Способ детекции генов метициллин-резистентности meca и mecc у стафилококков

Изобретение относится к биотехнологии, медицине, в частности к клинической лабораторной диагностике, клинической микробиологии, и может быть использовано для диагностики внутрибольничных инфекций, вызванных микроорганизмами рода Staphylococcus, имеющими гены резистентности к метициллину mecA и mecC. Способ детекции генов метициллин-резистентности mecA и mecC у стафилококков включает стадии: a. выделение ДНК микроорганизмов из чистой культуры стафилококка, выращенной на плотной питательной среде, b. амплификации двух фрагментов генома метициллин-резистеных стафилококков mecA и mecC с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), формирование контрольных тестов одновременно с амплификацией; d. детекции продуктов ампдификации методом электрофореза в агарозном геле, e. анализа амплифицированного продукта ПЦР. Заявленный способ использует набор AmpliTaq Gold PCR Master Mix (Applied Biosy stems) и две пары праймеров. Способ позволяет повысить скорость и информативность экспресс-диагностики метициллин-резистентности стафилококков с определением двух генов mecA и mecC, кодирующих изменения таргета бета-лактамов - пенициллин-связывающих белков. 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической лабораторной диагностике, клинической микробиологии, и может быть использовано для диагностики внутрибольничных инфекций, вызванных микроорганизмами рода Staphylococcus, имеющем гены резистентности к метициллину mecA и mecC.

Известна автоматическая система тестирования GeneXpert, производимая компанией Sepheid (Sunnyvale, USA) [Becker K., Denis О., Roisin S., Mellmann A., Idelevich E.A., Knaack D., van Alen S., Kriegeskorte A., Köck R., Schaumburg R, Peters G., Ballhausen В., Burnham C.-A.D. Detection of mecA- and mecC-Positive Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Isolates by the New Xpert MRSA Gen 3 PCR Assay // Journal of Clinical Microbiology. - 2015. - Vol. 54, Issue 1. - C. 180-184 DOI: 10.1128/JCM.02081-15].

Недостатками этого способа являются высокая стоимость исследования, а также закрытый формат тест системы не позволяющий подтвердить присутствие генов резистентности, а именно, провести секвенирование амплифицированного фрагмента.

Известен способ выявления метициллинрезистентности стафилококков «АмплиСенс MRSA-скрин-титр-FL», разработанный компанией Итерлабсервис (Россия), который дает возможность выявления принадлежности исследуемого микроорганизма в коагулазо-негативным стафилококкам либо к золотистому стафилококку, однако в современных условиях данное исследование не является необходимым в связи с развитием технологий быстрого валидного точного и дешевого определения стафилококков, до вида (способ MALDI-TOF масс-спектрометрия). Определение же метициллин-резистентности стафилококков при использовании данного способа ограничено только геном mecA, соответственно, определение гена mecC данным способом невозможно. Также, этот способ является закрытым, то есть не известны используемые праймеры и регионы ДНК, амплифицируемые в ходе ПЦР реакции. Поэтому применение этого способа не позволяет верифицировать обнаружение гена метициллин-резистентности, что можно осуществить при применении секвенирования по Сенгеру.

Известен также способ выделения гена mecA, предназначенный для исследовательских проектов и не являющийся готовой тест-системой. [Cikman A., Aydin М., Gulhan В., Karakecili R, Kurtoglu М.G., Yuksekkaya S., Parlak M., Gultepe В.S., Cicek A.C., Bilman F.В., Ciftci I.H., Kara M., Atmaca S., Ozekinci T. Absence of the mecC gene in methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated from various clinical samples: The first multi-centered study in Turkey. // Journal of Infection and Public Health. - 2019. - Vol. 12, Issue 4. - P. 528-533, https://doi.Org/10.1016/i.jiph.2019.01.063.]

Известен способ определения генотипов золотистого стафилококка (Пат. РФ №2526497, опубл. 10.05.2014 г.), включающий получение чистой культуры микроорганизмов на плотной питательной среде, выделение и амплификацию ДНК возбудителя с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующей детекцией результате в методом электрофореза в агарозном геле, при этом используют мультиплексную ПЦР с четырьмя парами праймеров:

nucl 5'-GCGATTGATGGTGATACGGT-3',

nuc 2 5'-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3,

luk-PV-1 5'-ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA-3',

luk-PV-2 5'-GCATCAAGTGTATTGGATAGCAAAAGC-3',

mecA - 1 5'-ACTGCTATCCACCCTCAAAC-3',

mecA - 2 5'-CTGGTGAAGTTGTAATCTGG-3'

tsstl f - 5'-ACCACCCGTTTTATCGCTTGAACG-3'

tsstlr - 5'-AGCCCTTTGTTGCTTGCGACA-3',

комплементарных к участкам гена внеклеточной термонуклеазы (nuc), гена лейкоцидина Пантона-Валлентайна (pvl), гена белка токсического шока (tst) и гена устойчивости к метициллину (mecA), и генетические группы (генотипы) золотистого стафилококка определяют по наличию или отсутствию генов вирулентности pvl и tst и гена устойчивости к метициллину mecA или их сочетаний.

Однако недостатком известного способа является определение видовой принадлежности только одного вида стафилококков - золотистого стафилококка, что не является необходимым в современных условиях применения метода MALDI-TOF масс-спектрометрии, факторов его вирулентности, что не имеет определяющего значения в клинической практике и в эпидемиологических исследованиях, как правило, основанных на типировании стафилококков методом мультилокусного сиквенс-типирования, а также возможность определения одного, а не двух генов резистентности к метициллину стафилококков.

Технический результат, достигаемый изобретением, заключается в повышении скорости и информативности экспресс-диагностики метициллин-резистентности стафилококков с определением двух генов mecA и mecC, способных кодировать изменения таргета бета-лактамов - пенициллин-связывающих белков.

Заявленный технический результат, достигается за счет того, что в способе детекции генов метициллин-резистентности mecA и mecC у стафилококков выполняют: выделение ДНК микроорганизмов из чистой культуры стафилококка, выращенной на плотной питательной среде, амплификацию двух фрагментов генома метициллин-резистеных стафилококков mecA и mecC с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), формирование контрольных тестов одновременно с амплификацией, детекцию продуктов ампдификации методом электрофореза в агарозном геле с последующим анализом амплифицированного продукта ПЦР, который проводят с амплификацией фрагментов генов устойчивости к стафилококкам, с использованием праймеров следующего состава:

mecA-F 5' - AACAGGAGAATTATTAGCACTTGTAAG - 3'

mecA-R 5' - CCACTTCATATCTTGTAACG - 3'

mecC-F 5' - GAAAAAAAGGCTTAGAACGCCTC - 3'

mecC-R 5' - GAAGATCTTTTCCGTTTTCAGC - 3',

с последующим выявлением генов устойчивости mecA и mecC по наличию амплификатов с размерами соответственно 287 и 138 п.н.

Такая конструкция праймеров позволяет использовать их одновременно в одной реакции, проводимой в формате ПЦР.

Кроме того, предлагаемый способ позволяет выявлять наличие двух генов метициллин-резистентности у стафилококков независимо от их видов и определять их чувствительность к бета-лактамам без проведения культуральных исследований. Важно отметить, что исследование имеет низкую стоимость, а также более высокую скорость, по сравнению с классическими методами определения чувствительности к метициллину у стафилококков. Следует подчеркнуть, что в качестве двух контрольных штаммов (положительный и отрицательный контроль) применяются собственные изоляты.

Способ осуществляют следующим образом.

Для исследования используют колонию чистой культуры стафилококка, выращенную на плотной питательной среде.

1. В микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл добавляют 100 мкл лизирующего буфера PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent.

2. Одиночную колонию диаметром 2 мм помещают в лизирующий буфер.

3. Инкубируют пробирку при 98°C в термостате течение 10 мин.

4. Пробирку помещают в микроцентрифугу, соблюдая принцип равновесия, и центрифугируют при 14000 об/мин в течение 2 мин.

5. Полученый супернатант используют для получения рабочего раствора ДНК (ДНК-матрицы) исследуемых образцов, для чего его разводят деионизированной водой в 100 раз.

Постановка амплификации.

Амплификация проводится двух фрагментов генома метициллин-резистеных стафилококков, а именно генов mecA и mecC, что снижает вероятность ложноотрицательные результаты при выявлении метициллин-резистентности стафилококка: исследование охватывает две мутации мишеней действия бета-лактамов.

Для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) используют набор AmpliTaq Gold PCR Master Mix (Applied Biosystems) и две пары праймеров:

mecA-F 5' - AACAGGAGAATTATTAGCACTTGTAAG - 3'

mecA-R 5' - CCACTTCATATCTTGTAACG - 3'

mecC-F 5' - GAAAAAAAGGCTTAGAACGCCTC - 3'

mecC-R 5' - GAAGATCTTTTCCGTTTTCAGC - 3'

1. Для приготовления смеси для ПЦР реакции общим объемом 10 мкл в пробирку объемом 0,2 мл вносят следующие компоненты:

AmpliTaq Gold Master mix (2x)	5 мкл
Смесь праймеров (концентрация каждого по 5 пикоМ/мкл)	1 мкл
ДНК-матрица	4 мкл

Необходимо при каждой постановке амплификации формировать контрольные тесты. Для этого в 3 пробирки вносят контроли (два положительных и отрицательный), по одному контролю в каждую пробирку. Контроли вносятся в пробирки, содержащие 2 компонента ПЦР-реакции:

AmpliTaq Gold Master mix (2x)	5 мкл
Смесь праймеров (концентрация каждого по 5 пикоМ/мкл)	1 мкл

(вместо ДНК-матрицы). Включение двух контрольных штаммов, несущих гены резистентности mecA и mecC соответственно, позволяет с высокой точностью оценить присутствие конкретной мутации в исследуемом микроорганизме.

2. Содержимое пробирок тщательно перемешивают в микроцентрифуге "вортекс".

3. Далее пробирки помещают в программируемый термоциклер (амплификатор) и проводят 30 циклов амплификации нуклеиновой кислоты (ПЦР) по следующей программе, предусматривающей следующие стадии: с начальной температурой 95°C стадия денатурации, с последующим понижением температуры до 56°C на стадии отжиг и повышения температуры до 72°C на стадии элонгации на цикл ПЦР для 30 циклов.

Детекция продуктов амплификации

Детекцию продуктов амплификации проводят методом электрофореза в агарозном геле с использованием 1,8%-ного агарозного геля.

Электрофорез проводится в течение 30 минут при напряжении 100 вольт. Проводят анализ результата электрофоретического разделения ПЦР-продуктов с помощью прибора Gel Doc XR по наличию светящихся полос и их местоположению по отношению к маркеру длин фрагментов ДНК (таблица 1) с учетом результатов тестирования двух положительных и отрицательного контроля.

Учет и интерпретация результатов.

Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК.

В качестве отрицательного контроля в тест-системе применяется ДНК, выделенная из штамма S. aureus АС 167, чувствительного к метициллину

В качестве положительного контроля наличия гена метициллин-резистентности mecA применяется ДНК, выделенная из штамма S. aureus АС488, имеющего ген резистентности к метициллину mecA.

В качестве положительного контроля наличия гена метициллин-резистентности mecC применяется ДНК, выделенная из штамма S. aureus АТСС ВАА-2312, имеющего ген резистентности к метициллину mecC.

Технология проведения исследования в предлагаемом способе по многим параметрам отличается от известных агалогов: применением иных праймеров и условий проведения реакции, а также методом детекции продуктов амплификации - электрофорезом в агарозном геле определенного состава.

Способ был применен для выявления генов метициллин - резистентности стафилококков у пациентов многопрофильного стационара (ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» МЗ РФ), страдающих различными вариантами внутрибольничных инфекций, вызванных метициллин-резистентными стафилококками, что было подтверждено в ходе исследования чувствительности изолятов к оксациллину и цефокситину.

Общее количество исследованных с помощью предложенной тест-системы штаммов метициллин-резистентного и метициллин-чувствительного стафилококка за время наблюдения составило 125 изолятов из клинических биосубстратов пациентов различных профилей с инфекционными нозокомиальными поражениями различных локализаций и объектов больничной среды.

Примеры реализации способа

Пример 1. Пациент И. Возраст 58 лет. Поступил в Центр им. В.А. Алмазова на хирургическое отделение. Пациенту была выполнена плановая операция. В послеоперационном периоде у пациента развился сепсис. При обследовании у пациента выделили из крови золотистый стафилококк в парных пробах, что свидетельствовало о наличии у пациента бактериемии. Клинические проявления позволяли классифицировать инфекцию как сепсис. Выделенный от пациента штамм золотистого стафилококка был исследован двумя методами; молекулярно-генетическим с применением предлагаемого способа и классическим бактериологическим диско-диффузионным методом с применением диска цефокситина и оценкой диаметра зоны задержки роста по критериям EUCAST. Оба метода подтвердили метициллин-резистентность исследованного штамма. С помощью предлагаемого способа был определен ген метициллин-резистентности mecA.

Пример 2. Пациент М. Возраст 48 лет. Поступил в Центр им. В.А. Алмазова с онкогематологгическим заболеванием. Пациенту была проведена высокодозная химиотерапия, у него развилась постцитостатическая цитопения. На фоне постцитостатической цитопении у пациента развился сепсис, из крови был выделен S. hominis. Для определения чувствительности изолята к метициллину было выполнено два теста: классический бактериологический диско-диффузионный метод и предложенный молекулярно-генетический способ определения генов метициллин-резистентности. Оба метода подтвердили резистентность исследуемого штамма к метициллину, нашим способом было выявлено присутствие гена mecA, кодирующего характерное изменение мишени действия бета-лактамов с образованием пенициллин-связывающего белка 2а.

Пример 3. Пациент Б. Возраст 22 года. Поступил в Центр им. В.А. Алмазова с неврологическим заболеванием. В связи с наличием иммунодефицитного состояния у пациента развился сепсис. При бактериологическом исследовании крови был выделен возбудитель - S. haemolyticus. Для определения чувствительности изолята к метициллину было выполнено два теста: классический бактериологический диско-диффузионный метод и предложенный молекулярно-генетический способ определения генов метициллин-резистентности. Оба метода подтвердили резистентность исследуемого штамма к метициллину, нашим способом было выявлено присутствие гена mecA, кодирующего образование пенициллин-связывающего белка 2а.

Таким образом, предлагаемый способ подтверждает достижение технического результата, заключающегося в повышении скорости и информативности экспресс-диагностики метициллин-резистентности стафилококков с определением двух генов mecA и mecC, кодирующих изменения таргета бета-лактамов - пенициллин-связывающих белков, промышленно применим.

1. Способ детекции генов метициллин-резистентности mесА и mесС у стафилококков, включающий получение чистой культуры микроорганизмов на плотной питательной среде, выделение и амплификацию ДНК возбудителя с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующей детекцией результатов методом электрофореза в агарозном геле, отличающийся тем, что используют праймеры в следующем составе:

mecA-F 5' - AACAGGAGAATTATTAGCACTTGTAAG - 3'

mecA-R 5' - CCACTTCATATCTTGTAACG - 3'

mecC-F 5' - GAAAAAAAGGCTTAGAACGCCTC - 3'

mecC-R 5' - GAAGATCTTTTCCGTTTTCAGC - 3',

с последующим выявлением генов устойчивости mecA и mecC по наличию ампликонов с размерами соответственно 287 и 138 п.н.

2. Способ по п. 1, где в качестве лизирующего буфера при выделении ДНК используют реагент PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent.

3. Способ по п. 1, где амплификацию ДНК достигают посредством условий проведения циклов ПЦР, предусматривающих следующие стадии: с начальной температурой 95°С - стадия денатурации, с последующим понижением температуры до 56°С - на стадии отжига и повышения температуры до 72°С - на стадии элонгации на цикл ПЦР для 30 циклов.

4. Способ по п. 1, где контрольные тесты содержат следующие компоненты:

AmpliTaq Gold Master mix (2x)	5 мкл
Смесь праймеров (концентрация каждого по 5 пикоМ/мкл)	1 мкл.

5. Способ по п. 1, где в качестве отрицательного тест-контроля применяют ДНК, выделенную из штамма S. aureus АС167, чувствительного к метициллину, в качестве положительного тест-контроля наличия гена метициллин-резистентности mесА применяют ДНК, выделенную из штамма S. aureus АС488, имеющего ген резистентности к метициллину mесА, в качестве положительного контроля наличия гена метициллин-резистентности mесС применяют ДНК, выделенную из штамма S. aureus АТСС ВАА-2312, имеющего ген резистентности к метициллину mесС.