Гранулы, используемые в клеточной культуре, и способы их получения
Группа изобретений относится к получению сухих клеточных культуральных сред или подпиток в формате гранул. Предложены способы получения гранул клеточной культуральной среды, модуля базового порошка или питательной среды путем прямого гранулирования. Вносят во вращающийся дисковый ротор аппарата с псевдоожиженным слоем первый сухой порошок клеточной культуральной среды, сухой базовый порошок питательной среды или сухой порошок питательной среды, где указанный первый сухой порошок предварительно смачивают. Далее вносят во вращающийся дисковый ротор растворитель и/или второй сухой порошок клеточной культуральной среды, сухой базовый порошок питательной среды или сухой порошок питательной среды, так, чтобы происходило образование гранулы. Первый сухой порошок, второй сухой порошок или растворитель содержит связующее вещество, вспомогательное вещество или их оба. Высушивают гранулы. Изобретения позволяют осуществлять прямое гранулирование порошков клеточных культуральных сред, подпиток или добавок, применяемых для культивирования клеток, содержащих от 80 до 100 отдельных компонентов. Гранулы сред могут быть более легки в обращении до восстановления, во время транспортировки и работы и/или во время восстановления. 3 н. и 14 з.п. ф-лы, 10 ил., 9 табл., 9 пр.
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА
Данная заявка заявляет приоритет согласно 35 U.S.C. 119(e) предварительной заявки США № 62/269031, поданной 17 декабря 2015 г. Полное содержание вышеупомянутой заявки включено в данный документ посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к гранулированным сухим клеточным культуральным средам, подпиткам, добавкам, концентратам или буферам сред, применяемым в культивировании клеток и других подобных применениях. Изобретение относится к процессам приготовления таких гранулированных композиций и способам придания гранулам необходимого размера частиц. Изобретение также относится к применению таких гранулярных препаратов для получения белков и полипептидов и для повышения, таким образом, клеточного роста и белковых титров.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Первый аспект изобретения относится к способу получения гранулированной клеточной культуральной среды, включающему: a) обработку первого сухого порошка суспензией в восходящем столбе газа в аппарате с псевдоожиженным слоем и центрифугирование в дисковом роторе; b) внесение растворителя и/или второго сухого порошка в аппарат с псевдоожиженным слоем на этапе (a) так, чтобы происходило образование гранул; и c) высушивание гранул, причем первый сухой порошок, второй сухой порошок или растворитель содержит связующее вещество, вспомогательное вещество или их оба.
В дополнительном аспекте первый сухой порошок с этапа (a) можно предварительно смачивать и, необязательно, на этапе (b) можно не вносить растворитель.
В некоторых аспектах первый и второй сухие порошки могут быть одинаковыми, а в других аспектах первый и второй сухие порошки могут быть разными.
В конкретном аспекте первый сухой порошок может быть выбран из группы, состоящей из порошка базальной среды, порошка полной среды, подпитки, добавки, концентрата среды или подпитки и смеси аминокислот, которые могут поддерживать культивирование клетки в культуре. В другом аспекте второй сухой порошок может быть выбран из группы, состоящей из порошка базальной среды, порошка полной среды, подпитки, добавки, концентрата среды или подпитки и смеси аминокислот, которые могут поддерживать культивирование клетки в культуре.
Во втором аспекте изобретения предложены связующие вещества или вспомогательные вещества, или и те, и другие, присутствующие в первом порошке, втором порошке, в растворителе или в любом из них и используемые в описанных способах. В другом аспекте связующее вещество или вспомогательное вещество могут быть выбраны из группы, состоящей из сахара, природного вещества, синтетического вещества и полусинтетического вещества. В конкретном аспекте природное вещество может представлять собой, например, микрокристаллическую целлюлозу.
В конкретном аспекте в изобретении предложены сахара, присутствующие в первом порошке, втором порошке, в растворителе или в любом из них и используемые в описанных способах; при этом сахар может быть выбран из группы, состоящей из глюкозы, сахарозы, трегалозы, моносахарида, дисахарида и олигосахарида. В дополнительном аспекте сахар может представлять собой глюкозу, при этом глюкоза может присутствовать в грануле в концентрации от 0,1 до 100% композиции гранулы. В конкретном варианте реализации сахар включает D-глюкозу.
В одном варианте реализации в изобретении предложены витамины, присутствующие в первом порошке, втором порошке, в растворителе или в любом из них и используемые в описанных способах. В конкретном варианте реализации витамины выбраны из одного или более из витамина B12, биотина, холина, фолиевой кислоты, ниацинамида, пиридоксина, рибофлавина, тиамина, аскорбиновой кислоты, пара-аминобензойной кислоты (PABA) и т.д.
В другом варианте реализации в изобретении предложены соли, которые могут присутствовать в первом порошке, втором порошке или в растворителе и использоваться в описанных способах. В одном варианте реализации соли выбраны из одной или более буферных солей, солей железа, цинка, кальция, меди, магния, марганца, аммония, ванадия и т.д.
В другом варианте реализации в изобретении предложены аминокислоты, присутствующие в первом порошке, втором порошке, в растворителе или в любом из них и используемые в описанных способах. В одном варианте реализации аминокислоты выбраны из одной или более хорошо известных двадцати аминокислот, их солей или производных. В другом варианте реализации аминокислоты выбраны из одной или более аминокислот из глицина, аланина, аргинина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, гистидина, изолейцина, метионина, фенилаланина, пролина, гидроксипролина, серина, треонина, триптофана, валина, тирозина, цистеина и лизина.
В другом аспекте в изобретении предложены связующие вещества, присутствующие в первом порошке, втором порошке, в растворителе или в любом из них и используемые в описанных способах. В некоторых вариантах реализации связующие вещества или вспомогательные вещества могут использоваться взаимозаменяемо или вместе по всему тексту заявки. В одном варианте реализации связующие вещества или вспомогательные вещества выбраны из группы, состоящей из сахара, природного вещества, синтетического вещества и полусинтетического вещества, микрокристаллической целлюлозы, глюкозы, сахарозы, трегалозы, моносахарида, дисахарида и олигосахарида, вспомогательных веществ и/или разрыхлителей. В одном конкретном варианте реализации связующие вещества представляют собой микрокристаллическую целлюлозу и глюкозу. В другом варианте реализации процентное содержание связующего (-их) вещества (-еств) в грануле может составлять от около 0,1 до около 100%. В конкретном варианте реализации % содержание связующего (-их) вещества (-еств) в грануле может составлять от около 30 до около 60%.
В третьем аспекте в изобретении предложены способы получения гранул различных размеров; в некоторых случаях гранула имеет размер от около 0,05 мм до 7 мм. В конкретном аспекте в изобретении предложены гранулы, имеющие размер от около 0,05 мм до около 0,5 мм, или от около 0,05 мм до около 1 мм, или от около 0,05 мм до около 2 мм, или от около 0,05 мм до около 3 мм, или от около 0,05 мм до около 4 мм, или от около 0,05 мм до около 5 мм, или от около 0,05 мм до около 6 мм, или от около 0,05 мм до около 0,1 мм, или от около 0,05 мм до около 0,2 мм, или от около 0,05 мм до около 0,3 мм, или от около 0,05 мм до около 0,4 мм, или от около 0,1 мм до около 1 мм, или от около 0,1 мм до около 2 мм, или от около 0,1 мм до около 3 мм, или от около 0,1 мм до около 4 мм, или от около 0,1 мм до около 5 мм, или от около 0,1 мм до около 6 мм, или от около 0,5 мм до около 1 мм, или от около 0,5 мм до около 2 мм, или от около 0,5 мм до около 3 мм, или от около 0,5 мм до около 4 мм, или от около 0,5 мм до около 5 мм, или от около 0,5 мм до около 6 мм, или от около 0,5 мм до около 7 мм, или от около 1 мм до около 2 мм, или от около 1 мм до около 3 мм, или от около 1 мм до около 4 мм, или от около 1 мм до около 5 мм, или от около 1 мм до около 6 мм, или от около 1 мм до около 7 мм. В конкретном варианте реализации в изобретении предложены гранулярные препараты, имеющие в основном размер гранул, который может быть больше чем около 0,1 мм, или больше чем около 0,2 мм, или больше чем около 0,3 мм, или больше чем около 0,4 мм, или больше чем около 0,5 мм, или больше чем около 0,6 мм, или больше чем около 0,7 мм, или больше чем около 0,8 мм, или больше чем около 0,9 мм, или больше чем около 1 мм, или больше чем около 2 мм.
В других аспектах получения гранул согласно изобретению способы могут относиться к применению дисковых роторов в рабочей камере, которые вращаются с разными скоростями.
В других аспектах растворитель вносят на этапе (a), при обработке первого сухого порошка суспензией в восходящем столбе газа в аппарате с псевдоожиженным слоем и центрифугировании в дисковом роторе, при этом растворитель вносят посредством тангенциального впрыскивания, верхнего впрыскивания или нижнего впрыскивания. В дополнительном аспекте скорость растворителя, вносимого на этапе (a), может составлять от около 1 г/мин до около 30 г/мин. В конкретном аспекте скорость растворителя, вносимого на этапе (a), может составлять около 5 г/мин.
В пятом аспекте в изобретении предложены способы получения гранул, в которых температура входящего газа может составлять от около 20°C до 30°C. В конкретном аспекте температура входящего газа может составлять около 25°C. В дополнительном аспекте можно поддерживать температуру гранулы от около 20°C до 30°C. В другом аспекте температура высушивания гранулы может составлять от около 50°C до 60°C. И в еще одном аспекте гранулу можно высушивать до влагосодержания от около 0,5% до 3%.
В шестом аспекте в изобретении предложен способ получения модулей гранулированного базового порошка, включающий: a) обработку первого сухого порошка суспензией в восходящем столбе газа в аппарате с псевдоожиженным слоем и центрифугирование в дисковом роторе; b) внесение растворителя и, необязательно, второго сухого порошка в аппарат с псевдоожиженным слоем на этапе (a) так, чтобы могло происходить образование гранул базового порошкового модуля; и c) высушивание гранул, причем первый сухой порошок, второй сухой порошок или растворитель содержит связующее вещество, вспомогательное вещество или их оба.
В дополнительном аспекте в изобретении предложен способ получения модуля гранулированного базового порошка, причем модуль может быть выбран из группы, состоящей из одного или более растворимых в воде витаминов, одного или более растворимых в кислотах витаминов, одного или более растворимых в нейтральных жидкостях витаминов, одной или более растворимых в кислотах аминокислот, одной или более растворимых в основаниях аминокислот, одной или более растворимых в нейтральной воде аминокислот, одной или более растворимых в воде неорганических солей, одной или более растворимых в кислотах неорганических солей, одного или более сахаров, одного или более растворимых в кислотах следовых элементов, одного или более растворимых в спиртах полиаминов, одного или более растворимых в спиртах липидов или одной или более буферных солей. В одном аспекте изобретения растворимый в воде или растворимый в кислотах или основаниях, или нейтральных жидкостях витаминный модуль, растворимый в воде или растворимый в кислотах или основаниях, или нейтральных жидкостях аминокислотный модуль или растворимый в воде или растворимый в кислотах или основаниях, или нейтральных жидкостях солевой модуль содержит по меньшей мере одно нерастворимое в воде вспомогательное вещество или нерастворимое в воде связующее вещество.
В другом аспекте модуль гранулированного базового порошка может быть выбран из группы, состоящей из одной или более растворимых в воде групп, одной или более растворимых в основаниях групп, одной или более растворимых в кислотах групп, одной или более растворимых в кислотах реактивных групп, одной или более растворимых в спиртах групп, одной или более растворимых в спиртах реактивных групп и одной или более pH-модифицирующих групп. В конкретном аспекте растворимая в воде группа может быть выбрана из группы, состоящей из витаминов, объемных неорганических солей и сахаров.
В седьмом аспекте в изобретении предложены гранулы, полученные или получаемые любым из вышеописанных способов.
В восьмом аспекте изобретение может относиться к гранулированной клеточной культуральной среде, подпитке, добавке или присадке, содержащей одну или более аминокислот, одно или более связующих веществ или вспомогательных веществ и один или более следовых компонентов.
В одном варианте реализации гранулированная клеточная культуральная среда, подпитка, добавка или присадка дополнительно содержит витамины. В конкретном варианте реализации витамины выбраны из одного или более из витамина B12, биотина, холина, фолиевой кислоты, ниацинамида, пиридоксина, рибофлавина, тиамина, аскорбиновой кислоты, пара-аминобензойной кислоты (PABA) и т.д.
В другом аспекте гранулированная клеточная культуральная среда, подпитка, добавка или присадка дополнительно содержит соли. В одном варианте реализации соли выбраны из одной или более буферных солей, солей железа, цинка, кальция, меди, магния, марганца, аммония, ванадия и т.д.
В другом аспекте гранулированная клеточная культуральная среда, подпитка, добавка или присадка содержит аминокислоты, выбранные из одной или более хорошо известных двадцати аминокислот, их солей или производных. В одном варианте реализации аминокислоты выбраны из одной или более аминокислот из глицина, аланина, аргинина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, гистидина, изолейцина, метионина, фенилаланина, пролина, гидроксипролина, серина, треонина, триптофана, валина, тирозина, цистеина и лизина.
В девятом аспекте изобретение может относиться к гранулированной клеточной культуральной среде, подпитке, добавке или присадке, содержащей связующие вещества или вспомогательные вещества, которые могут использоваться взаимозаменяемо или вместе по всему тексту описания. В одном варианте реализации связующие вещества или вспомогательные вещества выбраны из группы, состоящей из сахара, природного вещества, синтетического вещества и полусинтетического вещества, микрокристаллической целлюлозы, глюкозы, сахарозы, трегалозы, моносахарида, дисахарида и олигосахарида, вспомогательных веществ и/или разрыхлителей. В одном конкретном варианте реализации связующие вещества представляют собой микрокристаллическую целлюлозу и глюкозу. В другом варианте реализации % содержание связующего (-их) вещества (-еств) в грануле может составлять от около 0,1 до около 100%. В конкретном варианте реализации % содержание связующего (-их) вещества (-еств) в грануле может составлять от около 30 до около 60%.
В десятом аспекте описанная в изобретении композиция может относиться к гранулированной клеточной культуральной среде, подпитке, добавке или присадке, содержащей одно или более из 25-40% аминокислот, 20-65% связующих веществ, 1-5% витаминов, 2-10% солей, 0,01-0,05% следовых компонентов. В конкретном варианте реализации гранулярные композиции содержат одно или более из 31-32% аминокислот, 59-60% связующих веществ, 25% витаминов, 6-7% солей, 0,01-0,05% следовых компонентов. В предпочтительной композиции связующее вещество представляет собой D-глюкозу.
В одиннадцатом аспекте в изобретении предложены способы получения гранулы питательной среды, гранулы питательной среды с добавками, гранулы подгруппы питательной среды или гранулы буфера, включающие: агломерацию сухой порошковой среды, добавки, подгруппы среды или буфера среды с растворителем и образование гранулы с помощью вращающегося диска в псевдоожиженном слое, причем гранула содержит связующее вещество или вспомогательное вещество.
В другом аспекте в изобретении предложены способы получения гранулы питательной среды, гранулы питательной среды с добавками, гранулы подгруппы питательной среды или гранулы буфера, в которых связующее вещество или вспомогательное вещество можно впрыскивать с помощью растворителя или можно вмешивать в сухой порошок перед гранулированием. В конкретном варианте реализации связующее вещество может представлять собой сахар, а в предпочтительном варианте реализации сахар включает D-глюкозу. Процентное содержание связующего вещества, например, глюкозы, можно варьировать для достижения разного размера гранул или разной объемной плотности, или разного угла естественного откоса, или разной степени слипаемости или сухости. Например, в некоторых вариантах реализации количество можно варьировать в диапазоне 0-60% или 10-16%, или 20-60%, предпочтительно 30-40%, 40-50%, 30-35%, 30-45%, 40-50%, 40-55% и т.д. для достижения необходимых характеристик.
В другом аспекте изобретение может относиться к гранулам, полученным или получаемым любым из вышеприведенных способов, во всех вышеописанных вариациях.
В двенадцатом аспекте в изобретении предложены способы создания гранулы для культивирования клеток, включающие: приготовление микросуспензии сухой порошковой среды или модуля; экструдирование микросуспензии через экструдирующее устройство для образования капель; высушивание капель до гранул. Один аспект может относиться к полученным таким образом гранулам.
Тринадцатый аспект может относиться к применению гранул, полученных способами по любому из вышеприведенных пунктов, для культивирования клетки. В одном варианте реализации клетка может быть выбрана из группы, состоящей из клеток эукариот, прокариот, животных, растений, грибов, водорослей, насекомых, дрожжей, или клетку можно использовать для культивирования вируса или вирусной частицы. В конкретном варианте реализации клетка может представлять собой клетку животного. В другом варианте реализации клетка может представлять собой клетку млекопитающего. В конкретном варианте реализации клетка млекопитающего может быть выбрана из группы, состоящей из CHO, BHK, HEK, 293, VERO и т.д.
В четырнадцатом аспекте в изобретении предложены способы культивирования клетки в жидкости, восстановленной из любых гранул, полученных или получаемых вышеописанными способами, включающие: i) восстановление гранулы в подходящей жидкости или буфере; причем указанная гранула может представлять собой клеточную культуральную среду, подпитку, добавку или концентрат; ii) культивирование клетки в восстановленной жидкости в условиях, благоприятных для роста клетки. В одном варианте реализации клетка может быть выбрана из группы, состоящей из клеток эукариот, прокариот, животных, растений, грибов, водорослей, насекомых, дрожжей, или клетку можно использовать для культивирования вируса или вирусной частицы. В другом варианте реализации культивирование можно осуществлять для получения повышенного количества полипептида. В дополнительном варианте реализации полипептид может представлять собой рекомбинантный полипептид. В другом варианте реализации культивирование повышает выработку продукта, повышая клеточный рост, по сравнению с культурой с жидкой средой, не полученной из гранул.
В четырнадцатом аспекте в изобретении предложены наборы, содержащие: i) первый контейнер, содержащий гранулу, полученную или получаемую вышеописанными способами, причем указанная гранула может представлять собой клеточную культуральную среду, подпитку, добавку или концентрат; и ii) инструкции по применению гранулы. В других аспектах наборы могут дополнительно содержать добавочные контейнеры, каждый из которых может содержать клетки для культивирования, буферы и другие компоненты, включая другие среды (жидкость или сухой порошок, формат AGT), присадки, подпитки, антибиотики и т.д.
В пятнадцатом аспекте в изобретении предложены системы, содержащие жидкую среду/подпитку/добавку/присадку, восстановленную и вышеописанной гранулы, получаемой любым из вышеописанных способов, и клетку. В одном варианте реализации клетка может быть выбрана из группы, состоящей из клеток эукариот, прокариот, животных, растений, грибов, водорослей, насекомых, дрожжей, или клетку можно использовать для культивирования вируса или вирусной частицы. В другом варианте реализации восстановленную из гранулы жидкую среду/подпитку/добавку/присадку можно использовать для культивирования клетки, которая вырабатывает рекомбинантный полипептид, вирус, секретируемый белок, или клетку в суспензии или иммобилизованные клетки.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ
Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в данном документе, включены в него посредством ссылки в такой же степени, как в случае, если бы было указано, что каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка специально и в индивидуальном порядке включены посредством ссылки. В случае возникновения противоречий приоритет будет иметь приведенное в данном документе описание, включая определения. Цитирование или идентификацию любой ссылки в этой заявке не следует воспринимать как признание такой ссылки как предшествующего настоящей заявке уровня техники.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Новые признаки изобретения приведены в подробностях в прилагающейся формуле изобретения. Лучшее понимание признаков и преимуществ настоящего изобретения обеспечивается ссылкой на нижеприведенное подробное описание, в котором приведены иллюстративные варианты реализации, в которых используются принципы данного изобретения. Специалисту в данной области техники понятно, что описанные в данном документе графические материалы приведены исключительно в иллюстративных целях и никоим образом не подразумевают ограничение объема представленных идей.
Фигура 1A: Показаны приготовленные вручную гранулы или таблетки, называемые гранулированной подпиткой 1. Подробный способ приготовления описан в примере 1. 1B: Визуальная оценка размера гранулированной подпитки 1. 1C: Визуальное сравнение размера гранулированной или таблетированной подпитки 1.
Фигура 2A: Сравнение анализа жизнеспособности клеток для добавки на основе приготовленной вручную гранулированной подпитки 1 и жидкой добавки. Жизнеспособность для приготовленной вручную гранулированной подпитки 1 (исследуемый образец) показана на кривых таблеток 1, 2, 3; жизнеспособность для жидкости (положительный контроль) показана как жидк. 1, 2, 3; жизнеспособность без добавок (отрицательный контроль) показана как отр. контр. 1, 2, 3. Клеточная культура с добавкой гранулированной подпитки 1 (исследуемая в трех копиях: 1, 2, 3) продемонстрировала лучший % выживаемости по сравнению с клеточной культурой с добавкой жидкости (в трех копиях: 1, 2, 3), в особенности, с 8 до 16 дня.
Фигура 2B: Сравнение анализа роста клеток для добавки на основе приготовленной вручную гранулированной подпитки 1 и жидкой добавки. Клеточная культура с добавкой гранулированной подпитки 1 (в трех копиях: 1, 2, 3) продемонстрировала сравнимый рост клеток в течение периода, составляющего 15 суток в культуре, по сравнению с клеточной культурой с добавкой жидкости (в трех копиях: 1, 2, 3).
Фигура 2C: Сравнение анализа продуктивности клеток или белковых титров для добавки на основе приготовленной вручную гранулированной подпитки 1 и жидкой добавки в отношении выработки антител. Белковые титры (продуктивность клеток) приготовленных вручную гранул показана на кривых таблеток 1, 2, 3; белковые титры для жидкости (положительный контроль) показаны как жидк. (в трех копиях: 1, 2, 3); белковые титры без добавок (отрицательный контроль) показаны как отр. контр. (в трех копиях: 1, 2, 3). Клеточная культура с добавкой таблеток/гранул 1, 2, 3 демонстрировала выработку IgG ~ 325 мкг/мл (выработки), что немного ниже, чем выработка IgG ~425 мкг/мл в случае положительного жидкого контроля EFB (в трех копиях: 1, 2, 3), в течение периода, составляющего 15 суток в культуре. Отрицательный контроль без добавок продемонстрировал намного меньшую выработку IgG (~100 мкг/мл) по сравнению с клеточной культурой с добавкой таблеток подпитки 1 (исследуемой).
Фигура 3A: Увеличенное под микроскопом изображение гранулированного препарата или таблеток, полученных автоматизированным способом из размолотого порошка (стартовый материал) в виде гранулированной подпитки 2, приготовленной с применением технологии роторного диска, также иногда называемой подпиткой 2 на фигурах и в тексте заявки. Подробный способ приготовления описан в примерах.
Фигура 3B: Оценка размера частиц гранулированной подпитки 2, приготовленной с помощью технологии роторного диска.
Фигура 3C: Сравнение анализа роста клеток для приготовленной автоматизированным способом гранулированной подпитки 2 и жидкой добавки. Клеточная культура с добавкой таблеток/гранул продемонстрировала сравнимый рост клеток в течение периода, составляющего 15 суток в культуре, по сравнению с клеточной культурой с добавкой жидкости. Гранулированная подпитка 2 продемонстрировала количество жизнеспособных клеток, составляющее ~ 10×10 e6 клеток/мл (рост), что немного больше, чем в клеточной культуре с добавкой положительной контрольной подпитки (~8×10 e6).
Фигура 4A: Увеличенное под микроскопом изображение гранулированного препарата или таблеток, полученных автоматизированным способом из размолотого порошка (стартовый материал) в виде гранулированной подпитки 3, приготовленной с применением технологии роторного диска, также иногда называемой подпиткой 3 на фигурах и в тексте заявки. Подробный способ приготовления описан в примерах.
Фигура 4B: Оценка размера частиц гранулированной подпитки 3, приготовленной с помощью технологии роторного диска.
Фигура 4C: Сравнение анализа роста клеток для приготовленной автоматизированным способом гранулированной подпитки 3 и жидкой добавки. Клеточная культура с добавкой гранулированной подпитки 3 продемонстрировала сравнимый с положительным контролем рост клеток в течение периода, составляющего 14 суток в культуре, в особенности, по сравнению с отрицательным контролем (начиная с 7 суток). Гранулированная подпитка 3 продемонстрировала количество жизнеспособных клеток, составляющее ~ 9×10 e6 клеток/мл (рост), что немного больше, чем в клеточной культуре с добавкой положительной контрольной подпитки (~8×10 e6).
Фигура 5A: Увеличенное под микроскопом изображение гранулированного препарата или таблеток, полученных автоматизированным способом из перемолотого порошка (стартовый материал) в виде гранулированной подпитки 4, приготовленной с применением технологии роторного диска, в котором стартовый сухой базовый порошок содержал связующее вещество на основе целлюлозы. Иногда он также называется подпиткой 4 на фигурах и в тексте заявки. Подробный способ приготовления описан в примерах.
Фигура 5B: Оценка размера частиц гранулированной подпитки 4, приготовленной с помощью технологии роторного диска, в которой стартовый сухой базовый порошок содержал связующее вещество на основе целлюлозы. График для гранулированной подпитки 4 демонстрирует результат химического изменения стартовой композиции (для снижения растворимости в воде) с помощью целлюлозы. Размер гранулярных частиц был меньше по сравнению с подпитками 2 и 3.
Фигура 5C: Сравнение анализа роста клеток для приготовленной автоматизированным способом гранулированной подпитки 4 и жидкой добавки. Клеточная культура с добавкой гранулированной подпитки 4 продемонстрировала сравнимый с положительным контролем рост клеток в течение периода, составляющего 14 суток в культуре, в особенности, по сравнению с отрицательным контролем (начиная с 7 суток).
Фигура 6A: Увеличенное под микроскопом изображение гранулированного препарата или таблетки, полученного автоматизированным способом из перемолотого порошка (стартовый материал) в виде гранулированной подпитки 5, приготовленной с применением технологии роторного диска, в котором стартовый сухой базовый порошок сначала микроизмельчали до меньшего размера частиц перед его применением в процессе гранулирования. Иногда он также называется подпиткой 5 на фигурах и в тексте заявки. Подробный способ приготовления описан в примерах.
Фигура 6B: Оценка размера частиц гранулированной подпитки 5, приготовленной с помощью технологии роторного диска, в которой стартовый сухой базовый порошок сначала тонко измельчали до меньшего размера частиц. На графиках показан результат физического изменения стартовой композиции (снижение размера частиц). Размер частиц был более гомогенным.
Фигура 7A: Биологическая оценка гранулированных подпиток. Проводили анализ жизнеспособности для гранулированных подпиток 2, 3 и 4 и сравнивали с положительным (с добавкой жидкой подпитки) или отрицательным контролями (без добавки жидкости или гранул). Как видно из графика, гранулированные подпитки 2, 3 и 4 были хорошо сопоставимы, как и положительный контроль, и превосходили отрицательный контроль, в особенности после 6 суток. Анализ жизнеспособности клеток для гранулированной подпитки 5 дал результаты, аналогичные с подпитками 2, 3 и 4 (данные не показаны).
Фигура 7B: Биологическая оценка гранулированных подпиток. Проводили анализ продуктивности клеток (выработки антител) для гранулированных подпиток 2, 3 и 4 и сравнивали с положительным (с добавкой жидкой подпитки) или отрицательным контролями (без добавки жидкости или гранул). Как видно из графика, гранулированные подпитки 2, 3 и 4 были хорошо сопоставимы, как и положительный контроль, и превосходили отрицательный контроль, в особенности после 4 суток. Клеточная культура с добавкой гранулированной подпитки 2 (~ 229 мкг/мл) демонстрировала выработку IgG, сравнимую с выработкой IgG ~228 мкг/мл (на 14 сутки) для положительной контрольной подпитки; клеточная культура с добавкой гранулированной подпитки 3 (~ 243 мкг/мл) демонстрировала выработку IgG немного выше чем положительная контрольная подпитка; и клеточная культура с добавкой гранулированной подпитки 4 (~ 200 мкг/мл) демонстрировала выработку IgG немного ниже чем положительная контрольная подпитка. Анализ клеточной культуры без добавок (отрицательный контроль) продемонстрировал намного меньшее количество IgG (~100 мкг/мл) по сравнению с клеточной культурой с добавкой любой из гранулированных подпиток 2, 3 или 4. Анализ продуктивности клеток (выработки антител) для гранулированной подпитки 5 дал результаты, аналогичные с подпитками 2, 3 и 4 (данные не показаны).
Фигура 8: Процесс получения гранул: Гранулирование происходит посредством смачивания сухого порошка в псевдоожиженном роторе. В примере процесса получения гранул компоненты среды развешивают по отдельным группам, чтобы ограничить взаимодействия перед обработкой. Группы для применения в сухом порошке сегрегируют от тех компонентов, которые будут впрыскивать в псевдоожиженный порошок. Сухой порошок или раствор для впрыскивания, или они оба содержат связующее вещество. Готовят впрыскиваемые растворы, а компоненты сухого порошка размалывают и смешивают до гомогенности. В данном документе для непосредственного гранулирования из порошка используется роторная технология.
Фигура 9A и 9B: Примеры компонентов или групп для получения гранул модулярных сред, подпиток или добавок. Отнесение к категориям основано на их свойствах, таких как растворимость, или к тенденции к вступлению в нежелательные реакции с другими компонентами. В целом, нежелательные реагенты держат отдельно до конечной стадии, когда их добавляют вместе, аккуратно, чтобы предотвратить преципитацию, или образование аддуктов (что сделает продукт бесполезным), когда гранулы в конечном итоге восстанавливают жидкостью. Примерами категорий являются нейтральные растворимые компоненты, основные растворимые компоненты, кислые растворимые компоненты.
Фигура 10: Пример процесса для получения модулярной среды, в котором сначала добавляют кислые растворимые (объемные) элементы, потом основные нейтральные элементы и, наконец, следовые металлические элементы. В одном варианте реализации каждый элемент (растворимый в кислотах, растворимый в основаниях или растворимый в нейтральных жидкостях) можно гранулировать отдельно. В другом варианте реализации элементы добавляют последовательно в виде порошков, а затем гранулируют вместе для образования композитных гранул. В других вариантах реализации отдельный растворимый в кислотах элемент или комбинацию растворимых в кислотах элементов, такой как конкретная растворимая в кислотах аминокислота или комбинация аминокислот, или отдельный или комбинацию растворимых в основаниях элементов, или отдельный или комбинацию растворимых в нейтральных жидкостях элементов можно формовать в виде гранул. Следует отметить, что описанный в данном документе последовательный порядок добавления (сначала растворимые в кислотах, потом растворимые в основаниях или растворимые в нейтральных жидкостях элементы) является исключительно примером. При желании порядок добавления или смешивания можно менять, и он может зависеть от состава или наличия компонентов, вступающих в нежелательные реакции.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к способам получения сухих порошковых сред. При упоминании в этом описании сухие порошковые среды могут относиться к сухим порошковым средам (базальным средам или полным средам), сухим концентрированным клеточным культуральным средам, сухим порошковым подпиткам или добавкам, сухим порошковым концентрированным подпиткам или добавкам, сухим порошковым буферам, которые можно использовать в комбинации, или частично, или сами по себе (в случае полной среды) в культивировании клетки. В целом, культивирование относится к культивированию клетки in vitro. Способ получения гранулированных сред или подпиток в соответствии с настоящим изобретением будет описан ниже.
Для типичного рабочего процесса в производстве биотерапевтических средств с применением клеточных культур требуется распределение на открытом воздухе, восстановление сухой порошковой среды, дополнительные этапы приготовления с последующей корректировкой pH/осмолярности, фильтрация и перенос в биореактор. Многоэтапный процесс потенциально может привносить риск вследствие ошибочного приготовления или вследствие загрязнения нежелательными занесенными агентами (например, бактериями, вирусами, микоплазмой и т.д.).
Желательным решением вышеуказанной проблемы было бы обеспечение полной клеточной культуральной среды или подпитки для добавления в сухом формате, так, чтобы увлажнение среды или подпитки можно было проводить в «закрытой системе» перед добавлением в биореактор. Настоящее изобретение относится к гранулирующимся в псевдоожиженном слое порошкам базальных или полных клеточных культуральных сред, порошкам подпиток, порошкам добавок, порошкам буферов, порошкам витаминов, порошкам присадок или тому подобному для приготовления гранулированных или микрогранулированных форматов, которые можно легко использовать в таких «закрытых системах». Применение порошковых клеточных культуральных сред в виде «микрогранул» с компактным размером, хорошими свойствами сыпучести может обеспечить более легкое восстановление в жидкости для применения в биофармацевтическом производстве, чем сухой порошок с мелкими порошковыми частицами, которые разлетаются, приводя к потере материалов.
Процесс гранулирования в псевдоожиженном слое может быть взят из фармацевтической промышленности; фармацевтические композиции содержат от пары до нескольких ингредиентов в композиции. Например, фармацевтические композиции могут содержать от одного до максимум десяти компонентов. С другой стороны, порошки клеточных культуральных сред, порошки подпиток, порошки добавок, применяемые для культивирования клеток, в частности, клеток животных, конкретнее, клеток млекопитающих и, еще конкретнее, рекомбинантных клеток для получения рекомбинантных белков и вакцин, являются очень сложными в том смысле, что обычно они содержат от 80 до 100 отдельных компонентов, каждый из которых необходим в точном количестве. Некоторые из компонентов сред, такие как соли или ионы металлов, могут вступать в реакцию во время производственного процесса и могут образовывать аддукты или другие нежелательные для культуры клеток вещества в получаемой в результате композиции. Следовательно, можно проводить строгую оценку получаемой в результате среды после любого производственного процесса в отношении физической, химической и биологической оценки (роста и продуктивности клеточной культуры). Следовательно, адаптация любого процесса гранулирования из фармацевтической промышленности к композиции клеточной культуральной среды не является прямой. Производство гранул или микрогранул клеточных культуральных сред, как вручную, так и посредством автоматизированного процесса, ранее не проводилось вследствие сложности, связанной с таким процессом. В действительности, даже наши собственные начальные попытки в гранулировании сред приводили к получению нежелательного клейкого, похожего на тянучку вещества, слишком влажных материалов среды с плохими сыпучими свойствами. Точное применение фармацевтических процессов гранулирования (которые разработаны для меньшего количества химических веществ, лекарственных препаратов) могут сделать получаемую в результате среду или подпитку бесполезной в том смысле, что, хотя возможно получение хороших микрогранул/гранул, если гранула не может поддерживать жизнеспособность и рост клеток или не может поддерживать/улучшать продуктивность клеток, конечная цель не достигается. Следовательно, до появления настоящего изобретения оставалась потребность в гранулированных композициях сред и в способах получения гранулированных клеточных культуральных композиций (сред, подпиток, добавок, присадок и т.д.).
Описанные в данном документе гранулированные среды можно получать путем гранулирования смешанных порошковых компонентов сред, содержащих аминокислоты, сахара, витамины, следовые соли металлов, буферы, в рабочей камере, которая может вращаться, и в которую можно постепенно вносить дополнительные порошковые компоненты среды и/или растворитель при умеренной температуре. Растворитель, вносимый в гранулируемые смешанные порошковые компоненты сред может находиться в форме мелкой водяной пыли, пара, конденсата, спрея, мелких капель или в виде фазового состояния жидкость-газ.
В одном варианте реализации гранулы сред/подпиток могут быть получены вручную. Пример ручного способа описан в примерах 1 и 2, которые являются просто примером представленных идей и не должны восприниматься как ограничивающие объем того, как гранулы сред/подпиток можно получать вручную.
В другом варианте реализации гранулы сред/подпиток могут быть получены посредством автоматизированного процесса. В автоматизированном процессе можно использовать роторную технологию в аппарате с псевдоожиженным слоем, также называемым в данном документе рабочей камерой. Как понятно специалисту в данной области техники, в рабочей камере с псевдоожиженным слоем могут быть использованы или приспособлены любые средства, обеспечивающие вращение/центрифугирование. Применение термина «роторный диск», или «роторная технология», или «распылительный ротор» не следует воспринимать в ограниченном масштабе. Большое число эквивалентных технологий может обеспечить аналогичные результаты: например, также можно применять «центробежный диск», «фильтрацию с применением центробежного диска», «быстрый гранулирующий центробежный диск» и т.д., а специалист в данной области техники может соответствующим образом применить необходимые принципы. Конфигурацию «ротора», обеспечивающего вращение, также не следует воспринимать в ограниченном масштабе; ролики могут быть встроены в аппарат с псевдоожиженным слоем любым образом для обеспечения аналогичных результатов.
Не ограничиваясь теорией, считается, что псевдоожиженная система обеспечивает образование рассыпчатых частиц среды/подпитки в камере с псевдоожиженным слоем (или рабочей камере). Начало образования гранул с затравочных частиц среды не является обязательным, но может использоваться в случае необходимости. Дополнительный этап центрифугирования частиц в камере приводит к контакту частиц со стенками резервуара и/или перегородками резервуара и приводит к нарастанию порошка на рассыпчатых частицах с образованием гранул. Это похоже на нарастание снежного кома, который катится со склона, накапливая все больше порошкообразного снега в лавинном процессе, увеличиваясь в размере со все большим и большим нарастанием. При центрифугировании сухих порошковых частиц в правильных условиях происходит образование гранул хорошего размера. В примерном варианте реализации для создания гранул среды/подпитки применяли роторную камеру с псевдоожиженным слоем от Glatt Technologies, NJ. Технологии гранулирования с применением ротора/камер с псевдоожиженным слоем хорошо известны в фармацевтической промышленности. Однако, как было указано ранее, фармацевтические композиции содержат от пары до нескольких ингредиентов в рамках композиции. Например, фармацевтические композиции могут содержать от одного до максимум десяти компонентов. С другой стороны, порошки клеточных культуральных сред, порошки подпиток, порошки добавок, применяемые для культивирования клеток, в частности, клеток животных, конкретнее, клеток млекопитающих и, еще конкретнее, рекомбинантных клеток для получения рекомбинантных белков и вакцин, являются очень сложными в том смысле, что обычно они содержат от 80 до 100 отдельных компонентов, каждый из которых необходим в точном количестве. Некоторые из компонентов сред/подпиток, такие как соли или ионы металлов, могут вступать в реакцию во время производственного процесса, образовывая аддукты, другие нежелательные вещества. Следовательно, адаптация любого процесса гранулирования из фармацевтической промышленности к композиции клеточной культуральной среды не является прямой. Производство гранул или микрогранул клеточных культуральных сред, как вручную, так и посредством автоматизированного процесса, ранее не проводилось вследствие сложности, связанной с таким процессом. В действительности, даже наши собственные начальные попытки в гранулировании сред приводили к получению нежелательного клейкого, похожего на тянучку вещества или слишком влажных материалов среды с плохими сыпучими свойствами. Кроме того, фармацевтические процессы гранулирования (которые разработаны для меньшего количества химических веществ, лекарственных препаратов) могут сделать получаемую в результате среду или подпитку бесполезной в том смысле, что хотя возможно получение хороших микрогранул/гранул, если гранула не может поддерживать жизнеспособность и рост клеток или не может поддерживать/улучшать продуктивность клеток, конечная цель не достигается. Следовательно, до появления настоящего изобретения оставалась потребность в гранулированных композициях сред и в способах получения гранулированных клеточных культуральных композиций.
Описанные в данном документе гранулированные среды/подпитки отличаются от описанных выше и упоминаемых в другом месте описания (и включенных посредством ссылки) агломерированных сред тем, что они гранулируются посредством роторной технологии (центрифугирование, нарастание размера частиц) во вращающейся камере, с перегородками или без и другими средствами усиления процесса нарастания размера частиц.
Связующие вещества для описанных в данном документе гранулированных композиций могут быть клейкими и обеспечивать гранулам связующие свойства. Связующее вещество может представлять собой сахара, любые природные связующие вещества или синтетический или полусинтетический полимер. Сахара могут использоваться в сухой или жидкой форме и дополнительно включают, но не ограничиваются этим, глюкозу (любой изомер - D- или L-), сахарозу (любой изомер - D- или L-), любой моносахарид, дисахарид, олигосахарид, лактозу, мальтозу, трегалозу или любой ароматический сахар. Природные связующие вещества могут использоваться в сухой, влажной или пастообразной формах и включают, но не ограничиваются этим, целлюлозу, крахмал, клейстеризованный крахмал, не-сахара, такие как аравийская камедь, желатин, альгиновая кислота, трагакант и другие, известные в данной области техники. Синтетические или полусинтетические полимеры включают, но не ограничиваются этим, целлюлозу, этилцеллюлозу, поливиниловые спирты, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и другие, известные в данной области техники (связующие вещества, описанные в http://www.pharmainfo.net/binders, которые можно взаимозаменяемо использовать в рамках данного документа, включены посредством ссылки). В определенных случаях «вспомогательные вещества» можно добавлять к базовому порошку перед получением гранул. Вспомогательные вещества представляют собой неактивные вещества (что означает, что они не влияют на клеточный рост или культуру), которые могут служить в качестве носителя для обеспечения клеток другими полезными веществами в среде. Вспомогательные вещества также могут действовать как модификаторы растворимости, как разрыхлители, как барьеры для покрытия частиц среды (например, пленочные покрытия, инертные вещества и т.д.). Примеры вспомогательных веществ включают, но не ограничиваются этим, полимеры или микрокристаллическую целлюлозу, кристаллические соли, сахара, буферы и т.д. Некоторые вещества могут считаться связующими или вспомогательными, следовательно, термины связующие вещества и вспомогательные вещества могут взаимозаменяемо использоваться в этом описании, но остаются понятным специалисту в данной области техники. В определенных вариантах реализации разрыхлители можно вносить в гранулы посредством сухого порошка или растворителя; и они могут составлять 1-10% от частицы гранулы; разрыхлители могут включать, но не ограничиваются этим, кроссповидон, перекрестно-сшитую карбоксиметилцеллюлозу натрия, гидроксипропилцеллюлозу с низкой степенью замещения или тому подобное.
В некоторых вариантах реализации скорость впрыскивания может являться фактором образования гранул из сухой порошковой среды или подпитки. Клеточные культуральные подпитки, в особенности среды, содержат множество ингредиентов (до 100 компонентов). Некоторые из этих ингредиентов имеют высокую растворимость в воде, тогда как другие хуже растворяются в воде, а другие являются клейкими или адгезивными. Комбинирование химических свойств является проблемой для образования гранул подпиток или сред (в противоположность меньшему количеству комбинаций в фармацевтических средствах). Например, в случае определенных составов, когда в сухой порошок среды/подпитки может быть впрыснуто слишком много воды, или в других составах, если уровень впрыскивания является слишком быстрым, соединения, имеющие высокую растворимость в воде, могут начать растворяться, что может препятствовать образованию гранул. Хотя оптимальный уровень исходного растворения может быть необходим для образования гранул, изначальное смачивание смеси может привести к клейкости порошка. Снова, при оптимальном уровне клейкость может приводить к получению хороших гранул. Однако в определенных случаях наблюдали, что слишком большая клейкость (это применимо только к определенным составам вследствие избытка растворителя или быстрой скорости впрыскивания и т.д.) может вместо этого приводить к тянучей консистенции компонентов сухой клеточной культуры, а не к образованию гранул. Например, в одном неудачном варианте реализации в случае базового порошка, содержащего микрокристаллическую целлюлозу (40%), использовали скорость впрыскивания 40 г/мин, что приводило к тянучей консистенции компонентов сухой клеточной культуры, а не к образованию гранул. На основании описанных в данном документе идей специалисту в данной области техники будут понятны ограничения и он сможет получить гранулированные формы сред/подпиток, применяя подробно описанные и проиллюстрированные примерами идеи.
Связующие вещества и/или вспомогательные вещества можно вмешивать в базовый размолотый порошок и/или можно впрыскивать в рабочую камеру с порошком. В предложенных в данном документе примерах, которые можно не считать ограничивающими, применяли различные условия для получения гранул: например, гранулированная подпитка 2, гранулированная подпитка 3, гранулированная подпитка 4 и гранулированная подпитка 5 были получены, как подробно описано ниже. Полученные таким образом гранулы оценивали в следующих анализах: 1) в отношении физических характеристик (смотрите фотографии под микроскопом и распределение по размеру частиц: например, смотрите фигуры 3A и B, 4A и B, 5A и B и 6A и B); 2) и в отношении их аналитического содержания до и после гранулирования. Анализ проводили методом ВЭЖХ; что означает, что компоненты среды, такие как содержание аминокислот, содержание растворимых в воде витаминов, содержание гидрофобных аминокислот и т.д., анализировали до и после гранулирования (данные не показаны). Аналитические данные для каждой из гранулированных подпиток 2, 3, 4 и 5 были сравнимы так, что аналитические данные до и после гранулирования не продемонстрировали существенных изменений; и 3) в отношении их биологической активности, продуктивности в клеточной культуре (смотрите фигуры 3-7; подраздел С, применимо к каждой гранулированной подпитке).
Гранулы сред или подпиток могут иметь множество применений в клеточной культуре. Например, в некоторых вариантах реализации размер гранулярных частиц в диапазоне от 0 до менее чем около 500 микронов можно использовать в приготовлении водных суспензий сред/подпиток для применения в клеточной культуре. В других вариантах реализации размер гранулярных частиц в диапазоне от около 800 до около 500 микронов можно использовать в приготовлении таблеток сред/подпиток в виде множества частиц для применения в клеточной культуре. В другом варианте реализации размер гранулярных частиц в диапазоне от около 500 до около 2000 микронов можно использовать в приготовлении капсул сред/подпиток для применения в клеточной культуре.
Сферы применения: Гранулы/микрогранулы согласно изобретению имеют потенциальное применение в широком диапазоне эукариотических и микробных клеточных культурах. Гранулы/микрогранулы согласно изобретению обеспечивают несколько новых возможностей доставки, таких как: возможность обеспечивать единичные дозированные формы для применения в системах с периодической подпиткой; возможность отмеряемого дозирования питательных веществ для применения в перфузионных системах; новая возможность производить модулярные наборы, состоящие из некоторого количества гранулированных питательных веществ (например, витаминных гранул, аминокислотных гранул и т.д.); или возможность поверхностного покрытия (полимерными пленками) гранулярных композиций для использования в применениях с контролируемым высвобождением. В некоторых вариантах реализации размер гранулярных частиц можно регулировать для различных применений: например, гранулы в диапазоне от 0 до менее чем 500 микронов можно использовать в приготовлении водных суспензий сред/подпиток для применения в клеточной культуре; в других вариантах реализации размер гранулярных частиц в диапазоне от около 800 до около 500 микронов можно использовать в приготовлении таблеток сред/подпиток в виде множества частиц для применения в клеточной культуре; в другом варианте реализации размер гранулярных частиц в диапазоне от около 500 до около 2000 микронов можно использовать в приготовлении капсул сред/подпиток для применения в клеточной культуре.
В одном аспекте настоящего изобретения предложены сухие порошковые составы, прошедшие гранулирование. В другом аспекте изобретения предложены составы клеточной культуральной среды, содержащие все необходимые питательные факторы, которые облегчают in vitro культивирование клеток. В некоторых вариантах реализации в изобретении предложены способы и средства получения этих гранулированных составов. В некоторых вариантах реализации в изобретении предложены способы и средства внесения добавок в эти иди другие составы сред.
Клеточная культуральная среда в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой любую смесь компонентов, которые поддерживают и/или обеспечивают in vitro рост клеток. Клеточная культуральная среда может содержать некоторые, часть или все компоненты, необходимые для поддержания и/или обеспечения in vitro роста клеток. Если клеточная культуральная среда содержит только некоторые компоненты, дополнительные компоненты добавляют отдельно. Примерами клеточных культуральных сред в соответствии с настоящим изобретением являются полные среды, которые содержат все компоненты, необходимые для поддержания и/или обеспечения in vitro роста клеток, добавки или подпитки для среды. В предпочтительном варианте реализации клеточная культуральная среда может представлять собой полную среду. Существует потребность в новых форматах сухих порошковых сред.
Клеточные культуральные среды согласно изобретению могут поддерживать и/или обеспечивать рост клеток в планшете, колбе, биореакторе или в любой клеточной культуральной системе или емкости, такой как одноразовый пакет. В предпочтительном варианте реализации клеточная культуральная среда может представлять собой химически определенную клеточную культуральную среду. Химически определенные клеточные культуральные среды являются средами, которые не содержат каких-либо химически неопределенных веществ. Это означает, что химическая композиция и структура каждого химического вещества, используемого для получения среды, может быть известна по количеству и природе. Химически определенные среды не содержат экстрактов или гидролизатов растительного, животного, дрожжевого, грибкового происхождения; или они не содержат сыворотку, сывороточные фракции, кондиционированные среды, лизаты, клеточные экстракты, питающие клетки или компоненты, которые могут способствовать плохой химической определенности любого компонента в средах. Иногда химически определенные среды можно определить как содержащие определенные пептиды или определенные белки, в известных количествах и прослеживаемого происхождения.
Определения
В контексте данного документа термин «гранула» или «микрогранула» относится к «композициям клеточных культуральных сред», которые были уплотнены посредством любого процесса гранулирования для улучшения внешнего вида, смешиваемости, для увеличения размера частиц, для избежания пыльности, для приготовления более плотного материала, для снижения сегрегации компонентов среды, для общего улучшения физических и химических свойств мелкодисперсных порошков сред. Сухие гранулы также могут улучшать сыпучесть порошка и устранять нежелательные свойства, такие как закупорка входных и выходных отверстий любых контейнеров для сред, например, биореакторов, пакетов для сред, шаттлов для сред или аппаратов для смешивания сред и т.д.
В контексте данного документа термин «порошок» или «сухой порошок» относится к композициям порошков сред или порошковых сред для клеточной культуры, которые находятся в гранулярной форме, чьи общие внешние характеристики могут соответствовать сыпучему состоянию. Термин «порошок» включает агломерированные порошки. В контексте данного документа термин «базовый порошок» или «сухой базовый порошок» в целом относится к стартовой композиции сухого порошка перед возможным гранулированием. Термины «базовый порошок», «сухой базовый порошок» или «сухой порошок» могут употребляться взаимозаменяемо и, в зависимости от контекста, могут относиться к стартовому сухому порошку перед возможным гранулированием. или даже «сухой порошок» в контексте данного документа просто относится к. Он может не означать, что материал может быть полностью свободен от комплексного или агломерированного растворителя, если не указано иное.
Термины «композиции клеточных культуральных сред» или «композиции порошковых сред», или «порошки сред», или «сухие порошковые составы», или «составы сред» могут употребляться взаимозаменяемо и в широком смысле включают, например, среды, добавки к средам, подгруппы сред или буферы согласно изобретению, и могут включать, но не ограничиваться этим, базальные среды, полные среды, подпитки для сред, добавки для сред, присадки для сред, концентрированные среды, концентрированные добавки и подпитки, аминокислоты или группы аминокислот, короткие пептиды, витамины, буферы, соли, следовые компоненты и т.д. В целом, эти термины относятся к компонентам, добавляемым во время клеточного культивирования, а специалист в данной области техники легко поймет, когда или как используются эти термины.
Термин «ингредиент» относится к любому соединению, химического или биологического происхождения, которое можно использовать в клеточных культуральных средах для поддержания или стимуляции роста или пролиферации клеток. Термины «компонент», «питательное вещество» и «ингредиент» могут употребляться взаимозаменяемо и все они относятся к таким соединениям. Типичные ингредиенты, которые используются в клеточных культуральных средах, включают аминокислоты, соли, металлы, сахара, углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты, гормоны, витамины, жирные кислоты, белки и тому подобное. Другие ингредиенты, которые могут стимулировать или поддерживать культивирование клеток ex vivo, могут быть выбраны специалистами в данной области техники в соответствии с конкретной потребностью.
Выражения «клеточная культуральная среда», «культуральная среда» и «состав среды» (в каждом случае множественное число - это «среды») относятся к питательному раствору, который поддерживает культивирование и/или рост клеток; эти выражения могут употребляться взаимозаменяемо. Клеточная культуральная среда может представлять собой базальную среду (общую среду, для которой требуются дополнительные ингредиенты для поддержания клеточного роста) или полную среду, которая содержит все или практически все компоненты для поддержания клеточного роста. Клеточная культуральная среда может быть бессывороточной, безбелковой (один или оба варианта), может требовать или не требовать дополнительных компонентов, таких как факторы роста, присадки, подпитки, добавки, для эффективной и полноценной продуктивности клеток.
Термин «комбинирование» относится к смешиванию или примешиванию ингредиентов в составе клеточной культуральной среды. Комбинирование может происходить в жидкой или порошковой форме или с применением одного или более порошков и одной или более жидкостей. В другом примере два или более порошковых компонентов могут быть смешаны, а затем агломерировать в образовании комплексной смеси, такой как среды, добавки к средам, подгруппы сред или буферы.
Термин «приведение в контакт» относится к помещению предназначенных для культивирования клеток в культуральный сосуд со средой, в которой предстоит культивировать клетки. Термин «приведение в контакт» включает, помимо прочего, смешивание клеток со средой, перфузию клеток со средой, пипетирование среды на клетки в культуральном сосуде и погружение клеток в культуральную среду. «Культивирование с периодической подпиткой» определяет способ подачи композиций согласно настоящему изобретению к клеткам так, чтобы концентрация реагента являлась суммой отдельных добавлений реагента.
Добавление к клеткам в стандартной культуре подпитки или добавки может оказывать благоприятное действие на их поддержание или размножение, или рост, или жизнеспособность, или влиять на продуктивность клеток, или повышать долговечность культуры, или поддерживать клетки в псевдостационарной фазе, в которой продолжается экспрессия продукта, или приводить к существенному повышению конечного титра продукта. Термины подпитка или добавка могут взаимозаменяемо употребляться в этом описании и относятся к порошковым и жидким форматам (включая агломерированные форматы) компонентов сред, содержащим одну или более аминокислот, сахаров, витаминов, буферов, иногда пептидов, гидролизатов, фракций, факторов роста, гормонов и т.д., необходимых для восстановления баланса или восполнения, или для модуляции роста или продуктивности клеток в культуре или клеточной культуральной системе. Подпитка или добавка могут отличаться от клеточной культуральной среды тем, что их добавляют в клеточную культуральную среду, в которой может культивироваться клетка. Как понятно специалисту в данной области техники, иногда подпитка/добавка может содержать, главным образом, те аминокислоты, сахара, витамины, буферы и т.д., которые необходимы для восстановления баланса или восполнения, или для модуляции роста или продуктивности клеток в культуре или клеточной культуральной системе. Подпитка или добавка могут быть или не быть концентрированными, или могут быть частично концентрированными в отношении только определенных компонентов. Термины «подпитка» или «добавка», которые при добавлении в стандартные клеточные культуральные среды повышают рост клеток, долговечность культуры и экспрессию продукта. Приведены примеры, в которых показано, когда добавка может быть исключительно эффективной при выработке антител. В альтернативном варианте подпитки или добавки можно использовать для гибридомных линий клеток, линий клеток, в которых культивируют вирусы для производства вакцин, и т.д.
Термин «продуктивность клетки» означает культивирование клетки in vitro и оценку по любому стандартному параметру, известному специалисту в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, измерение одного или более из: числа/количества клеток, белковой экспрессии, оценки ДНК, измерения белкового титра, выработки рекомбинантного полипептида или белка, секреции полипептида или белка, выработки вируса или вирусной частицы, секретируемого белка, вырабатывают/секретируют ли клетки представляющий интерес белок, выявления клеточных маркеров, находится ли клетка в суспензии или является иммобилизованной клеткой, и т.д. В целом, продуктивность клетки оценивают в отношении того, когда количество конечного продукта может быть повышено вследствие добавления или изменения формата (например, гранулированного формата по сравнению с контрольным (жидким) форматом; культуры с подпиткой или без подпитки и т.д.).
Под растворителем подразумевается вода (дистиллированная и/или деионизированная вода, вода для инъекций (ВДИ) Gibco® для клеточных культур может представлять собой высококачественную, имеющую степень очистки, подходящую для клеточных культур, воду, которая соответствует требованиям как Фармакопеи Соединенных Штатов (USP), так и Европейской Фармакопеи (EP)), буферы, кислоты или основания (корректирующие pH агенты), любые из которых могут содержать один или более дополнительных компонентов (например, соли, полисахариды, ионы, детергенты, стабилизаторы и т.д.).
Размер частиц гранул можно количественно оценить методами рассеяния лазерного излучения или механической сегрегации на откалиброванных экранах с относительным размером ячеек сита. В целом, размер частиц можно выражать в микронах, миллиметрах или в размерах ячеек сита согласно стандартизированным в США измерениям - сравнительная таблица преобразования приведена ниже. Гранулы, полученные описанными в этом документе способами, могут иметь различные размеры; в некоторых случаях гранула имеет размер от около 0,05 мм до 7 мм. В конкретном аспекте в изобретении предложены гранулы, имеющие размер от около 0,05 мм до около 0,5 мм, или от около 0,05 мм до около 1 мм, или от около 0,05 мм до около 2 мм, или от около 0,05 мм до около 3 мм, или от около 0,05 мм до около 4 мм, или от около 0,05 мм до около 5 мм, или от около 0,05 мм до около 6 мм, или от около 0,05 мм до около 0,1 мм, или от около 0,05 мм до около 0,2 мм, или от около 0,05 мм до около 0,3 мм, или от около 0,05 мм до около 0,4 мм, или от около 0,1 мм до около 1 мм, или от около 0,1 мм до около 2 мм, или от около 0,1 мм до около 3 мм, или от около 0,1 мм до около 4 мм, или от около 0,1 мм до около 5 мм, или от около 0,1 мм до около 6 мм, или от около 0,5 мм до около 1 мм, или от около 0,5 мм до около 2 мм, или от около 0,5 мм до около 3 мм, или от около 0,5 мм до около 4 мм, или от около 0,5 мм до около 5 мм, или от около 0,5 мм до около 6 мм, или от около 0,5 мм до около 7 мм, или от около 1 мм до около 2 мм, или от около 1 мм до около 3 мм, или от около 1 мм до около 4 мм, или от около 1 мм до около 5 мм, или от около 1 мм до около 6 мм, или от около 1 мм до около 7 мм. В конкретном варианте реализации в изобретении предложены гранулярные препараты, имеющие в основном размер гранул, который может быть больше чем около 0,1 мм, или больше чем около 0,2 мм, или больше чем около 0,3 мм, или больше чем около 0,4 мм, или больше чем около 0,5 мм, или больше чем около 0,6 мм, или больше чем около 0,7 мм, или больше чем около 0,8 мм, или больше чем около 0,9 мм, или больше чем около 1 мм, или больше чем около 2 мм.
| Таблица 1 Размер частиц (США) | ||
| Микрон | Шкала США | Дюймы |
| 2000 | 10 | 0,0787 |
| 1680 | 12 | 0,0661 |
| 1410 | 14 | 0,0555 |
| 1190 | 16 | 0,0469 |
| 1000 | 18 | 0,0394 |
| 841 | 20 | 0,0331 |
| 707 | 25 | 0,028 |
| 595 | 30 | 0,0232 |
| 500 | 35 | 0,0197 |
| 420 | 40 | 0,0165 |
| 354 | 45 | 0,0138 |
| 297 | 50 | 0,0117 |
| 250 | 60 | 0,0098 |
| 210 | 70 | 0,0083 |
| 177 | 80 | 0,007 |
| 149 | 100 | 0,0059 |
| 125 | 120 | 0,0049 |
| 105 | 140 | 0,0041 |
| 88 | 170 | 0,0035 |
| 74 | 200 | 0,0029 |
| 63 | 230 | 0,0024 |
| 53 | 270 | 0,0021 |
| 44 | 325 | 0,0017 |
| 37 | 400 | 0,0015 |
Составы сред, подпиток/добавок для сред и подгрупп сред, предназначенные для гранулирования, а также многие другие обычно используемые среды для культивирования клеток животных хорошо известны в данной области техники и могут быть найдены, например, в каталоге и справочном руководстве GIBCO/BRL (Invitrogen Corporation Carlsbad California) и в каталоге клеток животных Sigma (Sigma; St. Louis, Missouri).
Агломерированные среды и их препараты, в частности, для применения в клеточных культурах, были хорошо описаны. Технология с применением псевдоожиженного слоя позволяет получать агломерированные порошки, имеющие измененные характеристики (в частности, например, растворимость) по сравнению со стартовыми материалами. В обычных применениях этой технологии порошки суспендируют в восходящем столбе воздуха, и в то же время в поток порошка может впрыскиваться регулируемое и определенное количество жидкости для получения смоченного состояния порошка; затем может использоваться умеренное нагревание для высушивания материала, что приводит к получению агломерированного порошка. Препараты агломерированных сред/подпиток, питательных порошков, добавок и т.д., их свойства, способы обеспечения автоматического pH и автоматической осмолярности агломерированных сред/подпиток, питательных порошков, добавок и т.д. были подробно описаны в заявках/патентах предыдущего уровня техники: например, в заявках на патент США № 09/023790; 11/669827; 13/984263; PCT/US 2012/024194; заявке на Европейский патент 10175914.0; Европейской публикации 2778221, а их описание в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки. Способы анализа объемной плотности, угла естественного откоса, размера частиц агломерированных сред хорошо описаны, например, в заявке на патент США № 11/669827, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.
Предназначенные для гранулирования среды/подпитки могут иметь pH, который может быть оптимальным для поддержания клеточного культивирования или роста без необходимости в корректировке pH жидкой среды. Следовательно, такой тип среды, определяемой в данном документе как «среда с автоматической корректировкой pH», устраняет необходимость во времязатратных и подверженных ошибкам этапах добавления буфера (ов) к среде после восстановления и корректировке pH среды после растворения буфера (ов), и был хорошо описан в заявке на патент США № 11/669827, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки. Например, среда для культивирования клеток млекопитающих, приготовленная в соответствии с этими способами, может после восстановления иметь pH от около 7,1 до около 7,5, более предпочтительно от около 7,1 до около 7,4 и наиболее предпочтительно 7,2 до около 7,4 или от около 7,2 до около 7,3. Среду с автоматическим регулированием pH можно обеспечить путем подбора буферных систем, присутствующих в самой среде, например, противопоставляя формы кисло-основных аминокислот в конъюгате. Путем подбора противоположных по pH форм таких буферов в среде в изобретении предложено получение среды с автоматическим регулированием pH, позволяющее избежать необходимости добавления дополнительных буферов или корректирующих pH агентов для достижения надлежащего уровня pH до или после восстановления среды и перед использованием. Например, натриевый HEPES (увеличение pH) и HEPES-HCl (понижение pH) являются примерами противоположных по pH компонентов. Одноосновные, двухосновные и/или трехосновные буферные соли являются другими примерами противоположных по pH компонентов. Как правило, используют одно-, двух- и трехосновные фосфатные соли, но другие соли также могут использоваться в соответствующих соотношениях.
«Микросуспензии»: Компонент (ы) клеточных культуральных сред или базового порошка можно растворять, суспендировать, коллоидировать или каким-либо другим образом вносить в растворитель в необходимой концентрации перед применением для гранулирования (смотрите пример 1).
Предложены способы выращивания клеток, в которых применяются описанные в данном документе добавки к средам таким образом, что они могут быть включены в среду в начале культивирования или могут добавляться в режиме периодической подпитки или в непрерывном режиме. Получаемые в результате среды можно использовать в различных способах культивирования, включая, но не ограничиваясь этим, режимы с подпиткой, с периодической подпиткой, хемостатный и перфузионный, и с различным оборудованием для культивирования клеток, включая, но не ограничиваясь этим, стационарные колбы, встряхиваемые колбы, вращающиеся колбы, ферментеры с перемешиванием, эрлифтные ферментеры, мембранные реакторы (включая, реакторы на основе половолоконных мембран, плоских мембран, с перфузией по внешнему контуру), реакторы с клетками, удерживаемыми на твердой подложке или иммобилизованными/захваченными в микропористых гранулах, и любые другие конфигурации, подходящие для роста или поддержания необходимой линии клеток.
Линии клеток, которые можно выращивать в восстановленных из гранул жидких средах, могут представлять клетки эукариот, прокариот, животных, растений, грибов, водорослей, насекомых или дрожжей или клетки, применяемые для культивирования вирусов или вирусных частиц. Примеры таких клеток включают, но не ограничиваются этим, кератиноциты, эндотелиальные клетки, гепатоциты, меланоциты, клетки CHO, клетки BHK, VERO, клетки 293, PerC6, гибридомы, гемопоэтические клетки, эмбриональные клетки, нервные клетки и т.д.
Дополнительные компоненты для добавления в низких количествах в культуральные среды согласно изобретению можно включать или не включать по необходимости, например, сыворотку или сывороточные фракции, факторы роста (например, EGF, aFGF, bFGF, KGF, HGF, IGF-1, IGF-2, NGF, инсулин и тому подобное), интерлейкины, колониестимулирующие факторы, интерфероны, факторы прикрепления, компоненты внеклеточного матрикса (например, коллагены, ламинины, протеогликаны, гликозаминогликаны, фибронектин, витронектин и тому подобное), липиды (такие как фосфолипиды, холестерин, концентрат бычьего холестерина, жирные кислоты, сфинголипиды и тому подобное), пептиды (например: ди-, три-, тетрапептиды), очищенные или рекомбинантно экспрессируемые белки (например: рекомбинантный альбумин, рекомбинантный инсулин), гидролизаты (например, растений, таких как рис, дрожжи, кукуруза, картофель) и т.д.
ПРИМЕРЫ
Новые признаки изобретения приведены в подробностях в прилагающейся формуле изобретения. Лучшее понимание признаков и преимуществ настоящего изобретения обеспечивается ссылкой на нижеприведенные примеры, в которых используются принципы данного изобретения. Специалисту в данной области техники понятно, что описанные в данном документе примеры являются всего лишь аспектами представленный идей и не должны восприниматься как каким-либо образом ограничивающие объем представленных идей.
Получение гранул клеточных культуральных сред, подпиток, добавок или буферов
В данном документе описаны примеры протоколов для получения гранул из сухого порошка клеточной культуральной среды, подпитки, буфера или добавки. Принципы, используемые в этих процедурах, и упоминаемое в данном документе оборудование, могут широко применяться специалистом в данной области техники для получения любой гранулярной композиции.
ПРИМЕР 1: Ручной способ получения гранул из микросуспензий
В данном документе представлен ручной способ гранулирования подпитки с применением процесса экструзии.
1) В этом примере стартовым базовым размолотым порошком был продукт из каталога, эффективная подпитка B AGT (также называемая подпиткой 1 на фигурах 1 и 2) [номер каталога Thermo Fisher, агломерированный, #A2530]. Развесить 30 г эффективной подпитки B AGT (в данном случае без использования фосфата натрия) в ступку. Фосфаты могут быть включены в состав.
2) Добавить 12,5 мл ВДИ (воды).
3) Используя зеленую пластиковую гибкую лопатку, перемешивать, пока порошок не будет смочен и не начнет «вбирать» воду и образовывать пасту. Тщательно быстро перемешивать пасту до гомогенности.
4) В случае необходимости получения вязкой, но текучей смеси добавить в микросуспензии ВДИ и тщательно перемешать. При необходимости смочить мельницу с двигателем и пестиком. Мокрый размол делает микросуспензию более гомогенной и снижает количество пузырьков воздуха, возникающих вследствие интенсивного перемешивания.
5) Собрать в контейнер; использовать лопатку для «соскребания» последнего количества микросуспензии в контейнер (объем будет составлять ~ 29-30 мл).
6) Подготовить пипеточный дозатор Eppendorf Repeater-Plus с 0,5 мл шприцем путем обрезания кончика на ~1/64ʺ ножницами, убедившись, что надрез находится не дальше расположения поршня шприца при полном вдавливании.
7) Используя пипеточный дозатор Eppendorf Repeater-Plus с 0,5 мл шприцем, установленным в положение 0,5 (5 мкл), медленно втянуть микросуспензию в шприц. Убедиться, что в шприц не попал воздух, так как он останется в вязкой микросуспензии и изменит доставляемый объем.
8) Надавить на рычажок Eppendorf несколько раз для заполнения шприца. После того, как микросуспензия вытечет из конца шприца, протереть конец шприца. Затем удерживать конец шприца вертикально вблизи твердой гидрофобной поверхности (например, парафиновой пленки или восковой бумаги), нажать на рычажок и аккуратно пометить каплю на поверхность. Незамедлительно поднять, нажать на рычажок снова и повторить. Копии можно делать очень быстро.
9) Поместить в вытяжной шкаф на 18-24 часа. Смотрите фигуры 1A, 1B, 1C и подписи к ним.
10) Собрать гранулы, поместить на чашу весов и поместить в вакуумную сушильную камеру над CaSO4.
11) Оставить гранулы сохнуть на 48-72 часа. Полученные таким образом гранулы называются гранулированной подпиткой 1, или подпиткой 1 или гранулами подпитки 1, что иногда используется взаимозаменяемо. Из 3,0 мл добавки эффективной подпитки В было получено 0,156 г гранул. Смотрите фигуры 1A, 1B и 1C в отношении изображений гранул. Размер гранул оказался однородным и измеряемым в миллиметровом диапазоне. Гранулы использовали для анализа жизнеспособности, роста и продуктивности (белкового титра), описанного в примере 4.
ПРИМЕР 2: Биологическая оценка приготовленных вручную гранул подпитки 1
Готовили гранулы подпитки 1 (смотрите пример 1) и использовали в анализе жизнеспособности, роста и продуктивности (белкового титра) клеток. Результаты для гранул/таблеток подпитки 1 были сравнимы с жидкой добавкой (положительный контроль; который представляет собой #A2530, восстановленный в жидкости и стерильно профильтрованный перед использованием). Для анализа выращивали линию клеток DG44-IgG в среде CD-OptiCHO (Thermo Fisher, каталог # 12681). В культуру добавляли/не добавляли (как указано) эффективную подпитку B (EFB) (Thermo Fisher, каталог #A2530) или подпитку 1 в формате гранул (иногда называемых таблетками) или в виде жидкости (положительный контроль). Клетки последовательно пассировали три раза в течение 3 суток и при каждом последующем пассаже клетки разделяли по 3×10 e5 жизнеспособных клеток/мл. На 4-м последовательном пассаже проводили ежедневный подсчет клеток. Каждое условие исследовали в трех копиях (то есть, кривые 1, 2, 3 являются тремя копиями для каждого типа добавки. На фигуре 2A показана жизнеспособность для приготовленных вручную гранул (исследуемый образец) на кривых таблеток 1, 2, 3; жизнеспособность для жидкости (положительный контроль) показана как жидк. 1, 2, 3; жизнеспособность без добавок (отрицательный контроль) показана как отр. контр. 1, 2, 3. Концентрации таблеток/гранул EFB были эквимолярными по сравнению с жидким форматом EFB. Как показано на фигуре 2A, клеточная культура с добавкой таблеток/гранул EFB (1, 2, 3) продемонстрировала лучший % жизнеспособности по сравнению с клеточной культурой с добавкой жидкой EFB (1, 2, 3), в особенности на 8-16 сутки.
Гранулы/таблетки подпитки 1 сравнивали с жидкой добавкой (положительный контроль) в анализе роста клеток - фигура 2B. В данном случае также использовали линию клеток DG44-IgG в среде CD-OptiCHO (Thermo Fisher, каталог #12681). Клетки последовательно пассировали и разделяли, как описано выше для 2A. На 4-м последовательном пассаже проводили ежедневный подсчет клеток. Каждое условие исследовали в трех копиях (то есть, кривые 1, 2, 3 являются тремя копиями для каждого условия. На фигуре 2B рост приготовленных вручную гранул (исследуемый образец) показан на кривых таблеток 1, 2, 3; кривые роста для жидкости (положительный контроль) показаны как жидк. 1, 2, 3); кривые роста без добавок (отрицательный контроль) показана как отр. контр. 1, 2, 3. Концентрации таблеток/гранул EFB были эквимолярными по сравнению с жидким форматом EFB. Как показано на фигуре 2B, клеточная культура с добавкой таблеток/гранул (1, 2, 3) продемонстрировала сравнимый рост клеток в течение периода, составляющего 15 суток в культуре, по сравнению с клеточной культурой с добавкой жидкости (1, 2, 3).
Гранулы/таблетки подпитки 1 сравнивали с жидкой добавкой (положительный контроль) в анализе продуктивности клеток или белкового титра (измерение выработки антител) -фигура 2C. В данном случае также использовали линию клеток DG44-IgG в среде CD-OptiCHO (Thermo Fisher, каталог #12681). Клетки последовательно пассировали и разделяли, как описано выше для 2A. На 4-м последовательном пассаже проводили ежедневный подсчет клеток и отслеживали выработку IgG. Каждое условие исследовали в трех копиях (то есть, кривые 1, 2, 3 являются тремя копиями для каждого условия. Как показано на фигуре 2C, белковые титры (продуктивность клеток) приготовленных вручную гранул показана на кривых таблеток 1, 2, 3; белковые титры для жидкости (положительный контроль) показаны как жидк. 1, 2, 3); белковые титры без добавок (отрицательный контроль) показана как отр. контр. 1, 2, 3. Как показано на фигуре 2C, клеточная культура с добавкой таблеток/гранул 1, 2, 3 демонстрировала выработку IgG ~ 325 мкг/мл (выработки), что немного ниже, чем выработка IgG ~425 мкг/мл в случае положительного жидкого контроля EFB (1, 2, 3), в течение периода, составляющего 15 суток в культуре. Отрицательный контроль без добавок продемонстрировал намного меньшую выработку IgG, ~100 мкг/мл, по сравнению с клеточной культурой с добавкой таблеток EFB (исследуемой).
ПРИМЕР 3: Пример автоматизированного процесса гранулирования в псевдоожиженном слое
В данном документе представлен пример автоматизированного процесса для получения гранул. В данном случае использовали роторную технологию в аппарате с псевдоожиженным слоем/рабочей камере (например, Glatt Technologies, NJ). Для получения гранул клеточных культуральных сред можно адаптировать любую вращающуюся рабочую камеру. Стартовый сухой порошок (клеточную культуральную среду, подпитку и т.д.) загружали на роторный диск аппарата с псевдоожиженным слоем, который приводился во вращение, при этом в аппарат с псевдоожиженным слоем поступал воздух. В этом случае жидкость аккуратно вносили (например, в виде мелкораспыленной струи, мелкой водяной пыли, пара, росы, конденсата или мелких капель) при регулируемой скорости, иногда с периодичностью, при регулируемой температуре, так, чтобы происходило образование гранул сухого порошка. Как правило, автоматическое оборудование также можно использовать для получения гранул; оно включает в себя, но не ограничивается этим: оборудование для размола, мельницу для тонкого помола, процессор с псевдоожиженным слоем, ротор с вращающимся диском, распылители для растворителя и т.д. Смотрите фигуру 8 в отношении типового рабочего процесса гранулирования сред. В конкретном варианте реализации гранулы формируют следующим образом:
a. Начинают с размолотого сухого базового порошка (не гранулированного). Необязательно, базовый порошок можно предварительно смачивать подходящим растворителем. Сухой порошок может содержать или не содержать связующее вещество и/или вспомогательное вещество. Кроме того, предназначенный для впрыскивания растворитель может содержать или не содержать связующее вещество и/или вспомогательное вещество.
b. Если в сухом базовом порошке отсутствует связующее вещество и/или вспомогательное вещество, или, в альтернативном варианте, если для образования гранулы необходимо больше связующего вещества и/или вспомогательного вещества (которое присутствует в базовом порошке), предназначенный для впрыскивания раствор растворителя будет содержать соответствующее количество связующего вещества и/или вспомогательного вещества.
c. В данном документе описаны примеры параметров процесса для получения гранул клеточной культуральной подпитки. Эти параметры были выбраны для исследуемых составов.
i. Скорость впрыскивания: наиболее предпочтительно 5 г/мин (диапазон скорости впрыскивания: от около 1 г/мин до около 30 г/мин в зависимости от состава)
ii. Температура на входе - 25°C (20-25oC)
iii. Температура продукта - (20-30oC) (так как среда/подпитка содержит термочувствительные компоненты)
iv. Объем воздуха (30-40 м3/ч)
v. Давление воздуха при распылении - 2 бар
vi. Температура сушки для гранул (50-60°C) (так как среда содержит термочувствительные компоненты) в процессоре с псевдоожиженным слоем.
vii.
ПРИМЕР 4: Примеры препаратов сред, используемых для автоматизированного процесса гранулирования.
Следующие композиции сред использовали для приготовления гранул в автоматизированной системе. Эти композиции служат исключительно примерами и не должны восприниматься как ограничивающие.
При приготовлении гранулированной подпитки 2, гранулированной подпитки 3, гранулированной подпитки 4 и гранулированной подпитки 5 стартовым сухим базовым порошком был продукт из каталога Thermo Fisher, PL002616P1. Примеры подпиток, описанные ниже, исследовали в отношении гранулирования:
| Аминокислоты | 25-35% |
| Глюкоза | 40-65% |
| Витамины | 1-5% |
| Соли | 3-5% |
| Следовые компоненты | 0,01-0,05% |
| ВСЕГО | 100% |
Гранулы могут содержать или не содержать связующие вещества и/или вспомогательные вещества, которые можно вмешивать в базовый размолотый порошок и/или можно впрыскивать в рабочую камеру с порошком. Применяли различные условия для получения гранул: гранулированной подпитки 2, гранулированной подпитки 3, гранулированной подпитки 4 и гранулированной подпитки 5, как подробно описано ниже. Полученные таким образом гранулы оценивали в трех типах анализа: 1) в отношении физических характеристик (смотрите фотографии под микроскопом и распределение по размеру частиц: фигуры 3A и B, 4A и B, 5A и B и 6A и B); 2) в отношении их аналитического содержания до и после гранулирования. Гранулы подпиток исследовали методом ВЭЖХ в отношении химической композиции и сравнивали с размолотым порошковым стартовым материалом. Анализ ВЭЖХ в отношении компонентов среды, таких как содержание аминокислот, содержание растворимых в воде витаминов, содержание гидрофобных аминокислот и т.д. (данные не показаны), показал, что многие ингредиенты в подпитывающей среде остались в пределах приемлемого диапазона после прохождения этапов процесса и сушки во время гранулирования. Аналитические данные до и после гранулирования для каждой из подпиток 2, 3, 4 и 5 были сравнимы; и 3) в отношении их биологической активности, продуктивности в клеточной культуре (смотрите фигуры 3-7; подраздел С, применимо к каждой гранулированной подпитке).
Гранулы сред или подпиток могут иметь множество применений в клеточной культуре. Например, в некоторых вариантах реализации размер частиц гранул в диапазоне от 0 до менее чем около 500 микронов можно использовать в приготовлении суспензий сред/подпиток на основе воды для применения в клеточной культуре. В других вариантах реализации размер частиц гранул в диапазоне от около 800 до около 500 микронов можно использовать в приготовлении таблеток сред/подпиток в виде множества частиц для применения в клеточной культуре. В другом варианте реализации размер частиц гранул в диапазоне от около 500 до около 2000 микронов можно использовать в приготовлении капсул сред/подпиток для применения в клеточной культуре. Пример состава для приготовления таких гранулированных подпиток представлен ниже:
| Аминокислоты | 20,710% |
| Декстроза | 28,610% |
| Витамины | 0,010% |
| Соли | 36,480% |
| Органические вещества | 13,150% |
| Следовые компоненты | 0,001% |
| ВСЕГО | 98,961% |
ПРИМЕР 5: Примеры способов для измерения физических характеристик порошков
Пример способа для процедуры анализа сыпучести
Эту процедуру можно использовать для анализа потока, а измерения, которые можно определить, включают FRI (показатель скорости потока); FDI (показатель плотности питающего вещества); BDI (показатель плотности ячейки); и SPI (показатель плотности пружины).
1. Собрать контейнер для образцов индисайзер (любой системы индисайзер для определения скорости потока, например, от Johanson Innovations, Inc, San Luis Obispo, CA) путем помещения сетчатого экрана, закрепленного на опорной вставке внизу чаши для образцов.
2. Тарировать контейнер для образцов индисайзер на соответствующий баланс.
3. Поместить приблизительно 100 граммов образца в подходящий контейнер и насытить воздухом путем перемешивания образца ложкой или венчиком.
4. Используя лопатку, удалить часть образца и аккуратно поместить образец в собранный контейнер для образцов индисайзер, избегая уплотнения образца.
5. Повторять добавления образца, пока образец гранул не будет пересыпаться/находиться над контейнером для образцов индисайзер.
6. Аккуратно сравнять образец гранул с верхней частью контейнера для образцов индисайзер путем сметания избытка.
7. Взвесить и записать массу образца гранул в контейнере для образцов индисайзер, используя ранее тарированный баланс.
8. Поместить контейнер для образцов на индисайзер и подсоединить воздуховоды к контейнеру для образцов.
9. Установить рабочие параметры на индисайзере для угла ячейки, диаметра выхода и диаметра ячейки. После завершения испытаний записать выходные данные индисайзера.
Пример процедуры для измерения угла естественного откоса
1. Поместить приблизительно 50 граммов образца в подходящий контейнер и насытить воздухом путем перемешивания образца ложкой или венчиком.
2. Установить прямоугольную коробку со слоем порошка на опорную платформу.
3. Убедиться, что опорная платформа установлена на угол в 0 (ноль) градусов, измеряемый внизу платформы.
4. Насыпать материал через воронку в прямоугольную коробку со слоем порошка до тех пор, пока материал не достанет по меньшей мере до одной из боковых стенок коробки и не образует конус.
5. Медленно и непрерывно поднимать коробку со слоем образца и платформу, используя опорный винт, обеспечивая насколько можно плавное перемещение.
6. Как только верхушка материала сдвинется, прекратить вращение опорного винта и провести измерение угла естественного откоса, используя угломер устройства, считывая угол на угломере в основании опорной платформы.
ПРИМЕР 6: Автоматизированное гранулирование в псевдоожиженном слое с применением роторной технологии - получение гранулированной подпитки 2
Гранулы/таблетки подпитки 2 готовили с помощью автоматизированного процесса, как описано ниже:
1. Начинают с размолотого сухого базового порошка (не гранулированного), каталог Thermo Fisher # PL002616P1- 950,0 г (чистая масса). Необязательно, в определенных вариантах реализации базовый порошок можно предварительно смачивать; в данном случае это не делается.
2. Загружают порошок в процессор с псевдоожиженным слоем, оборудованный роторным диском.
3. Включают процессор с псевдоожиженным на предварительно установленные условия (определенные во время разработки), чтобы начать непосредственное гранулирование из порошка. Параметры регулируют (например, объем воздуха, давление воздуха при распылении, скорость потока, входная температура, выходная температура, температура продукта, скорость впрыскивания растворителя, скорость роторного диска, зазор диска, форма диска и т.д.)
4. Отслеживают образование гранул путем проведения измерений для образцов во время процесса (например, микроскопии, фигура 3A; других физических свойств=таблица 2; размера частиц, фигура 3B и таблица 3, ниже) для определения, когда процесс будет завершен.
5. Достают влажные гранулы (общая масса 805,0 г) из процессора с псевдоожиженным слоем.
6. Сушат влажные гранулы для проведения анализа физических свойств (таблица 2).
7. Берут приблизительно 50,0 г гранул для измерения размера частиц (таблица 3).
Оценка физических характеристик полученной автоматизированным способом гранулированной подпитки 2
| Таблица 2: Гранулированная подпитка 2: Физические характеристики | ||||
| Материал | Масса (г) | Потеря при высушивании (%) | объемная плотность (г/куб. см) |
Угол естественного откоса |
| размолотый порошок | 950 | - | 0,719 | 37,8 |
| влажные гранулы | 805 | - | - | - |
| сухие гранулы | 800,4 | 2,07 | 0,53 | 34,7 |
Угол естественного откоса менее 50° (34,7) указывает на то, что гранулированная подпитка 2 имеет хорошую сыпучесть. Объемная плотность указывает на то, что частицы при необходимости можно уплотнять.
| Таблица 3: Гранулированная подпитка 2: Анализ размера частиц | |||
| Мэш # | Задерживаемый размер (микроны) | Задерживаемое количество (г) | Задерживаемый процент |
| 20 | 840 | 8,9 | 17,8 |
| 30 | 600 | 21,4 | 42,8 |
| 40 | 420 | 13,6 | 27,2 |
| 60 | 250 | 3,6 | 7,2 |
| 80 | 177 | 0,7 | 1,4 |
| 100 | 150 | 0,9 | 1,8 |
| Чаша | < 150 | 0,9 | 1,8 |
| Всего | - | 50 | - |
Анализ размера частиц для подпитки 2 показывает, что около 95% частиц превышают мэш 60, тогда как около 87,8% частиц превышают мэш 40 или около 87,8% > 0,4 мм.
Затем гранулы подпитки 2 оценивали в анализе жизнеспособности, роста и продуктивности (белкового титра). Результаты для гранул/таблеток подпитки 2 были сравнимы с жидкой добавкой (положительный контроль), которая представляет собой # PL002616P1 из каталога Thermo Fisher, восстановленный в жидкости и стерильно профильтрованный перед использованием. Для анализа выращивали линию клеток DG44-IgG в среде CD-CHO (Thermo Fisher, каталог # 12490). В культуру добавляли/не добавляли (как указано) # PL002616P1 из каталога Thermo Fisher - в формате гранул (иногда называемых таблетками) или в виде жидкости (положительный контроль). Клетки последовательно пассировали три раза в течение 3 суток и при каждом последующем пассаже клетки разделяли по 3×10 e5 жизнеспособных клеток/мл. На 4-м пассаже проводили ежедневный подсчет клеток.
Автоматически полученные гранулы/таблетки подпитки 2 сравнивали с жидкой добавкой (положительный контроль) в анализе роста клеток - фигура 3C. Клеточная культура с добавкой таблеток/гранул продемонстрировала сравнимый рост клеток в течение периода, составляющего 15 суток в культуре, по сравнению с клеточной культурой с добавкой жидкости. Гранулированная подпитка 2 продемонстрировала количество жизнеспособных клеток, составляющее ~ 10×10 e6 клеток/мл (рост), что немного больше, чем в клеточной культуре с добавкой положительной контрольной подпитки (~8×10 e6).
Проводили анализ жизнеспособности для гранулированных подпиток 2 и сравнивали с положительным (с добавкой жидкой подпитки) или отрицательным контролями (без добавки жидкости или гранул) -фигура 7A. Как видно из графика 7A, гранулированные подпитки 2, 3 и 4 были хорошо сопоставимы, как и положительный контроль, и превосходили отрицательный контроль, в особенности после 6 суток.
Проводили анализ продуктивности клеток (выработки антител) для гранулированных подпиток 2 и сравнивали с положительным (с добавкой жидкой подпитки) или отрицательным контролями (без добавки жидкости или гранул) -фигура 7B. Как видно из графика 7B, гранулированные подпитки 2 были хорошо сопоставимы, как и положительный контроль, и превосходили отрицательный контроль, в особенности после 4 суток. Клеточная культура с добавкой гранулированной подпитки 2 (~ 229 мкг/мл) демонстрировала выработку IgG, сравнимую с выработкой IgG, ~228 мкг/мл (на 14 сутки), для положительной контрольной подпитки; анализ клеточной культуры без добавок (отрицательный контроль) продемонстрировал намного меньшее количество IgG (~100 мкг/мл) по сравнению с клеточной культурой с добавкой гранулированной подпитки 2.
ПРИМЕР 7: Автоматизированное гранулирование в псевдоожиженном слое с применением роторной технологии - получение гранулированной подпитки 3
Гранулы/таблетки подпитки 3 готовили с помощью автоматизированного процесса, как описано ниже.
1. Начинают с размолотого сухого базового порошка (не гранулированного), каталог Thermo Fisher # PL002616P1- 950,0 г (чистая масса). Необязательно, в определенных вариантах реализации базовый порошок можно предварительно смачивать; в данном случае это не делается.
2. Загружают порошок в процессор с псевдоожиженным слоем, оборудованный роторным диском.
3. Включить процессор с псевдоожиженным на предварительно установленные условия (определенные во время разработки), чтобы начать непосредственное гранулирование из порошка. (например, объем воздуха, давление воздуха при распылении, скорость потока, входная температура, выходная температура, температура продукта, скорость впрыскивания растворителя, скорость роторного диска, зазор диска, форма диска и т.д.)
4. Отслеживают образование гранул путем проведения измерений для образцов во время процесса (например, микроскопии, фигура 4A; других физических свойств=таблица 4; размера частиц, фигура 4B и таблица 5, ниже) для определения, когда процесс будет завершен. Достают влажные гранулы (общая масса 770,0 г) из процессора с псевдоожиженным слоем.
5. Сушат влажные гранулы для проведения анализа физических свойств (таблица 4).
6. Берут приблизительно 50,0 г гранул для измерения размера частиц (таблица 5).
| Таблица 4: Гранулированная подпитка 3: Физические характеристики | ||||
| Материал | Масса (г) | Потеря при высушивании (%) | объемная плотность (Г/куб. см) |
Угол естественного откоса |
| размолотый порошок | 950 | - | 0,719 | 37,8 |
| влажные гранулы | 770 | - | - | - |
| сухие гранулы | 744,25 | 2,58 | 0,56 | 34,9 |
Угол естественного откоса менее 50° (34,9) указывает на то, что гранулированная подпитка 3 имеет хорошую сыпучесть. Объемная плотность указывает на то, что частицы при необходимости можно уплотнять.
| Таблица 5: Гранулированная подпитка 3: Анализ размера частиц | |||
| Мэш # | Задерживаемый размер (микроны) | Задерживаемое количество (г) | Задерживаемый процент |
| 20 | 840 | 6,4 | 12,7 |
| 30 | 600 | 14,1 | 27,9 |
| 40 | 420 | 14,8 | 29,3 |
| 60 | 250 | 9,5 | 18,8 |
| 80 | 177 | 3,5 | 6,9 |
| 100 | 150 | 1,7 | 3,4 |
| Чаша | < 150 | 0,5 | 1,0 |
| Всего | - | 50,5 | - |
Анализ размера частиц для подпитки 3 показывает, что около 88,7% частиц превышают мэш 60, тогда как около 69,9% частиц превышают мэш 40 или около 69,9% > 0,4 мм.
Затем гранулы подпитки 3 оценивали в анализе жизнеспособности, роста и продуктивности (белкового титра) аналогично с подпиткой 2. Результаты для гранул/таблеток подпитки 3 были сравнимы с жидкой добавкой (положительный контроль; который представляет собой # PL002616P1 из каталога Thermo Fisher, восстановленный в жидкости и стерильно профильтрованный перед использованием). Для анализа выращивали линию клеток DG44-IgG в среде CD-CHO (Thermo Fisher, каталог # 12490), аналогично с подпиткой 2 (гранулы подпитки 2=исследование гранулирования 1; гранулы подпитки 3=исследование гранулирования 2). Клетки последовательно пассировали три раза в течение 3 суток и при каждом последующем пассаже клетки разделяли по 3×10 e5 жизнеспособных клеток/мл. На 4-м пассаже проводили ежедневный подсчет клеток.
Автоматически полученные гранулы/таблетки подпитки 3 сравнивали с жидкой добавкой (положительный контроль) в анализе роста клеток - фигура 4C. Клеточная культура с добавкой гранулированной подпитки 3 продемонстрировала сравнимый с положительным контролем рост клеток в течение периода, составляющего 14 суток в культуре, в особенности, по сравнению с отрицательным контролем (начиная с 7 суток). Гранулированная подпитка 3 продемонстрировала количество жизнеспособных клеток, составляющее ~ 9×10 e6 клеток/мл (рост), что немного больше, чем в клеточной культуре с добавкой положительной контрольной подпитки (~8×10 e6).
Проводили анализ жизнеспособности для гранулированных подпиток 3 и сравнивали с положительным (с добавкой жидкой подпитки) или отрицательным контролями (без добавки жидкости или гранул) - фигура 7A. Как видно из графика 7A, гранулированные подпитки 2, 3 были хорошо сопоставимы, как и положительный контроль, и превосходили отрицательный контроль, в особенности после 6 суток.
Проводили анализ продуктивности клеток (выработки антител) для гранулированных подпиток 2, 3 и 4 и сравнивали с положительным (с добавкой жидкой подпитки) или отрицательным контролями (без добавки жидкости или гранул) - фигура 7B. Как видно из графика, гранулированные подпитки 3 были хорошо сопоставимы, как и положительный контроль, и превосходили отрицательный контроль, в особенности после 4 суток. Клеточная культура с добавкой гранулированной подпитки 3 (~ 243 мкг/мл) демонстрировала выработку IgG, немного выше, чем для положительной контрольной подпитки; анализ клеточной культуры без добавок (отрицательный контроль) продемонстрировал намного меньшее количество IgG (~100 мкг/мл) по сравнению с клеточной культурой с добавкой гранулированной подпитки 3.
ПРИМЕР 8: Автоматизированное гранулирование в псевдоожиженном слое с применением роторной технологии - получение гранулированной подпитки 4
Гранулы/таблетки подпитки 4 готовили с помощью автоматизированного процесса, как описано ниже.
1. Начинают с размолотого сухого базового порошка (не гранулированного), каталог Thermo Fisher # PL002616P1- 600,0 г (чистая масса), смешанного со связующим веществом, например: микрокристаллической целлюлозой Avicel®, (чистая масса 400,0 г), биополимером FMC типа PH-101, партия № P114826548.
2. Загружают смешанный порошок в процессор с псевдоожиженным слоем, оборудованный роторным диском.
7. Включить процессор с псевдоожиженным на предварительно установленные условия (определенные во время разработки), чтобы начать непосредственное гранулирование из порошка. (например, объем воздуха, давление воздуха при распылении, скорость потока, входная температура, выходная температура, температура продукта, скорость впрыскивания растворителя, скорость роторного диска, зазор диска, форма диска и т.д.)
3. Отслеживают образование гранул путем проведения измерений для образцов во время процесса (например, микроскопии, фигура 5A; других физических свойств=таблица 6; аналитики; размера частиц, фигура 5B и таблица 7, ниже) для определения, когда процесс будет завершен.
4. Достают влажные гранулы (общая масса 824,1 г) из процессора с псевдоожиженным слоем.
5. Сушат влажные гранулы для проведения анализа физических свойств (таблица 6).
6. Берут приблизительно 50,0 г гранул для измерения размера частиц (таблица 7).
| Таблица 6: Гранулированная подпитка 4: Физические характеристики | ||||
| Материал | Масса (г) | Потеря при высушивании (%) | объемная плотность (Г/куб. см) |
Угол естественного откоса |
| размолотый порошок | 950 | - | 0,719 | 37,8 |
| влажные гранулы | 824,1 | - | - | - |
| сухие гранулы | 788,1 | 4,37 | 0,5 | 43 |
Угол естественного откоса менее 50° (43) указывает на то, что гранулированная подпитка 4 имеет хорошую сыпучесть. Объемная плотность указывает на то, что частицы при необходимости можно уплотнять.
| Таблица 7: Гранулированная подпитка 4: Анализ размера частиц | |||
| Мэш # | Задерживаемый размер (микроны) | Задерживаемое количество (г) | Задерживаемый процент |
| 20 | 840 | 2,9 | 5,8 |
| 30 | 600 | 1 | 2,0 |
| 40 | 420 | 2,6 | 5,2 |
| 60 | 250 | 12,7 | 25,5 |
| 80 | 177 | 17,1 | 34,3 |
| 100 | 150 | 13 | 26,1 |
| Чаша | < 150 | 0,5 | 1,0 |
| Всего | - | 49,8 | - |
Анализ размера частиц для подпитки 4 показывает, что только около 38,5% частиц превышают мэш 60, тогда как только около 15% частиц превышают мэш 40 или около 15% > 0,4 мм. Разброс размеров частиц был больше, и больше частиц имело меньший размер.
Затем гранулы подпитки 4 оценивали в анализе жизнеспособности, роста и продуктивности (белкового титра) клеток аналогично с подпиткой 2 и подпиткой 3. Результаты для гранул/таблеток подпитки 4 были сравнимы с жидкой добавкой (положительный контроль; который представляет собой # PL002616P1 из каталога Thermo Fisher, восстановленный в жидкости и стерильно профильтрованный перед использованием). Для анализа выращивали линию клеток DG44-IgG в среде CD-CHO (Thermo Fisher, каталог # 12490). Клетки последовательно пассировали три раза в течение 3 суток и при каждом последующем пассаже клетки разделяли по 3×10 e5 жизнеспособных клеток/мл. На 4-м пассаже проводили ежедневный подсчет клеток.
Автоматически полученные гранулы/таблетки подпитки 4, содержащие дополнительное связующее вещество (кристаллическую целлюлозу), сравнивали с жидкой добавкой (положительный контроль) в анализе роста клеток - фигура 5C. Клеточная культура с добавкой гранулированной подпитки 4 продемонстрировала сравнимый с положительным контролем рост клеток в течение периода, составляющего 14 суток в культуре, в особенности, по сравнению с отрицательным контролем (начиная с 7 суток).
Проводили анализ жизнеспособности для гранулированных подпиток 4 и сравнивали с положительным (с добавкой жидкой подпитки) или отрицательным контролями (без добавки жидкости или гранул) -фигура 7A. Как видно из графика 7A, гранулированные подпитки 2, 3 и 4 были хорошо сопоставимы, как и положительный контроль, и превосходили отрицательный контроль, в особенности после 6 суток.
Проводили анализ продуктивности клеток (выработки антител) для гранулированной подпитки 4 (содержащей связующую целлюлозу) и сравнивали с положительным (с добавкой жидкой подпитки) или отрицательным контролями (без добавки жидкости или гранул) -фигура 7B. Как видно из графика, подпитка 4 была хорошо сопоставима, как и положительный контроль, и существенно превосходила отрицательный контроль, в особенности после 4 суток. Клеточная культура с добавкой гранулированной подпитки 4 (~ 200 мкг/мл) демонстрировала выработку IgG, немного ниже, но сравнимую с положительной контрольной подпиткой; в то же время анализ клеточной культуры без добавок (отрицательный контроль) продемонстрировал намного меньшее количество IgG (~100 мкг/мл ) по сравнению с клеточной культурой с добавкой гранулированной подпитки 4.
ПРИМЕР 9: Автоматизированное гранулирование в псевдоожиженном слое с применением роторной технологии - получение гранулированной подпитки 5
Гранулы/таблетки подпитки 5 готовили с помощью автоматизированного процесса, как описано ниже.
1. Начинают с микроизмельченного сухого базового порошка, каталог Thermo Fisher # PL002616P1- 950,0 г (чистая масса).
2. Загружают порошок в процессор с псевдоожиженным слоем, оборудованный роторным диском.
3. Включить процессор с псевдоожиженным на предварительно установленные условия (определенные во время разработки), чтобы начать непосредственное гранулирование из порошка (например, объем воздуха, давление воздуха при распылении, скорость потока, входная температура, выходная температура, температура продукта, скорость впрыскивания растворителя, скорость роторного диска, зазор диска, форма диска и т.д.)
4. Отслеживают образование гранул путем проведения измерений для образцов во время процесса (например, микроскопии, фигура 6A; других физических свойств=таблица 8; размера частиц, фигура 6B и таблица 9, ниже) для определения, когда процесс будет завершен.
5. Достают влажные гранулы (общая масса 824,1 г) из процессора с псевдоожиженным слоем.
6. Сушат влажные гранулы для проведения анализа физических свойств (таблица 8).
7. Берут приблизительно 50,0 г гранул для измерения размера частиц (таблица 9).
| Таблица 8: Гранулированная подпитка 5: Физические характеристики | ||||
| Материал | Масса (г) | Потеря при высушивании (%) | объемная плотность (Г/куб. см) |
Угол естественного откоса |
| размолотый порошок | 950 | - | 0,719 | 37,8 |
| влажные гранулы | 728,8 | - | - | - |
| сухие гранулы | 716,2 | 3,31 | 0,57 | 34,9 |
Угол естественного откоса менее 50° (34,9) указывает на то, что гранулированная подпитка 5 имеет хорошую сыпучесть. Объемная плотность указывает на то, что частицы при необходимости можно уплотнять.
| Таблица 9: Гранулированная подпитка 5: Анализ размера частиц | |||
| Мэш # | Задерживаемый размер (микроны) | Задерживаемое количество (г) | Задерживаемый процент |
| 20 | 840 | 4,4 | 8,8 |
| 30 | 600 | 1,1 | 2,2 |
| 40 | 420 | 8,1 | 16,3 |
| 60 | 250 | 28,1 | 56,4 |
| 80 | 177 | 6,4 | 12,9 |
| 100 | 150 | 0,3 | 0,6 |
| Чаша | < 150 | 1,4 | 2,8 |
| Всего | - | 49,8 | - |
Анализ размера частиц для подпитки 5 показывает, что около 83,7% частиц превышают мэш 60, тогда как около 27,3% частиц превышают мэш 40 или около 27,3% > 0,4 мм.
Затем гранулы подпитки 5 оценивали в анализе жизнеспособности, роста и продуктивности (белкового титра) клеток аналогично с подпиткой 2, 3, 4 (данные не показаны). Для анализа выращивали линию клеток DG44-IgG в среде CD-CHO (Thermo Fisher, каталог # 12490). Клетки последовательно пассировали три раза в течение 3 суток и при каждом последующем пассаже клетки разделяли по 3×10 e5 жизнеспособных клеток/мл. На 4-м пассаже проводили ежедневный подсчет клеток. Результаты для гранул/таблеток подпитки 5 сравнивали с жидкой добавкой (положительный контроль: # PL002616P1 из каталога Thermo Fisher, восстановленный в жидкости и стерильно профильтрованный перед использованием).
Клеточная культура с добавкой гранулированной подпитки 5 показала аналогичные результаты анализа роста клеток, анализа жизнеспособности клеток, анализа продуктивности клеток (выработки антител) с положительным контролем в течение периода, составляющего 14 суток в культуре, аналогично с результатами подпиток 2, 3 и 4 (данные не показаны).
Хотя в данном документе были показаны и описаны предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения, для специалистов в данной области техники очевидно, что такие варианты реализации приведены исключительно в качестве примера. Специалистам в данной области техники станут понятны многочисленные вариации, изменения и замены без отступления от изобретения. Следует понимать, что при практической реализации изобретения можно применять различные альтернативные варианты описанным в данном документе вариантам реализации изобретения. Подразумевается, что нижеприведенная формула изобретения определяет объем изобретения и что способы и структуры в пределах объема этой формулы изобретения и их эквиваленты ею охватываются.
1. Способ получения гранулы клеточной культуральной среды путем прямого гранулирования, включающий:
a) внесение во вращающийся дисковый ротор аппарата с псевдоожиженным слоем первого сухого порошка клеточной культуральной среды, содержащей базальную среду, полную среду, подпитку, добавку, концентрат среды, концентрат добавки или смесь аминокислот, которая может поддерживать культивирование клетки в культуре, и где указанный первый сухой порошок клеточной культуральной среды предварительно смачивают;
b) внесение во вращающийся дисковый ротор этапа (а) растворителя и/или второго сухого порошка клеточной культуральной среды, содержащей базальную среду, полную среду, подпитку, добавку, концентрат среды, концентрат добавки или смесь аминокислот, которая может поддерживать культивирование клетки в культуре, так, чтобы происходило образование гранулы клеточной культуральной среды; и
c) высушивание гранулы клеточной культуральной среды,
причем первый сухой порошок клеточной культуральной среды, второй сухой порошок клеточной культуральной среды или растворитель содержит связующее вещество, вспомогательное вещество или их оба.
2. Способ получения гранулы клеточной культуральной среды по п. 1, отличающийся тем, что первый и второй сухие порошки клеточной культуральной среды являются одинаковым типом сухих порошков клеточной культуральной среды или разными типами сухих порошков клеточной культуральной среды.
3. Способ получения гранулы клеточной культуральной среды по п. 1, отличающийся тем, что связующее вещество или вспомогательное вещество выбрано из группы, состоящей из сахара, природного вещества, синтетического вещества и полусинтетического вещества.
4. Способ получения гранулы клеточной культуральной среды по п. 3, отличающийся тем, что сахар выбран из группы, состоящей из глюкозы, сахарозы, трегалозы, моносахарида, дисахарида и олигосахарида, и где природное вещество представляет собой микрокристаллическую целлюлозу.
5. Способ получения гранулы клеточной культуральной среды по п. 1, отличающийся тем, что размер указанной гранулы составляет от около 0,05 мм до около 7 мм.
6. Способ получения гранулы клеточной культуральной среды по п. 1, отличающийся тем, что дисковый ротор вращается с разными скоростями.
7. Способ получения гранулы клеточной культуральной среды по п. 1, отличающийся тем, что растворитель вносят на этапе (b) посредством тангенциального впрыскивания, верхнего впрыскивания или нижнего впрыскивания.
8. Способ получения гранулы клеточной культуральной среды по п. 1, отличающийся тем, что скорость растворителя, вносимого на этапе (b), составляет от около 1 г/мин до около 30 г/мин.
9. Способ получения гранулы клеточной культуральной среды по п. 8, отличающийся тем, что скорость растворителя, вносимого на этапе (b), составляет около 5 г/мин.
10. Способ получения гранулы клеточной культуральной среды по п. 1, отличающийся тем, что температура входящего газа составляет от около 20°C до 30°C.
11. Способ получения гранулы модуля базового порошка путем прямого гранулирования, включающий:
a) внесение во вращающийся дисковый ротор аппарата с псевдоожиженным слоем первого сухого базового порошка питательной среды, содержащего основу среды, содержащую один или более водорастворимые витамины, один или более растворимые в кислотах витамины, один или более природные растворимые витамины, одну или более растворимые в кислотах аминокислоты, одну или более растворимые в основаниях аминокислоты, одну или более растворимые в нейтральной воде аминокислоты, одну или более водорастворимые неорганические соли, одну или более неорганические растворимые в кислотах соли, один или более сахара, один или более растворимые в кислотах следовые элементы, один или более растворимые в спирте полиамины, один или более растворимые в спирте липиды и одну или более буферные соли, и где указанный первый сухой базовый порошок питательной среды предварительно смачивают;
b) внесение во вращающийся дисковый ротор этапа (а) растворителя и, необязательно, второго сухого базового порошка питательной среды, содержащего основу среды, содержащую один или более водорастворимые витамины, один или более растворимые в кислотах витамины, один или более природные растворимые витамины, одну или более растворимые в кислотах аминокислоты, одну или более растворимые в основаниях аминокислоты, одну или более растворимые в нейтральной воде аминокислоты, одну или более водорастворимые неорганические соли, одну или более неорганические растворимые в кислотах соли, один или более сахара, один или более растворимые в кислотах следовые элементы, один или более растворимые в спирте полиамины, один или более растворимые в спирте липиды и одну или более буферные соли, так, чтобы происходило образование гранулы модуля базового порошка; и
c) высушивание гранулы модуля базового порошка,
причем первый сухой базовый порошок, второй сухой базовый порошок или растворитель содержит связующее вещество, вспомогательное вещество или их оба.
12. Способ получения гранулы питательной среды путем прямого гранулирования, включающий:
(а) внесение во вращающийся дисковый ротор аппарата с псевдоожиженным слоем сухого порошка среды, где указанный сухой порошок среды предварительно смачивают;
(b) внесение растворителя и/или второго сухого порошка среды; и
(с) образование гранулы, причем гранула содержит связующее вещество или вспомогательное вещество.
13. Способ получения гранулы клеточной культуральной среды по п. 1, отличающийся тем, что размер указанной гранулы составляет от около 0,05 мм до около 0,5 мм, или от около 0,05 мм до около 1 мм, или от около 0,05 мм до около 2 мм, или от около 0,05 мм до около 3 мм, или от около 0,05 мм до около 4 мм, или от около 0,05 мм до около 5 мм, или от около 0,05 мм до около 6 мм, или от около 0,05 мм до около 0,1 мм, или от около 0,05 мм до около 0,2 мм, или от около 0,05 мм до около 0,3 мм, или от около 0,05 мм до около 0,4 мм, или от около 0,1 мм до около 1 мм, или от около 0,1 мм до около 2 мм, или от около 0,1 мм до около 3 мм, или от около 0,1 мм до около 4 мм, или от около 0,1 мм до около 5 мм, или от около 0,1 мм до около 6 мм, или от около 0,5 мм до около 1 мм, или от около 0,5 мм до около 2 мм, или от около 0,5 мм до около 3 мм, или от около 0,5 мм до около 4 мм, или от около 0,5 мм до около 5 мм, или от около 0,5 мм до около 6 мм, или от около 0,5 мм до около 7 мм, или от около 1 мм до около 2 мм, или от около 1 мм до около 3 мм, или от около 1 мм до около 4 мм, или от около 1 мм до около 5 мм, или от около 1 мм до около 6 мм, или от около 1 мм до около 7 мм.
14. Способ получения гранулы клеточной культуральной среды по п. 1, отличающийся тем, что температура высушивания гранул составляет приблизительно 50°C - 60°C.
15. Способ получения гранулы модуля базового порошка питательной среды по п. 11, где базовый порошок содержит по массе 25–40% аминокислот, 20–65% D-глюкозы, 1–5% витаминов, 2–10% солей и 0,01–0,05% следовых компонентов.
16. Способ получения гранулы модуля базового порошка питательной среды по п. 11, где базовый порошок содержит по массе 31–32% аминокислот, 59–60% D-глюкозы, 25% витаминов, 6–7% солей и 0,01–0,05% следовых компонентов.
17. Способ получения гранулы питательной среды по п. 12, где связующее вещество представляет собой D-глюкозу.
