Стандартный образец содержания активатора прекалликреина в препаратах крови человека
Владельцы патента RU 2756159:
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России) (RU)
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к двухкомпонентному стандартному образцу для количественного определения содержания активатора прекалликреина в лекарственных препаратах иммуноглобулинов и альбумина человека. Двухкомпонентный стандартный образец для количественного определения содержания активатора прекалликреина в лекарственных препаратах иммуноглобулинов и альбумина человека, состоящий из двух компонентов: компонента для оценки содержания активатора прекалликреина и компонента контроля, полученные из раствора альбумина человека с концентрацией белка 200 мг/мл путем добавления регламентированного количества высокоочищенного реагента β-фрагмента фактора свертывания крови человека XII. Вышеописанный образец позволяет определять содержание активатора прекалликреина с повышенной достоверностью, а также стабильностью и воспроизводимостью получаемых результатов. 1 з.п. ф-лы, 4 табл., 11 пр.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к стандартным образцам, предназначенным для количественного определения содержания активатора прекалликреина в препаратах крови человека.
Изобретение может быть использовано для определения содержания активатора прекалликреина хромогенным методом (кинетический тест и тест по конечной точке) при оценке качества препаратов крови человека: иммуноглобулинов и альбумина человека как при выпуске, так и в ходе исследований с целью подтверждения соответствия требованиям нормативной документации.
Препараты крови человека представляют собой лекарственные средства, содержащие концентрированный раствор соответствующей белковой фракции, выделенной из объединенного пула плазмы крови человека более чем 1000 доноров. При выделении (фракционировании) иммуноглобулинов различной специфичности и альбумина человека невозможно полностью исключить риск контаминации готового препарата нецелевыми белками плазмы, в частности фактором свертывания крови XII (фактором Хагемана). Присутствие в лекарственных препаратах иммуноглобулинов и альбумина человека активированного β-фрагмента фактора Хагемана, именуемого активатором прекалликреина, может привести к появлению нежелательных эффектов при внутривенном введении. Появившийся после активации плазменного прекалликреина калликреин вызывает высвобождение высокомолекулярного брадикинина, вазодилатирующий эффект которого приводит к гипотензии [1-3].
Показателем качества препаратов крови человека, характеризующим количественное содержание активатора прекалликреина, является «Активатор прекалликреина». Общая фармакопейная статья ОФС.1.8.2.0013.18 «Определение содержания активатора прекалликреина в лекарственных препаратах из плазмы крови человека», включенная в Государственную фармакопею XIV издания, предусматривает определение содержания активатора прекалликреина в препаратах крови человека хромогенным методом [4]. Метод основан на превращении прекалликреина в калликреин под воздействием активатора прекалликреина (первый этап), отщепления калликреином хромофора от специфического синтетического хромогенного субстрата и спектрофотометрического определения высвобождаемого хромофора при длине волны 405 нм (второй этап).
Оценка количественного содержания активатора прекалликреина в исследуемом образце может осуществляться двумя способами:
- по измерению скорости образования хромофора в реакционной смеси (скорости изменения интенсивности окраски в минуту), которая прямо пропорциональна содержанию активатора прекалликреина в исследуемом образце (кинетический тест);
- по измерению интенсивности окраски реакционной смеси, зависящей от количества выделившегося хромофора за оптимальный период времени, которая прямо пропорциональна содержанию активатора прекалликреина в исследуемом образце (тест по конечной точке).
Содержание активатора прекалликреина вычисляют путем сравнения со стандартным образцом, калиброванным в международных единицах (МЕ). По калибровочной кривой, построенной с использованием значений скорости изменения интенсивности окраски в минуту (скорости изменения оптической плотности) / интенсивности окраски (оптической плотности), полученных для стандартного образца и его соответствующих концентраций, определяют содержание активатора прекалликреина в исследуемом образце в МЕ/мл.
Фармакопейные требования по допустимому пределу содержания активатора прекалликреина для инфузионных препаратов крови человека соответствуют не более 35 МЕ/мл (для препаратов иммуноглобулинов человека требования указаны для растворов с концентрацией белка 30 мг/мл).
Метод определения содержания активатора прекалликреина предусматривает использование биологического реагента - прекалликреина из плазмы крови человека, стандартизация которого по всем химическим и биологическим свойствам невозможна. Кроме того, как и для других методов определения биологически активных веществ, основанных на амидолитическом расщеплении специфического хромогенного субстрата, стабильность и воспроизводимость результатов рассматриваемого метода контроля качества лекарственных препаратов подвержена влиянию различных факторов: соотношение образца и прекалликреина человека в реакционной смеси, ионная сила и значение рН реакционной смеси, время и температура инкубации, концентрация активатора прекалликреина в стандартном образце, которая должна обеспечивать линейную зависимость в интервале значений калибровочной кривой (от 0 до 35 МЕ/мл).
Вариабельность перечисленных параметров указывает на необходимость использования компонентов стандартного образца не только для построения калибровочного графика, но и для подтвержения достоверности, стабильности и воспроизводимости полученных результатов в различных диапазонах значений в пределах регламентированных значений - не более 35 МЕ/мл.
Аналогами заявляемого стандартного образца являются следующие стандартные образцы.
1. 1-й Британский стандартный образец активатора прекалликреина (NIBSC 79/572) был утвержден в 1982 г., каждая ампула содержала приблизительно 5 мл белковой фракции плазмы. Содержание активатора прекалликреина составляло 78,9 ЕД/мл с доверительным интервалом от 73,5 до 84,6 ЕД/мл (степень достоверности 95 %) [5].
2. Международные стандартные образцы:
1-й Международный стандартный образец активатора прекалликреина (NIBSC 82/530) был утвержден в 1984 г., представлял собой лиофилизат для приготовления раствора с концентрацией альбумина 4,6 % и содержанием активатора прекалликреина, равным 85 МЕ/ампулу. Значительное содержание активатора прекалликреина обусловлено добавлением фракции частично очищенного методом гель-фильтрации на Сефакриле С200 активатора прекалликреина в раствор альбумина человека 20% и дальнейшим разбавлением [5].
2-й Международный стандартный образец активатора прекалликреина (NIBSC 02/168) был утвержден в 2003 г., представляет собой лиофилизат 20 % раствора альбумина с содержанием активатора прекалликреина, равным 29 МЕ/ампулу [6].
3-й Международный стандартный образец активатора прекалликреина (NIBSC 02/168) был утвержден в 2019 г., представляет собой лиофилизат 20% раствора альбумина с содержанием активатора прекалликреина, равным 37 МЕ/ампулу [7].
3. Фармакопейные стандартные образцы (Европейская фармакопея):
Стандартный образец активатора прекалликреина в альбумине BRP (Кат. № Y0000263) (серия 1) утвержден в 2003 г., представляет собой лиофилизат 20 % раствора альбумина (пул из трех мини-серий) с содержанием активатора прекалликреина, равным 29 МЕ/флакон [8].
Стандартный образец активатора прекалликреина в альбумине BRP (Кат. № Y0000263) (серии 2 и 3) утвержден в 2008 г., представляет собой лиофилизат 20 % раствора альбумина с содержанием активатора прекалликреина, равным 30 МЕ/флакон [9].
Стандартный образец активатора прекалликреина в альбумине BRP (Кат. № Y0000263) (серии 4, 5 и 6) утвержден в 2013 г., представляет собой лиофилизат 20 % раствора альбумина с содержанием активатора прекалликреина, равным 38 МЕ/флакон [10].
Стандартный образец активатора прекалликреина в альбумине BRP (Кат. № Y0000263) (серия 7) утвержден в 2019 г., представляет собой лиофилизат 20 % раствора альбумина с содержанием активатора прекалликреина, равным 37 МЕ/флакон [7].
4. Фармакопейный стандартный образец (Фармакопея США):
Стандартный образец активатора прекалликреина (Кат. № 1559709), серия F034G0, утвержден в 2016 г., представляет собой лиофилизат 20 % раствора альбумина человека с содержанием активатора прекалликреина, равным 45 МЕ при восстановлении в 0,5 мл [11].
5. 1-й Национальный стандартный образец активатора прекалликреина (Юж. Корея) (Кат. № 03/012), утвержден в 2003 г., представляет собой лиофилизат 5 % раствора альбумина человека с содержанием активатора прекалликреина, равным 62 МЕ/флакон [13].
Подготовку стандартного образца осуществляют в соответствии с прилагаемой инструкцией по применению. Стандартные образцы используют для построения калибровочной кривой и определения содержания активатора прекалликреина в испытуемых образцах относительно аттестованного значения содержания активатора прекалликреина в стандартном образце в международных единицах. Для изготовления стандартных образцов используют раствор альбумина человека не с регламентированным, точно заданным содержанием активатора прекалликреина, а с полученным случайным образом (от 29 до 85 МЕ). Это обстоятельство исключает стабильность аттестуемой характеристики стандартного образца по содержанию активатора прекалликреина от серии к серии.
Результаты определения содержания активатора прекалликреина в препаратах крови человека при производстве и при подтверждении соответствия требованиям нормативной документации в испытательных лабораториях могут быть сопоставлены только при условии одновременного использования в испытаниях стандартного образца, имеющего аттестованную характеристику в виде среднего значения и доверительного интервала.
Однако стандартные образцы, применимые для подтверждения достоверности, стабильности и воспроизводимости результатов определения содержания активатора прекалликреина в препаратах крови человека в пределах регламентированных значений - не более 35 МЕ/мл, не выявлены.
Техническим результатом изобретения является создание стандартного образца содержания активатора прекалликреина в препаратах крови человека, предназначенного для количественного определения содержания активатора прекалликреина в лекарственных препаратах иммуноглобулинов и альбумина человека хромогенным методом, повышающего качество испытаний (достоверность, стабильность и воспроизводимость результатов определения) при их контроле по содержанию активатора прекалликреина и обеспечивающего соответствующий уровень безопасности указанных препаратов для пациентов.
Сущность заявляемого стандартного образца содержания активатора прекалликреина в препаратах крови человека заключается в том, что он включает в себя два компонента, а именно:
1) компонент для оценки содержания активатора прекалликреина с целевым значением содержания активатора прекалликреина ˃35 МЕ/мл, полученный из раствора альбумина человека с концентрацией белка ≤200 мг/мл с добавлением регламентированного количества высокоочищенного реагента β-фрагмента фактора свертывания крови человека XII до содержания активатора прекалликреина ˃35 МЕ/мл, аттестованного по среднему содержанию активатора прекалликреина хромогенным методом (кинетический тест и тест по конечной точке) с использованием различных доступных реагентов прекалликреина плазмы крови человека;
2) компонент контроля с целевым значением содержания активатора прекалликреина ˂35 МЕ/мл, полученный из раствора альбумина человека с концентрацией белка ≤200 мг/мл с добавлением регламентированного количества высокоочищенного реагента β-фрагмента фактора свертывания крови человека XII до содержания активатора прекалликреина ˂35 МЕ/мл, аттестованного по среднему значению и доверительному интервалу, равному двум стандартным отклонениям, содержания активатора прекалликреина хромогенным методом (кинетический тест и тест по конечной точке) с использованием различных доступных реагентов прекалликреина плазмы крови человека.
Компонент для оценки содержания активатора прекалликреина используется для построения калибровочного графика, а компонент контроля используется для подтверждения достоверности, стабильности и воспроизводимости результатов испытаний.
Оба компонента представляют собой растворы альбумина человека с соответствующим содержанием активатора прекалликреина, разлитые во флаконы из прозрачного нейтрального стекла и лиофильно высушенные, имеющие маркировку на внешней поверхности, отражающую информацию о названии стандартного образца, наименовании компонента с указанием содержания активатора прекалликреина, об изготовителе, дате изготовления, сроке годности, условиях хранения, упакованы в тару для хранения и транспортирования с инструкцией по применению.
Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами:
Пример 1. Приготовление буферного раствора.
6,055 г трис(гидроксиметил) аминометана и 8,77 г натрия хлорида помещают в мерную колбу вместимостью 1000 мл, растворяют в воде, доводят рН до 7,95-8,05 2 М раствором хлористоводородной кислоты, перемешивают, доводят объем раствора водой до метки и вновь перемешивают. Раствор хранят при температуре 5±3 °С не более 6 мес.
Пример 2. Приготовление раствора прекалликреина.
Прекалликреин, полученный из коммерческих источников, представляет собой прекалликреин плазмы крови человека в лиофилизированном виде или в виде замороженной жидкости. Лиофилизат восстанавливают в соответствии с указаниями в сертификате анализа производителя в заданном объеме воды очищенной или при отсутствии указаний в буферном растворе до получения раствора с концентрацией 1 мг/мл. Замороженный прекалликреин после оттаивания при температуре 5±3 °С разводят в буферном растворе до получения раствора с концентрацией 1 мг/мл.
Критерием пригодности раствора прекалликреина является его активность при использовании в хромогенном кинетическом тесте со стандартным образцом активатора прекалликреина в концентрации 30-32 МЕ/мл, соответствующая значениям изменения оптической плотности в диапазоне от 0,20 до 0,60 в течение 10 мин (ΔА/10 мин).
При отсутствии информации в сертификате производителя о прекалликреиновой активности восстановленного раствора прекалликреина, готовят его разведение (например, в концентрации 0,01 мг/мл), проявляющее активность при использовании в хромогенном кинетическом тесте со стандартным образцом активатора прекалликреина в концентрации 30-32 МЕ/мл, соответствующая значениям ΔА/10 мин в диапазоне от 0,20 до 0,60.
Подготовленный раствор прекалликреина разделяют на аликвоты и хранят при температуре не выше минус 70°С. После размораживания хранят при комнатной температуре не более 8 ч.
Возможно применение раствора прекалликреина, изготовленного в лабораторных условиях из плазмы крови доноров. Методика изготовления прекалликреина должна быть валидирована. Критериями пригодности изготовленного в лабораторных условиях прекалликреина являются:
- отсутствие калликреиновой активности, которая подтверждается следующей методикой: смешивают раствор прекалликреина в соотношении 1:20 с предварительно подогретым раствором хромогенного субстрата, который будет использоваться в методике определения активатора прекалликреина, инкубируют при 37 °С в течение 2 мин, определяют изменение оптической плотности в минуту (ΔА/мин) при длине волны 405 нм. Прекалликреин может быть использован в методике, если ΔА/мин составляет менее 0,001;
- прекалликреиновая активность при использовании в хромогенном кинетическом тесте со стандартным образцом активатора прекалликреина (30-32 МЕ/мл), соответствующая значениям ΔА/10 мин в диапазоне от 0,20 до 0,60.
Подготовленный раствор прекалликреина разделяют на аликвоты и хранят при температуре не выше минус 70 °С в течение 12 мес. После размораживания раствор хранят при комнатной температуре не более 8 ч.
Пример 3. Приготовление рабочего раствора синтетического хромогенного субстрата (2 мМ).
25 мг хромогенного субстрата (например, S-2302, H-D-пролил-L-фенилаланил-L-аргинина-p-нитроанилин дигидрохлорид) растворяют в 6,8 мл буферного раствора до получения раствора с концентрацией 6 мМ (исходный раствор хромогенного субстрата). Раствор хранят при температуре 5±3 °С в течение 6 мес.
Для приготовления рабочего раствора хромогенного субстрата к одному объему исходного раствора хромогенного субстрата (6 мМ) добавляют два объема буферного раствора до получения раствора с концентрацией 2 мМ. Хранят при комнатной температуре не более 24 ч.
Пример 4. Приготовление 50 % раствора уксусной кислоты.
50 г уксусной кислоты ледяной помещают в мерный цилиндр вместимостью 100 мл доводят водой до объема 100 мл и перемешивают. Раствор хранят при температуре 5±3 °С в течение 3 мес.
Пример 5. Получение компонентов стандартного образца содержания активатора прекалликреина.
Для получения компонента для оценки содержания активатора прекалликреина в 100 мл раствора лекарственного препарата альбумина человека с концентрацией белка 200 мг/мл вносят 1850 нг высокоочищенного реагента β-фрагмента фактора свертывания крови человека XII, тщательно перемешивают, избегая образования пены. Разливают во флаконы по 1,0 мл и замораживают до температуры не выше минус 70 °С
Для получения компонента контроля в 100 мл раствора лекарственного препарата альбумина человека с концентрацией белка 200 мг/мл вносят 462 нг высокоочищенного реагента β-фрагмента фактора свертывания крови человека XII, тщательно перемешивают, избегая образования пены. Разливают во флаконы по 1,0 мл и замораживают до температуры не выше минус 70 °С
Замороженные образцы подвергают лиофильному высушиванию в течение 18-22 ч до содержания остаточной влаги не более 1 %.
Пример 6. Определение аттестуемой характеристики хромогенным методом (кинетический тест).
Восстанавливают содержимое флакона компонента для оценки содержания активатора прекалликреина заявляемого стандартного образца в 1,70 мл воды очищенной до расчетного содержания активатора прекалликреина в растворе 30 МЕ/мл. Выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин, перемешивают аккуратным покачиванием.
Восстанавливают содержимое ампулы 2-го Международного стандартного образца активатора прекалликреина (29 МЕ/ампулу) в 0,97 мл воды очищенной до расчетного содержания активатора прекалликреина в растворе 30 МЕ/мл. Выдерживают при комнатной температуре в течение 15 мин, перемешивают аккуратным покачиванием.
Следующие этапы приготовления проб с компонентом для оценки содержания активатора прекалликреина заявляемого стандартного образца содержания активатора прекалликреина в препаратах крови человека и международного стандартного образца активатора прекалликреина приведены в Табл.1.
Таблица 1
| Номер пробы | Расчетное содержание, МЕ/мл | Коэффициент разведения | Объем пробы (№…), мл | Объем буферного раствора, мл |
| 0 | 30 | - | 1,70 (компонент для оценки содержания активатора прекалликреина заявляемого стандартного образца) |
- |
| 0 | 30 | - | 0,97 (международный стандартный образец активатора прекалликреина) |
- |
| 1 | 25 | 1,2 | 0,10 (№ 0) | 0,020 |
| 2 | 20 | 1,5 | 0,05 (№ 0) | 0,025 |
| 3 | 15 | 2,0 | 0,05 (№ 0) | 0,050 |
| 4 | 10 | 3,0 | 0,10 (№ 0) | 0,200 |
| 5 | 5 | 6,0 | 0,10 (№ 4) | 0,100 |
| 6 | 1 | 30,0 | 0,50 (№ 4) | 0,450 |
Восстанавливают содержимое флакона компонента контроля заявляемого стандартного образца в 1,00 мл воды. Выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин, перемешивают аккуратным покачиванием.
В лунки 96-луночного планшета с плоским дном вносят по 0,005 мл соответствующей пробы компонентов заявляемого стандартного образца и международного стандартного образца в трех повторностях. В лунки двух повторностей вносят по 0,045 мл приготовленного по Примеру 2 раствора прекалликреина, в лунку третьей повторности (холостая проба) - 0,045 мл приготовленного по Примеру 1 буферного раствора. Содержимое лунок планшета перемешивают осторожным потряхиванием и выдерживают при температуре 37±1 °С в течение 30 мин. По окончании инкубации в лунки всех повторностей вносят по 0,050 мл приготовленного по Примеру 3 рабочего раствора хромогенного субстрата, подогретого до температуры 37±1 °С. Содержимое лунок планшета перемешивают осторожным потряхиванием, устанавливают в анализатор/спектрофотометр и при температуре 37±1 °С регистрируют скорость изменения оптической плотности в мин в течение со 2-й по 10 мин при длине волны 405 нм.
Корректируют значение ΔА/мин, вычитая из значения ΔА/мин для двух повторностей каждого образца результат, полученный для соответствующей холостой пробы (третья повторность). Вычисляют среднее значение ΔА/мин из двух повторностей для каждого образца. Содержание активатора прекалликреина в образцах компонента для оценки содержания активатора прекалликреина вычисляют, используя метод параллельных шкал. Содержание активатора прекалликреина в образцах компонента контроля вычисляют методом линейной регрессии.
Результаты определения содержания активатора прекалликреина хромогенным методом (кинетический тест) в компонентах заявляемого стандартного образца содержания активатора прекалликреина в препаратах крови человека представлены в Табл. 2.
Таблица 2
| Наименование компонента | Содержание активатора прекалликреина, МЕ/мл | ||
| определенное с помощью кинетического теста | определенное с помощью теста по конечной точке | Аттестованное значение | |
| Компонент для оценки содержания активатора прекалликреина1 | 50,9 | 51,0 | 51,0 |
| Компонент контроля2 | 10,1+1,8 | 10,1+1,6 | 10,1+1,8 |
Примечание - 1 - указано среднее значение ( 2 - указано среднее значение и доверительный интервал (  ±2Sx) |
Из данных, представленных в Табл. 2, следует, что аттестованное значение содержания активатора прекалликреина в компонентах заявляемого стандартного образца для определения содержания активатора прекалликреина соответствует заявленным требованиям: компонент для оценки содержания активатора прекалликреина содержит 51 МЕ/мл активатора прекалликреина (при восстановлении в 1,0 мл воды очищенной); компонент контроля содержит 10,1+1,8 МЕ/мл (
±2Sx) активатора прекалликреина (при восстановлении в 1,0 мл воды очищенной).
Пример 7. Определение аттестуемой характеристики хромогенным методом (тест по конечной точке).
В лунки 96-луночного планшета с плоским дном вносят по 0,005 мл соответствующей пробы компонентов заявляемого стандартного образца и международного стандартного образца в трех повторностях. В лунки двух повторностей вносят по 0,045 мл приготовленного по Примеру 2 раствора прекалликреина, в лунку третьей повторности (холостая проба) - 0,045 мл приготовленного по Примеру 1 буферного раствора. Содержимое лунок планшета перемешивают осторожным потряхиванием и выдерживают при температуре 37±1 °С в течение 30 мин. По окончании инкубации в лунки всех повторностей вносят по 0,050 мл приготовленного по Примеру 3 рабочего раствора хромогенного субстрата, подогретого до температуры 37±1 °С. Содержимое лунок планшета перемешивают осторожным потряхиванием, и выдерживают при температуре 37±1 °С в течение 15 мин. По окончании инкубации в лунки всех повторностей вносят по 0,050 мл приготовленного по Примеру 4 50 % раствора уксусной кислоты, устанавливают в анализатор/спектрофотометр и регистрируют оптическую плотность при длине волны 405 нм.
Корректируют значение оптической плотности, вычитая из значения оптической плотности для двух повторностей каждого образца результат, полученный для соответствующей холостой пробы (третья повторность). Вычисляют среднее значение оптической плотности из двух повторностей для каждого образца. Содержание активатора прекалликреина в образцах компонента для оценки содержания активатора прекалликреина вычисляют, используя метод параллельных шкал. Содержание активатора прекалликреина в образцах компонента контроля вычисляют методом линейной регрессии.
Результаты определения содержания активатора прекалликреина хромогенным методом (тест по конечной точке) в компонентах заявляемого стандартного образца содержания активатора прекалликреина в препаратах крови человека представлены в Табл. 2.
Из данных, представленных в Табл. 2, следует, что аттестованное значение содержания активатора прекалликреина в компонентах заявляемого стандартного образца для определения содержания активатора прекалликреина соответствует заявленным требованиям: компонент для оценки содержания активатора прекалликреина содержит 51 МЕ/мл активатора прекалликреина (при восстановлении в 1,0 мл воды очищенной); компонент контроля содержит 10,1+1,6 МЕ/мл (±2Sx) активатора прекалликреина (при восстановлении в 1,0 мл воды очищенной).
Пример 8. Изучение стабильности заявляемого стандартного образца содержания активатора прекалликреина в препаратах крови человека.
Для изучения стабильности образцы полученного стандартного образца содержания активатора прекалликреина хранят при температуре минус (20±2) °С и определяют содержание активатора прекалликреина в момент закладки на хранение, далее каждый месяц в течение первых трех месяцев, далее с интервалом в 3 мес. до 12 мес. Результаты изучения стабильности представлены в Табл. 3. Для установления окончательного срока хранения наблюдения продолжаются.
Таблица 3
| Наименование компонента | Содержание активатора прекалликреина на … месяц хранения,  ±Sx, МЕ/мл (р= 0,95) |
|||||
| 1 | 2 | 3 | 6 | 9 | 12 | |
| Компонент для оценки содержания активатора прекалликреина | 50,9+1,1 | 51,0+4,0 | 51,1+3,6 | 50,8+2,1 | 51,1+2,2 | 50,9+1,6 |
| Компонент контроля | 10,7+1,6 | 9,9+1,7 | 10,2+1,5 | 10,6+1,2 | 10,1+1,4 | 10,1+1,8 |
Пример 9. Стандарный образец содержания активатора прекалликреина, включающий в себя два компонента, а именно компонент для оценки содержания активатора прекалликреина (флакон вместимостью 2,0 мл), представляющий собой лиофильно высушенный раствор альбумина человека (1,0 мл) с концентрацией белка 200 мг/мл с добавлением регламентированного количества высокоочищенного реагента β-фрагмента фактора свертывания крови человека XII до содержания активатора прекалликреина 51 МЕ/мл, и компонент контроля (флакон вместимостью 2,0 мл), представляющий собой лиофильно высушенный раствор альбумина человека (1,0 мл) с концентрацией белка 200 мг/мл с добавлением регламентированного количества высокоочищенного реагента β-фрагмента фактора свертывания крови человека XII до содержания активатора прекалликреина в диапазоне от 8,5 до 11,7 МЕ/мл, аттестованные по методикам, изложенным в примерах 6 и 7.
Пример 10. Хранение и транспортирование стандартного образца.
Упакованный заявляемый стандартный образец хранят при температуре не выше минус (20±2) °С. Транспортирование осуществляют всеми видами крытого транспорта согласно санитарно-эпидемиологическим правилам СП 3.3.2.3332-16 «Условия транспортирования и хранения иммунобиологических лекарственных препаратов» при температуре не выше минус (20±2) °С.
Пример 11. Применение заявляемого стандартного образца содержания активатора прекалликреина в препаратах крови человека.
Восстанавливают содержимое флакона компонента для оценки содержания активатора прекалликреина заявляемого стандартного образца в 1,70 мл воды очищенной до расчетного содержания активатора прекалликреина в растворе 30 МЕ/мл. Выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин, перемешивают аккуратным покачиванием. Следующие этапы приготовления проб с компонентом для оценки содержания активатора прекалликреина заявляемого стандартного образца приведены в Табл.1.
Восстанавливают содержимое флакона компонента контроля заявляемого стандартного образца в 1,00 мл воды. Выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин, перемешивают аккуратным покачиванием.
Образец лекарственного препарата иммуноглобулина человека разводят приготовленным по примеру 1 буферным раствором до концентрации белка 30 мг/мл.
Образец лекарственного препарата альбумина человека используют без предварительной подготовки.
В лунки 96-луночного планшета с плоским дном вносят по 0,005 мл соответствующей пробы компонентов заявляемого стандартного образца, испытуемых образцов иммуноглобулинов и альбумина человека в трех повторностях. В лунки двух повторностей вносят по 0,045 мл приготовленного по Примеру 2 раствора прекалликреина, в лунку третьей повторности (холостая проба) - 0,045 мл приготовленного по Примеру 1 буферного раствора. Содержимое лунок планшета перемешивают осторожным потряхиванием и выдерживают при температуре 37±1 °С в течение 30 мин.
При проведении кинетического теста по окончании инкубации в лунки всех повторностей вносят по 0,050 мл приготовленного по Примеру 3 рабочего раствора хромогенного субстрата, подогретого до температуры 37±1 °С. Содержимое лунок планшета перемешивают осторожным потряхиванием, устанавливают в анализатор/спектрофотометр и при температуре 37±1 °С регистрируют скорость изменения оптической плотности в мин в течение со 2-й по 10 мин при длине волны 405 нм.
При проведении теста по конечной точке по окончании инкубации в лунки всех повторностей вносят по 0,050 мл приготовленного по Примеру 3 рабочего раствора хромогенного субстрата, подогретого до температуры 37±1 °С. Содержимое лунок планшета перемешивают осторожным потряхиванием и выдерживают при температуре 37±1 °С в течение 15 мин. По окончании инкубации в лунки всех повторностей вносят по 0,050 мл приготовленного по Примеру 4 50 % раствора уксусной кислоты, устанавливают в анализатор/спектрофотометр и регистрируют оптическую плотность при длине волны 405 нм.
Корректируют значение ΔА/мин (при проведении кинетического теста) или оптической плотности (при проведении теста по конечной точке), вычитая из значения ΔА/мин или оптической плотности для двух повторностей каждого образца результат, полученный для соответствующей холостой пробы (третья повторность). Вычисляют среднее значение ΔА/мин или оптической плотности из двух повторностей для каждого образца. Содержание активатора прекалликреина в образцах компонента контроля заявляемого стандартного образца, лекарственных препаратов иммуноглобулина и альбумина человека вычисляют методом линейной регрессии относительно компонента для оценки содержания активатора прекалликреина заявляемого стандартного образца.
Результаты количественного определения содержания активатора прекалликреина в образцах компонента контроля, лекарственных препаратов иммуноглобулина и альбумина человека представлены в Табл. 4.
Таблица 4
| Оператор | Номер испытания | Образец | Содержание активатора прекалликреина, МЕ/мл | Оценка достоверности результатов |
| 1 | 13 | ИГЧ | 2,0 | достоверны |
| АЧ | 6,5 | |||
| Компонент контроля | 9,0 | |||
| 24 | ИГЧ | 2,5 | достоверны | |
| АЧ | 5,8 | |||
| Компонент контроля | 8,0 | |||
| 2 | 15 | ИГЧ | 1,2 | достоверны |
| АЧ | 5,0 | |||
| Компонент контроля | 8,4 | |||
| 23 | ИГЧ | не выявлено | не достоверны | |
| АЧ | 3,4 | |||
| Компонент контроля | 7,9 | |||
| 3 | 14 | ИГЧ | 2,1 | достоверны |
| АЧ | 6,9 | |||
| Компонент контроля | 10,7 | |||
| 25 | ИГЧ | 3,4 | не достоверны | |
| АЧ | 9,4 | |||
| Компонент контроля | 12,3 | |||
| Примечания. 1. ИГЧ - лекарственный препарат иммуноглобулина человека, АЧ - лекарственный препарат альбумина человека 2. Аттестованное значение содержание активатора прекалликреина соответствует диапазону от 8,3 до 11,9 МЕ/мл. 3. Использован реагент прекалликреина из коммерческого источника (производитель 1). 4. Использован реагент прекалликреина из коммерческого источника (производитель 2). 5. Использован реагент прекалликреина из коммерческого источника (производитель 3). |
Из данных, представленных в Табл. 4, следует, что получаемые оператором 2 во втором испытании и оператором 3 во втором испытании значения содержания активатора в компоненте контроля не соответствуют аттестованному значению, развному диапазону от 8,3 до 11,9 МЕ/мл, что свидетельствует о недостоверности полученных результатов оценки содержания активатора прекалликреина в испытуемых образцах. Получаемые оператором 1 в обоих испытаниях, оператором 2 в первом испытании и оператором 3 в первом испытании значения содержания активатора прекалликреина в компоненте контроля соответствуют аттестованному значению, что свидетельствует о достоверности полученных результатов оценки содержания активатора прекалликреина в испытуемых образцах, а также о стабильности и воспроизводимости результатов (для оператора 1) в различных испытаниях при использовании различных реагентов прекалликреина.
Представленные примеры не ограничивают объем притязаний настоящего изобретения и служат только для цели иллюстрации.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Radosevich M., Burnouf T. Intravenous immunoglobulin G: trends in production methods, quality control and quality assurance. Vox Sang. 2010; 98(1): 12-28.
2. Heitsch H. The therapeutic potential of bradykinin B2 receptor agonists in the treatment of cardiovascular disease. Expert Opin Investig Drugs. 2003; 12(5): 759-770.
3. Messadi-Laribi E., Griol-Charhbili V., Gaies E., et al. Cardioprotection and kallikrein-kinin system in acute myocardial ischaemia in mice. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2008; 35(4): 489-493.
4. Определение содержания активатора прекалликреина в лекарственных препаратах из плазмы крови человека: ОФС.1.8.2.0013.18 // Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. [Электронный ресурс] URL: http://resource.rucml.ru/feml/pharmacopia/14_2/HTML/1395/index.html (дата обращения: 23.05.2020).
5. Kerry P.J., Curtis A.D., Thomas D.P. Standardization of prekallikrein activator (PKA): the 1st International Standard for PKA. Br J Haematol. 1985; 60(2): 345-352.
6. Longstaff C., Behr-Gross M.-E., Daas A., Lackner F. An international collaborative study to replace the 1st International Standard for prekallikrein activator. Vox Sang. 2005; 88(2): 143-151.
7. Fox B., Ezeajughi E., Graham R., Longstaff C. International collaborative study to calibrate proposed 3rd WHO International Standard And Ph. Eur. Biological Reference Preparation Batch 7 For Prekallikrein Activator. Еxpert committee on biological standardization; WHO/BS/2019.2357.
8. Longstaff C., Behr-Gross M.-E., Daas A., Lackner F. Collaborative study to establish a new biological reference preparation for prekallikrein activator. Pharmeuropa Bio. 2005; 2005(1): 1-12.
9. Lackner F., Daas A., Terao E., Behr-Gross M.-E. Establishment of replacement batches for prekallikrein activator in albumin biological reference preparation. Pharmeuropa Bio. 2008; 2008(1): 1-6.
10. Lackner F, Daas A., Terao E. Collaborative study for the calibration of the Ph. Eur. prekallikrein activator in albumin BRP batches 4, 5 and 6. Pharmeur Bio Sci Notes. 2015; 2015: 1-10.
11. USP Certificate Prekallikrein Activator. [Электронный ресурс] URL: http://static.usp.org/pdf/EN/referenceStandards/certificates/1559709-F034G0.pdf (дата обращения: 25.05.2020).
12. Shin I.S., Hong C.M., Ban S.J., Hong S.H. A collaborative study to establish the 1st National Standard of prekallikrein activator in Korea. Biologicals. 2012; 40(1): 79-83.
13 Sohn Y.W. 2014 Annual Report of National Lot Release. National Institute of Food and Drug Safety Evaluation; 2015; 42.
1. Двухкомпонентный стандартный образец для количественного определения содержания активатора прекалликреина в лекарственных препаратах иммуноглобулинов и альбумина человека, состоящий из двух компонентов:
компонент для оценки содержания активатора прекалликреина с целевым значением содержания активатора прекалликреина 47–51 МЕ/мл, полученный из раствора альбумина человека с концентрацией белка 200 мг/мл путем добавления регламентированного количества высокоочищенного реагента ß-фрагмента фактора свертывания крови человека XII до содержания активатора прекалликреина 47–51 МЕ/мл, аттестованного по среднему содержанию активатора прекалликреина;
компонент контроля с целевым значением содержания активатора прекалликреина 8,5–11,7 МЕ/мл, полученный из раствора альбумина человека с концентрацией белка 200 мг/мл путем добавления регламентированного количества высокоочищенного реагента ß-фрагмента фактора свертывания крови человека XII до содержания активатора прекалликреина 8,5–11,7 МЕ/мл, аттестованного по среднему значению и доверительному интервалу, равному двум стандартным отклонениям, содержания активатора прекалликреина.
2. Двухкомпонентный стандартный образец по п. 1, дополнительно характеризующийся тем, что компонент для оценки и компонент для контроля представляют собой лиофильно высушенные растворы.
