Тест-система и способ дифференцированного выявления антител к sars-cov-2

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Изобретение представляет собой тест-систему и способ дифференцированного (раздельного) выявления всех классов специфических антител к нуклеокапсиду и рецептор-связывающему домену спайк белка коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома-2 (SARS-CoV-2) с целью оценки иммунного ответа на перенесенную или текущую коронавирусную инфекцию COVID-19, лабораторной диагностики текущей инфекции в комплексе с другими исследованиями, подтверждения положительных или сомнительных результатов исследования, минимизации ложноположительных результатов исследования. Включает иммуносорбент на основе антигенов коронавируса, представляющих собой рецептор-связывающий домен (RBD) и нуклеопротеин (N) коронавируса SARS-CoV-2 и детектирующие реагенты, причем вышеперечисленные антигены сорбированы в разных лунках планшетов для иммуноферментного анализа, для сорбции используют 96-луночные разборные полистироловые планшеты. Изобретение позволяет определять стандартизованное относительное количество антител к разным белкам вируса за счет стандартности условий постановки и единого уровня порогового значения (отсекающей), обеспечивает повышение чувствительности, упрощение и удобство проведения анализа, при этом в комплексе с другими исследованиями может подтвердить положительные или сомнительные результаты исследования, минимизировать ложноположительные результаты (ЛПР). 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 8 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Использование: дифференцированное (раздельное) выявление всех классов специфических антител к нуклеокапсиду и рецептор-связывающему домену спайк белка коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома-2 (SARS-CoV-2), с целью оценки иммунного ответа на перенесенную или текущую коронавирусную инфекцию COVID-19, лабораторной диагностики текущей инфекции в комплексе с другими исследованиями, подтверждения положительных или сомнительных результатов исследования, минимизации ложноположительных результатов исследования. Включает иммуносорбент на основе антигенов коронавируса, представляющих собой рецептор-связывающий домен (RBD) и нуклеопротеин (N) коронавируса SARS-CoV-2 и детектирующие реагенты, причем вышеперечисленные антигены сорбированы в разных лунках планшетов для иммуноферментного анализа, для сорбции используют 96-луночные разборные полистироловые планшеты.

Изобретение позволяет определять стандартизованное относительное количество антител к разным белкам вируса за счет стандартности условий постановки и единого уровня порогового значения (отсекающей), обеспечивает повышение чувствительности, упрощение и удобство проведения анализа.

Сущность: получение иммуноферментной тест-системы для идентификации спектра антител всех классов к отдельным белкам коронавируса SARS-CoV-2 в сыворотке (плазме) крови человека. Разработанная тест-система может быть использована для оценки иммунного ответа на перенесенную или текущую коронавирусную инфекцию COVID-19, лабораторной диагностики текущей инфекции в комплексе с другими исследованиями, подтверждения положительных или сомнительных результатов исследования, минимизации ложноположительных результатов исследования, разделения естественного (нативного) и искусственного активного приобретенного (поствакцинального) иммунитета (в случае использования вакцин на основе спайк-белка в качестве иммуногена).

Уровень техники

Коронавирус SARS-CoV-2 (2019-nCoV), вызывающий инфекцию COVID-19, является седьмым коронавирусом, способным заражать человека, и третьим коронавирусом, возникшим за последние два десятилетия, вызвавшим вспышки с высокой тяжестью заболевания и значительной смертностью на территории разных стран. Симптомы COVID-19 не имеют отличительных признаков и совпадают с симптомами других тяжелых респираторных инфекций, вызванных коронавирусами MERS-CoV и SARS-CoV.

Лабораторная диагностика коронавирусной инфекции COVID-19 базируется на:

а) ПЦР-диагностике для выявления нуклеиновых кислот вируса SARS-CoV-2;

б) выявлении антигенов SARS-CoV-2;

в) выявлении антител к SARS-CoV-2.

Серологическая диагностика новой коронавирусной инфекции имеет важное клиническое значение. Согласно «Временным методическим рекомендациям Министерства здравоохранения Российской Федерации (BMP МЗ РФ) «Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19)», версия 9 (26.10.2020) методы тестирования на антитела к вирусу SARS-CoV-2 рекомендуется использовать в следующих случаях:

« - в качестве дополнительного метода диагностики острой инфекции (с учетом сероненгативного периода) или при невозможности исследования мазков методом амплификации нуклеиновых кислот, в том числе при госпитализации в стационар по поводу соматической патологии;

- для выявления лиц с бессимптомной формой инфекции;

- для установления факта перенесенной ранее инфекции при обследовании групп риска и проведении массового обследования населения для оценки уровня популяционного иммунитета;

- для отбора потенциальных доноров иммукомпетентной плазмы».

Для выявления антител при COVID-19 используют иммуноферментный анализ (ИФА), иммунохемилюминесцентный анализ (ИХЛА) и быстрые иммунохроматографические (ИХА) тесты. В основе ИФА лежит иммобилизация вирусных антигенов на планшетах, с которыми связываются антитела из образца. При наличии в исследуемых образцах специфических антител класса G, М и А к антигенам SARS-CoV-2 образуется иммунный комплекс антиген-антитело, который детектируется конъюгатом - смесью рекомбинантных антигенов SARS-CoV-2 или антител к иммуноглобулинам человека, меченных пероксидазой хрена.

Основными антигенными мишенями вируса SARS-CoV-2, против которых обнаруживаются антитела, являются спайк-белок (S-белок) и нуклеокапсидный фосфопротеин (N-белок).

S-белок, присутствующий на поверхности SARS-CoV-2, необходим для проникновения вируса в клетку; антитела к этому белку, в особенности к его рецептору связывающего домена (RBD), обладают нейтрализующими свойствами и препятствуют связыванию вируса с клетками человека, тем самым обеспечивают важную роль в определении индивидуального протективного иммунного ответа к SARS-CoV-2 (Grigoryan L., Pulendran В. The immunology of SARS-CoV-2 infections and vaccines,, Semin Immunol. 2020 Aug;50:101422).

N-белок является наиболее обильно экспрессируемым иммунодоминантным белком, который взаимодействует с РНК. Образование антител к нуклеокапсиду свидетельствует об активации клеточного иммунитета (Ferretti А.Р. et al. Unbiased screens show CD8+ T cells of COVID-19 patients recognize shared epitopes in SARS-CoV-2 that largely reside outside the spike protein. Immunity. 2020 Nov 17; 53(5):1095-1107.еЗ). Однако наличие антител к N-белку может свидетельствовать о предшествующем инфицировании другими сезонными коронавирусами человека, т.к. нуклеокапсидный белок содержит ряд общих консервативных последовательностей (Kathleen М. McAndrews et al. Heterogeneous antibodies against SARS-CoV-2 spike receptor binding domain and nucleocapsid with implications for COVID-19 immunity. JCI Insight. 2020 Sep 17; 5(18):el42386). Динамика образования антител к разным белкам коронавируса различается у каждого конкретного человека - у одних лиц изначально образуются антитела к N, у других к RBD, у третьих -к обоим белкам одновременно (Seow J. et al. Longitudinal observation and decline of neutralizing antibody responses in the three months following SARS-CoV-2 infection in humans. Nat Microbiol. 2020 Dec;5(12): 1598-1607; Kathleen M. McAndrews et al. Heterogeneous antibodies against SARS-CoV-2 spike receptor binding domain and nucleocapsid with implications for COVID-19 immunity. JCI Insight. 2020 Sep 17; 5(18):e142386.). Длительность персистирования антител к разным белкам тоже варьирует у разных лиц (Kathleen М. McAndrews et al. Heterogeneous antibodies against SARS-CoV-2 spike receptor binding domain and nucleocapsid with implications for COVID-19 immunity. JCI Insight. 2020 Sep 17; 5(18):e142386).

Поскольку последовательность S-белка SARS-CoV-2, особенно RBD, является уникальной, то определение антител к этому белку является очень специфичным маркером иммунного ответа на S ARS-CoV-2. Это имеет и свои негативные моменты - ввиду быстрой изменчивости вируса возникают новые штаммы возбудителя с мутациями в важных эпитопах, особенно в эпитопах, связанных с жизненно важными функциями, например, с проникновением вируса в клетку. Это может привести к недовыявлению мутантных штаммов SARS-CoV-2. Последовательность же нуклеокапсида является более консервативной. Поэтому возможна некоторая кросс-реактивность с другими сезонными коронавирусами. Но при этом определение антител к этому менее уязвимому к мутациям белку обеспечивает стабильность результатов.

Принимая во внимание, что антитела к N и S белкам SARS-CoV-2 могут отличаться динамикой и длительностью присутствия в крови, разным уровнем кросс-реактивности с сезонными коронавирусами, способностью участвовать в формировании иммунного ответа на вакцину (в зависимости от типа используемой вакцины), для объективной оценки иммунного статуса исследуемого образца необходимо определять наличие антител к 2 (этим двум) иммуннодоминантным белкам вируса.

Отдельной проблемой является возможность ЛПР, связанных, в основном с присутствием антител к сезонным коронавирусам.

Для минимизации ЛПР исследования BMP МЗ РФ «Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19)», версия 9 (26.10.2020) рекомендуется «ввести алгоритм последовательного тестирования пациентов, у которых получены первоначальные положительные результаты на антитела классов IgM/IgA или IgG, с использованием другого теста. С этой целью необходимо использовать тест-систему с максимальными чувствительностью и специфичностью, а также с одновременным выявлением антител классов А, М, G, которая будет играть роль референтной (верифицирующей) тест-системы. В качестве такой тест-системы может использоваться тест-система для выявления рецептор-связывающего домена поверхностного гликопротеинта S SARS-CoV-2. Использование такого алгоритма позволит выполнять надежную диагностику». Существует международный опыт использования последовательного тестирования к разным антигенам SARS-CoV-2. Подобный алгоритм тестирования на антитела к возбудителю COVID-19 изложен во Временном руководстве Центра по профилактике и контролю заболеваний (CDC, США) от 01.08. 2020 г. (https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/resources/antibody-tests-guidelines.html) и в ряде публикаций по эпидемиологической оценке распространенности специфических антител в популяции (Gudbjartsson D.F. et al. Spread of SARS-CoV-2 in the icelandic population. N Engl J Med. 2020 Jun 11; 382(24):2302-15; Ripperger T.J. Orthogonal SARS-CoV-2 serological assays enable surveillance of low-prevalence communities and reveal durable humoral immunity. Immunity. 2020 Nov 17;53(5):925-3.e4). Предлагаемое решение полностью соответствует описанным алгоритмам и позволяет проводить подтверждение полученных положительных результатов тестирования в соответствии с российскими и международными рекомендациями.

Подходом для принятия решения о проведении скрининга с целью установления текущей или перенесенной коронавирусной инфекции является описанный ранее «Способ использования рекомбинантных белков SARS-COV-2 в составе тест-системы для иммуноферментного анализа с определением уровней антител классов IgM, IgG, IgA в сыворотке/плазме крови больных COVID-19» по патенту RU 2730897. Однако описанный способ определения антител к сумме белков, сорбированных совместно, не позволяет использовать подобную тест-систему для определения спектра антител с целью минимизации ЛПР или разделения нативного и поствакцинального иммунитета.

Разработано множество тестов для определения антител к SARS-CoV-2. Все они отличаются друг от друга типом диагностической мишени, выявляемым спектром антител, объемом тестируемого образца, процедурой постановки, уровнем порогового значения. В таблице 1 собраны характеристики имеющихся на рынке основных тестов для диагностики SARS-CoV-2.

Разнообразие дизайна и разные процедуры проведения анализа приводят к низкой сходимости результатов тестирования, особенно в период ранней сероконверсии или при обследовании лиц с малосимптомным или бессимптомным течением заболевания. Так в работе Gudbjartsson D.F. et al. (2020) показано, что сходимость результатов тестирования с использованием 2 разных тестов, использующих N и S белки в качестве диагностической мишени, варьирует от 32,4 до 93,4%, в зависимости от обследованной группы (Gudbjartsson D.F. et al. Spread of SARS-CoV-2 in the icelandic population. N Engl J Med. 2020 Jun 11; 382(24):2302-15).

Одним из важнейших пунктов, наряду с диагностической мишенью и классами антител, является установленная пороговая величина (cut off или оптическая плотность критическая, ОП крит.). Это величина определяется производителем тестов на основе статистической обработки сигналов негативных проб. Величина выборки негативных проб, их происхождение и способ статистической обработки варьируют у разных производителей в процессе создания и валидации тест-системы и, соответственно, определяют разницу установленной пороговой величины, индивидуальной для каждой тест системы. Показано, что использование единой или нормализованной величины порогового значения позволяет увеличить сходимость результатов исследования, а также его чувствительность и специфичность (National SARS-CoV-2 serology assay evaluation group.Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison. Lancet Infect Dis.2020 Dec; 20(12): 1390-1400; Haselmann V. et al. Comparison of test performance of commercial anti-SARS-CoV-2 immunoassays in serum and plasma samples. Clin Chim Acta. 2020 Nov; 510:73-78).

Использование суммы результатов разноформатных тестов, нестандартизированных по условиям проведения анализа, также не позволяет делать объективные выводы о наличии антител к отдельным белкам SARS-CoV-2 (тем более об их относительном количестве), а, следовательно, о возможности подтверждения положительных или сомнительных результатов исследования, минимизации ЛПР исследования.

Раскрытие сущности изобретения

Настоящее техническое решение заключается в создании способа дифференцированного выявления специфических антител классов А, М, G к нуклеокапсиду и рецептор-связывающему домену спайк белка коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома-2 (SARS-CoV-2) и иммуноферментной тест-системы для выявления спектра антител к коронавирусу SARS-CoV-2, вызывающему COVID 19, позволяющей обеспечить дифференцированное (раздельное) выявление всех классов специфических антител к нуклеокапсиду и рецептор-связывающему домену спайк-белка SARS-CoV-2. Включает иммуносорбент на основе антигенов коронавируса представляющих собой рецептор-связывающий домен (RBD) и нуклеопротеин (N) SARS-CoV-2 и детектирующие реагенты, причем вышеперечисленные антигены сорбированы в разных лунках планшетов для ИФА; для сорбции используют 96-луночные разборные полистироловые планшеты.

Технический результат заключается в обеспечении повышения чувствительности, возможности подтверждения положительных или сомнительных результатов исследования, минимизации ЛПР исследования, разделения нативного и поствакцинального иммунитета, упрощение и удобство проведения анализа.

Преимуществом предлагаемой тест-системы является то, что она позволяет оценивать иммунный статус индивида по отношению к инфекции COVID 19 в стандартных условиях, одновременно выявляя антитела и к спайку и к нуклеокапсиду вируса SARS-CoV-2. Предлагаемый тест разработан в «сэндвич»-формате ИФА, позволяет выявлять суммарные антитела (классов G, М и А) к указанным белкам SARS-CoV-2. По процедуре постановки - одностадийный вариант ИФА (30 минут при 37°С в шейкере при 500 оборотах/мин) с последующей промывкой и проявлением реакции добавлением хромогенной смеси. Учет реакции проводится спектрофотометрически на ИФА-ридере.

Данное техническое решение отличается от известных:

1) Раздельным определением антител к N и S белкам вируса SARS-CoV-2 в одном наборе, сорбированным в разные лунки полистироловых планшетов;

2) Стандартными условиями проведения и общими реагентами теста для обоих белков, позволяющими обеспечить одинаковую кинетику иммунной и ферментативной реакции;

3) Единым значением порогового значения для обоих белков, определенным с использованием одной группы образцов и одинаковых статистических методов;

4) Удобством использования, заключающемся в предоставлении в одном наборе всех необходимых реагентов для определения антител к 2 различным антигенам вируса SARS-CoV-2.

Предложенное решение характеризуется:

- высокой чувствительностью и специфичностью (таблицы 2, 3, 4, 5);

- возможностью подтверждения положительных или сомнительных результатов исследования и минимизации ЛПР (таблицы 7, 8)

- возможностью разделения нативного и поствакцинального иммунитета (таблица 6, 8)

Осуществление изобретения

Набор реагентов для выявления спектра антител классов G, М, А к коронавирусу SARS-CoV-2 (COVID-19) методом ИФА («ДС-ИФА-АНТИ-8АК8-СоУ-2-СПЕКТР») предназначен для раздельного выявления антител классов G, М и А к нуклеокапсиду и спайк-белку SARS-CoV-2, вызывающему коронавирусную инфекцию COVID-19, в сыворотке или плазме крови человека.

Набор реагентов может быть использован для оценки иммунного ответа на перенесенную или текущую коронавирусную инфекцию COVID-19, лабораторной диагностики текущей инфекции в комплексе с другими исследованиями, подтверждения положительных или сомнительных результатов исследования, минимизации ЛПР исследования (в соответствии с п. 4.2. раздела «Лабораторная диагностика COVID-19» BMP МЗ РФ «Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19)», версия 9, от 26.10.2020 г.).

Средства и методы

Состав набора реагентов

Проведение ИФА

Учет результатов на анти-8АК8-СоУ-2-нуклеокапсид и aHTH-SARS-CoV-2-спайк проводить раздельно (для стрипов планшета, маркированных Nc, для стрипов планшета, маркированных Sp).

Реакцию учитывать, если значения оптической плотности (ОП) в лунках с К+ - не менее 0,600, а среднее значение ОП в лунках с К- - не более 0,150.

ОП крит. рассчитать по формуле:

ОП крит. = ОП cp.K- + A,

где A - коэффициент, определяемый производителем методом статистической обработки результатов постановки ИФА, величину которого указывают для каждой серии в инструкции по применению и в паспорте на серию.

Рассчитать коэффициент позитивности КП по формуле:

КП = ОПобразца/ОПкрит.

Исследуемые образцы расценивать как положительные: если КП ≥ 1,0 хотя бы в одной лунке.

Исследуемые образцы расценивать как отрицательные: если КП < 1,0 в обеих лунках.

Интерпретация результатов

Эффективность тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-SARS-CoV-2-СПЕКТР» продемонстрирована следующими примерами.

Пример 1.

Диагностическая чувствительность

Диагностическая чувствительность по коммерческой панели AccuSet™ SARS-CoV-2 Performance Panel 0820-0410, SeraCare. Согласно данным из паспорта панели, номера 1-10 содержат антитела к SARS-CoV-2, номер 11 - не содержит антитела к SARS-CoV-2. Результаты тестирования представлены в таблице 2.

Чувствительность «ДС-ИФА-АНТИ-SARS-CoV-2-СПЕКТР» по панели «AccuSet™ SARS-CoV-2 Performance Panel», 0820-0410 производства SeraCare составила 100%.

Диагностическую чувствительность набора реагентов «ДС-ИФА-АНТИ-SARS-CoV-2-СПЕКТР» (серия 243001 экс.-пр., годен до 2021-11-26; серия 243002 экс.-пр., годен до 2021-11-26) оценивали при исследовании 171 образца сыворотки крови от 105 пациентов с подтвержденным диагнозом COVID-19, полученного в разные сроки развития заболевания (0-47 дней после возникновения симптомов), предоставленного ФБУЗ «Приволжский окружной медицинский центр» Федерального медико-биологического агентства (ФБУЗ ПОМЦ ФМБА России). У всех пациентов диагноз COVID-19 был подтвержден лабораторно методом ПЦР-тестирования.

Были исследованы 35 клинических образцов сыворотки крови пациентов с подтвержденным диагнозом COVID-19, полученных в разные сроки развития заболевания, образцы предоставлены ФБУЗ «Республиканская клиническая инфекционная больница», г. Сыктывкар, Россия.

Для оценки диагностической чувствительности использовали коммерческие образцы (n=4) сыворотки крови пациентов с подтвержденным диагнозом COVID-19 Positive SARS-CoV-2 sample, Cantor Bioconnect, Канада, lot 190188, lot 190679, lot 190680, lot 190778.

Все исследуемые образцы были разделены на три группы по времени забора у пациентов от момента начала заболевания (появления первых симптомов): для ранней стадии заболевания ≤1 недели, для текущей инфекции 1-2 недели (8-14 дней), и для поздней стадии >2 недель от появления симптомов заболевания (таблица 3).

Согласно данным когортного серологического исследования Long Q.X. et al. (2020), у пациентов с диагнозом COVID-19 сероконверсия антител к SARS-CoV-2 происходит на 17-19 сутки после начала заболевания (Long Q.X. et al. Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients with COVID-19. Nat Med. 2020 Jun; 26(6):845-8). На основании приведенных в исследовании данных, была сформирована панель из 49 клинических образцов для оценки чувствительности тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-SARS-CoV-2-СПЕКТР». Панель состоит из 49 образцов сыворотки (плазмы) крови пациентов с подтвержденным диагнозом COVID-19 (положительные результаты ПЦР-тестирования и КТ грудной клетки). Все образцы были забраны с 17 по 47 день от начала появления симптомов заболевания (через две с половиной недели) (таблица 4).

В «ДС-ИФА-АНТИ-SARS-CoV-2-СПЕКТР» все образцы 49/49 показали положительный результат, диагностическая чувствительность тест-системы при выявлении антител у данной группы пациентов (>2,5 недель от начала заболевания) составила 100% (95% ДИ: 92,73-100,00%).

Пример 2.

Тестирование панели образцов, забранных с 1 по 28 день от начала появления симптомов COVID-19, параллельно с тестом сравнения

Протестировано одновременно в «ДС-ИФА-АНТИ-SARS-CoV-2-СПЕКТР» и тесте сравнения SARS-CoV-2-CoronaPass, Биопалитра, 33 образца от пациентов с клинически подтвержденным диагнозом COVID-19 из ФБУЗ ПОМЦ ФМБА России. Результаты представлены в таблице 5.

Из таблицы видно, что раздельное тестирование антител к каждому антигену уступает по чувствительности варианту, учитывающему одновременно иммунный ответ на оба антигена (ДС-ИФА-анти-SARS-CoV-2-СПЕКТР) - 90,9% и 93,9% против 100,0%. Чувствительность ДС-ИФА-анти-SARS-CoV-2-СПЕКТР также выше, чем у SARS-CoV-2-CoronaPass, Биопалитра, даже в части тестирования антител к спайк белку SARS-CoV-2, который лежит в основе тест-системы производства Биопалитра (93,9% против 78,8%).

Протестировано 54 образца сыворотки крови от 54 пациентов с лабораторно подтвержденной инфекцией COVID-19, полученных в реконвалесцентный период заболевания (59-127 день после возникновения симптомов). Диагностическая чувствительность составила 100% (95% ДИ: 93,36 - 100,00%).

Пример 3.

Тестирование образцов сыворотки крови от вакцинированных лиц

Протестированы 27 образцов сыворотки крови человека, полученные на 21 день после вакцинации второй дозой препарата «Гам-КОВИД-Вак Комбинированная векторная вакцина для профилактики коронавирусной инфекции, вызываемой вирусом SARS-CoV-2», ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, которые были предоставлены ГУЗ «Липецкая областная клиническая инфекционная больница», ГУЗ «Липецкий областной центр профилактики и борьбы со СПИД и ИЗ», ГУЗ «Грязинская центральная районная больница», ГУЗ «Липецкая больница скорой медицинской помощи №1», ГУЗ «Елецкая городская больница №1 им. Н.А. Семашко», ГУЗ «Городская больница №4 Липецк-Мед».

Образцы были исследованы в «ДС-ИФА-АНТИ-SARS-CoV-2-СПЕКТР» (серия 243001 экс.-пр., годен до 2021-11-26), результаты представлены в таблице 6.

При исследовании в «ДС-ИФА-АНТИ-SARS-CoV-2-СПЕКТР» 27 образцов сыворотки крови, полученных от лиц после вакцинации, антитела к нуклеокапсиду SARS-CoV-2 не выявлены, так как вакцина «Гам-КОВИД-Вак Комбинированная векторная вакцина для профилактики коронавирусной инфекции, вызываемой вирусом SARS-CoV-2» основана на последовательности спайк белка SARS-CoV-2, антитела к спайк белку содержат 27 из 27 образцов. Чувствительность «ДС-ИФА-АНТИ-SARS-CoV-2-СПЕКТР» по данной выборке составила 100% (95% ДИ: 87,54 - 100,00%).

Пример 4.

Оценка специфичности тест-системы

Была исследована коллекция образцов сыворотки крови человека, которые были забраны до ноября 2019 года и давали ложноположительную реакцию при определении антител к SARS-CoV-2 (n=22). Данная коллекция была протестирована в тест-системе «ДС-ИФА-АНТИ-SARS-CoV-2-СПЕКТР», результаты представлены в таблице 7.

Результаты исследования, показали, что 4/22 образца из коллекции ложноположительных продемонстрировали позитивный результат на aHTH-SARS-CoV-2-нуклеокапсид, все образцы из данной коллекции показали отрицательный результат на анти-SARS-CoV-2-спайк.

Данные выравнивания последовательности нуклеокапсида SARS-CoV-2 относительно последовательностей нуклеокапсидов сезонных коронавирусов человека (HKU1, NL63, ОС43, 229Е) с помощью ресурса NCBI National Center for Biotechnology Information, BLAST Protein, показали, что существует несколько коротких консервативных участков. Напротив, спайк (RBD) SARS-CoV-2 является уникальным регионом, который не имеет гомологичных участков с сезонными коронавирусами человека.

Исходя из вышесказанного, определение антител к нуклеокапсиду SARS-CoV-2 может давать ЛПР при наличии в образце антител к гомологичным эпитопам сезонных коронавирусов, а для определения антител к спайк (RBD) такое явление нехарактерно.

Диагностическая специфичность

Диагностическая специфичность тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-SARS-CoV-2-СПЕКТР» была оценена при исследовании:

- 242 образцов случайной выборки сыворотки крови доноров, забранных до ноября 2019 года, составила 99,17% (95% ДИ: 97,04 - 99,77%);

- 48 образцов сыворотки крови госпитальных пациентов с неинфекционными заболеваниями и составила 100% (95% ДИ: 92,59 - 100,00%).

Аналитическая специфичность

Аналитическая специфичность тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-SARS-CoV-2-СПЕКТР» была оценена при исследовании:

- 48 образцов сыворотки крови беременных. Специфичность составила 100%) (95% ДИ: 92,59 - 100,00%);

- 80 образцов сыворотки (плазмы) крови пациентов с инфекционными заболеваниями, вызванными вирусами гепатитов В, С, вирусом иммунодефицита человека, вирусом простого герпеса, цитомегаловирусом, вирусом Эпштейна-Барр. Специфичность составила 100% (95% ДИ: 95,42 - 100,00%).

Аналитическая интерференция

Влияние потенциально интерферирующих веществ на результаты исследований в тест-системе «ДС-ИФА-АНТИ-SARS-CoV-2-СПЕКТР» было оценено при тестировании:

- 50 образцов панели интерферирующих веществ IN.VENT. Специфичность составила 100,00% (95% ДИ: 92,86 - 100,00%). Установлено отсутствие интерференции при исследовании образцов сыворотки крови, содержащих антитела к Escherichia coli, НАМА, а также образцов сыворотки крови беременных. Определено, что наличие в образцах сыворотки крови ревматоидного фактора до 77,4 Ед/мл, билирубина до 502 мкмоль/л (0,3 мг/мл), триглицеридов до 6,61 мг/мл, холестерина до 2,04 мг/мл, гемоглобина до 2,65 мг/мл не влияет на качество исследований в тест-системе.

Перекрестная реактивность

Влияние потенциально перекрестно-реагирующих веществ на работу тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-SARS-CoV-2-СПЕКТР» было оценено при исследовании:

- 6 искусственных образцов сыворотки (плазмы) крови человека, содержащих молекулы моноклональных/поликлональных антител к возбудителям SARS и MERS и Fc-фрагменты иммуноглобулина человека. Специфичность составила 100,00% (95% ДИ: 60,97 - 100,00%);

- 8 образцов сыворотки крови человека, содержащих антитела к возбудителю малярии и вирусам гриппа A (H1N1), A (H3N2) и В. Специфичность составила 100,00% (95% ДИ: 67,56 - 100,00%).

Воспроизводимость

Коэффициент вариации тестирования положительных образцов внутри планшета, между планшетами одной серии и между сериями тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-SARS-CoV-2-СПЕКТР» не превышает 10%.

Эквивалентность образцов сыворотки и плазмы крови человека

Исследованием положительных (n=25) и отрицательных (n=25) на SARS-CoV-2 парных образцов сыворотки и плазмы крови человека, содержащих различные антикоагулянты (ЭДТА, гепарин, цитрат натрия), была показана их эквивалентность, что позволяет отнести показатели диагностической чувствительности и специфичности к обоим видам исследуемых образцов.

Спектры антител и интерпретация результатов

Варианты интерпретации результатов для разных групп исследованных образцов отражены в таблице 8. Из представленных данных видно, что спектр S+ N+ присутствует у 58, 3-100% пациентов с текущей или перенесенной инфекцией, в зависимости от срока заболевания, ни у одного из заведомо негативных доноров (донация до 2019 года), ни у одного из вакцинированных. Спектр S- N+ характерен для ранней фазы заболевания - от 2,4-3,3% (на сроках 0-14 дней), а также у 0,8%) заведомо негативных доноров, свидетельствуя о ранее перенесенной инфекции, вызванной сезонными коронавирусами. Наличие антител только в спайк белку вируса S+ N-, также наблюдается на ранних (до 15 дня) стадиях инфекции в 4,5-6,7%) случаев, у 100% лиц вакцинированных вакциной основанной на спайк белке вируса, и не наблюдается в группе заведомо отрицательных контролей. Отсутствие антител к обоим белкам S- N- может наблюдаться на первых 2 неделях заболевания - 3,3-33,3%.

Приведенные данные демонстрируют высокую диагностическую эффективность набора реагентов «ДС-ИФА-АНТИ-SARS-CoV-2-СПЕКТР». Тест-система по изобретнию может быть использована для выявления всех классов специфических антител к нуклеокапсиду и рецептор-связывающему домену спайк белка коронавируса SARS-CoV-2, с целью оценки иммунного ответа на перенесенную или текущую коронавирусную инфекцию COVID-19, лабораторной диагностики текущей инфекции в комплексе с другими исследованиями, подтверждения положительных или сомнительных результатов исследования, минимизации ЛПР исследования.

При этом диагностическая эффективность тест-системы и способа связаны не с конкретными последовательностями антигенов Nc и RBD Sp, а с раздельным определением антител к N и S белкам вируса S ARS-CoV-2 в одном наборе, сорбированным в разные лунки полистироловых планшетов; со стандартными условиями проведения и общими реагентами теста для обоих белков, позволяющими обеспечить одинаковую кинетику иммунной и ферментативной реакции; единым значением порогового значения для обоих белков, определенным с использованием одной группы образцов и одинаковых статистических методов.

SEQ ID NO: 1

MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA

SEQ ID NO: 2

VQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGATPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKPGEQKLISEEDLSAGGHHHHHHHHHH

1. Тест-система для выявления специфических антител классов A, M, G к нуклеокапсиду (Nc) и рецептор-связывающему домену спайк белка коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома-2 (SARS-CoV-2), содержащая набор реагентов для выявления специфических антител классов A, M, G к нуклеокапсиду и рецептор-связывающему домену (RBD) спайк белка (Sp) коронавируса SARS-CoV-2:

планшет полистироловый 96-луночный разборный до стрипов или до лунок, в лунках которого раздельно сорбированы рекомбинантные антигены SARS-CoV-2 - Nc и RBD Sp, а на поверхности стрипов нанесены краткие наименования иммобилизованных антигенов (иммуносорбент);

смесь рекомбинантных антигенов Nc и RBD Sp SARS-CoV-2, меченных пероксидазой хрена (конъюгат);

контрольный положительный образец, инактивированный (К+);

контрольный отрицательный образец, инактивированный (К-);

концентрат (×25) фосфатно-солевого буферного раствора с твином (ФСБ-Т);

раствор серной кислоты 0,2 М;

субстратный буферный раствор (СБ) - цитратный буфер, содержащий раствор перекиси водорода;

раствор, содержащий 3,3',5,5'-тетраметилбензидин - ТМБ (×11).

2. Тест-система по п. 1, где антигены SARS-CoV-2 - Nc и RBD Sp имеют последовательности

3. Способ дифференцированного выявления специфических антител классов А, М, G к нуклеокапсиду (Nc) и рецептор-связывающему домену спайк белка (Sp) коронавируса SARS-CoV-2, включающий использование тест-системы по пп. 1, 2 в одностадийном иммуноферментном анализе (ИФА), в рамку вставляют требуемое количество стрипов с иммобилизованными антигенами Nc и RBD Sp; в каждую лунку вносят по 80 мкл смеси рекомбинантных антигенов Nc и RBD Sp SARS-CoV-2, меченных пероксидазой хрена; для каждого антигена вносят в 1 лунку 20 мкл К+ и в 3 лунки К-; планшет накрывают защитной пленкой и выдерживают в термошейкере 30 мин при температуре 37,0±1,0°С и встряхивании при 500 об/мин; промывают планшет 4 раза концентратом (×25) фосфатно-солевого буферного раствора с твином (ФСБ-Т), осторожно внося указанный концентрат в лунки планшета до краев, не менее 350 мкл в лунку, затем удаляют содержимое лунок в емкость с дезинфицирующим раствором и проявляют реакции добавлением хромогенной смеси; во все лунки планшета вносят по 100 мкл субстратной смеси (цитратного буфера с перекисью водорода и ТМБ); планшет выдерживают 20 мин в защищенном от света месте при комнатной температуре 18-25°С; реакцию останавливают добавлением во все лунки по 150 мкл раствора серной кислоты 0,2 М и через 1-2 мин, но не позднее 20 мин измеряют оптическую плотность (ОП) при длине волны 450/620-680 нм; проводят учет результатов реакции, если значения оптической плотности (ОП) в лунках с (К+) - не менее 0,600, а среднее значение ОП в лунках с (К-) - не более 0,150, при этом ОП крит. рассчитывают по формуле:

ОПкрит.=ОПср.(К-)+А,

где А - коэффициент, определяемый производителем методом статистической обработки результатов постановки ИФА, величину которого указывают для каждой серии в инструкции по применению и в паспорте на серию,

рассчитывают коэффициент позитивности (КП) по формуле:

КП=ОПобразца/ОПкрит.,

исследуемые образцы расценивают как положительные, если КП≥1,0 хотя бы в одной лунке,

исследуемые образцы расценивают как отрицательные, если КП<1,0 в обеих лунках.