Липосомальные противоопухолевые композиции

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к онкологии, и предназначена для лечения рака. Фармацевтическая композиция для лечения рака содержит липосому, при этом липосома содержит: (i) множество липидов; (ii) слабоосновное противоопухолевое соединение и (iii) щавелевую кислоту, соль щавелевой кислоты, винную кислоту или соль винной кислоты. Массовое соотношение множества липидов и слабоосновного противоопухолевого соединения составляет от 20:1 до 100:1. Также представлен способ получения указанной фармацевтической композиции, включающий смешивание раствора, содержащего слабоосновное противоопухолевое соединение, с суспензией, содержащей множество липосом и щавелевую кислоту, соль щавелевой кислоты, винную кислоту или соль винной кислоты. Кроме того, обеспечивается набор для указанной фармацевтической композиции. Использование группы изобретений позволяет улучшить профиль высвобождения противоопухолевого соединения в зависимости от рН, химическую и физическую стабильность, а также повысить эффективность и привлекательность системы приготовления указанной композиции. 4 н. и 23 з.п. ф-лы, 23 ил., 38 табл., 13 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США № 62/385763, поданной 9 сентября 2016, полное содержание которой включено в данное описание посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Противоопухолевые средства, которые in vitro выглядят перспективными, могут не оправдать надежд при применении in vivo по причине отсутствия адекватной концентрации лекарственного средства в месте опухоли из-за дозолимитирующей токсичности и плохого локального накопления. За годы было разработано множество стратегий для улучшения внутриопухолевой доставки лекарственных средств, включая пассивное нацеливание лекарственного средства, активное нацеливание на опухолевые клетки и инициированное высвобождение лекарственных средств с помощью наноносителей [2-12]. Однако включение лекарственных средств в наноноситель может значительно изменить их кинетику и характеристики взаимодействия с клетками. Антибиотик антрациклинового ряда доксорубицин является эффективным противоопухолевым средством при различных злокачественных новообразованиях, но его применение строго ограничено из-за его кардиотоксических побочных эффектов. Инкапсуляция доксорубицина в пегилированные липосомные наноносители снижает типичные побочные эффекты, связанные с доксорубицином [4, 5, 7-8]. Кроме того, увеличивается время циркуляции [2], а специфическая доставка к опухоли улучшается благодаря усиленной проницаемости и эффекту удержания [3].

[0003] Стабильность липосом, содержащих противоопухолевые соединения, зависит как от стабильности липосом в крови, так и от стабильности лекарственных средств внутри липосом. Со стабильной формой лекарственных средств внутри липосом могут быть связаны такие свойства, как увеличение стабильности липосом, содержащих противоопухолевые средства, в крови, и снижение токсичности. Было показано, что доксорубицин может образовывать агрегаты с несколькими противоионами, такими как сульфат [1, 13-15], фосфат [13-14] и цитрат [1, 10, 13-15]. Поведение доксорубицина в части утечки из липосом, содержащих различные соли доксорубицина, подтверждают, что агрегат доксорубицин-соль определяет скорость высвобождения свободного доксорубицина из липосом.

[0004] Доксорубицин представляет собой химиотерапевтическое лекарственное средство. В липосомальном доксорубицине молекулы лекарственного средства заключены (инкапсулированы) в жировое покрытие, известное как липосома. Липосома позволяет доксорубицину дольше оставаться в организме [2]. Это означает, что большая часть химиотерапии доставляется к раковым клеткам, оказывая меньшие побочные эффекты на здоровые ткани [4, 5, 7-8]. В настоящее время на рынке представлены две липосомальные композиции доксорубицина, одобренные для применения у людей: Myocet® и Caelyx® (EU), он же Doxil® (США). Эти два липосомальных препарата доксорубицина в настоящее время действуют немного по-разному и применяются для лечения разных типов рака.

[0005] Лекарственный нанопрепарат Doxil® был одобрен для лечения СПИД-ассоциированной саркомы Капоши, рака яичников и молочной железы поздних стадий и множественной миеломы [4]. Doxil® состоит из пегилированных фосфолипидов и холестерина, загрузка осуществляется с помощью градиента сульфата аммония. Инкапсуляция доксорубицина в пегилированные липосомные наноносители снижает типичные побочные эффекты, связанные с доксорубицином [4-7]. Хотя инкапсулирование снижает кардиотоксичность и увеличивает период циркуляции в крови [2] и внутриопухолевую доставку [3], но терапевтическая эффективность по сравнению со свободной композицией остается довольно скромной [6-9, 11-12]. Для обеспечения более длительного периода циркуляции в крови и высокой стабильности носитель состоит из прочного бислоя фосфолипидов и ПЭГ-покрытия. Впоследствии, после попадания в опухолевый интерстиций, большая часть лекарственного средства остается инкапсулированной, и внутриклеточная биодоступность (то есть присутствие лекарственного средства в его внутриклеточной мишени) ограничена [9]. Таким образом, липосомальный состав Doxil® доставляет больше доксорубицина в опухоль, но не высвобождает активную молекулу доксорубицина эффективно. Это постоянное состояние с очень медленным высвобождением лекарственного средства может объяснять неудовлетворительный ответ опухолей по сравнению со свободным введением лекарственного средства и необходимость повторного введения. Действительно, противоопухолевая эффективность Doxil® затруднена из-за неудовлетворительного высвобождения активного лекарственного средства из липосом в опухоли [11]. Многочисленные опубликованные отчеты демонстрируют, что, хотя наблюдается значительное увеличение внутриопухолевого доксорубицина, доставляемого с помощью Doxil®, по сравнению с введением свободного доксорубицина, это значительное увеличение не обязательно коррелирует с увеличением внутриклеточной биодоступности и, следовательно, терапевтическими уровнями доксорубицина [9, 11-12]. Исследование кинетики свободного доксорубицина в сравнении с липосомальным доксорубицином (Doxil®) in vitro, а также in vivo показало, что в течение 8 часов после введения свободного доксорубицина 26% лекарственного средства перемещалось в ядро и при достижении определенной концентрации убивало клетку. В отличие от свободного доксорубицина, только 0,4% доксорубицина, введенного в виде липосомального препарата, проникло в ядро [12]. Также было продемонстрировано, что секвестрация липосомального доксорубицина в лизосомальном компартменте приводит к ограниченной доставке в ядро. Этот захват значительно снижает биодоступную концентрацию доксорубицина, доставляемого Doxil®, и, следовательно, делает ее неэффективной по сравнению со свободным доксорубицином при уничтожении опухолевых клеток [12]. Кроме того, это лекарственное средство связано с местной воспалительной реакцией тканей, называемой ладонно-подошвенной эритродизестезией (ЛПЭ) [10], что является недостатком липосом с пегилированным доксорубицином. Основными побочными эффектами Doxil® являются стоматит и токсическое воздействие на кожу [7, 10]. Фактически, хотя кардиотоксичность снижается за счет пегилирования, длительный период циркуляции часто приводит к токсическому воздействию на кожу, называемому ладонно-подошвенной эритродизестезией (ЛПЭ) [7, 10, 38-39], что является недостатком пегилированных липосом, загруженных доксорубицином, который еще предстоит преодолеть.

[0006] Myocet® содержит яичный фосфатидилхолин/холестерин, загрузка осуществляется с помощью градиента цитрата. Хотя образование агрегатов доксорубицин-цитрат приводит к относительно высокой скорости высвобождения лекарственного средства при рН 4,5-5,5 (желательный результат в кислой лизосомальной среде) [1, 13-15], это также приводит к дополнительной утечке доксорубицина из липосом при физиологическом рН и температуре 37°С [14]. Такой профиль высвобождения приведет к потере доксорубицина из липосом во время циркуляции липосом в крови, и уменьшению эффективной концентрации инкорпорированного Dox (доксорубицина) [14]. В долгосрочной перспективе (в зависимости от режима приема) это может привести к более высокой токсичности и снижению эффективности лекарственной формы доксорубицина и более короткому сроку годности липосомальной суспензии. Для того, чтобы решить проблему со стабильностью, Myocet® поставляют в виде системы из трех флаконов, при этом требуется, чтобы аптека с рецептурно-производственным отделом соблюдала многостадийный протокол для приготовления загруженных доксорубицином липосом до их введения пациентам. Действительно, процедура включает нагревание и энергичное встряхивание и состоит из нескольких стадий, которые включают раздельное восстановление липосомного материала и доксорубицина в различных средах, регулирование pH пустых липосом, нагревание материала до температуры 55-60°С, загрузку доксорубицина в липосомы и охлаждение материала до комнатной температуры перед применением. Такой состав очень неудобно готовить у постели больного.

[0007] Таким образом, есть возможность усовершенствования существующих способов лечения. Хотя Doxil® обладает превосходной стабильностью как липосомальная суспензия и, следовательно, имеет привлекательный формат, находясь в одном флаконе, противоопухолевая эффективность Doxil® сдерживается уменьшенным или ограниченным высвобождением активного лекарственного средства из липосомы в опухоли. По сравнению с Doxil®, Myocet® демонстрирует заметно более высокое высвобождение доксорубицина при кислотном pH (опухоль), но происходит утечка доксорубицина из липосом при физиологическом pH, что приводит к снижению безопасности и эффективности лекарственного средства. Продукт Myocet® также требует, чтобы аптека соблюдала сложный многостадийный протокол для приготовления загруженных доксорубицином липосом до введения пациентам.

[0008] Таким образом, существует потребность в разработке новых липосомальных наноносителей с улучшенными профилями высвобождения лекарственного средства по сравнению с известными продуктами, доступными на рынке (например, Myocet® и Doxil®), и с простой, эффективной и привлекательной системой приготовления составов. В настоящем документе представлены решения этих и других потребностей в данной области.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0009] Настоящее изобретение относится среди прочего к противоопухолевым композициям и способам их получения. В определенных аспектах настоящего изобретения композиция представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую липосому. Липосома содержит слабоосновное противоопухолевое соединение и кислоту или соль указанного соединения. В вариантах реализации настоящего изобретения указанная кислота представляет собой щавелевую кислоту или винную кислоту. В вариантах реализации настоящего изобретения указанное слабоосновное противоопухолевое соединение представляет собой доксорубицин, иринотекан, митоксантрон или их комбинацию.

[0010] В вариантах реализации настоящего изобретения указанная липосома содержит полоксамер. В вариантах реализации настоящего изобретения указанный полоксамер представляет собой полоксамер 188.

[0011] В вариантах реализации настоящего изобретения указанная липосома содержит множество липидных соединений. Массовое соотношение указанного множества липидов к указанному слабоосновному противоопухолевому агенту может составлять по меньшей мере 20/1. В вариантах реализации настоящего изобретения липосома содержит множество липидных соединений, и массовое соотношение указанного множества липидов к указанному слабоосновному противоопухолевому агенту составляет от примерно 20/1 до примерно 100/1. В вариантах реализации настоящего изобретения указанная липосома содержит множество липидных соединений, и массовое соотношение указанного множества липидов к указанному слабоосновному противоопухолевому агенту составляет от 20/1 до примерно 50/1.

[0012] В вариантах реализации настоящего изобретения указанное слабоосновное противоопухолевое соединение по существу высвобождается из липосомы только при кислотном pH. В вариантах реализации настоящего изобретения по меньшей мере 10-100% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН от 5,0 до 6,7 в стандартных условиях анализа. В варианте реализации настоящего изобретения менее чем 5% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН 7,4 в стандартных условиях анализа. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа включают 20-кратное и/или 50-кратное разведение в буфере PBS с pH 5,0 или выше, например, pH 5,0, pH 5,5, pH 6,0, pH 6,5, pH 6,7, pH 7,0 или pH 7,4 или любые промежуточные значения pH, или в сыворотке крови человека или в крови человека, и инкубацию при температуре 37°C в течение 2, 4 или 8 часов. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа включают 20-кратное и/или 50-кратное разведение в буфере PBS. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа включают инкубацию в буфере PBS с рН примерно 5,0. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа включают инкубацию в буфере PBS с рН примерно 5,5. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа включают инкубацию в буфере PBS с рН примерно 6,0. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа включают инкубацию в буфере PBS с рН примерно 6,5. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа включают инкубацию в буфере PBS с рН примерно 6,7. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа включают инкубацию в буфере PBS с рН примерно 7,0. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа включают инкубацию в буфере PBS с рН примерно 7,4. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа включают инкубацию в плазме крови человека или в крови человека. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа включают инкубацию при температуре 37°C в течение примерно 2 часов. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа включают инкубацию при температуре 37°C в течение примерно 4 часов. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа включают инкубацию при температуре 37°C в течение примерно 6 часов.

[0013] В вариантах реализации настоящего изобретения липосома является по существу сферической. В вариантах реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит множество липосом со средним наибольшим размером примерно 60-80 нм, определяемым как усредненные по интенсивности диаметры частиц (Z-среднее) при измерении с помощью динамического рассеяния света. В вариантах реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит множество липосом со средним наибольшим размером примерно 10-30 нм, определяемым по количественным диаметрам частиц при измерении с помощью динамического рассеяния света. В вариантах реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит множество липосом, имеющих средний наибольший размер от 10 до 30 нм, определенный с помощью криотрансмиссионной электронной микроскопии.

[0014] В вариантах реализации настоящего изобретения липосома содержит примерно 500-1000 мкг/мл слабоосновного противоопухолевого соединения и необязательно кислоту или соль указанного соединения. В вариантах реализации настоящего изобретения липосома содержит примерно 700-850 мкг/мл слабоосновного противоопухолевого соединения и, в применимых случаях, кислоту или соль указанного соединения. В вариантах реализации настоящего изобретения липосома содержит множество слабоосновных противоопухолевых соединений, образующих агрегат. Указанный агрегат может быть некристаллическим. Указанный некристаллический агрегат может быть частично или полностью неупорядоченным. В вариантах реализации настоящего изобретения липосома содержит множество указанного слабоосновного противоопухолевого соединения и сохраняет более 90% множества слабоосновного противоопухолевого соединения через 40 дней при хранении при температуре 2-8°C в стандартных условиях хранения.

[0015] В вариантах реализации настоящего изобретения указанная липосома не содержит холестерин или полоксамер 188. В вариантах реализации настоящего изобретения указанная липосома не содержит кислое органическое соединение, отличное от щавелевой кислоты, винной кислоты или их солей. В вариантах реализации настоящего изобретения указанная липосома не содержит активный агент, отличный от указанного слабоосновного противоопухолевого соединения. В вариантах реализации настоящего изобретения указанная липосома не содержит лекарственное средство, отличное от указанного слабоосновного противоопухолевого соединения. В вариантах реализации настоящего изобретения указанная липосома не содержит фармацевтически активное соединение, отличное от указанного слабоосновного противоопухолевого соединения. В вариантах реализации настоящего изобретения указанная липосома не содержит какого-либо противоопухолевого соединения, кроме указанного слабоосновного противоопухолевого соединения (например, липосома содержит слабоосновное противоопухолевое соединение только одной химической структуры, включая его соли).

[0016] В вариантах реализации настоящего изобретения указанную липосому получают путем загрузки указанного слабоосновного противоопухолевого соединения в незагруженную липосому с последующей инкубацией при комнатной температуре. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения указанные незагруженные липосомы хранят в течение примерно 30 дней. В вариантах реализации настоящего изобретения указанные незагруженные липосомы хранят в течение примерно 60 дней. В вариантах реализации настоящего изобретения указанные незагруженные липосомы хранят в течение примерно 90 дней. В вариантах реализации настоящего изобретения указанные незагруженные липосомы хранят в течение примерно 120 дней. В вариантах реализации настоящего изобретения указанные незагруженные липосомы хранят в течение примерно 150 дней. В вариантах реализации настоящего изобретения указанные незагруженные липосомы хранят в течение примерно 180 дней. В вариантах реализации настоящего изобретения указанные незагруженные липосомы хранят в течение примерно 210 дней. В вариантах реализации настоящего изобретения указанные незагруженные липосомы хранят в течение примерно 240 дней. В вариантах реализации настоящего изобретения указанные незагруженные липосомы хранят в течение примерно 270 дней. В вариантах реализации настоящего изобретения указанные незагруженные липосомы хранят в течение примерно 300 дней. В вариантах реализации настоящего изобретения указанные незагруженные липосомы хранят в течение примерно 330 дней. В вариантах реализации настоящего изобретения указанные незагруженные липосомы хранят в течение примерно 360 дней. В вариантах реализации настоящего изобретения указанные незагруженные липосомы хранят в течение примерно 390 дней. В вариантах реализации настоящего изобретения указанные незагруженные липосомы хранят в течение примерно 420 дней. В вариантах реализации настоящего изобретения указанные незагруженные липосомы хранят в течение примерно 450 дней. В вариантах реализации настоящего изобретения указанные незагруженные липосомы хранят в течение примерно 480 дней. В вариантах реализации настоящего изобретения указанные незагруженные липосомы хранят в течение примерно 510 дней. В вариантах реализации настоящего изобретения указанные незагруженные липосомы хранят в течение примерно 540 дней. В вариантах реализации настоящего изобретения указанные незагруженные липосомы хранят при температуре 2-8 °С в стандартных условиях хранения. В вариантах реализации настоящего изобретения указанные незагруженные липосомы, хранящиеся в любых вышеупомянутых условиях, сохраняют более 90% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения после загрузки указанного слабоосновного противоопухолевого соединения. В вариантах реализации настоящего изобретения по меньшей мере 40-80% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН 5,0 в стандартных условиях анализа. В вариантах реализации настоящего изобретения по меньшей мере 20-60% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН 6,0. В вариантах реализации настоящего изобретения по меньшей мере 7-30% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН 6,7 в стандартных условиях анализа. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения менее чем 5% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН 7,4 в стандартных условиях анализа.

[0017] Другие аспекты относятся к способу получения липосомы, содержащей (т.е. включающей или инкапсулирующей) указанное слабоосновное противоопухолевое соединение, кислоту или соль указанного соединения. В вариантах реализации настоящего изобретения указанная кислота представляет собой щавелевую кислоту или винную кислоту. Указанный способ включает: смешивание раствора указанного слабоосновного противоопухолевого соединения с суспензией, содержащей липосомы, содержащие инкапсулированную кислоту или соль; и инкубирование раствора слабоосновного противоопухолевого соединения с суспензией, содержащей липосомы, содержащие инкапсулированную кислоту или соль. В вариантах реализации настоящего изобретения в липосомах удерживается примерно 85-100% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения, применяемого для смешивания с суспензией липосом, содержащих инкапсулированную кислоту или соль. В вариантах реализации настоящего изобретения в липосомах удерживается примерно 90-100% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения, применяемого для смешивания с суспензией липосом, содержащих инкапсулированную кислоту или соль. В вариантах реализации настоящего изобретения стадию инкубации осуществляют при комнатной температуре. В вариантах реализации настоящего изобретения стадия инкубации длится примерно 10-30 минут. В вариантах реализации настоящего изобретения стадия инкубации длится примерно 5-25 минут.

[0018] Другие аспекты относятся к набору, содержащему первый флакон, содержащий слабоосновное противоопухолевое соединение, и второй флакон, содержащий суспензию липосом, содержащих инкапсулированную кислоту или соль. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения указанное слабоосновное противоопухолевое соединение в первом флаконе представляет собой лиофилизированное слабоосновное противоопухолевое соединение. В вариантах реализации настоящего изобретения указанная суспензия липосом, содержащая инкапсулированную кислоту или соль во втором флаконе представляет собой водную суспензию липосом.

[0019] Другие аспекты относятся к способу применения набора, описанного выше, включающему смешивание содержимого первого флакона с содержимым второго флакона. В вариантах реализации настоящего изобретения указанное смешивание происходит при комнатной температуре.

[0020] В варианте реализации настоящего изобретения описан способ получения липосомы, содержащей указанное слабоосновное противоопухолевое соединение и кислоту или соль указанного соединения. В вариантах реализации настоящего изобретения указанная кислота представляет собой лимонную кислоту. Указанный способ включает смешивание раствора указанного слабоосновного противоопухолевого соединения и кислоты или соли указанного соединения с суспензией, содержащей липосомы, содержащие инкапсулированную кислоту или соль указанного соединения; и инкубирование раствора слабоосновного противоопухолевого соединения и кислоты или соли указанного соединения с суспензией, содержащей липосомы, содержащие инкапсулированную кислоту или соль указанного соединения.

[0021] Вариант реализации настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей липосому, содержащую слабоосновное противоопухолевое соединение и кислоту или соль указанного соединения. В вариантах реализации настоящего изобретения указанная кислота представляет собой лимонную кислоту. В вариантах реализации настоящего изобретения указанная липосома содержит множество липидных соединений, и массовое соотношение указанного множества липидов к указанному слабоосновному противоопухолевому агенту составляет по меньшей мере 20/1.

[0022] Другие аспекты относятся к способу лечения рака у субъекта. Указанные способ включает введение эффективного количества фармацевтической композиции субъекту, нуждающемуся в лечении. Указанная фармацевтическая композиция содержит липосому, содержащую слабоосновное противоопухолевое соединение и кислоту или соль указанного соединения. В вариантах реализации настоящего изобретения указанная кислота представляет собой щавелевую кислоту или винную кислоту. Указанное слабоосновное противоопухолевое соединение обладает противоопухолевой активностью в отношении рака.

[0023] Каждый из аспектов и вариантов реализации, описанных в данном документе, можно применять вместе, если только они ясным или явным образом не исключены из контекста указанного аспекта или варианта реализации.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0024] На фиг. 1 схематично представлены градиенты pH в (A) системном кровообращении, (B) опухоли и локальной среде и (C и D) внутри клетки. На (E) показаны желаемые профили высвобождения в диапазоне pH 8,0-5,0.

[0025] На фиг. 2 представлена схема эксперимента для исследования in vivo.

[0026] На фиг. 3 представлена столбчатая диаграмма, показывающая высвобождение внутрилипосомального доксорубицина в процентах в растворяющую среду после инкубации при температуре 37 °С в течение 8 часов. Загрузку доксорубицина в липосомы проводили при температуре 70 °С. Левые столбцы в каждой паре - высвобождение при рН 5; правые столбцы в каждой паре - высвобождение при рН 7,4. Каждая точка на кривых представляет собой среднее±стандартное отклонение (STD) данных, полученных в 2-6 независимых экспериментах. Для каждого эксперимента все измерения проводили в шести повторностях.

[0027] На фиг. 4 представлена микрофотография (полученная при помощи криотрансмиссионной электронной микроскопии, C-TEM) EPC/хол. липосом, загруженных доксорубицином при помощи градиента (NH₄)₂HPO₄ [13].

[0028] На фиг. 5 представлено C-TEM-изображение доксорубицина, загруженного в липосомы, забуференные цитратом [15].

[0029] На фиг. 6A и фиг. 6B представлены изображения, полученные при помощи криотрансмиссионной электронной микроскопии (СТЕМ), липосом, полученных в цитрате [15] (фиг. 6А), и липосом, полученных в (NH₄)₂SO₄ [15, 25] (фиг. 6В).

[0030] На фиг. 7A, 7B и 7C при помощи криотрансмиссионной электронной микроскопии охарактеризованы доксорубицин-оксалатные липосомы (лот# 647-2-157). На Фиг. 7A увеличение составляет 27K и на фиг. 7B и 7C увеличение составляет 50K.

[0031] На фиг. 8 представлен график, показывающий влияние соотношения липида к лекарственному средству (или соотношение липид/лекарственное средство или липид:лекарственное средство) на высвобождение внутрилипосомального доксорубицина в процентах в растворяющую среду за 8 часов. Загрузку доксорубицина в оксалатсодержащие липосомы проводили при температуре 70 °С. Эксперимент по высвобождению проводили при температуре 37 °С. Высвобождение при рН 5,0 - верхняя кривая. Высвобождение при рН 7,4 - нижняя кривая. Каждая точка на кривых представляет собой среднее±стандартное отклонение (STD) данных, полученных в 2-3 независимых экспериментах. Для каждого эксперимента все измерения проводили в шести повторностях.

[0032] На фиг. 9 представлен собой график, показывающий влияние плацебо, свободного доксорубицина, Doxil® и липосом, содержащих доксорубицин-оксалат, на уровень смертности мышей. Мышей делили на 4 группы (8 мышей в каждой группе, получавшей лечение Rx-препаратами; 6 мышей в группе плацебо). Все тестируемые изделия вводили мышам в течение трех последовательных дней посредством внутривенных (в/в) инъекций. Каждая группа, получавшая лечение Rx-препаратами, получала 3 мг/кг доксорубицина при помощи инъекции. Группа 1 (плацебо) получала липидный состав без лекарственных средств. Группа 2 получала оксалатные липосомы с доксорубицином (лот № 647-2-13). Группа 3 получала Doxil®. Группа 4 получала свободный доксорубицин. Лечение также обозначено на графике. На графике день введения клеток В-лимфомы определяется как день 0.

[0033] На фиг. 10 представлен график, показывающий влияние соотношения липид/лекарственное средство на высвобождение внутрилипосомального доксорубицина в процентах в растворяющую среду за 8 часов. Загрузка доксорубицина в тартратсодержащие липосомы проводилась при температуре 70 °С. Эксперимент по высвобождению проводили при температуре 37 °С. Высвобождение при рН 5,0 - верхняя кривая. Высвобождение при рН 7,4 - нижняя кривая. Каждая точка на кривых представляет собой среднее±стандартное отклонение (STD) данных, полученных в 2-3 независимых экспериментах. Для каждого эксперимента все измерения проводили в шести повторностях.

[0034] На фиг. 11 представлен график, показывающий влияние соотношения липид/лекарственное средство на высвобождение внутрилипосомального доксорубицина в процентах в растворяющую среду за 8 часов. Загрузку доксорубицина в оксалатсодержащие липосомы проводили при комнатной температуре. Эксперимент по высвобождению проводили при температуре 37 °С. Высвобождение при рН 5,0 - верхняя кривая. Высвобождение при рН 7,4 - нижняя кривая. Каждая точка на кривых представляет собой среднее±стандартное отклонение (STD) данных, полученных в 2-3 независимых экспериментах. Для каждого эксперимента все измерения проводили в шести повторностях.

[0035] На фиг. 12 представлен график, показывающий влияние соотношения липид/лекарственное средство на высвобождение внутрилипосомального доксорубицина в процентах в растворяющую среду за 8 часов. Загрузку доксорубицина в тартратсодержащие липосомы проводили при комнатной температуре. Эксперимент по высвобождению проводили при температуре 37 °С. Высвобождение при рН 5,0 - верхняя кривая. Высвобождение при рН 7,4 - нижняя кривая. Каждая точка на кривых представляет собой среднее±стандартное отклонение (STD) данных, полученных в 2-3 независимых экспериментах. Для каждого эксперимента все измерения проводили в шести повторностях.

[0036] На фиг. 13 представлен график, показывающий влияние различной температуры загрузки на высвобождение внутрилипосомального доксорубицина в растворяющую среду, определенное при температуре 37 °С. Загрузку доксорубицина в оксалатсодержащие липосомы проводили при температуре 70 °С: а) высвобождение при рН 5,0 (верхняя сплошная линия); b) высвобождение при рН 7,4 (нижняя сплошная линия); каждая точка на кривых представляет собой среднее±стандартное отклонение данных, полученных в четырех независимых экспериментах. Загрузку доксорубицина в оксалатсодержащие липосомы проводили при комнатной температуре: c) высвобождение при рН 5,0 (верхняя сплошная линия); высвобождение при рН 7,4 (нижняя сплошная линия); каждая точка на кривых представляет собой среднее±стандартное отклонение данных, полученных в двух независимых экспериментах. Для каждого эксперимента все измерения проводили в шести повторностях.

[0037] На фиг. 14 представлен график, показывающий влияние различной температуры загрузки на высвобождение внутрилипосомального доксорубицина в растворяющую среду, определенное при температуре 37 °С. Загрузку доксорубицина в тартратсодержащие липосомы проводили при температуре 70 °С: а) высвобождение при рН 5,0 (верхняя сплошная линия); b) высвобождение при рН 7,4 (нижняя сплошная линия); каждая точка на кривых представляет собой среднее±стандартное отклонение данных, полученных в двух независимых экспериментах. Загрузку доксорубицина в тартратсодержащие липосомы проводили при комнатной температуре. c) высвобождение при рН 5,0 (верхняя сплошная линия); высвобождение при рН 7,4 (нижняя сплошная линия); каждая точка на кривых представляет собой среднее±стандартное отклонение данных, полученных в двух независимых экспериментах. Для каждого эксперимента все измерения проводили в шести повторностях.

[0038] На фиг. 15 представлена диаграмма, показывающая высвобождение внутрилипосомального доксорубицина процентах в растворяющую среду после инкубации при температуре 37 °С в течение 8 часов. Загрузку доксорубицина в липосомы проводили при комнатной температуре. Левые столбцы в каждой паре - высвобождение при рН 5; правые столбцы в каждой паре - высвобождение при рН 7,4. Каждая точка на кривых представляет собой среднее±стандартное отклонение (STD) данных, полученных в 2-3 независимых экспериментах. Для каждого эксперимента все измерения проводили в шести повторностях.

[0039] На фиг. 16 представлен график, показывающий влияние различных противоионов на рН-зависимое высвобождение доксорубицина из липосом. Сравнение с Doxil® и ʺMyocetʺ. Липосомный материал 20-кратно разводили в растворяющей среде и проводили эксперименты по высвобождению при температуре 37 °С в течение 8 часов при рН 7,4, 6,7, 6,0 и 5,0. Каждая точка на кривых представляет собой среднее±стандартное отклонение (STD) данных, полученных в 2-3 независимых экспериментах. Для каждого эксперимента все измерения проводили в шести повторностях. Состав композиции, соотношение липида к лекарственному средству (то есть липид/лекарственное средство) и соотношения фосфолипида к свободному холестерину (то есть фосфолипид/свободный холестерин или PL/FC) приведены в таблицах 28e - 28g.

[0040] На фиг. 17 представлен график, показывающий влияние различных противоионов на рН-зависимое высвобождение доксорубицина из липосом. Сравнение с Doxil® и ʺMyocetʺ. Липосомный материал 50-кратно разводили в растворяющей среде и проводили эксперименты по высвобождению при температуре 37 °С в течение 8 часов при рН 7,4, 6,7, 6,0 и 5,0. Каждая точка на кривых представляет собой среднее±стандартное отклонение (STD) данных, полученных в 2-3 независимых экспериментах. Для каждого эксперимента все измерения проводили в шести повторностях. Состав композиции, соотношения липид/лекарственное средство и фосфолипид/свободный холестерин (PL/FC) приведены в таблицах 28e - 28g.

[0041] На фиг. 18 представлен график, показывающий влияние соотношений липид/лекарственное средство и фосфолипид/свободный холестерин (PL/FC) на рН-зависимое высвобождение доксорубицина из липосом. Сравнение с Doxil® и ʺMyocetʺ. Липосомный материал 20-кратно разводили в растворяющей среде и проводили эксперименты по высвобождению при температуре 37 °С в течение 8 часов при рН 7,4, 6,7, 6,0 и 5,0. Каждая точка на кривых представляет собой среднее±стандартное отклонение (STD) данных, полученных в 2-3 независимых экспериментах. Для каждого эксперимента все измерения проводили в шести повторностях. Состав композиции, соотношения липид/лекарственное средство и фосфолипид/свободный холестерин (PL/FC) приведены в таблицах 28e - 28g.

[0042] На фиг. 19 представлен график, показывающий влияние соотношений липид/лекарственное средство и фосфолипид/свободный холестерин (PL/FC) на рН-зависимое высвобождение доксорубицина из липосом. Сравнение с Doxil® и ʺMyocetʺ. Липосомный материал 20-кратно разводили в растворяющей среде и проводили эксперименты по высвобождению при температуре 37 °С в течение 8 часов при рН 7,4, 6,7, 6,0 и 5,0. Каждая точка на кривых представляет собой среднее±стандартное отклонение (STD) данных, полученных в 2-3 независимых экспериментах. Для каждого эксперимента все измерения проводили в шести повторностях. Состав композиции, соотношения липид/лекарственное средство и фосфолипид/свободный холестерин (PL/FC) приведены в таблицах 28e - 28g.

[0043] На фиг. 20 представлен график, показывающий влияние соотношения липид/лекарственное средство на стабильность липосом в сыворотке. Сравнение с Doxil® и ʺMyocetʺ. Липосомный материал 50-кратно разводили в сыворотке человека и наблюдали за стабильностью липосом при температуре 37 °С в течение 2, 4 и 8 часов. Каждая точка на кривых представляет собой среднее±стандартное отклонение (STD) данных, полученных в 2-3 независимых экспериментах. Для каждого эксперимента все измерения проводили в шести повторностях. Состав композиции, соотношения липид/лекарственное средство и фосфолипид/свободный холестерин (PL/FC) приведены в таблицах 28e и 28h.

[0044] На фиг. 21 представлен график, показывающий влияние соотношения фосфолипид/свободный холестерин (PL/FC) на стабильность липосом в сыворотке. Сравнение с Doxil® и ʺMyocetʺ. Липосомный материал 50-кратно разводили в сыворотке человека и наблюдали за стабильностью липосом при температуре 37 °С в течение 2, 4 и 8 часов. Каждая точка на кривых представляет собой среднее±стандартное отклонение (STD) данных, полученных в 2-3 независимых экспериментах. Для каждого эксперимента все измерения проводили в шести повторностях. Состав композиции, соотношения липид/лекарственное средство и фосфолипид/свободный холестерин (PL/FC) приведены в таблицах 28e и 28h.

[0045] На фиг. 22 представлена диаграмма, показывающая высвобождение внутрилипосомального иринотекана в процентах в растворяющую среду (pH 5) после инкубации при температуре 37 °С в течение 2 часов. Каждая точка на кривых представляет собой среднее±стандартное отклонение (STD) данных, полученных в 2-6 независимых экспериментах. Для каждого эксперимента все измерения проводили в шести повторностях.

[0046] На фиг. 23А и фиг. 23B представлены изображения растворов митоксантрона при pH 7,4 и pH 5,0. На фиг. 23А показан раствор в момент времени 0. На фиг. 23А показан раствор в момент времени 24 ч. Загрузку митоксантрона в липосомы проводили при температуре 2-8 °С.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0047] Настоящее изобретение относится к композициям и способам, применяемым для получения стабильных противоопухолевых соединений и кислот или их солей и субмикронных частиц с высоким содержанием липидов (наночастиц с липосомами), подходящих для доставки лекарственных средств. Композиции и способы согласно настоящему изобретению можно аналогичным образом применять с другими солями лекарственных средств в липосомах. Композиции с солями доксорубицина и структура липосом, полученных согласно способам, описанным в настоящем документе, обеспечивают желательные биологические и физико-химические характеристики (профиль высвобождения лекарственного средства в зависимости от рН).

[0048] Варианты реализации настоящего изобретения, в которых применяется противоопухолевое соединение доксорубицин, обладают улучшенной терапевтической полезностью настоящего изобретения по сравнению с известными видами терапии доксорубицином, инкапсулированным в липосомах, а именно, такие варианты реализации настоящего изобретения имеют более желательный профиль высвобождения, который включает в себя низкую скорость высвобождения доксорубицина из липосом при физиологическом рН ~ 7,4 (в кровообращении) и значительно большую скорость высвобождения при более кислом рН 5,0-6,7 (например, после воздействия локальной среды опухоли или эндосомальной/лизосомальной среды после интернализации липосом, загруженных доксорубицином, раковыми клетками).

[0049] Существуют многочисленные опубликованные отчеты, указывающие на существование и важность градиента рН между нормальными тканями и опухолью, а также на влияние рН-зависимого высвобождения лекарственного средства из липосом не только для доставки, но и для обеспечения доступности свободного лекарственного средства (посредством эффективного высвобождения) для раковых клеток [1, 10, 13-15, 25, 40-42]. Одним из основных различий между многими солидными опухолями и окружающими нормальными тканями является питательная и метаболическая среда. Функциональная сосудистая сеть опухолей часто недостаточна для удовлетворения потребностей растущей популяции опухолевых клеток в питании, что приводит к дефициту кислорода и многих других питательных веществ. Выработка молочной кислоты в анаэробных условиях и гидролиз АТФ в среде с дефицитом энергии способствуют кислой микросреде, обнаруженной во многих типах опухолей [35]. pH в нормальных тканях человека и грызунов варьируется в диапазоне от 7,00 до 8,06, тогда как в злокачественной ткани был определен более широкий диапазон значений pH, примерно от 5,8 до 7,6 в опухолях человека и грызунов [1, 41-42].

[0050] Таким образом, желательный профиль высвобождения доксорубицина из липосом будет следующим: максимальная скорость высвобождения при кислотном рН 5,0-6,7 (т.е. после воздействия местной среды опухоли или эндосомальной/лизосомальной среды при интернализации липосом раковыми клетками), и подавление высвобождения из липосом при физиологическом рН ~ 7,4 (в кровотоке).

Определения

[0051] Используемый в настоящем документе термин «липосомы» обозначает наночастицы, в основном сферические, состоящие из липидного бислоя. В вариантах реализации настоящего изобретения липосомы могут инкапсулировать терапевтические агенты для доставки. Содержание липидов в липосомах может варьироваться, изменяя размер липосом, их стабильность, растворимость, кривизну и т. д. Примеры липидов включают, но не ограничиваются ими, холестерин, продукты/производные фосфатидилхолина (PC, англ. phosphatidylcholine) (жирные кислоты с различной длиной углеродной цепи, насыщенные, мультиненасыщенные и смешанные PC); 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE); 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфат (DMPA); 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфат (DPPA); 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфат (DOPA); 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфо- (1'-рац-глицерин) (DMPG); 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфо- (1'-рац-глицерин) (DPPG); 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфо- (1'-рац-глицерин) (DOPG); 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DMPC); 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серин (DMPS); 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серин (DPPS); 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серин (DOPC); 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- [метокси(полиэтиленгликоль)- 2000] (DSPE-mPEG-2000); 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтанол-амин-N- [фолат(полиэтиленгликоль)- 5000] (DSPE-mPEG-5000); 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- [амино(полиэтиленгликоль)- 2000] (DSPE-PEG-2000); 1,2-стеароил-3-триметиламмонийпропан (DOTAP); L-α-фосфатидилхолин, гидрогенизированный (Hydro Soy PC) и 2-стеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (Lyso PC).

[0052] Используемые в настоящем документе термины «включает», «инкапсулирует» или «удерживает» означает включение, например, в липосому. В контексте формулы изобретения в настоящем документе также может употребляться термин «содержит». Например, липосома может содержать терапевтический агент, такой как противоопухолевое соединение, или кислоту или соль указанного соединения. В вариантах реализации настоящего изобретения, из липосомы с течением времени может рассеиваться или диффундировать терапевтический агент, когда он в ней содержится.

[0053] Используемый в настоящем документе термин «слабоосновное противоопухолевое соединение» включает любое терапевтическое средство, подходящее для лечения рака или опухолевого заболевания со слабоосновной pKa. В вариантах реализации настоящего изобретения слабоосновное значение pH означает pKa примерно 7,0-10,0. В вариантах реализации настоящего изобретения слабоосновное значение pH означает pKa примерно 7,0-9,0. В вариантах реализации настоящего изобретения слабоосновное значение pH означает pKa примерно 7,5-9,0. В вариантах реализации настоящего изобретения слабоосновное значение pH означает pKa примерно 8,0-9,0. В вариантах реализации настоящего изобретения указанный противоопухолевый агент имеет более одной pKa, любая из которых может находиться в слабоосновных пределах, как описано выше.

[0054] Термин «доксорубицин» используется в соответствии с его прямым обычным значением. Доксорубицин представляет собой противоопухолевое соединение, первоначально полученные из Streptomyces peucetius. Доксорубицин (doxorubicin) может также упоминаться как адриамицин (Adriamycin), доксил (Doxil), рубекс (Rubex), адриабластин (Adriablastin) и доксорубицин (doxorubicine). В вариантах реализации настоящего изобретения доксорубицин представляет собой слабоосновное противоопухолевое соединение. Структура доксорубицина показана в настоящем документе.

[0055] Термин «иринотекан» используется в соответствии с его прямым обычным значением. Иринотекан представляет собой противоопухолевое соединение, которое можно применять при раке ободочной и прямой кишки с метастазами (распространением на другие части тела), включая метастатический рак с рецидивом (возвращением) или без улучшение при другой химиотерапии, и для лечения пациентов с метастатической аденокарциномой поджелудочной железы после прогрессирования заболевания после терапии гемцитабином. Иринотекан (irinotecan) может также упоминаться как камптозар (Camptosar); 97682-44-5; (+)-иринотекан; иринотеканум (irinotecanum) и иринотекан. В вариантах реализации настоящего изобретения иринотекан представляет собой слабоосновное противоопухолевое соединение. Структура иринотекана показана в настоящем документе.

[0056] Термин «митоксантрон» используется в соответствии с его прямым обычным значением. Митоксантрон представляет собой противоопухолевое соединение, которое можно применять при остром миелолейкозе (ОМЛ) и раке простаты. Его также можно применять в качестве паллиативного лечения при запущенном гормонорефрактерным заболевании (заболевание, которое не реагирует на гормональное лечение). Митоксантрон (mitoxantrone) может также упоминаться как 65271-80-9; Mitoxanthrone; митозантрон (Mitozantrone); DHAQ; и митоксантрон. В вариантах реализации настоящего изобретения митоксантрон представляет собой слабоосновное противоопухолевое соединение. Структура митоксантрона показана в настоящем документе.

[0057] Используемый в настоящем документе термин «кислота или соль указанного соединения» относится к любой фармацевтически приемлемой кислоте или соли соединения, описанного в настоящем документе. Примеры кислот или солей, подходящих для применения с противоопухолевыми соединениями, включают, но не ограничиваются ими, 1-гидрокси-2-нафтойную кислоту, 2,2-дихлоруксусную кислоту, 2-гидроксиэтансульфоновую кислоту, 2-оксоглутаровую кислоту, 4-ацетамидобензойную кислоту, 4-аминосалициловую кислоту, уксусную кислоту, адипиновую кислоту, аскорбиновую кислоту (L), аспарагиновую кислоту (L), бензолсульфоновую кислоту, бензойную кислоту, камфорную кислоту (+), камфорно-10-сульфоновую кислоту (+), каприновую кислоту (декановую кислоту), капроновую кислоту (гексановую кислоту), каприловую кислоту (октановую кислоту), угольную кислоту, коричную кислоту, лимонную кислоту, цикламиновую кислоту, додецилсульфоновую кислоту, этан-1,2-дисульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, муравьиную кислоту, фумаровую кислоту, галактаровую кислоту, гентизиновую кислоту, глюкогептоновую кислоту (D), глюконовую кислоту (D), глюкуроновую кислоту (D), глутаминовую кислоту, глутаровую кислоту, глицерофосфорную кислоту, гликолевую кислоту, гиппуровую кислоту, бромистоводородную кислоту, соляную кислоту, изомасляную кислоту, молочную кислоту (DL), лактобионовую кислоту, лауриновую кислоту, малеиновую кислоту, яблочную кислоту (-L), малоновую кислоту, миндальную кислоту (DL), метансульфоновую кислоту, нафталин-1,5-дисульфоновую кислоту, нафталин-2-сульфоновую кислоту, никотиновую кислоту, азотную кислоту, олеиновую кислоту, щавелевую кислоту, пальмитиновую кислоту, памоевую кислоту, фосфорную кислоту, пропионовую кислоту, пироглутаминовую кислоту (-L), салициловую кислоту, себациновую кислоту, стеариновую кислоту, янтарную кислоту, серную кислоту, винную кислоту (+ L), тиоциановую кислоту, толуолсульфоновую кислоту (p) и ундециленовую кислоту.

[0058] Используемый в настоящем документе термин «неорганизованный» или «некристаллический» относится к неорганизованному неупорядоченному полиморфному состоянию соединения. Это неупорядоченное состояние может напоминать аморфное состояние. В неупорядоченных некристаллических агрегатах молекулы не образуют упорядоченную кристаллическую решетку. В вариантах реализации настоящего изобретения неупорядоченный агрегат может также включать любые некристаллические структуры и коллоиды. В вариантах реализации настоящего изобретения некоторые неупорядоченные и некристаллические агрегаты могут содержать некоторые фиброидные структуры.

[0059] Используемый в настоящем документе термин «по существу высвобождается» указывает, что большая часть содержимого высвобождается, например, из липосомы. В вариантах реализации настоящего изобретения «по существу высвобождается» означает высвобождение более примерно 5% или более содержащихся веществ. В вариантах реализации настоящего изобретения «по существу высвобождается» означает высвобождение более примерно 10% или более содержащихся веществ. В вариантах реализации настоящего изобретения «по существу высвобождается» означает высвобождение более примерно 20% или более содержащихся веществ. В вариантах реализации настоящего изобретения «по существу высвобождается» означает высвобождение более примерно 30% или более содержащихся веществ. В вариантах реализации настоящего изобретения «по существу высвобождается» означает высвобождение более примерно 40% или более содержащихся веществ. В вариантах реализации настоящего изобретения «по существу высвобождается» означает высвобождение более примерно 50% или более содержащихся веществ. В вариантах реализации настоящего изобретения «по существу высвобождается» означает высвобождение более примерно 60% или более содержащихся веществ. В вариантах реализации настоящего изобретения «по существу высвобождается» означает высвобождение более примерно 70% или более содержащихся веществ. В вариантах реализации настоящего изобретения «по существу высвобождается» означает высвобождение более примерно 80% или более содержащихся веществ. В вариантах реализации настоящего изобретения «по существу высвобождается» означает высвобождение более примерно 90% или более содержащихся веществ. В вариантах реализации настоящего изобретения «по существу высвобождается» означает высвобождение более примерно 95% или более содержащихся веществ. В вариантах реализации настоящего изобретения «по существу высвобождается» означает высвобождение более примерно 97% или более содержащихся веществ. В вариантах реализации настоящего изобретения «по существу высвобождается» означает высвобождение более примерно 98% или более содержащихся веществ. В вариантах реализации настоящего изобретения «по существу высвобождается» означает высвобождение более примерно 99% или более содержащихся веществ. В вариантах реализации настоящего изобретения существенное высвобождение является рН-обусловленным, например, противоопухолевый агент по существу высвобождается только при кислотном рН.

[0060] Используемые в настоящем документе термины «стандартное условие анализа» или «стандартные условия анализа» относятся к контролируемому набору условий анализа, включая стандартные измерения времени, температуры, pH и т. д. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа включают 20-кратное и/или 50-кратное разведение в PBS. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа включают 20-кратное и/или 50-кратное разведение в сыворотке крови или крови. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения, описанного в настоящем документе, включают температуру примерно 25 °С. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения, описанного в настоящем документе, включают температуру примерно 37 °С. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения, описанного в настоящем документе, включают инкубацию продолжительностью примерно 2, 4, 8 часов или любой промежуточный период из вышеупомянутых, или более чем примерно 8 часов. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения, описанного в настоящем документе, включают инкубацию в течение примерно 2 часов. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения, описанного в настоящем документе, включают инкубацию в течение примерно 4 часов. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения, описанного в настоящем документе, включают инкубацию в течение примерно 8 часов. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения, описанного в настоящем документе, включают инкубацию в течение более 8 часов. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения, описанного в настоящем документе, включают инкубацию при pH примерно 7,4. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения, описанного в настоящем документе, включают инкубацию при pH примерно 6,7. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения, описанного в настоящем документе, включают инкубацию при pH примерно 6,0. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения, описанного в настоящем документе, включают инкубацию при pH примерно 5,0.

[0061] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 7,4 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 7,4 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 7,4 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 7,4 в течение более 8 часов.

[0062] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,7 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,7 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,7 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,7 в течение более 8 часов.

[0063] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,0 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,0 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,0 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,0 в течение более 8 часов.

[0064] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 5,0 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 5,0 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 5,0 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 5,0 в течение более 8 часов.

[0065] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 7,4 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 7,4 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 7,4 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 7,4 в течение более 8 часов.

[0066] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,7 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,7 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,7 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,7 в течение более 8 часов.

[0067] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,0 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,0 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,0 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,0 в течение более 8 часов.

[0068] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 5,0 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 5,0 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 5,0 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 5,0 в течение более 8 часов.

[0069] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 7,4 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 7,4 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 7,4 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 7,4 в течение более 8 часов.

[0070] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,7 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,7 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,7 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,7 в течение более 8 часов.

[0071] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,0 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,0 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,0 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,0 в течение более 8 часов.

[0072] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 5,0 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 5,0 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 5,0 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в PBS с pH примерно 5,0 в течение более 8 часов.

[0073] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 7,4 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 7,4 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 7,4 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 7,4 в течение более 8 часов.

[0074] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,7 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,7 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,7 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,7 в течение более 8 часов.

[0075] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,0 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,0 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,0 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 6,0 в течение более 8 часов.

[0076] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 5,0 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 5,0 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 5,0 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в PBS с pH примерно 5,0 в течение более 8 часов.

[0077] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 7,4 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 7,4 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 7,4 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 7,4 в течение более 8 часов.

[0078] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,7 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,7 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,7 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,7 в течение более 8 часов.

[0079] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,0 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,0 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,0 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,0 в течение более 8 часов.

[0080] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 5,0 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 5,0 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 5,0 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 5,0 в течение более 8 часов.

[0081] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 7,4 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 7,4 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 7,4 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 7,4 в течение более 8 часов.

[0082] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,7 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,7 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,7 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,7 в течение более 8 часов.

[0083] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,0 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,0 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,0 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,0 в течение более 8 часов.

[0084] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 5,0 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 5,0 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 5,0 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 25 °С или примерно 25 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 5,0 в течение более 8 часов.

[0085] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 7,4 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 7,4 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 7,4 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 7,4 в течение более 8 часов.

[0086] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,7 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,7 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,7 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,7 в течение более 8 часов.

[0087] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,0 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,0 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,0 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,0 в течение более 8 часов.

[0088] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 5,0 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 5,0 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 5,0 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 20-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 5,0 в течение более 8 часов.

[0089] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 7,4 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 7,4 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 7,4 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 7,4 в течение более 8 часов.

[0090] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,7 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,7 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,7 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,7 в течение более 8 часов.

[0091] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,0 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,0 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,0 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 6,0 в течение более 8 часов.

[0092] Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 5,0 в течение примерно 2 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 5,0 в течение примерно 4 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 5,0 в течение примерно 8 часов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия анализа для анализа высвобождения включают температуру 37 °С или примерно 37 °С и инкубацию в 50-кратном разведении в сыворотке крови или крови с pH примерно 5,0 в течение более 8 часов.

[0093] Используемые в настоящем документе термины «стандартное условие хранения» или «стандартные условия хранения» относятся к контролируемым условиям правильного хранения соединения, например, фармацевтического соединения. В вариантах реализации настоящего изобретения можно контролировать определенные стандартные параметры, такие как время, температуру, влажность и другие. В вариантах реализации настоящего изобретения стандартные условия хранения включают хранение при температуре 2-8°C и относительной влажности окружающей среды. В вариантах реализации настоящего изобретения относительная влажность окружающей среды включает любой диапазон относительной влажности от примерно 10% до примерно 90%. В вариантах реализации настоящего изобретения относительная влажность окружающей среды включает относительную влажность примерно 10%. В вариантах реализации настоящего изобретения относительная влажность окружающей среды включает относительную влажность примерно 20%. В вариантах реализации настоящего изобретения относительная влажность окружающей среды включает относительную влажность примерно 30%. В вариантах реализации настоящего изобретения относительная влажность окружающей среды включает относительную влажность примерно 40%. В вариантах реализации настоящего изобретения относительная влажность окружающей среды включает относительную влажность примерно 50%. В вариантах реализации настоящего изобретения относительная влажность окружающей среды включает относительную влажность примерно 60%. В вариантах реализации настоящего изобретения относительная влажность окружающей среды включает относительную влажность примерно 70%. В вариантах реализации настоящего изобретения относительная влажность окружающей среды включает относительную влажность примерно 80%. В вариантах реализации настоящего изобретения относительная влажность окружающей среды включает относительную влажность примерно 90%.

[0094] Используемый в настоящем документе термин «по существу сферический» означает среднюю тенденцию к сферической форме, например, диаметры по любой оси примерно равны. В вариантах реализации настоящего изобретения ни один диаметр не отличается по длине. В вариантах реализации настоящего изобретения ни один диаметр не отличается по длине более чем примерно на 20% или менее от диаметра на любой другой оси. В вариантах реализации настоящего изобретения ни один диаметр не отличается по длине более чем примерно на 20% или менее от диаметра на любой другой оси в пределах по существу сферической формы. В вариантах реализации настоящего изобретения ни один диаметр не отличается по длине более чем примерно на 15% или менее от диаметра на любой другой оси в пределах по существу сферической формы. В вариантах реализации настоящего изобретения ни один диаметр не отличается по длине более чем примерно на 10% или менее от диаметра на любой другой оси в пределах по существу сферической формы. В вариантах реализации настоящего изобретения ни один диаметр не отличается по длине более чем примерно на 9% или менее от диаметра на любой другой оси в пределах по существу сферической формы. В вариантах реализации настоящего изобретения ни один диаметр не отличается по длине более чем примерно на 8% или менее от диаметра на любой другой оси в пределах по существу сферической формы. В вариантах реализации настоящего изобретения ни один диаметр не отличается по длине более чем примерно на 7% или менее от диаметра на любой другой оси в пределах по существу сферической формы. В вариантах реализации настоящего изобретения ни один диаметр не отличается по длине более чем примерно на 6% или менее от диаметра на любой другой оси в пределах по существу сферической формы. В вариантах реализации настоящего изобретения ни один диаметр не отличается по длине более чем примерно на 5% или менее от диаметра на любой другой оси в пределах по существу сферической формы. В вариантах реализации настоящего изобретения ни один диаметр не отличается по длине более чем примерно на 4% или менее от диаметра на любой другой оси в пределах по существу сферической формы. В вариантах реализации настоящего изобретения ни один диаметр не отличается по длине более чем примерно на 3% или менее от диаметра на любой другой оси в пределах по существу сферической формы. В вариантах реализации настоящего изобретения ни один диаметр не отличается по длине более чем примерно на 3% или менее от диаметра на любой другой оси в пределах по существу сферической формы. В вариантах реализации настоящего изобретения ни один диаметр не отличается по длине более чем примерно на 1% или менее от диаметра на любой другой оси в пределах по существу сферической формы.

[0095] Используемый в настоящем документе термин «средний наибольший размер» относится к среднему значению самого большего размера по существу сферического объекта. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения указанный средний наибольший размер можно измерить по усредненным по интенсивности диаметрам частиц (Z-среднее). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения усредненные по интенсивности диаметры частиц (Z-среднее) рассчитывают на основе кумулянтного анализа, как определено в ISO 13321 (Международная организация по стандартизации 1996). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения указанный средний наибольший размер можно измерить по количественным диаметрам частиц. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения количественное распределение частиц по размерам вычисляют по распределению интенсивности и оптических свойств материала. Между размером частиц и вкладом в распределение существует линейная зависимость.

[0096] Используемый в настоящем документе термин «комнатная температура» или «к.т.» относится к температуре анализа, проводимого при стандартной температуре внутри помещения. В вариантах реализации настоящего изобретения термин «комнатная температура» относится к анализу, проводимому без какого-либо дополнительного нагревания или охлаждения. В вариантах реализации настоящего изобретения комнатная температура представляет собой контролируемую температуру примерно 22-25°С. В вариантах реализации настоящего изобретения комнатная температура составляет 25°С.

[0097] Используемые в настоящем документе термины «раствор липосом», «водный раствор липосом», «суспензия липосом» или «водная суспензия липосом» относятся к жидкому раствору или суспензии липосом. Липосомы могут быть суспендированы в различных растворителях, буферах или растворах. В вариантах реализации настоящего изобретения липосомы суспендируют в водной фазе. В вариантах реализации настоящего изобретения липосомы суспендируют в физиологическом буфере, имеющем рН 7,0-7,4.

[0098] Используемый в настоящем документе термин «полоксамер» представляет собой неионный сополимер. Полоксамеры содержат центральную гидрофобную цепь полиоксипропилена и две боковые цепи полиоксилэтилена. В вариантах реализации настоящего изобретения полоксамер представляет собой полоксамер 188. Дополнительные названия для полоксамера 188: Lutrol® F68, P188, Kolliphor® P188 и поли(этиленгликоль)- блок-поли(пропиленгликоль)- блок-поли(этиленгликоль). Номер CAS для P188: 9003-11-6. P188 имеет следующую структуру, где X равно 80, Z равно 80 и Y равно 27:

[0099] Используемый в настоящем документе термин «холестерин» или «соединение холестерина» относится к стеролам или модифицированным стероидам. Неограничивающие примеры включают: холестерин, гидроксихолестерины, холестаны, холестаны, кетохолестанолы, кампестерол, эпоксиды холестерина, холестерин-peg, ланостерин, этерифицированные холестерины. Термин «свободный холестерин» относится к неэтерифицированному холестерину со следующей общей формулой C₂₇H₄₆O и структурой:

[0100] Используемый в настоящем документе термин «фосфолипид» или «фосфолипиды», другое название фосфатид или фосфатиды, относится к представителю класса веществ, содержащих фосфор и/или жирные кислоты. Обычно фосфолипиды состоят из фосфатной группы, двух спиртов и одной или двух жирных кислот. На одном конце молекулы находятся фосфатная группа и один спирт; этот конец полярный, т.е. имеет электрический заряд и притягивается к воде (гидрофильный). Другой конец, который состоит из жирных кислот, является нейтральным; он гидрофобен и не растворим в воде, но растворим в жирах. Некоторые неограничивающие и иллюстративные примеры фосфолипидов включают, но не ограничиваются ими, фосфатидиновую кислоту (фосфатидат), продукты/производные фосфатидилхолина (PC) (жирные кислоты с различной длиной углеродной цепи, насыщенные, мультиненасыщенные и смешанные PC); 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE); 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфат (DMPA); 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфат (DPPA); 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфат (DOPA); 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфо- (1'-рац-глицерин) (DMPG); 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфо- (1'-рац-глицерин) (DPPG); 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфо- (1'-рац-глицерин) (DOPG); 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DMPC); 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серин (DMPS); 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серин (DPPS); 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серин (DOPC); 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- [метокси(полиэтиленгликоль)- 2000] (DSPE-mPEG-2000); 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- [фолат(полиэтиленгликоль)- 5000] (DSPE-mPEG-5000); 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- [амино(полиэтиленгликоль)- 2000] (DSPE-PEG-2000); 1,2-стеароил-3-триметиламмонийпропан (DOTAP); L-α-фосфатидилхолин, гидрогенизированный (Hydro Soy PC) и 2-стеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (Lyso PC), фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол (PI), фосфатидилинозитолфосфат (PIP), фосфатидилинозитолбисфосфат (PIP2), фосфосфинголипиды и любые их производные.

[0101] Используемые в настоящем документе термины «лиофилизировать», «лиофилизированный» или «лиофилизация», другое название сублимационная сушка или криодессикация, относятся к процессу дегидратации, который можно применять для сохранения материала или соединения. Лиофилизация может включать замораживание материала или соединения и затем снижение окружающего давления, чтобы позволить замороженной воде или жидкому компоненту в замерзшем материале или соединении перейти в газовую фазу.

[0102] «Лечение» определяется как воздействие на заболевание, расстройство или состояние с помощью агента для снижения или ослабления вредного или любого другого нежелательного воздействия указанного заболевания, расстройства или состояния и/или его симптомов. «Лечение» состояния или субъекта, нуждающегося в этом, относится к (1) принятию мер для получения полезных или желаемых результатов, включая клинические результаты, такие как уменьшение симптомов; (2) ингибирование заболевания, например, остановка или уменьшение развития заболевания или его клинических симптомов; (3) облегчение заболевания, например, путем вызывания регрессии заболевания или его клинических симптомов; или (4) задержка заболевания. Например, полезные или желательные клинические результаты включают, но не ограничиваются ими, уменьшение и/или устранение раковых клеток и предотвращение и/или уменьшение метастазирования раковых клеток.

[0103] Используемый в настоящем документе термин «введение» относится к физическому введению композиции субъекту с применением любого из различных способов и систем доставки, известных специалистам в данной области. Пути введения композиции, описанной в настоящем документе, включают внутривенный, внутрибрюшинный, внутримышечный, подкожный, спинальный или другие парентеральные пути введения, например, путем инъекции или инфузии. Выражение «парентеральное введение», используемое в настоящем документе, означает способы введения, отличные от энтерального и местного введения, обычно путем инъекции, и включает, без ограничения, внутривенные, внутрибрюшинные, внутримышечные, внутриартериальные, интратекальные, внутрилимфатические, внутриочаговые, внутрикапсульные, внутриглазничные, внутрисердечные, внутрикожные, транстрахеальные, подкожные, внутрикожные, внутрисуставные, субкапсулярные, субарахноидальные, интраспинальные, эпидуральные и интрастернальные инъекции и инфузии, а также электропорацию in vivo. Альтернативно композицию, описанную в настоящем документе, можно вводить непарентеральным путем, таким как местный, эпидермальный или мукозальный путь введения, например, интраназально, перорально, вагинально, ректально, сублингвально или местно. Введение также можно выполнять, например, один раз, множество раз и/или в течение одного или нескольких продолжительных периодов.

[0104] «Противоопухолевый агент» или «противоопухолевое соединение» представляет собой терапевтическое средство, обладающее противоопухолевой активностью, которое можно применять при лечении или профилактике рака. Противоопухолевый агент может быть большой или маленькой молекулой. Примеры противоопухолевых агентов включают антитела, малые молекулы и большие молекулы или их комбинации. Примеры «противоопухолевой активности» включают, но не ограничиваются ими, уменьшение числа раковых клеток, уменьшение размера опухоли, уничтожение раковых клеток, уменьшение и/или ингибирование метастазирования и уменьшение роста и/или пролиферации раковых клеток.

[0105] Термин «субъект» или «субъект, нуждающийся в таком лечении» относится к живому организму, который страдает заболеванием или состоянием или который может иметь заболевание или состояние в будущем. Термин «пациент» относится к живому организму, у которого уже есть заболевание или состояние, например, к пациенту, у которого диагностировано заболевание или состояние или который имеет один или более симптомов, связанных с заболеванием или состоянием. Неограничивающие примеры включают людей, других млекопитающих, крупный рогатый скот, крыс, мышей, собак, обезьян, коз, овец, коров, оленей и других животных, не являющихся млекопитающими. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения пациент представляет собой человека.

[0106] Согласно способам, представленным в настоящем документе, субъекту можно вводить эффективное количество одного или более описанных в настоящем документе агентов, композиций или комплексов, которые в настоящем документе используются взаимозаменяемо (например, фармацевтической композиции, содержащей липосому, содержащую противоопухолевое соединение и его кислоту или соль). Термины «эффективное количество» и «эффективная дозировка» используются взаимозаменяемо. Термин «эффективное количество» определяется как любое количество, необходимое для достижения желаемого эффекта (например, для лечения заболевания, такого как рак). Эффективные количества и схемы введения агента могут быть определены опытным путем специалистом в данной области техники. Диапазоны доз для введения достаточно велики для получения желаемых эффектов. Дозировка не должна быть настолько большой, чтобы вызывать существенные побочные эффекты, такие как нежелательные взаимодействия, анафилактические реакции и тому подобное. Обычно дозировка может варьироваться в зависимости от возраста, состояния, пола, типа заболевания, степени заболевания или расстройства, пути введения или от того, включены ли другие препараты в схему лечения, и может быть определена специалистом в данной области техники. В случае каких-либо противопоказаний лечащий врач может скорректировать дозировку. Дозировки могут варьироваться, и дозировки можно вводить в виде одного или нескольких приемов дозы ежедневно в течение одного или нескольких дней. Общие принципы могут быть найдены в литературе для соответствующих дозировок для данных классов фармацевтических продуктов. Например, для определенного параметра эффективное количество может показать увеличение или уменьшение по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90% или по меньшей мере на 100%. Эффективность также может быть выражена как «кратное» увеличение или уменьшение. Например, терапевтически эффективное количество может иметь по меньшей мере 1,2-кратное, 1,5-кратное, 2-кратное, 5-кратное или более по сравнению с контролем. Точная доза и состав могут зависеть от цели лечения и могут быть определены специалистом в данной области с использованием известных методик (см., например, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (тома 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Gennaro, Editor (2003), и Pickar, Dosage Calculations (1999)).

[0107] Используемый в настоящем документе термин «рак» относится ко всем типам рака, новообразований или злокачественных опухолей, обнаруженных у млекопитающих, включая лейкозы, лимфомы, меланомы, нейроэндокринные опухоли, карциномы и саркомы. Типичные виды рака, которые можно лечить соединением, фармацевтической композицией или способом, представленным в настоящем документе, включают лимфому, саркому, рак мочевого пузыря, рак кости, опухоль головного мозга, рак шейки матки, рак толстой кишки, рак пищевода, рак желудка, рак головы и шеи, рак почки, миелому, рак щитовидной железы, лейкоз, рак предстательной железы, рак молочной железы (например, тройной отрицательный, рецептор-позитивный, рецептор-негативный, резистентный к химиотерапии, резистентный к герцептину, HER2-позитивный, резистентный к доксорубицину, резистентный к тамоксифену, карцинома протоков, лобулярная карцинома, первичный, метастатический), рак яичников, панкреатический рак, рак печени (например, гепатоцеллюлярная карцинома), рак легкого (например, немелкоклеточная карцинома легкого, плоскоклеточная карцинома легкого, аденокарцинома, крупноклеточная карцинома легкого, мелкоклеточная карцинома легкого, карциноид, саркома), мультиформная глиобластома, глиома, меланома, рак предстательной железы, кастрационно-резистентный рак предстательной железы, рак молочной железы, тройной негативный рак молочной железы, глиобластома, рак яичников, рак легких, плоскоклеточная карцинома (например, головы, шеи или пищевода), рак ободочной и прямой кишки, лейкоз, острый миелоидный лейкоз, лимфома, В-клеточная лимфома или множественная миелома. Дополнительные примеры включают рак щитовидной железы, рак эндокринной системы, рак головного мозга, рак молочной железы, рак шейки матки, рак толстой кишки, рак головы и шеи, рак пищевода, рак печени, рак почек, рак легких, немелкоклеточный рак легких, меланому, мезотелиому, рак яичников, саркому, рак желудка, рак матки или медуллобластому, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому, множественную миелому, нейробластому, глиому, мультиформную глиобластому, рак яичника, рабдомиосаркому, первичный тромбоцитоз, первичную макроглобулинемию, первичные опухоли головного мозга, рак, злокачественную инсуланому поджелудочной железы, злокачественный карциноид, рак мочевого пузыря, предраковые поражения кожи, рак яичка, лимфомы, рак щитовидной железы, нейробластому, рак пищевода, рак мочеполового тракта, злокачественную гиперкальциемию, рак эндометрия, рак коры надпочечников, новообразования эндокринной или экзокринной части поджелудочной железы, медуллярный рак щитовидной железы, медуллярную карциному щитовидной железы, меланому, рак ободочной и прямой кишки, папиллярный рак щитовидной железы, гепатоцеллюлярную карциному, болезнь Педжета (рак соска молочной железы), филлоидную цистосаркому, лобулярную карциному, карциному протоков, рак звездчатых клеток поджелудочной железы, рак звездчатых клеток печени, рак предстательной железы.

Липосомальные композиции

[0108] В вариантах реализации композиции согласно настоящему изобретению являются химически и физически стабильными в изготовленном лекарственном продукте и обеспечивают коммерчески адекватный срок годности.

[0109] В вариантах реализации настоящего изобретения уменьшение размера частиц может привести к значительному увеличению растворимости лекарственного средства. Материалы в наночастицах имеют гораздо большую склонность покидать частицу и попадать в окружающий раствор, чем материалы, находящиеся в более крупных частицах того же состава. Это явление может увеличить доступность лекарственного средства для проникновения через биологическую мембрану, но оно также может создать физическую нестабильность самой наночастицы. Физическую стабильность наночастиц можно улучшить за счет применения соответствующих поверхностно-активных агентов и вспомогательных веществ на нужных уровнях для уменьшения межфазной энергии, регулирования поверхностного заряда частиц для поддержания дисперсии и изготовления частиц с узким распределением по размерам.

[0110] В вариантах реализации настоящего изобретения предпочтительное фармакокинетика композиций по настоящему изобретению может быть отнесена к размеру, форме, составу и заряду частицы. В вариантах реализации настоящего изобретения частицы могут быть по существу сферическими для плавного перемещения через капилляры. В вариантах реализации настоящего изобретения диапазон распределения по размерам составляет примерно от 10 до 160 нм. В вариантах реализации настоящего изобретения диапазон распределения по размерам составляет примерно от 20 до 150 нм. В вариантах реализации настоящего изобретения диапазон распределения по размерам составляет примерно от 30 до 140 нм. В вариантах реализации настоящего изобретения диапазон распределения по размерам составляет примерно от 40 до 130 нм. В вариантах реализации настоящего изобретения диапазон распределения по размерам составляет примерно от 50 до 120 нм. В вариантах реализации настоящего изобретения диапазон распределения по размерам составляет примерно от 60 до 110 нм. В вариантах реализации настоящего изобретения диапазон распределения по размерам составляет примерно от 70 до 100 нм. В вариантах реализации настоящего изобретения диапазон распределения по размерам составляет в среднем примерно 10 нм. В вариантах реализации настоящего изобретения диапазон распределения по размерам составляет в среднем примерно 20 нм. В вариантах реализации настоящего изобретения диапазон распределения по размерам составляет в среднем примерно 30 нм. В вариантах реализации настоящего изобретения диапазон распределения по размерам составляет в среднем примерно 40 нм. В вариантах реализации настоящего изобретения диапазон распределения по размерам составляет в среднем примерно 50 нм. В вариантах реализации настоящего изобретения диапазон распределения по размерам составляет в среднем примерно 60 нм. В вариантах реализации настоящего изобретения диапазон распределения по размерам составляет в среднем примерно 70 нм. В вариантах реализации настоящего изобретения диапазон распределения по размерам составляет в среднем примерно 80 нм. В вариантах реализации настоящего изобретения диапазон распределения по размерам составляет в среднем примерно 90 нм. В вариантах реализации настоящего изобретения диапазон распределения по размерам составляет в среднем примерно 100 нм. В вариантах реализации настоящего изобретения диапазон распределения по размерам составляет в среднем примерно 110 нм. В вариантах реализации настоящего изобретения диапазон распределения по размерам составляет в среднем примерно 120 нм. В вариантах реализации настоящего изобретения диапазон распределения по размерам составляет в среднем примерно 130 нм. В вариантах реализации настоящего изобретения диапазон распределения по размерам составляет в среднем примерно 140 нм. В вариантах реализации настоящего изобретения диапазон распределения по размерам составляет в среднем примерно 150 нм. В вариантах реализации настоящего изобретения диапазон распределения по размерам составляет в среднем примерно 160 нм. Указанная композиция может содержать холестерин, другие липиды и поверхностно-активные агенты с добавлением полимеров, используемых для формирования структуры частиц, или без их добавления.

[0111] Размер частиц можно определять несколькими методами. Примеры методов включают динамическое рассеяние света (ДРС) и криотрансмиссионную электронную микроскопию. ДРС можно использовать для оценки размера частиц путем измерения интенсивности, например, усредненные по интенсивности диаметры частиц (Z-среднее) рассчитываются на основе кумулянтного анализа, как определено в ISO 13321 (Международная организация по стандартизации 1996). В вариантах реализации настоящего изобретения средний наибольший размер липосомы при измерении с помощью ДРС по интенсивности находится в диапазоне примерно 40-100 нм, 50-90 нм или 60-80 нм.

[0112] ДРС также можно использовать для оценки размера частиц путем количественного измерения, например, существует линейная зависимость между размером частиц и вкладом в распределение. Количественное распределение частиц по размерам рассчитывают на основе распределения интенсивности и оптических свойств материала. В вариантах реализации настоящего изобретения средний наибольший размер липосомальной частицы при количественном измерении с помощью ДРС находится в диапазоне примерно 1-50 нм, 5-40 нм или 10-30 нм

[0113] Криотрансмиссионную электронную микроскопию также можно использовать для оценки размера липосом. В вариантах реализации настоящего изобретения средний наибольший размер липосомы при измерении с помощью криотрансмиссионной электронной микроскопии находится в диапазоне примерно 1-50 нм, 5-40 нм или 10-30 нм.

[0114] В вариантах реализации липосомы по настоящему изобретению являются однослойными. Примеры липидов, которые могут быть частью бислоя липосомы, включают, но не ограничиваются ими, холестерин, продукты/производные фосфатидилхолина (PC) (жирные кислоты с различной длиной углеродной цепи, насыщенные, мультиненасыщенные и смешанные PC); 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE); 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфат (DMPA); 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфат (DPPA); 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфат (DOPA); 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфо- (1'-рац-глицерин) (DMPG); 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DMPC); 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфо- (1'-рац-глицерин) (DPPG); 1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфо- (1'-рац-глицерин) (DOPG); 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серин (DMPS); 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серин (DPPS); 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серин (DOPC); 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- [метокси(полиэтиленгликоль)- 2000] (DSPE-mPEG-2000); 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- [фолат(полиэтиленгликоль)- 5000] (DSPE-mPEG-5000); 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- [амино (полиэтиленгликоль)- 2000] (DSPE-PEG-2000); 1,2-стеароил-3-триметиламмонийпропан (DOTAP); L-α-фосфатидилхолин, гидрогенизированный (Hydro Soy PC); и 2-стеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (Lyso PC).

Соли и противоионы

[0115] Настоящее изобретение относится к композициям противоопухолевых соединений и их солей, инкапсулированных в липосомы. Физико-химические свойства противоионов, которые определяют рабочие характеристики и физическое состояние солевых агрегатов, включают pKa, валентность, размер, стереохимию, дипольный момент, поляризуемость. Настоящее изобретение обеспечивает оптимальное соотношение липида к лекарственному средству (лекарственным средствам) совместно с подходящим противоионом (противоионами), что позволяет в полной мере воспользоваться как свойствами рКа противоиона, так и физическим состоянием агрегатов противоопухолевых соединений, для достижения целевых свойств высвобождения (например, максимально возможная разница высвобождения ΔрН 7,4-5,0).

[0116] В таблице 1 приведены примеры солей, включая применимые рКа. В таблице 2 приведены примеры слабоосновных противоопухолевых соединений, в частности соединений, которые образуют соли или агрегаты с оксалатом или тартратом.

Таблица 1. Фармацевтические соли и противоионы.

Реагенты	Противоион	pKa 1	pKa 2	pKa 3
Сульфат		-3	1,92	NA
Пиколинат		1,07	NA	NA
Оксалат		1,27	4,27	NA
Малеат		1,92	6,23	NA
Фосфат		1,96	7,12	12,32
Цистеинат		1,96	8,18	NA
Малонат		2,83	5,70	NA
Тартрат		3,03	4,36	NA
Фумарат		3,03	4,38	NA
Цитрат		3,13	4,76	6,40
Формиат		3,75	NA	NA
N-ацетил-L-цистеин		3,82	9,52	NA
Сукцинат		4,21	5,64	NA
Аскорбат		4,17	11,57	NA
Ацетат		4,76	NA	NA

Таблица 2. Примеры слабоосновных химиотерапевтических агентов, которые образуют соли/агрегаты с оксалатом или тартратом и демонстрируют желательный профиль выделения лекарственного средства, дифференцированный по pH.

Доксорубицина гидрохлорид		Применение одобрено для лечения: острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), рака молочной железы (также применяется в качестве вспомогательной терапии при раке молочной железы, который после операции распространился на лимфатические узлы), рака желудка, лимфомы Ходжкина, нейробластомы, неходжкинской лимфомы, рака яичников, мелкоклеточного рака легких, саркомы мягких тканей и кости, рака щитовидной железы, переходно-клеточного рака мочевого пузыря, опухоли Вильмса.
Иринотекана гидрохлорид		Применение одобрено для лечения: рака ободочной и прямой кишки с метастазами (распространение на другие части тела), включая метастатический рак, который рецидивировал (вернулся) или если не наступило улучшения после другой химиотерапии
Митоксантрона гидрохлорид		Применение одобрено для лечения: острого миелоидного лейкоза (ОМЛ). рака предстательной железы. Также применяется в качестве паллиативного лечения при запущенном гормонорефрактерным заболевании (заболевание, которое не реагирует на гормональное лечение).

[0117] В вариантах реализации композиция по настоящему изобретению содержат соль доксорубицина. В вариантах реализации настоящего изобретения соль доксорубицина присутствует в липосоме. В вариантах реализации настоящего изобретения соль доксорубицина может образовываться в липосоме после инкапсулирования доксорубицина. В вариантах реализации настоящего изобретения композиция, описанная в настоящем документе, проявляет желательные физические характеристики и оптимальный рН-зависимый профиль высвобождения лекарственного средства, которое могут быть чрезвычайно эффективным в опухолевых тканях, в то же время проявляя низкую токсичность вне целевых тканей. В вариантах реализации настоящего изобретения, вне связи с какой-либо определенной теорией, при физиологическом рН при циркуляции в крови доксорубицин в основном удерживается липосомами, тогда как намного большее высвобождение лекарственного средства достигается при более низком рН (~ 5,0-6,7), что происходит во внутриклеточном лизосомальном компартменте и локальном внеклеточном пространстве в опухоли, которая имеет тенденцию удерживать липосомы из-за плохой сосудистой системы.

[0118] В вариантах реализации настоящего изобретения состав соли доксорубицина определяется выбором физико-химических свойств анионов и соответствующих кислот, а также стадий обработки, используемых для получения липосом, содержащих агрегаты соли доксорубицина с желаемыми физико-химическими свойствами.

[0119] В вариантах реализации настоящего изобретения оптимальное соотношение (соотношения) липида к лекарственному средству в липосоме, содержащей соответствующий противоион (противоионы), инкапсулирующей противоопухолевое соединение, позволяет использовать как свойства pKa противоиона, так и физическое состояние агрегатов доксорубицина для достижения целевых свойств высвобождения (например, максимально возможное значение разницы высвобождения ΔpH 7,4/6,7/6,0/5,0 - ΔpH 7,4/5,0). В вариантах реализации настоящего изобретения доксорубицин стабилизируют подходящими противоионами внутри липосом при надлежащем соотношении липид/лекарственное средство для максимизации безопасности и эффективности.

[0120] Когда упоминается соотношение между двумя частями, то есть соотношение между A и B, оно может упоминаться как соотношение A/B, A:B или A к B. Например, если значение, указанное для каждой из частей A и B, равно 1 и 10, соответственно, то можно указать, что соотношение A/B (или соотношение A к B, или соотношение A:B) составляет 1:10, 1/10 или 1 к 10.

[0121] Например, pKa1 для серной кислоты составляет -3 (доксорубицин-сульфат - Doxil®), тогда как pKa1 для лимонной кислоты составляет +3,13 (доксорубицин-цитрат - Myocet®) (таблица 1). Сульфат может образовывать сильную соль с доксорубицином, что может привести к снижению высвобождения доксорубицина из липосом Doxil® при рН от 7 до 5,0. Напротив, доксорубицин-цитрат является более слабой солью, что может приводить к большему высвобождению доксорубицина из липосом Myocet® в диапазоне рН от 7 до 5,0.

[0122] Таким образом, в настоящем документе представлены варианты реализации настоящего изобретения, в которых оптимальное высвобождение доксорубицина из липосом достигается посредством выбора подходящих противоионов со значениями pKa (например, pKa1) более -3 (серная кислота) и менее +3,13 (лимонная кислота). Таким образом, в вариантах реализации настоящего изобретения применяемая кислота имеет pKa (например, pKa1) выше -3 и ниже 3. В вариантах реализации настоящего изобретения применяемая кислота имеет pKa (например, pKa1) выше -2,9 и ниже 2,9. В вариантах реализации настоящего изобретения применяемая кислота имеет pKa (например, pKa1) выше -2,8 и ниже 2,8. В вариантах реализации настоящего изобретения применяемая кислота имеет pKa (например, pKa1) выше -2,5 и ниже 2,5.

[0123] Были протестированы различные противоионы (таблица 1) с различными значениями pKa на их способность облегчать загрузку доксорубицина в липосомы и обеспечивать рН-зависимое высвобождение доксорубицина из липосом. Противоион(ы), который обеспечивает(ют) наибольшую разницу между высвобождением доксорубицина при рН 7,4 до pH 5,0 (ΔpH 7,4/5,0), имеет(ют) предпочтительный профиль высвобождения.

[0124] В вариантах реализации настоящего изобретения образцы липосом для примерного анализа профиля высвобождения разводили 20-кратно (т.е. 100 мкл образца+1,9 мл разбавителя) или 50-кратно (т.е. 50 мкл образца+2,45 мл разбавителя) в буферах PBS pH 7,4 при температуре 25°C или в предварительно прогретом до температуры 37°C (для имитации температуры in vivo) и инкубировали в течение 2, 4 и 8 часов при температуре 25 ° C или 37 °C, соответственно. В вариантах реализации настоящего изобретения образцы липосом для примерного анализа профиля высвобождения разводили 20-кратно (т.е. 100 мкл образца+1,9 мл разбавителя) или 50-кратно (т.е. 50 мкл образца+2,45 мл разбавителя) в буфере PBS pH 6,7 при температуре 25°C или в предварительно прогретом до температуры 37°C (для имитации температуры in vivo) и инкубировали в течение 2, 4 и 8 часов при температуре 25 ° C или 37 °C, соответственно. В вариантах реализации настоящего изобретения образцы липосом для примерного анализа профиля высвобождения разводили 20-кратно (т.е. 100 мкл образца+1,9 мл разбавителя) или 50-кратно (т.е. 50 мкл образца+2,45 мл разбавителя) в буфере PBS pH 6,0 при температуре 25°C или в предварительно прогретом до температуры 37°C (для имитации температуры in vivo) и инкубировали в течение 2, 4 и 8 часов при температуре 25 ° C или 37 °C, соответственно. В вариантах реализации настоящего изобретения образцы липосом для примерного анализа профиля высвобождения разводили 20-кратно (т.е. 100 мкл образца+1,9 мл разбавителя) или 50-кратно (т.е. 50 мкл образца+2,45 мл разбавителя) в буфере PBS pH 5,0 при температуре 25°C или в предварительно прогретом до температуры 37°C (для имитации температуры in vivo) и инкубировали в течение 2, 4 и 8 часов при температуре 25 ° C или 37 °C, соответственно.

[0125] В вариантах реализации настоящего изобретения для определения в момент времени T0 липосомальные составы разводили в PBS pH 7,4 при температуре ~ 25 ° C. В вариантах реализации настоящего изобретения для определения в момент времени T0 липосомальные составы разводили в PBS pH 6,7 при температуре ~ 25 ° C. В вариантах реализации настоящего изобретения для определения в момент времени T0 липосомальные составы разводили в PBS pH 6,0 при температуре ~ 25 ° C. В вариантах реализации настоящего изобретения для определения в момент времени T0 липосомальные составы разводили в PBS pH 5,0 при температуре ~ 25 ° C. Температура планшет-ридера может быть установлена на 25 °C, а длины волн возбуждения и испускания были установлены на 478 нм и 594 нм, соответственно. В каждый момент времени измеряли флуоресценцию интактных липосом (Fi) и общую флуоресценцию липосом, разрушенных при помощи Тритона Х-100 (Ft). Процент высвобождения лекарственного средства был количественно определен как [(Fi_n -Fi_t)/Ft_средн)]*100%, где Fi_n - Fi, измеренный через 2, 4 или 8 часов, Fi_t0 - Fi, измеренный в момент времени T0, и Ft_средн - среднее значение Ft для всех временных точек.

[0126] В вариантах реализации настоящего изобретения, без связи с какой-либо теорией, можно выбрать кристаллическое состояние различных солей противоопухолевых соединений из-за их благоприятных свойств. Например, криотрансмиссионная электронная микроскопия (cTEM) выявляет выделения доксорубицина в виде волокнистых пучкообразных агрегатов как в цитратсодержащих, так и в сульфатсодержащих липосомах [1, 13-14]. Считается, что плоские ароматические антрациклиновые кольца складываются в продольном направлении, образуя линейные волокна. Эти волокна выровнены в гексагональной конфигурации с образованием пучков, приблизительно 12-60 волокон на пучок [25]. Агрегаты доксорубицина в присутствии сульфата обычно представляют собой жесткие линейные пучки волокон (расстояние между волокнами составляет примерно 27 A°) по сравнению с агрегатами доксорубицин-цитрат в присутствии цитрата, которые выглядят в основном линейными или изогнутыми (расстояние между волокнами составляет примерно 30-35 A°) [15, 25]. В вариантах реализации настоящего изобретения сульфат-анион, будучи меньше, чем цитрат-анион, может обеспечивать более плотную упаковку, что приводит к снижению гибкости пучков волокон. В вариантах реализации настоящего изобретения доксорубицин-сульфат (например, доксорубицин-сульфатные агрегаты) приводит к более медленному высвобождению лекарственного средства при физиологическом и кислотном рН по сравнению с доксорубицин-фосфатом [13-14] и цитратом (например, цитратными агрегатами) [1, 13-15].

[0127] В вариантах реализации композиции по настоящему изобретению предназначены для того, чтобы воспользоваться биологией опухоли за счет применения надлежащих противоионов (оксалат и тартрат), оптимизированного соотношения липид/лекарственное средство и оптимизированных условий загрузки противоопухолевого соединения (например, доксорубицина), сильной зависимости высвобождения лекарственного средства от pH и преимущественного нацеливания химиотерапевтического агента (химиотерапевтических агентов) на опухоль. В вариантах реализации настоящего изобретения для дополнения противоиона(ов) и/или антиоксидантов применяют хелаторы.

[0128] В варианте реализации настоящего изобретения использование оксалата или тартрата в качестве противоиона, соотношение липид/лекарственное средство в оптимизированном диапазоне и надлежащие условия загрузки позволит достичь целевого (рН-зависимого) высвобождения лекарственного средства и, следовательно, позволит улучшить безопасность и эффективность слабоосновных химиотерапевтических агентов с различными молекулярными мишенями (интеркалирующие/повреждающие ДНК агенты, ингибиторы топоизомеразы, ингибиторы киназы и т. д.; таблица 3).

Таблица 3. Другие примеры слабоосновных химиотерапевтических агентов, которые, как ожидается, образуют соли/агрегаты с оксалатом или тартратом.

Даунорубицина гидрохлорид		Применение одобрено для лечения: острого лимфобластного лейкоза у взрослых и детей, острого миелоидного лейкоза у взрослых
Эпирубицина гидрохлорид		Применение одобрено для лечения: рака молочной железы. Он применяется после операции у пациентов с ранней стадией рака молочной железы, который распространился на лимфатические узлы под рукой.
Идарубицина гидрохлорид		Применение одобрено для лечения: острого миелоидного лейкоза (ОМЛ).
Бендамустина гидрохлорид		Применение одобрено для лечения: В-клеточной неходжкинской лимфомы (НХЛ) у пациентов, чье заболевание не улучшилось при другой химиотерапии или рецидивировало (вернулось, хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ)
Индимитекана гидрохлорид		Клинические испытания. Солидные опухоли и лимфомы.
Индотекана гидрохлорид		Клинические испытания. Солидные опухоли и лимфомы.
Эрлотиниба гидрохлорид		Применение одобрено для лечения: немелкоклеточного рака легких (НМРЛ). Применяется в качестве первой линии лечения метастатического НМРЛ у пациентов с опухолями, которые имеют определенные мутации рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). Применяется для лечения местно-распространенного или метастатического НМРЛ у пациентов, которые уже проходили химиотерапию. Рак поджелудочной железы. Применяется с гидрохлоридом гемцитабина у пациентов, у которых заболевание не может быть удалено хирургическим путем или имеет метастазы.
Ралоксифена гидрохлорид		Применение одобрено для лечения: рака молочной железы. Применяется для снижения вероятности инвазивного рака молочной железы у женщин в постменопаузе, имеющих высокий риск развития заболевания или страдающих остеопорозом. Ралоксифена гидрохлорид также одобрен для профилактики и лечения: Остеопороз у женщин в постменопаузе
Топотекана гидрохлорид		Применение одобрено для лечения: Рака шейки матки, в случае, если другое лечение не привело к улучшению или если рак рецидивировал (вернулся). Применяется с другим лекарственным средством, цисплатином. Рак яичников у пациентов, если другая химиотерапия не привела к улучшению. Мелкоклеточный рак легкого у пациентов, если другая химиотерапия не привела к улучшению.
Понатиниба гидрохлорид		Применение одобрено для лечения: Острого лимфобластного лейкоза с положительной реакцией на Филадельфийскую хромосому и мутацией T315I, хронического миелогенного лейкоза с мутацией T315I. Для этих типов лейкоза без мутации T315I применяется гидрохлорид понатиниба, когда нельзя использовать другие ингибиторы тирозинкиназы.
Типирацила гидрохлорид		Применение одобрено для лечения: рака ободочной и прямой кишки с метастазами (распространение на другие части тела). Применяется у пациентов, которые уже проходили определенную химиотерапию и биологическую терапию.
Прокарбазина гидрохлорид		Применение одобрено для лечения: Лимфомы Ходжкина поздних стадий.
Мехлорэтамина гидрохлорид		Применение одобрено для лечения: бронхогенной карциномы, хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), хронического миелогенного лейкоза (ХМЛ), лимфомы Ходжкина поздних стадий, злокачественного плеврального выпота, злокачественного перикардиального выпота и злокачественного перитонеального выпота, фунгоидного микоза, неходжкинской лимфомы (НХЛ).
Пазопаниба гидрохлорид		Применение одобрено для лечения: Почечно-клеточного рака (типа рака почки) поздних стадий, саркомы мягких тканей поздних стадий. Применяется у пациентов, которые уже проходили химиотерапию.
Понатиниба гидрохлорид		Применение одобрено для лечения: Острого лимфобластного лейкоза, положительного по филадельфийской хромосоме и с мутацией T315I, хронического миелогенного лейкоза с мутацией T315I.
Гемцитабина гидрохлорид		Применение одобрено для лечения: рака молочной железы с метастазами (распространение на другие части тела), когда не наступило улучшения после другой химиотерапии, применяется с паклитакселом; немелкоклеточного рака легкого поздних стадий или с метастазами, применяется у пациентов, у которых заболевание не может быть удалено хирургическим путем, применяется с цисплатином. Рак яичников поздних стадий, если другая химиотерапия не привела к улучшению. Применяется с карбоплатином. Рак поджелудочной железы поздних стадий или с метастазами. Применяется у пациентов, у которых заболевание не может быть удалено хирургическим путем и которые уже прошли курс другой химиотерапии. Применяется с композицией наночастиц паклитаксела, стабилизированной альбумином.
AZD7762		Применение одобрено для лечения: AZD7762 является ингибитором киназы Chk1, который повышает чувствительность к повреждающим ДНК агентам, включая гемцитабин. Разработка прекращена из-за неожиданной сердечной токсичности. Киназа Chk1 остается важной терапевтической мишенью.
Винкристина сульфат		Применение одобрено для лечения: Острого лимфобластного лейкоза, отрицательного по филадельфийской хромосоме. Применяется у пациентов, у которых заболевание рецидивировало два или более раз или не улучшилось при двух или более типах лечения.
Винбластина сульфат		Применение одобрено для лечения: рака молочной железы, если не наступило улучшения после другого лечения, хориокарциномы, если не наступило улучшения после другого лечения. Хориокарцинома является типом гестационного трофобластического заболевания. лимфомы Ходжкина, саркомы Капоши, фунгоидного микоза, неходжкинской лимфомы (НХЛ), рака яичек.
Сунитиниба малат		Применение одобрено для лечения: желудочно-кишечных стромальных опухолей (тип рака желудка). Применяется у пациентов, состояние которых ухудшилось при приеме другого лекарственного средства под названием иматиниба мезилат, или у тех пациентов, которые не могут принимать иматиниба мезилат. Рака поджелудочной железы. Применяется у пациентов с прогрессирующими нейроэндокринными опухолями, которые не могут быть удалены хирургическим путем, являются местно-распространенными или имеют метастазы (распространяются на другие части тела). Почечно-клеточного рака (типа рака почки) поздних стадий.
Ланреотида ацетат		Применение одобрено для лечения: гастроэнтеропанкреатических нейроэндокринных опухолей. Применяется для некоторых опухолей, которые не могут быть удалены хирургическим путем, являются местно-распространенными или имеют метастазы (распространяются на другие части тела).
Тамоксифена цитрат		Применение одобрено для лечения: рака молочной железы у женщин и мужчин. Тамоксифена цитрат также одобрен для предотвращения рака молочной железы у женщин с высоким риском заболевания.
Лейпролида ацетат		Применение одобрено для лечения: рака предстательной железы поздних стадий.

[0129] В вариантах реализации настоящего изобретения нацеливание высвобождения липосомального лекарственного средства в зависимости от градиента pH кровь - опухоль - лизосомы повышает безопасность и эффективность слабоосновных химиотерапевтических средств по сравнению с их липосомальной формой без дифференциации высвобождения по pH или с меньшей дифференциацией и/или по сравнению со свободной формой.

Соотношения липида к лекарственному средству (т.е. липид/лекарственное средство) и фосфолипида к свободному холестерину (т.е. PL/FC)

[0130] В вариантах реализации настоящего изобретения оптимальная загрузка лекарственным средством частиц согласно настоящему изобретению достигается за счет правильного выбора противоиона. Кроме того, можно выбрать липофильные неактивные компоненты и поверхностно-активные вещества. Дополнительно можно выбрать подходящее соотношение лекарственного средства и липида. В вариантах реализации настоящего изобретения выбор сделан так, чтобы уменьшить высвобождение при нейтральном рН в кровотоке и увеличить внеклеточное/внутриклеточное высвобождение при более кислом рН в участке-мишени.

[0131] В вариантах реализации настоящего изобретения соотношения липида к лекарственному средству (липид/лекарственное средство) и PL/FC связаны с желательными физико-химическими и биологическими характеристиками.

[0132] В вариантах реализации настоящего изобретения структура частиц определяется выбором компонентов композиции и соотношений липид/лекарственное средство и PL/FC, а также стадиями обработки, используемыми для получения частиц. Структурные и количественные элементы, которые определяют характеристики частиц, включают соотношения липид/лекарственное средство и PL/FC, противоионы, размер частиц (и распределение по размерам в популяции), форму частиц, заряд частиц и распределение отдельных компонентов в частице, особенно тех, которые находятся на поверхности частицы.

[0133] В вариантах реализации структурированные богатые липидами наночастицы/липосомы по настоящему изобретению предназначены для того, чтобы нести полезную лекарственную нагрузку в лекарственном препарате, вводимом парентерально. Лекарственные средства, представляющие интерес для этой системы доставки, включают комплексы лекарственные средства/соли, имеющие низкую растворимость при физиологическом pH и значительно более высокую растворимость при более кислом pH (локальная опухолевая внеклеточная и эндосомальная/лизосомальная среда). Липосомы по настоящему изобретению могут иметь уникальные физико-химические показатели. В вариантах реализации высокие соотношения липид/лекарственное средство и соотношение PL/FC≤4,0, но≥1,0 могут обеспечивать стабильный липидный слой, который ограничивает высвобождение содержимого липосом при помощи градиента концентрации в сыворотке или крови, но допускает дифференцированное высвобождение лекарственного средства в ответ на изменение pH внешней среды, и, следовательно, позволяют воспользоваться преимуществом конкретных противоионов и pKa соответствующей кислоты (кислот).

[0134] В вариантах реализации настоящего изобретения доксорубицин может представлять собой пегилированный липосомальный доксорубицин, такой как применяется в Doxil®. В вариантах реализации настоящего изобретения указанный доксорубицин замещен амфифильным блок-сополимером, а не полиэтиленгликолем.

[0135] В вариантах реализации настоящего изобретения липиды, применяемые в липосомальных композициях, представляют собой пегилированные липиды. В вариантах реализации настоящего изобретения вместо пегилированных липидов применяют полоксамерные липиды (например, липиды P188). Полоксамеры представляют собой неионные сополимеры поли(этиленоксида) (ПЭО) и поли(пропиленоксида) (ППО). Их можно применять в фармацевтических составах в качестве поверхностно-активных веществ. Их поверхностно-активные свойства полезны для моющего действия, дисперсий, стабилизации, пенообразования и эмульгирования. Полоксамеры широко используются в клинических применениях [16]. В вариантах реализации настоящего изобретения липосомы, покрытые (например, интеркалированные) р188, образуются путем растворения липидов и Р188 в ДХМ, затем испарения ДХМ с образованием липидной пленки и гидратации липидной пленки. Этот примерный процесс приводит к интеркаляции (вставке) гидрофобной углеводородной цепи р188 между липидной углеводородной цепью и нахождению более гидрофильной части в водной фазе, а также к возникновению модифицированной липидной поверхности липосом, что предотвращает их опсонизацию и распознавание системой макрофагов.

[0136] В вариантах реализации настоящего изобретения композиции, содержащие липосомы, покрытые полоксамером (например, р188), применяют для лечения заболеваний, где требуется, чтобы активный агент (например, слабоосновное противоопухолевое соединение) преодолел гематоэнцефалический барьер. В вариантах реализации настоящего изобретения композиции, содержащие липосомы, покрытые полоксамером (например, р188), применяют для лечения заболеваний, где требуется активный агент (например, слабоосновное противоопухолевое соединение) и где вмешательство аполипопротеина Е нежелательно.

[0137] В вариантах реализации настоящего изобретения более низкие соотношения липид/лекарственное средство применяют для увеличения поверхностного натяжения и нарушения целостности липидного слоя, что при разведении может привести к повышенной утечке липосомального содержимого в растворяющую среду при нейтральном рН из-за градиента концентрации и может сместить высвобождение лекарственного средства, обусловленное рН. В вариантах реализации настоящего изобретения большие соотношения липид/лекарственное средство применяют для снижения поверхностного натяжения и получения липидного слоя (липидных слоев) с большей целостностью, что предотвращает «нецелевую» утечку интралипосомальных веществ в растворяющую среду и способствует высвобождению лекарственного средства только в ответ на изменение рН.

[0138] В вариантах реализации настоящего изобретения липосомы содержат множество липидов, и можно рассматривать соотношение множества липидов к лекарственному средству (например, слабоосновному противоопухолевому агенту и/или его кислоте или соли). В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (липид к лекарственному средству) представляет собой соотношение по массе (мас./мас.) общих липидов к лекарственному средству (например, свободному основанию доксорубицина) в конечной суспензии загруженных лекарственным средством липосом и имеет среднее значение примерно 0,5:1 (мас./мас.), примерно 1:1, примерно 5:1, примерно 10:1, примерно 20:1, примерно 30:1, примерно 40:1, примерно 50:1, примерно 60:1, примерно 70:1, примерно 80:1, примерно 90:1, примерно 100:1 или любое промежуточное значение из указанных, или выше, чем примерно 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (липид к лекарственному средству) представляет собой мольное соотношение (моль/моль) общих липидов к лекарственному средству в конечной суспензии загруженных лекарственным средством липосом и имеет среднее значение примерно 0,5:1 (моль/моль), примерно 1:1, примерно 5:1, примерно 10:1, примерно 20:1, примерно 30:1, примерно 40:1, примерно 50:1, примерно 60:1, примерно 70:1, примерно 80:1, примерно 90:1, примерно 100:1 или любое промежуточное значение из указанных, или выше, чем примерно 100:1.

[0139] В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (т.е. липид/лекарственное средство) (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 0,5:1 до 1:1, примерно от 0,5:1 до 5:1, примерно от 0,5:1 до 10:1, примерно от 0,5:1 до 20:1, примерно от 0,5:1 до 30:1, примерно от 0,5:1 до 40:1, примерно от 0,5:1 до 50:1, примерно от 0,5:1 до 60:1, примерно от 0,5:1 до 70:1, примерно от 0,5:1 до 80:1, примерно от 0,5:1 до 90:1 или примерно от 0,5:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 1:1 до 5:1, примерно от 1:1 до 10:1, примерно от 1:1 до 20:1, примерно от 1:1 до 30:1, примерно от 1:1 до 40:1, примерно от 1:1 до 50:1, примерно от 1:1 до 60:1, примерно от 1:1 до 70:1, примерно от 1:1 до 80:1, примерно от 1:1 до 90:1 или примерно от 1:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 5:1 до 10:1, примерно от 5:1 до 20:1, примерно от 5:1 до 30:1, примерно от 5:1 до 40:1, примерно от 5:1 до 50:1, примерно от 5:1 до 60:1, примерно от 5:1 до 70:1, примерно от 5:1 до 80:1, примерно от 5:1 до 90:1 или примерно от 5:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 10:1 до 20:1, примерно от 10:1 до 30:1, примерно от 10:1 до 40:1, примерно от 10:1 до 50:1, примерно от 10:1 до 60:1, примерно от 10:1 до 70:1, примерно от 10:1 до 80:1, примерно от 10:1 до 90:1 или примерно от 10:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 20:1 до 30:1, примерно от 20:1 до 40:1, примерно от 20:1 до 50:1, примерно от 20:1 до 60:1, примерно от 20:1 до 70:1, примерно от 20:1 до 80:1, примерно от 20:1 до 90:1 или примерно от 20:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 30:1 до 40:1, примерно от 30:1 до 50:1, примерно от 30:1 до 60:1, примерно от 30:1 до 70:1, примерно от 30:1 до 80:1, примерно от 30:1 до 90:1 или примерно от 30:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 40:1 до 50:1, примерно от 40:1 до 60:1, примерно от 40:1 до 70:1, примерно от 40:1 до 80:1, примерно от 40:1 до 90:1 или примерно от 40:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 50:1 до 60:1, примерно от 50:1 до 70:1, примерно от 50:1 до 80:1, примерно от 50:1 до 90:1 или примерно от 50:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 60:1 до 70:1, примерно от 60:1 до 80:1, примерно от 60:1 до 90:1 или примерно от 60:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 70:1 до 80:1, примерно от 70:1 до 90:1 или примерно от 70:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 80:1 до 90:1 или примерно от 80:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 90:1 до 100:1.

[0140] В вариантах реализации настоящего изобретения мол.% лекарственного средства (например, количество молей лекарственного средства относительно общего количества молей всех составляющих препарата, включая фосфолипиды, холестерин, полоксамеры, противоопухолевое лекарственное средство, соли и т. д.) составляет в среднем примерно 0,5%, примерно 1%, примерно 2%, примерно 3%, примерно 4%, примерно 5%, примерно 6%, примерно 7%, примерно 8%, примерно 9%, примерно 10%, примерно 15%, примерно 20%, примерно 30% или любое промежуточное значение, или выше, чем примерно 30%.

[0141] В вариантах реализации настоящего изобретения мол. % лекарственного средства имеет диапазон примерно 0,5-1%, примерно 0,5-2%, примерно 0,5-3%, примерно 0,5-4%, примерно 0,5-5%, примерно 0,5-6%, примерно 0,5-7%, примерно 0,5-8%, примерно 0,5-9%, примерно 0,5-10%, примерно 0,5-15%, примерно 0,5-20% или примерно 0,5-30%. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения мол. % лекарственного средства имеет диапазон примерно 1-2%, примерно 1-3%, примерно 1-4%, примерно 1-5%, примерно 1-6%, примерно 1-7%, примерно 1-8%, примерно 1-9%, примерно 1-10%, примерно 1-15%, примерно 1-20% или примерно 1-30%. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения мол. % лекарственного средства имеет диапазон примерно 2-3%, примерно 2-4%, примерно 2-5%, примерно 2-6%, примерно 2-7%, примерно 2-8%, примерно 2-9%, примерно 2-10%, примерно 2-15%, примерно 2-20% или примерно 2-30%. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения мол. % лекарственного средства имеет диапазон примерно 3-4%, примерно 3-5%, примерно 3-6%, примерно 3-7%, примерно 3-8%, примерно 3-9%, примерно 3-10%, примерно 3-15%, примерно 3-20% или примерно 3-30%. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения мол. % лекарственного средства имеет диапазон примерно 4-5%, примерно 4-6%, примерно 4-7%, примерно 4-8%, примерно 4-9%, примерно 4-10%, примерно 4-15%, примерно 4-20% или примерно 4-30%. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения мол. % лекарственного средства имеет диапазон примерно 5-6%, примерно 5-7%, примерно 5-8%, примерно 5-9%, примерно 5-10%, примерно 5-15%, примерно 5-20% или примерно 5-30%. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения мол. % лекарственного средства имеет диапазон примерно 6-7%, примерно 6-8%, примерно 6-9%, примерно 6-10%, примерно 6-15%, примерно 6-20% или примерно 6-30%. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения мол. % лекарственного средства имеет диапазон примерно 7-8%, примерно 7-9%, примерно 7-10%, примерно 7-15%, примерно 7-20% или примерно 7-30%. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения мол. % лекарственного средства имеет диапазон примерно 8-9%, примерно 8-10%, примерно 8-15%, примерно 8-20% или примерно 8-30%. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения мол. % лекарственного средства имеет диапазон примерно 9-10%, примерно 9-15%, примерно 9-20% или примерно 9-30%. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения мол. % лекарственного средства имеет диапазон примерно 10-15%, примерно 10-20% или примерно 10-30%. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения мол. % лекарственного средства имеет диапазон примерно 15-20% или примерно 15-30%. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения мол. % лекарственного средства имеет диапазон примерно 20-30%.

[0142] В вариантах реализации настоящего изобретения липосомы содержат множество свободного холестерина (FC). В вариантах реализации настоящего изобретения незагруженные липосомы и/или лекарственное средство, загруженное в липосомы, содержит множество фосфолипидов (PL). Следовательно, в определенных вариантах реализации настоящего изобретения липосомы, загруженные лекарственным средством, содержат свободный холестерин (FC) и фосфолипиды (PL). В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение PL к FC (т.е. «PL к FC» или «PL/FC») представляет собой массовое соотношение (мас./мас.) фосфолипидов к свободным холестеринам в конечной суспензии загруженных лекарственным средством липосом и имеет среднее значение примерно 0,5:1 (мас./мас.), примерно 1:1, примерно 2:1, примерно 3:1, примерно 4:1, примерно 5:1, примерно 10:1, примерно 20:1, примерно 30:1, примерно 40:1, примерно 50:1, примерно 60:1, примерно 70:1, примерно 80:1, примерно 90:1, примерно 100:1, или любое промежуточное значение из указанных, или выше, чем примерно 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение PL к FC (т.е. «PL к FC») представляет собой мольное соотношение (моль/моль) фосфолипидов к свободным холестеринам в конечной суспензии загруженных лекарственным средством липосом и имеет среднее значение примерно 0,5:1 (моль/моль), примерно 1:1, примерно 2:1, примерно 3:1, примерно 4:1, или примерно 5:1, примерно 10:1, примерно 20:1, примерно 30:1, примерно 40:1, примерно 50:1, примерно 60:1, примерно 70:1, примерно 80:1, примерно 90:1, примерно 100:1, или любое промежуточное значение из указанных, или выше, чем примерно 100:1.

[0143] В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение «PL к FC (т.е. PL/FC)» (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно 0,5:1, примерно 0,55:1, примерно 0,6:1, примерно 0,65:1, примерно 0,7:1, примерно 0,75:1, примерно 0,8:1, примерно 0,85:1, примерно 0,9:1, примерно 0,95:1, примерно 1:1, примерно 1,05:1, примерно 1,1:1, примерно 1,15:1, примерно 1,2:1, примерно 1,25:1, примерно 1,3:1, примерно 1,35:1, примерно 1,4:1, примерно 1,45:1, примерно 1,5:1, примерно 1,55:1, примерно 1,6:1, примерно 1,65:1, примерно 1,7:1, примерно 1,75:1, примерно 1,8:1, примерно 1,85:1, примерно 1,9:1, примерно 2:1, примерно 2,05:1, примерно 2,1:1, примерно 2,15:1, примерно 2,2:1, примерно 2,25:1, примерно 2,3:1, примерно 2,35:1, примерно 2,4:1, примерно 2,45:1, примерно 2,5:1, примерно 2,55:1, примерно 2,6:1, примерно 2,65:1, примерно 2,7:1, примерно 2,75:1, примерно 2,8:1, примерно 2,85:1, примерно 2,9:1, примерно 3:1, примерно 3,05:1, примерно 3,1:1, примерно 3,15:1, примерно 3,2:1, примерно 3,25:1, примерно 3,3:1, примерно 3,35:1, примерно 3,4:1, примерно 3,45:1, примерно 3,5:1, примерно 3,55:1, примерно 3,6:1, примерно 3,65:1, примерно 3,7:1, примерно 3,75:1, примерно 3,8:1, примерно 3,85:1, примерно 3,9:1, примерно 4:1, примерно 4,05:1, примерно 4,1:1, примерно 4,15:1, примерно 4,2:1, примерно 4,25:1, примерно 4,3:1, примерно 4,35:1, примерно 4,4:1, примерно 4,45:1, примерно 4,5:1, примерно 4,55:1, примерно 4,6:1, примерно 4,65:1, примерно 4,7:1, примерно 4,75:1, примерно 4,8:1, примерно 4,85:1, примерно 4,9:1, примерно 5:1 или любое промежуточное значение из указанных.

[0144] В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение «PL к FC (т.е. PL/FC)» (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно 0,86:1, примерно 1,22:1, примерно 1,29:1, примерно 1,62:1, примерно 1,72:1, примерно 3,68:1 или любое промежуточное значение из указанных. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение PL/FC (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно 0,86:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение PL/FC (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно 1,22:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение PL/FC (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно 1,29:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение PL/FC (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно 1,62:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение PL/FC (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно 1,72:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение PL/FC (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно 3,68:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение PL/FC (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 0,86:1 до 1,22:1, примерно от 0,86:1 до 1,29:1, примерно от 0,86:1 до 1,62:1, примерно от 0,86:1 до 1,72:1 или примерно от 0,86:1 до 3,68:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение PL/FC (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 1,22:1 до 1,29:1, примерно от 1,22:1 до 1,62:1, примерно от 1,22:1 до 1,72:1 или примерно от 1,22:1 до 3,68:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение PL/FC (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 1,29:1 до 1,62:1, примерно от 1,29:1 до 1,72:1 или примерно от 1,29:1 до 3,68:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение PL/FC (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 1,62:1 до 1,72:1 или примерно от 1,62:1 до 3,68:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение PL/FC (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 1,72:1 до 3,68:1.

[0145] В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение PL/FC (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 0,5:1 до 1:1, примерно от 0,5:1 до 2:1, примерно от 0,5:1 до 3:1, примерно от 0,5:1 до 4:1, примерно от 0,5:1 до 5:1, примерно от 0,5:1 до 10:1, примерно от 0,5:1 до 20:1, примерно от 0,5:1 до 30:1, примерно от 0,5:1 до 40:1, примерно от 0,5:1 до 50:1, примерно от 0,5:1 до 60:1, примерно от 0,5:1 до 70:1, примерно от 0,5:1 до 80:1, примерно от 0,5:1 до 90:1 или примерно от 0,5:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 1:1 до 2:1, примерно от 1:1 до 3:1, примерно от 1:1 до 4:1, примерно от 1:1 до 5:1, примерно от 1:1 до 10:1, примерно от 1:1 до 20:1, примерно от 1:1 до 30:1, примерно от 1:1 до 40:1, примерно от 1:1 до 50:1, примерно от 1:1 до 60:1, примерно от 1:1 до 70:1, примерно от 1:1 до 80:1, примерно от 1:1 до 90:1 или примерно от 1:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 2:1 до 3:1, примерно от 2:1 до 4:1, примерно от 2:1 до 5:1, примерно от 2:1 до 10:1, примерно от 2:1 до 20:1, примерно от 2:1 до 30:1, примерно от 2:1 до 40:1, примерно от 2:1 до 50:1, примерно от 2:1 до 60:1, примерно от 2:1 до 70:1, примерно от 2:1 до 80:1, примерно от 2:1 до 90:1 или примерно от 1:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 3:1 до 4:1, примерно от 3:1 до 5:1, примерно от 3:1 до 10:1, примерно от 3:1 до 20:1, примерно от 3:1 до 30:1, примерно от 3:1 до 40:1, примерно от 3:1 до 50:1, примерно от 3:1 до 60:1, примерно от 3:1 до 70:1, примерно от 3:1 до 80:1, примерно от 3:1 до 90:1 или примерно от 3:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 4:1 до 5:1, примерно от 4:1 до 10:1, примерно от 4:1 до 20:1, примерно от 4:1 до 30:1, примерно от 4:1 до 40:1, примерно от 4:1 до 50:1, примерно от 4:1 до 60:1, примерно от 4:1 до 70:1, примерно от 4:1 до 80:1, примерно от 4:1 до 90:1 или примерно от 4:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 5:1 до 10:1, примерно от 5:1 до 20:1, примерно от 5:1 до 30:1, примерно от 5:1 до 40:1, примерно от 5:1 до 50:1, примерно от 5:1 до 60:1, примерно от 5:1 до 70:1, примерно от 5:1 до 80:1, примерно от 5:1 до 90:1 или примерно от 5:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 10:1 до 20:1, примерно от 10:1 до 30:1, примерно от 10:1 до 40:1, примерно от 10:1 до 50:1, примерно от 10:1 до 60:1, примерно от 10:1 до 70:1, примерно от 10:1 до 80:1, примерно от 10:1 до 90:1 или примерно от 10:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 20:1 до 30:1, примерно от 20:1 до 40:1, примерно от 20:1 до 50:1, примерно от 20:1 до 60:1, примерно от 20:1 до 70:1, примерно от 20:1 до 80:1, примерно от 20:1 до 90:1 или примерно от 20:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 30:1 до 40:1, примерно от 30:1 до 50:1, примерно от 30:1 до 60:1, примерно от 30:1 до 70:1, примерно от 30:1 до 80:1, примерно от 30:1 до 90:1 или примерно от 30:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 40:1 до 50:1, примерно от 40:1 до 60:1, примерно от 40:1 до 70:1, примерно от 40:1 до 80:1, примерно от 40:1 до 90:1 или примерно от 40:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 50:1 до 60:1, примерно от 50:1 до 70:1, примерно от 50:1 до 80:1, примерно от 50:1 до 90:1 или примерно от 50:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 60:1 до 70:1, примерно от 60:1 до 80:1, примерно от 60:1 до 90:1 или примерно от 60:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 70:1 до 80:1, примерно от 70:1 до 90:1 или примерно от 70:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 80:1 до 90:1 или примерно от 80:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липида к лекарственному средству (моль/моль или мас./мас.) имеет среднее значение в диапазоне примерно от 90:1 до 100:1.

[0146] В вариантах реализации настоящего изобретения мол.% фосфолипида (например, количество молей фосфолипида относительно общего количества молей всех составляющих препарата, включая фосфолипиды, холестерин, полоксамеры, противоопухолевое лекарственное средство, соли и т. д.) составляет в среднем примерно 10%, примерно 20%, примерно 30%, примерно 40%, примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 90% или любое промежуточное значение, или выше, чем примерно 90%.

[0147] В вариантах реализации настоящего изобретения мол.% свободного холестерина (FC) (например, количество молей FC относительно общего количества молей всех составляющих препарата, включая фосфолипиды, холестерин, полоксамеры, противоопухолевое лекарственное средство, соли и т. д.) составляет в среднем примерно 5%, примерно 10%, примерно 20%, примерно 30%, примерно 40%, примерно 50%, примерно 60% или любое промежуточное значение, или выше, чем примерно 60%.

[0148] В вариантах реализации настоящего изобретения более низкие соотношения PL/FC (мас./мас. или моль/моль) приводят к увеличению жесткости липидного бислоя, что в свою очередь отрицательно влияет на высвобождение лекарственного средства в зависимости от рН. В вариантах реализации настоящего изобретения более высокие соотношения PL/FC (мас./мас. или моль/моль) нарушают стабильность липосом в сыворотке или крови. Таким образом, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения оптимальный диапазон для соотношения PL/FC соответствует диапазону от 1/1 до 4/1.

[0149] Полученные данные по липосомам, содержащим иринотекан, хорошо согласуются с результатами, полученными для доксорубицина, и подтверждают влияние оксалатных и тартратных противоионов и предпочтительное соотношение липид/лекарственное средство.

Способ загрузки противоопухолевых соединений в липосомы

[0150] В вариантах реализации настоящего изобретения влияние условий загрузки может изменить объем лекарственного средства, содержащегося в липосоме, кинетику высвобождения, размер липосом и т. д. В вариантах реализации настоящего изобретения загрузка липосом в холодных условиях (например, без стадии нагревания или при комнатной температуре) обеспечивает благоприятную кинетику высвобождения.

[0151] В вариантах реализации настоящего изобретения противоопухолевое соединение и парные для него липосомы, содержащие инкапсулированный противоион, можно хранить в отдельном контейнере (например, во флаконах) для смешивания в медицинских условиях перед применением. В вариантах реализации настоящего изобретения слабоосновное противоопухолевое соединение согласно настоящему изобретению является лиофилизированным и легко восстанавливается в стерильной воде для инъекций. В вариантах реализации настоящего изобретения лиофилизированное и восстановленное противоопухолевое соединение можно смешивать с суспензией липосом. В вариантах реализации настоящего изобретения это смешивание происходит при комнатной температуре. Для композиций согласно настоящему изобретению требуется короткое время для инкубации после смешивания. В вариантах реализации настоящего изобретения время инкубации составляет примерно 0-60 минут. В вариантах реализации настоящего изобретения время инкубации составляет примерно 0-45 минут. В вариантах реализации настоящего изобретения время инкубации составляет примерно 0-30 минут. В вариантах реализации настоящего изобретения время инкубации составляет примерно 0-25 минут. В вариантах реализации настоящего изобретения время инкубации составляет примерно 0-20 минут. В вариантах реализации настоящего изобретения время инкубации составляет примерно 0-15 минут. В вариантах реализации настоящего изобретения время инкубации составляет примерно 0-10 минут. В вариантах реализации настоящего изобретения время инкубации составляет примерно 10-30 минут. В вариантах реализации настоящего изобретения время инкубации составляет примерно 5-25 минут. В вариантах реализации настоящего изобретения липосомы суспендируют в водном буфере с рН ~ 7,4.

[0152] Лиофилизация водного раствора доксорубицина в присутствии лактозы и/или маннита приводила к получению лиофилизированного материала, который легко восстанавливался в стерильной воде для инъекций при комнатной температуре до конечной концентрации 6 мг/мл. Смешивание лиофилизированного и восстановленного доксорубицина согласно настоящему изобретению с оксалатсодержащими и тартратсодержащими липосомами приводит к эффективной и быстрой инкапсуляции доксорубицина.

ПРИМЕРЫ

[0153] В вариантах реализации липосомальные композиции согласно настоящему изобретению имеют уникальную биологическую эффективность. При введении эти частицы могут не распознаваться как чужеродные, например, они не мечены белками, которые запускают процессы очистки в тканях ретикулоэндотелиальной системы. В вариантах реализации настоящего изобретения липосомальные композиции покрыты компонентом, который ингибирует опсонизацию и фагоцитоз. Кроме того, липосомальные композиции могут обеспечивать оптимизированное высвобождение лекарственного средства при определенных условиях, например, рН-зависимое высвобождение.

[0154] В вариантах реализации настоящего изобретения рН-зависимый профиль высвобождения лекарственного средства можно оптимизировать путем выбора подходящих противоионов, липидного состава и точной настройки соотношения липид/лекарственное средство с учетом системной и опухолевой биологии (фиг. 1). Например, при оптимизации параметров можно учитывать следующие принципы:

[0155] При нахождении в системном кровообращении - ограничение высвобождения лекарственного средства при нейтральном pH (pH крови 7,4) (фиг. 1A).

[0156] При накоплении в опухоли - высвобождение лекарственного средства в более кислом локальном внеклеточном пространстве (фиг. 1B). Опухоли могут иметь кислую локальную среду (~ рН 6,5-7,2) по сравнению с кровью [1, 40-42]. Кроме того, бедная сосудистая сеть опухоли может привести к предпочтительному накоплению липосомального носителя лекарственного средства. Таким образом, как накопление липосом, так и более кислая локальная среда могут способствовать локальному высвобождению лекарственного средства во внеклеточном пространстве опухоли.

[0157] При интернализации раковыми клетками - максимальное высвобождение лекарственного средства во время резиденции липосом при более кислом рН (например, 6-6,5) в эндосомальной среде (фиг. 1C), что требует меньшего количества лекарственного средства, удерживаемого в лизосомах (фиг. 1D) [50-51]. Локальное накопление/захват липосомального лекарственного носителя в опухоли также может приводить к усилению интернализации липосом раковыми клетками. При интернализации и попадании в кислую эндосомальную среду (~ рН 6,0-6,5) липосомы могут легко высвобождать лекарственное средство и, следовательно, его цитоплазматическая биодоступность значительно улучшается.

[0158] Таким образом, желательный профиль высвобождения лекарственного средства (фиг. 1E) будет способствовать высвобождению большей части инкапсулированного лекарственного средства в диапазоне рН от 6,9 до 6,0, что соответствует опухоли и эндосомальной среде по меньшей мере в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения.

Пример 1: Материалы и методы: доксорубицин

Количественная оценка доксорубицина при помощи ВЭЖХ

[0159] Все измерения ВЭЖХ проводили с использованием системы Agilent 1260 Infinity, оснащенной насосом G13110B, автосэмплером G1329B, отсеком для колонки G1316A и детектором с диодной матрицей G1315D. Программное обеспечение OpenLab CDS (издание EZChrom) контролировало все модули и применялось для анализа и составления отчетов по хроматографии. Для всех анализов применяли колонку Phenomenex Luna C18 (5 мкм, 150 × 4,6 мм; деталь № 00G-4252-E0).

[0160] Ацетат натрия чистоты, соответствующей действующим требованиям надлежащей производственной практики (cGMP), был приобретен у Macco Organiques Inc. (Валлифилд, Квебек, Канада), а соляная кислота (применяемая для корректировки pH), чистота которой соответствовала стандарту Американского химического общества (ACS), была приобретена у EMD Millipore (Биллерика, Массачусетс, США). Вся использованная вода была очищенной.

[0161] Хроматографический анализ доксорубицина (DOX) проводили на системе Agilent 1260 Infinity с использованием колонки C18 (см. выше) с температурой колонки 40°C и температурой образца, соответствующей условиям окружающей среды (~ 25 °C). Все реагенты для подвижной фазы перед использованием фильтровали через фильтрующую мембрану 0,45 мкм. Ацетонитрил степени чистоты «для ВЭЖХ» был приобретен у EMD Millipore. Использовали изократическую подвижную фазу, содержащую ацетат натрия 0,05 М (рН 4,0) и ацетонитрил (72:28, об./об.). Устанавливали скорость потока подвижной фазы 1,0 мл/мин при времени работы 15 минут. Детектор с диодной матрицей работал на 487 нм с шириной полосы 4 нм. Объем впрыска был установлен на 10 мкл.

[0162] Стандартный исходный раствор доксорубицина готовили в 0,9% солевом растворе, или метаноле, или в водном растворе (1 мг/мл). Калибровочные стандарты готовили путем разведения исходного раствора в безводном метаноле, чтобы ограничить целевую концентрацию для анализа. Для этого исследования раствор доксорубицина разводили безводным метанолом или IPA до конечной концентрации 50 мкг/мл, 100 мкг/мл и 200 мкг/мл, соответственно. Образцы липосомальной суспензии также разводили безводным метанолом или IPA 8-кратно или 10-кратно перед анализом.

Флюорометрия

[0163] Все анализы выполнялись с использованием флуоресцентного планшет-ридера SpectraMax Gemini EM Molecular Devices. Для контроля прибора и для анализа и составления отчетов о значениях использовали программное обеспечение SoftMax Pro.

[0164] Стандартный исходный раствор доксорубицина гидрохлорида готовили в 0,9% солевом растворе (6 мг/мл). Калибровочные стандарты готовили путем разведения исходного раствора в забуференном фосфатом физиологическом растворе, рН 7,4 и 5,0, чтобы ограничить целевую концентрацию для анализа. Температура планшет-ридера была установлена на 25 °C, а длины волн возбуждения и испускания были установлены на 478 нм и 594 нм, соответственно. Был определен линейный диапазон, равный 0,5-4 мкг/мл гидрохлорида доксорубицина. Чтобы оставаться в линейном диапазоне, калибровочные стандарты доксорубицина гидрохлорида и образцы разводили соответствующим образом.

[0165] Для определения общего содержания доксорубицина в липосомальной композиции (Ft) липосомы разрушали при помощи добавления Тритона Х-100 до конечной концентрации 1%, перемешивали переворачиванием и инкубировали до количественного определения.

[0166] Для определения свободного доксорубицина указанную липосомальную композицию загружали в ультрафильтрационную установку (концентратор Pierce, ThermoScientific, Рофорд, Иллинойс, США) с отсечкой молекулярной массы 100000 D. После центрифугирования при 2500 об/мин в течение 1-2 часов фильтрат анализировали с использованием флуоресцентного планшет-ридера SpectraMax Gemini EM и определяли количественно.

[0167] Для определения флуоресценции интралипосомального содержания доксорубицина указанную липосомальную композицию подвергали флуорометрическому анализу без предварительной обработки тритоном Х-100.

Количественная оценка высвобождения доксорубицина из липосомальных композиций

[0168] Для определения высвобождения доксорубицина применяли метод Ли с соавторами (Lee et al.) [20], в котором используют исчезновение эффекта гашения флуоресценции и относят его к 100% флуоресценции (липосомы, разрушенные тритоном Х-100). Этот подход основан на том факте, что флуоресценция доксорубицина гасится при инкапсуляции в липосомы и заметно увеличивается при высвобождении доксорубицина из липосом. Следовательно, увеличение флуоресценции интактных липосом (Fi) во время инкубации образца в растворяющей среде представляет собой высвобождение доксорубицина в среду. Разница между значениями Fi в разные моменты времени и T0, отнесенная к Ft (100% флуоресценция разрушенных липосом) представляет собой процент высвобожденного лекарственного средства.

[0169] Исследование проводили при температуре 25°C и 37°C (для имитации условий in vivo) в следующие моменты времени: T0, T2ч, T4ч и T8ч. Отдельные образцы разводили в отдельных разбавителях/растворяющих средах количеством до четырех; PBS pH 7,4 и/или PBS/pH 6,7, и/или PBS pH 6,0, и/или PBS pH 5,0 20-кратно (например, 100 мкл образца+1,9 мл разбавителя) или 50-кратно (например, 50 мкл образца+2,45 мл разбавителя). Для определения в момент времени T0 липосомальные композиции разводили в буферах PBS с pH 7,4, и/или pH 6,7, и/или pH 6,0, и/или pH 5,0 при температуре ~ 25 °C. Сразу же измеряли флуоресценцию интактных липосом (Fi) и общую флуоресценцию липосом, разрушенных при помощи Тритона Х-100 (Ft). Температура планшет-ридера была установлена на 25 °C; длины волн возбуждения и испускания были установлены на 478 нм и 594 нм, соответственно.

[0170] Другие образцы липосом разводили 20-кратно или 50-кратно в буфере PBS с pH 7,4, 6,7, 6,0 и pH 5,0, предварительно нагретым до температуры 37°C (для моделирования температуры in vivo), и инкубировали в течение 2, 4 и 8 часов при температуре 37 °C.

[0171] Другие образцы липосом разводили 20-кратно или 50-кратно сывороткой крови или кровью человека, предварительно нагретыми до температуры 37°C (для моделирования температуры in vivo), и инкубировали в течение 2, 4 и 8 часов при температуре 37 °C. В каждый момент времени измеряли флуоресценцию интактных липосом (Fi) и общую флуоресценцию липосом, разрушенных при помощи Тритона Х-100 (Ft). Процент высвобождения лекарственного средства был количественно определен как [(Fi_n -Fi_t0)/Ft_средн)]*100%, где Fi_n - Fi, измеренный через 2, 4 или 8 часов, Fi_t0 - Fi, измеренный в момент времени T0, и Ft_средн - среднее значение Ft для всех временных точек. Стоит отметить, что не было значительного изменения значений Ft, наблюдаемых в различные моменты времени и при разных pH.

Определение размера частиц

[0172] Все анализы проводили с использованием анализатора размера частиц, молекулярной массы и дзета-потенциала Malvern Zetasizer Nano ZS с He-Ne лазером 4 мВт, работающим на длине волны 633 нм и при угле обнаружения 173°. Для контроля прибора и для анализа и составления отчетов о значениях использовали программное обеспечение Zetasizer.

[0173] Распределение частиц по размеру по интенсивности. Усредненные по интенсивности диаметры частиц (Z-среднее) рассчитывали на основе кумулянтного анализа, как определено в ISO 13321 (Международная организация по стандартизации 1996).

[0174] Количественное распределение частиц по размеру. В этом распределении существует линейная зависимость между размером частиц и вкладом в распределение. Количественное распределение частиц по размерам рассчитывают на основе распределения интенсивности и оптических свойств материала. Обычно данные ДРС показывают уменьшение диаметра при переходе от средних значений по интенсивности к количественным средним значениям [35].

[0175] Обычно значения Z-среднего, полученные на основе интенсивности, превышают диаметры, полученные с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ), по следующим причинам: а) вклад диаметра частицы в интенсивность рассеяния света пропорционален шестой степени, так что более крупные частицы преобладают в сигнале, и b) ДРС измеряет гидродинамический диаметр (т.е. диаметр частицы плюс лиганды, ионы или молекулы, которые связаны с поверхностью частицы), так что инструмент воспринимает частицу как большую по сравнению с ТЭМ.

[0176] Образцы готовили с использованием 30 мкл липосомальной композиции в 1,5 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (рН 7,4) и перед анализом выдерживали при температуре 25 °С. Измерения размера проводили трижды для каждого образца.

Криотрансмиссионная электронная микроскопия доксорубицинсодержащих липосом.

[0177] Медные сетки 400 меш с углеродным покрытием (EMS) были обработаны в тлеющем разряде при помощи блока, создающего тлеющий разряд EMS100x. Три микролитра образца, разведенного 15-кратно в предоставленном буфере, наносили на сетку, обработанную тлеющим разрядом, а затем замораживали в жидком этане при помощи Vitrobot™ Mark II (FEI) и затем хранили в жидком азоте. Изображения сеток получали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа с полевой эмиссионной пушкой FEI CM200 при ускоряющем напряжении 200 кВ. Сетка была тщательно рассмотрена, репрезентативные изображения получали при увеличении 15kx, 27,5kx, 38kx, 50kx и 66kx с использованием детектора TVIPS F224 2kx2k.

Измерения pH.

[0178] Все анализы выполняли с использованием pH-метра Mettler Toledo SevenCompact с микроэлектродом Mettler Toledo InLab pH.

Получение грубой суспензии.

[0179] Грубую суспензию готовили при растворении PC, DMPC, FC и P188 в 10 мл ДХМ в соотношениях, указанных в таблице 6. Смесь сушили в потоке азота до получения вязкой пленки. Затем пленку сушили в вакуумной печи в течение ночи. На следующий день высушенную липидную пленку гидратировали 300 мМ раствором следующих солей аммония: оксалат аммония, или сульфат аммония, или пиколинат аммония, или фосфат аммония, или цитрат аммония, или ацетат аммония, или формиат аммония, предварительно нагретым до температуры 65 °С, и сразу же гомогенизировали с помощью ручного гомогенизатора в течение 2-3 мин. Определяли размер частиц грубой суспензии, который всегда находился в диапазоне 800-1200 нм. Малеиновую кислоту, цистеин, NAC, аскорбиновую кислоту, малоновую кислоту, винную кислоту, фумаровую кислоту или янтарную кислоту сначала титровали гидроксидом аммония до рН 4,8-5,0, а затем использовали в качестве гидратирующей среды.

Микрофлюидизация (MF)

[0180] Для микрофлюидизации объем всегда составлял 100 мл, если не указано иное. Для микрофлюидизации давление всегда составляло 10 KPSI (тысяч фунтов на квадратный дюйм) (соответствует ~ 68,9476 мПа). Микрофлюидизацию грубой суспензии проводили в режиме рециркуляции (с возвратом материала в питающий резервуар) при контролируемой (≤ 65 °C) температуре. Время обработки находилось в диапазоне 10-16 минут. Желаемый размер частиц (Z-среднее) составлял 60-70 нм.

Фильтрование тангенциальным потоком

[0181] Полупрозрачную наносуспензию собирали из микрофлюидизатора и подвергали фильтрованию тангенциальным потоком (TFF) с 15-20 Х объемами PBS, pH 7,4. Целью TFF было заменить внешние буферы, включающие оксалат аммония, или сульфат аммония, или фосфат аммония, или тартрат аммония, или цитрат аммония, или малеиновую кислоту, цистеин, NAC, аскорбиновую кислоту, малоновую кислоту, винную кислоту, фумаровую кислоту или янтарную кислоту, титрованные гидроксидом аммония до рН 4,8-5,0, на PBS, и главным образом для того, чтобы удалить аммоний из внешнего буфера и внутрилипосомального пространства. Аммоний во внешнем буфере измеряли при помощи аммоний-специфичного электрода. TFF прекращали, когда концентрация аммония во внешнем буфере составляла≤3 мМ.

«Бесконтактная» загрузка доксорубицином

[0182] Доксорубицина гидрохлорид растворяли в физиологическом растворе до конечной концентрации 6 мг/мл. Физиологический раствор доксорубицина добавляли к липосомальной наносуспензии в PBS, рН 7,4, до конечной концентрации 1 мг/мл. Смесь нагревали до температуры 70 °С. После инкубации при температуре 70 ° C в течение 30 мин указанной смеси давали остыть до температуры окружающей среды (~ 25 °C) и подвергали еще одному циклу TFF 5X с PBS pH 7,4, содержащим 6% сахарозы.

[0183] Холодную загрузку доксорубицина в липосомы выполняли следующим образом: физиологический раствор доксорубицина добавляли к липосомальной наносуспензии при комнатной температуре до конечной концентрации 1 мг/мл, осторожно переворачивали (2-3 раза) и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. После инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут указанную смесь: а) подвергли еще одному циклу TFF 5Х с PBS pH 7,4, содержащим 6% сахарозы, и/или b) помещали в холодильник при температуре 2-8 °С на 16 часов, а затем подвергали стерилизующему фильтрованию или проводили другой цикл TFF 5X с PBS pH 7,4, содержащим 6% сахарозы.

[0184] После холодной загрузки липосомальную наносуспензию подвергали стерилизующему фильтрованию в стерильную колбу Nalgene через фильтр 0,22 мкм. Определяли размер частиц, pH, содержание доксорубицина по ВЭЖХ, Fi, Ft, свободный доксорубицин и профиль высвобождения доксорубицина. Стерильную наносуспензию асептически распределяли в предварительно стерилизованные флаконы объемом 2 мл, закупоривали и герметизировали. Флаконы хранили при температуре 2-8 °С.

Анализ цитотоксичности на основе клеток in vitro.

[0185] Клетки Дауди (ATCC, CCL-213). Клетки высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 100К клеток на лунку. В среде для выращивания клеток (RPMI-1640, 10% FBS) соответствующим образом разводили доксорубицина гидрохлорид, Doxil® или оксалатные липосомы с доксорубицином (RPMI-1640, 10% FBS) и добавляли к клеткам. После инкубации при температуре 37 °С в течение 1 часа планшеты центрифугировали, супернатант удаляли аспирацией, в каждую лунку добавляли 100 мкл свежей среды и клетки культивировали в течение 48 часов.

[0186] Клетки Hela (HeLa (ATCC CCL-2). Клетки высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 25К клеток на лунку. В среде для выращивания клеток (DMEM, 5% FBS, 1% антибиотик, 1% HEPES) соответствующим образом разводили доксорубицина гидрохлорид, Doxil® или оксалатные липосомы с доксорубицином и добавляли к клеткам. После инкубации при температуре 37 °С в течение 1 часа планшеты центрифугировали, супернатант удаляли аспирацией, в каждую лунку добавляли 100 мкл свежей среды и клетки культивировали в течение 48 часов.

[0187] В день 3 для оценки жизнеспособности клеток готовили раствор аламарового синего в среде для выращивания клеток (RPMI-1640, 10% FBS) в разведении 1:250 и добавляли непосредственно в клеточную среду. После инкубации при температуре 37 °С в течение 6 часов полученную флуоресценцию считывали на планшет-ридере. Флуоресценция клеток, которые не получали никакого лекарственного средства, была взята за максимальную жизнеспособность. Флуоресценция бесклеточной среды была взята за полную гибель клеток. Анализ данных проводили с использованием программного обеспечения для нелинейной регрессии Prism (GraphPad Software) для подбора кривой и определения значений IC50.

Исследование in vivo

[0188] Клеточную линию В-лимфомы человека Ramos (RA 1) (ATCC CRL-1596) культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 20 мМ HEPES, 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина и 1 мМ пирувата натрия. Плотность клеток поддерживали в диапазоне 3×10^5-1,5×10⁶, а жизнеспособность поддерживали в диапазоне 90-95%. До введения животным в тот же день клетки подсчитывали, центрифугировали при 12000 об/мин, промывали стерильным PBS, снова центрифугировали при 1200 об/мин, ресуспендировали в стерильном PBS до конечного числа клеток 35×10 на мл. Суспензию клеток вводили животным внутривенно посредством однократной болюсной инъекции с доставкой 5×10⁶ клеток на каждую мышь.

[0189] Четырехнедельных иммунодефицитных мышей SCID Beige (линия - CB17.Cg-Prkdc^scidLyst^bg-J /Crl) в возрасте четырех недель содержали на сбалансированной диете. В возрасте 8 недель мышей подразделяли на 3 группы. В день 1 каждой мыши вводили внутривенно 5×10⁶ клеток В-лимфомы (фиг. 2). На второй день одна группа получала плацебо (липосомы, не содержащие доксорубицина), а еще две группы получали Doxil® (лот № FAZSR00) или оксалатные липосомы с доксорубицином, соответственно. На 2 и 3 день все процедуры повторяли (фиг.2). Животных контролировали ежедневно и взвешивали два раза в неделю.

[0190] Перед инъекцией липосомы Doxil® или оксалатные липосомы с доксорубицином были соответствующим образом разведены в PBS до конечной концентрации 0,5 мг/мл. Лечение вводили внутривенно в объеме 120 мкл с помощью однократной болюсной инъекции с доставкой 60 мкг доксорубицина на каждую мышь или дозы ~ 3 мг/кг.

[0191] Используемые материалы приведены в таблице 4.

Таблица 4. Список материалов

Реагенты	ММ	№ по кат.	Поставщик/Производитель
Фосфатидилхолин (PC) яичный лецитин (LIPOID E PC S)	770	510800-KG-1	Lipoid
1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DMPC)	678	850345P	Avanti Polar Lipids
DSPE-PEG (2000) Амин 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- [амино(полиэтиленгликоль)- 2000] (аммониевая соль)	2790	880128P	Avanti Polar Lipids
Коллифор Р 188 (Полоксамер Р188)	7680-9510	WPCH537B	Mutchler
P188/Synperonic PE/F68	7680-9510	ETK1229	Croda
Свободный холестерин (ФК)	387	A11470	Alfa Aesar
Доксорубицина гидрохлорид	579,98	7000AO02113	Sicor, TEVA* API Division
Doxil® (Caelyx)	N/A	FAZSR00	TTY Biopharm Company Ltd,
Doxil® (Caelyx)	N/A	L01DB01	Ben Venue, Огайо, США
Иринотекан гидрохлорид тригидрат	677,18	I-4122	LC Labs
Иринотекана гидрохлорид	623,14	I1406	Sigma-Aldrich
Митоксантрона дигидрохлорид	516,70	14842	Cayman Chemicals
Сульфат аммония	132,14	A4418	Sigma-Aldrich
Щавелевая кислота	90,03	241172	Sigma-Aldrich
Аммоний оксалат моногидрат	142	09898	Sigma-Aldrich
Фосфат аммония одноосновный	115,03	216003	Sigma-Aldrich
Фосфат аммония двухосновный	132,06	215996	Sigma-Aldrich
Цитрат аммония двухосновный	226,18	25102	Sigma-Aldrich
Цитрат аммония трехосновный	243,22	A1332	Sigma-Aldrich
L - (+) винная кислота	150,09	251380	Sigma-Aldrich
Цистеин	121,16	C 7352	Sigma-Aldrich
Ацетат аммония	77,08	AX 1222-5	EMD
Пиколиновая кислота	123,11	P 42800	Sigma-Aldrich
Малоновая кислота	104,06	M 1296	Sigma-Aldrich
Малеиновая кислота	116,07	M0375	Sigma-Aldrich
Фумаровая кислота	116,07	47910	Sigma-Aldrich
Раствор формиата аммония, 10М	63,06	78314	Sigma-Aldrich
Янтарная кислота	118,09	S3674	Sigma-Aldrich
L-аскорбиновая кислота	176,12	A5960	Sigma-Aldrich
Бутилированный гидрокситолуол (БГТ)	220,36	B1196	Spectrum
N-ацетил L цистеин	163,19	A7250	Sigma-Aldrich
Гидроксид аммония	35,04	AX1303-6	EMD
HCl	36,5	HX0603	EMD Millipore
Дихлорметан (ДХМ)	85	P3813	Sigma-Aldrich
Физиологический раствор с фосфатным буфером	NA	P5368-10PAK	Sigma-Aldrich
Triton X-100	625	9400	OmniPur
Сахароза с низким содержанием эндотоксина	342	1.00892.1003	EMD Millipore
Лактоза	360,31	Таблетоза 80	MEGGE Pharma
Маннит	182,17	Pearlitol 160C	Roquette
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)	292,25	PN: 0322	Amresco
Хлорид натрия	58	M-11619:	Fisher Scientific
6-пальмитат L-аскорбиновой кислоты	414,53	A1968	Sigma-Aldrich
Коэнзим Q10	863,34	C9538	Sigma-Aldrich
Резазурина натриевая соль (аламаровый синий)	251,17	R7017	Sigma-Aldrich
Вода для орошения	NA	PN: BMGR5007	B. Braun
Вода для инъекций	NA	PN: 2B0309	Baxter
2 мл флаконы	N/A	RTF8409	Afton Scientific
Объединенная сыворотка крови здорового человека	N/A	IPLA-SER	Innovative Research
Цельная кровь человека от одного донора - антикоагулянт Na ЭДТА	N/A	IPLA-WB1	Innovative Research
Сыворотка крови мышей дикого типа	N/A	IGMS-C57-SER	Innovative Research

*- регистрационное досье препарата.

[0192] Используемое оборудование приведено в таблице 5.

Таблица 5. Список оборудования

Инструмент	Модель	Поставщик/Производитель
Лабораторный смеситель с высоким сдвиговым усилием	Silverson L5M-A	Silverson
Микрофлюидизатор	M 110P	Microfluidics
Анализатор размера частиц, молекулярной массы и дзета-потенциала	Nano ZSP	Malvern
Считыватель микропланшетов	SpectraMax Gemini EM	Molecular devices
Блок фильтрования тангенциальным потоком	Система Labscale TFF с кассетой Pellicon XL	MD Millipore
Насос-репитер	BAXA	Baxter
Циркуляционная водяная баня VWR		VWR Scientific
Лиофилизатор	VirTis Genesis SQ25EL	VirTis
Аналитические весы	XS 6002S	Mettler Toledo
Прибор для измерения pH	SevenCompact	Mettler Toledo
Центрифуга Эппендорф	5417	Eppendorf
Ручной прибор для измерения рН с аммоний-специфичным электродом	SP21	VWR
Центрифуга Beckman Coulter	Allegra 6R	Beckman Coulter
ВЭЖХ Agilent Technologies	1220 Infinity LC	Agilent
Вакуумная печь	1430 D	VWR Scientific
Микроскоп	Olympus BHA	Olympus

[0193] Краткий перечень используемых сокращений: ВЭЖХ- высокоэффективная жидкостная хроматография; MFD - дата производства; ДХМ -дихлорметан; PC - фосфатидилхолин; FC - свободный холестерин; P188 - полоксамер 188; DMPC - 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин; MF - микрофлюидизатор; мас./об. -масса к объему; mfg - производство; ND - не определено; Fi - флуоресценция интактных липосом, загруженных флуоресцентным лекарственным средством; Ft - общая флуоресценция лекарственного средства, доставленного из разрушенных липосом; TFF - фильтрование тангенциальным потоком; мас./мас. -массовое соотношение; соотношение липида к лекарственному средству - мас./мас. соотношение (PC+DMPC+FC)/доксорубицин, или иринотекан, или митоксантрон.

Пример 2: Загрузка доксорубицином при температуре 70°C: Сравнение различных противоионов при фиксированном соотношении липид/лекарственное средство (т.е. соотношение липида к лекарственному средству) 50:1 (т.е. 50 к 1 или 50/1).

[0194] Используемые гидратирующие среды:

а) 300 мМ раствор следующих солей аммония: оксалат аммония, или сульфат аммония, или пиколинат аммония, или фосфат аммония, или цитрат аммония, или ацетат аммония, или формиат аммония.

b) щавелевую кислоту, малеиновую кислоту, цистеин, малоновую кислоту, винную кислоту, фумаровую кислоту, янтарную кислоту, аскорбиновую кислоту или N-ацетил-L-цистеин (NAC) сначала титровали гидроксидом аммония до рН 4,8-5,0, а затем использовали в качестве гидратирующей среды.

[0195] «Бесконтактную» загрузку осуществляли при температуре 70°С с 1 мг/мл доксорубицина гидрохлорида (например, 0,936 мг свободного основания доксорубицина на мл). Гидрохлорид. Состав композиции приведен в таблице 6. Все композиции были приготовлены при соотношении липид/лекарственное средство 50: 1 (таблица 6). Соотношение липид/лекарственное средство представляет собой массовое соотношение (мас./мас.) общих липидов к свободному основанию доксорубицина в конечной суспензии загруженных доксорубицином липосом.

[0196] Данные по пиколинату, малеату, цистеинату, малонату, фумарату, формиату, сукцинату, ацетату, аскорбиновой кислоте или NAC не показаны, поскольку не было обнаружено какой-либо загрузки доксорубицином и липосомный материал выпадал в осадок после хранения в течение ночи при температуре 2-8 °C.

Таблица 6. Состав композиции

Лот #	Гидратирующая среда	Количество твердых веществ, используемых в композициях, мас./мас., %
PC	DMPC	FC	P 188	Доксорубицина гидрохлорид	Липид/лек. ср-во
647-2-106	Сульфат аммония	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-121 A	Оксалат аммония	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-145 B	Щавелевая кислота+NH4OH до pH 4,8-5,0	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-144 B	Фосфат аммония	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-151 B	Винная кислота+NH4OH до pH 4,8-5,0	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-105 B	Цитрат аммония	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50

[0197] Готовили грубую суспензию и обрабатывали микрофлюидизацией (MF). После микрофлюидизации в течение 9-12 минут размер частиц (Z-среднее) достигал ~ 60-75 нм. Образец собирали и подвергали стерилизующему фильтрованию в стерильную колбу Nalgene. Определяли размер частиц в фильтрованной наносуспензии (Таблица 7).

Таблица 7. Сводка параметров микрофлюидизации и параметров полученной эмульсии.

Лот #	Противоион	MFD	Давление обработки, KPSI (тысячи фунтов на кв. дюйм)	Размер частиц Z средн., нм
647-2-106	Сульфат	28 марта 2016	10	60
647-2-121 A	Оксалат	12 апреля 2016	10	59
647-2-145 B	Оксалат	09 мая 2016	10	63
647-2-144 B	Фосфат	06 мая 2016	10	60
647-2-151 B	Тартрат	05 мая 2016	10	65
647-2-105 B	Цитрат	03 мая 2016	10	60

[0198] Липосомы подвергали TFF с последующей «бесконтактной» загрузкой доксорубицином, затем проводили еще один цикл TFF с PBS с сахарозой. Концентрация доксорубицина гидрохлорида, используемая для «бесконтактной» загрузки: 1,0 мг/мл (концентрация свободного основания доксорубицина: 0,936 мг/мл).

[0199] Размер частиц липосом, загруженных доксорубицином, представлен в таблице 8.

Таблица 8. Размер частиц липосом, загруженных доксорубицином.

Лот #	Противоион	Дата загрузки	Размер частиц Z средн., нм
647-2-106	Сульфат	31 марта 2016	66
647-2-121 A	Оксалат	12 апреля 2016	68
647-2-145 B	Оксалат	09 мая 2016	72
647-2-144 B	Фосфат	06 мая 2016	70
647-2-151 B	Тартрат	18 мая 2016	70
647-2-105 B	Цитрат	03 мая 2016	72

[0200] Определение доксорубицина в липосомальной суспензии. После загрузки доксорубицином липосомальную суспензию подвергали 5X TFF, чтобы в основном удалить свободный (не инкапсулированный) доксорубицин. Для определения общей концентрации доксорубицина в момент времени T0 (в течение одной недели с даты производства (MFD)) липосомы, промытые при помощи TFF, разводили в метаноле или IPA и проводили анализ ВЭЖХ. Содержание доксорубицина, процент извлечения (содержание доксорубицина в липосомальной суспензии относительно концентрации свободного основания доксорубицина, применяемого для «бесконтактной» загрузки) и эффективность инкапсуляции (%) представлены в таблице 9. Эффективность инкапсуляции (%) представляет собой разницу между извлечением доксорубицина (%) и свободным доксорубицином (%).

Таблица 9. Общее содержание доксорубицина и эффективность инкапсуляции.

Лот #	Противоион	Свободное основание доксорубицина, исп. для загрузки, мкг/мл	Анализ ВЭЖХ	Инкапсулированный доксорубицин, % [Извлечение, %] - [Свободн., %]
Содержание доксорубицина (липосомальная суспензия) мкг/мл	Извлечение, %
647-2-106	Сульфат	936	936	100	100
647-2-121 A	Оксалат	936	841	90	100
647-2-145 B	Оксалат	936	792	85	100
647-2-144 B	Фосфат	936	795	85	84
647-2-151 B	Тартрат	936	814	87	87
647-2-105 B	Цитрат	936	750	80	79

[0201] Количество свободного (не инкапсулированного) доксорубицина определяли в течение одной недели после изготовления (таблица 10).

Таблица 10. Содержание свободного доксорубицина.

Лот #	Противоион	% от общего
647-2-106	Сульфат	0,02
647-2-121 A	Оксалат	0,13
647-2-145 B	Оксалат	0,01
647-2-144 B	Фосфат	0,46
647-2-151 B	Тартрат	0,03
647-2-105 B	Цитрат	0,90

[0202] Изменение содержания свободного (не инкапсулированного) доксорубицина при хранении при температуре 2-8 °С представлено в таблице 11.

Таблица 11. Изменение содержания свободного доксорубицина во время хранения при температуре 2-8 °С

Лот #	Противоион	Дней после T0	% от общего
647-2-106	Сульфат	0	0,02
62	0,03
647-2-121 A	Оксалат	0	0,13
45	0,3
647-2-145 B	Оксалат	0	0,01
36	0,19
647-2-144 B	Фосфат	0	0,46
26	0,25
647-2-151 B	Тартрат	0	0,03
26	0,1
647-2-105 B	Цитрат	0	0,90
34	1,10

[0203] Изучение высвобождения липосомального доксорубицина проводили при температуре 25°C (таблица 12) и 37°C (таблица 13). Для каждого образца высвобождение доксорубицина определялось через 2, 4 и 8 часов.

Таблица 12. Скорость высвобождения доксорубицина, определенная при температуре 25°.

Лот #	Противоион	Pka1	pH 5, высвобождение, %	pH 7,4, высвобождение, %
2 часа	4 часа	8 часов	2 часа	4 часа	8 часов
647-2-106	Сульфат	-3	1	0	1	0	0	1
647-2-121 A	Оксалат	1,27	2	5	7	0	0	0
647-2-144 B	Фосфат	1,96	2	3	4	0	1	0
647-2-151 B	Тартрат	3,03	0	4	4	0	0	0
647-2-105 B	Цитрат	3,13	3	4	6	0	0	0

Таблица 13. Скорость высвобождения доксорубицина, определенная при температуре 37°.

Лот #	Противоион	Pka1	pH 5, высвобождение, %	pH 7,4, высвобождение, %
2 часа	4 часа	8 часов	2 часа	4 часа	8 часов
Doxil®	Сульфат	-3	0,9	1,1	1,4	0,9	1,1	1,1
647-2-106	Сульфат	-3	0,1	2,7	2,4	0,01	0,6	0,1
647-2-121 A	Оксалат	1,27	47	55	73	2	2	5
647-2-145 B	Оксалат	1,27	41	58	70	1	4	5
647-2-144 B	Фосфат	1,96	18	20	22	0	0	1
647-2-151 B	Тартрат	3,03	14	27	39	0	1	1
647-2-105 B	Цитрат	3,13	14	19	24	0	0	0

[0204] Скорость высвобождения доксорубицина (при температуре 37°С) также контролировали во время хранения образцов при температуре 2-8°С (таблица 14).

Таблица 14. Скорость высвобождения доксорубицина при температуре 37°С. Влияние хранения при температуре 2-8°С.

Лот #	Противоион	Дней после T0	pH 5, высвобождение, %	pH 7,4, высвобождение, %
2 часа	4 часа	8 часов	2 часа	4 часа	8 часов
647-2-106	Сульфат	0	0,1	2,7	2,4	0	0,6	0,1
62	1	2	2	0	0	1
647-2-121 A	Оксалат	0	47	55	73	2	2	4
45	41	56	72	4	6	5
647-2-145 B	Оксалат	0	41	58	70	1	4	5
36	30	50	68	1	4	6
647-2-144 B	Фосфат	0	18	20	22	0	0	1
38	16	17	19	1	1	3
647-2-151 B	Тартрат	0	14	27	39	0	1	1
26	15	24	35	1	1	2
647-2-105 B	Цитрат	0	14	19	24	0	0	0
59	22	27	31	0	0	0

[0205] Размер частиц. Из таблицы 7 видно, что микрофлюидизация различных липосомальных композиций приводила к получению частиц сходных размеров. Загрузка доксорубицином приводила к незначительному увеличению размера частиц во всех составах (таблица 8).

[0206] Эффективность инкапсуляции доксорубицина варьировала от 79 до 100%. Наибольшая инкапсуляция 100% наблюдалась при применении сульфата в качестве противоиона (таблица 9)

[0207] Свободный доксорубицин отражает определенную концентрацию неинкапсулированного лекарственного средства (в течение одной недели после изготовления (T0)) и при хранении липосомального материала при температуре 2-8°C. Из таблицы 10 видно, что содержание свободного доксорубицина в момент времени T0 находилось в диапазоне от 0,02 до 0,9%. Не наблюдалось значительного изменения концентрации свободного доксорубицина при хранении при температуре 2-8°C в течение по меньшей мере одного месяца (таблица 11).

[0208] Скорость высвобождения липосомального доксорубицина. Исследования высвобождения лекарственного средства проводили при температуре 25°С и 37°С.

[0209] При температуре 25°C все составы (например, с сульфатом, оксалатом, фосфатом, тартратом и цитратом) продемонстрировали сходные очень низкие скорости высвобождения (таблица 12) с разницей высвобождения при ΔpH7,4/5,0, близкой к нулю.

[0210] При температуре 37°С, когда в качестве противоионов использовали оксалат или тартрат, разница между высвобождением доксорубицина при рН 7,4 и рН 5,0 (разница высвобождения ΔpH7,4/5,0) была заметно выше по сравнению с другими противоионами (таблица 13 и фиг. 3).

[0211] Стоит отметить, что независимо от того, были ли использованы аммоний-оксалатная соль или щавелевая кислота (титрованная до рН 4,8-5,0 при помощи NH₄OH) для приготовления гидратирующих сред, размер частиц пустых липосом или загруженных доксорубицином липосом (таблицы 7-8), эффективность инкапсуляции доксорубицина (таблица 9) и профиль высвобождения (таблицы 13-14) были практически одинаковыми.

[0212] Скорость высвобождения при температуре 37°C и величина разности высвобождения ΔpH7,4/5,0, наблюдаемые в момент времени T0 (в течение одной недели после даты изготовления (MFD)), сохранялись при хранении при температуре 2-8°C в течение не менее примерно двух месяцев (таблица 14).

[0213] Низкие скорости высвобождения доксорубицина, наблюдаемые для всех испытанных противоионов при температуре 25°C (таблица 12), и резкое увеличение высвобождения доксорубицина при температуре 37°C, наблюдаемое с оксалатом или тартратом по сравнению с сульфатом, фосфатом и цитратом (таблица 13), свидетельствуют об уникальном физическом состоянии агрегатов доксорубицин-оксалат или доксорубицин-тартрат при температуре 37°С, которое может способствовать их растворению и, следовательно, высвобождению доксорубицина. Наблюдаемое различие в разности высвобождения ΔpH7,4/5,0 для указанных противоионов при температуре 25°С и 37°С, возможно, также указывает на более глубокие температурно-зависимые переходы в физическом состоянии доксорубицин-оксалатных или доксорубицин-тартратных интралипосомальных агрегатов по сравнению с доксорубицин-сульфатными или доксорубицин-фосфатными в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения.

[0214] В вариантах реализации настоящего изобретения доксорубицин образует агрегаты, когда инкапсулируется в липосомы, под действием градиента рН и противоионов - это наблюдение было подтверждено несколькими исследовательскими группами [1, 13, 15, 23-25]. Физико-химические свойства противоионов (например, оксалата, сульфата, фосфата, тартрата и цитрата), такие как размер, значения рКа, стереохимия, дипольный момент, поляризуемость и т. д., могут оказывать взаимное влияние на образование различных осажденных структур и, следовательно, контролировать высвобождение доксорубицин из липосом.

[0215] Андреас Фритце с коллегами (Andreas Fritze, et al.) [13] использовали криотрансмиссионную электронную микроскопию (C-TEM) для визуализации загруженных доксорубицином липосом, приготовленных в растворе 300 мМ (NH₄)₂HPO₄. Как показано на фиг. 4, захваченный и осажденный доксорубицин образует пучки, которые выглядят как линейные структуры и вызывают изменение формы липосом, что приводит к образованию характерной структуры «кофейных зерен». Было продемонстрировано, что высвобождение доксорубицина в буфер с pH 7,4 из липосом, содержащих пучки доксорубицина фосфата, составляло <2-3% в течение 1 часа и при температуре 25°C [13].

[0216] Ксингонг Ли с коллегами (Xingong Li, et al.) [15] исследовали физическое состояние доксорубицина (DOX) в растворе и внутри EPC/холестериновых липосом, которые были загружены за счет трансмембранного градиента pH. При помощи криогенную электронную микроскопию (крио-ЭМ) они отметили, что доксорубицин, загруженный до внутренних концентраций 200-300 мМ, в цитратсодержащих липосомах образовывал линейные, изогнутые и круглые пучки волокон без значительного взаимодействия/искажения мембраны везикулы [15] (фиг. 5). Также было показано, что высвобождение доксорубицина в буфер с pH 7,6 из липосом, содержащих волокна цитрата доксорубицина, было относительно медленным (~ 4% в течение 1 часа).

[0217] Агрегаты доксорубицина в присутствии сульфата обычно представляют собой жесткие линейные пучки волокон (расстояние между волокнами составляет примерно 27 A°) по сравнению с агрегатами доксорубицин-цитрат в присутствии цитрата, которые выглядят в основном линейными или изогнутыми (расстояние между волокнами составляет примерно 30-35A°) [1, 15, 23-25] (фиг. 6). Эти результаты позволяют предположить, что сульфат-анион, будучи меньше, чем цитрат-анион, может обеспечить более плотную упаковку, что приводит к снижению гибкости пучков волокон и, следовательно, к более низкой скорости высвобождения лекарственного средства из липосом.

[0218] Крио-ТЭМ-анализ доксорубицин-оксалатсодержащих липосом (лот № 647-2-157). Доксорубицин-оксалатсодержащие липосомы (лот № 647-2-157) были охарактеризованы с помощью криотрансмиссионной электронной микроскопии (крио-ТЭМ). При помощи анализа крио-ТЕМ были обнаружены отчетливо выраженные плотные липосомальные частицы сферической морфологии (фиг. 7А, 7B и 7C) с отчетливо выраженной двухслойной мембраной (толщиной 5-6 нм, фиг. 7С) и небольшую внутреннюю плотность липосом, что соответствует высокому (50:1) соотношению лекарственного средства к липиду. Также следует отметить, что содержание свободного (не инкапсулированного) доксорубицина, определенное методом ультрафильтрации, составляло ~ 0,3% (таблица 21).

[0219] Несмотря на то, что частицы выглядели плотно расположенными на подложке, растекание образца по сетке было относительно равномерным, кластеризации или скоплений частиц не наблюдалось. При большем увеличении можно легко различить мембранный бислой (фиг. 7B и 7C). Подавляющее большинство (97%) частиц является однослойными.

[0220] В вариантах реализации настоящего изобретения доксорубицин-оксалатные агрегаты, по-видимому, некристаллические (фиг. 7A-7C) и не образовывали плотно упакованных пучков, которые наблюдаются при использовании сульфата или фосфата в качестве противоиона (фиг. 4-6). Этот результат указывает на уникальное физическое состояние интралипосомальных доксорубицин-оксалатных агрегатов по сравнению с доксорубицин-сульфатными и доксорубицин-фосфатными агрегатами и хорошо согласуется с наблюдаемой разницей в профилях высвобождения лекарственного средства (фиг. 3, таблицы 13-14).

[0221] В целом полученные данные демонстрируют эффективную загрузку доксорубицина и образование стабильных липосомальных составов при использовании сульфата, оксалата, фосфата, тартрата и цитрата в качестве противоионов. Хотя все составы одинаково высвобождали доксорубицин при температуре 25°С, оксалат и тартрат демонстрировали желаемую разницу высвобождения ΔpH7,4/5,0 при определении скорости высвобождения доксорубицина при температуре 37°С. Эти данные указывают на то, что температурно-зависимый переход в физическом состоянии доксорубицин-оксалатных или доксорубицин-тартратных агрегатов может быть более обширным по сравнению с доксорубицин-сульфатными или доксорубицин-фосфатными агрегатами.

[0222] В вариантах реализации настоящего изобретения, вне связи с какой-либо теорией, хотя значения pKa противоионов определяют реакцию на изменение внешнего pH, pKa может быть важна не только для высвобождения липосомального доксорубицина на молекулярном уровне (в растворе), но и в сочетании с другими физико-химическими свойства противоионов (например, размер, стереохимия, дипольный момент, поляризуемость и т. д.) также важна для контроля интралипосомальной упаковки доксорубицина, физического состояния образующихся агрегатов и, следовательно, скорости их растворения.

[0223] Таким образом, было продемонстрировано влияние противоиона на оптимальное рН-зависимое высвобождение лекарственного средства, и проведенные исследования убедительно показывают, что оптимальными противоионами являются оксалат и тартрат по меньшей мере в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения.

[0224] В некоторых альтернативных вариантах реализации настоящего изобретения в качестве противоиона можно использовать цитрат.

Пример 3: Дальнейшая характеристика доксорубицин-оксалатсодержащих липосом. Различные соотношения липид/лекарственное средство.

Гидратирующая среда: 300 мМ оксалат аммония.

[0225] Липосомы получали при различных соотношениях липид/лекарственное средство (5:1-100:1) и различных концентрациях P188 (таблица 15). Конечные концентрации гидрохлорида доксорубицина, используемые для «бесконтактной» загрузки, составляли 0,5 или 1,0 мг/мл. «Бесконтактную» загрузку проводили при температуре 70°С.

Таблица 15. Состав композиции

Лот #	Количество твердых веществ, используемых в композициях, мас./мас., %	Соотношения
	PC	DMPC	FC	P 188	Доксорубицина гидрохлорид	Липид/лек. ср-во
647-1-175	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-1-174	66,05	16,51	11,56	4,95	0,88	100
647-2-13	63,94	15,98	11,19	7,99	0,85	100
647-2-48	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-121 A	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-157	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-159 B	68,89	17,22	12,06	0,00	1,84	50
647-2-99 A	61,72	15,43	10,80	7,71	4,34	20
647-2-99 B	54,61	13,65	9,56	6,83	15,35	5

[0226] Готовили грубую суспензию и обрабатывали микрофлюидизацией (MF) при давлении 10 KPSI (тысяч фунтов на квадратный дюйм) (соответствует ~ 68,9476 мПа). После микрофлюидизации в течение 9-15 минут размер частиц (Z-среднее) достигал ~ 60-65 нм. Образец собирали и подвергали стерилизующему фильтрованию в стерильную колбу Nalgene. Определяли размер частиц в фильтрованной наносуспензии (Таблица 16).

Таблица 16. Сводка параметров микрофлюидизации и параметров полученной эмульсии.

Лот #	MFD	Размер частиц Z средн., нм
647-1-175	15 июля 2015	62
647-1-174	15 июля 2015	62
647-2-13	08 октября 2015	63
647-2-48	20 января 2016	63
647-2-121 A	12 апреля 2016	60
647-2-157	24 мая 2016	65
647-2-159 B	02 июня 2016	65
647-2-99 A	22 марта 2016	64
647-2-99 B	23 марта 2016	61

[0227] Липосомы подвергали TFF с последующей «бесконтактной» загрузкой доксорубицином, затем проводили еще один цикл TFF с PBS с сахарозой. Концентрации гидрохлорида доксорубицина, используемые для «бесконтактной» загрузки, составляли 0,5 или 1,0 мг/мл.

[0228] Размер частиц липосом, загруженных доксорубицином, представлен в таблице 17.

Таблица 17. Размер частиц липосом, загруженных доксорубицином.

Лот #	Липид/лек. ср-во	Дата загрузки	Размер частиц Z средн., нм
647-1-175	50	21 июля 2015	66
647-1-174	100	22 июля 2015	66
647-2-13	100	09 октября 2015	70
647-2-48	50	21 января 2016	73
647-2-121 A	50	12 апреля 2016	68
647-2-157	50	24 мая 2016	73
647-2-159 B	50	02 июня 2016	67
647-2-99 A	20	22 марта 2016	81
647-2-99 B	5	23 марта 2016	80

[0229] Данные по стабильности частиц представлены в таблице 18.

Таблица 18. Размер частиц липосом, загруженных доксорубицином. Стабильность при температуре 2-8°C.

Лот #	Липид/лек. ср-во	Стабильность
Дней после T0	Размер частиц Z средн., нм
647-1-175	50	0	66
		41	67
113	67
647-1-174	100	0	66
		42	67
114	68
647-2-13	100	0	70
		34	71
114	72
647-2-48	50	0	73
82	74
647-2-121A	50	0	68
45	69
647-2-99 A	20	0	81
		7	81
65	83
647-2-99 B	5	0	80
		7	80
65	84

[0230] Определение доксорубицина в липосомальной суспензии. После загрузки доксорубицином липосомальную суспензию подвергали 5X TFF, чтобы в основном удалить свободный (не инкапсулированный) доксорубицин. Для определения общей концентрации доксорубицина в момент времени T0 (в течение одной недели с даты производства (MFD)) липосомы, промытые при помощи TFF, разводили в метаноле или IPA и проводили анализ ВЭЖХ. Содержание доксорубицина, процент извлечения (содержание доксорубицина в липосомальной суспензии относительно концентрации свободного основания доксорубицина, применяемого для «бесконтактной» загрузки) и эффективность инкапсуляции (%) представлены в таблице 19. Эффективность инкапсуляции (%) представляет собой разницу между извлечением доксорубицина (%) и свободным доксорубицином (%).

Таблица 19. Общее содержание доксорубицина и эффективность инкапсуляции.

Лот #	Липид/лек. ср-во	Свободное основание доксорубицина, исп. для загрузки, мкг/мл	Анализ ВЭЖХ	Инкапсулированный доксорубицин, % [Извлечение, %] - [Свободн., %]
Содержание доксорубицина (липосомальная суспензия) мкг/мл	Извлечение, %
647-1-175	50	936	839	90	90
647-1-174	100	468	436	93	93
647-2-13	100	468	461	98	98
647-2-48	50	936	899	95	95
647-2-121A	50	936	841	90	90
647-2-157	50	936	861	92	92
647-2-159 B	50	936	920	98	98
647-2-99 A	20	936	526	56	52
647-2-99 B	5	936	384	41	31

[0231] Стабильность липосомального доксорубицина оценивали при хранении при температуре 2-8°С. Процент извлечения во время хранения относительно начального содержания доксорубицина, определенного в момент времени T0, приведен в таблице 20.

Таблица 20. Стабильность инкапсулированного доксорубицина. Условия хранения: 2-8°C.

Лот #	Липид/лек. ср-во	Дней после T0	Содержание, мкг/м	Извлечение, %
647-1-175	50	41	861	102
647-1-174	100	42	452	103
647-2-13	100	118	461	100
647-2-48	50	84	812	91
647-2-121A	50	45	799	95

[0232] Количество свободного доксорубицина определяли в течение одной недели после изготовления (таблица 21).

Таблица 21. Содержание свободного доксорубицина.

Лот #	Липид/лек. ср-во	% от общего
647-1-175	50	0,38
647-1-174	100	0,20
647-2-13	100	0,35
647-2-48	50	0,41
647-2-121A	50	0,13
647-2-157	50	0,29
647-2-159 B	50	0,02
647-2-99 A	20	4
647-2-99 B	5	10

[0233] Изменение содержания свободного доксорубицина при хранении при температуре 2-8 °С представлено в таблице 22.

Таблица 22. Изменение содержания свободного доксорубицина при хранении при температуре 2-8°С.

Лот #	Липид/лек. ср-во	Дней после T0	% от общего
647-1-175	50	0	0,38
		41	0,49
114	0,74
647-1-174	100	0	0,20
		41	0,34
114	0,64
647-2-13	100	0	0,35
		38	0,5
124	0,5
647-2-48	50	0	0,41
82	0,9
647-2-121A	50	0	0,13
45	0,69
647-2-99 A	20	0	4
7	5
647-2-99 B	5	0	10
7	15

[0234] Изучение высвобождения липосомального доксорубицина проводили при температуре 37°C в течение одной недели после изготовления (таблица 23). Для каждого образца высвобождение доксорубицина определяли через 2, 4 и 8 часов.

Таблица 23. Скорость высвобождения доксорубицина определяли в момент времени T0 (в течение одной недели после изготовления).

Лот #	Липид/лек. ср-во	pH 5, высвобождение, %	pH 7,4, высвобождение, %
2 часа	4 часа	8 часов	2 часа	4 часа	8 часов
647-1-175	50	55	65	81	2	1	5
647-1-174	100	38	57	81	2	3	7
647-2-13	100	ND*	ND*	ND*	ND*	ND*	ND*
647-2-48	50	50	56	75	0	0	0
647-2-121 A	50	47	55	73	2	2	5
647-2-157	50	43	56	73	0	3	5
647-2-159 B	50	50	65	78	2	7	7
647-2-99 A	20	22	35	53	14	27	35
647-2-99 B	5	27	43	64	12	20	42

ND* - не выполнено

[0235] Скорость высвобождения липосомального доксорубицина (при температуре 37°C) также контролировали во время дальнейшего хранения образцов при температуре 2-8°С (таблица 23a).

Таблица 23a. Изменение скорости высвобождения доксорубицина при хранении при температуре 2-8°С.

Лот #	Липид/лек. ср-во	Дней после T0	pH 5, высвобождение, %	pH 7,4, высвобождение, %
2 часа	4 часа	8 часов	2 часа	4 часа	8 часов
647-1-175	50	0	55	65	81	2	1	5
		41	66	75	96	4	5	7
114	65	72	84	1	3	3
647-1-174	100	0	38	57	81	2	3	7
		41	42	60	75	3	5	10
114	28	45	62	0	2	5
647-2-13	100	0	ND*	ND*	ND*	ND*	ND*	ND*
		38	29	34	54	0	0	3
119	40	42	71	4	7	8
647-2-48	50	0	50	56	75	0	0	0
82	40	54	74	0	0	2
647-2-121A	50	0	47	55	73	2	2	5
45	41	56	72	4	6	8
647-2-99 A	20	0	22	35	53	14	27	35
647-2-99 B	5	0	27	43	64	12	20	42

ND* - не выполнено

[0236] Размер частиц. Из таблиц 15 и 16 видно, что микрофлюидизация всех указанных липосомальных композиций приводила к получению частиц сходных размеров. Загрузка доксорубицином приводила только к незначительному увеличению размера частиц в композициях с соотношениями липид/лекарственное средство от 50:1 до 100:1 (таблица 17), тогда как заметное увеличение наблюдалось для композиций с соотношениями липид/лекарственное средство 20:1 и 5:1 (таблица 17). Размер частиц липосом, загруженных доксорубицином, с соотношениями липид/лекарственное средство от 50:1 до 100:1 остается стабильным в течение по меньшей мере четырех месяцев (таблица 18), тогда как размер частиц липосом с соотношениями липид/лекарственное средство 20:1 и 5:1 был нестабильным и показал значительное увеличение.

[0237] Эффективность инкапсуляции доксорубицина. Эффективность инкапсуляции доксорубицина в липосомы с соотношениями липид/лекарственное средство от 50:1 до 100:1 варьировалась от 90 до 98% (таблица 19), и при хранении при температуре 2-8°C не наблюдалось значительного изменения содержания липосомального доксорубицина (Таблица 20). Напротив, для липосом с соотношениями липид/лекарственное средство 20:1 и 5:1 наблюдалась существенно более низкая эффективность инкапсуляции (31-52%) (таблица 19).

[0238] Свободный (не инкапсулированный) доксорубицин. Свободный доксорубицин отражает концентрацию лекарственного средства, не инкапсулированного в липосомы во время стадии загрузки или вытекшего из липосомы во время хранения. Из таблицы 21 видно, что содержание свободного доксорубицина в композициях с соотношениями липид/лекарственное средство 50:1 и 100:1 находилось в диапазоне от 0,2 до 0,41%. Не наблюдалось значительного изменения концентрации свободного доксорубицина при хранении при температуре 2-8°C в течение до ~4 месяцев (таблица 22).

[0239] Содержание свободного доксорубицина, определенное в композициях с соотношениями липид/лекарственное средство 20:1 и 5:1, было заметно выше (таблица 21) и заметно увеличилось после 7 дней хранения при температуре 2-8°C (таблица 22). Эти данные указывают на явную утечку доксорубицина из липосом, полученных при соотношении липид/лекарственное средство ниже 50:1 и хранящихся при температуре 2-8°С и рН 7,4.

[0240] Скорость высвобождения липосомального доксорубицина. Из таблицы 23 видно, что для составов с соотношениями липид/лекарственное средство 50:1 и 100:1 скорость высвобождения доксорубицина при рН 5 была заметно выше, чем при рН 7,4 (таблица 23 и фиг. 3). Разница высвобождения ΔpH7,4/5,0, наблюдаемая в момент времени T0 (в течение одной недели после изготовления (MFD)), сохранялась после хранения при температуре 2-8°C в течение до 114 дней (таблица 23a).

[0241] Напротив, композиции с более низким соотношением липид/лекарственное средство (20:1 и 5:1) продемонстрировали низкую разницу высвобождения ΔpH7,4/5,0 (таблица 23 и фиг. 8) и заметную утечку доксорубицина при pH 7,4 (таблицы 22-23a).

[0242] В вариантах реализации настоящего изобретения, без связи с какой-либо теорией, более низкие соотношения липид/лекарственное средство могут приводить к увеличению поверхностного натяжения и нарушению целостности липидного слоя, что при разведении может привести к повышенной не зависящей от pH утечке липосомального содержимого в растворяющую среду из-за градиента концентрации и может сместить высвобождение лекарственного средства, обусловленное рН. Напротив, более высокие соотношения липид/лекарственное средство могут привести к образованию липосом со сниженным поверхностным натяжением и липидным слоем (липидными слоями) с большей целостностью, что может предотвратить «нецелевую» утечку интралипосомального материала в растворяющую среду и позволяет высвобождать лекарственное средство только в ответ на изменение рН.

[0243] Таким образом, было продемонстрировано влияние соотношения липид/лекарственное средство как на рН-зависимое высвобождение лекарственного средства, так и на стабильность характеристик липосом. Проведенные исследования позволяют предполагать, что в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения оптимальные соотношения липид/лекарственное средство находятся в диапазоне от 20:1 до 50:1. Другие соотношения, которые можно использовать, включают от 20:1 до 100:1 в некоторых других вариантах реализации настоящего изобретения.

[0244] Следует также отметить, что добавление P188 в липосомальную композицию не оказало какого-либо значительного влияния на размер частиц (таблицы 15-17), эффективность инкапсуляции доксорубицина (таблицы 19 и 21) и профиль высвобождения доксорубицина (таблица 23) по сравнению с липосомальным составом, приготовленным без Р188 (лот № 647-2-159 В). Тем не менее, был сделан выбор в пользу применения P188 в липосомальных композициях из-за его возможного полезного влияния на биологическую эффективность липосом, загруженных лекарственным средством [10-11, 16-19].

Пример 4: Анализ цитотоксичности на основе клеток in vitro.

[0245] Линию В-клеточной лимфомы человека Дауди, которую обычно используют для оценки лекарственных средств для лечения B-клеточных лимфом [21, 22], использовали для проверки цитотоксичности липосом, загруженных оксалатом доксорубицина, в отношении B-клеток по сравнению со свободным доксорубицином и Doxil®. Из таблицы 24 видно, что три разные партии липосом, загруженных оксалатом доксорубицина, демонстрировали клеточную цитотоксичность, аналогичную свободному доксорубицину, и были примерно в 50-70 раз сильнее, чем Doxil® (лот № L01DB01); такая разница позволяет прогнозировать повышенную эффективность in vivo.

[0246] Для оценки цитотоксичности лекарственных средств также применяли клетки Hela - линию клеток человека, полученную из рака шейки матки. Из таблицы 24 видно, что липосомы, загруженные оксалатом доксорубицина, демонстрировали клеточную цитотоксичность в 2-3 раза ниже, чем свободный доксорубицин, но в 4-6 раз выше, чем Doxil® (таблица 24).

Таблица 24. Значения CC₅₀ (мкМ), полученные для доксорубицина и композиций липосомального доксорубицина.

Лот #	Название	Липид/лек. ср-во	Хранение T°C	Дауди, CC50, мкм	Hela, CC50, мкм
7000AO02113	Доксорубицина гидрохлорид	N/A	N/A	0,4	7
L01DB01	Doxil® (липосомальный сульфат доксорубицина)	8	2-8	29	100
647-1-175	Липосомальный оксалат доксорубицина	50	2-8	0,4	26
647-1-174	Липосомальный оксалат доксорубицина	100	2-8	0,4	20
647-2-13	Липосомальный оксалат доксорубицина	100	2-8	0,2	15

[0247] Полученные данные по цитотоксичности продемонстрировали заметно повышенную активность доксорубицин-оксалатсодержащих липосом по сравнению с Doxil®, что хорошо согласуется с заметно большей разницей высвобождения ΔpH7,4/5,0 по сравнению с липосомальным доксорубицин сульфатом.

Пример 5: Исследование in vivo

[0248] Эффективность липосом, загруженных оксалатом доксорубицина (лот № 647-2-13), сравнивали с Doxil® (лот № FAZSR00) на стандартной модели лимфомы на мышах Beige (линия - CB17.Cg-Prkdc^scidLyst^bg-J /Crl). Как показано на временной шкале на фиг. 2, клетки В-лимфомы (5×10⁶) инъецировали внутривенно в день 0 и давали им возможность распространиться в течение 24 часов, а затем в дни 1, 2 и 3 вводили мышам не содержащую лекарственного средства липидную композицию (плацебо) или липосомы, содержащие оксалат доксорубицина (3 мг доксорубицина на кг) или Doxil® (3 мг доксорубицина на кг).

[0249] У животных, получавших плацебо (липосомы, не содержащие доксорубицина), среднее время выживания (MST) составляло 21 день, тогда как липосомы, загруженные оксалатом доксорубицина, увеличили MTS до 33 дней (фиг. 5). Напротив, для липосом Doxil® MST составлял 15 дней (фиг. 5). Меньшее значение MST, наблюдаемое для мышей, получавших лечение Doxil®, по сравнению с мышами, получавшими плацебо (фиг. 5), указывает на потенциальную токсичность Doxil®, тогда как в случае липосом, содержащих оксалат доксорубицина, такой токсичности не наблюдалось. Группа необработанных мышей (без инъекций какого-либо материала) показала выживаемость, идентичную плацебо (не показано на графике). На 11 день в группе животных, получавших доксорубицин-оксалатные липосомы, наблюдали усредненную максимальную потерю веса примерно 8%, при этом полное выздоровление наступало на 17 день, тогда как у мышей, получавших Doxil®, на 14 день наблюдалась потеря веса примерно 30%, что приводило к смерти 4 из 8 животных. Высокая токсичность также наблюдалась в группе мышей, получавших свободный доксорубицин (смертность 50% на 13-й день), хотя выжившие продемонстрировали самое длинное MST, что подтверждает модель. Более низкая токсичность, наблюдаемая для доксорубицин-оксалатсодержащих липосом, может быть отчасти связана с их более быстрым клиренсом. Более низкая токсичность и более высокая эффективность тестируемых липосом согласно настоящему изобретению по сравнению с Doxil® является весьма желательным и обнадеживающим результатом. Таким образом, в соответствии с тем же протоколом эксперимента лечение липосомами, содержащими оксалат доксорубицина, не показало очевидной токсичности и значительного улучшения показателей выживаемости по сравнению с контролем плацебо, тогда как лечение доксилом (Doxil®) в тех же дозах и в том же режиме продемонстрировало заметную токсичность и не показало сколько-нибудь значительного улучшения MST по сравнению с плацебо. Более высокая эффективность доксорубицин-оксалатных липосом соответствовала оптимизированной разнице высвобождения ΔpH и в целом приводила к повышению безопасности и эффективности по сравнению с липосомами Doxil® (доксорубицин-сульфат).

[0250] Таким образом, в соответствии с тем же протоколом эксперимента лечение липосомами, содержащими оксалат доксорубицина, не показало очевидной токсичности и значительного улучшения показателей выживаемости по сравнению с контролем плацебо, тогда как лечение доксилом (Doxil®) в тех же дозах и в том же режиме продемонстрировало заметную токсичность и не показало сколько-нибудь значительного улучшения MST по сравнению с плацебо (фиг. 9). Более высокая эффективность доксорубицин-оксалатсодержащих липосом согласуется с оптимизированной разницей высвобождения ΔpH7,4/5,0 и в целом приводит к повышению безопасности и эффективности по сравнению с липосомами Doxil® (доксорубицин-сульфат).

Пример 6: Дальнейшая характеристика доксорубицин-тартратсодержащих липосом: Различные соотношения липид/лекарственное средство.

[0251] Получение и дальнейшая характеристика доксорубицин-тартратсодержащих липосом. Липосомы были получены при различных соотношениях липид/лекарственное средство (5:1, что может быть обозначено как 5 к 1 или 5/1-100:1, что может быть обозначено как 100 к 1 или 100/1) (таблица 25). Концентрации доксорубицина гидрохлорида, используемые для «бесконтактной» загрузки, составляли 0,5 или 1,0 мг/мл (т.е. 0,468 и 0,936 мг свободного основания доксорубицина на мл). «Бесконтактную» загрузку выполняли с помощью доксорубицина гидрохлорида при температуре 70°С. Винную кислоту сначала титровали гидроксидом аммония до рН 4,8-5,0, а затем использовали в качестве гидратирующей среды.

Таблица 25. Состав композиции

Лот #	Количество твердых веществ, используемых в композициях, мас./мас., %	Соотношения
	PC	DMPC	FC	P 188	Доксорубицина гидрохлорид	Липид/лек. ср-во
647-2-186 B	66,0,5	16,51	11,56	4,95	0,88	100
647-2-151 B	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-178 B	63,68	15,92	11,14	4,78	4,48	20
647-2-178 D	56,15	14,04	9,83	4,21	15,78	5

[0252] Готовили грубую суспензию и обрабатывали микрофлюидизацией (MF) при давлении 10 KPSI (тысяч фунтов на квадратный дюйм) (соответствует ~ 68,9476 мПа). После микрофлюидизации в течение 9-15 минут размер частиц (Z-среднее) достигал ~ 60-65 нм. Образец собирали и подвергали стерилизующему фильтрованию в стерильную колбу Nalgene. Определяли размер частиц в фильтрованной наносуспензии (Таблица 25a).

Таблица 25a. Сводка параметров микрофлюидизации и параметров полученной эмульсии.

Лот #	MFD	Размер частиц Z средн., нм
647-2-186 B	18 июля 2016	62
647-2-151 B	05 мая 2016	65
647-2-178 B	11 июля 2016	61
647-2-178 D	11 июля 2016	61

[0253] Липосомы подвергали TFF с последующей «бесконтактной» загрузкой доксорубицином, затем проводили еще один цикл TFF с PBS с сахарозой. Концентрации гидрохлорида доксорубицина, используемые для «бесконтактной» загрузки, составляли 0,5 или 1,0 мг/мл.

[0254] Размер частиц липосом, загруженных доксорубицином, представлен в таблице 25b.

Таблица 25b. Размер частиц липосом, загруженных доксорубицином.

Лот #	Липид/ лек.ср-во	Дата загрузки	Размер частиц Z средн., нм
647-2-186 B	100	19 июля 2016	64
647-2-151 B	50	18 мая 2016	68
647-2-178 B	20	11 июля 2016	67
647-2-178 D	5	11 июля 2016	66

[0255] Определение доксорубицина в липосомальной суспензии. После загрузки доксорубицином липосомальную суспензию подвергали 5X TFF, чтобы в основном удалить свободный (не инкапсулированный) доксорубицин. Для определения общей концентрации доксорубицина в момент времени T0 (в течение одной недели с даты производства (MFD)) липосомы, промытые при помощи TFF, разводили в метаноле или IPA и проводили анализ ВЭЖХ. Содержание доксорубицина, процент извлечения (содержание доксорубицина в липосомальной суспензии относительно концентрации свободного основания доксорубицина, применяемого для «бесконтактной» загрузки) и эффективность инкапсуляции (%) представлены в таблице 25с. Эффективность инкапсуляции (%) представляет собой разницу между извлечением доксорубицина (%) и свободным доксорубицином (%).

Таблица 25c. Общее содержание доксорубицина и эффективность инкапсуляции.

Лот #	Липид/лек. ср-во	Свободное основание доксорубицина, исп. для загрузки, мкг/мл	Анализ ВЭЖХ	Инкапсулированный доксорубицин, % [Извлечение, %] - [Свободн., %]
Содержание доксорубицина (липосомальная суспензия) мкг/мл	Извлечение, %
647-2-186 B	100	468	354	76	76
647-2-151 B	50	936	814	87	87
647-2-178 B	20	936	897	96	96
647-2-178 D	5	936	413	44	41

[0256] Количество свободного (не инкапсулированного) доксорубицина определяли в течение одной недели после изготовления (таблица 25d).

Таблица 25d. Содержание свободного доксорубицина.

Лот #	Липид/лек. ср-во	% от общего
647-2-186 B	100	0,01
647-2-151 B	50	0,03
647-2-178 B	20	0,01
647-2-178 D	5	3,20

[0257] Изучение высвобождения липосомального доксорубицина проводили при температуре 37°C в течение одной недели после изготовления (таблица 25е). Для каждого образца высвобождение доксорубицина определяли через 2, 4 и 8 часов.

Таблица 25e. Скорость высвобождения доксорубицина определяли в момент времени T0 (в течение одной недели после изготовления).

Лот #	Липид/лек. ср-во	pH 5, высвобождение, %	pH 7,4, высвобождение, %
2 часа	4 часа	8 часов	2 часа	4 часа	8 часов
647-2-186 B	100	18	35	56	2	1	0
647-2-151 B	50	14	27	39	0	1	1
647-2-178 B	20	9	15	21	1	2	3
647-2-178 D	5	17	23	27	1	4	5

[0258] Размер частиц. Из таблиц 25 и 25a видно, что микрофлюидизация всех указанных липосомальных композиций приводила к получению частиц сходных размеров. Загрузка доксорубицином приводила к незначительному увеличению размера частиц (таблица 25b).

[0259] Эффективность инкапсуляции доксорубицина. Эффективность инкапсуляции доксорубицина в липосомы с соотношениями липид/лекарственное средство от 5:1 до 100:1 варьировалась от 76 до 96% (таблица 25c). Напротив, для липосом с соотношением липид/лекарственное средство 5:1 наблюдалась существенно более низкая эффективность инкапсуляции (41%) (таблица 25с).

[0260] Свободный (не инкапсулированный) доксорубицин. Свободный доксорубицин отражает концентрацию лекарственного средства, который не был инкапсулирован в липосомы во время стадии загрузки или вытек из липосомы во время хранения. Из таблицы 25d видно, что содержание свободного доксорубицина в композициях с соотношениями липид/лекарственное средство от 20:1 до 100:1 находилось в диапазоне от 0,01 до 0,03%, тогда как повышенные уровни свободного доксорубицина (3,2%) наблюдались при соотношении липид/лекарственное средство 5:1. Эти данные согласуются с результатами, полученными для оксалатсодержащих липосом (таблица 21), и указывают на явную утечку доксорубицина при нейтральном pH из липосом, полученных при соотношении липид/лекарственное средство ниже 20:1.

[0261] Скорость высвобождения липосомального доксорубицина. Хотя скорость высвобождения доксорубицина при рН 5 была выше, чем при рН 7,4, для всех составов (таблица 25е), для составов с соотношениями липид/лекарственное средство ниже 50:1 наблюдалась дополнительная утечка при нейтральном рН. Однако стоит отметить, что утечка доксорубицина при рН 7,4 была заметно меньше для тартратсодержащих липосом по сравнению с оксалатсодержащими липосомами (Таблица 21, 23, фиг. 8 и 10).

[0262] Таким образом, было продемонстрировано влияние соотношения липид/лекарственное средство для противоионов оксалат и тартрат. Проведенные исследования позволяют предполагать, что в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения оптимальные соотношения липид/лекарственное средство находятся в диапазоне от 20:1 до 50:1. Другие соотношения, которые можно использовать, включают от 20:1 до 100:1 в некоторых других вариантах реализации настоящего изобретения.

Пример 7: Холодная загрузка доксорубицина в оксалат- и тартратсодержащие липосомы: Различные соотношения липид/лекарственное средство.

[0263] Холодную загрузку доксорубицина в липосомы выполняли следующим образом: физиологический раствор доксорубицина гидрохлорида добавляли к липосомальной наносуспензии при комнатной температуре до конечной концентрации 0,5 или 1 мг/мл (т.е. 0,468 и 0,936 мг свободного основания доксорубицина на мл), осторожно переворачивали (2-3 раза) и инкубировали при комнатной температуре в течение 10-20 минут. После инкубации при комнатной температуре в течение 10-20 минут указанную смесь: а) подвергли еще одному циклу TFF 5Х с PBS pH 7,4, содержащим 6% сахарозы, и/или b) помещали в холодильник при температуре 2-8 °С на 16 часов, а затем проводили другой цикл TFF 5X с PBS pH 7,4, содержащим 6% сахарозы. Не было замечено ощутимых различий между профилями высвобождением доксорубицина из липосом, загруженных при комнатной температуре, или при комнатной температуре с последующей инкубацией при температуре 2-8°С в течение ночи. Данные для комнатной температуры с последующей инкубацией при температуре 2-8°С в течение ночи не приведены.

[0264] Состав композиции приведен в таблице 26.

Таблица 26. Состав композиции

Лот #	Противоион	Количество твердых веществ, используемых в композициях, мас./мас., %	Соотношения
PC	DMPC	FC	P 188	Доксорубицина гидрохлорид	Липид/лек. ср-во
647-2-181 A	Оксалат	66,0,5	16,51	11,56	4,95	0,88	100
647-2-163 B	Оксалат	65,57	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-185 A	Оксалат	63,68	15,92	11,14	4,78	4,48	20
647-2-185 C	Оксалат	56,15	14,04	9,83	4,21	15,78	5
647-2-186 A	Тартрат	66,0,5	16,51	11,56	4,95	0,88	100
647-2-170 B	Тартрат	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-178 A	Тартрат	63,68	15,92	11,14	4,78	4,48	20
647-2-178 C	Тартрат	56,15	14,04	9,83	4,21	15,78	5

[0265] Готовили грубую суспензию и обрабатывали микрофлюидизацией (MF) при давлении 10 KPSI (тысяч фунтов на квадратный дюйм) (соответствует ~ 68,9476 мПа). После микрофлюидизации в течение 9-15 минут размер частиц (Z-среднее) достигал ~ 60-66 нм. Образец собирали и подвергали стерилизующему фильтрованию в стерильную колбу Nalgene. Определяли размер частиц в фильтрованной наносуспензии (Таблица 26a).

Таблица 26a. Сводка параметров микрофлюидизации и параметров полученной эмульсии.

Лот #	Противоион	MFD	Липид/лек. ср-во	Размер частиц Z средн., нм
647-2-181 A	Оксалат	24 мая 2016	100	66
647-2-163 B	Оксалат	24 мая 2016	50	66
647-2-185 A	Оксалат	19 июля 2016	20	62
647-2-185 C	Оксалат	19 июля 2016	5	63
647-2-186 A	Тартрат	19 июля 2016	100	62
647-2-170 B	Тартрат	23 июня 2016	50	63
647-2-178 A	Тартрат	11 июля 2016	20	61
647-2-178 C	Тартрат	11 июля 2016	5	61

[0266] Липосомы подвергали TFF с последующей «бесконтактной» загрузкой доксорубицином, затем проводили еще один цикл TFF с PBS с сахарозой. Размер частиц липосом, загруженных доксорубицином, представлен в таблице 26b.

Таблица 26b. Размер частиц липосом, загруженных доксорубицином.

Лот #	Противоион	Дата загрузки	Липид/лек. ср-во	Размер частиц Z средн., нм
647-2-181 A	Оксалат	14 июля 2016	100	67
647-2-163 B	Оксалат	10 июня 2016	50	67
647-2-185 A	Оксалат	19 июля 2016	20	62
647-2-185 C	Оксалат	19 июля 2016	5	62
647-2-186 A	Тартрат	19 июля 2016	100	62
647-2-170 B	Тартрат	23 июня 2016	50	63
647-2-178 A	Тартрат	11 июля 2016	20	60
647-2-178 C	Тартрат	11 июля 2016	5	65

[0267] Определение доксорубицина в липосомальной суспензии. После загрузки доксорубицином липосомальную суспензию подвергали 5X TFF, чтобы в основном удалить свободный (не инкапсулированный) доксорубицин. Для определения общей концентрации доксорубицина в момент времени T0 (в течение одной недели с даты производства (MFD)) липосомы, промытые при помощи TFF, разводили в метаноле или IPA и проводили анализ ВЭЖХ. Содержание доксорубицина, процент извлечения (содержание доксорубицина в липосомальной суспензии относительно концентрации свободного основания доксорубицина, применяемого для «бесконтактной» загрузки) и эффективность инкапсуляции (%) представлены в таблице 26с. Эффективность инкапсуляции (%) представляет собой разницу между извлечением доксорубицина (%) и свободным доксорубицином (%).

Таблица 26c. Общее содержание доксорубицина и эффективность инкапсуляции.

Лот #	Противоион	Липид/ лек. ср-во	Свободное основание доксорубицина, исп. для загрузки, мкг/мл	Анализ ВЭЖХ	Инкапсулированный доксорубицин, % [Извлечение, %] - [Свободн., %]
Содержание доксорубицина (липосомальная суспензия) мкг/мл	Извлечение, %
647-2-181 A	Оксалат	100	468	425	91	91
647-2-163 B	Оксалат	50	936	909	97	97
647-2-185 A	Оксалат	20	936	892	95	95
647-2-185 C	Оксалат	5	936	252	27	22
647-2-186 A	Тартрат	100	468	388	83	83
647-2-170 B	Тартрат	50	936	850	91	91
647-2-178 A	Тартрат	20	936	850	91	91
647-2-178 C	Тартрат	5	936	645	69	67

[0268] Количество свободного доксорубицина определяли в течение одной недели после изготовления (таблица 26d).

Таблица 26d. Содержание свободного доксорубицина.

Лот #	Противоион	Липид/лек. ср-во	% от общего
647-2-181 A	Оксалат	100	0,07
647-2-163 B	Оксалат	50	0,08
647-2-185 A	Оксалат	20	0,01
647-2-185 C	Оксалат	5	4,96
647-2-186 A	Тартрат	100	0,01
647-2-170 B	Тартрат	50	0,04
647-2-178 A	Тартрат	20	0,01
647-2-178 C	Тартрат	5	2,51

[0269] Изучение высвобождения липосомального доксорубицина проводили при температуре 37°C в течение одной недели после изготовления (таблица 26е). Для каждого образца высвобождение доксорубицина определяли через 2, 4 и 8 часов.

Таблица 26e. Скорость высвобождения доксорубицина, определенная при температуре 37°C.

Лот #	Противоион	Липид/лек. ср-во	pH 5, высвобождение, %	pH 7,4, высвобождение, %
2 часа	4 часа	8 часов	2 часа	4 часа	8 часов
647-2-181 A	Оксалат	100	93	100	100	0	0	0
647-2-163 B	Оксалат	50	92	100	100	0	0	0
647-2-185 A	Оксалат	20	51	66	84	3	8	4
647-2-185 C	Оксалат	5	40	49	60	3	8	11
647-2-186 A	Тартрат	100	56	72	81	0	0	0
647-2-170 B	Тартрат	50	63	89	100	0	0	0
647-2-178 A	Тартрат	20	20	32	42	0	1	2
647-2-178 C	Тартрат	5	13	18	24	0	2	4

[0270] Размер частиц. Из таблиц 26 и 26a видно, что микрофлюидизация всех указанных липосомальных композиций приводила к получению частиц сходных размеров. Загрузка доксорубицином приводила к незначительному увеличению размера частиц в некоторых составах.

[0271] Эффективность инкапсуляции доксорубицина. Эффективность инкапсуляции доксорубицина в оксалатсодержащие липосомы с соотношениями липид/лекарственное средство от 20:1 до 100:1 варьировалась от 91 до 97% (таблица 26c). Напротив, для липосом с соотношением липид/лекарственное средство 5:1 наблюдалась существенно более низкая эффективность инкапсуляции (22%) (таблица 26с).

[0272] Когда в качестве противоиона использовали тартрат, эффективность инкапсуляции доксорубицина в липосомы с соотношениями липид/лекарственное средство от 20:1 до 100:1 варьировалась от 83 до 91% (таблица 26c), тогда как для липосом с соотношением липид/лекарственное средство 5:1 наблюдалась более низкая эффективность инкапсуляции (67%) (таблица 26с).

[0273] Свободный (не инкапсулированный) доксорубицин. Свободный доксорубицин отражает концентрацию лекарственного средства, не инкапсулированного в липосомы во время стадии загрузки или вытекшего из липосомы во время хранения. Из таблицы 26d видно, что содержание свободного доксорубицина в оксалатсодержащих липосомах с соотношениями липид/лекарственное средство 20:1 и 100:1 находилось в диапазоне от 0,01 до 0,08%. Содержание свободного доксорубицина, определенное в композициях с соотношением липид/лекарственное средство 5:1, составило 4,96% (таблица 26d).

[0274] Когда в качестве противоиона использовали тартрат, содержание свободного доксорубицина для липосом с соотношениями липид/лекарственное средство от 20:1 до 100:1 варьировалось от 0,01 до 0,04% (таблица 26d), тогда как для липосом с соотношением липид/лекарственное средство 5:1 наблюдалась более низкая эффективность инкапсуляции и более высокое содержание свободного доксорубицина (2,51%) (таблица 26d).

Скорость высвобождения липосомального доксорубицина.

[0275] Влияние соотношения липид/лекарственное средство. Из таблицы 26e видно, что для составов с соотношениями липид/лекарственное средство 50:1 и 100:1 для обоих противоионов высвобождение доксорубицина при pH 5 было значительно выше, чем при pH 7,4 (таблица 26e, фиг. 11- 12). Более того, утечка доксорубицина при рН 7,4 была полностью подавлена (таблица 26e, фиг. 11-12).

[0276] При pH 5 высвобождение доксорубицина из оксалатсодержащих липосом с холодной загрузкой достигало ~100% в момент времени 2 часа, что в два раза превышало значения для липосом, загруженных при 70°C (фиг. 13).

[0277] При pH 5 высвобождение доксорубицина из тартратсодержащих липосом с холодной загрузкой достигало ~90-100% в момент времени 4 часа, что в три раза превышало значения для липосом, загруженных при 70°C (фиг. 14).

[0278] Неожиданно то, что, когда в качестве противоионов использовались оксалат и/или тартрат, за счет холодной загрузки (например, смешивание при комнатной температуре) дополнительно улучшалась (максимально увеличивалась) разница высвобождения ΔpH 7,4/5,0 по сравнению с липосомами, загруженными при температуре 70°C: высвобождение лекарственного средства при pH 5 заметно увеличивалось, а при рН 7,4 подавлялось (таблица 26e, фиг. 13 и фиг. 14). При кислотном pH высвобождение доксорубицина из оксалатсодержащих липосом с холодной загрузкой достигало ~100% в момент времени 2 часа, что в два раза превышало значения для липосом, загруженных при 70°C (фиг. 13). Высвобождение доксорубицина из тартратсодержащих липосом с холодной загрузкой достигало ~90% в момент времени 4 часа (фиг. 14), что в три раза превышало значения для липосом, загруженных при 70°C.

[0279] Интересно то, что доксорубицин-цитратсодержащие липосомы демонстрировали низкую скорость высвобождения при рН 5, хотя разница высвобождения ΔpH 7,4/5,0 имела приемлемые значения из-за чрезвычайно низкого высвобождения при рН 7,4 (таблица 13 и фиг. 3).

[0280] Напротив, составы с соотношениями липид/лекарственное средство ниже 5:1 демонстрировали низкую разницу высвобождения ΔpH7,4/5,0 из-за более низкого высвобождения при pH 5,0 и утечки доксорубицина при pH 7,4 (таблица 26e и фиг. 11-12). Однако следует отметить, что тартратсодержащие липосомы при соотношении липид/лекарственное средство ниже 50:1 продемонстрировали более сильное подавление утечки доксорубицина при нейтральном рН по сравнению с оксалатными липосомами (таблица 26e и фиг. 11-12).

[0281] Таким образом, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения соотношение липид/лекарственное средство может играть важную роль для обоих противоионов: оксалата и тартрата. Проведенные исследования позволяют предполагать, что в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения оптимальные соотношения липид/лекарственное средство могут находиться в диапазоне от 20:1 до 50:1 по меньшей мере для некоторых вариантов реализации. Другие соотношения, которые можно использовать, включают от 10:1 до 100:1 в некоторых других вариантах реализации настоящего изобретения.

[0282] Также было продемонстрировано, что в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения холодная загрузка доксорубицином максимизировала разницу высвобождения ΔpH7,4/5,0, достигаемую при использовании оксалата и тартрата в качестве противоионов и при соотношении липид/лекарственное средство 50:1 и 100:1. Другие температуры, которые можно использовать для «бесконтактной» загрузки доксорубицина в оксалат и тартрат, включают температуры от 2-8°C до 70°C в некоторых других вариантах реализации настоящего изобретения.

Пример 8.1: Холодная загрузка лиофилизированного и восстановленного доксорубицина в оксалат- и/или тартратсодержащие липосомы.

[0283] Лиофилизация. Доксорубицин-гидрохлорид растворяли до конечной концентрации 6 мг/мл в стерильной воде для инъекций, содержащей 6% сахарозы, или 4% маннита, или 1% лактозы, или 3% лактозы, подвергали стерилизующему фильтрованию, в асептических условиях заполняли во флаконы объемом 2 мл (объем наполнения 1 мл) и лиофилизировали в лиофилизаторе VirTis Genesis SQ25EL. Флаконы, содержащие раствор доксорубицина, переносили в предварительно охлажденный до температуры -40°C лиофилизатор и оставляли замораживаться в течение ночи (16 часов). Через 16 часов включали вакуум и температуру повышали до -32°С со скоростью повышения температуры 1°С/4мин. После 24 часов лиофилизации при температуре 32°С дополнительно повышали температуру до 20°С при скорости повышения температуры 1°С/20 мин. Флаконы закупоривали в вакууме.

[0284] «Бесконтактная» загрузка: Лиофилизированный материал восстанавливали в стерильной воде для инъекций до конечной концентрации 6 мг/мл и 0,4 мл восстановленного материала (~ 2,24 мг свободного основания доксорубицина) добавляли к 2 мл липосомальной наносуспензии при комнатной температуре до конечной концентрации 0,936 мг/мл свободного основания доксорубицина, осторожно переворачивали (2-3 раза) и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут.

[0285] Состав композиции приведен в таблице 27.

Таблица 27. Состав композиции

Лот #	Противоион	Количество твердых веществ, используемых в композициях, мас./мас., %	Соотношения
PC	DMPC	FC	P 188	Доксорубицина гидрохлорид	Липид/лек. ср-во
647-2-196	Оксалат	65,44	16,36	11,45	4,91	1,84	50
647-2-198	Тартрат	65,44	16,36	11,45	4,91	1,84	50

[0286] Готовили грубую суспензию и обрабатывали микрофлюидизацией (MF) при давлении 10 KPSI (тысяч фунтов на квадратный дюйм) (соответствует ~ 68,9476 мПа). После микрофлюидизации в течение 9-15 минут размер частиц (Z-среднее) достигал ~ 60-70 нм. Образец собирали и подвергали стерилизующему фильтрованию в стерильную колбу Nalgene. Определяли размер частиц в фильтрованной наносуспензии (Таблица 27a).

Таблица 27a. Сводка параметров микрофлюидизации и параметров полученной эмульсии.

Лот #	Противоион	MFD	Соотношение липид/лек. ср-во	Размер частиц Z средн., нм
647-2-196	Оксалат	05 августа 2016	50	64
647-2-198	Тартрат	09 августа 2016	50	65

[0287] Липосомы подвергали TFF, затем проводили «бесконтактную» загрузку доксорубицином при комнатной температуре в течение 10 минут. Размер частиц липосом, загруженных доксорубицином, представлен в таблице 27b.

Таблица 27b. Размер частиц липосом, загруженных доксорубицином.

Лот #	Противоион	Криопротектор для лиофилизации доксорубицина	MFD	Липид/лек. ср-во	Размер частиц Z средн., нм
647-2-196 A	Оксалат	Маннит, 4%	12 августа 2016	50	64
647-2-196 B	Оксалат	Лактоза, 1%	12 августа 2016	50	64
647-2-196 C	Оксалат	Лактоза, 3%	12 августа 2016	50	64
647-2-198 A	Тартрат	Маннит, 4%	12 августа 2016	50	65
647-2-198 B	Тартрат	Лактоза, 1%	12 августа 2016	50	65
647-2-198 C	Тартрат	Лактоза, 3%	12 августа 2016	50	65

[0288] Количество свободного (не инкапсулированного) доксорубицина определяли в течение одной недели после изготовления (таблица 27c).

Таблица 27c. Содержание свободного доксорубицина.

Лот #	Противоион	Криопротектор для лиофилизации доксорубицина	% от общего
647-2-196 A	Оксалат	Маннит, 4%	0,23
647-2-196 B	Оксалат	Лактоза, 1%	0,24
647-2-196 C	Оксалат	Лактоза, 3%	0,24
647-2-198 A	Тартрат	Маннит, 4%	0,14
647-2-198 B	Тартрат	Лактоза, 1%	0,18
647-2-198 C	Тартрат	Лактоза, 3%	0,17

[0289] Определение доксорубицина в липосомальной суспензии. После стадии загрузки доксорубицина повторную TFF не проводили. Для определения общей концентрации доксорубицина в момент времени T0 (в течение одной недели с даты производства (MFD)) липосомы, загруженные доксорубицином, разводили в метаноле или IPA и проводили анализ ВЭЖХ. Содержание доксорубицина, процент извлечения (содержание доксорубицина в липосомальной суспензии относительно концентрации свободного основания доксорубицина, применяемого для «бесконтактной» загрузки) и эффективность инкапсуляции (%) представлены в таблице 27d. Эффективность инкапсуляции (%) представляет собой разницу между извлечением доксорубицина (%) и свободным доксорубицином (%).

Таблица 27d. Общее содержание доксорубицина и эффективность инкапсуляции.

Лот #	Противоион	Криопротектор	Свободное основание доксорубицина, исп. для загрузки, мкг/мл	Анализ ВЭЖХ	Инкапсулированный доксорубицин, %
Содержание доксорубицина (липосомальная суспензия) мкг/мл	Извлечение, %
647-2-196 A	Оксалат	Маннит, 4%	936	936	100	100
647-2-196 B	Оксалат	Лактоза, 1%	936	936	100	100
647-2-196 C	Оксалат	Лактоза, 3%	936	934	97	97
647-2-198 A	Тартрат	Маннит, 4%	936	934	97	97
647-2-198 B	Тартрат	Лактоза, 1%	936	936	100	100
647-2-198 C	Тартрат	Лактоза, 3%	936	936	100	100

[0290] Изучение высвобождения липосомального доксорубицина проводили при температуре 37°C в течение одной недели после изготовления (таблица 27е). Для каждого образца высвобождение доксорубицина определяли через 2, 4 и 8 часов.

Таблица 27e. Скорость высвобождения доксорубицина, определенная при температуре 37°C.

Лот #	Противоион	Криопротектор для лиофилизации доксорубицина	pH 5, высвобождение, %	pH 7,4, высвобождение, %
2 часа	4 часа	8 часов	2 часа	4 часа	8 часов
647-2-196 A	Оксалат	Маннит, 4%	92	98	100	0	0	0
647-2-196 B	Оксалат	Лактоза, 1%	88	100	100	0	0	0
647-2-196 C	Оксалат	Лактоза, 3%	97	100	100	0	0	0
647-2-198 A	Тартрат	Маннит, 4%	33	54	74	0	0	0
647-2-198 B	Тартрат	Лактоза, 1%	28	50	70	0	0	0
647-2-198 C	Тартрат	Лактоза, 3%	31	53	72	0	0	0

[0291] Продукт лиофилизированного доксорубицина. Водный раствор лиофилизированного доксорубицина, содержащий маннит или лактозу, давал продукт доксорубицина, который легко (т.е. мгновенно) восстанавливался. Напротив, лиофилизация в присутствии 6% сахарозы давала материал, который трудно восстанавливался. Следовательно, лиофилизированный доксорубицин, содержащий 6% сахарозы, не рассматривался для дальнейшей разработки и не использовался в экспериментах по загрузке.

[0292] Размер частиц. Из таблиц 27 и 27a видно, что микрофлюидизация липосомальных композиций приводила к получению частиц сходных размеров. Загрузка доксорубицином не влияла на размер частиц липосом, вне зависимости от противоиона и криопротектора (таблица 27b).

[0293] Свободный (не инкапсулированный) доксорубицин. Свободный доксорубицин отражает концентрацию лекарственного средства, не инкапсулированного в липосомы во время стадии загрузки или вытекшего из липосомы во время хранения. Из таблицы 27с видно, что содержание свободного доксорубицина в оксалатсодержащих липосомах составляло ~0,24%. При использовании тартрата в качестве противоиона содержание свободного доксорубицина в липосомальной суспензии находилось в диапазоне от 0,14 до 0,18% (таблица 27d).

[0294] Эффективность инкапсуляции доксорубицина. Эффективность инкапсуляции доксорубицина составляла от 97 до 100% (с учетом уровней свободного доксорубицина) вне зависимости от противоиона и криопротектора (таблица 27d).

[0295] Скорость высвобождения липосомального доксорубицина. Холодная (при комнатной температуре) загрузка лиофилизированного и восстановленного доксорубицина в оксалат- и/или тартратсодержащие липосомы приводила к быстрой (в течение 10 минут) инкапсуляции доксорубицина. Продукт липосомального доксорубицина продемонстрировал исключительную разницу высвобождения ΔpH7,4/5,0 с большим высвобождением доксорубицина при pH 5, в то время как высвобождение доксорубицина при pH 7,4 было полностью подавлено (таблица 27e).

[0296] Таким образом, была продемонстрирована успешная лиофилизация доксорубицина, которая приводит к получению лиофилизированного продукта, который легко восстанавливается при комнатной температуре в воде для инъекций, а также уникальная способность наших новых липосом быстро инкапсулировать восстановленный продукт доксорубицина при комнатной температуре и обеспечивать исключительную разницу высвобождения ΔpH7,4/5,0.

[0297] В целом, стабильность продуктов липосомального доксорубицина зависит как от стабильности липосом, так и от стабильности лекарственного продукта внутри липосом. Лиофилизированный и легко восстанавливаемый при комнатной температуре доксорубицин и способность оксалат- или тартратсодержащих липосом к быстрой загрузке доксорубицином при комнатной температуре устраняют эти потенциальные проблемы со стабильностью, а также обеспечивают превосходные профили высвобождения. Эти выводы приводят к определенному формату представления продукта; продукт состоит из двух флаконов: флакона с лиофилизированным доксорубицином и флакона с липосомальной суспензией носителя. Смешивание (путем простого переворачивания) восстановленного содержимого двух флаконов при комнатной температуре даст конечный готовый к употреблению продукт в течение нескольких минут.

[0298] Стабильность продукта. Как суспензия липосом, содержащих оксалат или тартрат и не содержащих доксорубицин (носитель), так и лиофилизированный доксорубицин были стабильны при хранении при температуре 2-8°C и относительной влажности в течение не менее 6 месяцев. Момент времени шесть месяцев соответствует последнему испытанию на стабильность, проведенному для композиций, описанных в разделе 8.1. Носитель был загружен лиофилизированным и восстановленным доксорубицином, и тестирование стабильности включало: По ВЭЖХ-анализу лиофилизированного и восстановленного доксорубицина (98±2,%), эффективности инкапсуляции доксорубицина в липосомы (98±2,%), определения свободного (не инкапсулированного) доксорубицина (0,1-1%), размера частиц (Zсредн.=63-68 нм), pH (7,2-7,4) и разница высвобождения доксорубицина ΔpH7,4/5,0 была близка к 100%. Кроме того, более старая партия (647-1-190) оксалатсодержащих липосом (носитель), хранившаяся при температуре 2-8°C и относительной влажности, показала приемлемую стабильность в течение по меньшей мере 18 месяцев без каких-либо заметных изменений в вышеописанных параметрах. Также рассматривается разработка лиофилизированного липосомального носителя.

Пример 8.2: Сравнение различных противоионов при фиксированном соотношении липид/лекарственное средство 50:1: Холодная загрузка.

[0299] Используемые гидратирующие среды:

а) 300 мМ раствор следующих солей аммония: оксалат аммония, или сульфат аммония, или фосфат аммония, или цитрат аммония;

b) винную кислоту, аскорбиновую кислоту или N-ацетил-L-цистеин (NAC) сначала титровали гидроксидом аммония до рН 4,8-5,0, а затем использовали в качестве гидратирующей среды.

Состав композиции приведен в таблице 27. Все композиции были приготовлены при постоянном соотношении липид/лекарственное средство 50: 1 (таблица 28)

[0300] Данные для NAC не показаны, поскольку было установлено, что загрузка доксорубицина не происходит и липосомный материал выпадает в осадок после хранения в течение ночи при температуре 2-8°C.

Таблица 28. Состав

Лот #	Противоион	Количество твердых веществ, используемых в композициях, мас./мас., %
PC	DMPC	FC	P 188	Доксорубицина гидрохлорид	Липид/ лек. ср-во
647-2-169 B	Сульфат	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-163 B	Оксалат	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-169 C	Фосфат	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-170 B	Тартрат	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-169 D	Цитрат	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-164 B	Аскорбат	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50

[0301] Готовили грубую суспензию и обрабатывали микрофлюидизацией (MF). После микрофлюидизации в течение 9-12 минут размер частиц (Z-среднее) достигал ~ 60-75 нм. Образец собирали и подвергали стерилизующему фильтрованию в стерильную колбу Nalgene. Затем липосомы подвергали TFF с последующей «бесконтактной» загрузкой доксорубицином, затем проводили еще один цикл TFF с PBS с сахарозой. Размер частиц микрофлюидизированного липосомального материала был аналогичен показанному в настоящем документе.

[0302] Концентрация доксорубицина гидрохлорида, используемая для «бесконтактной» загрузки: 1,0 мг/мл (концентрация свободного основания доксорубицина: 0,936 мг/мл).

[0303] Холодную загрузку доксорубицина в липосомы проводили следующим образом: физиологический раствор доксорубицина гидрохлорида (6 мг/мл) добавляли к липосомальной наносуспензии при комнатной температуре до конечной концентрации 1 мг/мл (т.е. 0,936 мг свободного основания доксорубицина на мл), осторожно переворачивали (2-3 раза) и инкубировали при комнатной температуре в течение 10-20 минут. После инкубации при комнатной температуре в течение 10-20 минут указанную смесь: а) подвергли еще одному циклу TFF 5Х с PBS pH 7,4, содержащим 6% сахарозы, и/или b) помещали в холодильник при температуре 2-8 °С на 16 часов, а затем проводили другой цикл TFF 5X с PBS pH 7,4, содержащим 6% сахарозы. Не было замечено ощутимых различий между профилями высвобождением доксорубицина из липосом, загруженных при комнатной температуре, или при комнатной температуре с последующей инкубацией при температуре 2-8°С в течение ночи. Данные для комнатной температуры с последующей инкубацией при температуре 2-8°С в течение ночи не приведены.

[0304] Размер частиц липосом, загруженных доксорубицином, представлен в таблице 28a.

Таблица 28a. Размер частиц липосом, загруженных доксорубицином.

Лот #	Противоион	Дата загрузки	Размер частиц Z средн., нм
647-2-169 B	Сульфат	17 июня 16	62
647-2-163 B	Оксалат	10 июня 16	67
647-2-169 C	Фосфат	17 июня 16	62
647-2-170 B	Тартрат	23 июня 16	63
647-2-169 D	Цитрат	17 июня 16	61
647-2-164 B	Аскорбат	15 июня 16	67

[0305] Определение доксорубицина в липосомальной суспензии. После загрузки доксорубицином липосомальную суспензию подвергали 5X TFF, чтобы в основном удалить свободный (не инкапсулированный) доксорубицин. Для определения общей концентрации доксорубицина в момент времени T0 (в течение одной недели с даты производства (MFD)) липосомы, промытые при помощи TFF, разводили в метаноле или IPA и проводили анализ ВЭЖХ. Содержание доксорубицина, процент извлечения (содержание доксорубицина в липосомальной суспензии относительно концентрации свободного основания доксорубицина, применяемого для «бесконтактной» загрузки) и эффективность инкапсуляции (%) представлены в таблице 28b. Эффективность инкапсуляции (%) представляет собой разницу между извлечением доксорубицина (%) и свободным доксорубицином (%).

Таблица 28b. Общее содержание доксорубицина и эффективность инкапсуляции.

Лот #	Противоион	Свободное основание доксорубицина, исп. для загрузки, мкг/мл	Анализ ВЭЖХ	Инкапсулированный доксорубицин, % [Извлечение, %] - [Свободн., %]
Содержание доксорубицина (липосомальная суспензия) мкг/мл	Извлечение, %
647-2-169 B	Сульфат	936	828	88	88
647-2-163 B	Оксалат	936	909	97	97
647-2-169 C	Фосфат	936	725	78	78
647-2-170 B	Тартрат	936	850	91	91
647-2-169 D	Цитрат	936	853	91	91
647-2-164 B	Аскорбат	936	822	88	86

[0306] Количество свободного доксорубицина определяли в течение одной недели после изготовления (таблица 28с).

Таблица 28c. Содержание свободного доксорубицина.

Лот #	Противоион	% от общего
647-2-169 B	Сульфат	0,01
647-2-163 B	Оксалат	0,08
647-2-169 C	Фосфат	0,01
647-2-170 B	Тартрат	0,04
647-2-169 D	Цитрат	0,01
647-2-164 B	Аскорбат	1,85

[0307] Изучение высвобождения липосомального доксорубицина проводили при температуре 37°C (таблица 28d). Для каждого образца высвобождение доксорубицина определяли через 2, 4 и 8 часов.

Таблица 28d. Скорость высвобождения доксорубицина, определенная при температуре 37°.

Лот #	Противоион	Pka1	pH 5, высвобождение, %	pH 7,4, высвобождение, %
2 часа	4 часа	8 часов	2 часа	4 часа	8 часов
647-2-169 B	Сульфат	-3	2	1	2	0	0	0
647-2-163 B	Оксалат	1,27	92	100	100	0	0	2
647-2-169 C	Фосфат	1,96	2	2	2	0	0	0
647-2-170 B	Тартрат	3,03	63	89	100	0	0	0
647-2-169 D	Цитрат	3,13	19	33	44	0	0	0
647-2-164 B	Аскорбат	4,17	97	97	100	58	66	69

[0308] Размер частиц. Микрофлюидизация различных липосомальных составов приводила к получению частиц, сходных по размеру с описанными в настоящем документе. Холодная загрузка доксорубицина приводила к немного меньшему увеличению размера частиц (кроме аскорбатсодержащих липосом) по сравнению с липосомами, загруженными доксорубицином при температуре 70°С (таблица 28a и таблица 8).

[0309] Эффективность инкапсуляции доксорубицина. Эффективность инкапсуляции доксорубицина для большинства композиций варьировалась от 86 до 97%, за исключением фосфатсодержащих липосом, которые показали извлечения доксорубицина 78% (Таблица 27b). Наиболее эффективная инкапсуляция наблюдалась при использовании оксалата в качестве противоиона, и наименее эффективная при использовании фосфата в качестве противоиона (таблица 28b).

[0310] Свободный (неинкапсулированный) доксорубицин. Свободный доксорубицин отражает концентрацию неинкапсулированного лекарственного средства, определенную в момент времени T0 (в течение одной недели после изготовления). Из таблицы 27c видно, что содержание свободного доксорубицина для всех композиций (кроме фосфата) находилось в диапазоне от 0,01 до 0,08%. В случае доксорубицин-аскорбатсодержащих липосом наблюдалась заметно большая утечка свободного доксорубицина (Таблица 28c).

[0311] Скорость высвобождения липосомального доксорубицина. Исследования высвобождения лекарственного средства проводили при температуре 37°С.

[0312] Холодная загрузка доксорубицина привела к некоторому улучшению разницы высвобождения ΔpH7,4/5,0 для цитрата (таблица 28d, фиг. 15), значительному улучшению разницы высвобождения ΔpH7,4/5,0 для оксалата и значительному улучшению для тартрата (таблица 28d, фиг. 15) по сравнению с липосомами, загруженными доксорубицином при температуре 70°С (таблица 13, фиг. 3).

[0313] Для липосом, содержащих доксорубицин-сульфат и доксорубицин-фосфат, разница высвобождения ΔpH7,4/5,0 была низкой (таблица 28d, фиг. 15) из-за низкого высвобождения при обоих значениях pH. Хотя липосомы, содержащие доксорубицин-аскорбат, демонстрировали большое высвобождение доксорубицина при рН 5, разница высвобождении ΔpH7,4/5,0 была очень низкой из-за высоких значений высвобождения/утечки доксорубицина при рН 7,4 (таблица 28d, фиг. 15), что противоречит цели инкапсуляция доксорубицина и ставит под угрозу стабильность и эффективность продукта in vivo.

[0314] Таким образом, когда в качестве противоионов использовали оксалат или тартрат, разница между высвобождением доксорубицина при pH 5 и pH 7,4 была заметно выше по сравнению с другими используемыми противоионами, вне зависимости от условий загрузки (таблица 13, фиг. 3 и таблица 28d, фиг. 15). Тем не менее, стоит отметить, что холодная загрузка дополнительно улучшала разницу высвобождения ΔpH7,4/5,0 для липосом, содержащих доксорубицин-оксалат и доксорубицин-тартрат, по сравнению с теми же липосомальными композициями, которые были загружены при температуре 70°C. Наблюдаемое различие свидетельствует об уникальности физического состояния агрегатов доксорубицин-оксалат или доксорубицин-тартрат при температуре 37°C, что может способствовать их растворению как реакцию на температуру и pH.

Пример 8,3: Холодная загрузка доксорубицина в оксалат-, тартрат- или цитратсодержащие липосомы.

[0315] Этот пример направлен на (i) дальнейшую характеристику рН-зависимого высвобождения доксорубицина при рН 7,4, 6,7, 6,0 и 5,0 и (ii) влияние соотношений липид/лекарственное средство и фосфолипид/свободный холестерин (PL/FC) на рН-зависимое высвобождение доксорубицина. Было проведено сравнение с Myocet-подобной композицией («Myocet», доксорубицин-цитрат) и Doxil® (доксорубицин-сульфат).

[0316] Оксалат-, тартрат- и цитрат-содержащие липосомы (носитель) получали и загружали гидрохлоридом доксорубицина, как описано в методах и в разделе 8.1, до конечной концентрации 1 мг/мл. Различные соотношения липид/лекарственное средство и фосфолипид/свободный холестерин (PL/FC) были достигнуты за счет корректировки относительных количеств фосфолипида и/или свободного холестерина (таблица 28e) и/или за счет соответствующих разведений липосом перед загрузкой доксорубицином. В таблицах 28e-28h «липид/лекарственное средство» представляет собой массовое соотношение (мас./мас.) общих липидов к свободному основанию доксорубицина в конечной суспензии загруженных доксорубицином липосом. «PL/FC» представляет собой мольное соотношение фосфолипидов (PL) к свободному холестерину (FC) в конечной суспензии загруженных доксорубицином липосом.

[0317] В качестве препаратов сравнения использовали коммерчески доступный Doxil® и Myocet-подобные липосомы («Myocet»). Myocet-подобные («Myocet») липосомы получали путем гидратирования липидной пленки, содержащей 6,9 г PC и 2,84 г FC (мольное соотношение 55/45), при помощи 100 мл 0,3М лимонной кислоты, рН 4,0, при температуре 65°С. Микрофлюидизацию и TFF проводили так, как описано в методах и в разделе 8.1. Полученные липосомы подвергали стерилизующему фильтрованию. Отбирали аликвоту 1,9 мл и загружали 50 мг доксорубицином в 25 мл загрузочной среды при температуре 70°C в соответствии с протоколом, описанным во вкладыше в упаковку Myocet. Подробный состав композиции представлен в Таблице 28e.

Таблица 28e. Состав композиции

Лот #	Противоион	Количество твердых веществ, используемых в композициях, мас./мас., %
PC	DMPC	FC	P 188	Доксорубицина гидрохлорид	Липид/лек. ср-во масс./масс	PL/FC, моль/моль
761-1-36	Оксалат	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50	3,68
761-1-55	Оксалат	57,91	14,48	21,72	4,34	1,54	58	1,72
761-1-63	Оксалат	54,01	13,50	27,00	4,05	1,44	63	1,29
761-1-63-23	Оксалат	52,61	13,13	26,31	3,94	4,00	23	1,29
761-1-63-16	Оксалат	51,70	12,93	25,85	3,87	5,65	16	1,29
761-1-64	Оксалат	47,58	11,90	35,69	3,57	1,27	68	0,86
761-1-37	Тартрат	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50	3,68
761-1-38	Цитрат	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50	3,68
761-1-69 ʺMyocetʺ	Цитрат	54,99	N/A	22,63	N/A	22,38	3,5	1,22
		DSPE-PEG	HSPC	FC	P188	Доксорубицин
Doxil®	Сульфат	17,76	53,34	17,76	N/A	11,14	8,0	1,62

PL - фосфолипид, FC - свободный холестерин.

[0318] Тестирование высвобождения доксорубицина проводили при 20-кратном (таблица 28f) и 50-кратном (таблица 28g) разведениях в растворяющей среде.

Таблица 28f. Скорость высвобождения доксорубицина определяли после инкубации в течение 8 часов в растворяющих средах при pH 7,4, 6,7, 6,0 и 5,0 при температуре 37°C. Разведение в растворяющей среде 20-кратное.

Лот #	Противоион	Липид/ лек. ср-во масс./масс	PL/FC, моль/ моль	Высвобождение доксорубицина, %
pH 7,4	pH 6,7	pH 6,0	pH 5,0
761-1-36	Оксалат	50	3,68	0	35	88	100
761-1-55	Оксалат	58	1,72	0	35	64	100
761-1-63	Оксалат	63	1,29	0	25	64	100
761-1-63-23	Оксалат	23	1,29	0	15	50	80
761-1-63-16	Оксалат	16	1,29	0	10	40	70
761-1-64	Оксалат	68	0,86	0	5	54	100
761-1-37	Тартрат	50	3,68	0	7	40	81
761-1-38	Цитрат	50	3,68	0	3	12	44
761-1-69 ʺMyocetʺ	Цитрат	3,5	1,22	0	0	5	15
Doxil®	Сульфат	8,0	1,62	0	0	2	3

Таблица 28g. Скорость высвобождения доксорубицина определяли после инкубации в течение 8 часов в растворяющих средах при pH 7,4, 6,7, 6,0 и 5,0 при температуре 37°C. Разведение в растворяющей среде 50-кратное.

Лот #	Противоион	Липид/лек. ср-во масс./масс	PL/FC, моль/моль	Высвобождение доксорубицина, %
pH 7,4	pH 6,7	pH 6,0	pH 5,0
761-1-36	Оксалат	50	3,68	0	40	93	100
761-1-55	Оксалат	58	1,72	0	39	95	100
761-1-63	Оксалат	63	1,29	0	36	95	100
761-1-63-23	Оксалат	23	1,29	4	30	80	100
761-1-63-16	Оксалат	16	1,29	6	25	70	100
761-1-64	Оксалат	68	0,86	0	19	77	100
761-1-37	Тартрат	50	3,68	0	14	60	100
761-1-38	Цитрат	50	3,68	0	7	25	68
761-1-69 ʺMyocetʺ	Цитрат	3,5	1,22	0	5	13	23
Doxil®	Сульфат	8,0	1,62	0	0	3	6

[0319] Влияние противоионов. Из таблиц 28f, 28g и фиг. 16-17 видно, что доксорубицин-оксалатсодержащие липосомы демонстрируют наибольшую разницу высвобождения доксорубицина ΔpH (7,4/6,7/6,0/ 5,0) как при 20-кратных разведениях, так и при 50-кратных по сравнению с доксорубицин-тартратсодержащими и доксорубицин-цитратсодержащими липосомами, полученными с тем же самым соотношением липид/лекарственное средство (50/1). Следует отметить, что рН-зависимое высвобождение доксорубицина из доксорубицин-оксалатсодержащих липосом (таблицы 28f, 28g, фиг.16 и 17) и в несколько меньшей степени из доксорубицин-тартратсодержащих липосом соответствует физиологическому градиенту рН, существующему in vivo (фиг.1), что указывает на потенциал нашей липосомальной системы доставки в отношении нацеливания на рН. Для Myocet наблюдали заметно более низкую разность высвобождения ΔpH (7,4/6,7/6,0/5,0) доксорубицина при 20-кратном и 50-кратном разведениях (таблицы 28f, 28g, фиг. 16-17). Разница высвобождения доксорубицина ΔpH (7,4/6,7/6,0/5,0) для Doxil® была близка к нулю (таблицы 28f, 28g, фиг. 16-17).

[0320] Влияние соотношения липид/лекарственное средство. Зависимость разницы высвобождения доксорубицина ΔpH (7,4/6,7/6,0/5,0) от соотношения липид/лекарственное средство отчетливо видна при сравнении разницы высвобождения ΔpH для доксорубицин-оксалатных липосом (соотношение липид/лекарственное средство 50/1) и для доксорубицин-оксалатных липосомах, полученных при соотношениях липид/лекарственное средство 23/1 и/или 16/1 (таблица 28f и фиг.18; 20-кратное разведение липосом в растворяющей среде). Аналогичная зависимость, но в меньшей степени, наблюдалась при 50-кратном разведении липосомального материала в растворяющей среде (таблица 28g и фиг. 19). Стоит отметить, что липосомы, полученные при низких (23/1 и 16/1) соотношениях липид/лекарственное средство, показали заметную зависимость от фактора разведения (то есть 20-кратное или 50-кратное), тогда как липосомы с более высоким (50/1) соотношением липид/лекарственное средство продемонстрировали в основном аналогичное высвобождение лекарственного средства в тех и в других условиях (таблицы 28f, 28g и фиг. 16-19). Некоторая утечка доксорубицина из липосом, полученных при низких (23/1 и 16/1) соотношениях липид/лекарственное средство, наблюдалась при 50-кратном разведении (таблица 28g и фиг. 19).

[0321] Заметную зависимость разницы высвобождения доксорубицина ΔpH (7,4/6,7/6,0/5,0) от соотношения липид/лекарственное средство можно увидеть из сравнения доксорубицин-цитратных липосом, полученных при соотношениях липид/лекарственное средство 50/1 и 3,5/1 (таблицы 28f, 28g и фиг.16-17) в 20-кратном и 50-кратном разведениях.

[0322] Таким образом, полученные данные демонстрируют, что в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения для более высоких соотношений липид/лекарственное средство достигаются большие значения разницы высвобождения доксорубицина ΔpH 7,4/6,7, 7,4/6,0 и 7,4/5,0. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения при более низких соотношениях липид/лекарственное средство доксорубицин-оксалатные или доксорубицин-тартратные, или, возможно, доксорубицин-цитратные агрегаты могут быть вынуждены образовывать более плотные фибриллоподобные структуры, которые негативно влияют на растворение агрегатов. Также эти данные указывают на то, что в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения более высокие соотношения липид/лекарственное средство обеспечивают/поддерживают такое физическое состояние агрегатов доксорубицина, которое чувствительно к pH, возможно, неорганизованное физическое состояние. Утечка доксорубицина при нейтральном рН, наблюдаемая для композиций с более низким соотношением липид/лекарственное средство, может быть обусловлена более низким содержанием липидов, что приводит к увеличению поверхностного натяжения и нарушению целостности липидного бислоя загруженных доксорубицином липосом по меньшей мере в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения.

[0323] Влияние соотношения PL/FC (фосфолипид/свободный холестерин). Содержание свободного холестерина может влиять на жесткость липидного бислоя в однослойных липосомах, что потенциально может повлиять на стабильность липосом в сыворотке/крови [52, 53], а также может закладывать основание для дальнейшей разработки лиофилизированного продукта. Чтобы проверить, будет ли повышенное содержание FC отрицательно влиять на разницу высвобождения доксорубицина ΔpH (7,4/6,7/6,0/5,0), были проведены эксперименты по влиянию содержания FC и, следовательно, соотношения PL/FC на разницу высвобождения ΔpH. Из таблицы 28f и фиг. 18 (20-кратное разведение в растворяющей среде) видно, что увеличение содержания FC и соответствующее уменьшение соотношения PL/FC с 3,68 до 0,86 в доксорубицин-оксалатных липосомах приводило к заметному снижению высвобождения лекарственного средства при рН 6,7, при этом высвобождение при рН 6,0 и 5,0 не было существенно затронуто.

[0324] В экспериментах по высвобождению, проводившихся при 50-кратном разведении (таблица 28g и фиг. 19) с использованием липосом с соотношениями PL/FC 3,68-1,29 не наблюдалось заметного влияния FC на разницу высвобождения доксорубицина ΔpH (7,4/6,7/6,0/5,0). Стоит отметить, что соотношение PL/FC <1,0 приводило к заметным изменениям в высвобождении доксорубицина как в 20-кратном, так и в 50-кратном разведениях (таблицы 28f и 28g).

[0325] Таким образом, общие данные демонстрируют, что в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения разница высвобождения доксорубицина ΔpH (7,4/6,7/6,0/5,0) для доксорубицин-оксалатных липосом сохраняется при большом уменьшении молярного соотношения PL/FC с 3,68 до 1,29, в экспериментах по высвобождению, проводимых в 50-кратном разведении. При 20-кратном разведении уменьшение молярного соотношения PL/FC с 3,68 до 1,29 в основном влияло на разницу высвобождения ΔpH (7,4/6,7), в то время как при рН 6,0 и 5,0 не наблюдалось значительных изменений скорости высвобождения доксорубицина. Напротив, уменьшение молярного соотношения PL/FC в доксорубицин-цитратных липосомах с 3,68 до 1,22 привело к уменьшению разницы высвобождения ΔpH во всем диапазоне pH (таблицы 28f, 28g и фиг. 16-17).

Пример 8.4: Холодная загрузка доксорубицина в оксалат-, тартрат- или цитратсодержащие липосомы.

[0326] Этом пример направлен на (i) дальнейшую характеристику стабильности доксорубицин-оксалатсодержащих, доксорубицин-тартратсодержащих и (ii) доксорубицин-цитратсодержащих липосом в сыворотке крови человека. Показано влияние соотношений липид/лекарственное средство и фосфолипид/свободный холестерин (PL/FC).

[0327] Оксалат-, тартрат- и цитрат-содержащие липосомы (носитель) получали и загружали гидрохлоридом доксорубицина, как описано в методах и в разделе 8.1, до конечной концентрации 1 мг/мл. Различные соотношения липид/лекарственное средство и фосфолипид/свободный холестерин (PL/FC) были достигнуты за счет корректировки относительных количеств фосфолипида и/или свободного холестерина (таблица 28e) и/или за счет соответствующих разведений липосом перед загрузкой доксорубицином.

[0328] В качестве препаратов сравнения использовали коммерчески доступный Doxil® и Myocet-подобные липосомы («Myocet»). Myocet-подобные («Myocet») липосомы получали путем гидратирования липидной пленки, содержащей 6,9 г PC и 2,84 г FC (мольное соотношение 55/45), при помощи 100 мл 0,3М лимонной кислоты, рН 4,0, при температуре 65°С. Микрофлюидизацию и TFF проводили так, как описано в методах и в разделе 8.1. Полученные липосомы подвергали стерилизующему фильтрованию. Отбирали аликвоту 1,9 мл и загружали 50 мг доксорубицином в 25 мл загрузочной среды при температуре 70°C в соответствии с протоколом, описанным во вкладыше в упаковку Myocet. Подробный состав композиции представлен в Таблице 28e.

[0329] Исследования стабильности в сыворотке проводили при 50-кратном разведении липосомного материала (что имитирует введение 60 мг/м² или 110 мг/70 кг дозы человеческого доксорубицина) в сыворотке крови человека путем добавления 50 мкл загруженных доксорубицином липосом к 2,45 мл сыворотки крови человека (50-кратное разведение). Образцы для момента времени T0 анализировали сразу же, а другие образцы инкубировали при температуре 37°C в течение 2, 4 и 8 часов. В каждый момент времени измеряли флуоресценцию интактных липосом (Fi) и общую флуоресценцию липосом, разрушенных при помощи Тритона Х-100 (Ft). Данные представлены в таблице 28h.

Таблица 28h. Высвобождение доксорубицина определяли через 2, 4 и 8 часов инкубации липосом, загруженных доксорубицином, в сыворотке крови человека при температуре 37°С и 50-кратном разведении.

Лот #	Противоион	Липид/лек. ср-во масс./масс	PL/FC, моль/моль	Высвобождение доксорубицина, %
2 часа	4 часа	8 часов
761-1-36	Оксалат	50	3,68	45	50	52
761-1-55	Оксалат	58	1,72	42	45	52
761-1-63	Оксалат	63	1,29	25	27	33
761-1-63-23	Оксалат	23	1,29	46	65	77
761-1-63-16	Оксалат	16	1,29	60	92	100
761-1-64	Оксалат	68	0,86	12	14	20
761-1-37	Тартрат	50	3,68	48	49	53
761-1-38	Цитрат	50	3,68	40	43	46
761-1-69 ʺMyocetʺ	Цитрат	3,5	1,22	100	100	100
Doxil®	Сульфат	8,0	1,62	4	6	8

[0330] Влияние противоионов. Аналогичная стабильность в сыворотке крови человека наблюдалась для доксорубицин-оксалатсодержащих, доксорубицин-тартратсодержащих и доксорубицин-цитратсодержащих липосом, полученных при одном и том же (50/1) соотношении липид/лекарственное средство (таблица 28h). Эти данные указывают на то, что противоионы не определяют стабильность тестируемых изделий в сыворотке крови человека. Следует отметить, что заметная стабильность липосом Doxil® в сыворотке крови достигается за счет применения пегилированных липидов [2-5, 7-8].

[0331] Влияние соотношения липид/лекарственное средство. Из таблицы 28h и фиг. 20 видно, что стабильность доксорубицин-оксалатных липосом в сыворотке крови уменьшается с уменьшением соотношения липид/лекарственное средство. Стабильность доксорубицин-оксалатных липосом, полученных при соотношениях липид/лекарственное средство≥50/1, заметно выше по сравнению с доксорубицин-оксалатными липосомами, полученными при соотношениях липид/лекарственное средство 23/1 и 16/1. Такая же тенденция наблюдалась при сравнении доксорубицин-цитратных липосом, полученных при соотношениях липид/лекарственное средство 50/1 и 3,5/1 (таблица 28h и фиг. 20). Эти данные четко демонстрируют, что соотношение липид/лекарственное средство может способствовать стабильности липосом в сыворотке крови. Влияние соотношения липид/лекарственное средство на стабильность липосом в сыворотке крови, а также его влияние на разницу высвобождения доксорубицина ΔpH (7,4/6,7/6,0/5,0) демонстрирует преимущество использования более высоких соотношений липид/лекарственное средство для оптимальной работы системы доставки липосом в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения.

[0332] Влияние соотношения PL/FC (фосфолипид/свободный холестерин). Дальнейшее повышение стабильности доксорубицин-оксалатных липосом в сыворотке крови наблюдалось с увеличением содержания FC и последующим снижением соотношения PL/FC (таблица 28h и фиг. 21). Для соотношения PL/FC 0,86 наблюдали наивысшую защиту липосом в сыворотке крови человека, хотя было отмечено заметное отрицательное влияние соотношения PL/FC 0,86 на разницу высвобождения доксорубицина ΔpH (7,4/6,7/6,0/5,0) (таблицы 28f и 28g). Полученные данные позволяют предположить, что оптимальное соотношение PL/FC для доксорубицин-оксалатных липосом будет находиться в диапазоне от 3,68 до 1 (таблицы 28f-28h и фиг. 20-21). Однако следует отметить, что доксорубицин-оксалатные липосомы с почти оптимальным соотношением PL/FC (1,29), но с более низкими, чем 50/1, соотношениями липид/лекарственное средство (т.е. 23/1 и 16/1) демонстрировали более низкую стабильность в сыворотке крови (таблица 28h и фиг. 20). Эти данные демонстрируют вклад как соотношения липид/лекарственное средство, так и соотношения PL/FC в стабильность липосом в сыворотке крови. Аналогичные зависимости между соотношениями липид/лекарственное средство и PL/FC наблюдались для доксорубицин-цитратных липосом (таблица 28h и фиг. 20). Также стоит упомянуть, что кровь человека, а также сыворотка крови мыши оказывают меньшее вредное воздействие на липосомы по сравнению с сывороткой крови человека (данные не показаны).

[0333] Полученные данные четко демонстрируют влияние соотношения липид/лекарственное средство и соотношения PL/FC как на стабильность липосом в сыворотке крови, так и на разницу высвобождения доксорубицина ΔpH (7,4/6,7/6,0/5,0), и подчеркивают благоприятный эффект более высоких значений соотношений липид/лекарственное средство и значений PL/FC ниже 3,68, но выше 1,0 в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения.

[0334] В целом полученные данные демонстрируют, что доксорубицин-оксалатные липосомы демонстрируют заметно большую разницу высвобождения доксорубицина ΔpH (7,4/6,7/6,0/5,0) по сравнению с «Myocet» и Doxil® (таблицы 28e-28g и фиг. 16-17). Стабильность доксорубицин-оксалатных липосом в сыворотке крови заметно выше, чем у «Myocet», но ниже, чем у Doxil®, хотя снижение соотношения PL/FC при сохранении соотношения липид/лекарственное средство≥50/1 дополнительно улучшает стабильность доксорубицин-оксалатных липосом в сыворотке крови и она становится в какой-то мере сравнима со стабильностью Doxil® (таблицы 28e, 28h и фиг. 21). Известно, что некоторые физические и химические свойства липосом, такие как размер, липидный состав, заряд и покрытия на поверхности, определяют их взаимодействие с белками плазмы, что влияет на фармакокинетику клиренса везикул [53]. Следовательно, если фармакокинетика in vivo системы липосомальной доставки согласно настоящему изобретению (то есть площадь под кривой концентрация в плазме-время, период полувыведения и т. д.) отражает эффективность сыворотки (то есть между Myocet и Doxil®), это было бы весьма желательным результатом.

Пример 9: Холодная загрузка доксорубицина в липосомы с фиксированным (50:1) соотношением липид/лекарственное средство: Добавление аскорбиновой кислоты (AA), N-ацетилцистеина (NAC), аскорбилпальмитата (AP), убихинона (CoQ10) или этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в аммоний-оксалатную и/или аммоний-тартратную гидратирующую среду.

[0335] Используемые гидратирующие среды: 300 мМ оксалата аммония; винную кислоту сначала титровали гидроксидом аммония до рН 4,8-5,0, а затем использовали в качестве гидратирующей среды.

[0336] Липосомы получали так, как описано в разделе «Методы», за исключением того, что NAC, или AA, или AP, или CoQ10, или ЭДТА добавляли к 300 мМ аммоний-оксалатной гидратирующей среде до конечных концентраций 100 мМ (NAC), или 36 и 100 мМ (AA), 2 мМ или 20 мМ (AP), 1 мМ (CoQ10), 2 мМ или 20 мМ (ЭДТА).

[0337] Холодную загрузку доксорубицина в липосомы выполняли следующим образом: физиологический раствор доксорубицина гидрохлорида (6 мг/мл) добавляли к липосомальной наносуспензии при комнатной температуре до конечной концентрации 1 мг/мл (т.е. 0,936 мг свободного основания доксорубицина на мл), осторожно переворачивали (2-3 раза) и инкубировали при комнатной температуре в течение 10-20 минут. После инкубации при комнатной температуре в течение 10-20 минут указанную смесь: а) подвергли еще одному циклу TFF 5Х с PBS pH 7,4, содержащим 6% сахарозы, и/или b) помещали в холодильник при температуре 2-8 °С на 16 часов, а затем проводили другой цикл TFF 5X с PBS pH 7,4, содержащим 6% сахарозы. Не было замечено ощутимых различий между профилями высвобождением доксорубицина из липосом, загруженных при комнатной температуре, или при комнатной температуре с последующей инкубацией при температуре 2-8°С в течение ночи. Данные для комнатной температуры с последующей инкубацией при температуре 2-8°С в течение ночи не приведены.

[0338] Состав композиции приведен в таблице 29.

Таблица 29. Состав композиции

Лот #	Гидратирующая среда	Количество твердых веществ, используемых в композициях, мас./мас., %	Соотношения
PC	DMPC	FC	P 188	Доксорубицина гидрохлорид	Липид/лек. ср-во
647-2-163 B	Оксалат аммония	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-170 B	Тартрат аммония	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-153 C	Оксалат аммония Аскорбиновая кислота (36 мМ)	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-161 B	Оксалат аммония Аскорбиновая кислота (100 мМ)	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-165 B	Оксалат аммония NAC (100 мМ)	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-172 B	Оксалат аммония Аскорбилпальмитат (2 мМ)	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-173 B	Оксалат аммония Аскорбилпальмитат (20 мМ)	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-175 B	Оксалат аммония Убихинон (1 мМ)	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-190 B	Оксалат аммония ЭДТА (2 мМ)	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-192 B	Оксалат аммония ЭДТА (20 мМ)	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-193 B	Тартрат аммония ЭДТА (2 мМ)	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-194 B	Тартрат аммония ЭДТА (20 мМ)	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50

[0339] Готовили грубую суспензию и обрабатывали микрофлюидизацией (MF) при давлении 10 KPSI (тысяч фунтов на квадратный дюйм) (соответствует ~ 68,9476 мПа). После микрофлюидизации в течение 9-15 минут размер частиц (Z-среднее) достигал ~ 60-75 нм. Образец собирали и подвергали стерилизующему фильтрованию в стерильную колбу Nalgene. Определяли размер частиц в фильтрованной наносуспензии (Таблица 29a).

Таблица 29a. Сводка параметров микрофлюидизации и параметров полученной эмульсии.

Лот #	MFD	Размер частиц Z средн., нм
647-2-163 B	24 мая 2016	66
647-2-170 B	23 июня 2016	63
647-2-153 C	19 мая 2016	62
647-2-161 B	03 июня 2016	62
647-2-165 B	16 июня 2016	65
647-2-172 B	05 июля 2016	63
647-2-173 B	06 июля 2016	67
647-2-175 B	07 июля 2016	62
647-2-190 B	28 июля 2016	62
647-2-192 B	29 июля 2016	62
647-2-193 B	01 августа 2016	62
647-2-194 B	02 августа 2016	62

[0340] Липосомы подвергали TFF с последующей «бесконтактной» загрузкой доксорубицином, затем проводили еще один цикл TFF с PBS с сахарозой.

[0341] Размер частиц липосом, загруженных доксорубицином, представлен в таблице 29b.

Таблица 29b. Размер частиц липосом, загруженных доксорубицином.

Лот #	Дата загрузки	Размер частиц Z средн., нм
647-2-163 B	10 июня 2016	67
647-2-170 B	23 июня 2016	63
647-2-153 C	03 июня 2016	63
647-2-161 B	03 июня 2016	66
647-2-165 B	16 июня 2016	69
647-2-172 B	05 июля 2016	64
647-2-173 B	06 июля 2016	67
647-2-175 B	07 июля 2016	62
647-2-190 B	28 июля 2016	62
647-2-192 B	29 июля 2016	62
647-2-193 B	01 августа 2016	62
647-2-194 B	02 августа 2016	62

[0342] Количество свободного (не инкапсулированного) доксорубицина определяли в течение одной недели после изготовления (таблица 29c).

Таблица 29c. Содержание свободного доксорубицина.

Лот #	% от общего
647-2-163 B	0,08
647-2-170 B	0,04
647-2-153 C	0,07
647-2-161 B	0,03
647-2-165 B	0,01
647-2-172 B	0,08
647-2-173 B	0,09
647-2-175 B	0,16
647-2-190 B	0,1
647-2-192 B	0,07
647-2-193 B	0,02
647-2-194 B	0,01

[0343] Определение доксорубицина в липосомальной суспензии. После загрузки доксорубицином липосомальную суспензию подвергали 5X TFF, чтобы в основном удалить свободный (не инкапсулированный) доксорубицин. Для определения общей концентрации доксорубицина в момент времени T0 (в течение одной недели с даты производства (MFD)) липосомы, промытые при помощи TFF, разводили в метаноле или IPA и проводили анализ ВЭЖХ. Содержание доксорубицина, процент извлечения (содержание доксорубицина в липосомальной суспензии относительно концентрации свободного основания доксорубицина, применяемого для «бесконтактной» загрузки) и эффективность инкапсуляции (%) представлены в таблице 29d. Эффективность инкапсуляции (%) представляет собой разницу между извлечением доксорубицина (%) и свободным доксорубицином (%).

Таблица 29d. Общее содержание доксорубицина и эффективность инкапсуляции.

Лот #	Свободное основание доксорубицина, исп. для загрузки, мкг/мл	Анализ ВЭЖХ	Инкапсулированный доксорубицин, % [Извлечение, %] - [Свободн., %]
Содержание доксорубицина (липосомальная суспензия) мкг/мл	Извлечение, %
647-2-163 B	936	909	97	97
647-2-170 B	936	850	91	91
647-2-153 C	936	750	80	80
647-2-161 B	936	745	80	80
647-2-165 B	936	910	97	97
647-2-172 B	936	936	100	100
647-2-173 B	936	936	100	100
647-2-175 B	936	912	97	97
647-2-190 B	936	936	100	100
647-2-192 B	936	926	99	99
647-2-193 B	936	926	99	99
647-2-194 B	936	926	99	99

[0344] Изучение высвобождения липосомального доксорубицина проводили при температуре 37°C в течение одной недели после изготовления (таблица 29е). Для каждого образца высвобождение доксорубицина определяли через 2, 4 и 8 часов.

Таблица 29e. Скорость высвобождения доксорубицина, определенная при температуре 37°C.

Лот #	pH 5, высвобождение, %	pH 7,4, высвобождение, %
2 часа	4 часа	8 часов	2 часа	4 часа	8 часов
647-2-163 B	92	100	100	0	0	2
647-2-170 B	63	89	100	0	0	0
647-2-153 C	90	97	100	0	3	3
647-2-161 B	92	100	100	0	1	4
647-2-165 B	82	90	100	1	5	13
647-2-172 B	80	87	94	0	0	0
647-2-173 B	69	71	75	0	0	0
647-2-175 B	80	94	94	0	0	0
647-2-190 B	77	88	94	0	0	0
647-2-192 B	6	9	18	0	0	0
647-2-193 B	33	50	64	0	0	0
647-2-194 B	3	5	12	0	0	0

[0345] Эффективность инкапсуляции доксорубицина в присутствии или отсутствии аскорбиновой кислоты или NAC находилась в диапазоне 80-97% (таблица 29d). Добавление аскорбиновой кислоты или NAC в аммоний-оксалатную гидратирующую среду не оказало существенного влияния на размер частиц липосом±доксорубицин (таблицы 289 и 29b), на свободный (не инкапсулированный или вытекший) доксорубицин (таблица 29c) и, что более важно, на профиль высвобождения доксорубицина (таблица 29e) по сравнению с липосомами, образованными только с оксалатом или тартратом (таблицы 29a-e).

[0346] Добавление 2 мМ или 20 мМ ЭДТА, 2 мМ или 20 мМ АР или 1 мМ CoQ10 не оказало существенного влияния на размер частиц пустых или загруженных доксорубицином липосом (таблицы 29a и 29b), свободный доксорубицин (29c) и эффективность инкапсуляции (таблица 29d).

[0347] Добавление оксалата с 2 мМ АР (АР/оксалат- 1:150) или 1 мМ CoQ10 (CoQ10/оксалат- 1:300) не влияло на профиль высвобождения доксорубицина (таблица 29e). Хотя при добавлении 20 мМ АР (АР/оксалат- 1:15) наблюдалось некоторое уменьшение высвобождения доксорубицина, разница высвобождения ΔpH7,4/5,0 была достаточно большой (таблица 29e).

[0348] Добавление 2 мМ ЭДТА в оксалат (оксалат/ЭДТА в соотношении 1:150) не влияло на профиль высвобождения доксорубицина (таблица 28e). Хотя при добавлении 2 мМ ЭДТА к 300 мМ тартратной гидратирующей среды (тартрат/ЭДТА - 1:150) наблюдалось заметное снижение высвобождения доксорубицина (таблица 29e), разница высвобождения ΔpH7,4/5,0 была достаточно большой. Напротив, когда к 300 мМ оксалатной или тартратной гидратирующей среды добавляли 20 мМ ЭДТА, наблюдалось очень низкое высвобождение доксорубицина (таблица 29e).

[0349] Эти данные позволяют применять аскорбиновую кислоту, и/или NAC, и/или аскорбилпальмитат, и/или CoQ10, и/или ЭДТА в сочетании с оксалатом или тартратом (предпочтительные противоионы в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения) или цитратом для уменьшения окислительного стресса во время обработки, что может привести к получению более стабильного продукта с более длительным сроком хранения. Кроме того, аскорбиновая кислота может оказывать кардиопротекторное действие в отношении предотвращения или облегчения сердечной токсичности, вызванной доксорубицином [28-29, 33]. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения это может быть результатом естественного метаболизма, вызванного лекарственными средствами, метаболизма активных форм кислорода в сердце [28-29]. Исследования показали, что перенос электронов в сердце после лечения доксорубицином заметно усиливается и приводит к значительному увеличению образования супероксид-анионов и перекиси водорода в митохондриях и саркоплазматической сети, двух основных участках, где возникают повреждения сердца от доксорубицина [28, 30-31]. Витамин С (аскорбиновая кислота) является антиоксидантным витамином, который, как было показано, противодействует воздействию противоопухолевых препаратов, генерирующих активные формы кислорода [29, 32-33]. Также было продемонстрировано, что лечение экспериментальных животных фармакологическими дозами NAC избирательно защищает сердце от токсичности доксорубицина [28, 29, 34]. Хелатирующие агенты, такие как ЭДТА, могут снижать образование активных форм кислорода (АФК) за счет хелатирования ионов переходных металлов, следовательно, могут уменьшать повреждение мембраны кардиомиоцитов и риск развития кардиомиопатии, связанной с доксорубицином [36, 37]. Кроме того, ЭДТА может повысить стабильность липосомальных составов за счет ингибирования окисления липидов, катализируемого металлом.

[0350] Таким образом, добавление к оксалату, тартрату (предпочтительным противоионам в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения) или к цитрату аскорбиновой кислоты (AA/оксалат - 1:8 или 1:3) и/или NAC (NAC/оксалат - 1:3), и/или AP (AP/оксалат-1:150 или 1:15) и/или CoQ10 (CoQ10/оксалат-1:300) и/или ЭДТА (ЭДТА/оксалат - 1:150) не оказали значительного отрицательного влияния на разницу высвобождения доксорубицина ΔpH7,4/5,0. Следовательно, эта мощная комбинация оптимизированной разницы высвобождения ΔpH7,4/5,0 и антиоксиданта(-ов)/хелаторов может быть эффективна для больных раком и полезна для снижения кардиотоксического эффекта свободного доксорубицина. Другие соотношения аскорбиновой кислоты или NAC к оксалату, тартрату или цитрату, которые можно использовать, включают от 1:10 до 1:1. Другие соотношения AP к оксалату, тартрату или цитрату, которые можно использовать, включают от 1:300 до 1:10. Другие соотношения CoQ10 к оксалату, тартрату или цитрату, которые можно использовать, включают от 1:300 до 1:10. Другие соотношения ЭДТА к оксалату, тартрату или цитрату, которые можно использовать, включают от 1:300 до 1: 5.

[0351] Соотношения хелатора (например, аскорбиновой кислоты (AA), N-ацетилцистеина (NAC), аскорбилпальмитата (AP), убихинона (CoQ10) или этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА)) к противоиону (например, оксалату, тартрату или цитрату), то есть соотношение хелатор/противоион, может составлять от 1:1 до 1:10000.

[0352] Таким образом, в вариантах реализации настоящего изобретения соотношение АА/оксалат может составлять примерно 1:1, примерно 1:2, примерно 1:3, примерно 1:5, примерно 1:8, примерно 1:10, примерно 1:15, примерно 1:20, примерно 1:50, примерно 1:100, примерно 1:200, примерно 1:300, примерно 1:500, примерно 1:1000, примерно 1:2000, примерно 1:5000, примерно 1:10000 или более. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение NAC/оксалат может составлять примерно 1:1, примерно 1:2, примерно 1:3, примерно 1:5, примерно 1:8, примерно 1:10, примерно 1:15, примерно 1:20, примерно 1:50, примерно 1:100, примерно 1:200, примерно 1:300, примерно 1:500, примерно 1:1000, примерно 1:2000, примерно 1:5000, примерно 1:10000 или более. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение AP/оксалат может составлять примерно 1:1, примерно 1:2, примерно 1:3, примерно 1:5, примерно 1:8, примерно 1:10, примерно 1:15, примерно 1:20, примерно 1:50, примерно 1:100, примерно 1:200, примерно 1:300, примерно 1:500, примерно 1:1000, примерно 1:2000, примерно 1:5000, примерно 1:10000 или более. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение CoQ10/оксалат может составлять примерно 1:1, примерно 1:2, примерно 1:3, примерно 1:5, примерно 1:8, примерно 1:10, примерно 1:15, примерно 1:20, примерно 1:50, примерно 1:100, примерно 1:200, примерно 1:300, примерно 1:500, примерно 1:1000, примерно 1:2000, примерно 1:5000, примерно 1:10000 или более. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение ЭДТА/оксалат может составлять примерно 1:1, примерно 1:2, примерно 1:3, примерно 1:5, примерно 1:8, примерно 1:10, примерно 1:15, примерно 1:20, примерно 1:50, примерно 1:100, примерно 1:200, примерно 1:300, примерно 1:500, примерно 1:1000, примерно 1:2000, примерно 1:5000, примерно 1:10000 или более.

[0353] В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение АА/тартрат может составлять примерно 1:1, примерно 1:2, примерно 1:3, примерно 1:5, примерно 1:8, примерно 1:10, примерно 1:15, примерно 1:20, примерно 1:50, примерно 1:100, примерно 1:200, примерно 1:300, примерно 1:500, примерно 1:1000, примерно 1:2000, примерно 1:5000, примерно 1:10000 или более. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение NAC/тартрат может составлять примерно 1:1, примерно 1:2, примерно 1:3, примерно 1:5, примерно 1:8, примерно 1:10, примерно 1:15, примерно 1:20, примерно 1:50, примерно 1:100, примерно 1:200, примерно 1:300, примерно 1:500, примерно 1:1000, примерно 1:2000, примерно 1:5000, примерно 1:10000 или более. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение AP/тартрат может составлять примерно 1:1, примерно 1:2, примерно 1:3, примерно 1:5, примерно 1:8, примерно 1:10, примерно 1:15, примерно 1:20, примерно 1:50, примерно 1:100, примерно 1:200, примерно 1:300, примерно 1:500, примерно 1:1000, примерно 1:2000, примерно 1:5000, примерно 1:10000 или более. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение CoQ10/тартрат может составлять примерно 1:1, примерно 1:2, примерно 1:3, примерно 1:5, примерно 1:8, примерно 1:10, примерно 1:15, примерно 1:20, примерно 1:50, примерно 1:100, примерно 1:200, примерно 1:300, примерно 1:500, примерно 1:1000, примерно 1:2000, примерно 1:5000, примерно 1:10000 или более. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение ЭДТА/тартрат может составлять примерно 1:1, примерно 1:2, примерно 1:3, примерно 1:5, примерно 1:8, примерно 1:10, примерно 1:15, примерно 1:20, примерно 1:50, примерно 1:100, примерно 1:200, примерно 1:300, примерно 1:500, примерно 1:1000, примерно 1:2000, примерно 1:5000, примерно 1:10000 или более.

[0354] В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение АА/цитрат может составлять примерно 1:1, примерно 1:2, примерно 1:3, примерно 1:5, примерно 1:8, примерно 1:10, примерно 1:15, примерно 1:20, примерно 1:50, примерно 1:100, примерно 1:200, примерно 1:300, примерно 1:500, примерно 1:1000, примерно 1:2000, примерно 1:5000, примерно 1:10000 или более. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение NAC/цитрат может составлять примерно 1:1, примерно 1:2, примерно 1:3, примерно 1:5, примерно 1:8, примерно 1:10, примерно 1:15, примерно 1:20, примерно 1:50, примерно 1:100, примерно 1:200, примерно 1:300, примерно 1:500, примерно 1:1000, примерно 1:2000, примерно 1:5000, примерно 1:10000 или более. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение AP/цитрат может составлять примерно 1:1, примерно 1:2, примерно 1:3, примерно 1:5, примерно 1:8, примерно 1:10, примерно 1:15, примерно 1:20, примерно 1:50, примерно 1:100, примерно 1:200, примерно 1:300, примерно 1:500, примерно 1:1000, примерно 1:2000, примерно 1:5000, примерно 1:10000 или более. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение CoQ10/цитрат может составлять примерно 1:1, примерно 1:2, примерно 1:3, примерно 1:5, примерно 1:8, примерно 1:10, примерно 1:15, примерно 1:20, примерно 1:50, примерно 1:100, примерно 1:200, примерно 1:300, примерно 1:500, примерно 1:1000, примерно 1:2000, примерно 1:5000, примерно 1:10000 или более. В вариантах реализации настоящего изобретения соотношение ЭДТА/цитрат может составлять примерно 1:1, примерно 1:2, примерно 1:3, примерно 1:5, примерно 1:8, примерно 1:10, примерно 1:15, примерно 1:20, примерно 1:50, примерно 1:100, примерно 1:200, примерно 1:300, примерно 1:500, примерно 1:1000, примерно 1:2000, примерно 1:5000, примерно 1:10000 или более.

[0355] Другие противоионы и/или антиоксиданты, и/или хелаторы, которые могут быть пригодны и/или которые можно применять в комбинации с оксалатом и/или тартратом, включают цитрат, и/или фитат, и/или глутатион, и/или витамин Е, и/или дексразоксан, и/или дефероксамин.

[0356] В целом полученные данные продемонстрировали эффекты, оказываемые:

а) подходящими противоионами, такими как оксалат и тартрат, которые определяют физическое состояние интралипосомальных агрегатов доксорубицина и оптимальную разницу высвобождения ΔpH7,4/5,0 и ΔpH7,4/6,7/6,0/5,0;

b) соотношением липид/лекарственное средство (в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предпочтительный диапазон составляет 20: -50:1) для селективного ответа на изменение рН;

c) температурой загрузки доксорубицина (преимущество холодной загрузки для максимизации разницы высвобождения ΔpH7,4/5,0 и ΔpH7,4/6,7/6,0/5,0);

для обеспечения оптимального рН-зависимого профиля высвобождения лекарственного средства и стабильности липосом, загруженных доксорубицином.

[0357] Кроме того, для обеспечения стабильности конечного продукта и его биологической эффективности может быть полезно дополнить предпочтительный противоион (противоионы) другими противоионами, и/или антиоксидантами, и/или хелаторами.

Пример 10: Иринотекан

Способы

Флюорометрия

[0358] Все анализы выполнялись с использованием флуоресцентного планшет-ридера SpectraMax Gemini EM Molecular Devices. Для контроля прибора и для анализа и составления отчетов о значениях использовали программное обеспечение SoftMax Pro.

[0359] Стандартный исходный раствор иринотекана гидрохлорида готовили в 6% растворе сахарозы в стерильной воде для инъекций (т.е. 6,0 мг порошка иринотекана гидрохлорида в 1 мл воды, содержащей 6% сахарозы). Калибровочные стандарты готовили путем разведения исходного раствора в забуференном фосфатом физиологическом растворе, рН 7,4 и 5,0, чтобы ограничить целевую концентрацию для анализа. Температура планшет-ридера была установлена на 25 °C, а длины волн возбуждения и испускания были установлены на 370 нм и 470 нм, соответственно. Был определен линейный диапазон, равный 0,5-4 мкг/мл гидрохлорида иринотекана. Чтобы оставаться в линейном диапазоне, калибровочные стандарты иринотекана гидрохлорида и образцы разводили соответствующим образом.

[0360] Для определения флуоресценции общего иринотекана в липосомальной композиции (Ft) липосомы разрушали при помощи добавления Тритона Х-100 до конечной концентрации 1%, перемешивали переворачиванием и инкубировали в течение 5-10 минут до количественного определения.

[0361] Для определения флуоресценции интралипосомального иринотекана (Fi) указанную липосомальную композицию подвергали флуорометрическому анализу без предварительной обработки тритоном Х-100.

Количественная оценка высвобождения иринотекана из липосомальных композиций

[0362] Для определения высвобождения иринотекана применяли метод, в котором используют исчезновение эффекта гашения флуоресценции и относят его к флуоресценции липосом, разрушенных тритоном Х-100. Этот подход основан на том факте, что флуоресценция иринотекана гасится при инкапсуляции в липосомы и заметно увеличивается при высвобождении иринотекана из липосом. Следовательно, увеличение флуоресценции интактных липосом (Fi) во время инкубации образца в растворяющей среде представляет собой высвобождение иринотекана в среду. Разница между значениями Fi в разные моменты времени и T0, отнесенная к Ft (флуоресценция разрушенных липосом) представляет собой процент высвобожденного лекарственного средства.

[0363] Исследование проводили в следующие моменты времени: T0, T2ч, T4ч и T8ч. Отдельные образцы разводили в 2 отдельных разбавителях/растворяющих средах; PBS pH 7,4 и PBS pH 5 20-кратно (например, 100 мкл образца+1,9 мл разбавителя) для имитации внутривенной инъекции мыши. Для определения в момент времени T0 липосомальные композиции разводили в буферах PBS с pH 7,4 и pH 5 при температуре ~ 25°C. Сразу же (в течение 10 минут) измеряли флуоресценцию интактных липосом (Fi) и общую флуоресценцию липосом, разрушенных при помощи Тритона Х-100. Температура планшет-ридера была установлена на 25 °C; длины волн возбуждения и испускания были установлены на 370 нм и 470 нм, соответственно.

[0364] Другие образцы липосом разводили 20-кратно в буфере PBS с pH 7,4 и pH 5, предварительно нагретом до температуры 37°C (для моделирования температуры in vivo), и инкубировали в течение 2, 4 и 8 часов при температуре 37°C. В каждый момент времени измеряли флуоресценцию интактных липосом (Fi) и общую флуоресценцию липосом, разрушенных при помощи Тритона Х-100 (Ft). Процент высвобождения лекарственного средства был количественно определен как [(Fi_n -Fi_t0)/Ft_средн)]*100%, где Fi_n - Fi, измеренный через 2, 4 или 8 часов, Fi_t0 - Fi, измеренный в T0, и Ft_средн - среднее значение Ft в момент времени T0.

[0365] Следует отметить, что общая флуоресценция (Ft) значительно увеличилась за 8 часов инкубации липосом при рН 7,4. Это наблюдение согласуется с сообщениями о превращении иринотекана в карбоксилатную форму в нейтральной среде [26-27].

Определение размера частиц

[0366] Все анализы проводили с использованием анализатора размера частиц, молекулярной массы и дзета-потенциала Malvern Zetasizer Nano ZS с He-Ne лазером 4 мВт, работающим на длине волны 633 нм и при угле обнаружения 173°. Для контроля прибора и для анализа и составления отчетов о значениях использовали программное обеспечение Zetasizer.

[0367] Усредненные по интенсивности диаметры частиц (Z-среднее) рассчитывали на основе кумулянтного анализа, как определено в ISO 13321 (Международная организация по стандартизации 1996).

[0368] Образцы готовили с использованием 30 мкл липосомальной композиции в 1,5 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (рН 7,4) и перед анализом выдерживали при температуре 25 °С. Измерения размера проводили трижды для каждого образца.

Измерения pH

[0369] Все анализы выполняли с использованием pH-метра Mettler Toledo SevenCompact с микроэлектродом Mettler Toledo InLab pH.

Получение липосом: Получение грубой суспензии.

[0370] Грубую суспензию готовили при растворении PC, DMPC, FC и P188 в 10 мл ДХМ в соотношениях, указанных в таблице 29. Смесь сушили в потоке азота до получения вязкой пленки. Затем пленку сушили в вакуумной печи в течение ночи. На следующий день высушенную липидную пленку гидратировали 300 мМ аммоний-оксалатным, или аммоний-сульфатным, или аммоний-фосфатным, или аммоний-цитратным буфером, предварительно нагретым до температуры 65 °С, и сразу же гомогенизировали с помощью ручного гомогенизатора в течение 2-3 мин. Винную кислоту сначала титровали до рН 4,8-5,0 с помощью NH₄OH, а затем использовали в качестве гидратирующей среды. Определяли размер частиц грубой суспензии, который всегда находился в диапазоне 800-1200 нм.

Обработка микрофлюидизацией

[0371] Для микрофлюидизации объем всегда составлял 100 мл, если не указано иное. Для микрофлюидизации давление всегда составляло 10 KPSI (тысяч фунтов на квадратный дюйм) (соответствует ~ 68,9476 мПа). Микрофлюидизацию грубой суспензии проводили в режиме рециркуляции (с возвратом материала в питающий резервуар) при контролируемой (≤ 65 °C) температуре. Время обработки находилось в диапазоне 9-12 минут. Желаемый размер частиц (Z-среднее) составлял 60-70 нм.

Фильтрование тангенциальным потоком

[0372] Полупрозрачную наносуспензию собирали из микрофлюидизатора и подвергали фильтрованию тангенциальным потоком (TFF) с 15-20 Х объемами PBS, pH 7,4. Цель TFF состояла в том, чтобы заменить аммоний-оксалатный, или аммоний-сульфатный, или аммоний-фосфатный, или аммоний-цитратный, или аммоний-тартратный внешний буфер на PBS и в основном удалить аммоний из интралипосомального пространства. Аммоний во внешнем буфере измеряли при помощи аммоний-специфичного электрода. TFF прекращали, когда концентрация аммония во внешнем буфере составляла≤3 мМ.

«Бесконтактная» загрузка иринотекана

[0373] Гидрохлорид иринотекана растворяли в стерильной воде для инъекций, содержащей 6% сахарозы, до конечной концентрации 6 мг/мл. Раствор гидрохлорида иринотекана добавляли к липосомальной наносуспензии при комнатной температуре до конечной концентрации 1 мг/мл (например, 0,94 мг свободного основания иринотекана на мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 10-30 минут с инкубацией в течение ночи при температуре 2-8°C или без нее, а затем проводили еще один цикл TFF 5X с PBS pH 7,4, содержащим 6% сахарозы. Целью этого цикла TFF было вымывание свободного (не инкапсулированного) иринотекана. Не было замечено ощутимых различий между профилями высвобождением иринотекана из липосом, загруженных при комнатной температуре, или при комнатной температуре с последующей инкубацией при температуре 2-8°С в течение ночи. Данные для комнатной температуры с последующей инкубацией при температуре 2-8°С в течение ночи не приведены.

[0374] Затем липосомальную наносуспензию подвергали стерилизующему фильтрованию в стерильную колбу Nalgene через фильтр 0,22 мкм. Определяли размер частиц, pH, Fi, Ft и профиль высвобождения иринотекана. Стерильную наносуспензию асептически распределяли в предварительно стерилизованные флаконы объемом 2 мл, закупоривали и герметизировали. Флаконы хранили при температуре 2-8 °С.

Пример 11: Холодная загрузка иринотекана в липосомы с фиксированным (50:1) соотношением липид/лекарственное средство.

[0375] В этом примере использовали противоионы, которые продемонстрировали способность облегчать загрузку доксорубицина в липосомы с соотношением липид/лекарственное средство 50: 1.

[0376] Используемые гидратирующие среды: 300 мМ сульфат аммония, оксалат аммония, фосфат аммония, цитрат аммония.

[0377] Винную кислоту сначала титровали гидроксидом аммония до рН 5, а затем использовали в качестве гидратирующей среды.

[0378] Холодную «бесконтактную» загрузку осуществляли при помощи 1 мг/мл (т.е. 0,94 мг свободного основания иринотекана на мл) гидрохлорида иринотекана. Состав композиции приведен в таблице 30. Все композиции были приготовлены при постоянном соотношении липид/лекарственное средство 50: 1 (таблица 30).

Таблица 30. Состав композиции

Лот #	Гидратирующая среда	Количество твердых веществ, используемых в композициях, мас./мас., %
PC	DMPC	FC	P 188	Иринотекана гидрохлорид	Липид/лек. ср-во
647-2-142 A	Сульфат аммония	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-91	Оксалат аммония	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-142 B	Фосфат аммония	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-161 A	Тартрат аммония	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50
647-2-142 C	Цитрат аммония	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50

[0379] Готовили грубую суспензию и обрабатывали микрофлюидизацией (MF) при давлении 10 KPSI (тысяч фунтов на квадратный дюйм) (соответствует ~ 68,9476 мПа). После микрофлюидизации в течение 9-12 минут размер частиц (Z-среднее) достигал ~ 60-65 нм. Образец собирали и подвергали стерилизующему фильтрованию в стерильную колбу Nalgene. Определяли размер частиц в фильтрованной наносуспензии (Таблица 31).

Таблица 31. Сводка параметров микрофлюидизации и параметров полученной эмульсии.

Лот #	Противоион	MFD	Размер частиц Z средн., нм
647-2-142 A	Сульфат	28 марта 2016	60
647-2-91	Оксалат	11 марта 2016	65
647-2-142 B	Фосфат	28 апреля 2016	64
647-2-161 A	Тартрат	17 мая 2016	65
647-2-142 C	Цитрат	03 мая 2016	62

[0380] Липосомы подвергали TFF с последующей «бесконтактной» загрузкой иринотеканом, после чего загруженные иринотеканом липосомы подвергали еще одному циклу TFF с PBS с содержанием сахарозы 6%. Концентрация иринотекана гидрохлорида, используемая для «бесконтактной» загрузки: 1,0 мг/мл (концентрация свободного основания иринотекана: 0,94 мг/мл).

[0381] Размер частиц липосом, загруженных иринотеканом, представлен в таблице 32.

Таблица 32. Размер частиц липосом, загруженных иринотеканом.

Лот #	Противоион	Дата загрузки	Размер частиц Z средн., нм
647-2-142 A	Сульфат	28 марта 2016	64
647-2-91	Оксалат	11 марта 2016	65
647-2-142 B	Фосфат	28 апреля 2016	65
647-2-161 A	Тартрат	17 мая 2016	65
647-2-142 C	Цитрат	03 мая 2016	63

[0382] После загрузки иринотеканом липосомальную суспензию подвергали 5X TFF, чтобы в основном удалить свободный (не инкапсулированный) иринотекан. Для определения липосомальной концентрации иринотекана в момент времени T0 (в течение одной недели после MFD) промытые при помощи TFF липосомы разрушали при помощи добавления Тритона X-100 до конечной концентрации 1%, перемешивали переворачиванием и инкубировали в течение 5-10 минут до количественного определения с помощью флуорометрического анализа. Содержание иринотекана и процент извлечения (содержание иринотекана в липосомальной суспензии относительно концентрации свободного основания иринотекана, применяемого для «бесконтактной» загрузки) представлены в таблице 33.

Таблица 33. Содержание иринотекана в липосомах

Лот #	Противоион	Свободное основание иринотекана, исп. для загрузки мкг/мл	Анализ ВЭЖХ
Содержание иринотекана (липосомальная суспензия) мкг/мл	Извлечение, %
647-2-142 A	Сульфат	0,94	870	100
647-2-91	Оксалат	0,94	850	98
647-2-142 B	Фосфат	0,94	850	98
647-2-161 A	Тартрат	0,94	869	100
647-2-142 C	Цитрат	0,94	800	93

[0383] Изучение высвобождения липосомального иринотекана проводили при температуре 37°C в течение одной недели после изготовления (таблица 34). Для каждого образца высвобождение иринотекана определяли через 2, 4 и 8 часов.

Таблица 34. Скорость высвобождения иринотекана определяли в момент времени T0 (в течение одной недели после изготовления).

Лот #	Противоион	Pka1	pH 5, высвобождение, %
2 часа	4 часа	8 часов
647-2-142 A	Сульфат	-3	0	3	3
647-2-91	Оксалат	1,27	95	95	95
647-2-142 B	Фосфат	1,96	9	11	7
647-2-161 A	Тартрат	3,03	76	93	100
647-2-142 C	Цитрат	3,13	25	67	70

[0384] Размер частиц Из таблицы 31 видно, что микрофлюидизация различных липосомальных композиций приводила к получению частиц сходных размеров. Загрузка иринотекана не приводила к значительному увеличению размера частиц для любой из приготовленных композиций (таблицы 31-32).

[0385] Содержание иринотекана в липосомах Извлечение 100% наблюдалось при применении сульфата в качестве противоиона (таблица 33). Интересно то, что аналогичная тенденция наблюдалась для доксорубицин-содержащих липосом (таблица 9). ~ 100%-ное извлечение липосомального иринотекана после 5x TFF с PBS (pH 7,4) убедительно свидетельствует об отсутствии утечки инкапсулированного иринотекана.

[0386] Скорость высвобождения липосомального иринотекана. Изучение высвобождения лекарственного средства проводили в течение одной недели после изготовления (MFD). Поскольку иринотекан очень нестабилен при нейтральном рН и быстро превращается в карбоксилатную форму в нейтральной среде [26-27], эксперименты по высвобождению проводили только при рН 5. Из таблицы 34 видно, что, когда в качестве противоионов использовали оксалат или тартрат, скорость высвобождения иринотекана при рН 5 достигала ~ 100% и достигала плато через 2-4 часа. Когда в качестве противоиона использовали цитрат, высвобождение при кислотном рН было более низким и достигало 70% через 4-8 часов. Составы с сульфатом и фосфатом показали очень низкое высвобождение при рН 5 (таблица 34 и фиг. 22). В целом, полученные данные о содержании липосомального иринотекана и его высвобождении при pH 5 указывают на большую разницу высвобождения ΔpH7,4/5,0, достигаемую при использовании оксалата, или тартрата, или цитрата в качестве противоионов.

[0387] Интересно то, что высвобождение доксорубицина или иринотекана из сульфатсодержащих, фосфатсодержащих или цитратсодержащих липосом показало зависимость от значения pKa1 соответствующего противоиона (фиг. 15 и 16). Однако высвобождение доксорубицина или иринотекана из оксалатсодержащих или тартратсодержащих (предпочтительные противоионы в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения) липосом не коррелируют со значениями pKa1 тестируемых противоионов (фиг. 15 и 16). Эти данные убедительно свидетельствуют о влиянии уникального физического состояния доксорубицин-оксалатных и/или доксорубицин-тартратных, а также иринотекан-оксалатных и/или иринотекан-тартратных интралипосомальных агрегатов на профили высвобождения доксорубицина или иринотекана и согласуются с анализом методом С-TEM доксорубицин-оксалатсодержащих липосом.

[0388] В целом полученные данные по липосомам, содержащим иринотекан, хорошо согласуются с результатами, полученными для доксорубицина, и подтверждают влияние оксалатных и тартратных противоионов при предпочтительном соотношении липид/лекарственное средство. Таким образом, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения для доставки иринотекана можно применять противоионы оксалат или тартрат. Данные также позволяют предположить, что в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения возможно использование цитрата в качестве противоиона для иринотекана.

Пример 12: Митоксантрон

Способы.

Высвобождение митоксантрона из липосомальных композиций

[0389] Исследование проводили при температуре 37°C в следующие моменты времени: T0 и T24ч. Отдельные образцы разводили в 2 отдельных разбавителях/растворяющих средах; PBS pH 7,4 и PBS pH 5 20-кратно (например, 100 мкл образца+1,9 мл разбавителя) для имитации внутривенной инъекции мыши. Для момента времени T0 липосомальные композиции разводили в буферах PBS с pH 7,4 и pH 5 при температуре ~ 25 °C.

[0390] Другие липосомальные образцы разводили 20-кратно в буферах PBS с pH 7,4 и pH 5, предварительно нагретых до температуры 37°C (для моделирования температуры in vivo), и инкубировали в течение 0 и 24 часов при температуре 37°C. В каждый момент времени высвобождение митоксантрона из липосом оценивали визуальным наблюдением: PBS/физиологический раствор митоксантрона имеет интенсивный синий цвет, а при инкапсуляции в липосомы цвет меняется на фиолетовый. Высвобождение митоксантрона из липосом приводит к изменению цвета с фиолетового на синий.

Определение размера частиц

[0391] Все анализы проводили с использованием анализатора размера частиц, молекулярной массы и дзета-потенциала Malvern Zetasizer Nano ZS с He-Ne лазером 4 мВт, работающим на длине волны 633 нм и при угле обнаружения 173°. Для контроля прибора и для анализа и составления отчетов о значениях использовали программное обеспечение Zetasizer.

[0392] Усредненные по интенсивности диаметры частиц (Z-среднее) рассчитывали на основе кумулянтного анализа, как определено в ISO 13321 (Международная организация по стандартизации 1996).

[0393] Образцы готовили с использованием 30 мкл липосомальной композиции в 1,5 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (рН 7,4) и перед анализом выдерживали при температуре 25 °С. Измерения размера проводили трижды для каждого образца.

Измерения pH

[0394] Все анализы выполняли с использованием pH-метра Mettler Toledo SevenCompact с микроэлектродом Mettler Toledo InLab pH.

Получение грубой суспензии.

[0395] Грубую суспензию готовили при растворении PC, DMPC, FC и P188 в 10 мл ДХМ в соотношениях, указанных в таблице 34. Смесь сушили в потоке азота до получения вязкой пленки. Затем пленку сушили в вакуумной печи в течение ночи. На следующий день высушенную липидную пленку гидратировали 300 мМ аммоний-оксалатным буфером, предварительно нагретым до температуры 65°С, и сразу же гомогенизировали с помощью ручного гомогенизатора в течение 2-3 мин. Определяли размер частиц грубой суспензии, который всегда находился в диапазоне 800-1200 нм.

Обработка микрофлюидизацией

[0396] Для микрофлюидизации объем всегда составлял 100 мл, если не указано иное. Для микрофлюидизации давление всегда составляло 10 KPSI (тысяч фунтов на квадратный дюйм) (соответствует ~ 68,9476 мПа). Микрофлюидизацию грубой суспензии проводили в режиме рециркуляции (с возвратом материала в питающий резервуар) при контролируемой (≤ 65 °C) температуре. Время обработки находилось в диапазоне 9-12 минут. Желаемый размер частиц (Z-среднее) составлял 60-70 нм.

Фильтрование тангенциальным потоком

[0397] Полупрозрачную наносуспензию собирали из микрофлюидизатора и подвергали фильтрованию тангенциальным потоком (TFF) с 15-20 Х объемами PBS, pH 7,4. Цель TFF состояла в том, чтобы заменить аммоний-оксалатный внешний буфер на PBS и в основном удалить аммоний из интралипосомального и внешнего пространства. Аммоний во внешнем буфере измеряли при помощи аммоний-специфичного электрода. TFF прекращали, когда концентрация аммония во внешнем буфере составляла≤3 мМ.

«Бесконтактная» загрузка митоксантрона

[0398] Митоксантрона гидрохлорид растворяли в физиологическом растворе до конечной концентрации 6 мг/мл. Физиологический раствор гидрохлорида митоксантрона добавляли к липосомальной наносуспензии в PBS с рН 7,4 до конечной концентрации 1 мг/мл, инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут и оставляли при температуре 2-8°С. После инкубации при температуре 2-8°C в течение 16 часов указанную смесь подвергали еще одному циклу TFF 5X с PBS pH 7,4, содержащим 6% сахарозы. Целью этого цикла TFF было вымывание свободного (не инкапсулированного) митоксантрона.

[0399] Затем липосомальную наносуспензию подвергали стерилизующему фильтрованию в стерильную колбу Nalgene через фильтр 0,22 мкм. Определяли размер частиц и pH. Стерильную наносуспензию асептически распределяли в предварительно стерилизованные флаконы объемом 2 мл, закупоривали и герметизировали. Флаконы хранили при температуре 2-8 °С.

Пример 13: Холодная загрузка митоксантрона в липосомы с фиксированным (50:1) соотношением липид/лекарственное средство.

[0400] Оксалат продемонстрировал способность облегчать загрузку доксорубицина и иринотекана в липосомы с соотношением липид/лекарственное средство 50:1. Поэтому в этом примере использовали оксалат (таблица 35).

Таблица 35. Состав композиции

Лот #	Гидратирующая среда	Количество твердых веществ, используемых в композициях, мас./мас., %
PC	DMPC	FC	P 188	Митоксантрона дигидрохлорид	Липид/лек. ср-во
647-2-97 B	Оксалат аммония	65,50	16,38	11,46	4,91	1,75	50

[0401] Готовили грубую суспензию и обрабатывали микрофлюидизацией (MF) при давлении 10 KPSI (тысяч фунтов на квадратный дюйм) (соответствует ~ 68,9476 мПа). После микрофлюидизации в течение 9-12 минут размер частиц (Z-среднее) достигал ~ 60-70 нм. Образец собирали и подвергали стерилизующему фильтрованию в стерильную колбу Nalgene. Определяли размер частиц в фильтрованной наносуспензии (Таблица 36).

Таблица 36. Сводка параметров микрофлюидизации и параметров полученной эмульсии.

Лот #	Противоион	MFD	Давление обработки, KPSI (тысячи фунтов на кв. дюйм)	Размер частиц Z средн., нм
647-2-97 B	Оксалат	11 марта 2016	10	65

[0402] Липосомы подвергали TFF с последующей «бесконтактной» загрузкой митоксантроном, затем проводили еще один цикл TFF с PBS с сахарозой. Концентрация митоксантрона гидрохлорида, используемая для дистанционной загрузки, составляла 1,0 мг/мл

[0403] Размер частиц липосом, загруженных митоксантроном, представлен в таблице 37.

Таблица 37. Размер частиц. Липосомы, загруженные митоксантроном.

Лот #	Противоион	Дата загрузки	Размер частиц Z средн., нм
647-2-97 B	Оксалат	15 марта 2016	67

[0404] Изучение высвобождения липосомального митоксантрона проводили в течение одной недели после изготовления. В каждый момент времени (0 и 24 часа) высвобождение митоксантрона из липосом оценивали визуальным наблюдением. Стоит отметить, что высвобождение митоксантрона из липосом было заметно медленнее по сравнению с доксорубицином и иринотеканом.

[0405] Поскольку исследование высвобождения митоксантрона продолжалось в течение 24 часов, размер частиц в инкубированных образцах определяли при T0 и T24, чтобы доказать, что целостность липосом не была нарушена. Из таблицы 37 видно, что после 24 часов инкубации 20-кратно разведенного образца при температуре 37°С не наблюдалось резкого изменения размера частиц или агрегации.

Таблица 38. Измерение размера частиц во время исследования высвобождения.

Лот #	Время	pH	Размер частиц Z средн., нм
647-2-97 B	0 часов	5	63
647-2-97 B	24 часа	70
647-2-97 B	0 часов	7	63
647-2-97 B	24 часа	69

Обсуждение

[0406] Размер частиц. Из таблиц 36 и 37 видно, что микрофлюидизация и загрузка митоксантроном привели к получению частиц сходных размеров, сопоставимых с доксорубицином (таблицы 16 и 17) и иринотеканом (таблицы 31 и 32).

[0407] Выделение липосомального митоксантрона. Изучение высвобождения лекарственного средства проводили в течение одной недели после изготовления (MFD). Стоит отметить, что PBS/физиологический раствор митоксантрона имеет интенсивный синий цвет, а при инкапсуляции в липосомы цвет меняется на фиолетовый. Как видно на фиг. 23А, в момент времени T0 цвет митоксантрона остается фиолетовым при рН 7,4 и 5, что свидетельствует об инкапсуляции митоксантрона. Когда в качестве противоиона использовали оксалат, цвет образца становился синим через 24 часа при рН 5,0, тогда как при рН 7,4 он оставался фиолетовым (фиг. 23В). Эти данные указывают на высвобождение митоксантрона из липосом при рН 5,0 и отсутствие высвобождения при рН 7,4.

[0408] Таким образом, в целом полученные данные демонстрируют влияние противоионов оксалата и тартрата, соотношения липид/лекарственное средство и условий загрузки лекарственного средства для возникновения предпочтительного физического состояния агрегатов интралипосомального доксорубицина, которое приводит к оптимальной разнице высвобождения ΔpH7,4/5,0 по меньшей мере в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения. Все эти факторы могут вносить вклад в эффективную pH-целевую доставку слабоосновных химиотерапевтических агентов в опухоль.

Краткое изложение экспериментальных результатов

[0409] В вариантах реализации настоящего изобретения идентификация подходящих противоионов оксалата и тартрата (например, предпочтительных противоионов в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения), которые могут образовывать интралипосомальные агрегаты фармацевтических солей со слабыми основаниями, подходящего соотношения липид/лекарственное средство (например, предпочтительный диапазон от 20:1 до 65:1 в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения) и соотношения PL/FC (например, предпочтительный диапазон от 1/1 до 4/1 в некоторых вариантах реализации) позволяет максимизировать разницу в высвобождении лекарственного средства между нейтральным и кислым pH и повысить липосомальную стабильность в сыворотке/крови для оптимальной pH-целевой доставки слабоосновных химиотерапевтических средств (для различных молекулярных мишеней) в опухоль. Заметное различие между in vitro характеристиками оксалатсодержащих или тартратсодержащих липосом и других протестированных противоионов убедительно свидетельствует об уникальности физического состояния (состояний) интралипосомальных доксорубицин-оксалатных или доксорубицин-тартратных агрегатов, которое, очевидно, облегчает их растворение в ответ на температуру и pH.

[0410] Из 15 протестированных противоионов только 5 (сульфат, оксалат, фосфат, тартрат и цитрат) способствовали «бесконтактной» загрузке доксорубицина и образованию стабильных липосом, содержащих соль доксорубицина. Другие 10 протестированных противоионов не приводили к загрузке доксорубицина в липосомы и вызывали осаждение липосомного материала при хранении в течение ночи при температуре 2-8°С.

[0411] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что только оксалат и тартрат дают доксорубицин-содержащие липосомы с желаемым рН-зависимым профилем высвобождения лекарственного средства (разница высвобождения ΔpH 7,4/5,0 или ΔpH 7,4/6,7/6,0/5,0) при температуре 37°C (температура тела). Следовательно, оксалат и тартрат были выбраны в качестве предпочтительных противоионов в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения.

[0412] Повышенная цитотоксичность доксорубицин-оксалатсодержащих липосом по сравнению с Doxil® (доксорубицин-сульфат) наблюдалась на двух линиях раковых клеток (клетки Дауди и Hela).

[0413] Повышенная безопасность и эффективность доксорубицин-оксалатсодержащих липосом по сравнению с Doxil® (доксорубицин-сульфат) наблюдалась в модели В-лимфомы у мышей.

[0414] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что оксалатсодержащие и тартратсодержащие липосомы могут эффективно и быстро инкапсулировать доксорубицин при комнатной температуре. Также неожиданно было обнаружено, что в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения загрузка доксорубицина при комнатной температуре (к.т.) в оксалатсодержащие и тартратсодержащие липосомы дополнительно улучшала (максимизировала) разницу высвобождения ΔpH 7,4/5,0 по сравнению с оксалат- и/или тартратсодержащими липосомами, загруженными при температуре 70°С. Другие температуры, которые можно использовать для «бесконтактной» загрузки доксорубицина в оксалатсодержащие липосомы, включают температуры от 2-8°C до 70°C с инкубацией в течение ночи при температуре 2-8°C или без нее.

[0415] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения цитрат был еще одним противоионом, с которым было обнаружено заметное улучшение разницы высвобождения ΔpH 7,4/5,0 при холодной загрузке доксорубицином. Напротив, загрузка при комнатной температуре не приводила к улучшению профиля высвобождения доксорубицина при использовании сульфата и/или фосфата в качестве противоионов. Другие температуры, которые можно использовать для «бесконтактной» загрузки доксорубицина в тартрат- и цитратсодержащие липосомы, включают температуры от 2-8°C до 70°C с инкубацией в течение ночи при температуре 2-8°C или без нее.

[0416] В вариантах реализации настоящего изобретения успешная лиофилизация доксорубицина в присутствии лактозы и/или маннита приводила к получению лиофилизированного материала, который легко восстанавливался в воде для инъекций при комнатной температуре до конечной концентрации до 6 мг/мл. В вариантах реализации настоящего изобретения смешивание лиофилизированного и восстановленного материала доксорубицина с обладающими новизной липосомами, содержащими оксалат и тартрат (предпочтительные противоионы в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения), приводило к эффективному и быстрому инкапсулированию доксорубицина при комнатной температуре. Полученный продукт продемонстрировал исключительную разницу высвобождения ΔpH 7,4/5,0 или ΔpH 7,4/6,7/6,0/5,0 в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения. В вариантах реализации настоящего изобретения эти выводы приводят к определенному формату представления продукта; продукт состоит из двух флаконов: флакона с лиофилизированным доксорубицином и флакона с липосомальной суспензией носителя. Смешивание (путем простого переворачивания) восстановленного содержимого двух флаконов при комнатной температуре даст конечный готовый к употреблению продукт в течение нескольких минут, это очень удобный состав для приготовления прямо у постели больного. Также рассматривается разработка лиофилизированного липосомального носителя.

[0417] В вариантах реализации настоящего изобретения влияние соотношения липид/лекарственное средство на достижение максимальной разницы высвобождения ΔpH 7,4/5,0 или ΔpH 7,4/6,7/6,0/5,0 и оптимальной стабильности в сыворотке/крови был продемонстрировано для обоих предпочтительных противоионов: оксалата и тартрата. В вариантах реализации настоящего изобретения также было неожиданно обнаружено, что липосомы демонстрировали большую разницу высвобождения ΔpH 7,4/5,0 или ΔpH 7,4/6,7/6,0/5,0 и повышенную стабильность в сыворотке/крови, когда соотношение липид/лекарственное средство было выше 20 (предпочтительный диапазон составляет 20:1-65:1). В вариантах реализации настоящего изобретения, когда соотношение липид/лекарственное средство составляло≤20, загрузка доксорубицином была плохой и происходила явная утечка доксорубицина из липосом. Другие соотношения, которые можно использовать, включают от 20:1 до 100:1. Проведенные исследования позволяют предполагать, что в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения соотношения липид/лекарственное средство, оптимальные для достижения максимальной разницы высвобождения для различных pH, находятся в диапазоне от 20:1 до 65:1. Другие соотношения, которые можно использовать, включают от 10:1 до 100:1. В вариантах реализации настоящего изобретения влияние определенного диапазона соотношений PL/FC (например, от 1/1 до 4/1) на оптимальную стабильность в сыворотке/крови и разницу высвобождения pH 7,4/6,7/6,0/5,0 было продемонстрирован для предпочтительного противоиона оксалата.

[0418] Применимость указанных противоионов и оптимизированного соотношения липид/лекарственное средство для достижения дифференцированного по рН профиля высвобождения лекарственного средства была продемонстрирована для -3 структурно различных слабоосновных терапевтических агентов для лечения рака: доксорубицин, иринотекан и митоксантрон. Другие соотношения, которые можно использовать, включают от 20:1 до 100:1.

[0419] Криотрансмиссонная электронная микроскопия (крио-ТЭМ) позволила обнаружить, что доксорубицин-оксалатные агрегаты, по-видимому, имеют некристаллическую природу и не образуют плотно упакованные пучки, наблюдаемые в тех случаях, когда в качестве противоионов используют сульфат, фосфат или цитрат. Этот результат указывает на уникальное физическое состояние интралипосомальных доксорубицин-оксалатных агрегатов по сравнению с доксорубицин-сульфатными, фосфатными и цитратными агрегатами и хорошо согласуется с наблюдаемой разницей в профилях высвобождения лекарственного средства.

[0420] В вариантах реализации настоящего изобретения слабая разница высвобождения ΔpH 7,4/5,0 наблюдалась при температуре 25°C для всех протестированных противоионов, в то время как при температуре 37°C наблюдалось резкое увеличение разницы высвобождения ΔpH7,4/5,0 с оксалатом или тартратом, но не с сульфатом, фосфатом или цитратом. Наблюдаемое различие в разности высвобождения ΔpH 7,4/5,0, определенное при температуре 25°С и 37°С может также указывать на более глубокие температурно-зависимые переходы в физическом состоянии доксорубицин-оксалатных или доксорубицин-тартратных интралипосомальных агрегатов по сравнению с доксорубицин-сульфатными, доксорубицин-фосфатными или доксорубицин-цитратными по меньшей мере в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения.

[0421] В вариантах реализации настоящего изобретения добавление P188 к липосомальной композиции не оказывало какого-либо значительного влияния на размер частиц, эффективность инкапсуляции доксорубицина и профиль высвобождения доксорубицина по сравнению с липосомальной композицией, полученной без P188. Тем не менее, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения P188 применяли в липосомальных композициях из-за его возможного полезного влияния на биологическую эффективность липосом, загруженных лекарственным средством [10-11, 16-19].

[0422] В вариантах реализации настоящего изобретения дополнение предпочтительных противоионов оксалата и/или тартрата аскорбиновой кислотой (например, AA/оксалат - 1:8 или 1:3) и/или NAC (например, NAC/оксалат - 1:3) и/или аскорбилпальмитатом (например, AP/оксалат - 1:150 или 1:15), и/или CoQ10 (например, CoQ10/оксалат - 1:300), и/или ЭДТА (например, ЭДТА/оксалат - 1:150) не оказывало значительного отрицательного влияния на профиль высвобождения доксорубицина по сравнению с липосомами, содержащими только оксалат или тартрат. Эти данные позволили в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения применять аскорбиновую кислоту, и/или NAC, и/или аскорбилпальмитат, и/или CoQ10, и/или ЭДТА в сочетании с оксалатом или тартратом. В вариантах реализации настоящего изобретения цитрат можно использовать с любыми вышеперечисленными хелаторами в любом соотношении. В вариантах реализации настоящего изобретения добавление антиоксидантов и/или хелаторов может облегчить окислительный стресс во время обработки липосом и, следовательно, может быть полезным для обеспечения стабильности конечного продукта. Кроме того, в вариантах реализации настоящего изобретения комбинация оптимизированной разницы высвобождения ΔpH7,4/5,0 и антиоксиданта (антиоксидантов) и/или хелаторов может быть благоприятной для биологической эффективности конечного продукта. Было показано, что аскорбиновая кислота, NAC и ЭДТА оказывают кардиозащитное действие, снижая токсичность, вызванную доксорубицином [28-29, 33, 36-37]. В вариантах реализации настоящего изобретения можно использовать другие соотношения AP к оксалату или тартрату, составляющие от 1:300 до 1:10. Другие соотношения CoQ10 к оксалату или тартрату, которые можно использовать, включают от 1:300 до 1:10. Другие соотношения ЭДТА к оксалату или тартрату, которые можно использовать, включают от 1:300 до 1:5. Другие противоионы и/или антиоксиданты, и/или хелаторы, которые могут обеспечивать преимущества и/или которые можно применять в комбинации с оксалатом и/или тартратом, включают цитрат, и/или фитат, и/или глутатион, и/или витамин Е, и/или дексразоксан, и/или дефероксамин.

[0423] В вариантах реализации настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что структурно отличающиеся друг от друга химиотерапевтические агенты иринотекан и митоксантрон (таблица 2) демонстрировали сходный с доксорубицином pH-дифференцированный профиль высвобождения при использовании оксалата и/или тартрата в качестве противоиона при соотношении липид/лекарственное средство 50: 1 (другие соотношения, которые можно применять: от 20:1 до 100:1). Следует отметить, что доксорубицин, иринотекан и митоксантрон являются слабыми основаниями (таблица 2). Таким образом, в вариантах реализации настоящего изобретения основность химиотерапевтических агентов, надлежащие противоионы, оптимальное соотношение липид/лекарственное средство и условия загрузки могут способствовать pH-дифференцированному высвобождению лекарственного средства и эффективной доставке слабоосновных химиотерапевтических агентов (таблица 3) в опухоль.

[0424] В вариантах реализации настоящего изобретения высвобождение доксорубицина или иринотекана из сульфатсодержащих, фосфатсодержащих или цитратсодержащих липосом показало зависимость от значения pKa1 соответствующего противоиона. Однако высвобождение доксорубицина или иринотекана из оксалатсодержащих или тартратсодержащих (предпочтительные противоионы в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения) липосом не коррелируют со значениями pKa1 тестируемых противоионов. Эти данные могут свидетельствовать о влиянии уникального физического состояния доксорубицин-оксалатных и/или доксорубицин-тартратных интралипосомальных агрегатов на профили высвобождения доксорубицина и согласуются с данными анализа доксорубицин-оксалатсодержащих липосом методом С-TEM.

ВАРИАНТЫ РЕАЛИЗАЦИИ

Вариант реализации 1

[0425] Фармацевтическая композиция, содержащая липосому, содержащую слабоосновное противоопухолевое соединение и кислоту или соль указанного соединения, при этом указанная кислота представляет собой щавелевую кислоту или винную кислоту.

Вариант реализации 2

[0426] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 1, отличающаяся тем, что указанное слабоосновное противоопухолевое соединение представляет собой доксорубицин, иринотекан, митоксантрон или их комбинацию.

Вариант реализации 3

[0427] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 1 или 2, отличающаяся тем, что указанная липосома содержит полоксамер.

Вариант реализации 4

[0428] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 3, отличающаяся тем, что указанный полоксамер представляет собой полоксамер 188.

Вариант реализации 5

[0429] Фармацевтическая композиция согласно вариантам реализации 1-3, отличающаяся тем, что указанная липосома содержит множество липидных соединений, и массовое соотношение указанного множества липидов к указанному слабоосновному противоопухолевому соединению составляет по меньшей мере 20/1.

Вариант реализации 6

[0430] Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов реализации 1-3, отличающаяся тем, что указанная липосома содержит множество липидных соединений, и массовое соотношение указанного множества липидов к указанному слабоосновному противоопухолевому соединению составляет от примерно 20/1 до примерно 100/1.

Вариант реализации 7

[0431] Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов реализации 1-3, отличающаяся тем, что указанная липосома содержит множество липидных соединений, и массовое соотношение указанного множества липидов к указанному слабоосновному противоопухолевому соединению составляет от 20/1 до примерно 50/1.

Вариант реализации 8

[0432] Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов реализации 1-7, отличающаяся тем, что указанное слабоосновное противоопухолевое соединение по существу высвобождается из липосомы при кислом pH.

Вариант реализации 9

[0433] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 8, отличающаяся тем, что по меньшей мере 40% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН 5 в стандартных условиях анализа и менее 5% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН 7,4 в стандартных условиях анализа.

Вариант реализации 10

[0434] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 8, отличающаяся тем, что по меньшей мере 80% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН 5 в стандартных условиях анализа и менее 5% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН 7,4 в стандартных условиях анализа.

Вариант реализации 11

[0435] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 9, отличающаяся тем, что стандартные условия анализа включают 20-кратное разведение в буфере PBS с pH 6,7 или pH 5, и инкубацию при температуре 25°C или 37°C в течение 2, 4 или 8 часов.

Вариант реализации 12

[0436] Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов реализации 1-11, отличающаяся тем, что указанная липосома является по существу сферической.

Вариант реализации 13

[0437] Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов реализации 1-12, содержащая множество липосом со средним наибольшим размером примерно 60-80 нм, определяемым как усредненные по интенсивности диаметры частиц (Z-среднее) при измерении с помощью динамического рассеяния света.

Вариант реализации 14

[0438] Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов реализации 1-12, содержащая множество липосом со средним наибольшим размером примерно 10-30 нм, определяемым по количественным диаметрам частиц при измерении с помощью динамического рассеяния света.

Вариант реализации 15

[0439] Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов реализации 1-12, содержащая множество липосом со средним наибольшим размером 10-30 нм, определенным с помощью криотрансмиссионной электронной микроскопии.

Вариант реализации 16

[0440] Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов реализации 1-14, отличающаяся тем, что указанная липосома содержит примерно 500-1000 мкг/мл указанного слабоосновного противоопухолевого соединения и кислоты или соли указанного соединения.

Вариант реализации 17

[0441] Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов реализации 1-14, отличающаяся тем, что указанная липосома содержит примерно 700-850 мкг/мл указанного слабоосновного противоопухолевого соединения и кислоты или соли указанного соединения.

Вариант реализации 18

[0442] Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов реализации 1 -17, отличающаяся тем, что указанная липосома содержит множество указанного слабоосновного противоопухолевого соединения, образующего неупорядоченный некристаллический агрегат.

Вариант реализации 19

[0443] Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов реализации 1-18, отличающаяся тем, что указанная липосома содержит множество указанного слабоосновного противоопухолевого соединения и сохраняет более чем 90% от указанного множества слабоосновного противоопухолевого соединения после 40 дней при хранении при температуре 2-8°C в стандартных условиях хранения.

Вариант реализации 20

[0444] Фармацевтическая композиция согласно вариантам реализации 1-2 или 4-19, отличающаяся тем, что указанная липосома не содержит холестерин или полоксамер 188.

Вариант реализации 21

[0445] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 1, отличающаяся тем, что указанная липосома не содержит кислое органическое соединение, отличное от щавелевой кислоты, винной кислоты или их солей.

Вариант реализации 22

[0446] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 1-21, отличающаяся тем, что указанная загруженная лекарственным средством липосома получена путем загрузки указанного слабоосновного противоопухолевого соединения в незагруженную липосому, содержащую инкапсулированную кислоту или соль указанного соединения, с последующей инкубацией при комнатной температуре.

Вариант реализации 23

[0447] Способ получения липосомы, содержащей слабоосновное противоопухолевое соединение и кислоту или соль указанного соединения, при этом указанная кислота представляет собой щавелевую кислоту или винную кислоту, включающий

смешивание раствора указанного слабоосновного противоопухолевого соединения с суспензией, содержащей липосомы, содержащие инкапсулированную кислоту или соль указанного соединения; и

инкубирование указанного раствора слабоосновного противоопухолевого соединения с суспензией, содержащей липосомы, содержащие инкапсулированную кислоту или соль указанного соединения.

Вариант реализации 24

[0448] Способ согласно варианту реализации 23, отличающийся тем, что в липосомах удерживается примерно 85-100% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения, применяемого для смешивания с суспензией, содержащей липосомы, содержащие инкапсулированную кислоту или соль указанного соединения.

Вариант реализации 25

[0449] Способ согласно варианту реализации 23, отличающийся тем, что в липосомах удерживается примерно 95-100% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения, применяемого для смешивания с суспензией, содержащей липосомы, содержащие инкапсулированную кислоту или соль указанного соединения.

Вариант реализации 26

[0450] Способ согласно любому из вариантов реализации 23 -26, отличающийся тем, что указанную стадию инкубации проводят при комнатной температуре.

Вариант реализации 27

[0451] Способ согласно варианту реализации 25, отличающийся тем, что указанная стадия инкубации длится примерно 10-30 минут.

Вариант реализации 28

[0452] Способ согласно варианту реализации 25, отличающийся тем, что указанная стадия инкубации длится примерно 5-25 минут.

Вариант реализации 29

[0453] Набор, содержащий первый флакон, содержащий слабоосновное противоопухолевое соединение, и второй флакон, содержащий суспензию, содержащую липосомы, содержащие инкапсулированную кислоту или соль указанного соединения.

Вариант реализации 30

[0454] Набор согласно варианту реализации 29, отличающийся тем, что указанное слабоосновное противоопухолевое соединение в указанном первом флаконе представляет собой лиофилизированное слабоосновное противоопухолевое соединение.

Вариант реализации 31

[0455] Набор согласно варианту реализации 29, отличающийся тем, что указанная суспензия липосом в указанном втором флаконе представляет собой водную суспензию липосом, содержащих инкапсулированную кислоту или соль указанного соединения.

Вариант реализации 32

[0456] Способ применения набора согласно любому из вариантов реализации 28-31, включающий смешивание содержимого указанного первого контейнера с содержимым указанного второго контейнера.

Вариант реализации 33

[0457] Способ согласно варианту реализации 32, отличающийся тем, что указанное смешивание проводят при комнатной температуре.

Вариант реализации 34

[0458] Способ согласно любому из вариантов реализации 23 -25, отличающийся тем, что указанную стадию инкубации проводят при комнатной температуре, а затем проводят инкубацию при температуре 2-8°C.

Вариант реализации 35

[0459] Способ согласно варианту реализации 34, отличающийся тем, что указанная стадия инкубации при комнатной температуре длится примерно 10-30 минут.

Вариант реализации 36

[0460] Способ согласно любому из вариантов реализации 34, отличающийся тем, что указанная стадия инкубации при температуре 2-8°C длится примерно 60-960 минут.

Вариант реализации 37

[0461] Способ согласно любому из вариантов реализации 23-35, отличающийся тем, что указанную стадию инкубации проводят при температуре 70°C.

Вариант реализации 38

[0462] Способ согласно варианту реализации 37, отличающийся тем, что указанная стадия инкубации длится примерно 10-30 минут.

Вариант реализации 39

[0463] Способ получения липосомы, содержащей слабоосновное противоопухолевое соединение и кислоту или соль указанного соединения, при этом указанная кислота представляет собой лимонную кислоту, включающий

смешивание раствора указанного слабоосновного противоопухолевого соединения с суспензией, содержащей липосомы, содержащие инкапсулированную кислоту или соль указанного соединения; и

инкубирование указанного раствора слабоосновного противоопухолевого соединения с суспензией, содержащей липосомы, содержащие инкапсулированную кислоту или соль указанного соединения.

Вариант реализации 40

[0464] Фармацевтическая композиция, содержащая липосому, содержащую слабоосновное противоопухолевое соединение и кислоту или соль указанного соединения, при этом указанная кислота представляет собой лимонную кислоту, указанная липосома содержит множество липидных соединений и массовое соотношение указанного множества липидов к указанному слабоосновному противоопухолевому соединению составляет по меньшей мере 20/1.

Вариант реализации 41

[0465] Фармацевтическая композиция, содержащая липосому, содержащую слабоосновное противоопухолевое соединение и кислоту или соль указанного соединения, при этом указанная кислота представляет собой щавелевую кислоту или винную кислоту.

Вариант реализации 42

[0466] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что указанное слабоосновное противоопухолевое соединение представляет собой доксорубицин, иринотекан, митоксантрон или их комбинацию.

Вариант реализации 43

[0467] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что указанная липосома содержит полоксамер.

Вариант реализации 44

[0468] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 43, отличающаяся тем, что указанный полоксамер представляет собой полоксамер 188.

Вариант реализации 45

[0469] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что указанная липосома содержит множество липидов, и массовое соотношение указанных липидов к указанному слабоосновному противоопухолевому соединению и кислоте или соли указанного соединения составляет по меньшей мере 10/1.

Вариант реализации 46

[0470] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что указанная липосома содержит множество липидов, и массовое соотношение указанных липидов к указанному слабоосновному противоопухолевому соединению и кислоте или соли указанного соединения составляет от примерно 10/1 до примерно 100/1.

Вариант реализации 47

[0471] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что указанная липосома содержит множество липидов, и массовое соотношение указанных липидов к указанному слабоосновному противоопухолевому соединению и кислоте или соли указанного соединения составляет от 20/1 до примерно 50/1.

Вариант реализации 48

[0472] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что указанная липосома содержит множество свободных холестеринов.

Вариант реализации 49

[0473] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что указанная липосома содержит множество фосфолипидов.

Вариант реализации 50

[0474] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 48, содержащая фосфолипиды, и молярное соотношение указанных фосфолипидов к свободным холестеринам составляет по меньшей мере 0,5/1.

Вариант реализации 51

[0475] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 48, содержащая фосфолипиды, и молярное соотношение указанных фосфолипидов к свободным холестеринам составляет по меньшей мере от 0,5/1 до примерно 4/1.

Вариант реализации 52

[0476] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 48, содержащая фосфолипиды, и молярное соотношение указанных фосфолипидов к указанным свободным холестеринам находится в диапазоне от примерно 0,86:1 до примерно 3,68:1.

Вариант реализации 53

[0477] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что указанное слабоосновное противоопухолевое соединение по существу высвобождается из липосомы при рН < 7,4.

Вариант реализации 54

[0478] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что по меньшей мере 40% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН 5 в стандартных условиях анализа.

Вариант реализации 55

[0479] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что менее чем 5% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН 7,4 в стандартных условиях анализа.

Вариант реализации 56

[0480] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что по меньшей мере 80% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН 5 в стандартных условиях анализа.

Вариант реализации 57

[0481] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что по меньшей мере 10% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН примерно 6,0 в стандартных условиях анализа.

Вариант реализации 58

[0482] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что по меньшей мере 50% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН 6,0 в стандартных условиях анализа.

Вариант реализации 59

[0483] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что по меньшей мере 7% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН 6,7 в стандартных условиях анализа.

Вариант реализации 60

[0484] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что по меньшей мере 30% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН 6,7 в стандартных условиях анализа.

Вариант реализации 61

[0485] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что указанная липосома содержит множество слабоосновных противоопухолевых соединений и сохраняет более чем 35-50% от указанного множества слабоосновных противоопухолевых соединений в течение примерно 8 часов инкубации в сыворотке крови или крови при тестировании в стандартных условиях анализа.

Вариант реализации 62

[0486] Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов реализации 54-61, отличающаяся тем, что указанные стандартные условия анализа включают 20-кратное или 50-кратное разведение указанных липосом в буфере PBS.

Вариант реализации 63

[0487] Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов реализации 54 -61, отличающаяся тем, что указанные стандартные условия анализа включают инкубацию при рН 7,4, рН 6,7, рН 6,0 или рН 5,0.

Вариант реализации 64

[0488] Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов реализации 54 -61, отличающаяся тем, что указанные стандартные условия анализа включают инкубацию при температуре примерно 25°C или примерно 37 °C.

Вариант реализации 65

[0489] Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов реализации 14-21, отличающаяся тем, что указанные стандартные условия анализа включают инкубацию в течение примерно 2, примерно 4 или примерно 8 часов.

Вариант реализации 66

[0490] Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов реализации 54-61, отличающаяся тем, что указанные стандартные условия анализа включают 50-кратное разведение указанных липосом в сыворотке крови или крови и инкубацию при температуре 37 °С в течение 2, 4 или 8 часов при физиологическом рН (рН 7,4).

Вариант реализации 67

[0491] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что указанная липосома является по существу сферической.

Вариант реализации 68

[0492] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, содержащая множество липосом со средним наибольшим размером примерно 60-80 нм, определяемым как усредненные по интенсивности диаметры частиц (Z-среднее) при измерении с помощью динамического рассеяния света.

Вариант реализации 69

[0493] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, содержащая множество липосом со средним наибольшим размером примерно 10-30 нм, определяемым по количественным диаметрам частиц при измерении с помощью динамического рассеяния света.

Вариант реализации 70

[0494] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, содержащая множество липосом со средним наибольшим размером 10-30 нм, определенным с помощью криотрансмиссионной электронной микроскопии.

Вариант реализации 71

[0495] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что указанная липосома содержит примерно 500-1000 мкг/мл указанного слабоосновного противоопухолевого соединения и кислоты или соли указанного соединения.

Вариант реализации 72

[0496] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что указанная липосома содержит примерно 700-850 мкг/мл указанного слабоосновного противоопухолевого соединения и кислоты или соли указанного соединения.

Вариант реализации 73

[0497] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что указанная липосома содержит множество указанного слабоосновного противоопухолевого соединения, образующего неупорядоченный некристаллический агрегат.

Вариант реализации 74

[0498] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что указанная липосома содержит множество указанного слабоосновного противоопухолевого соединения и сохраняет более чем 90% от указанного множества слабоосновного противоопухолевого соединения после 40 дней при хранении при температуре 2-8°C в стандартных условиях хранения.

Вариант реализации 75

[0499] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что указанная липосома не содержит холестерин или полоксамер 188.

Вариант реализации 76

[0500] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что указанная липосома не содержит кислое органическое соединение, отличное от щавелевой кислоты, винной кислоты или их солей.

Вариант реализации 77

[0501] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что указанная липосома не содержит указанное слабоосновное противоопухолевое соединение и кислоту или соль указанного соединения, отличные от щавелевой кислоты, винной кислоты или их солей.

Вариант реализации 78

[0502] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что указанная липосома, содержащая указанное слабоосновное противоопухолевое соединение и кислоту или соль указанного соединения, получена путем загрузки указанного слабоосновного противоопухолевого соединения в незагруженную липосому, содержащую инкапсулированную кислоту или соль указанного соединения, с последующей инкубацией при комнатной температуре.

Вариант реализации 79

[0503] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 38, отличающаяся тем, что указанная незагруженная липосома после 180 и/или 540 дней хранения при температуре 2-8 °С в стандартных условиях хранения сохраняет более 90% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения и кислоты или соли указанного соединения после загрузки.

Вариант реализации 80

[0504] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 39, отличающаяся тем, что примерно 40-80% загруженного указанного слабоосновного противоопухолевого соединения и кислоты или соли указанного соединения высвобождается из указанной липосомы при рН 5,0 в стандартных условиях анализа.

Вариант реализации 81

[0505] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 39, отличающаяся тем, что примерно 20-60% загруженного указанного слабоосновного противоопухолевого соединения и кислоты или соли указанного соединения высвобождается из указанной липосомы при рН 6,0 в стандартных условиях анализа.

Вариант реализации 82

[0506] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 39, отличающаяся тем, что примерно 7-30% загруженного указанного слабоосновного противоопухолевого соединения и кислоты или соли указанного соединения высвобождается из указанной липосомы при рН 6,7 в стандартных условиях анализа.

Вариант реализации 83

[0507] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 39, отличающаяся тем, что менее 5% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения и кислоты или соли указанного соединения высвобождается из указанной липосомы при рН 7,4 в стандартных условиях анализа.

Вариант реализации 84

[0508] Фармацевтическая композиция согласно п. 41, дополнительно содержащая соединение, выбранное из группы, состоящей из аскорбиновой кислоты (AA), N-ацетилцистеина (NAC), аскорбилпальмитата (AP), убихинона (CoQ10) и этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).

Вариант реализации 85

[0509] Способ получения липосомы, содержащей слабоосновное противоопухолевое соединение и кислоту или соль указанного соединения, при этом указанная кислота представляет собой щавелевую кислоту или винную кислоту, включающий

смешивание раствора, содержащего слабоосновное противоопухолевое соединение, с суспензией, содержащей множество липосом, где каждая из указанных липосом содержит щавелевую кислоту или винную кислоту или их соли.

Вариант реализации 86

[0510] Способ согласно варианту реализации 85, дополнительно включающий инкубацию указанного раствора и указанной суспензии.

Вариант реализации 87

[0511] Способ согласно варианту реализации 85, отличающийся тем, что примерно 85-100% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения инкорпорировано в указанное множество липосом после указанного смешивания.

Вариант реализации 88

[0512] Способ согласно варианту реализации 85, отличающийся тем, что примерно 95-100% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения инкорпорировано в указанное множество липосом после указанного смешивания.

Вариант реализации 89

[0513] Способ согласно варианту реализации 86, отличающийся тем, что указанную стадию инкубации проводят при комнатной температуре.

Вариант реализации 90

[0514] Способ согласно варианту реализации 89, отличающийся тем, что указанная стадия инкубации длится примерно 10-30 минут.

Вариант реализации 91

[0515] Способ согласно варианту реализации 89, отличающийся тем, что указанная стадия инкубации длится примерно 5-25 минут.

Вариант реализации 92

[0516] Способ согласно варианту реализации 85, отличающийся тем, что указанную стадию инкубации проводят при комнатной температуре (к.т.), а затем проводят инкубацию при температуре 2-8°C.

Вариант реализации 93

[0517] Способ согласно варианту реализации 92, отличающийся тем, что указанная стадия инкубации при комнатной температуре длится примерно 10-30 минут.

Вариант реализации 94

[0518] Способ согласно варианту реализации 92, отличающийся тем, что указанная стадия инкубации при температуре 2-8°C длится примерно 60-960 минут.

Вариант реализации 95

[0519] Способ согласно варианту реализации 86, отличающийся тем, что указанную стадию инкубации проводят при температуре 70°C.

Вариант реализации 96

[0520] Способ согласно варианту реализации 95, отличающийся тем, что указанная стадия инкубации длится примерно 10-30 минут.

Вариант реализации 97

[0521] Набор, содержащий первый контейнер, содержащий слабоосновное противоопухолевое соединение, и второй контейнер, содержащий суспензию, содержащую множество липосом, где каждая из указанного множества липосом содержит кислоту или соль указанного слабоосновного противоопухолевого соединения, где кислота представляет собой щавелевую кислоту или винную кислоту.

Вариант реализации 98

[0522] Набор согласно варианту реализации 97, отличающийся тем, что указанное слабоосновное противоопухолевое соединение представляет собой лиофилизированное слабоосновное противоопухолевое соединение.

Вариант реализации 99

[0523] Набор согласно варианту реализации 97, отличающийся тем, что указанная суспензия представляет собой водную суспензию.

Вариант реализации 100

[0524] Способ применения набора согласно варианту реализации 97, включающий смешивание содержимого указанного первого контейнера с содержимым указанного второго контейнера.

Вариант реализации 101

[0525] Способ согласно варианту реализации 100, отличающийся тем, что указанное смешивание проводят при комнатной температуре.

Вариант реализации 102

[0526] Способ получения липосомы, содержащей слабоосновное противоопухолевое соединение и кислоту или соль указанного соединения, при этом указанная кислота представляет собой лимонную кислоту, включающий

смешивание раствора, содержащего указанное слабоосновное противоопухолевое соединение, с суспензией, содержащей множество липосом, где каждая из указанного множества липосом содержит кислоту или соль указанного соединения.

Вариант реализации 103

[0527] Способ согласно варианту реализации 102, дополнительно включающий инкубацию указанного раствора с указанной суспензией.

Вариант реализации 104

[0528] Способ согласно варианту реализации 102, отличающийся тем, что указанную стадию инкубации проводят при комнатной температуре.

Вариант реализации 105

[0529] Способ согласно варианту реализации 104, отличающийся тем, что указанная стадия инкубации длится примерно 10-30 минут.

Вариант реализации 106

[0530] Способ согласно варианту реализации 104, отличающийся тем, что указанная стадия инкубации длится примерно 5-25 минут.

Вариант реализации 107

[0531] Способ согласно варианту реализации 103, отличающийся тем, что указанную стадию инкубации проводят при комнатной температуре (к.т.), а затем проводят инкубацию при температуре 2-8 °C

Вариант реализации 108

[0532] Способ согласно варианту реализации 107, отличающийся тем, что указанная стадия инкубации при комнатной температуре длится примерно 10-30 минут.

Вариант реализации 109

[0533] Способ согласно варианту реализации 107, отличающийся тем, что указанная стадия инкубации при температуре 2-8°C длится примерно 60-960 минут.

Вариант реализации 110

[0534] Способ согласно варианту реализации 103, отличающийся тем, что указанную стадию инкубации проводят при температуре 70°C.

Вариант реализации 111

[0535] Способ согласно варианту реализации 110, отличающийся тем, что указанная стадия инкубации длится примерно 10-30 минут.

Вариант реализации 112

[0536] Фармацевтическая композиция, содержащая липосому, содержащую слабоосновное противоопухолевое соединение и кислоту или соль указанного соединения, при этом указанная кислота представляет собой лимонную кислоту.

Вариант реализации 113

[0537] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 112, отличающаяся тем, что указанная липосома содержит множество липидов, и массовое соотношение указанного множества липидов к указанному слабоосновному противоопухолевому соединению и кислоте или соли указанного соединения составляет по меньшей мере 10/1.

Вариант реализации 114

[0538] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 112, отличающаяся тем, что указанная липосома содержит множество свободных холестеринов.

Вариант реализации 115

[0539] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 114, отличающаяся тем, что указанная липосома содержит фосфолипиды, при этом молярное соотношение указанных фосфолипидов к указанным свободным холестеринам составляет по меньшей мере 1:1.

Вариант реализации 116

[0540] Фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 112, дополнительно содержащая соединение, выбранное из группы, состоящей из аскорбиновой кислоты (AA), N-ацетилцистеина (NAC), аскорбилпальмитата (AP), убихинона (CoQ10) и этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).

Вариант реализации 117

[0541] Способ лечения рака у субъекта, включающий:

введение эффективного количества фармацевтической композиции согласно варианту реализации 40 субъекту, нуждающемуся в указанном лечении.

Вариант реализации 118

[0542] Способ согласно варианту реализации 117, отличающийся тем, что указанное слабоосновное противоопухолевое соединение представляет собой доксорубицин, иринотекан, митоксантрон или их комбинацию.

Вариант реализации 119

[0543] Способ согласно варианту реализации 117, отличающийся тем, что указанная липосома содержит полоксамер.

Вариант реализации 120

[0544] Способ согласно варианту реализации 117, отличающийся тем, что указанный полоксамер представляет собой полоксамер 188.

Вариант реализации 121

[0545] Способ согласно варианту реализации 117, отличающийся тем, что указанная липосома содержит липиды, и массовое соотношение указанных липидов к указанному слабоосновному противоопухолевому соединению составляет по меньшей мере 10/1.

Вариант реализации 122

[0546] Способ согласно варианту реализации 117, отличающийся тем, что указанная липосома содержит липиды, и массовое соотношение указанных липидов к указанному слабоосновному противоопухолевому соединению составляет от примерно 10/1 до примерно 100/1.

Вариант реализации 123

[0547] Способ согласно варианту реализации 117, отличающийся тем, что указанная липосома содержит множество липидов, и массовое соотношение указанных липидов к указанному слабоосновному противоопухолевому соединению составляет от примерно 20/1 до примерно 50/1.

Вариант реализации 124

[0548] Способ согласно варианту реализации 117, отличающийся тем, что указанная липосома содержит множество свободных холестеринов.

Вариант реализации 125

[0549] Способ согласно варианту реализации 117, отличающийся тем, что указанная липосома содержит множество фосфолипидов.

Вариант реализации 126

[0550] Способ согласно варианту реализации 125, отличающийся тем, что указанная липосома содержит фосфолипиды, и молярное соотношение указанных фосфолипидов к указанным свободным холестеринам составляет по меньшей мере 0,5/1.

Вариант реализации 127

[0551] Способ согласно варианту реализации 125, отличающийся тем, что указанная липосома содержит фосфолипиды, и молярное соотношение указанных фосфолипидов к указанным свободным холестеринам составляет по меньшей мере от 0,5/1 до примерно 4/1.

Вариант реализации 128

[0552] Способ согласно варианту реализации 125, отличающийся тем, что указанная липосома содержит фосфолипиды, и молярное соотношение указанных фосфолипидов к указанным свободным холестеринам находится в диапазоне от примерно 0,86/1 до примерно 3,68/1.

Вариант реализации 129

[0553] Способ согласно варианту реализации 117, отличающийся тем, что указанное слабоосновное противоопухолевое соединение по существу высвобождается из липосомы при рН < 7,4.

Вариант реализации 130

[0554] Способ согласно варианту реализации 117, отличающийся тем, что по меньшей мере 40% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН 5 в стандартных условиях анализа.

Вариант реализации 131

[0555] Способ согласно варианту реализации 117, отличающийся тем, что менее 5% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН 7,4 в стандартных условиях анализа.

Вариант реализации 132

[0556] Способ согласно варианту реализации 117, отличающийся тем, что по меньшей мере 80% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН 5 в стандартных условиях анализа.

Вариант реализации 132

[0557] Способ согласно варианту реализации 117, отличающийся тем, что по меньшей мере 10% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН примерно 6,0 в стандартных условиях анализа.

Вариант реализации 134

[0558] Способ согласно варианту реализации 117, отличающийся тем, что по меньшей мере 50% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН 6,0 в стандартных условиях анализа.

Вариант реализации 135

[0559] Способ согласно варианту реализации 117, отличающийся тем, что по меньшей мере 7% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН 6,7 в стандартных условиях анализа.

Вариант реализации 136

[0560] Способ согласно варианту реализации 117, отличающийся тем, что по меньшей мере 30% указанного слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН 6,7 в стандартных условиях анализа.

Вариант реализации 137

[0561] Способ согласно варианту реализации 117, отличающийся тем, что указанная липосома содержит множество слабоосновных противоопухолевых соединений и сохраняет более чем 35-50% от указанного множества слабоосновных противоопухолевых соединений в течение примерно 8 часов инкубации в сыворотке крови или крови при тестировании в стандартных условиях анализа.

Вариант реализации 138

[0562] Способ согласно любому из вариантов реализации 130-137, отличающийся тем, что указанные стандартные условия анализа включают 20-кратное или 50-кратное разведение указанных липосом в буфере PBS.

Вариант реализации 139

[0563] Способ согласно любому из вариантов реализации 130 -137, отличающийся тем, что указанные стандартные условия анализа включают инкубацию при рН 7,4, рН 6,7, рН 6,0 или рН 5,0.

Вариант реализации 140

[0564] Способ согласно любому из вариантов реализации 130-137, отличающийся тем, что указанные стандартные условия анализа включают инкубацию при температуре примерно 25°C или примерно 37 °C.

Вариант реализации 141

[0565] Способ согласно любому из вариантов реализации 130-137, отличающийся тем, что указанные стандартные условия анализа включают инкубацию в течение примерно 2, примерно 4 или примерно 8 часов.

Вариант реализации 142

[0566] Способ согласно любому из вариантов реализации 130-137, отличающийся тем, что указанные стандартные условия анализа включают 50-кратное разведение указанных липосом в сыворотке крови или крови и инкубацию при температуре 37 °С в течение 2, 4 или 8 часов при физиологическом рН (рН 7,4).

Вариант реализации 143

[0567] Способ согласно варианту реализации 117, отличающийся тем, что указанная липосома является по существу сферической.

Вариант реализации 144

[0568] Способ согласно варианту реализации 117, отличающийся тем, что указанная липосома содержит примерно 500-1000 мкг/мл указанного слабоосновного противоопухолевого соединения и кислоты или соли указанного соединения.

Вариант реализации 145

[0569] Способ согласно варианту реализации 117, отличающийся тем, что указанная липосома содержит примерно 700-850 мкг/мл указанного слабоосновного противоопухолевого соединения и кислоты или соли указанного соединения.

Вариант реализации 146

[0570] Способ согласно варианту реализации 117, отличающийся тем, что указанная липосома содержит множество указанного слабоосновного противоопухолевого соединения, образующего неупорядоченный некристаллический агрегат.

Вариант реализации 147

[0571] Способ согласно варианту реализации 117, отличающийся тем, что указанная липосома не содержит холестерин или полоксамер 188.

Вариант реализации 148

[0572] Способ согласно варианту реализации 117, отличающийся тем, что указанная липосома не содержит кислое органическое соединение, отличное от щавелевой кислоты, винной кислоты или их солей.

Вариант реализации 149

[0573] Способ согласно варианту реализации 117, отличающийся тем, что указанная липосома не содержит указанное слабоосновное противоопухолевое соединение и кислоту или соль указанного соединения, отличные от щавелевой кислоты, винной кислоты или их солей.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Robert J. Lee, Susan Wang, Mary Jo Turk, and Philip S. Low. The Effects of pH and Intraliposomal Buffer Strength on the Rate of Liposome Content Release and Intracellular Drug Delivery. 1998. Bioscience Reports, Vol. 18, No. 2, 69-78.

2. A. Gabizon, R. Catane, B. Uziely, B. Kaufman, T. Safra, R. Cohen, F.Martin, A. Huang, Y. Barenholz, Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. 1994. Cancer Res. 54, 987-992.

3. H. Maeda, J. Wu, T. Sawa, Y. Matsumura, K. Hori, Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. 2000. J. Control. Release 65, 271-284.

4. A.A. Gabizon, O. Lyass, G.J. Berry, M. Wildgust, Cardiac safety of pegylated liposomal doxorubicin (Doxil/Caelyx) demonstrated by endomyocardial biopsy in patients with advanced malignancies. 2004. Cancer Invest. 22, 663-669.

5. Gabizon, Cardiac safety of liposomal anthracyclines, Semin. Oncol. 2004. 31, 161-181.

6. E. Rivera, V. Valero, F.J. Esteva, L. Syrewicz, M. Cristofanilli, Z. Rahman, D.J. Booser, G.N. Hortobagyi, Lack of activity of stealth liposomal doxorubicin in the treatment of patients with anthracycline-resistant breast cancer. 2002. Cancer Chemother. Pharmacol. 49, 299-302.

7. M.E. O'Brien, N. Wigler, M. Inbar, R. Rosso, E. Grischke, A. Santoro, R. Catane, D.G. Kieback, P. Tomczak, S.P. Ackland, F. Orlandi, L. Mellars, L. Alland, C. Tendler, C.B.C.S. Group, Reduced cardiotoxicity and comparable efficacy in a phase III trial of pegylated liposomal doxorubicin HCl (CAELYX/Doxil) versus conventional doxorubicin for first-line treatment of metastatic breast cancer. 2004. Ann. Oncol. 15, 440-449.

8. Judson, J.A. Radford, M. Harris, J.Y. Blay, Q. van Hoesel, A. le Cesne, A.T. van Oosterom, M.J. Clemons, C. Kamby, C. Hermans, J. Whittaker, E. Donato di Paola, J. Verweij, S. Nielsen, Randomised phase II trial of pegylated liposomal doxorubicin (DOXIL/CAELYX) versus doxorubicin in the treatment of advanced or metastatic soft tissue sarcoma: a study by the EORTC Soft Tissue and Bone Sarcoma Group. 2001. Eur. J. Cancer 37, 870-877.

9. K.M. Laginha, S. Verwoert, G.J. Charrois, T.M. Allen, Determination of doxorubicin levels in whole tumor and tumor nuclei in murine breast cancer tumors. 2005. Clin. Cancer Res. 11, 6944-6949.

10. Roberto Angioli, Michela Angelucci, Francesco Plotti, Corrado Terranova, Roberto Montera, Patrizio Damiani, Ester Valentina Cafa, Pierluigi Benedetti Panici and Angiolo Gadducci. Liposome Encapsulated Doxorubicin Citrate (Ledc) as an Alternative Therapeutic Option for Patients with Recurrent Ovarian Cancer Suffering from Doxorubicin-Related Cutaneous Toxicity. 2013. Chemotherapy, Volume 2, Issue 1, 1-5.

11. Yi Zhao, Daria Y. Alakhova, Jong Oh Kim, Tatiana K. Bronich, Alexander V. Kabanov. A simple way to enhance Doxil® therapy: Drug release from liposomes at the tumor site by amphiphilic block copolymer. 2013. Journal of Controlled Release 168, 61-69

12. Ann L.B. Seynhaeve, Bilyana M. Dicheva, Saske Hoving, Gerben A. Koning, Timo L.M. ten Hagen. Intact Doxil is taken up intracellularly and released doxorubicin sequesters in the lysosome: Evaluated by in vitro/in vivo live cell imaging. 2013. Journal of Controlled Release 172, 330-340

13. Andreas Fritze, Felicitas Hens, Andrea Kimpf ler, Rolf Schubert, Regine Peschka-Süss. Remote loading of doxorubicin into liposomes driven by a transmembrane phosphate gradient. 2006. Biochim. Biophys. Acta. 1758, 1633-1640

14. Lei Zhang, Hong Pan, Min Liu, Weiyue Lu. In vitro and in vivo stabilities of doxorubicin aggregates with various salts inside liposomes. (http://www.paper.edu.cn)

15. Li, Xingong, Hirsh, Donald J., Cabral-Lilly, Donna., Zirkel, Achim., Gruner, Sol M., Janoff, Andrew S., Perkins Walter R. Doxorubicin physical state in solution and inside liposomes loaded via a pH gradient. 1998. Biochim. Biophys. Acta. 1415, 23-40

16. Hitesh R. Patel, Rakesh P. Patel, M.M. Patel. ʺPoloxamers: A pharmaceutical excipient with therapeutic behaviorsʺ. 2009. International Journal of PharmTech Research, Vol.1, No.2, pp 299-303.

17. Guohui Wu, Jaroslaw Majewski, Canay Ege, Kristian Kjaer, Markus Jan Weygand, and Ka Yee C. Lee. ʺInteraction between Lipid Monolayers and Poloxamer 188: An X-Ray Reflectivity and Diffraction Studyʺ. 2005. Biophysical Journal Volume 89, 3159-3173.

18. Zhang, Wen-li, Liu Jian-ping, Liu Xiao-xu, Chen Zhi-qiang. ʺStealth tanshinone IIA-loaded solid lipid nanoparticles: effects of poloxamer 188 coating on in vitro phagocytosis and in vivo pharmacokinetics in ratsʺ. 2009. Acta Pharm Sin, 44: 1421-1428.

19. Parag Aggarwal, Jennifer B. Hall, Christopher B. McLeland, Marina A. Dobrovolskaia, Scott E. McNeil. ʺNanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacyʺ. 2009. Advanced Drug Delivery Reviews 61, 428-437.

20. Lee, R.J., Wang, S., Turk, M.J., and Low, P.S. ʺThe effects of pH and intraliposomal buffer strength on the rate of liposome content release and intracellular drug deliveryʺ. 1998. Bioscience Reports 18(2):69-78.

21. Ghetie MA, Tucker K, Richardson J, Uhr JW, Vitetta ES. Eradication of minimal disease in severe combined immunodeficient mice with disseminated Daudi lymphoma using chemotherapy and an immunotoxin cocktail. 1994. Blood. 84(3):702-707.

22. Newton DL, Hansen HJ, Mikulski SM, Goldenberg DM, Rybak SM. Potent and specific antitumor effects of an anti-CD22-targeted cytotoxic ribonuclease: potential for the treatment of non-Hodgkin lymphoma. 2001. Blood.;97(2):528-535.

23. Lasic, D. D. Doxorubicin in sterically stabilized liposomes. 1996. Nature 380, 561-562.

24. Lasic, D. D., Frederik, P. M., Stuart, M. C., Barenholz, Y., and McIntosh, T. J.. Gelation of liposome interior. A novel method for drug encapsulation. 1992. FEBS Lett. 312, 255-258.

25. Sheela A. Abraham, Dawn N. Waterhouse, Lawrence D. Mayer, Pieter R. Cullis, Thomas D. Madden, and Marcel B. Bally. The Liposomal Formulation of Doxorubicin. 2005. Methods in Enzymology, Vol. 391: 71-97.

26. Hongyan Wei, Juan Song, Hao Li, Yang Li, Shanshan Zhu, Xiaodan Zhou, Xiwen Zhang, Li Yang. Active loading liposomal irinotecan hydrochloride: Preparation, in vitro and in vivo evaluation. 2013. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences, 8, 303-311.

27. Daryl C. Drummond, Charles O. Noble, Zexiong Guo, Keelung Hong, John W. Park, and Dmitri B. Kirpotin. Development of a Highly Active Nanoliposomal Irinotecan Using a Novel Intraliposomal Stabilization Strategy. 2006. Cancer research, 66: (6), 3271-7.

28. James H. Doroshow, Gershon Y. Locker, Ina Ifrim, And Charles E. Myers. Prevention of Doxorubicin Cardiac Toxicity in the Mouse by N-Acetylcysteine. 1981. J. Clin. Invest. Volume 68, 1053-1064.

29. Sakthibalan M, Sawadkar MS, Asmathulla S, Ivan EA, Muthu G. Study of cardio protective effect of NAcetylcysteine, Vitamin C, and Enalapril given in combination to prevent doxorubicin induced cardio toxicity in Wistar rats. 2013. J Pharm Biomed Sci. 36(36): 1902-1908

30. Myers, C. E., W. P. McGuire, R. H. Liss, I. Ifrim, K. Grotzinger, and R. C. Young. Adriainycin: the role of lipid peroxidation in cardiac toxicity and tumor response. 1977. Science (Wash. D. C.). 197: 165-167.

31. Doroshow, J. H., and J. Reeves. Anthracycline enhanced oxygen radical formation in the heart. 1980. Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 21: 266.

32. Heaney ML, Gardner JR, Karasavvas N, Golde DW, Scheinberg DA, Smith

EA, O'Connor OA. Vitamin C antagonizes the cytotoxic effects of antineoplastic drugs. 2008. Cancer Res. 68(19): 8031-803.

33. Viswanatha Swamy AH, Wangikar U, Koti BC, et al. Cardioprotective effect of ascorbic acid on doxorubicin-induced myocardial toxicity in rats. 2011. Indian J Pharmacol 43: 507-511.

34. Villani F, Galimberti M, Monti E, Piccinini F, Lanza E, Rozza A, Favalli L, Poggi P, Zunino F. Effect of glutathione and N-acetylcysteine on in vitro and in vivo cardiac toxicity of doxorubicin. 1990. Free Radic Res Commun. 11(1-3): 145-51.

35. Guidelines for Dynamic Light Scattering Measurement and Analysis. Nanocomposix's guide to dynamic light scattering measurement and analysis. 2015. V. 1.4.

36. Song Y, Huang Z, Song Y, Tian Q, Liu X, She Z, Jiao J, Lu E, Deng Y. The application of EDTA in drug delivery systems: doxorubicin liposomes loaded via NH4EDTA gradient. 2014. Int J Nanomedicine. 9:3611-21.

37. Cranton EM, Frackelton JP. Free oxygen radical pathology and EDTA chelation therapy: mechanisms of action. 1988. Journal of Advancement in Medicine. 11(4):277-310

38. Hong RL, Tseng YL. Phase I and pharmacokinetic study of a stable, polyethylene-glycolated liposomal doxorubicin in patients with solid tumors: the relation between pharmacokinetic property and toxicity. 2001. Cancer ; 91: 1826-1833.

39. Chao TC, Wang WS, Yen CC, et al. A dose-escalating pilot study of sterically stabilized, pegylated liposomal doxorubicin (Lipo-Dox) in patients with metastatic breast cancer. 2003. Cancer Invest; 21:837-847.

40. Ian F. Tannock and Daniela Rotin. Acid pH in Tumors and Its Potential for Therapeutic Exploitation. 1989. Cancer Research 49, 4173-4384.

41. 36. Wike-Hooley, J. L., Haveman, J., and Reinhold, J. S. The relevance of tumour pH to the treatment of malignant disease.1984. Radiother. Oncol., 2: 343-366.

42. Yuan F, Leunig M, Huang SK, Berk DA, Papahadjopoulos D, Jain RK. Microvascular permeability and interstitial penetration of sterically stabilized (Stealth) liposomes in a human tumor xenograft. 1994. Cancer Res 54: 3352-3356.

43. Vitols S: Uptake of low-density lipoprotein by malignant cells - possible therapeutic applications. 1991. Cancer Cells 3, 488-495.

44. Muller CP, Trilling B, Steinke B: The prognostic significance of total serum cholesterol in patients with Hodgkin's disease. 1992. Cancer 69, 1042-1046.

45. Parag Aggarwal, Jennifer B. Hall, Christopher B. McLeland, Marina A. Dobrovolskaia, Scott E. McNeil. ʺNanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacyʺ. 2009. Advanced Drug Delivery Reviews 61, 428-437.

46. Innerarity TL and Mahley RW Enhanced binding by cultured human fibroblasts of apo-E-containing lipoproteins as compared with low density lipoproteins. 1978. Biochemistry 17: 1440-1447.

47. Innerarity TL Pitas RE and Mahley RW (1979) Binding of arginine-rich (E) apoprotein after recombination with phospholipid vesicles to the low density lipoprotein receptors of fibroblasts. 1979. J Biol Chem 254: 4186-4190.

48. AJ Versluis, PCN Rensen, ET Rump, TJC Van Berkel and MK Bijsterbosch. Low-density lipoprotein receptor-mediated delivery of a lipophilic daunorubicin derivative to B16 tumours in mice using apolipoprotein E-enriched liposomes. 1998. British Journal of Cancer 78(12): 1607-1614.

49. Zensi A, Begley D, Pontikis C, et al. Albumin nanoparticles targeted with Apo E enter the CNS by transcytosis and are delivered to neurones. 2009. J Control Release; 137(1):78-86.

50. Pillay, C.S., E. Elliott, and C. Dennison. 2002. Endolysosomal proteolysis and its regulation. Biochem. J. 363:417-429.

51. Joseph A. Mindell. Lysosomal Acidification Mechanisms. 2012. Annual Review of Physiology Vol. 74: 69-86.

52. Guo LS, Hamilton RL, Goerke J, Weinstein JN, Havel RJ. Interaction of unilamellar liposomes with serum lipoproteins and apolipoproteins. 1980. J Lipid Res. Vol. 21(8):993-1003.

53. Sean C. Semple, Arcadio Chonn, Pieter R. Cullis. Interactions of liposomes and lipid-based carrier systems with blood proteins: Relation to clearance behaviour in vivo. 1998. Advanced Drug Delivery Reviews. Vol. 32: 3-17.

1. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая липосому, при этом липосома содержит: (i) множество липидов; (ii) слабоосновное противоопухолевое соединение и (iii) щавелевую кислоту, соль щавелевой кислоты, винную кислоту или соль винной кислоты; где массовое соотношение множества липидов и слабоосновного противоопухолевого соединения составляет от 20:1 до 100:1.

2. Фармацевтическая композиция по п. 1, где липосома содержит: (i) множество липидов; (ii) слабоосновное противоопухолевое соединение и (iii) щавелевую кислоту или соль щавелевой кислоты.

3. Фармацевтическая композиция по п. 1, где липосома содержит: (i) множество липидов; (ii) слабоосновное противоопухолевое соединение и (iii) винную кислоту или соль винной кислоты.

4. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-3, где массовое соотношение множества липидов и слабоосновного противоопухолевого соединения составляет от 20:1 до 50:1.

5. Фармацевтическая композиция по п. 4, где массовое соотношение множества липидов и слабоосновного противоопухолевого соединения составляет от 30:1 до 50:1.

6. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-3, где массовое соотношение множества липидов и слабоосновного противоопухолевого соединения составляет от 50:1 до 100:1.

7. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-6, где слабоосновное противоопухолевое соединение представляет собой доксорубицин, иринотекан, митоксантрон или их комбинацию.

8. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-6, где слабоосновное противоопухолевое соединение имеет pKa 7,5-9,0.

9. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-8, где множество липидов включает множество свободных холестеринов; множество фосфолипидов или их сочетание.

10. Фармацевтическая композиция по п. 9, где множество липидов включает множество свободных холестеринов и множество фосфолипидов.

11. Фармацевтическая композиция по п. 10, где молярное соотношение фосфолипидов и свободных холестеринов составляет от по меньшей мере 0,5:1 до 4:1.

12. Фармацевтическая композиция по п. 10, где молярное соотношение фосфолипидов и свободных холестеринов составляет от 0,86:1 до 3,68:1.

13. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-12, где множество липидов содержит полоксамер.

14. Фармацевтическая композиция по п. 13, где полоксамер представляет собой полоксамер 188.

15. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-14, где фармацевтическая композиция содержит множество липосом со средним наибольшим размером 40-100 нм, определяемым по усредненным по интенсивности диаметрам частиц при измерении с помощью динамического рассеяния света, или фармацевтическая композиция содержит множество липосом со средним наибольшим размером 1-50 нм, определенным с помощью криотрансмиссионной электронной микроскопии.

16. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-15, где указанная липосома содержит примерно 500-1000 мкг/мл слабоосновного противоопухолевого соединения.

17. Фармацевтическая композиция по п. 16, где липосома содержит примерно 700-850 мкг/мл слабоосновного противоопухолевого соединения.

18. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-17, дополнительно содержащая соединение, выбранное из группы, состоящей из аскорбиновой кислоты, N-ацетилцистеина, аскорбилпальмитата, убихинона и этилендиаминтетрауксусной кислоты.

19. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-18, где по меньшей мере 40-80% слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН 5,0 в стандартных условиях анализа; где по меньшей мере 10-50% слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН 6,0 в стандартных условиях анализа; и где 7-30% слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН 6,7 в стандартных условиях анализа; и где менее 5% слабоосновного противоопухолевого соединения высвобождается из липосомы при рН 7,4 в стандартных условиях анализа; при этом стандартные условия анализа включают 20-кратное или 50-кратное разведение липосом в забуференном фосфатом физиологическом растворе и инкубацию при температуре 25°C или 37°C в течение 2 часов, 4 часов или 8 часов.

20. Способ получения фармацевтической композиции по любому из пп. 1-19, включающий смешивание раствора, содержащего слабоосновное противоопухолевое соединение, с суспензией, содержащей множество липосом и щавелевую кислоту, соль щавелевой кислоты, винную кислоту или соль винной кислоты.

21. Способ по п. 20, дополнительно включающий инкубацию указанного раствора и указанной суспензии.

22. Способ по п. 21, где стадию инкубации проводят при комнатной температуре в течение 10-30 минут или при температуре 70°C в течение 10-30 минут.

23. Способ по п. 21, где стадию инкубации проводят при комнатной температуре в течение от 10 минут до 30 минут, после чего следует инкубация при температуре 2-8°C в течение 60-960 минут.

24. Набор для фармацевтической композиции по любому из пп. 1-19, содержащий первый контейнер, содержащий слабоосновное противоопухолевое соединение, и второй контейнер, содержащий суспензию, содержащую множество липосом и щавелевую кислоту, соль щавелевой кислоты, винную кислоту или соль винной кислоты.

25. Набор по п. 24, где слабоосновное противоопухолевое соединение является лиофилизированным.

26. Набор по п. 24 или 25, где суспензия представляет собой водную суспензию.

27. Применение фармацевтической композиции по любому из пп. 1-19 для лечения рака.