтез которого находится под контролем дрожжевого промотора ADH1. Ацетамидаза, синтезируемая дрожжами при интеграции фрагмента pKLAC2 в хромосому, позволяет трансформированным клеткам использовать ацетамид в качестве источника азота в селективной питательной среде. Сайт множественного клонирования (MCS) расположен так, чтобы сделать возможным трансляционное слияние сигнальной последовательности полового α-фактора (α-MF) с N-концом рекомбинантного белка-мишени. Это адресует химерный белок в общий секреторный путь, но α-MF отщепляется в аппарате Гольджи протеазой Kех, что приводит к секреции только рекомбинантного белка. Синтез рекомбинантного слитого белка находится под контролем промотора LAC4 K. lactis.

Несмотря на перечисленные преимущества данный вектор имеет ряд недостатков. В частности, как говорилось выше, интеграция целевого гена под контроль дрожжевого промотера LAC4 может приводить к значительному фоновому синтезу целевого белка в отсутствии индуктора, что может быть критическим в случае экспрессии генов токсичных белков. Кроме того, промотор LAC4 не является автоиндуцибильным, что вносит дополнительную стадию при культивировании целевого белка. Еще одним недостатком данного вектора является использование гена ацетамидазы в качестве селективного маркера. Питательная среда YEB, используемая для селекции клонов K. lactis имеет высокую стоимость, и не позволяет регулировать количество селективного маркера, вносимого в среду.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является плазмида pUC19/Pr₃₅₀ описанная в статье Hassan Sakhtah и его коллег (Sakhtah, Н., Behler, J., АН-Reynolds, A., Causey, Т.В., Vainauskas, S., & Taron, С.Н. А novel regulated hybrid promoter that permits autoinduction of heterologous protein expression in Kluyveromyces lactis. 2019. Applied and environmental microbiology. 85(14), e00542-19), спроектированная на основе коммерческого вектора pUC19. Данный экспрессионный вектор (pUC19/Pr₃₅₀) способен к репликации в Е. coli и к стабильной интеграции в геном дрожжей Kluyveromyces lactis, различных гетерологических белков. Используемый для контроля экспрессии рекомбинантных генов гибридный промотер Р₃₅₀обеспечивает автоиндукцию синтеза белка в K. lactis.

Однако кроме нового промотера, остальные структурные элементы плазмиды pUC19/Pr₃₅₀ не отличается от коммерческого вектора pKLAC2, что налагает те же ограничения в ее использовании. Так использование в качестве сигнальной последовательности полового α-фактора (α-MF) имеет ряд недостатков. Этот сигнал секреции способствует посттрансляционной транслокации в эндоплазматический ретикулум (ЭР), поэтому белки, скрадывающиеся в цитозоле, могут неэффективно транслоцироваться и как следствие плохо секретироваться. Кроме того, если белок самоассоциируется, про-область α-фактора потенциально может вызывать агрегацию, тем самым препятствуя экспорту из ЭР.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание универсального рекомбинантного вектора pSVO и плазмидных генетических конструкций pSVO-Gluc и pSVO-Vic, обеспечивающих синтез и секрецию целевых белков в клетках дрожжей вида Kluyveromyces lactis и полученные с использованием указанного универсального вектора, которые лишены недостатков прототипа.

Указанный технический результат достигается тем, что универсальный рекомбинантный вектор pSVO для создания плазмидных генетических конструкций, обеспечивающих синтез и секрецию целевых белков в клетках дрожжей вида Kluyveromyces lactis имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 1 и содержит в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 1г, следующие элементы:

- автоиндуцибильный гибридный промотор с 341 по 1017, включающий коровую последовательность промотера глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAP) и регуляторную последовательность промотера изоцитрат лиазы (ICL);

- гибридную сигнальную последовательность (Ost2) для обеспечения секреции белка во внеклеточное пространство с 1018 по 1287;

- регион встройки целевого гена (MCS) с 1297 по 1353;

- терминаторную область гена S. Cerevisiae (CYC) с 1360 по 1638;

- промотер гена алкогольдегидрогеназы (ADH1 promoter) с 1647 по 2339;

- ген устойчивости к зеоцину (BleoR) с 2360 по 2734;

- 5' последовательность гена промотера изоцитрат лиазы (ICL-5') с 2735 по 3694;

- ориджин репликации (ori) с 4504 по 5092;

- ген устойчивости к ампициллину (AmpR) с 5263 по 6122.

Указанный технический результат достигается также тем, что плазмидная генетическая конструкция pSVO-Gluc обеспечивает синтез и секрецию целевого белка люциферазы из Gaussia princeps в клетках дрожжей вида Kluyveromyces lactis, имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 2 и содержит в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 2, следующие элементы:

- последовательность гена люциферазы из Gaussia princeps (Glue) с 1300 по 1803;

- терминаторную область гена S. cerevisiae (CYC) с 1813 по 2091;

- промотер гена алкогольдегидрогеназы (ADH1 promoter) с 2100 по 2792;

- ген устойчивости к зеоцину (BleoR) с 2813 по 3187;

- 5' последовательность гена промотера изоцитрат лиазы (ICL-5') с 3188 по 4147;

- ориджин репликации (ori) с 4957 по 5545;

- ген устойчивость к ампициллину (AmpR) с 5716 по 6576.

Указанный технический результат достигается также тем, что плазмидная генетическая конструкция pSVO-Vic обеспечивает синтез и секрецию целевого белка прохимозина альпака в клетках дрожжей вида Kluyveromyces lactis, имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 3 и содержит в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 4, следующие элементы:

- гибридная сигнальная последовательность (Ost2) для обеспечения секреции белка во внеклеточное пространство с 1018 по 1287;

- последовательность гена прохимозина альпака (Vic) с 1300 по 2397;

- терминаторную область гена S. Cerevisiae (CYC) с 2405 по 2682;

- промотер гена алкогольдегидрогеназы (ADH1 promoter) с 2691 по 3383;

- ген устойчивости к зеоцину (BleoR) с 3404 по 3778;

- 5' последовательность гена промотера изоцитрат лиазы (ICL-5') с 3779 по 4738;

- ориджин репликации (ori) с 5548 по 6136;

- ген устойчивость к ампициллину (AmpR) с 6307 по 7167.

Заявляемые плазмиды лишены недостатков прототипа т.к. в качестве сигнальной последовательности в них использован гибридный сигнал секреции Ost2, который по сравнению с сигналом α-MF увеличивает секрецию гетерогенных белков до 20 раз (Barrero, J.J., Casler, J.С, Valero, F., Ferrer, P., & Glick, B.S. An improved secretion signal enhances the secretion of model proteins from Pichia pastoris. Microbial cell factories. 2018; 17(1), 161).

Автоиндуцибильный гибридный промотер, включающий коровую последовательность промотера глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAP1) и регуляторную последовательность промотера изоцитрат лиазы (ICL1) с одной стороны, обеспечивает эффективный синтез целевой РНК, а с другой - жестко подавляет экспрессию их генов в отсутствии индукции. Использованный в векторе гена устойчивости к зеоцину (BleoR), позволяет регулировать количество вносимого в среду селективного маркера, для более эффективного отбора многокопийных клонов. В приведенных примерах показано, что заявляемый универсальный плазмидный вектор pSVO позволяет создавать целевые плазмиды (на примерах pSVO-Gluc и pSVO-Vic), которые обеспечивают эффективный синтез целевых белков, с жестким контролем до момента автоиндукции.

Изобретение поясняется следующими графическими материалами. На фиг. 1, (А, Б, В, Г) приведена схема конструирования универсального рекомбинантного вектора pSVO. На фиг. 2 изображена электрофореграмма продуктов амплификации вектора pSVO-Vic (дорожка 1) и вектора pSVO-Gluc (дорожка 2). На фиг. 3 представлен рекомбинантный вектор pSVO-Gluc для экспрессии гена люциферацы из Gaussia princeps в клетках K. lactis. На фиг. 4 приведены данные о люциферазной активности белка, продуцируемого плазмидой pSVO-Vic в клетках K. lactis. На фиг. 5 представлен рекомбинантный вектор pSVO-Vic для экспрессии гена прохимозина альпака в клетках K. lactis.

Ниже приведены примеры 1-3 конкретного осуществление изобретения.

Пример 1. Конструирование вектора pSVO.

Схема конструирования заявляемого изобретения приведена на Фиг. 1.

Последовательность с) гибридного лидерного сигнала Ost2 была синтезирована на заказ. Остальные составные части сконструированного вектора были амплифицированны с использованием спроектированных олигонуклеотидов (таблица 1).

С матрицы к ДНК K. lactis были получены амликоны: а) 3'-часть ICL1 промотера, b) 5'-часть GAP промотера и g) 5'-часть ICL1 промотера. С матрицы геномной ДНК S. cerevisiae получен ампликон i) терминаторной области гена CYC1.

С матрицы вектора pKLAC2 получены ампликоны гена f) алкогольдегидрогеназы и ген ацетамидазы amdS (Фиг. la). Реакционные смесь для ПНР на 50 мкл содержала: 1 мМ раствор dNTP; 100 пМ каждого из праймеров; 5 мкл 10× буфера Pfu ДНК полимеразы; 0,5 ед.а. Рfu ДНК полимеразы; 20 нгр матричной ДНК. Реакционную смесь денатурировали при 95°С в течении 10 минут, с последующей амплификацией (25 циклов), состоящей из денатурации при 94°С в течении 30 сек, отжига при 59°С в течении 30 секунд и элонгации при 72°С продолжительность рассчитывалась из расчета 1 минута на 1000 п. н. После завершения амплификации достройка концов ДНК осуществлялась при 72°С в течении 5 минут. Реакции проводили на ПЦР-амплификаторе (ООО «БИС-Н», Россия).

Далее полученные части были объединены с использованием отжига в три фрагмента по следующей схеме 1: а) b) с) 2: i) 3: f) g) (Фиг. 1б). Полученные фрагменты были встроены в челночный вектор pJet1.2 с целью проверки целостности нуклеотидных последовательностей. После проверки вектора обрабатывали ферментами CciNI, ВаmHI, XmaI, PspXI (Фиг. 1в) для их одновременной встройки в состав челночного вектора pjet1.2. В результате на основе коммерческого вектора pJet1.2 был получен вектор pSVO (Фиг. 1г), имеющий следующие структурные элементы:

- регион встройки целевого гена (MCS) с 1297 по 1353;

- терминаторную область гена S. Cerevisiae (CYC) с 1360 по 1638;

- промотер гена алкогольдегидрогеназы (ADH1 promoter) с 1647 по 2339;

- ген устойчивости к зеоцину (BleoR) с 2360 по 2734;

- 5' последовательность гена промотера изоцитрат лиазы (ICL-5') с 2735 по 3694;

- ориджин репликации (ori) с 4504 по 5092;

- ген устойчивость к ампициллину (AmpR) с 5263 по 6122.

Сконструированный универсальный вектор pSVO далее был протестирован на способность к экспрессии и секреции белков в системе Kluyveromyces lactis, путем встройки генов целевых ферментов, которые входят в состав разработанных плазмидных векторов pSVO-Gluc и pSVO-Vic, а также определена их специфическая активность в полученной культуральной жидкости.

Пример 2. Конструирование вектора pSVO-Gluc и детекция экспрессии гена люциферазы из Gaussia princeps в культуральной среде после трансформации клеток Kluyveromyces lactis сконструированной плазмидой. Для конструирования вектора pSVO-Gluc гена люциферазы из Gaussia princeps амплифицировали с матрицы плазмиды pCDH-EFl-GausLuc-IRES-copGFP с использованием спроектированных праймеров:

- Gluc-G-F (5'-aaaaaaggatccaaaagaaagcccaccgagaacaacgaag-3') и

- Gluc-G-R (5'-atcgacaaaggaaaaggggcctgtcctaggttagtcaccaccggcccccttg-3'). После продукт ПЦР лигировали в регион встройки целевого гена вектора pSVO по уникальным сайтам BamHI/AspA2I, фирмы «ЗАО Сибэнзим, Россия», согласно рекомендациям производителя. В результате был получен вектор pSVO-Gluc (Фиг. 3), содержащий следующие структурные элементы:

- последовательность гена люцифирацы из Gaussia princeps (Gluc) с 1300 по 1803;

- терминаторную область гена S. cerevisiae (CYC) с 1813 по 2091;

- промотер гена алкогольдегидрогеназы (ADH1 promoter) с 2100 по 2792;

- ген устойчивости к зеоцину (BleoR) с 2813по 3187;

- 5' последовательность гена промотера изоцитрат лиазы (ICL-5') с 3188 по 4147;

- ориджин репликации (ori) с 4957 по 5545;

- ген устойчивость к ампициллину (AmpR) с 5716 по 6576.

Сконструированным вектором pSVO-Gluc трансформировали электрокомпетентные клетки K. lactis штамма GG799, для этого проводили ПЦР с использованием спроектированных праймеров:

- J-F (5' -cgactcactatagggagagcggc-3') и

- J-R (5'-aagaacatcgattttccatggcag-3')

Затем получений продукт ПЦР (Фиг 2, дорожка 2) в количестве 1 мкг был встроен в клетки K. lactis штамма GG799, путем электропорации с использованием прибора MicroPulser Electroporator (BioRad, США), согласно рекомендациям производителя. После электропорации клетки высевали на агарезированную среду YPDS содержащую 500, 1000, 2000 мкг/мл зеоцина в качестве селективного маркера и культивировли в термостате при 30°С в течении 72 часов. Далее по 3 индивидуальные колонии с каждой чашки переносили в жидкую среду YEP содержащей 2%, и растили в течение ночи на орбитальном шейкере при 30°С и 220 об/мин. Инокулят, в соотношении 1:100, переносили в колбу Эрленмейера, содержащую среду YEP содержащей 2% и культивировали в течении четырех дней при 30°С и 220 об/мин, каждый день снимая пробы культуральной жидкости. Затем полученные пробы анализировали на наличие люциферазной активности с использованием в качестве субстрата нативного коэлентеразина (NanoLight Technologies, США). В качестве положительного контроля выступала культуральная среда клеток HEK293FT, трансфецированных плазмидой pCDH-EF1-GausLuc-IRES-copGFP. В качестве отрицательного, культуральная жидкость K. lactis штамма GG799. Данные о люциферазной активности представлены на фиг. 4.

Пример 3. Конструирование вектора pSVO-Vic и детекция молокосвертывающей активности (МА) в культуральной среде после трансформации клеток Kluyveromyces lactis сконструированной плазмидой.

Для конструирования вектора pSVO-Vic последовательность гена прохимозина альпака была синтезирована на заказ в составе челночного вектора pGH и встроена в вектор pSVO по уникальным сайтам BamHI/AspA2I. В результате был получен вектор pSVO-Vic (Фиг. 5), содержащий следующие структурные элементы:

- последовательность гена прохимозина альпака (Vic) с 1300 по 2397;

- терминаторную область гена S. Cerevisiae (CYC) с 2405 по 2682;

- промотер гена алкогольдегидрогеназы (ADH1 promoter) с 2691 по 3383;

- ген устойчивости к зеоцину (BleoR) с 3404 по 3778;

- 5' последовательность гена промотера изоцитрат лиазы (ICL-5') с 3779 по 4738;

- ориджин репликации (ori) с 5548 по 6136;

- ген устойчивость к ампициллину (AmpR) с 6307 по 7167.

Сконструированным вектором pSVO-Vic проводили электропорацию клеток K. lactis штамма GG799. Для этого проводили ПЦР с использованием спроектированных праймеров:

- J-F (5'-cgactcactatagggagagcggc-3')

- J-R (5'-aagaacatcgattttccatggcag-3')

Далее в клетки K. lactis штамма GG799 был встроен полученый продукт ПЦР (Фиг 2, дорожка 1) в количестве 1 мкг, путем электропорации с использованием прибора MicroPulser Electroporator (BioRad, США), согласно рекомендациям производителя. Культивирование полученных индивидуальных колоний, проводили как описано в примере 2. После получения образцов культуральной среды в них определяли молокосвертываюшую активность (МА) для анализа наличия целевого белка (прохимозина альпака) в ферментативно-активной форме. В начале проводили процедуру активации полученных образцов культуральной среды. Для этого в образцы, при постоянном перемешивании, вносили 2,0М НСl до рН 3,0. Останавливали перемешивание и инкубировали смесь при рН 3,0±0,1 в течение 2 часов. По истечении времени инкубации, доводили рН образца до 5,8±0,1, используя 0,5М NaOH. После в активированном таким способом образце определяли МА.

Для определения МА использовали стандартизированный сухой молочный субстрат ("Субстрат СТ.3"), выпускаемый ВНИИМС (г. Углич). Для подготовки к работе 25,0 гр. субстрата растворяли в 230 мл 0,01N СаСl2 в течение 1 ч при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Доводили рН полученной смеси до 6,5±0,1, используя 1,0М NaOH. Конечный объем раствора доводили до 250 мл 0,01 N СаСl2. Активность исследуемых образцов определяли относительно отраслевого контрольного образца сычужного фермента (ОКО СФ), аттестованного по МА, выпускаемого ОАО "Московский завод сычужного фермента". Для подготовки к работе к 1,0 г ОКО СФ добавляли 80 мл дистиллированной воды, перемешивали 30 минут при 20-25°С, доводили объем смеси до 100 мл и выдерживали на водяной бане при 35°С в течение 15 мин. Перед определением МА исследуемые образцы выдерживали 15 минут при 35°С.

Определение МА проводили при 35°С. В сухую стеклянную пробирку вносили 2,5 мл раствора стандартизированного субстрата и прогревали при 35°С в течение 5 минут. В пробирку с субстратом добавляли 0,25 мл исследуемого образца, включали секундомер, содержимое пробирки сразу же тщательно перемешивали. Продолжительность свертывания субстрата отмечали по секундомеру с момента внесения образца до появления первых хлопьев коагуляции субстрата. Появление хлопьев проверяли путем периодического нанесения стеклянной палочкой капли реакционной смеси на стенку пробирки. Значения молокосвертывающей активности (МА) приведены в таблице 2.

Полученные в приведенных выше примерах 2-3 результаты показывают, что с использованием универсального рекомбинантного вектора pSVO удалось получить целевые плазмидные вектора pSVO-Gluc и pSVO-Vic, обеспечивающие синтез во внеклеточное пространство гетерогенных белков после трансформации клеток K. lactis. При этом следует отметить что использование в сконструированных векторах гена устойчивости к блеомецину позволяет с повышением концентрации антибиотика отбирать многокопийные клоны рекомбинантных клеток K. lactis. Использование гибридного промотера позволяет полностью подавить экспрессию целевого гена до момента автоиндукции.

--->

Перечень последовательностей

<110> Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр

вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере

защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Роспотребнадзора)

<120> Универсальный рекомбинантный вектор pSVO и плазмидные генетические

конструкции pSVO-Gluc и pSVO-Vic, обеспечивающие синтез и секрецию целевых

белков в клетках дрожжей вида Kluyveromyces lactis и полученные с

использованием указанного универсального вектора

<160> SEQ ID NO: 3

<210> SEQ ID NO: 1

<211> 6315

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<223> Нуклеотидная последовательность вектора pSVO

<400> 1

1 gcccctgcag ccgaattata ttatttttgc caaataattt ttaacaaaag ctctgaagtc

61 ttcttcattt aaattcttag atgatacttc atctggaaaa ttgtcccaat tagtagcatc

121 acgctgtgag taagttctaa accatttttt tattgttgta ttatctctaa tcttactact

181 cgatgagttt tcggtattat ctctattttt aacttggagc aggttccatt cattgttttt

241 ttcatcatag tgaataaaat caactgcttt aacacttgtg cctgaacacc atatccatcc

301 ggcgtaatac gactcactat agggagagcg gccgcaattc atctagataa tcgggtatga

361 ttaacagcga catagctatg tgattatctg ccccattact taaagtaagg tttcactttc

421 ggactaagga cgaatgacac aagacacaga acgctcacac ggttgaaaca ttttttttcc

481 tgatcctttt gaccctgttt gttgtccctc ttttacgatg ggagaattga atcatccgcc

541 attaaaccga atgtgatagt ttttccagtt tttcttcccc tccctacatc catttctaaa

601 gaattcacgg acattttcgc atgaatgggg aaagttgact cagttgactc tatttggttc

661 ctcagcctcg actgctttgc ttcatcttct ctatgggcca atgagctaat gagcacaatg

721 tgctgcgaaa taaagggata tctaatttat attattacat tataatatgt actagtgtgg

781 ttattggtaa ttgtacttaa ttttgatata taaagggtgg atctttttca ttttgaatca

841 gaattggaat tgcaacttgt ctcttgtcac tattacttaa tagtaattat atttcttatt

901 aacctttttt ttaagtcaaa acaccaagga caagaactac tcttcaaagg tatttcaagt

961 tatcatacgt ctcacacacg cttcacagtt tcaagtaaaa aaaaagaata ttacacaatg

1021 agacaagttt ggttctcttg gatcgttggt ttgttcttgt gtttcttcaa cgtttcttct

1081 gctgctccag ttaacactac tactgaagat gagactgctc aaattccagc tgaagctgtt

1141 attggttact ctgatttgga aggtgatttc gatgttgctg ttttgccatt ctctaactca

1201 actaacaacg gtttgttgtt catcaacacc actattgctt ctatcgctgc taaagaagag

1261 ggagtttctt tggaaaaaag agaggctgga tccaaaagag aggctgaagc tagaagagct

1321 catatgtcca tgggcggccg cgatatcgtc gaccctagga caggcccctt ttcctttgtc

1381 gatatcatgt aattagttat gtcacgctta cattcacgcc ctcctcccac atccgctcta

1441 accgaaaagg aaggagttag acaacctgaa gtctaggtcc ctatttattt tttttaatag

1501 ttatgttagt attaagaacg ttatttatat ttcaaatttt tctttttttt ctgtacaaac

1561 gcgtgtacgc atgtaacatt atactgaaaa ccttgcttga gaaggttttg ggacgctcga

1621 aggctttaat ttgcaagcag cccgggtgtt tccgggtgta caatatggac ttcctctttt

1681 ctggcaacca aacccataca tcgggattcc tataatacct tcgttggtct ccctaacatg

1741 taggtggcgg aggggagata tacaatagaa cagataccag acaagacata atgggctaaa

1801 caagactaca ccaattacac tgcctcattg atggtggtac ataacgaact aatactgtag

1861 ccctagactt gatagccatc atcatatcga agtttcacta ccctttttcc atttgccatc

1921 tattgaagta ataataggcg catgcaactt cttttctttt tttttctttt ctctctcccc

1981 cgttgttgtc tcaccatatc cgcaatgaca aaaaaatgat ggaagacact aaaggaaaaa

2041 attaacgaca aagacagcac caacagatgt cgttgttcca gagctgatga ggggtatctc

2101 gaagcacacg aaactttttc cttccttcat tcacgcacac tactctctaa tgagcaacgg

2161 tatacggcct tccttccagt tacttgaatt tgaaataaaa aaaagtttgc tgtcttgcta

2221 tcaagtataa atagacctgc aattattaat cttttgtttc ctcgtcattg ttctcgttcc

2281 ctttcttcct tgtttctttt tctgcacaat atttcaagct ataccaagca tacaatcaag

2341 caattccaga tctgccacca tggccaagtt gaccagtgcc gttccggtgc tcaccgcgcg

2401 cgacgtcgcc ggagcggtcg agttctggac cgaccggctc gggttctccc gggacttcgt

2461 ggaggacgac ttcgccggtg tggtccggga cgacgtgacc ctgttcatca gcgcggtcca

2521 ggaccaggtg gtgccggaca acaccctggc ctgggtgtgg gtgcgcggcc tggacgagct

2581 gtacgccgag tggtcggagg tcgtgtccac gaacttccgg gacgcctccg ggccggccat

2641 gaccgagatc ggcgagcagc cgtgggggcg ggagttcgcc ctgcgcgacc cggccggcaa

2701 ctgcgtgcac ttcgtggccg aggagcagga ctgactttta cctttgttgt cttatgtgtt

2761 tttactccaa cacccctaac cctaattcca catagatcca accctaattc cgcagaggta

2821 caaataaaca caaccagcta gagatagcac accaccatga ggctaggttg cacataacac

2881 accaccgaat tttttgctac ccacttttct tcctctttgt ctctatacca acccatttag

2941 tacccacaaa taaactctgg ggtgtacggt accaagcttc gccaacgaga atgcaacaaa

3001 tgatgaatat actgtgatgt agtgattgct cattgaataa gtagcgttat tcgaagtaaa

3061 gaatagaaaa tcacaagact ggggttaaag ctgcatcaaa taggcaaatg tgcggcgtat

3121 cgtggtttgc gcgcacggat tatctaacaa gtttttccac cacttaaaaa ttgagggagc

3181 gttccgcata attataattg ctttttttgc tgacatcggc atcctgactt cttcttttgt

3241 agtgctctat ttgtgagtgg tgttaaaaaa acattcaaag tggcatgcta ttctaaggca

3301 atatggaaac atgagagttc ctctttgaat atctggagct ccagcctatt aggcaagttt

3361 tgtcagactg cttgtatgga agaggttttc gggaaaccat attcgactcg gtagagtaag

3421 agatatgtct gatttatcct catatgaaag gtttttaaga atataagaat caagtatcga

3481 aatatttgca aaattttggc actatggccg agtggttaag gcgacagact tgaaatctgt

3541 tgggctctgc ccgcgctggt tcaaatcctg ctggtgtcgt tattttttgg aaataacttt

3601 ttttaactag acaataagcg tttagccggg taatatttat ttatatatat cggctccttc

3661 catggagctg ataccgtaag ctcacctaat ctgcgaattg ctcgagtttt ttatctttct

3721 agaagatctc ctacaatatt ctcagctgcc atggaaaatc gatgttcttc ttttattctc

3781 tcaagatttt caggctgtat attaaaactt atattaagaa ctatgctaac cacctcatca

3841 ggaaccgttg taggtggcgt gggttttctt ggcaatcgac tctcatgaaa actacgagct

3901 aaatattcaa tatgttcctc ttgaccaact ttattctgca ttttttttga acgaggttta

3961 gagcaagctt caggaaactg agacaggaat tttattaaaa atttaaattt tgaagaaagt

4021 tcagggttaa tagcatccat tttttgcttt gcaagttcct cagcattctt aacaaaagac

4081 gtctcttttg acatgtttaa agtttaaacc tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat

4141 tccacacatt atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag

4201 ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gccaattgct ttccagtcgg gaaacctgtc

4261 gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg

4321 ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt

4381 atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa

4441 gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc

4501 gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag

4561 gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt

4621 gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg

4681 aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg

4741 ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg

4801 taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac

4861 tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg

4921 gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt

4981 taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg

5041 tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc

5101 tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt

5161 ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt

5221 taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag

5281 tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt

5341 cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc

5401 gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc

5461 cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg

5521 ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac

5581 aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg

5641 atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc

5701 tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact

5761 gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc

5821 aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat

5881 acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc

5941 ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac

6001 tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa

6061 aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact

6121 catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg

6181 atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg

6241 aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag

6301 gcgtatcacg aggcc

<210> SEQ ID NO: 2

<211> 6768

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<223> Нуклеотидная последовательность вектора pSVO-Gluc

<400> 2