Анти-lag-3 антитела
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к выделенному агонистическому антителу против гена активации лимфоцитов-3 (LAG-3) и его антигенсвязывающему фрагменту, а также к содержащей его композиции. Также раскрыта нуклеиновая кислота, кодирующая указанное антитело или его фрагмент, а также содержащие ее вектор и клетка. Изобретение эффективно для лечения опосредованного Т-клетками иммунного нарушения. 9 н. и 55 з.п. ф-лы, 31 ил., 36 табл., 23 пр.
Данное изобретение относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые связываются с геном активации лимфоцитов-3 (LAG-3), в частности, антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые являются агонистами LAG-3, и применению антител или фрагментов в качестве лекарственных средств, в частности, для лечения состояний, связанных с пролиферацией и/или активацией CD4+ и/или CD8+ Т-клеток, в частности, воспалительных и аутоиммунных нарушений.
Ген активации лимфоцитов-3 (LAG-3) является гомологом мембранного белка типа I CD4, содержащим четыре внеклеточных домена суперсемейства Ig. Аналогично CD4, LAG-3 олигомеризуется на поверхностях Т-клеток и связывается с молекулами МНС класса II на антигенпредставляющих клетках (АРС), но со значительно более высокой аффинностью, чем CD4. LAG-3 экспрессируется на активированных CD4-положительных и CD8-положительных Т-лимфоцитах, где он ассоциирует с комплексом CD3-TCR на клеточной поверхности и негативно регулирует сигнальную трансдукцию. Как следствие, он негативно регулирует пролиферацию, функцию и гомеостаз Т-клеток. Когда происходит распознавание комплекса МНС класса II-пептид специфическим TCR, внутриклеточные сигналы трансдуцируются в Т-клетку посредством TCR и в АРС через молекулы МНС класса II. Негативная регуляторная роль передачи сигнала LAG-3 в Т-клетки осуществляется в первичных ответах CD4 и CD8 Т-клеток человека (
, et al., Immunology. 2005 Jun; 115(2): 170-178). Также, LAG-3 кодирует вариант альтернативного сплайсинга, который переводится в растворимую форму LAG-3 (sLAG-3). В виде растворимой молекулы LAG-3 активирует антигенпредставляющие клетки (АРС) путем передачи сигнала МНС класса II, что приводит к увеличению антигенспецифических Т-клеточных ответов in vivo (Triebel, Trends Immunol., 2003, 24: 619-622).
Аминокислотная последовательность человеческого и мышиного белка LAG-3 представлена на фигуре 1 в работе Huard et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 11: 5744-5749, 1997). Последовательность человеческого белка LAG-3 воспроизведена на фигуре 1 ниже (SEQ ID NO: 27). Аминокислотные последовательности четырех внеклеточных доменов суперсемейства Ig (D1, D2, D3 и D4) человеческого LAG-3 находятся в аминокислотных остатках: 1-149 (D1) (SEQ ID NO: 28); 150-239 (D2) (SEQ ID NO: 29); 240-330 (D3) (SEQ ID NO: 39); и 331-412 (D4) (SEQ ID NO: 51).
В работе Baixeras, et al. (J. Exp. Med., 1992, Vol. 176: 327-337) описано получение 17B4, мышиного моноклонального антитела (изотип IgG1) к человеческому белку LAG-3. Это антитело распознает внешнюю петлю из 30 аминокислот первого N-концевого домена D1 человеческого LAG-3. 17 В4 ингибирует взаимодействия LAG-3/класс МНС и увеличивает пролиферацию Т-клеток в качестве антагониста передачи сигнала LAG-3 (Huard at al., Eur J Immunol. 1996;26:1180-6). Моноклональное антитело (mAb) 17B4 не обладает агонистической активностью, что определяется его неспособностью индуцировать повышение уровня внутриклеточного свободного кальция в Т-клетках в отсутствие вторичного сшивающего реагента (Hannier et al., J Immunol. 1998;161:4058-65.).
Крайне желательны агенты, способные модулировать функции активации и/или эффекторные функции CD8-положительных и CD4-положительных Т-клеток. В частности, известно, что во многие аутоиммунные нарушения вовлечены аутореактивные Т-клетки и аутоантитела. Таким образом, существует потребность в агентах, которые способны ингибировать или элиминировать аутореактивные лимфоциты, не нарушая способность иммунной системы осуществлять защиту от патогенов.
В работе Poirier et al. (Clinical and Experimental Immunology, 2011, 164: 265-274) описана оценка цитотоксического химерного антитела против LAG-3 (химерного А9Н12). In vivo антитело истощало LAG-3+-активированные Т-клетки в лимфатических узлах и показало эффективность в отношении уменьшения воспаления кожи в модели туберкулин-индуцированной гиперчувствительности замедленного типа (DTH) у бабуинов. Антитела, которые специфически истощают активированные Т-клетки, представляют перспективную терапевтическую стратегию для предупреждения и/или лечения аутоиммунных нарушений.
В качестве альтернативной стратегии заявитель установил, что агонисты LAG-3 будут негативно регулировать пролиферацию и/или функцию Т-клеток без истощения Т-клеток, и что такие агонисты можно также использовать для лечения воспалительных или аутоиммунных нарушений.
Заявитель смог получить моноклональные анти-LAG-3 агонистические антитела. Эти антитела ингибируют антиген-индуцированную пролиферацию CD4-положительных и CD8-положительных Т-клеток. Такие антитела и их антигенсвязывающие фрагменты можно использовать для лечения иммунных нарушений, в частности, иммунных нарушений, опосредованных Т-клетками, включая воспалительные и аутоиммунные нарушения.
В соответствии с изобретением предлагается агонистическое анти-LAG-3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В частности, антитело представляет собой моноклональное агонистическое анти-LAG-3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
Используемый здесь термин «LAG-3» относится к гену активации лимфоцитов-3. Термин «LAG-3» включает варианты, изоформы, гомологи, ортологи и паралоги. Например, антитела, специфические в отношении человеческого белка LAG-3, могут в некоторых случаях перекрестно реагировать с белком LAG-3 видов, отличных от человека. В других вариантах осуществления антитела, специфические в отношении человеческого белка LAG-3, могут быть полностью специфическими в отношении человеческого белка LAG-3 и могут не проявлять видовую или другие типы перекрестной реактивности, или могут перекрестно реагировать с LAG-3 некоторых других, но не всех других видов (например, перекрестно реагировать с LAG-3 обезьяны, но не мышиным LAG-3). Термин «человеческий LAG-3» относится к последовательности человеческого LAG-3, такой как полная аминокислотная последовательность человеческого LAG-3, имеющая номер доступа в Genbank NP 002277 (SEQ ID NO: 38), или аминокислотная последовательность человеческого белка LAG-3, представленная на фигуре 1 (SEQ ID NO: 27). Термин «мышиный LAG-3» относится к мышиной последовательности LAG-3, такой как полная аминокислотная последовательность мышиного LAG-3, имеющая номер доступа в Genbank NP_032505. В уровне техники LAG-3 также известен, например, как CD223. Последовательность человеческого LAG-3 может отличаться от поледовательности человеческого LAG-3, имеющей номер доступа в Genbank NP_002277, наличием, например, консервативных мутаций или мутаций в неконсервативных областях, и LAG-3 обладает по существу такой же биологической функцией, что и человеческий LAG-3, имеющий номер доступа в Genbank NP_002277. Например, биологическая функция человеческого LAG-3 заключается в наличии эпитопа во внеклеточном домене LAG-3, который специфически связан с антителом согласно настоящему изобретению, или биологической функцией человеческого LAG-3 является связывание с молекулами МНС класса II.
Термин «обезьяний LAG-3» охватывает белки LAG-3, экспрессируемые обезьянами Старого и Нового Света, включая, но без ограничения, LAG-3 макак-крабоедов и LAG-3 макак-резус. Репрезентативная аминокислотная последовательность обезьяньего LAG-3 представляет собой аминокислотную последовательность LAG-3 макак-резус, которая также депонирована в Genbank под номером доступа XM_001108923. Другая репрезентативная аминокислотная последовательность обезьяньего LAG-3 представляет собой альтернативную последовательность макак-резус клона ра23-5, описанную в US 2011/0150892 А1. Эта альтернативная аминокислотная последовательность макак-резус имеет единственное отличие в положении 419 от последовательности, депонированной в Genbank.
Конкретная последовательность человеческого LAG-3 обычно по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности человеческого LAG-3, имеющей номер доступа в Genbank NP_002277, и содержит аминокислотные остатки, которые идентифицируют аминокислотную последовательность как человеческую при сравнении с аминокислотными последовательностями LAG-3 других видов (например, мышей). В некоторых случаях аминокислотная последовательность человеческого LAG-3 может быть по меньшей мере на 95% или даже по меньшей мере на 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности LAG-3, имеющей номер доступа в Genbank NP_002277. В некоторых вариантах осуществления последовательность человеческого LAG-3 будет проявлять не более 10 аминокислотных отличий от последовательности LAG-3, имеющей номер доступа в Genbank NP_002277. В некоторых вариантах осуществления человеческий LAG-3 может проявлять не более 5 или даже не более 4, 3, 2 или 1 аминокислотного отличия от последовательности LAG-3, имеющей номер доступа в Genbank NP_002277. Процентная идентичность может быть определена, как описано в настоящем документе.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления агонистическое анти-LAG-3 антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток или антиген-индуцированную активацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток.
Агонистическое анти-LAG-3 антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой выделенное агонистическое анти-LAG-3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
Термин «агонистический» используется в настоящем документе взаимозаменяемо с термином «агонист».
Также, в соответствии с изобретением предлагается выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с LAG-3 и ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток или антиген-индуцированную активацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток.
В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ Т-клеток и/или антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ Т-клеток и антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток. В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток больше, чем антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ Т-клеток.
На фигуре 21 показаны различия между истощающими анти-LAG-3 антителами, антагонистическими анти-LAG-3 антителами и антителами согласно изобретению (то есть агонистическими анти-LAG-3 антителами и антителами, которые связываются с LAG-3 и ингибируют антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток или антиген-индуцированную активацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток).
Истощающее анти-LAG-3 антитело вызывает истощение активированных Т-клеток путем связывания с LAG-3, экспрессируемым на поверхности клеток. Истощение может достигаться через антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), или комплементзависимую цитотоксичность (CDC). В ADCC область Fc истощающего антитела связывается с рецепторами Fc (FcγRs) на поверхности иммунных эффекторных клеток, таких как природные клетки-киллеры и макрофаги, что приводит к лизису клеток-мишеней. В CDC область Fc истощающего антитела связывается с C1q-компонентом комплемента, и клетка-мишень уничтожается путем запуска каскада комплемента на клеточной поверхности. Таким образом, истощающие анти-LAG-3 антитела ингибируют опосредованные Т-клетками иммунные ответы. Следует учесть, что эффекты истощающих анти-LAG-3 антител являются длительными и необратимыми, так как они вызывают деструкцию активированных Т-клеток. Такие антитела являются полезными, например, для лечения воспалительных и аутоиммунных нарушений, и для предотвращения отторжения трансплантата.
Антагонистическое анти-LAG-3 антитело связывается с LAG-3 на поверхности активированных Т-клеток и предотвращает взаимодействие LAG-3 с молекулами МНС класса II на поверхности антигенпредставляющих клеток (АРС). Это блокирует негативную регуляцию сигнальной трансдукции, что происходит, когда АРС связываются с LAG-3 на поверхности активированных Т-клетках. Соответственно, антагонистические анти-LAG-3 антитела предотвращают негативную регуляцию пролиферации, функции и гомеостаза Т-клеток, обычно опосредованную LAG-3. Такие антитела являются полезными, например, для лечения рака и инфекционного заболевания.
Антитела согласно изобретению связываются с LAG-3 на поверхности активированных Т-клеток и негативно регулируют сигнальную трансдукцию через агонизм LAG-3, вызывая негативную регуляцию пролиферации и/или активации Т-клеток.
Таким образом, антитела согласно изобретению ингибируют иммунные ответы, опосредованные Т-клетками, в частности, путем ингибирования антиген-индуцированной пролиферации CD4+ и/или CD8+ Т-клеток, и/или антиген-индуцированной активации CD4+ и/или CD8+ Т-клеток. Эффекты таких антител являются обратимыми и могут быть менее длительными, чем эффекты истощения анти-LAG-3 антител, поскольку они не вызывают деструкции активированных Т-клеток. Следует учесть, что период времени, в течение которого антитело согласно настоящему изобретению является эффективным, будет зависеть от периода полужизни антитела в плазме.
Ингибирование антиген-индуцированной пролиферации CD4+ и/или CD8+ Т-клеток может быть определено с помощью любого подходящего способа, известного специалисту в данной области. Примером подходящего способа является измерение пролиферации CD4+ и/или CD8+ Т-клеток, индуцированной антигенными пептидами в присутствии антитела или фрагмента, по сравнению с соответствующей пролиферацией в присутствии отрицательного контрольного антитела такого же изотипа. CD4+ и CD8+ Т-клетки могут присутствовать, например, в образце мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), полученных от здорового донора. Пролиферацию клеток можно индуцировать любыми подходящими антигенными пептидами, такими как пул пептидов, охватывающих последовательность CMV рр35. Пролиферацию клеток можно измерить путем мечения клеток, например, флуоресцентным красителем, таким как сукцинимидильный эфир карбоксифлуоресцеина (CFSE). Пример способа определения ингибирования антиген-индуцированной пролиферации CD4+ и/или CD8+ Т-клеток описан более подробно в примере 10 ниже.
Процентное ингибирование антиген-индуцированной пролиферации CD4+ и/или CD8+ Т-клеток может быть определено в виде процентного ингибирования индекса пролиферации (PI), рассчитанного как сумма процента CD4+ и/или CD8+ Т-клеток под каждым пиком деления (оцененное с помощью FACS), умноженная на число делений, как описано более подробно в примере 10 ниже.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ Т-клеток по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% по сравнению с антиген-индуцированной пролиферацией CD4+ Т-клеток в отсутствие антитела или фрагмента.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% по сравнению с антиген-индуцированной пролиферацией CD8+ Т-клеток в отсутствие антитела или фрагмента.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ Т-клеток и антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток, каждых, по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% по сравнению с антиген-индуцированной пролиферацией CD4+ Т-клеток и антиген-индуцированной пролиферацией CD8+ Т-клеток, соответственно, в отсутствие антитела или фрагмента.
В одном варианте осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ Т-клеток по меньшей мере на 20% по сравнению с антиген-индуцированной пролиферацией CD4+ Т-клеток в отсутствие антитела или фрагмента, и ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток по меньшей мере на 30% по сравнению с антиген-индуцированной пролиферацией CD8+ Т-клеток в отсутствие антитела или фрагмента.
Ингибирование антиген-индуцированной пролиферации CD4+ и/или CD8+ Т-клеток антителом согласно изобретению или его фрагментом можно сравнить с антиген-индуцированной пролиферацией CD4+ и/или CD8+ Т-клеток в присутствие отрицательного контрольного антитела такого же изотипа или его фрагмента.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% больше, чем антитело или фрагмент ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ Т-клеток.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления ингибирование антиген-индуцированной пролиферации CD8+ Т-клеток является LAG-3-зависимым и IL-2-независимым.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует антиген-индуцированную активацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток и антиген-индуцированную активацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток.
В частности, антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может связываться с LAG-3 и ингибировать антиген-индуцированную активацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с LAG-3 и ингибирует антиген-индуцированную активацию CD4+ Т-клеток и антиген-индуцированную активацию CD8+ Т-клеток.
Ингибирование активации CD4+ и/или CD8+ Т-клеток может быть определено с помощью любого подходящего способа, известного специалисту в данной области. Примером подходящего способа является измерение эффекта антитела или фрагмента на экспрессию маркера активации CD4+ и/или CD8+ Т-клеток или секрецию маркера активации Т-клеток. Например, активация CD8+ Т-клеток может быть измерена путем измерения экспрессии CD25, в качестве маркера активации, на CD8+ Т-клетках, индуцированной антигенными пептидами в присутствии антитела или фрагмента по сравнению с соответствующей экспрессией CD25 в присутствии отрицательного контрольного антитела такого же изотипа. Альтернативно, активация Т-клеток может быть измерена путем измерения секреции IFN-γ в клеточном супернатанте Т-клеток, индуцированной антигенными пептидами в присутствии антитела или фрагмента, по сравнению с соответствующей секрецией в присутствии отрицательного контрольного антитела такого же изотипа. Т-клетки могут присутствовать, например, в образце РВМС, полученных от здорового донора. Активация клеток может быть индуцирована любыми подходящими антигенными пептидами, такими как пул пептидов, покрывающих последовательность CMV рр35. Пример способа определения ингибирования антиген-индуцированной активации Т-клеток путем измерения секреции маркера активации Т-клеток описан более подробно в примере 15 ниже. Пример способа определения ингибирования антиген-индуцированной активации CD8+ Т-клеток путем измерения экспрессии маркера активации CD8+ Т-клеток описан более подробно в примере 16 ниже.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует антиген-индуцированную активацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% по сравнению с антиген-индуцированной активацией CD4+ и/или CD8+ Т-клеток в отсутствие антитела или фрагмента.
Ингибирование антиген-индуцированной активации CD4+ и/или CD8+ Т-клеток антителом согласно изобретению или его фрагментом можно сравнить с антиген-индуцированной активацией CD4+ и/или CD8+ Т-клеток в присутствии отрицательного контрольного антитела такого же изотипа или его фрагмента.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует связывание IMP321 с МНС класса II-положительными клетками.
IMP321 (также называемый как «LAG-3Ig» ниже) представляет собой рекомбинантный растворимый человеческий белок слияния LAG-3Ig. Белок слияния получен в виде димера с молекулярной массой 200 кДа, продуцируемого в клетках яичника китайского хомячка (СНО), трансфицированных плазмидой, кодирующей внеклеточный домен человеческого LAG-3, слитый с Fc-фрагментом IgG1 человека. Последовательность IMP321 представлена в SEQ ID NO: 17 в заявке на патент США 2011/0008331.
Связывание IMP321 с МНС класса II-положительными клетками может быть определено путем измерения связывания конъюгата IMP321-метка (например, конъюгат IMP321-А1ех 488) с клетками Raji (которые являются МНС класса II-положительными В-клетками), например, как описано в примере 8 ниже.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует связывание IMP321 с МНС класса II-положительными клетками по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%) по сравнению со связыванием IMP321 с МНС класса II-положительными клетками в отсутствие антитела или фрагмента.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует связывание IMP321 с МНС класса II-положительными клетками по меньшей мере на 30% по сравнению со связыванием IMP321 с МНС класса II-положительными клетками в отсутствие антитела или фрагмента, при этом соотношение концентрации антитела или фрагмента к IMP321 составляет 0,1:1.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует связывание IMP321 с МНС класса II-положительными клетками по меньшей мере на 80% по сравнению со связыванием IMP321 с МНС класса II-положительными клетками в отсутствие антитела или фрагмента, при этом соотношение концентрации антитела или фрагмента к IMP321 составляет 0,3:1 или 1:1.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует индуцированную IMP321 активацию моноцитов.
IMP321 способен активировать клетки человеческой моноцитарной клеточной линии ТНР-1. Активация клеток ТНР-1 может быть определена по уровню секреции лиганда хемокина 4 (CCL4, также известного как макрофагальный белок воспаления 1β, MIP-1β) клетками ТНР-1. Предварительную инкубацию антитела или фрагмента согласно изобретению с IMP321 перед инкубацией смеси с клетками ТНР-1 можно использовать для определения, ингибирует ли антитело или фрагмент IMP321-индуцированную активацию моноцитов. Способ определения ингибирования IMP321-индуцированной активации моноцитов описан более подробно в примере 9 ниже.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует IMP321-индуцированную активацию моноцитов по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90% по сравнению с количеством IMP321-индуцированной активации моноцитов в отсутствие антитела или фрагмента.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует IMP321-индуцированную активацию моноцитов по меньшей мере на 70% по сравнению с количеством IMP321-индуцированной активации моноцитов в отсутствие антитела или фрагмента, при этом соотношение концентрации антитела или фрагмента к IMP321 равно 1:1.
В работе Huard et al (Proc. Natl Acad. Sci. USA, 11: 5744-5749, 1997) описана характеристика участка связывания МНС класса II на белке LAG-3. Многие остатки, важные для связывания белков МНС класса II, сгруппированы на основе крупной структуры внешней петли из 30 аминокислот в домене D1 LAG-3. Аминокислотная последовательность структуры внешней петли домена D1 человеческого белка LAG-3 представляет собой GPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRY (SEQ ID NO: 40), подчеркнутую последовательность на фигуре 1.
Антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может связываться с эпитопом человеческого LAG-3, который перекрывается с участком связывания МНС класса II на LAG-3.
Антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может связываться с эпитопом, который перекрывается с внешней петлей из 30 аминокислот первого N-концевого домена D1 человеческого LAG-3.
В других вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент не связывается с последовательностью внешней петли из 30 аминокислот (SEQ ID NO: 40) первого N-концевого домена D1 человеческого LAG-3.
Антитело согласно изобретению может ингибировать связывание LAG-3 с молекулами МНС класса II in vivo. В частности, антитело согласно изобретению может антагонизировать МНС класса II-активирующий сигнал в антигенпредставляющие клетки (АРС). Таким образом, антитело согласно изобретению может ингибировать индуцированную LAG-3 активацию АРС, например, активацию дентритных клеток, например, индуцированную LAG-3 активацию моноцитов или макрофагов.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует связывание LAG-3 с МНС класса II-положительными клетками по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90% по сравнению со связыванием LAG-3 с МНС класса II-положительными клетками в отсутствие антитела или фрагмента.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует LAG-3-индуцированную активацию АРС по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90% по сравнению с количеством LAG-3-индуцированной активации АРС в отсутствие антитела или фрагмента.
Моноклональное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать один, два или три участка, определяющих комплементарность (CDR), вариабельной области тяжелой цепи (VH) антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и/или один, два или три CDR-участка вариабельной области легкой цепи (VL) антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
Также, в соответствии с изобретением предлагается анти-LAG-3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое содержит один, два или три участка, определяющих комплементарность (CDR), вариабельной области тяжелой цепи (VH) антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и/или один, два или три CDR-участка вариабельной области легкой цепи (VL) антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
CDR-участки VH-области антитела могут представлять собой CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2 и 3, и CDR-участки VL-области антитела могут представлять собой CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4, 5 и 6.
Антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать VH-область антитела с CDR-участками, имеющими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2 и 3, и/или VL-область антитела с CDR-участками, имеющими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4, 5 и 6.
CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2 и 3, могут быть представлены в любом порядке в VH-области, и CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4, 5 и 6, могут быть представлены в любом порядке в VL-области. Однако в предпочтительном варианте осуществления антитело или его фрагмент содержит CDR-H1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: l, CDR-H2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и CDR-H3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и/или CDR-L1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR-L2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR-L3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
CDR-участки VH-области антитела могут представлять собой CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 21, 22 и 23, и CDR-участки VL-области антитела могут представлять собой CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 24, 25 и 26.
Антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать VH-область антитела с CDR-участками, имеющими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 21, 22 и 23, и/или VL-область антитела с CDR-участками, имеющими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 24, 25 и 26.
CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 21, 22 и 23, могут быть представлены в любом порядке в VH-области, и CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 24, 25 и 26, могут быть представлены в любом порядке в VL-области. Однако в предпочтительном варианте осуществления антитело или его фрагмент содержит CDR-H1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, CDR-H2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, и CDR-H3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и/или CDR-L1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, CDR-L2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и CDR-L3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
В некоторых вариантах осуществления CDR-участки VH-области антитела выбраны из CDR-участков, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 21, 22 и 23, и CDR-участки VL-области антитела выбраны из CDR-участков, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4, 5, 6, 24, 25 и 26.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH-область антитела, содержащую CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, где CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21, и/или CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22, и/или CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23.
В некоторых вариантах осуществления:
CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21, и CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22:
CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23;
CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; или
CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21, CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL-область антитела, содержащую CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, где CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24, и/или CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25, и/или CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26.
В некоторых вариантах осуществления:
CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24, и CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25;
CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26;
CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; или
CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24, CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26.
В конкретных вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH-область антитела, содержащую: CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; и CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и VL-область антитела, содержащую: CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; и CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26.
Антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 7, и/или VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8.
В предпочтительном варианте осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и/или VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
Антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать VH-область антитела и/или VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична или которая является идентичной аминокислотной последовательности VH и/или VL областей мышиного моноклонального анти-LAG-3 антитела 13Е2, описанного в настоящем документе в примерах 1, 2 и 3 (аминокислотная последовательность VH 13Е2: SEQ ID NO: 7; аминокислотная последовательность VL 13Е2: SEQ ID NO: 8).
Также, в соответствии с изобретением предлагается антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое конкурирует за связывание с LAG-3 с антителом, которое содержит VH-область антитела, содержащую аминокислотную
последовательность SEQ ID NO: 7, и VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
Кроме того, в настоящем изобретении предлагается антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое конкурирует за связывание с LAG-3 с мышиным моноклональным анти-LAG-3 антителом 13Е2.
Моноклональное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать один, два или три участка, определяющих комплементарность (CDR), вариабельной области тяжелой цепи (VH) антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и/или один, два или три CDR-участка вариабельной области легкой цепи (VL) антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
Также, в соответствии с изобретением предлагается анти-LAG-3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит один, два или три участка, определяющих комплементарность (CDR), вариабельной области тяжелой цепи (VH) антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и/или один, два или три CDR-участка вариабельной области легкой цепи (VL) антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
CDR-участки VH-области антитела могут представлять собой CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11, 12 и 13, и CDR-участки VL-области антитела могут представлять собой CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 14, 15 и 16.
Антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать VH-область антитела с CDR-участками, имеющими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11, 12 и 13, и/или VL-область антитела с CDR-участками, имеющими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 14, 15 и 16.
CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11, 12 и 13, могут быть представлены в любом порядке в VH-области, и CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 14, 15 и 16, могут быть представлены в любом порядке в VL-области. Однако в предпочтительном варианте осуществления антитело или его фрагмент содержит CDR-H1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, CDR-H2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и CDR-H3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и/или CDR-L1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, CDR-L2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и CDR-L3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.
CDR-участки VH-области антитела могут представлять собой CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 31, 32 и 33, и CDR-участки VL-области антитела могут представлять собой CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 34, 35 и 36.
Антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать VH-область антитела с CDR-участками, имеющими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 31, 32 и 33, и/или VL-область антитела с CDR-участками, имеющими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 34, 35 и 36.
CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 31, 32 и 33, могут быть представлены в любом порядке в VH-области, и CDR-участки, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 34, 35 и 36, могут быть представлены в любом порядке в VL-области. Однако в предпочтительном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR-H1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, CDR-H2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, и CDR-H3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и/или CDR-L1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, CDR-L2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, и CDR-L3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36.
В некоторых вариантах осуществления CDR-участки VH-области антитела выбраны из CDR-участков, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11, 12, 13, 31, 32 и 33, и CDR-участки VL-области антитела выбраны из CDR-участков, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 14, 15, 16, 34, 35 и 36.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH-область антитела, содержащую CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, где CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31, и/или CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32, и/или CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33.
В некоторых вариантах осуществления:
CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31, и CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32;
CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33;
CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; или
CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31, CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL-область антитела, содержащую CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, где CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34, и/или CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35, и/или CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36.
В некоторых вариантах осуществления:
CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34, и CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35;
CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36;
CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36; или
CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34, CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36.
В конкретных вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH-область антитела, содержащую: CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31, CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32, и CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; и VL-область антитела, содержащую: CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34, CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35, и CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36.
Антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17, и/или VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18.
В предпочтительном варианте осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и/или VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
Антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать VH-область антитела и VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична или которая является идентичной аминокислотной последовательности VH- и VL-областей мышиного моноклонального анти-LAG-3 антитела 34F4, описанного в настоящем документе в примерах 4, 5 и 6 (аминокислотная последовательность VH 34F4: SEQ ID NO: 17; аминокислотная последовательность VL 34F4: SEQ ID NO: 18).
Также, в соответствии с изобретением предлагается антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое конкурирует за связывание с LAG-3 с антителом, которое содержит VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
Кроме того, в соответствии с изобретением предлагается антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое конкурирует за связывание с LAG-3 с мышиным моноклональным анти-LAG-3 антителом 34F4.
В определенных вариантах осуществления антитела согласно изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, которые отличаются от последовательностей антитела 13Е2 или 34F4 одной или более консервативными модификациями, например, пятью консервативными модификациями. В данной области следует понимать, что могут быть сделаны определенные модификации консервативных последовательностей, которые не нарушают связывание антигена. См., например, Brummell et al. (1993) Biochem 32:1180-8; de Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10:835-41; Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:26864-26870; Hall et al. (1992) J. Immunol. 149:1605-12; Kelley and O'Connell (1993) Biochem. 32:6862-35; Adib-Conquy et al. (1998) Int. Immunol. 10:341-6 и Beers et al. (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43.
Используемое здесь выражение «модификации консервативной последовательности» относится к аминокислотным модификациям, которые значительно не влияют или значительно не изменяют характеристики связывания антитела, содержащего эту аминокислотную последовательность. Такие консервативные модификации включают аминокислотные замены, добавления и делеции. Модификации могут быть введены в антитело согласно изобретению обычными методами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез и PCR-опосредованный мутагенез. Консервативные аминокислотные замены представляют собой такие замены, при которых аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, определены в данной области. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или более аминокислотных остатков в пределах CDR-участков антитела согласно изобретению могут быть заменены на другие аминокислотные остатки из того же самого семейства боковых цепей, а измененное антитело можно тестировать на сохраненную функцию (то есть функции, представленные выше) с помощью функциональных анализов, описанных в настоящем документе.
Антитела согласно изобретению могут быть получены с использованием антитела, имеющего одну или более последовательностей VH и/или VL 13Е2 или 34F4 в качестве исходного материала для конструирования модифицированного антитела. Антитело может быть сконструировано путем модифицирования одного или более остатков в пределах одной или в обеих вариабельных областей (то есть VH и/или VL), например, в пределах одного или более CDR-участков и/или в пределах одной или более каркасных областей. Дополнительно или альтернативно антитело может быть сконструировано путем модифицирования остатков в пределах константной области(ей), например, с целью изменения эффекторной функции(й) антитела.
В некоторых вариантах осуществления для конструирования вариабельных областей антител может быть использована прививка CDR. Антитела взаимодействуют с целевыми антигенами преимущественно за счет аминокислотных остатков, локализованных в шести участках, определяющих комплементарность (CDR), тяжелой и легкой цепей. По этой причине аминокислотные последовательности в пределах CDR индивидуальных антител более различны между собой, чем последовательности вне CDR. Так как последовательности CDR отвечают за большинство взаимодействий антитело-антиген, то можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфических природных антител, путем конструирования экспрессирующих векторов, которые включают последовательности CDR из специфического встречающегося в природе антитела, привитые на каркасные последовательности из другого антитела с другими свойствами (см., например, Riechmann et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525; Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033; патенты США 5225539; 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370).
Также, в соответствии с изобретением предлагается антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент, например, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи антитела, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и/или содержащее CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 (то есть CDR-участки 13Е2). Несмотря на то, что такие антитела содержат CDR-последовательности VH- и VL-областей моноклонального антитела 13Е2, они могут содержать различные каркасные последовательности.
Аналогично, в соответствии с изобретением предлагается антитело согласно изобретению или его антигенсвязыващий фрагмент, например, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и/или содержащее CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18 (то есть CDR-участки 34F4). Несмотря на то, что такие антитела содержат последовательности CDR VH и VL моноклонального антитела 34F4, они могут содержать различные каркасные последовательности. Такие каркасные последовательности могут быть получены из публичных баз данных ДНК или опубликованных ссылочных материалов, которые включают последовательности генов антител зародышевой линии. Например, ДНК-последовательности зародышевой линии для генов вариабельной области тяжелой и легкой цепи человека могут быть найдены в базе данных последовательностей зародышевой линии человека «VBase» (доступной в Интернете на сайте www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), а также в Kabat et al. (1991), см. выше; Tomlinson et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; и Cox et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836; содержание которых специально включено в настоящий документ посредством ссылки. В качестве другого примера ДНК-последовательности зародышевой линии для генов вариабельной оласти тяжелой и легкой цепи человека могут быть найдены в базе данных Genbank. Например, следующие последовательности зародышевой линии тяжелой цепи, обнаруженные у мыши НСо7 HuMAb, доступны в сопутствующих номерах доступа Genbank: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 и ВС070333), 3-33 (NG_0010109 и NT_024637) и 3-7 (NG_0010109 и NT_024637). В качестве другого примера, следующие последовательности зародышевой линии тяжелой цепи, обнаруженные у мышей НСо12 HuMAb, доступны в сопутствующих номерах доступа Genbank: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 и ВС070333), 5-51 (NG_0010109 и NT_024637), 4-34 (NG_0010109 и NT_024637), 3-30.3 (CAJ556644) и 3-23 (AJ406678).
Белковые последовательности антител сравнивали с собранной базой данных белковых последовательностей, используя один из методов поиска сходства последовательностей, называемый Gapped BLAST (Altschul et al. (1997), supra), который хорошо известен специалистам в данной области.
Предпочтительными каркасными последовательностями для применения в антителах согласно изобретению являются последовательности, структурно сходные с каркасными последовательностями антител 13Е2 или 34F4.
Последовательности, показывающие значительное выравнивание с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей домен VH моноклонального антитела 13Е2, включают следующие гены зародышевой линии: IGHV8-8*01, IGHV8-11*01, IGHV8-12*01, IGHD2-12*01, IGHD1-1*01, IGHJ1*01, IGHJ1*02, IGHJ1*03.
Последовательности, показывающие значительное выравнивание с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей домен VL моноклонального антитела 13Е2, включают следующие гены зародышевой линии: IGKV6-17*01, IGKV6-25*01, IGKV6-23*01, IGKJ2*01, IGKJ2*03, IGKJ2*02.
Последовательности, показывающие значительное выравнивание с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей домен VH моноклонального антитела 34F4, включают следующие гены зародышевой линии: IGHV8-8*01, IGHV8-12*01, IGHV8-11*01, IGHD1-1*01, IGHD1-2*01, IGHD2-3*01, IGHJ2*01, IGHJ2*02, IGHJ2*03.
Последовательности, показывающие значительное выравнивание с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей домен VL моноклонального антитела 34F4, включают следующие гены зародышевой линии: IGKV6-17*01, IGKV6-25*01, IGKV6-23*01, IGKJ1*01, IGKJ1*02, IGKJ2*01.
Предпочтительными каркасными последовательностями тяжелой цепи для применения в антителах согласно изобретению являются последовательности, которые структурно сходны с каркасными последовательностями, кодируемыми геном V зародышевой линии IGHV8-8*01, IGHV8-11*01 или IGHV8-12*01, особенно IGHV8-8*01. Предпочтительными каркасными последовательностями легкой цепи для применения в антителах согласно изобретению являются последовательности, которые структурно сходны с каркасными последовательностями, кодируемыми геном V зародышевой линии IGKV6-17*01, IGKV6-25*01 или IGKV6-23*01, особенно IGKV6-17*01.
Последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL могут быть привиты на каркасные области, которые имеют последовательность, идентичную последовательности, обнаруженной в гене иммуноглобулина зародышевой линии, из которого получена указанная последовательность, или такие последовательности CDR могут быть привиты на каркасные области, которые содержат одну или более мутаций по сравнению с последовательностями зародышевой линии. Например, было обнаружено, что в некоторых случаях предпочтительно осуществлять мутацию остатков в каркасных областях для сохранения или усиления антигенсвязывающей способности данного антитела (см., например, патенты США 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370).
Другим типом модификации вариабельной области является мутирование аминокислотных остатков в пределах участков CDR1, CDR2 и/или CDR3 VH и/или VL для улучшения одного или более свойств связывания (например, аффинности) представляющего интерес антитела. Сайт-направленный мутагенез или PCR-опосредованный мутагенез может быть выполнен для введения мутации (мутаций), и действие на связывание антител или другое представляющее интерес функциональное свойство может быть оценено в анализах in vitro или in vivo, описанных в настоящем документе и представленных в примерах. Предпочтительно вводят консервативные модификации (описанные выше). Такими мутациями могут быть замены, добавления или делеции аминокислот, но предпочтительно являются замены. Кроме того, обычно изменяют не более одного, двух, трех, четырех или пяти остатков в пределах CDR-участка. В некоторых вариантах осуществления в общей сложности изменяют не более одного, двух, трех, четырех или пяти остатков для всех шести CDR-участков.
В конкретных вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
VH-область антитела, содержащую: CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; и CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательностью, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и VL-область антитела, содержащую: CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; и CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; или его вариант, в котором не более одного, двух, трех, четырех или пяти аминокислотных остатков изменены путем замены, добавления или делеции аминокислот в пределах последовательностей CDR.
В конкретных вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
VH-область антитела, содержащую: CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31, CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32, и CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; и VL-область антитела, содержащую: CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательностью, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34, CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35, и CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36; или
его вариант, в котором не более одного, двух, трех, четырех или пяти аминокислотных остатков изменены путем замены, добавления или делеции аминокислот в пределах последовательностей CDR.
В другом варианте осуществления в изобретении предлагается анти-LAG-3 моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: (a) CDR1 -участок VH, имеющий SEQ ID NO: 1, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 1; (b) CDR2-участок VH, имеющий SEQ ID NO: 2, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 2; и (с) CDR3-участок VH, имеющий SEQ ID NO: 3, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 3; и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую: (a) CDR1-участок VL, имеющий SEQ ID NO: 4, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 4; (b) CDR2-участок VL, содержащий SEQ ID NO: 5, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 5; и (с) CDR3-участок VL, содержащий SEQ ID NO: 6, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 6.
В другом варианте осуществления в изобретении предлагается анти-LAG-3 моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: (a) CDR1-участок VH, имеющий SEQ ID NO: 11, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 11; (b) CDR2-участок VH, имеющий SEQ ID NO: 12, или аминокислотную последовательность, имеющую одно, два, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 12; и (с) CDR3-участок VH, имеющий SEQ ID NO: 13, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 13; и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую: (a) CDR1-участок VL, имеющий SEQ ID NO: 14, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 14; (b) CDR2-участок VL, имеющий SEQ ID NO: 15, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 15; и (с) CDR3-участок VL, имеющий SEQ ID NO: 16, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 16.
В другом варианте осуществления в изобретении предлагается анти-LAG-3 моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: (a) CDR1-участок VH, имеющий SEQ ID NO: 21, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 21; (b) CDR2-участок VH, имеющий SEQ ID NO: 22, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 22; и (с) а CDR3-участок VH, имеющий SEQ ID NO: 23, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 23; и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую: (a) CDR1 -участок VL, имеющий SEQ ID NO: 24, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 24; (b) CDR2-участок VL, имеющий SEQ ID NO: 25, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 25; и (с) CDR3-участок VL, имеющий SEQ ID NO: 26, или или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 26.
В другом варианте осуществления в изобретении предлагается анти-LAG-3 моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: (a) CDR1-участок VH, имеющий SEQ ID NO: 31, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 31; (b) CDR2-участок VH, имеющий SEQ ID NO: 32, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 32; и (с) CDR3-участок VH, имеющий SEQ ID NO: 33, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 33; и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую: (a) CDR1-участок VL, имеющий SEQ ID NO: 34, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 34; (b) CDR2-участок VL, имеющий SEQ ID NO: 35, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 35; и (с) CDR3-участок VL, имеющий SEQ ID NO: 36, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеции или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 36.
Сконструированные антитела согласно изобретению включают антитела, в которых модификации были произведены в каркасных остатках в VH и/или VL, например, для улучшения свойств данного антитела. Обычно такие каркасные модификации производят для уменьшения иммуногенности антитела. Например, одним подходом является «обратное мутирование» одного или более каркасных остатков в соответствующую последовательность зародышевой линии. Более конкретно, антитело, которое было подвергнуто соматической мутации, может содержать каркасные остатки, которые отличаются от последовательности зародышевой линии, из которой получено антитело. Такие остатки могут быть идентифицированы путем сравнения каркасных последовательностей антитела с последовательностями зародышевой линии, из которой получено данное антитело.
Другой тип модификации каркаса включает мутацию одного или более остатков в каркасной области или даже в одном или более CDR-участках для удаления эпитопов Т-клеток для уменьшения таким образом потенциальной иммуногенности антитела. Этот подход также называют «деиммунизацией», и он описан более подробно в публикации патента США 20030153043.
В качестве допонения или альтернативы модификациям, произведенным в каркасных областях или CDR-участках, антитела согласно изобретению могут быть сконструированы таким образом, что они включают модификации в Fc-области, обычно для изменения одного или более функциональных свойств антитела, таких как период полужизни в сыворотке, фиксация комплемента, связывание Fc-рецептора и/или антиген-независимая клеточноопосредованная цитотоксичность. Кроме того, антитело согласно изобретению может быть также химически модифицировано (например, к антителу могут быть присоединены одна или более химических групп), или может быть модифицировано для изменения его гликозилирования, опять для изменения одного или более функциональных свойств антитела. Каждый из указанных вариантов осуществления описан более подробно ниже. Нумерация остатков в Fc-области является нумерацией EU-индекса Кабата.
В одном варианте осуществления шарнирная область домена CF11 модифицирована таким образом, что количество остатков цистеина в шарнирной области изменено, например, увеличено или уменьшено. Такой подход описан дополнительно в патенте США 5677425. Количество остатков цистеина в шарнирной области домена CF11 изменяют, например, для облегчения сборки легких или тяжелых цепей, или для увеличения или уменьшения стабильности антитела.
В другом варианте осуществления шарнирную область Fc антитела мутируют для повышения или уменьшения биологического периода полужизни антитела. Более конкретно, одну или более аминокислотных мутаций вводят в области контакта доменов CF12-CF13 Fc-шарнирного фрагмента таким образом, что данное антитело имеет нарушенное связывание стафилококкового белка A (SpA) по сравнению со связыванием нативного Fc-шарнирного домена с SpA. Такой подход описан более подробно в патенте США 6165745.
В другом варианте осуществления антитело модифицируют для увеличения его биологического периода полужизни. Класс IgG является наиболее стабильным и имеет период полужизни в сыворотке 20 дней, тогда как IgM и IgA он продолжается только 5-8 дней (Brekke & Sandlie, 2003, Nature Reviews Drug Discovery 2, 52-62). Возможны различные подходы. Например, могут быть введены одна или более из следующих мутаций: T252L, T254S, T256F, как описано в патенте США 6277375. Альтернативно, для увеличения биологического периода полужизни антитело может быть изменено в пределах области CF11 или CL таким образом, чтобы оно содержало эпитоп связывания рецептора реутилизации, образованный из двух петель CF12-домена Fc-области IgG, как описано в патентах США 5869046 и 6121022.
Антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент должно быть лишено антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) и комплементзависимой цитотоксичности (CDC), таким образом, что антитело или фрагмент может быть использовано для негативного регулирования пролиферации и/или функции Т-клеток без истощения Т-клеток в результате ADCC или CDC.
В ADCC, Fc-область антитела связывается с Fc-рецепторами (FcγRs) на поверхности иммунных эффекторных клеток, таких как естественные киллеры и макрофаги, что приводит к лизису клеток-мишеней. В CDC Fc-область связывается с компонентом C1q комплемента и клетки-мишени уничтожаются путем запуска каскада комплемента на клеточной поверхности. Активность ADCC и CDC антитела зависит от его изотипа. Как IgM, так и IgG могут опосредовать фиксацию комплемента, тогда как только IgG может способствовать антитело-зависиомой клеточной цитотоксичности (ADCC). Изоформы IgG проявляют различные уровни CDC и ADCC:
IgG: CDC (hIgG3>hIgG1>hIgG2>hIgG4; mIgG2a>mIgG1);
ADCC (hIgG1≥hIgG3>hIgG2≥IgG4; mIgG2a>mIgG1).
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит Fc-фрагмент IgG1 мыши или IgG4 человека, чтобы гарантировать, что антитело или фрагмент не имеют активности ADCC и CDC.
Активность ADCC и CDC антитела согласно изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента может быть определена с помощью любого подходящего способа, известного специалисту в данной области. Примеры подходящих анализов активности CDC и ADCC описаны в WO 2008/132601 и ниже.
Анти-LAG-3 антитело, проявляющее CDC-активность, будет последовательно уничтожать LAG-3+ клетки в присутствии комплемента по сравнению с его изотипическим контролем.
Для тестирования CDC клетки-мишени, используемые для оценки анти-LAG-3 антитела, могут представлять собой трансфицированную LAG-3 клеточную линию или первичные Т-клетки, активированные для индукции экспрессии LAG-3. Например, в одном возможном анализе для тестирования CDC клетками-мишенями являются LAG-3+ клетки СНО по сравнению с клетками wt СНО (wt, дикого типа). Оба типа клеток (то есть клетки, экспрессирующие LAG-3, и эквивалентные клетки, не экспрессирующие LAG-3), инкубировали в течение 1 часа при 37°С либо с тестируемым анти-LAG-3 антителом, либо с его изотипически сходным отрицательным контрольным антителом и кроличьей сывороткой, содержащей активный комплемент. Затем оценивали жизнеспособность клеток с использованием флуоресцентного красителя 7-амино-актиномицина D (7-AAD), метящего клетки, которые утратили целостность своей мембраны, явление, которое появляется быстро после смерти. Процент 7-AAD-положительных клеток СНО (то есть мертвых клеток-мишеней) определяли методом проточной цитометрии. Антитело, проявляющее активность CDC, будет уничтожать только клетки LAG-3+ (например, LAG-3+ клетки СНО) в присутствии комплемента. анти-LAG-3 антитело можно титровать, чтобы определить эффективность антитела для активации CDC при низкой концентрации антитела.
Анализ CDC может быть также выполнен на РВМС, стимулированных суперантигеном SEB. Цитотоксичность тестируемого антитела анализировали как на активированных (а именно CD25+/LAG-3+ клетках), так и неактивированных (а именно CD25-/LAG-3- клетках) CD4+ хелперных Т- и CD8+ цитотоксических Т-клетках. Только активированные CD4+ и CD8+ Т-клетки специфически уничтожались антителом, проявляющим CDC.
При тестировании ADCC РМВС стимулировали в течение одного дня с помощью IL-2 для использования в качестве эффекторных клеток, и LAG-3-экспрессирующие клетки (например, LAG-3+ клетки СНО) метили витальным красителем CFSE для использования в качестве клеток-мишеней. В присутствии тестируемого анти-LAG-3 антитела, если эффекторные клетки (РВМС) способны уничтожать значительный процент LAG-3-экспрессирующих клеток (например, LAG-3+ клеток СНО) по сравнению с изотипически сходным отрицательным контрольным антителом, то указанное тестируемое антитело проявляет ADCC. Этот эффект должен увеличиваться с количеством эффекторных клеток. Тестируемое антитело может быть титровано для определения эффективности антитела для индукции ADCC при низкой концентрации антитела.
Тестируемое анти-LAG-3 антитело можно рассматривать как не проявляющее CDC или ADCC, когда оно уничтожает менее чем вдвое больше LAG-3+ клеток по сравнению с изотипически сходным отрицательным контрольным антителом в любом из анализов, описанных выше.
Гибель клеток-мишеней используется в классических биологических анализах ADCC, в которых используют донорские мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) или субпопуляцию естественных клеток-киллеров (NK) в качестве эффекторных клеток. Однако эти клетки могут варьировать по ответу и могут привести к высоким показаниям фона. В анализе ADCC Reporter Bioassay, доступном от фирмы Promega, используется альтернативное считывание в более ранней точке на пути активации ADCC: активации транскрипции генов посредством пути NFAT (ядерный фактор активированных Т-клеток) в эффекторной клетке. Кроме того, в анализе ADCC Reporter Bioassay используются сконструированные клетки Jurkat, стабильно экспрессирующие FcγRIIIa-рецептор, вариант V158 (с высоким сродством) и элемент ответа NFAT, управляющий экспрессией люциферазы светлячка, в качестве эффекторных клеток. Биологическую активность антител в ADCC количественно определяли посредством люциферазы, продуцируемой в результате активации пути NFAT; активность люциферазы в эффекторной клетке количественно оценивали с помощью считывания люминесценции. Используя этот анализ, сигнал является высоким, а фоновый уровень в анализе является низким. Удовлетворительный ответ в анализе достигается только в случае присутствия клеток-мишеней с правильным поверхностным антигеном, правильным специфическим антителом и эффекторными клетками, экспрессирующими FcγRIIIa. В случае отсутствия одного из перечивленного выше, ответа нет.
При оценке ADCC-активности антитела с использованием ADCC Reporter Bioassay, тестируемое антитело можно считать не проявляющим ADCC, когда измеренное увеличение биолюминесценции в два раза меньше, чем изотипически сходного отрицательного контрольного антитела.
В других вариантах осуществления Fc-область содержит мутантную человеческую последовательность IgG4 Fc с мутацией S228P для отмены обмена Fab-фрагментами (как показано на фигуре 20(A) для химерного антитела Chim13E2IgG4 содержащего последовательность 13E2IgG4mut тяжелой цепи).
В других вариантах осуществления Fc-область содержит С-часть человеческой каппа-цепи иммуноглобулинов Ig (IgK) дикого типа (13E2IgK) (как показано на фигуре 20(B) для химерного антитела Chim13E2IgG4, содержащего последовательность легкой цепи 13E2IgK).
Нумерация остатков в Fc-области, используемая для человеческого мутанта IgG4 Fc, описанного выше, представляет собой стандартную нумерацию Eu-индекса как в Kabat (Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication n° 91-3242, pp. 662,680,689 (1991)).
В еще одном варианте осуществления модификации подвергается гликозилирование антитела. Например, может быть получено дегликозилированное антитело (то есть антитело, не имеющее гликозилирования). Гликозилирование может быть подвергнуто изменениям, например, для увеличения сродства антитела к антигену. Такие модификации углеводного состава могут осуществляться, например, изменением одного или более сайтов гликозилирования в аминокислотной последовательности антитела. Например, может быть проведено замещение одного или более аминокислотных остатков, которое приводит к уничтожению одного или более сайтов гликозилирования каркаса вариабельных областей, чтобы тем самым устранить гликозилирование по этому сайту. Такое дегликозилирование может увеличивать сродство антитела к антигену. См., например, патенты США 5714350 и 6350861.
Другой модификацией антител по настоящей заявке, которая рассматривается в настоящем изобретении, является пегилирование. Антитело может быть пегилировано, например, для увеличения его биологического (например, в сыворотке) времени полужизни. Для осуществления пегилирования антитела это антитело или его фрагмент, как правило, вводят во взаимодействие с полиэтиленгликолем (PEG), например, реакционноспособным сложным эфиром или альдегидным производным PEG, в условиях, при которых одна или более групп PEG присоединяются к антителу или его фрагменту. Предпочтительно пегилирование выполняют с помощью реакции ацилирования или реакции алкилирования с реакционноспособной молекулой PEG (или аналогичного реакционноспособного водорастворимого полимера). Предполагается, что используемый здесь термин «полиэтиленгликоль» охватывает любую из форм PEG, которые применялись для получения производных других белков, таких как моно (С1-С10)алкокси или арилокси полиэтиленгликоли или полиэтиленгликольмалеимид. В некоторых вариантах осуществления антитело, подлежащее пегилированию, представляет собой дегликозилированное антитело. Способы пегилирования белков известны в данной области, и они могут быть применены для пегилирования антител согласно изобретению. См., например, европейские патенты ЕР 0154316 и ЕР 0401384.
Антитело согласно изобретению может представлять собой моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
Термины «антитело» и «иммуноглобулин» охватывают антитела или иммуноглобулины любого изотипа, фрагменты антител, сохраняющие специфическое связывание с антигеном, включая, но без ограничения, фрагменты Fab, Fv, scFv и Fd, химерные антитела, гуманизированные антитела, одноцепочечные антитела (scAb), однодоменные антитела (dAb), однодоменные антитела тяжелой цепи, однодоменные антитела легкой цепи, биспецифические антитела, мультиспецифические антитела и белки слияния, содержащие антиген-связывающую (также называемую здесь как антиген связывающую) часть антитела и белка, не являющегося антителом. Также, термин охватывает Fab', Fv, F(ab')2 и/или другие фрагменты антител, которые сохраняют специфическое связывание с антигеном, и моноклональные антитела. Антитело может быть моновалентным или бивалентным. Антитело может представлять собой мономер Ig, который представляет собой «Y-образную» молекулу, которая состоит из четырех полипептидных цепей: двух тяжелых цепей и двух легких цепей, связанных дисульфидными связями. Антитела могут быть помечены детектируемой меткой, например, радиоизотопом, ферментом, образующим детектируемый продукт, флуоресцентным белком и т.п. Антитела также могут быть конъюгированы с другими молекулами, как-то членами специфически связывающихся пар, например, биотином (член специфически связывающейся пары биотин-авидин) и др. Антитела также могут быть связаны с твердой подложкой, включая, но без ограничения, полистирольные планшеты или частицы, и т.п.
«Фрагменты антител» содержат части интактного антитела, например, связывающую или вариабельную область интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диатела; линейные антитела (Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); доменные антитела (dAb; Holt et al. (2003) Trends Biotechnol. 21:484); молекулы одноцепочечных антител; и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. При расщеплении антител папаином образуются два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых «Fab» фрагментами, каждый с одним антигенсвязывающим сайтом, и остаточный «Fc» фрагмент, название которого отражает его способность к легкой кристаллизации. Обработка пепсином приводит к образованию фрагмента F(ab')2, который содержит два антигенсвязывающих сайта и все еще способен вызывать перекрестное сшивание антигена.
«Fv» представляет наименьший фрагмент антител, который содержит сайт распознавания и связывания антигена. Этот участок состоит из димера вариабельного домена одной тяжелой и одной легкой цепи, тесно связанных нековалентными связями. Именно в этой конфигурации взаимодействуют три CDR-участка каждого вариабельного домена, составляя антигенсвязывающий участок на поверхности димера VH-VL. Все вместе эти шесть CDR-участков придают антителу специфичность связывания антигена. Однако даже единичный вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR-участка, специфических в отношении антигена) обладает способностью к распознаванию и связыванию антигена, хотя и с меньшим сродством, чем полный участок связывания.
Фрагмент «Fab» также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Fab-фрагменты отличаются от Fab'-фрагментов добавлением нескольких остатков на карбоксильном конце домена CH1 тяжелой цепи, в том числе одного или более цистеинов из шарнирной области антител. В настоящем документе Fab'-SH обозначает такие Fab'-фрагменты, в которых остаток (остатки) цистеина в константных доменах содержат свободную тиольную группу. F(ab')2-фрагменты антител первоначально были получены в виде пары Fab'-фрагментов, содержащих между ними шарнирные цистеины. Известны также и другие химические конъюгаты фрагментов антител.
«Легкие цепи» антител из любого вида позвоночных могут относиться к одному из двух четко различающихся типов, называемых каппа и лямбда, исходя из аминокислотной последовательности их константных доменов. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелых цепей иммуноглобулины могут относиться к различным классам. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, а некоторые из них могут дополнительно подразделяться на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Подклассы могут дополнительно подразделяться на типы, например, IgG2a и IgG2b.
«Одноцепочечные Fv» или «sFv» или «scFv» фрагменты антител содержат домены VH и VL антител, при этом эти домены находятся в одной полипептидной цепи. В некоторых вариантах осуществления полипептид Fv, кроме того, содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который дает возможность sFv образовывать требуемую для связывания антигена структуру. Для обзора sFv см. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
Термин «диатела» относится к небольшим фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими участками, которые содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одной и той же полипептидной цепи (VH-VL). При использовании линкера, слишком короткого, чтобы позволить спаривание между двумя доменами на одной и той же цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи, создавая при этом два антигенсвязывающих участка. Диатела описаны более подробно, например, в ЕР 404097; WO 93/11161; и Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448.
Используемое здесь «моноклональное антитело» представляет собой антитело, продуцируемое группой идентичных клеток, все из которых были получены из одной клетки путем повторной клеточной репликации. То есть клон клеток производит только один вид антител. Несмотря на то, что моноклональное антитело может быть получено с использованием технологии получения гибридомы, могут быть также использованы другие способы получения, известные специалистам в данной области, (например, антитела, полученные из библиотек фагового дисплея антител).
Используемый здесь термин «CDR» или «участок, определяющий комплементарность» служит для обозначения несмежных антигенсвязывающих центров, находящихся в вариабельых областях полипептидов тяжелой и легкой цепи. CDR-участки описаны Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991) (также называемые здесь как Kabat 1991); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) (also referred to herein as Chothia 1987); и MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996). Дополнительной системой является система нумерации International ImMunoGeneTics (IMGT) (Lefranc et al., Nucleic Acids Research 27:209-212 (1999)). Определения включают перекрывающиеся или подгруппы аминокислотных остатков при сравнении их друг с другом. Тем не менее применение любого из этих определений в отношении CDR антител или привитых антител либо их вариантов должно быть в рамках термина, определенного и используемого здесь. Аминокислотные остатки, охватывающие CDR-участки, определенные в каждой из указанных выше ссылок, представлены ниже для сравнения в таблице 1. CDR-участки, перечисленные в таблице 4 в примере 2 и в таблице 9 в примере 5. были определены в соответствии с Lefranc 1999, и Kabat 1991.
Используемые здесь термины «CDR-L1», «CDR-L2» и «CDR-L3» относятся, соответственно, к первому, второму и третьему CDR-участкам в вариабельной области легкой цепи. Используемые здесь термины «CDR-H1», «CDR-H2» и «CDR-Н3» относятся, соответственно, к первому, второму и третьему CDR-участкам в вариабельной области тяжелой цепи. Используемые здесь термины «CDR-1», «CDR-2» и «CDR-3» относятся, соответственно, к первому, второму и третьему CDR-участкам каждого вариабельного домена цепи.
Используемый здесь термин «аффинность» относится к константе равновесия для обратимого связывания двух агентов (например, антитела и антигена) и выражается в виде константы диссоциации (Kd). Аффинность может быть по меньшей мере в 1 раз больше, по меньшей мере в 2 раза больше, по меньшей мере в 3 раза больше, по меньшей мере в 4 раза больше, по меньшей мере в 5 раз больше, по меньшей мере в 6 раз больше, по меньшей мере в 7 раз больше, по меньшей мере в 8 раз больше, по меньшей мере в 9 раз больше, по меньшей мере в 10 раз больше, по меньшей мере в 20 раз больше, по меньшей мере в 30 раз больше, по меньшей мере в 40 раз больше, по меньшей мере в 50 раз больше, по меньшей мере в 60 раз больше, по меньшей мере в 70 раз больше, по меньшей мере в 80 раз больше, по меньшей мере в 90 раз больше, по меньшей мере в 100 раз больше или по меньшей мере в 1000 раз больше, или более, чем аффинность антитела к неродственным аминокислотным последовательностям. Аффинность антитела к белку-мишени может составлять, к примеру, примерно от 100 нМ (наномолярная концентрация) до 0,1 нМ, примерно от 100 нМ до 1 пМ (пикомолярная концентрация), или примерно от 100 нМ до 1 фМ (фемтомолярная концентрация) или более. Используемый здесь термин «авидность» относится к устойчивости комплекса из двух или более агентов к диссоциации после разбавления. Термины «иммунореактивный» и «предпочтительно связывается» применяются взаимозаменяемо в настоящем документе в отношении антител и/или антигенсвязывающих фрагментов.
Термин «связывание» относится к прямой ассоциации между двумя молекулами благодаря, например, ковалентным, электростатическим, гидрофобным и ионным взаимодействиям и/или водородным связям, включая такие взаимодействия, как солевые мостики и водные мостики. Антитело согласно изобретению специфически связывается с эпитопом в пределах белка LAG-3, в частности, человеческого белка LAG-3. «Специфическое связывание» относится к связыванию с аффинностью по меньшей мере около 5×10-7 M или больше, например, 10-7 М, 5×10-8 M, 10-8 M или больше. «Неспецифическое связывание» относится к связыванию с аффинностью менее чем около 10-7 М, например, связыванию с аффинностью 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M и т.д. Как используется в настоящем документе, антитело, которое «специфически связывается с человеческим LAG-3 », относится к антителу, которое связывается с человеческим белком LAG-3 (и возможно белком LAG-3 от одного или более других видов, отличных от человека), но практически не связывается с белками, отличными от белка LAG-3. Предпочтительно антитело связывается с человеческим белком LAG-3 с «высокой аффинностью», а именно, с Kd 1×10-7 M или менее, более предпочтительно 1×10-8 M или менее, более предпочтительно 5×10-9 M или менее, более предпочтительно 1×10-9 M или менее.
Используемое здесь выражение «практически не связывается» с белком или клетками означает не связывается или не связывается с высокой аффинностью с белком или клетками, то есть связывается с белком или клетками с Kd 1×10-6 M или более, более предпочтительно 1×10-5 M или более, более предпочтительно 1 χ 10-4 M или более, более предпочтительно 1×10-3 M или более, даже более предпочтительно 1×10-2 M или более.
Используемый здесь термин «Kassoc» или «Ka» относится к константе скорости ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген, тогда как используемый здесь термин «Kdis» или «Kd» относится к константе скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Используемый здесь термин «KD» относится к константе диссоциации, которую получают из отношения Kd к Ka (то есть Kd/Ka) и выражают в виде молярной концентрации (М).
Термин «высокоаффинное» в отношении антитела IgG относится к антителу, имеющему KD 1×10-7 M или менее, более предпочтительно 5×10-8 M или менее, даже более предпочтительно 1×10-8 M или менее, даже более предпочтительно 5×10-9 M или менее и даже более предпочтительно 1×10-9 M или менее в отношении антигена-мишени. Однако «высокоаффинное» связывание может меняться для других изотипов антител. Например, «высокоаффинное» связывание для IgM изотипа относится к антителу, имеющему KD 10-6 M или менее, более предпочтительно 10-7 M или менее, даже более предпочтительно 10-8 M или менее.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с белком LAG-3 человека с более высокой аффинностью (то есть с более низкой константой диссоциации), чем антагонистическое анти-LAG-3 моноклональное антитело 17 В4 (Baixeras, et al., J. Exp.Med., 1992, Vol.176: 327-337). В примере 7 ниже описаны результаты анализа Biacore связывания антитела 17 В4 с белком LAG-3Ig человека. Результаты показали, что константа диссоциации 17 В4 для LAG-3Ig человека составила 3,69 нМ. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитело согласно настоящему изобретению связывается с белком LAG-3 человека (или белком LAG-3Ig человека) с константой диссоциации (KD) менее 3,69 нМ, например, как определено с помощью анализа Biacore.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно настоящему изобретению связывается с белком LAG-3 человека (или его производным, таким как белок LAG-3Ig человека) с константой диссоциации (KD) не более 3,5 нМ, не более 2,5 нМ, не более 2 нМ, не более 1 нМ, не более 0,9 нМ, не более 0,8 нМ, не более 0,7 нМ, не более 0,6 нМ, не более 0,5 нМ, не более 0,4 нМ, не более 0,3 нМ, не более 0,2 нМ, не более 0,1 нМ. В некоторых вариантах осуществления анти-LAG-3 антитело согласно настоящему изобретению связывается с белком LAG-3 человека с KD не более 90 пМ, не более 80 пМ, не более 70 пМ, не более 60 пМ, не более 50 пМ, не более 40 пМ, не более 30 пМ, не более 20 пМ, не более 10 пМ, не более 9 пМ, не более 8 пМ, не более 7 пМ, по не более 6 пМ, не более 5 пМ, не более 4 пМ, не более 3 пМ, не более 2 пМ или не более 1 пМ.
В примере 20 ниже описаны результаты анализа Biacore связывания химерного антитела IgG4 13Е2 (описанного ниже) и гуманизированного IgG4 13Е2 (описанного ниже) с белком LAG-3Ig человека. Результаты показали, что константа диссоциации химерного антитела IgG4 13Е2 для LAG-3Ig человека составила 21,9 пМ, а гуманизированного 13Е2 IgG4 для LAG-3Ig человека - 22,8 пМ.
В конкретных вариантах осуществления антитело согласно настоящему изобретению связывается с белком LAG-3 человека (или белком LAG-3Ig человека) с константой диссоциации (KD) не более 100 пМ, не более 90 пМ, не более 80 пМ, не более 70 пМ, не более 60 пМ, не более 50 пМ, не более 40 пМ, не более 30 пМ, или не более 25 пМ, например, как определено с помощью анализа Biacore.
В некоторых вариантах осуществления аффинность антитела согласно изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента может быть по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% более высокой, чем аффинность 17 В4 в отношении белка LAG-3 человека. В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может по меньшей мере в 1,5, 2, 2,5, 3 или 3,5 раз превышать аффинность 17 В4 в отношении белка LAG-3 человека.
Аффинность антитела в отношении белка LAG-3 человека может быть определена специалистом в данной области, например, с помощью поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием биосенсорной системы, такой как система Biacore (Murphy et al, Using Biacore to measure the binding kinetics of an antibody-antigen interaction; Curr Protoc Protein Sci. 2006 Sep; Chapter 19:Unit 19.14). Например, анализ Biacore может быть использован для определения константы диссоциации между антителом согласно изобретению и белком LAG-3 человека.
Связывание с LAG-3 человека может быть оценено с использованием одного или более других методик, также хорошо известных в данной области. Например, антитело может быть подвергнуто тестированию с помощью анализа методом проточной цитометрии, в котором антитело взаимодействует с клеточной линией, экспрессирующей LAG-3 человека, такой как клетки СНО, которые были трансфицированы для экспрессии LAG-3 человека на своей клеточной поверхности. Другие подходящие клетки для использования в анализах методом проточной цитометрии включают SEB-стимулированные РВМС, или анти-CD3-стимулированные CD4+ активированные Т-клетки, которые экспрессируют нативный LAG-3. Еще другие подходящие анализы связывания включают анализы ELISA, например, с использованием рекомбинантного белка LAG-3.
Антитело согласно изобретению представляет собой выделенное антитело. «Выделенное» антитело представляет собой антитело, которое было идентифицировано и выделено, и/или извлечено из компонента его природного окружения. Загрязняющие компоненты его природного окружения представляют собой вещества, которые будут препятствовать диагностическому или терапевтическому применению антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В некоторых вариантах осуществления антитело очищают (1) до более чем 90%, более чем 95% или более чем 98% по массе антитела, что определяют по методу Лоури, например, до более чем 99% по массе, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности при использовании секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенности путем электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием окрашивания кумасси синим или серебром. Выделенное антитело включает антитело in situ в рекомбинантных клетках, поскольку в этом случае отсутствует по меньшей мере один компонент природного окружения антитела. В некоторых случаях выделенное антитело будет получено посредством по меньшей мере одной стадии очистки.
В предпочтительных вариантах осуществления антитело согласно изобретению представляет собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в частности, гуманизированное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
Гуманизированное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать гуманизированную каркасную область легкой цепи и/или гуманизированную каркасную область тяжелой цепи.
Используемый в настоящем документе термин «гуманизированное антитело» относится к иммуноглобулину, содержащему части иммуноглобулинов разного происхождения, при этом по меньшей мере одна часть содержит аминокислотные последовательности человеческого происхождения. Например, гуманизированное антитело может содержать части, полученные из иммуноглобулина нечеловеческого происхождения с необходимой специфичностью, такого как мышь, и из последовательностей иммуноглобулина человеческого происхождения (например, иммуноглобулин), соединенные вместе химически обычными способами (например, синтетическими) или полученные в виде непрерывного полипептида с использованием методов генной инженерии (например, ДНК, кодирующая белковые части химерного антитела, может быть экспрессирована для получения непрерывной полипептидной цепи). Другим примером гуманизированного иммуноглобулина является иммуноглобулин, содержащий одну или более цепей иммуноглобулина, содержащих CDR-участок, полученный из антитела нечеловеческого происхождения, и каркасную область, полученную из легкой и/или тяжелой цепи человеческого происхождения (например, CDR-привитые антитела с изменениями или без изменений каркаса). Химерные или CDR-привитые одноцепочечные антитела также охвачены термином гуманизированный иммуноглобулин. См., например, Cabilly et al., патент США 4816567; Cabilly et al., Европейский патент 0125023 B1; Boss et al., патент США 4816397; Boss et al., Европейский патент 0120694 B1; Neuberger, M. S. et al., WO 86/01533; Neuberger, M. S. et al., Европейский патент 0194276 B1; Winter, патент США 5225539; Winter, Европейский патент 0239400 B1; Padlan, E. A. et al., Европейская заявка на патент 0519596 A1. См., также, Ladner et al., патент США 4946778; Huston, патент США 5476786; и Bird, R. E. et al., Science, 242: 423-426 (1988)), касающиеся одноцепочечных антител.
Термин «химерное антитело» относится к антителам, в которых последовательности вариабельной области получены из одного вида, и последовательности константной области получены из другого вида, таким как антитело, в котором последовательности вариабельной области получены из мышиного антитела и последовательности константной области получены из антитела человека. Аминокислотная последовательность вариабельной области может быть идентична аминокислотной последовательности вариабельной области видов, из которых она получена (например, мышиная последовательность), или может быть по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична этой последовательности вариабельной области. Например, аминокислотная последовательность вариабельной области химерного антитела согласно изобретению может содержать одну или более аминокислотных делеций, замен или добавлений (например, одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислотных делеций, замен или добавлений) по сравнению с аминокислотной последовательностью вариабельной области видов, из которых она получена.
Аналогично, аминокислотная последовательность константной области может быть идентична аминокислотной последовательности константной области видов, из которых она получена (например, человеческая последовательность), или может быть по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности этой константной области. Например, аминокислотная последовательность константной области химерного антитела согласно изобретению может содержать одну или более аминокислотных делеции, замен или добавлений (например, одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислотных делеции, замен или добавлений) по сравнению с аминокислотной последовательностью константной области видов, из которых она получена.
Например, как описано выше, аминокислотная последовательность Fc шарнирной области химерного антитела может быть мутирована, чтобы уменьшить биологический период полужизни антитела, или аминокислотная последовательность Fc-области может быть мутирована, чтобы увеличить биологический период полужизни химерного антитела.
Например, в некоторых вариантах осуществления химерных антител согласно изобретению последовательность вариабельной области тяжелой цепи содержит или получена из мышиного антитела, и последовательность константной области тяжелой цепи содержит или получена из последовательности Fc IgG4. В других вариантах осуществления последовательность вариабельной области легкой цепи содержит или получена из мышиного антитела, и последовательность константной области легкой цепи содержит или получена из последовательности человеческой С цепи каппа Ig (IgK).
В других вариантах осуществления Fc-область содержит мутантную человеческую последовательность Fc IgG4 с мутацией S228P для отмены обмена Fab-фрагментами (как показано на фигуре 20(A) для химерного антитела Chim13E2IgG4, содержащего последовательность тяжелой цепи 13E2IgG4mut).
В других вариантах осуществления Fc-область содержит часть С цепи каппа человеческого Ig (IgK) дикого типа (13E2IgK) (как показано на фигуре 20(B) для химерного антитела Chim13E2IgG4, содержащего последовательность легкой цепи 13E2IgK).
Нумерация остатков в Fc-области, используемая для человеческого мутанта Fc IgG4, описанного выше, представляет собой стандартную нумерацию индекса Eu, как в Kabat (Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication n° 91-3242, pp. 662,680,689 (1991)).
Гуманизированные антитела могут быть получены с использованием синтетических и/или рекомбинантных нуклеиновых кислот для получения генов (например, кДНК), кодирующих желательную гуманизированную цепь. Например, последовательности нуклеиновых кислот (например, ДНК), кодирующие гуманизированные вариабельные области, могут быть сконструированы с использованием способов PCR-мутагенеза для изменения последовательностей ДНК, кодирующих человеческую или гуманизированную цепь, такую как темплат ДНК, из ранее гуманизированной вариабельной области (см., например, Kamman, M., et al., Nucl. Acids Res., 17: 5404 (1989)); Sato, K., et al., Cancer Research, 53: 851-856 (1993); Daugherty, B. L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); и Lewis, A. P. and J. S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)). Используя эти или другие подходящие методы, могут быть также получены варианты. Например, клонированные вариабельные области могут быть подвергнуты мутагенезу, и могут быть выбраны последовательности, кодирующие варианты с требуемой специфичностью (например, из фаговой библиотеки; см., например, Krebber et al., U.S. Pat. No. 5,514,548; Hoogenboom et al., WO 93/06213, published Apr. 1, 1993)).
Используемый здесь термин «каркас» применительно к вариабельной области антитела служит для обозначения всех аминокислотных остатков вне участков CDR в пределах вариабельной области антитела. Каркас вариабельной области обычно представляет собой прерывистую аминокислотную последовательность длиной примерно 100-120 аминокислот, но к нему относятся только те аминокислоты, которые находятся вне участков CDR. Используемый здесь термин «каркасный участок» служит для обозначения тех участков каркаса, которые разделены участками CDR.
Гуманизация каркасной области(ей) снижает риск появления антител, вызывающих реакцию на человеческое антимышиное антитело (НАМА) у людей. Признанные в данной области способы определения иммунного ответа могут быть выполнены для контроля ответа HAMA у конкретного пациента или во время клинических испытаний. Пациенты, которым вводили гуманизированные антитела, могут быть оценены на иммуногенность вначале и во время проведения терапии. Ответ НАМА измеряют, например, путем детекции антител к гуманизированному терапевтическому реагенту в образцах сыворотки от пациентов с использованием способа, известного в данной области, включая технологию поверхностного плазмонного резонанса (BIACORE) и/или твердофазный иммуносорбентный анализ (ELISA). Во многих случаях гуманизированное антитело согласно изобретению по существу не вызывает ответ НАМА у субъектов-людей.
Определенные аминокислоты остатков каркаса вариабельной области человека выбирают для замены исходя из их возможного влияния на CDR-конформацию и/или связывание с антигеном. Неестественное сочленение мышиных CDR-участков с человеческой вариабельной каркасной областью может привести к неестественным конформационным ограничениям, которые, при отсутствии коррекции путем замены определенных аминокислотных остатков, приводят к утрате афинности связывания.
Выбор аминокислотных остатков для замены может быть определен, в частности, путем компьютерного моделирования. Компьютерное аппаратное обеспечение и программное обеспечение для получения трехмерных изображений молекул иммуноглобулина известно в данной области. Как правило, молекулярные модели создают, начиная от разрешенных структур для иммуноглобулиновых цепей или их доменов. Цепи для моделирования сравнивали по сходству аминокислотной последовательности с цепями или доменами разрешенной трехмерной структуры, и цепи или домены, демонстрирующие наибольшее сходство последовательностей, выбирают в качестве отправной точки для конструирования молекулярной модели. Для моделирования выбирают цепи или домены, обладающие по меньшей мере 50% идентичностью последовательности, например, такие цепи или домены, которые обладают по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% идентичностью последовательности или более. Разрешенные начальные структуры моделируют таким образом, чтобы допустить различия между фактическими аминокислотами в цепях иммуноглобулина или доменах, которые моделируются, и таковыми в начальной структуре. Модифицированные структуры затем компонуют в составной иммуноглобулин. Наконец, модель уточняется по минимизации энергии и по проверке того, что все атомы находятся в пределах соответствующих расстояний один от другого, и что длины связей и углы находятся в химически допустимых пределах.
CDR и каркасные области могут быть определены согласно ссылке Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991). Альтернативное структурное определение было предложено Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987); Nature 342:878 (1989); и J. Mol. Biol. 186:651 (1989) (совместно называемые как "Chothia"). Когда каркасные остатки, как определено Kabat выше, представляют собой структурные остатки петли, как определено Chothia выше, аминокислоты, присутствующие в мышином антителе, могут быть выбраны для замены в гуманизированное антитело. Остатки, которые «прилегают к CDR-участку», включают аминокислотные остатки в положениях, расположенных непосредственно рядом с одним или более CDR в первичной последовательности цепи гуманизированного иммуноглобулина, например, в положениях, непосредственно прилегающих CDR, как определено Kabat, или CDR, как определено Chothia (см., например, Chothia and Lesk JMB 196:901 (1987)). Особенно вероятно, что эти аминокислоты взаимодействуют с аминокислотами в CDR-участках и, если выбраны из акцептора, деформируют донорские CDR и снижают аффинность. Кроме того, соседние аминокислоты могут взаимодействовать непосредственно с антигеном (Amit et al., Science, 233:747 (1986)) и выбор этих аминокислот из донора может быть желательным для сохранения всех контактов с антигеном, которые обеспечивают аффинность исходного антитела. Альтернативно, CDR и каркасные области могут быть такими, как определено MacCallum et al., или Lefranc et al. (смотри выше таблицу 1).
В некоторых случаях гуманизированная каркасная область VH или каркасная область VL представляет собой консенсусную гуманизированную каркасную область. Консенсусная гуманизированная каркасная область может представлять наиболее широко встречающийся аминокислотный остаток при селекции каркасных последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его фрагмент содержит один или более гуманизированных каркасных участков (FR). В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое анти-LAG-3 антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую один, два, три или четыре FR-участка легкой цепи, которые были гуманизированы. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 легкой цепи; CDR-L1, как описано в настоящем документе; гуманизированный FR2 легкой цепи; CDR-L2, как описано в настоящем документе; гуманизированный FR3 легкой цепи; CDR-L3, как описано в настоящем документе; и гуманизированный FR4 легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 представляют собой следующие: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3.
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область легкой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 легкой цепи; CDR-L1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; гуманизированный FR2 легкой цепи; CDR-L2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; гуманизированный FR3 легкой цепи; CDR-L3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и гуманизированный FR4 легкой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 представляют собой следующие: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6.
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область легкой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR легкой цепи; CDR-L1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; гуманизированный FR2 легкой цепи; CDR-L2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; гуманизированный FR3 легкой цепи; CDR-L3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и гуманизированный FR4 легкой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 представляют собой следующие: SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26.
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область легкой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 легкой цепи; CDR-L1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; гуманизированный FR2 легкой цепи; CDR-L2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; гуманизированный FR3 легкой цепи; CDR-L3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и гуманизированный FR4 легкой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 выбраны из: SEQ ID NO: 4 и 24 (CDR-L1); SEQ ID NO: 5 и 25 (CDR-L2); и SEQ ID NO: 6 и 26 (CDR-L3).
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область легкой цепи, содержащую в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 легкой цепи; CDR-L1, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24; гуманизированный FR2 легкой цепи; CDR-L2, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; гуманизированный FR3 легкой цепи; CDR-L3, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; и гуманизированный FR4 легкой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 представляют собой следующие: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13.
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область легкой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 легкой цепи; CDR-L1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; гуманизированный FR2 легкой цепи; CDR-L2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; гуманизированный FR3 легкой цепи; CDR-L3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и гуманизированный FR4 легкой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 представляют собой следующие: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16.
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область легкой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 легкой цепи; CDR-L1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; гуманизированный FR2 легкой цепи; CDR-L2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; гуманизированный FR3 легкой цепи; CDR-L3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; и гуманизированный FR4 легкой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 представляют собой следующие: SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36.
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область легкой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 легкой цепи; CDR-L1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; гуманизированный FR2 легкой цепи; CDR-L2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; гуманизированный FR3 легкой цепи; CDR-L3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и гуманизированный FR4 легкой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 выбраны из: SEQ ID NO: 14 и 34 (CDR-L1); SEQ ID NO: 15 и 35 (CDR-L2); и SEQ ID NO: 16 и 36 (CDR-L3).
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область легкой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 легкой цепи; CDR-L1, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34; гуманизированный FR2 легкой цепи; CDR-L2, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35; гуманизированный FR3 легкой цепи; CDR-L3, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36; и гуманизированный FR4 легкой цепи.
В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое анти-LAG-3 антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую один, два, три или четыре FR-участка тяжелой цепи, которые были гуманизированы. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 тяжелой цепи; CDR-H1, как описано в настоящем документе; гуманизированный FR2 тяжелой цепи; CDR-H2, как описано в настоящем документе; гуманизированный FR3 тяжелой цепи; CDR-H3, как описано в настоящем документе; и гуманизированный FR4 тяжелой цепи.
В некоторых вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 представляют собой следующие: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6.
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 тяжелой цепи; CDR-H1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; гуманизированный FR2 тяжелой цепи; CDR-H2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; гуманизированный FR3 тяжелой цепи; CDR-H3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и гуманизированный FR4 тяжелой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 представляют собой следующие: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3.
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 тяжелой цепи; CDR-H1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; гуманизированный FR2 тяжелой цепи; CDR-H2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; гуманизированный FR3 тяжелой цепи; CDR-H3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и гуманизированный FR4 тяжелой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 представляют собой следующие: SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23.
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 тяжелой цепи; CDR-H1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; гуманизированный FR2 тяжелой цепи; CDR-H2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; гуманизированный FR3 тяжелой цепи; CDR-H3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и гуманизированный FR4 тяжелой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 выбраны из следующих: SEQ ID NO: I и 21 (CDR-H1); SEQ ID NO: 2 и 22 (CDR-H2); и SEQ ID NO: 3 и 23 (CDR-H3).
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 тяжелой цепи; CDR-H1, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21; гуманизированный FR2 тяжелой цепи; CDR-H2, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; гуманизированный FR3 тяжелой цепи; CDR-H3, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 23; и гуманизированный FR4 тяжелой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 выбраны из следующих: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16.
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 тяжелой цепи; CDR-H1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; гуманизированный FR2 тяжелой цепи; CDR-H2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; гуманизированный FR3 тяжелой цепи; CDR-H3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; и гуманизированный FR4 тяжелой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 представляют собой следующие: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13.
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 тяжелой цепи; CDR-H1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; гуманизированный FR2 тяжелой цепи; CDR-H2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; гуманизированный FR3 тяжелой цепи; CDR-H3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и гуманизированный FR4 тяжелой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 представляют собой следующие: SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33.
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 тяжелой цепи; CDR-H1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; гуманизированный FR2 тяжелой цепи; CDR-H2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; гуманизированный FR3 тяжелой цепи; CDR-H3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; и гуманизированный FR4 тяжелой цепи.
В других вариантах осуществления соответствующие аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 выбраны из: SEQ ID NO: 11 и 31 (CDR-H1); SEQ ID NO: 12 и 32 (CDR-H2); и SEQ ID NO: 13 и 33 (CDR-H3).
Например, рассматриваемое антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу: гуманизированный FR1 тяжелой цепи; CDR-H1, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31; гуманизированный FR2 тяжелой цепи; CDR-H2, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32;
гуманизированный FR3 тяжелой цепи; CDR-H3, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; и гуманизированный FR4 тяжелой цепи.
Примеры подходящих гуманизированных каркасных последовательностей включают:
вариант 1 VH (VH1)
VH1 FR1: QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFS (SEQ ID NO: 52);
VH1 FR2: WIRQPPGKALEWLA (SEQ ID NO: 53);
VH1 FR3: RLTISKDTSKSQVILNMTNMDPVDTATYYC (SEQ ID NO: 54); и
VH1 FR4: WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 55);
вариант 2 VH (VHi)
VH2 FR1: QITLKESGPALVKPTQTLTLTCSFS (SEQ ID NO: 56);
VH2 FR2: WIRQPPGKALEWLA (SEQ ID NO: 57);
VH2 FR3: RLTISKDTSKNQVVLTMANMDPVDTATYYC (SEQ ID NO: 58);
VH2 FR4: WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 59);
вариант 3 VH (VH3)
VH3 FR1: QITLKETGPTLVKPTQTLTLTCTFS (SEQ ID NO: 60);
VH3 FR2: WIRQPPGKALEWVT (SEQ ID NO: 61);
VH3 FR3: RVTIRKDTSKNQVALTMTNMDPLDTGTYYC (SEQ ID NO: 62);
VH3 FR4: WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 63);
вариант 4 VH (VH4)
VH4 FR1: QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFS (SEQ ID NO: 64);
VH4 FR2: WIRQPPGKTLEWLT (SEQ ID NO: 65);
VH4 FR3: RLSITKDTSKNQVVLTMTNMDPLDTGTYYC (SEQ ID NO: 66);
VH4 FR4: WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 67);
вариант 1 VL (VLi)
VL1 FR1: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC (SEQ ID NO: 68);
VL1 FR2: WYQQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO: 69);
VL1 FR3: GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (SEQ ID NO: 70); и
VL1 FR4: FGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 71);
вариант 2 VL (VL2)
VL2 FR1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 72);
VL2 FR2: WYQQKPGQAPKLLIF (SEQ ID NO: 73);
VL2 FR3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTLSSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 74); и
VL2 FR4: FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 75);
вариант 3 VL ГУЪз)
VL3 FR1: DIVMTQTPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 76);
VL3 FR2: WYQQRPGQAPKLLIY (SEQ ID NO: 77);
VL3 FR3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 78); и
VL3 FR4: FGQGTRLDIK (SEQ ID NO: 79);
вариант 4 VL (VLt)
VL4 FR1: EIVLTQSPDSLAVSLGERATINC (SEQ ID NO: 80);
VL4 FR2: WYQQKAGQSPKLLIY (SEQ ID NO: 81);
VL4 FR3: GVPDRFSGSGSGTDFTLTIDSLQAEDVAVYYC (SEQ ID NO: 82); и
VL4 FR4: FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 83).
На фигуре 22 показаны последовательности вариабельных областей гуманизированных вариантов 1-4 VH и вариантов 1-4 VL, выровненные с соответствующей последовательностью исходного мышиного антитела 13Е2. Последовательности CDR выделены серым цветом. Изменения в гуманизированных каркасных последовательностях вариантов по сравнению с исходной мышиной последовательностью показаны подчеркнутыми и выделенными жирным шрифтом. Измененные остатки в гуманизированной последовательности для каждого варианта также показаны в таблице 26 (последовательности тяжелой цепи) и 27 (последовательности легкой цепи) в примере 18.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело согласно изобретению (или его антигенсвязывающий фрагмент) содержит гуманизированную тяжелую цепь, которая содержит любую из аминокислотных замен, показанных для VH1, VH2, VH3 или VH4 в таблице 26, и/или гуманизированную легкую цепь, которая содержит любую из аминокислотных замен, показанных для VL1, VL2, VL3 или VL4 в таблице 27.
Антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент (в частности, гуманизированное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент) может содержать любую из вышеуказанных гуманизированных каркасных последовательностей (SEQ ID NO: 52-83), или любую комбинацию вышеуказанных гуманизированных каркасных последовательностей (SEQ ID NO: 52-83).
В некоторых вариантах осуществления гуманизированная каркасная область тяжелой цепи может содержать аминокислотную последовательность, представленную в любой из: SEQ ID NO: 52, 53, 54 или 55; любой из SEQ ID NO: 56, 57, 58 или 59; любой из SEQ ID NO: 60, 61, 62 или 63; или любой из SEQ ID NO: 64, 65, 66 или 67.
В конкретных вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент (в частности, гуманизированное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент) может содержать:
каркасную область 1 VH I (FR1 VH) последовательности SEQ ID NO: 52; FR2 VH последовательности SEQ ID NO: 53; FR3 VH последовательности SEQ ID NO: 54; и FR4 VH последовательности SEQ ID NO: 55;
каркасную область 1 VH (FR1 VH) последовательности SEQ ID NO: 56; FR2 VH последовательности SEQ ID NO: 57; FR3 VH последовательности SEQ ID NO: 58; и FR4 VH последовательности SEQ ID NO: 59;
каркасную область 1 VH (FR1 VH) последовательности SEQ ID NO: 60; FR2 VH последовательности SEQ ID NO: 61; FR3 VH последовательности SEQ ID NO: 62; и FR4 VH последовательности SEQ ID NO: 63; или
каркасную область 1 VH (FR1 VH) последовательности SEQ ID NO: 64; FR2 VH последовательности SEQ ID NO: 65; FR3 VH последовательности SEQ ID NO: 66; и FR4 VH последовательности SEQ ID NO: 67.
Альтернативно или дополнительно, в некоторых вариантах осуществления гуманизированная каркасная область легкой цепи может содержать аминокислотную последовательность, представленную в любой из: SEQ ID NO: 68, 69, 70 или 71; любой из SEQ ID NO: 72, 73, 74 или 75; любой из SEQ ID NO: 76, 77, 78 или 79; или любой из SEQ ID NO: 80, 81, 82 или 83.
В конкретных вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент (в частности, гуманизированное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент) может содержать:
каркасную область 1 VL (FR1 VL) последовательности SEQ ID NO: 68; FR2 VL последовательности SEQ ID NO: 69; FR3 VL последовательности SEQ ID NO: 70; и FR4 VL последовательности SEQ ID NO: 71;
каркасную область 1 VL (FR1 VL) последовательности SEQ ID NO: 72; FR2 VL последовательности SEQ ID NO: 73; FR3 VL последовательности SEQ ID NO: 74; и FR4 VL последовательности SEQ ID NO: 75;
каркасную область 1 VL (FR1 VL) последовательности SEQ ID NO: 76; FR2 VL последовательности SEQ ID NO: 77; FR3 VL последовательности SEQ ID NO: 78; и FR4 VL последовательности SEQ ID NO: 79; или
каркасную область 1 VL (FR1 VL) последовательности SEQ ID NO: 80; FR2 VL последовательности SEQ ID NO: 81; FR3 VL последовательности SEQ ID NO: 82; и FR4 VL последовательности SEQ ID NO: 83.
В конкретных вариантах осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент (в частности, гуманизированное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент) может содержать любую из следующих комбинаций гуманизированных каркасных последовательностей:
FR1-FR4 VH1; и FR1-FR4 VL1;
FR1-FR4 VH1; и FR1-FR4 VL2;
FR1-FR4 VH1; и FR1-FR4 VL3;
FR1-FR4 VH1; и FR1-FR4 VL4;
FR1 -FR4 VH2; и FR1-FR4 VL1;
FR1-FR4 VH2; и FR1-FR4 VL2;
FR1-FR4 VH2; и FR1-FR4 VL3;
FR1 -FR4 VH2; и FR1 -FR4 VL4;
FR1-FR4 VH3; и FR1-FR4 VL1;
FR1-FR4 VH3; и FR1-FR4 VL2;
FR1-FR4 VH3; и FR1-FR4 VL3;
FR1-FR4 VH3; и FR1-FR4 VL4;
FR1-FR4 VH4; и FR1-FR4 VL1;
FR1-FR4 VH4; и FR1-FR4 VL2;
FR1-FR4 VH4; и FR1-FR4 VL3;
FR1-FR4 VH4; и FR1-FR4 VL4.
В конкретном варианте осуществления антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент (в частности, гуманизированное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент) содержит следующие гуманизированные каркасные последовательности:
FR1 VH4: QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFS (SEQ ID NO: 64);
FR2 VH4: WIRQPPGKTLEWLT (SEQ ID NO: 65);
FR3 VH4: RLSITKDTSKNQVVLTMTNMDPLDTGTYYC (SEQ ID NO: 66); и
FR4 VH4: WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 67); и
FR1 VL3: DIVMTQTPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 76);
FR2 VL3: WYQQRPGQAPKLLIY (SEQ ID NO: 77);
FR3 VL3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 78); и
FR4 VL3: FGQGTRLDIK (SEQ ID NO: 79).
В конкретных вариантах осуществления выделенное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH-область антитела, содержащую:
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21;
FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21;
FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21;
FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21;
FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67; или
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67.
В конкретном варианте осуществления выделенное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 84.
Альтернативно или дополнительно, в конкретных вариантах осуществления выделенное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент сдержит область VL антитела, содержащую:
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24;
FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24;
FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24;
FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24;
FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83.
В конкретном варианте осуществления выделенное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 85.
В следующем конкретном варианте осуществления выделенное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 84, и легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 85.
В других вариантах осуществления выделенное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH-область антитела, содержащую:
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31;
FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31;
FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31;
FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31;
FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67; и
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67.
Альтернативно или дополнительно, в конкретных вариантах осуществления выделенное антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL-область антитела, содержащую:
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34;
FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34;
FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34;
FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34;
FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83; или
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83. В некоторых случаях рассматриваемое антитело содержит константную область иммуноглобулина (например, Fc-область). В некоторых вариантах осуществления Fc-область, в случае присутствия, представляет собой человеческую Fc-область. Если присутствуют константные области, антитело может содержать константные области легкой цепи и тяжелой цепи.
Подходящие константные области тяжелой цепи включают СН1, шарнирную, СН2, СН3 и СН4 области.
Примером подходящей Fc-области тяжелой цепи является Fc-область изотипа IgG4 человека. Константные области легкой цепи могут представлять собой лямбда или каппа. Рассматриваемое антитело (например, рассматриваемое гуманизированное антитело) может содержать последовательности из более чем одного класса или изотипа. Антитела могут экспрессироваться в виде тетрамеров, содержащих две легкие и две тяжелые цепи, в виде отдельных тяжелых цепей, легких цепей, в виде Fab, Fab', F(ab')2 и Fv, или в виде одноцепочечных антител, в которых вариабельные области легкой и тяжелой цепей соединены с помощью спейсера.
В некоторых случаях область тяжелой цепи может представлять собой область изотипа IgG4. В некоторых из этих вариантов осуществления шарнирная область содержит замену S241P. См., например, Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30:105. В некоторых из этих вариантов осуществления шарнирная область содержит замену L236E (или L235E, с использованием нумерации EU; Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. U.S. Dept. Health and Human Services, Bethesda, MD, NIH Publication No. 91-3242). См., например, Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925; и Klechevsky et al. (2010) Blood 116:1685. В некоторых из этих вариантов осуществления шарнирная область содержит замену S241P и замену L236E.
Аминокислотная последовательность константной области может быть идентична аминокислотной последовательности константной области видов, из которых она получена (например, человеческая последовательность), или может быть по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична этой аминокислотной последовательности константной области. Например, аминокислотная последовательность константной области антитела согласно изобретению может содержать одну или более аминокислотных делеций, замен или добавлений (например, одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислотных делеций, замен или добавлений) по сравнению с аминокислотной последовательностью константной области видов, из которых она получена.
Например, как описано выше, аминокислотная последовательность Fc шарнирной области антитела согласно изобретению может быть мутирована для уменьшения биологического времени полужизни антитела, или аминокислотная последовательность Fc-области может быть мутирована для увеличения биологического времени полужизни антитела.
Необходимо обеспечить, чтобы антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент было лишено антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) и комплементзависимой цитотоксичности (CDC), чтобы антитело или фрагмент можно быть использовать для негативного регулирования пролиферации и/или функции Т-клеток без истощения Т-клеток в результате ADCC или CDC.
Например, в некоторых вариантах осуществления Fc-область содержит человеческую последовательность Fc-области IgG4 дикого типа.
В других вариантах осуществления Fc-область содержит мутантную человеческую последовательность Fc IgG4 с мутацией S228P для устранения обмена Fab-фрагментами (как показано на фигуре 20(А) для химерного антитела Chim13E2IgG4, содержащего последовательность тяжелой цепи 13E2IgG4mut).
В других вариантах осуществления Fc-область содержит С-часть каппа-цепи Ig (IgK) человека дикого типа (13E2IgK) (как показано на фигуре 20(В) для химерного антитела Chim13E2IgG4, содержащего последовательность легкой цепи 13E2IgK).
Нумерация остатков в Fc-области, используемых для человеческого мутанта Fc IgG4, описанного выше, представляет стандартную нумерацию индекса EU, как в Kabat (Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication №91-3242, pp. 662,680,689 (1991)).
Рассматриваемое антитело может содержать свободную тиольную (-SH) группу на карбоксильном конце, при этом свободная тиольная группа может быть использована для присоединения антитела ко второму полипептиду (например, другому антителу, включая рассматриваемое антитело), каркасу, носителю и т.д.
В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое антитело содержит одну или более не встречающихся в природе аминокислот. В некоторых вариантах осуществления не встречающаяся в природе аминокислота содержит карбонильную группу, ацетильную группу, аминооксигруппу, гидразиновую группу, гидразидную группу, семикарбазидную группу, азидную группу или алкиновую группу. См., например, патент США 7632924, где описаны типичные не встречающиеся в природе аминокислоты. Включение неприродной аминокислоты может обеспечивать присоединение к полимеру, второму полипептиду, каркасу и т.п. Например, рассматриваемое антитело, соединенное с водорастворимым полимером, можно получить путем реакции водорастворимого полимера (например, PEG), содержащего карбонильную группу, с антителом, содержащим неприродную аминокислоту, содержащую аминоокси, гидразиновую, гидразидную или семикарбазидную группу. В качестве другого примера, рассматриваемое антитело, соединенное с водорастворимым полимером, можно получить путем реакции рассматриваемого антитела, содержащего алкинсодержащую аминокислоту, с водорастворимым полимером (например, PEG), содержащим азидную группу; в некоторых вариантах осуществления азидная или алкиновая группа соединяется с молекулой PEG амидной связью. «Не встречающаяся в природе аминокислота» означает такую аминокислоту, которая не является одной из 20 распространенных аминокислот или пирролизином, или селеноцистеином. Другие термины, которые могут применяться как синонимы термину «не встречающаяся в природе аминокислота» - это «не природная аминокислота», «неприродная аминокислота», «аминокислота не природного происхождения» и различные их варианты с написанием через дефис и без него. Термин «не встречающаяся в природе аминокислота» также включает, но без ограничения, аминокислоты, возникающие при модификации (например, посттрансляционной модификации) аминокислот природного происхождения (включая, но без ограничения, 20 распространенных аминокислот или пирролизин и селеноцистеин), но сами они не встраиваются трансляционным комплексом в растущую полипептидную цепь. Примеры таких не встречающихся в природе аминокислот включают, но без ограничения, N-ацетилглюкозаминил-L-серин, N-ацетилглюкозаминил-L-треонин и O-фосфотирозин.
В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое антитело связано (например, ковалентно связано) с полимером (например, полимером, отличным от полипептида). Подходящими полимерами являются, например, биосовместимые полимеры и водорастворимые биосовместимые полимеры. Подходящие полимеры включают синтетические полимеры и полимеры природного происхождения. Подходящие полимеры включают, например, замещенные или незамещенные линейные или разветвленные полиалкиленовые, полиалкениленовые или полиоксиалкиленовые полимеры либо разветвленные или неразветвленные полисахариды, например, гомо- или гетерополисахариды. Подходящие полимеры включают, например, сополимеры этилена и винилового спирта (широко известные под общим названием EVOH или под торговой маркой EVAL); полибутилметакрилат; поли(гидроксивалерат); поли(L-молочную кислоту); поликапролактон; поли(лактид-ко-гликолид); поли(гидроксибутират); поли(гидроксибутират-ко-валерат); полидиоксанон; полиортоэфир; полиангидрид; поли(гликолевую кислоту); поли(D,L-молочную кислоту); поли(гликолевую кислоту-ко-триметиленкарбонат); полифосфоэфир; полифосфоэфир уретана; поли(аминокислоты); цианоакрилаты; поли(триметиленкарбонат); поли(иминокарбонат); сополимеры простых и сложных эфиров (например, сополимеры поли(этиленоксида)-поли(молочной кислоты) (PEO/PLA); полиалкиленоксалаты; полифосфазены; биомолекулы, такие как фибрин, фибриноген, целлюлоза, крахмал, коллаген и гиалуроновая кислота; полиуретаны; силиконы; сложные полиэфиры; полиолефины; сополимеры полиизобутилена и этилен-альфа-олефинов; акриловые полимеры и сополимеры; винилгалидные полимеры и сополимеры, такие как поливинилхлорид; поливиниловые простые эфиры, такие как поливинилметиловый эфир; поливинилиденгалиды, такие как поливинилиденфторид и поливинилиденхлорид; полиакрилонитрил; поливинилкетоны, поливиниловые ароматические полимеры, такие как полистирол; поливиниловые сложные эфиры, такие как поливинилацетат; сополимеры виниловых мономеров друг с другом и олефинами, такие как сополимеры этилена и метилметакрилата, сополимеры акрилонитрила и стирола, ABS-смолы и сополимеры этилена и винилацетата; полиамиды, такие как Nylon 66 и поликапролактам; алкидные смолы; поликарбонаты; полиоксиметилены; полиимиды; полиэфиры; эпоксидные смолы; полиуретаны; вискозу; триацетат вискозы; целлюлозу; ацетат целлюлозы; бутират целлюлозы; ацетат-бутират целлюлозы; целлофан; нитрат целлюлозы; пропионат целлюлозы; эфиры целлюлозы; аморфный тефлон; поли(этиленгликоль); и карбоксиметилцеллюлозу.
Подходящие синтетические полимеры включают незамещенный и замещенный линейный или разветвленный поли(этиленгликоль), поли(пропиленгликоль), поли(виниловый спирт) и их производные, например, замещенный поли(этиленгликоль), такой как метоксиполи(этиленгликоль), и его производные. Подходящие природные полимеры включают, например, альбумин, амилозу, декстран, гликоген и их производные.
Средняя молекулярная масса подходящих полимеров может составлять от 500 Да до 50000 Да, например, от 5000 Да до 40000 Да, или от 25000 Да до 40000 Да. Например, в некоторых вариантах осуществления, в которых рассматриваемое антитело содержит полимер поли(этиленгликоль) (PEG) или метоксиполи(этиленгликоль), этот полимер PEG или метоксиполи(этиленгликоль) может иметь молекулярную массу в диапазоне примерно от 0,5 килодальтон (кДа) до 1 кДа, примерно от 1 кДа до 5 кДа, от 5 кДа до 10 кДа, от 10 кДа до 25 кДа, от 25 кДа до 40 кДа или от 40 кда до 60 кДа.
Как отмечалось выше, в некоторых вариантах осуществления рассматриваемое антитело ковалентно связано с непептидным синтетическим полимером. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое антитело ковалентно связано с полимером PEG. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый мультимер scFv ковалентно связан с полимером PEG. См., например, Albrecht et al. (2006) J. Immunol. Methods 310:100. Способы и реагенты, подходящие для пегилирования белка, хорошо известны в данной области и могут быть найдены, например, в патенте США 5849860.
PEG, подходящий для конъюгирования с белком, как правило, растворим в воде при комнатной температуре и имеет общую формулу R(O-CH2-CH2)nO-R, где R представляет собой водород или защитную группу, такую как алкильная или алканольная группа, и где п представляет целое число от 1 до 1000. Когда R является защитной группой, то обычно он содержит от 1 до 8 атомов углерода.
В некоторых вариантах осуществления PEG, конъюгированный с рассматриваемым антителом, является линейным. В некоторых вариантах осуществления PEG, конъюгированный с рассматриваемым антителом, является разветвленным. Разветвленные производные PEG описаны в патенте США 5643575, «звездчатые PEG» и многолучевые PEG описаны в каталоге Shearwater Polymers, Inc. "Polyethylene Glycol Derivatives 1997-1998". Звездчатые PEG описаны в данной области, включая, например, патент США 6046305.
Рассматриваемое антитело может быть гликозилировано, например, рассматриваемое антитело может содержать ковалентно связанный углеводный или полисахаридный фрагмент. Гликозилирование антител обычно бывает N-связанным или O-связанным. N-связанное относится к присоединению углеводного фрагмента к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серина и аспарагин-Х-треонин, где Х представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, представляют собой последовательности распознавания для ферментативного присоединения углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. O-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из Сахаров N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, чаще всего серину или треонину, хотя могут быть также использованы 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.
Добавление сайтов гликозилирования в антитело удобным образом осуществляется путем изменения аминокислотной последовательности таким образом, чтобы она содержала одну или более из вышеописанных трипептидных последовательностей (для N-связанных сайтов гликозилирования). Изменение также может быть осуществлено путем добавления или замены одним или более остатками серина или треонина в последовательности исходного антитела (для сайтов O-связанного гликозилирования). Аналогичным образом, удаление сайтов гликозилирования может быть осуществлено путем модификации аминокислот в природных сайтах гликозилирования антитела.
Рассматриваемое антитело в некоторых вариантах осуществления содержит «рентгеноконтрастную» метку, например, метку, которую можно легко визуализировать, например, с помощью рентгеновских лучей. Рентгеноконтрастные материалы хорошо известны специалистам в данной области. Наиболее распространенными рентгеноконтрастными материалами являются соли иода, брома или бария. Также известны и другие рентгеноконтрастные материалы, которые включают, но без ограничения, органические производные висмута (см., например, патент США 5939045), рентгеноконтрастные мультиуретаны (см. патент США 5346981), висмуторганические композиты (смотри, например, патент США 5256334), рентгеноконтрастные мультимерные комплексы бария (см., например, патент США 4866132), и т.п.
Рассматриваемое антитело может быть ковалентно связано со второй молекулой (например, липидом, полипептидом, отличным от рассматриваемого антитела, синтетическим полимером, углеводом и т.п.) при помощи, например, глутаральдегида, гомобифункционального сшивающего реагента, или гетеробифункционального сшивающего реагента. Глутаральдегид сшивает полипептиды посредством своих аминогрупп. Гомобифункциональные сшивающие реагенты (например, гомобифункциональный имидоэфир, гомобифункциональный N-гидроксисукцинимидиловый (NHS) эфир или гомобифункциональный реагирующий с сульфгидрилами сшивающий реагент) содержат два или более идентичных реакционноспособных фрагмента и могут быть использованы в одностадийных реакциях, в которых сшивающий реагент добавляется в раствор, содержащий смесь полипептидов, подлежащих сшиванию. Гомобифункциональный NHS-эфир и имидоэфиры сшивают аминосодержащие полипептиды. При слегка щелочном рН имидоэфиры реагируют только с первичными аминами с образованием имидоамидов и не влияют на общий заряд сшитых полипептидов. Гомобифункциональные реагирующие с сульфгидрилами сшивающие реагенты включают бисмалеимидгексан (ВМН), 1,5-дифтор-2,4-динитробензол (DFDNB) и 1,4-ди-(3',2'-пиридилдитио)пропионамидобутан (DPDPB).
Гетеробифункциональные сшивающие реагенты содержат два или более различных реакционноспособных фрагментов (например, реагирующий с амином фрагмент и реагирующий с сульфгидрилом фрагмент) и сшиваются с одним из полипептидов через реагирующий с амином или сульфгидрилом фрагмент, а затем реагируют с другим полипептидом через непрореагировавший фрагмент. Существует множество гетеробифункциональных галогенацетильных сшивающих реагентов, а также пиридилдисульфидных сшивающих реагентов. Карбодиимиды являются классическим примером гетеробифункциональных сшивающих реагентов для конъюгирования карбоксилов с аминами, что дает амидную связь.
Рассматриваемое антитело может быть иммобилизовано на твердой подложке. Подходящие подложки хорошо известны в данной области и содержат, в частности, коммерчески доступные колоночные материалы, полистиреновые шарики, латексные шарики, магнитные шарики, коллоидные металлические частицы, стеклянные и/или силиконовые чипы и поверхности, нитроцеллюлозные полоски, нейлоновые мембраны, листы, дурациты, лунки реакционных планшетов (например, многолуночных планшетов), пластиковые пробирки и т.д. Твердая подложка может включать любые из целого ряда веществ, включая, например, стекло, полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, полиэтилен, поликарбонат, декстран, нейлон, амилозу, природную и модифицированную целлюлозы, полиакриламиды, агарозы и магнетит. Подходящие способы иммобилизации рассматриваемого антитела на твердой подложке хорошо известны и включают, но без ограничения, ионные, гидрофобные, ковалентные взаимодействия и т.п. Твердые подложки могут быть растворимыми или нерастворимыми, например, в водном растворе. В некоторых вариантах осуществления подходящая твердая подложка обычно нерастворима в водном растворе.
Рассматриваемое антитело в некоторых вариантах осуществления содержит детектируемую метку. Подходящие детектируемые метки включают любую композицию, детектируемую спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими средствами. Подходящие метки включают, но без ограничения, магнитные частицы (например, Dynabeads™), флуоресцентные красители (например, флуоресцеин изотиоцанат, техасский красный, родамин, зеленый флуоресцентный белок, красный флуоресцентный белок, желтый флуоресцентный белок и т.п.), радиоактивные метки (например, 3H, 125I, 35S, 14C или 32P), ферменты (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, люцифераза и другие широко используемые в ферментном иммуносорбентном анализе (ELISA)) и колориметрические метки, такие как коллоидное золото, или цветные стеклянные или пластиковые (например, полистирольные, полипропиленовые, латексные и т.д.) шарики.
В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое антитело содержит контрастное вещество или радиоизотоп, при этом контрастное вещество или радиоизотоп является подходящим для применения в визуализации, например, процедурах видуализации, проводимых на человеке. Неограничивающие примеры меток включают радиоизотоп, такой как 1231I (иод), 18F (фтор), 99Tc (технеций), 111In (индий) и 67Ga (галлий), и контрастное вещество, такое как гадолиний (Gd), диспрозий и железо.
Радиоактивные изотопы Gd (153Gd) также являются доступными и подходящими для процедур визуализации на млекопитающих, не относящихся к человеку.
Рассматриваемое антитело может быть мечено с использованием стандартных методов. Например, рассматриваемое антитело может быть йодировано с использованием хлорамина Т или 1,3,4,6-тетрахлор-3а,6а-дифенилгликоурила. При фторировании фтор добавляют к рассматриваемому антителу в ходе синтеза путем реакции замещения ионов фтора. См. обзоры по синтезу белков с такими радиоизотопами: Muller-Gartner, H., TIB Tech., 16:122-130 (1998) и Saji, H., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst, 16(2):209-244 (1999). Рассматриваемое антитело также может быть мечено контрастным веществом при помощи стандартных методов. Например, рассматриваемое антитело может быть мечено Gd путем конъюгирования с антителом низкомолекулярных хелатов Gd, таких как Gd-диэтилентриаминпентауксусная кислота (GdDTPA) или Gd-тетраазациклододекантетрауксусная кислота (GdDOTA). См., Caravan et al., Chem. Rev. 99:2293-2352 (1999) и Lauffer et al., J. Magn. Reson. Imaging, 3:11-16 (1985). Рассматриваемое антитело может быть мечено Gd, например, путем конъюгирования с антителом хелатов полилизин-Gd. См., например, Curtet et al.. Invest. Radiol., 33(10):752-761 (1998). Альтернативно, рассматриваемое антитело может быть мечено Gd путем инкубации парамагнитных полимеризованных липосом, содержащих липид-хелатор Gd, с авидином и биотинилированным антителом. См., например, Sipkins et al., Nature Med., 4:623-626 (1998).
Подходящие флуоресцентные белки, которые могут быть присоединены к рассматриваемому антителу, включают, но без ограничения, зеленый флуоресцентный белок из Aequoria victoria или его мутант или производное, например, как описано в патентах США 6066476; 6020192; 5985577; 5976796; 5968750; 5968738; 5958713; 5919445; 5874304; например. Enhanced GFP, многие такие GFP, которые являются коммерчески доступными, например, от фирмы Clontech, Inc.; красный флуоресцентный белок; желтый флуоресцентный белок; любой из различных флуоресцентных и окрашенных белков из видов Anthozoan, как описано, например, в работе Matz et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:969-973; и т.п.
В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое антитело конъюгировано с терапевтическим средством. Любое из рассматриваемых антител, описанных здесь, может быть использовано для образования конъюгата антитело-агент. Агент может быть присоединен к N-концу легкой цепи, С-концу легкой цепи, N-концу тяжелой цепи или С-концу тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления агент присоединен к шарнирной области антитела или к одному или более другим участкам на антителе. Для одноцепочечного антитела агент может быть присоединен к N- или С-концу одноцепочечного антитела. Агент может быть конъюгирован к антителу напрямую или посредством линкера с использованием методик, известных специалистам в данной области. Линкер может быть расщепляемым или нерасщепляемым. Примеры таких терапевтических агентов (например, для применения в терапии) известны специалистам в данной области.
В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое антитело будет связано (например, ковалентно или не ковалентно) с партнером по слиянию, например, лигандом; эпитопной меткой; пептидом; белком, отличным от антитела; и т.п. Подходящие партнеры по слиянию включают пептиды и полипептиды, которые наделяют повышенной стабильность in vivo (например, увеличенным временем полужизни в сыворотке); обеспечивают легкость очистки, например, (His)n, например, 6His, и т.п.; обеспечивают секрецию белка слияния из клетки; обеспечивают эпитопную метку, например, GST, гемагглютинин (НА; например, YPYDVPDYA; SEQ ID NO: 41), FLAG (например, DYKDDDDK; SEQ ID NO: 42), c-myc (например, EQKLISEEDL; SEQ ID NO: 43), и т.п.; обеспечивают детектируемый сигнал, например, фермент, генерирующий детектируемый продукт (например, β-галактозидаза, люцифераза), или белок, который сам является детектируемым, например, зеленый флуоресцентный белок, красный флуоресцентный белок, желтый флуоресцентный белок и т.д.; обеспечивают мультимеризацию, например, домен мультимеризации, такой как Fc-часть иммуноглобулина; и т.п.
Слияние может также охватывать домен аффинности, включая пептидные последовательности, которые могут взаимодействовать с партнером по связыванию, например, иммобилизованным на твердой подложке, применяющимся для идентификации или очистки. Последовательные единичные аминокислоты, такие как гистидин, при слиянии с белком могут быть использованы для одностадийной очистки белка слияния путем высокоаффинного связывания со смолой на колонке, такой как никелевая сефароза. Типичными доменами аффинности являются His5 (HHHHH) (SEQ ID NO: 44), HisX6 (НННННН) (SEQ ID NO: 45), c-myc (EQKLISEEDL) (SEQ ID NO: 46), Flag (DYKDDDDK) (SEQ ID NO: 42), StrepTag (WSHPQFEK) (SEQ ID NO: 47), гемагглютинин, например, НА-Tag (YPYDVPDYA; SEQ ID NO: 41), глутатинон^-трансфераза (GST), тиоредоксин, целлюлозосвязывающий домен, RYIRS (SEQ ID NO: 48), Phe-His-His-Thr (SEQ ID NO: 49), хитин-связывающий домен, S-пептид, T7 пептид, домен SH2, С-концевой РНК-тег, WEAAAREACCRECCARA (SEQ ID NO: 50), металлсвязывающие домены, например, цинк-связывающие домены или кальций-связывающие домены, такие как домены кальций-связывающих белков, например, кальмодулин, тропонин С, кальцинейрин В, легкая цепь миозина, рековерин, S-модулин, визинин, VILIP, нейрокальцин, гиппокальцин, фреквенин, калтрактин, большая субъединица кальпаина, белок S100, парвальбумин, кальбиндин D9K, кальбиндин D28K, и кальретинин, интеины, биотин, стрептавидин, MyoD, последовательности лейциновой «молнии», и мальтозосвязывающий белок.
В отношении нуклеотидной и аминокислотной последовательнотей термин «идентичный» или «идентичность» означает степень идентичности между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот при оптимальном выравнивании и сравнении с соответствующими вставками или делениями.
Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией от числа идентичных положений, разделяемых последовательностями (то есть % идентичности = количеству идентичных положений/общее количество положений, умноженному на 100%), с учетом количества гэпов и длины каждого гэпа, которое требуется для введения для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процентной идентичности между двумя последовательностями может быть выполнено с использованием математического алгоритма, как описано ниже.
Процент идентичности между запрашиваемой последовательностью нуклеиновой кислоты и рассматриваемой последовательностью нуклеиновой кислоты представляет собой величину «идентичности», выраженную в виде процента, которую рассчитывают с помощью алгоритма BLASTN, когда рассматриваемая последовательность нуклеиновой кислоты имеет 100% запрашиваемое покрытие с запрашиваемой последовательностью нуклеиновой кислоты после выполнения попарного выравнивания BLASTN. Такие попарные выравнивания BLASTN между запрашиваемой последовательностью нуклеиновой кислоты и рассматриваеомой последовательностью нуклеиновой кислоты выполняли путем использования параметров по умолчанияю алгоритма BLASTN, доступного на веб-сайте National Center for Biotechnology Institute без фильтрации областей низкой сложности. Важно, что запрашиваемая нуклеотидная последовательность может быть описана с помощью последовательности нуклеиновой кислоты, идентифицированной в одном или более пунктах формулы изобретения в настоящем документе.
Процент идентичности между запрашиваемой аминокислотной последовательностью и рассматриваемой аминокислотной последовательностью представляет собой величину «идентичностей», выраженную в виде процента, который рассчитывают с помощью алгоритма BLASTP, когда рассматриваемая аминокислотная последовательность имеет 100% запрашиваемое покрытие с запрашиваемой аминокислотной последовательностью после выполнения попарного выравнивания BLASTP. Такие попарные выравнивания BLASTN между запрашиваемой аминокислотной последовательностью и рассматриваеомой аминокислотной последовательностью выполняли путем использования параметров по умолчанияю алгоритма BLASTN, доступного на веб-сайте National Center for Biotechnology Institute без фильтрации областей низкой сложности. Важно, что запрашиваемая нуклеотидная последовательность может быть описана с помощью последовательности нуклеиновой кислоты, идентифицированной в одном или более пунктах формулы изобретения в настоящем документе.
Способы получения рассматриваемого антитела
Рассматриваемое антитело может быть получено с помощью любого известного способа, например, стандартными методами синтеза белков; методами рекомбинантной ДНК; и др. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое антитело получали с помощью способа, выбранного из группы, состоящей из рекомбинантного получения и химического синтеза.
Когда рассматриваемое антитело представлено одноцепочечным полипептидом, его можно синтезировать при помощи стандартных методов химического синтеза пептидов. Когда полипептид синтезирован химическим способом, то синтез может происходить в жидкой фазе или твердой фазе. Твердофазный синтез полипептидов (SPPS), при котором С-концевая аминокислота данной последовательности фиксируется на нерастворимой подложке, после чего последовательно добавляются остальные аминокислоты из последовательности, является примером подходящего способа химического синтеза рассматриваемого антитела. Для синтеза рассматриваемого антитела подходят различные формы SPPS, такие как Fmoc и Вое. Методы твердофазного синтеза описаны в Barany and Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; pp. 3-284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963); Stewart et al.. Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, 111. (1984); а также Ganesan A. 2006 Mini Rev. Med Chem. 6:3-10 и Camarero JA et al. 2005 Protein Pept Lett. 12:723-8. Вкратце, небольшие нерастворимые пористые шарики обрабатываются функциональными звеньями, из которых строятся пептидные цепи. После многократных циклов присоединения/деблокирования свободный N-концевой амин прикрепленного к твердой фазе пептида конъюгируют с одним N-блокированным аминокислотным звеном. Затем это звено деблокируют, открывая новый N-концевой амин, к которому может присоединяться следующая аминокислота. Пептид остается иммобилизованным на твердой фазе и подвергается процессу фильтрации, после чего его отщепляют.
Для получения рассматриваемого антитела могут быть использованы стандартные рекомбинантные методы. Например, в экспрессионные векторы вводятся нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей, необязательно связанные с константными областями. Легкую и тяжелую цепи можно клонировать в одном и том же или в разных экспрессионных векторах. Сегменты ДНК, кодирующие цепи иммуноглобулина, функционально соединяют с контрольными последовательностями в экспрессионном векторе(ах), обеспечивающими экспрессию полипептидов иммуноглобулина. Контролирующие экспрессию последовательности включают, но без ограничения, промоторы (например, собственные или гетерологичные промоторы), сигнальные последовательности, энхансерные элементы, репрессорные элементы и последовательности терминации транскрипции. Контролирующие экспрессию последовательности могут быть представлены эукариотическими системами промоторов в векторах, способных трансформировать или трансфицировать эукариотические клетки-хозяева (например, клетки COS или СНО). После встраивания вектора в подходящего хозяина, хозяина содержат в условиях, подходящих для высокого уровня экспрессии нуклеотидных последовательностей и для извлечения и очистки антител.
Вследствие вырожденности генетического кода каждую аминокислотную последовательность иммуноглобулинов могут кодировать различные нуклеотидные последовательности. Требуемые последовательности нуклеиновых кислот могут быть получены посредством твердофазного синтеза ДНК de novo, полимеразной цепной реакции (PCR) или мутагенеза ранее полученного варианта данного полинуклеотида. Опосредованный олигонуклеотидами мутагенез является примером подходящего способа получения вариантов замен, делеций и вставок в ДНК искомого полипептида. См., Adelman et al., DNA 2:183 (1983). Вкратце, ДНК искомого полипептида подвергается изменению путем гибридизации олигонуклеоида, кодирующего требуемую мутацию, с одноцепочечной ДНК матрицы. После гибридизации с помощью ДНК-полимеразы синтезируется полная вторая комплементарная цепь матрицы, содержащая олигонуклеотидный праймер, которая и кодирует выбранное изменение в ДНК искомого полипептида.
Подходящие экспрессионные векторы обычно реплицируются в организмах хозяев в виде эписом, либо как часть, вошедшая в состав хромосомной ДНК хозяина. Обычно экспрессионные векторы содержат селекционные маркеры (например, устойчивости к ампициллину, устойчивости к гигромицину, устойчивости к тетрациклину, устойчивости к канамицину или неомицину), позволяющие обнаружить клетки, трансформированные требуемой последовательностью ДНК.
Escherichia coli является примером прокариотических клеток-хозяев, которые можно использовать для клонирования полинуклеотида, кодирующего рассматриваемое антитело. Другие подходящие для этого хозяева-микробы включают бациллы, такие как Bacillus subtilis, и другие энтеробактерии, такие как Salmonella, Serratia, и различные виды Pseudomonas. В этих прокариотических организмах можно получать экспрессионные векторы, которые должны будут содержать контролирующие экспрессию последовательности, совместимые с клеткой-хозяином (например, начало репликации). Кроме того, будет присутствовать любое число различных хорошо известных промоторов, таких как система лактозных промоторов, система триптофановых (trp) промоторов, промотора бета-лактамазы или промоторов фага лямбда. Промотры будут, как правило, контролировать экспрессию, необязательно с последовательностью оператора, и содержать последовательности сайта связывания с рибосомой и др. для инициации и завершения транскрипции и трансляции.
Для экспрессии применимы также и другие микроорганизмы, такие как дрожжи. Примерами подходящих дрожжевых клеток-хозяев являются Saccharomyces (например, S. cerevisiae) и Pichia с соответствующими векторами, содержащими контролирующие экспрессию последовательности (например, промоторы), начало репликации, последовательности терминации и др., как потребуется. Типичными промоторами являются промоторы 3-фосфоглицераткиназы и других гликолитических ферментов. Индуцибельные дрожжевые промоторы включают, среди прочего, промоторы алкогольдегидрогеназы, изоцитохрома С и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы.
Наряду с микроорганизмами, для экспрессии и продукции анти-LAG-3 антитела согласно настоящему изобретению (например, полинуклеотиды, кодирующие рассматриваемое анти-LAG-3 антитело) можно использовать и клетки млекопитающих (например, клетки млекопитающих, выращенные в культуре клеток in vitro). См. Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987). Подходящими клетками-хозяевами млекопитающих являются линии клеток СНО, различные линии клеток Cos, клетки HeLa, линии клеток миеломы и трансформированные В-клетки или гибридомы. Экспрессионные векторы для этих клеток могут включать контролирующие экспрессию последовательности, такие как начало репликации, промотор и энхансер (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), и необходимые для процессинга сайты, такие как сайты связывания с рибосомой, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования и последовательности терминаторов транскрипции. Примерами подходящих контролирующих экспрессию последовательностей являются промоторы, происходящие из генов иммуноглобулинов, SV40, аденовирусов, бычьего вируса папилломы, цитомегаловируса и др. См. Со et al., J. Immunol. 148:1149 (1992). В других способах антитела согласно изобретению могут быть получены у мышей (см., например, Laffleur et al. "Production of human or humanized antibodies in mice", Methods Mol Biol. 2012;901:149-59).
После синтеза (химического или рекомбинантного) целые антитела, их димеры, индивидуальные легкие и тяжелые цепи или другие формы рассматриваемого антитела (например, scFv и др.) могут быть очищены согласно стандартным процедурам, включая осаждение сульфатом аммония, аффинные колонки, колоночную хроматографию, методы высокоэффективной жидкостной хроматографии, гель-электрофореза и др. (см., как правило, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)). Рассматриваемое антитело может быть по существу очищенным, например, по меньшей мере примерно на 80-85%, по меньшей мере примерно 85-90%, по меньшей мере примерно на 90-95% или на 98-99%, или больше, например, свободным от таких загрязнений, как клеточный дебрис, макромолекулы, отличные от рассматриваемого антитела и т.д. Молекулы нуклеиновой кислоты, экспрессионные векторы и клетки-хозяева
Настоящее изобретение также обеспечивает молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие анти-LAG-3 антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент.
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 17.
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 18.
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 последовательностей SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 последовательностей SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 последовательностей SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 последовательностей SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 последовательностей SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 последовательностей SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 последовательностей SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует рассматриваемое анти-LAG-3 антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи.
Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая рассматриваемое антитело, может быть функционально связана с одним или более регуляторными элементами, такими как промотор и энхансер, которые дают возможность экспрессии нуклеотидной последовательности в предполагаемых клетках-мишенях (например, клетке, которая является генетически модифицированной для синтеза кодируемого антитела).
Подходящие промоторные и энхансерные элементы известны в данной области. Подходящие промоторы для применения в прокариотических клетках-хозяевах включают, но без ограничения, промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; промотор Т3; промотор Т5; промотор лямбда Р; промотор trp; промотор lac-оперона; гибридный промотор, например, гибридный промотор lac/tac, гибридный промотор tac/trc, промотор trp/lac, промотор Т7/lac; промотор trc; промотор tac и т.п.; промотор gpt; промотор araBAD; т vivo регулируемые промоторы, такие как промотор ssaG или родственный промотор (см., например, публикацию патент США 20040131637), промотор pagC (Pulkkinen and Miller, J. Bacterial., 1991: 173(1): 86-93; Alpuche-Aranda et al., PNAS, 1992; 89(21): 10079-83), промотор nirB (Harbome et al. (1992) Mol. Micro. 6:2805-2813) и т.п.{см., например, Dunstan et al. (1999) Infect. Immun. 67:5133-5141; McKelvie et al. (2004) Vaccine 22:3243-3255; и Chatfield et al. (1992) Biotechnol. 10:888-892); промотор сигма 70, например, консенсусный промотор сигма 70 (см., например, GenBank, номера доступа АХ798980, АХ798961 и АХ798183); промотор стационарной фазы, например, промотор dps, промотор spv и т.п.; промотор, происходящий из острова патогенности SPI-2 (см., например, W096/17951); промотор actA (см., например, Shetron-Rama et al. (2002) Infect. Immun. 70:1087-1096); промотор rpsM (см., например, Valdivia и Falkow (1996). Mol. Microbiol. 22:367); промотор tet (см., например, Hillen, W. и Wissmann, A. (1989) In Saenger, W. and Heinemann, U. (eds). Topics in Molecular and Structural Biology, Protein-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, pp. 143-162); промотор SP6 (см., например, Melton et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12:7035); и т.п. Подходящие сильные промоторы для использования в прокариотах, таких как Escherichia coli, включают, но без ограничения, Trc, Tac, Т5, Т7 и Pbambda. Неограничивающие примеры операторов для использования в бактериальных клетках-хозяевах включают оператор промотор лактозы (LacI репрессорный белок изменяет конформацию при контакте с лактозой, тем самым предотвращая связывание репрессорного белка Lad с оператором), оператор промотор триптофана (при образовании комплекса с триптофаном репрессорный белок TrpR имеет конформацию, которая связывается с оператором; в отсутствие триптофана репрессорный белок TrpR имеет конформацию, которая не связывается с оператором) и оператор промотор tac (см., например, deBoer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25).
В некоторых вариантах осуществления, например, для экспрессии в клетках дрожжей, подходящий промотор представляет собой конститутивный промотор, такой как промотор ADH1, промотор PGK1, промотор ENO, промотор PYK1 и т.п.; или регулируемый промотор, такой как промотор GAL1, промотор GAL10, промотор ADH2, промотор РН05, промотор CUP1, промотор GAL7, промотор МЕТ25, промотор МЕТ3, промотор CYC1, промотор HIS3, промотор ADH1, промотор PGK, промотор GAPDH, промотор ADC1, промотор TRP1, промотор URA3, промотор LEU2, промотор ENO, промотор ТР1 и АОХ1 (например, для использования в Pichia).
Для экспрессии в эукариотической клетке подходящие промоторы включают, но без ограничения, промотор легкой и/или тяжелой цепей гена иммуноглобулина и энхансерные элементы; промотор гена немедленного раннего ответа цитомегаловируса; тимидин киназа вируса простого герпеса; ранний и поздний промоторы SV40; промотор, присутствующий в длинных концевых повторах ретровируса; промотор мышиного металлотионеина-1; и различные известные в данной области тканеспецифические промоторы.
Отбор подходящего вектора и промотора находится в компетенции специалиста в данной области.
Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая рассматриваемое антитело, может присутствовать в экспрессионном векторе и/или клонирующем векторе. В настоящем изобретении предлагается рекомбинантный вектор, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую рассматриваемое антитело в векторе клонирования. В настоящем изобретении также предлагается рекомбинантная молекула, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую рассматриваемое антитело, функционально связанное с соответствующей регуляторной последовательностью(ями) в экспрессионном векторе для обеспечения экспрессии кодируемого антитела. Когда рассматриваемое антитело содержит два отдельных полипептида, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие два полипептида, могут быть клонированы в один и тот же или отдельные векторы с образованием одной или более рекомбинантных молекул. Рекомбинантная молекула может включать селектируемый маркер, начало репликации и другие отличительные признаки, которые обеспечивают репликацию и/или сохранение рекомбинантной молекулы.
Большое количество подходящих векторов и промоторов известно специалистам в данной области; многие являются коммерчески доступными для создания рассматриваемой рекомбинантной молекулы. Следующие векторы представлены в качестве примера. Бактериальные: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, Calif., USA); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 и pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Sweden). Эукариотические: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG и pSVL (Pharmacia).
Экспрессионные векторы, как правило, имеют сайты рестрикции, расположенные возле последовательности промотора для обеспечения вставки нуклеотидных последовательностей, кодирующих гетерологичные белки. Может присутствовать селектируемый маркер, функциональный в хозяине экспрессии. Подходящие векторы экспрессии включают, но без ограничения, вирусные векторы. Примеры вирусных векторов включают, но без ограничения, вирусные векторы на основе: вируса осповакцины; полиовируса; аденовируса (см., например, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 и WO 95/00655); аденоассоциированного вируса (см., например, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava in WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; и Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; вируса простого герпеса; ретровирусного вектора (например, вирус лейкемии мышей, вирус некроза селезенки и векторы, полученные из ретровирусов, таких как вирус саркомы Рауса, вирус саркомы мышей Харви, вирус лейкоза птиц, вирус иммунодефицита человека (см., например, Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999), миелопролиферативный вирус саркомы мышей и вирус опухоли молочной железы); и т.п.
Как отмечалось выше, рассматриваемая молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую анти-LAG-3 антитело согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемая молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую CDR-участки тяжелой и легкой цепей рассматриваемого антитела 13Е2 или 34F4. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемая молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую CDR-участки тяжелой и легкой цепей рассматриваемого антитела, где CDR-кодирующие последовательности перемежаются с FR-кодирующими нуклеотидными последовательностями. В некоторых вариантах осуществления FR-кодирующие нуклеотидные последовательности представляют собой человеческие FR-кодирующие нуклеотидные последовательности. Клетки-хозяева
В настоящем изобретении предлагаются выделенные генетически модифицированные клетки-хозяева (например, клетки in vitro), которые являются генетически модифицированными рассматриваемой молекулой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемая выделенная генетически модифицированная клетка-хозяин может продуцировать рассматриваемое антитело. Такая клетка называется рекомбинантной клеткой. Рекомбинантная клетка содержит рекомбинантную молекулу, кодирующую рассматриваемое антитело.
Подходящие клетки-хозяева включают эукариотические клетки-хозяева, такие как клетку млекопитающего, клетку насекомого-хозяина, клетку дрожжей; и прокариотические клетки, такие как бактериальная клетка. Введение рассматриваемой нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина может быть достигнуто, например, путем осаждения фосфатом кальция, опосредованной декстраном DEAE трансфекции, опосредованной липосомой трансфекции, электропорации или другого известного способа.
Подходящие клетки млекопитающего включают первичные клетки и иммортализованные клеточные линии. Подходящие клеточные линии млекопитающего включают человеческие клеточные линии, нечеловеческие клеточные линии приматов, клеточные линии грызунов (например, мыши, крысы) и т.п. Подходящие клеточные линии млекопитающих включают, но без ограничения, клетки HeLa (например. Американская коллекция типовых культур (American Type Culture Collection, ATCC) No. CCL-2), клетки CHO (например, ATCC No. CRL9618, CCL61, CRL9096), клетки 293 (например, ATCC No. CRL-1573), клетки Vero, клетки NIH 3Т3 (например, ATCC No. CRL-1658), клетки Huh-7, клетки ВПК (например, ATCC No. CCL10), клетки РС12 (ATCC No. CRL1721), клетки COS, клетки COS-7 (ATCC No. CRL1651), клетки RAT1, мышиные клетки L (ATCC No. CCL1.3), человеческие эмбриональные клетки почек (ПЕК) (ATCC No. CRL1573), клетки HLHepG2, и т.п. В некоторых случаях клетки представляют собой клетки HEK. В некоторых случаях клетки представляют собой клетки CHO, например, клетки СНО-K1 (ATCC No. CCL-61), клетки СНО-М, клетки CHO-DG44 (АТСС No. PTA-3356) и т.п. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку COS. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку 293. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку СНО.
Подходящие клетки дрожжей включают, но без ограничения, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Neurospora crassa, Chlamydomonas reinhardtii, и т.п. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой Saccharomyces. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой Pichia.
Подходящие прокариотические клетки включают, но без ограничения, любые из разнообразных лабораторных штаммов Escherichia coli. Bacillus (например, В. subtilis), Lactobacillus sp., и т.п. См., например. Carrier et al. (1992) J. Immunol. 148:1176-1181; патент США 6447784; и Sizemore et al. (1995) Science 270:299-302. Обычно лабораторный штамм представляет собой штамм, который является непатогенным. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой Escherichia coli. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой Bacillus subtilis. Композиции
В настоящем описании представлены композиции, содержащие рассматриваемое антитело. Композиция рассматриваемого антитела, наряду с рассматриваемым антителом, может содержать одно или более из следующего: соль, например, NaCl, MgCl2, KCl, MgSO4 и т.д.; буферный агент, например, фосфатный буфер, цитратный буфер, трис-буфер, N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-(2-этансульфоновую кислоту) (HEPES), 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту (MES), натриевую соль 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES), 3-(N-морфолино)пропансульфоновую кислоту (MOPS), N-трис[гидроксиметил]метил-3-аминопропансульфоновую кислоту (TAPS) и т.п.; солюбилизирующий агент; детергент, например, неионный детергент, такой как Твин-20, и т.п.; ингибитор протеазы; глицерин; и т.п.
Фармацевтические композиции
В настоящем описании представлены композиции, включая фармацевтические композиции, содержащие рассматриваемое антитело. В целом, фармацевтическая композиция также называется в настоящем документе как лекарственная форма, содержащая эффективное количество рассматриваемого антитела. «Эффективное количество» означает дозу, достаточную для получения желательного результата, например, сокращения неблагоприятного симптома, связанного с иммунным нарушением, ослабление симптома иммунного нарушения, замедление прогрессирования иммунного нарушения и т.п. В целом, желательным результатом является по меньшей мере ослабление симптома иммунного нарушения по сравнению с контролем.
Лекарственные формы
В рассматриваемых способах данное антитело можно вводить в организм любым стандартным способом, способным вызывать желательный терапевтический эффект или диагностический эффект. Так, оно может входить в целый ряд лекарственных форм для терапевтического введения. В частности, рассматриваемое антитело может быть составлено в фармацевтические композиции путем комбинирования с подходящими, фармацевтически приемлемыми носителями, фармацевтически приемлемыми разбавителями или другими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, и может входить в препараты в твердых, полутвердых, жидких или газообразных формах, таких как таблетки, капсулы, порошки, гранулы, мази, растворы, суппозитории, инъекции, ингаляторы и аэрозоли. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит рассматриваемое антитело и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
В фармацевтических лекарственных формах рассматриваемое антитело можно вводить в виде их фармацевтически приемлемых солей, которые могут применяться сами по себе или в подходящей ассоциации, а также в комбинации с другими фармацевтически активными соединениями. Следующие способы и вспомогательные вещества приводятся только для примера и никоим образом не для ограничения.
Для пероральных препаратов рассматриваемое антитело можно применять отдельно или в комбинации с соответствующими добавками для изготовления таблеток, порошков, гранул или капсул, например, с обычными добавками, такими как лактоза, маннит, кукурузный крахмал или картофельный крахмал; со связующими веществами, такими как кристаллическая целлюлоза, производные целлюлозы, аравийская камедь, кукурузный крахмал или желатины; с дезинтегрирующими веществами, такими как кукурузный кразмал, картофельный крахмал или натрий карбоксиметилцеллюлоза; со смазывающими веществами, такими как тальк или стеарат магния; и по желанию с разбавителями, буферными веществами, увлажняющими веществами, консервантами и вкусовыми агентами.
Рассматриваемое антитело может быть составлено в препараты для инъекций путем растворения, суспендирования или эмульгирования антитела в водном или неводном растворителе, таком как растительное или другие подобные масла, пропиленгликоль, синтетические глицериды алифатических кислот, инъецируемые органические сложные эфиры (например, этилолеат), сложные эфиры высших алифатических кислот или пропиленгликоль; и по желанию, с обычными добавками, таким как солюбилизаторы, изотонические агенты, суспендирующие вещества, эмульгаторы, стабилизаторы и консерванты. Парентеральные носители включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, раствор рингера с лактатом или фиксированные масла. Внутривенные носители включают добавки для восполнения жидкости и питательных веществ, добавки для восполнения электролита (такие как добавки на основе декстрозы Рингера) и т.п. Кроме того, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может содержать дополнительные агенты, такие как допамин или психофармакологические лекарственные средства в зависимости от предполагаемого применения фармацевтической композиции.
Фармацевтические композиции, содержащие рассматриваемое антитело, получали смешиванием рассматриваемого антитела требуемой степени чистоты с необязательными физиологически приемлемыми носителями, другими вспомогательными веществами, стабилизаторами, поверхностно-активными веществами, буферами и/или изотоническими веществами. Приемлемые носители, другие вспомогательные вещества и/или стабилизаторы не должны быть токсичными для реципиента в используемых дозах и концентрациях, и включают буферы типа фосфатного, цитратного и других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту, глутатион, цистеин, метионин и лимонную кислоту; консерванты (такие как этанол, бензиловый спирт, фенол, м-крезол, п-хлор-м-крезол, метил- или пропилпарабены, бензалконий хлорид или их комбинации); аминокислоты, такие как аргинин, глицин, орнитин, лизин, гистидин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, изолейцин, лейцин, аланин, фенилаланин, тирозин, триптофан, метионин, серин, пролин и их комбинации; моносахариды, дисахариды и дргуие угелеводы; низкомолекулярные (менее чем около 10 остатков) полипептиды; белки, такие как желатин или сывороточный альбумин; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как трегалоза, сахароза, лактоза, глюкоза, манноза, мальтоза. галактоза, фруктоза, сорбоза, раффиноза, глюкозамин, N-метилглюкозамин, галактозамин и нейраминовая кислота; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как Tween, Brij Pluronics, Triton-X или полиэтиленгликоль (PEG).
Фармацевтическая композиция может находиться в жидкой форме, лиофилизованной форме или жидкой форме, восстановленной из лиофилизированной формы, при этом лиофилизированный препарат должен быть восстановлен стерильным раствором перед введением. Стандартная методика восстановаления лиофилизированной композиции состоит в добавлении туда объема чистой воды (обычно эквивалентного объему, удаленному при лиофилизации); однако при получении фармацевтических композиций для парентерального введения можно использовать растворы, содержащие антибактериальные средства; см. также Chen (1992) Drug Dev Ind Pharm 18, 1311-54.
Типичные концентрации антитела в рассматриваемой фармацевтической композиции могут составлять примерно от 1 мг/мл до 200 мг/мл или примерно от 50 мг/мл до 200 мг/мл, или примерно от 150 мг/мл до 200 мг/мл.
Водные составы антител можно готовить в забуференном растворе, например, до рН в диапазоне примерно от 4,0 до 7,0 или примерно от 5,0 до 6,0, или же при около 5,5. Примеры буферов, подходящих для рН в этом диапазоне, включают фосфатный, гистидиновый, нитратный, сукцинатный, ацетатный буфер и буферы из других органических кислот. Концентрация буфера может составлять примерно от 1 мМ до 100 мМ или примерно от 5 мМ до 50 мМ в зависимости, например, от буфера и желаемой тоничности состава.
В лекарственную форму антитела может входить вещество для модулирования тоничности состава. Типичными веществами для поддержания тоничности являются хлорид натрия, хлорид калия, глицерин и любые другие компоненты из группы аминокислот, Сахаров, а также их комбинации. В некоторых вариантах осуществления водные формы являются изотоничными, хотя могут быть подходящими и гипертоничные или гипотоничные растворы. Термин «изотоничный» обозначает раствор, имеющий такую же тоничность, как и другой раствор, с которым он сравнивается, такой как физиологический солевой раствор или сыворотка. Вещества для поддержания тоничности могут применяться в количестве примерно от 5 мМ до 350 мМ, например, в количестве от 100 мМ до 350 нМ.
В состав лекарственной формы антитела может также входить поверхностно-активное вещество для уменьшения агрегации заключенных в нем антител и/или минимизации образования твердых частиц и/или уменьшения адсорбции. Типичными поверхностно-активными веществами являются полиоксиэтиленсорбитановые эфиры жирных кислот (Tween), алкильные эфиры полиоксиэтилена (Brij), алкилфениловые эфиры полиоксиэтилена (Triton-X), сополимер полиоксиэтилена и полиоксипропилена (полоксамер, плюроник), и додецилсульфат натрия (SDS). Примерами подходящих полиоксиэтиленсорбитановых эфиров жирных кислот являются полисорбат 20 (продается под торговой маркой Tween 20™) и полисорбат 80 (продается под торговой маркой Tween 80™). Примерами подходящих сополимеров полиэтилена и полипропилена являются те, которые продаются под наименованием Pluronic® F68 или Poloxamer 188™. Примерами подходящих алкильных эфиров полиоксиэтилена являются те, которые продаются под торговой маркой Brij™. Типичные концентрации поверхностно-активных веществ могут варьировать в диапазоне примерно от 0,001% до 1% масса/объем.
Для защиты лабильного активного ингредиента (например, белка) от дестабилизирующих условий в процессе лиофилизации также можно добавлять лиопротекторы. Например, известными лиопротекторами являются сахара (в том числе глюкоза и сахароза); полиолы (в том числе маннит, сорбит и глицерин); и аминокислоты (в том числе аланин, глицин и глутаминовая кислота). Лиопротекторы можно включать в количестве примерно от 10 мМ до 500 нМ.
В некоторых вариантах осуществления рассматриваемая лекарственная форма включает рассматриваемое антитело и одно или более из указанных выше веществ (например, поверхностно-активное вещества, буфер, стабилизатор, вещество для поддержания тоничности) и в основном не содержит один или более консервантов, таких как этанол, бензиловый спирт, фенол, м-крезол, п-хлор-м-крезол, метил- или пропилпарабены, бензалконий хлорид и их комбинации. В других вариантах осуществления консервант входит в состав, например, в концентрации примерно от 0,001% до 2% (масса/объем).
Например, рассматриваемая лекарственная форма может представлять собой жидкую или лиофилизированную форму, пригодную для парентерального введения, и может содержать: примерно от 1 мг/мл до 200 мг/мл рассматриваемого антитела; примерно от 0,001% до 1% по меньшей мере одного поверхностно активного вещества; примерно от 1 мМ до 100 мМ буфера; необязательно примерно от 10 мМ до 500 мМ стабилизатора; и примерно от 5 мМ до 305 мМ поддерживающего тоничность вещества; и имеет рН примерно от 4,0 до 7,0.
В качестве другого примера рассматриваемая парентеральная лекарственная форма представляет собой жидкую или лиофилизированную форму, содержащую: примерно от 1 мг/мл до 200 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,04% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L-гистидина; и 250 мМ сахарозы; и имеет рН 5,5.
В качестве другого примера рассматриваемая парентеральная лекарственная форма представляет собой лиофилизированную форму, содержащую: 1) 15 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,04% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L-гистидина; и 250 мМ сахарозы; и имеет рН 5,5; или 2) 75 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,04% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L-гистидина; и 250 мМ сахарозы; и имеет рН 5.5; или 3) 75 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,02% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L-гистидина; и 250 мМ сахарозы; и имеет рН 5,5; или 4) 75 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,04% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L-гистидина; и 250 мМ трегалозы; и имеет рН 5,5; или 5) 75 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,02% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L-гистидина; и 250 мМ трегалозы; и имеет рН 5.5.
В качестве другого примера рассматриваемая парентеральная лекарственная форма представляет собой жидкую форму, содержащую: 1) 7,5 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,02% Tween 20 масса/объем; 120 мМ L-гистидина; и 250 125 мМ сахарозы; и имеет рН 5,5; или 2) 37,5 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,02% Tween 20 масса/объем; 10 мМ L-гистидина; и 125 мМ сахарозы; и имеет рН 5,5; или 3) 37,5 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,01% Tween 20 масса/объем; 10 мМ L-гистидина; и 125 мМ сахарозы; и имеет рН 5,5; или 4) 37,5 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,02% Tween 20 масса/объем; 10 мМ L-гистидина; 125 мМ трегалозы; и имеет рН 5,5; или 5) 37,5 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,01% Tween 20 масса/объем; 10 мМ L-гистидина; и 125 мМ трегалозы; и имеет рН 5,5; или 6) 5 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,02% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L-гистидина; и 250 мМ трегалозы; и имеет рН 5,5; или 7) 75 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,02% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L-гистидина; и 250 мМ маннита; и имеет рН 5,5; или 8) 75 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,02% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L гистидина; и 140 мМ хлорида натрия; и имеет рН 5.5; или 9) 150 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,02% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L-гистидина; и 250 мМ трегалозы; и имеет рН 5,5; или 10) 150 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,02% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L-гистидина; и 250 мМ маннита; и имеет рН 5,5; или 11) 150 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,02% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L-гистидина; и 140 мМ хлорида натрия; и имеет рН 5,5; или 12) 10 мг/мл рассматриваемого антитела; 0,01% Tween 20 масса/объем; 20 мМ L-гистидина; и 40 мМ хлорида натрия; и имеет рН 5,5.
Рассматриваемое антитело можно применять в составе аэрозоля для введения путем ингаляции. Рассматриваемое антитело может входить в состав находящихся под давлением приемлемых вытеснителей, такие как дихлордифторметан, пропан, азот и т.п. Аэрозольные лекарственные формы, такие как лекарственные формы в виде назального спрея, включают очищенные водные или другие растворы активного агента с консервантами и изотоническими агентами. Такие составы скорректированы по рН и изотоническому состоянию, совместимому со слизистыми оболочками полости носа.
Кроме того, рассматриваемое антитело может входить в состав суппозиториев путем смешивания с различными основами, такими как эмульгирующие основы или водорастворимые основы. Рассматриваемое антитело можно вводить ректально посредством суппозитория. Суппозиторий может включать носители, такие как масло какао, карбовакс и полиэтиленгликоли, которые плавятся при температуре тела, но затвердевают при комнатной температуре.
Могут предусматриваться стандартные лекарственные формы для перорального или ректального введения, такие как сиропы, эликсиры и суспензии, при этом каждая единица дозирования, например, чайная ложка, столовая ложка, таблетка или суппозиторий, содержит заданное количество композиции. Аналогично, стандартные лекарственные формы для инъекции или внутривенного введения могут содержать рассматриваемое антитело в композиции в виде раствора в стерильной воде, нормальном солевом растворе или другом фармацевтически приемлемом носителе.
Термин «стандартная лекарственная форма», используемый в настоящем документе, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве однократных доз для человека и животных, при этом каждая единица содержит заданное количество анти-LAG-3 антитела согласно настоящему изобретению, рассчитанное в количестве, достаточном для получения желаемого эффекта вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем или наполнителем. Спецификации для рассматриваемого антитела могут зависеть от конкретного используемого антитела и того эффекта, который нужно получить, а также фармакодинамики по каждому антителу в организме.
Другие способы введения также находят применение в рассматриваемом способе.
Например, рассматриваемое антитело может быть заключено в суппозитории, а в некоторых случаях в аэрозоли и интраназальные композиции. Для суппозиториев в состав наполнителя должны входить традиционные связывающие вещества и носители, такие как полиалкиленгликоли или триглицериды. Такие суппозитории могут быть получены из смесей, содержащих активный ингредиент в диапазоне примерно от 0,5% до 10% (масса/масса), например, примерно от 1% до 2%.
Интраназальные составы обычно включают наполнители, которые не вызывают раздражения слизистой оболочки носа или значительно не нарушают цилиарную функцию. Могут быть использованы разбавители, такие как вода, водный солевой раствор или другие известные субстанции. Назальные формы могут также содержать консерванты, такие как, но без ограничения, хлорбутанол и бензалконий хлорид. Может присутствовать и поверхностно-активное вещество для усиления всасывания рассматриваемого антитела слизистой оболочкой носа.
Рассматриваемое антитело можно вводить в виде инъекционного состава. Обычно композиции для инъекций готовят в виде жидких растворов или суспензий; также, могут быть изготовлены твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидких наполнителях перед инъекцией. Также препарат может быть эмульгирован или антитело может быть инкапсулировано в липосомных носителях.
Подходящие вспомогательные наполнители представляют собой, например, воду, солевой раствор, декстрозу, глицерин, этанол или т.п. и их комбинации. Кроме того, наполнитель может содержать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие вещества, или рН-буферные вещества. Конкретные способы изготовления таких лекарственных форм известны или будут очевидны специалистам в данной области. См., например. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 17th edition, 1985. Вводимая композиция или состав, в любом случае, будет содержать количество рассматриваемого антитела, достаточное для достижения желаемого состояния у подлежащего лечению субъекта.
Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, такие как наполнители, адъюванты, носители или разбавители, являются легкодоступными. Более того, легкодоступными являются и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, такие как агенты, регулирующие уровень рН и буферные агенты, регулирующие тоничность агенты, стабилизаторы, смачивающие вещества и т.п.
В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое антитело составлено в виде состава с контролируемым высвобождением. Препараты с замедленным высвобождением могут быть изготовлены с использованием способов, хорошо известных в данной области. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, при этом матрицы находятся в форме изделий определенной формы, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают сложные полиэфиры, сополимеры L-глутаминовой кислоты и этил-L-глутамина, неразлагаемый этилен-винилацетат, гидрогели, полилактиды, разлагаемые сополимеры молочной и гликолевой кислоты и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота. Возможную утрату биологической активности и возможные изменения в иммуногенности антител, содержащихся в препаратах с замедленным высвобождением, можно предотвратить путем использования подходящих добавок, путем контроля содержания влаги и путем разработки специфических композиций полимерных матриц.
Контролируемое высвобождение в пределах объема настоящего изобретения может означать любые из целого ряда лекарственных форм с замедленным высвобождением. Следующие термины можно рассматривать как практически эквивалентные контролируемому высвобождению для целей настоящего изобретения: непрерывное высвобождение, контролируемое высвобождение, отсроченное высвобождение, депо, пролонгированное высвобождение, ступенчатове высвобождение, немедленное высвобождение, длительное высвобождение, программируемое высвобождение, пролонгированное высвобождение, равномерное высвобождение, длительное высвобождение, депонирующийся, ретард, медленное высвобождение, высвобождение с интервалами, пролонгированное высвобождение, покрытие во времени, высвобождение во времени, задержанное действие, расширенное действие, послойное действие, длительное действие, пролонгированное действие, повторное действие, замедленное действие, задержанное действие и лекарственные средства с замедленным действием. Дополнительные описания этих терминов содержатся в Lesczek Krowczynski, Extended-Release Dosage Forms, 1987 (CRC Press, Inc.).
Различные технологии контролируемого высвобождения охватывают очень широкий круг лекарственных дозированных форм. Технологии контролируемого высвобождения включают, но без ограничения, физические системы и химические системы.
Физические системы включают, но без ограничения, резервуарные системы с контролирующими скорость мембранами, такие как микроинкапсулирование, макроинкапсулирование и мембранные системы; резервуарные системы без контролирующих скорость мембран, такие как полые волокна, ультрапористый триацетат целлюлозы и пористые полимерные субстраты и пены; монолитные системы, включая системы, физически растворенные в непористых, полимерных или эластомерных матрицах (например, неэродируемых, эродируемых, пропускающих окружающие вещества и разлагаемых), и материалы, физически диспергированные в непористых, полимерных или эластомерных матрицах (например, неэродируемых, эродируемых, пропускающих окружающие вещества и разлагаемых); ламинированные структуры, включая резервуарные слои, химически сходные или несходные с внешними контрольными слоями; и другие физические методы, такие как осмотические насосы или адсорбция на ионообменные смолы.
Химические системы включают, но без ограничения, химическую эрозию полимерных матриц (например, гетерогенную или гомогенную эрозию) или биологическую эрозию полимерной матрицы (например, гетерогенную или гомогенную). Дополнительное обсуждение различных систем для контролируемого высвобождения можно найти в Agis F. Kydonieus, Controlled Release Technologies: Methods, Theory and Applications, 1980 (CRC Press, Inc.).
Существует ряд лекарственных форм с контролируемым высвобождением, разработанных для перорального введения. Они включают, но без ограничения, контролируемые осмотическим давлением системы желудочно-кишечной доставки; контролируемые гидродинамическим давлением системы желудочно-кишечной доставки; контролируемые проницаемостью мембранные системы желудочно-кишечные доставки, которые включают контролируемые проницаемостью микропористые мембранные устройства желудочно-кишечной доставки; устойчивые к желудочному соку, нацеленные на кишечник устройства желудочно-кишечной доставки с контролируемым высвобождением; контролируемые диффузией в геле системы желудочно-кишечной доставки; и контролируемые ионным обменом системы желудочно-кишечной доставки, которые включают катионные и анионные препараты. Дополнительная информация по системам доставки лекарственных средств с контролируемым высвобождением приведена в Yie W. Chien, Novel Drug Delivery Systems, 1992 (Marcel Dekker, Inc.).
Дозировка
Подходящую дозировку может определить лечащий врач или другой квалифицированный персонал, исходя из различных клинических факторов. Как хорошо известно в области медицины, дозировка для любого пациента зависят от многих факторов, включая размеры пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное вводимое соединение, пол пациента, время и способ введения, общее состояние здоровья и другие лекарственные средства, вводимые одновременно. Рассматриваемое антитело можно вводить в количестве от 1 нг/кг массы тела до 20 мг/кг массы тела на дозу, например, от 0,001 до 10, от 0,01 до 10, от 0,1 до 10, от 1 до 10, от 0,001 до 1, от 0,01 до 1, от 0,1 до 1, от 0,05 до 5, от 0,05 до 0,5 или от 0,5 до 5 мг/кг массы тела. Однако предусмотрены и дозы ниже или выше этого типичного диапазона, особенно с учетом вышеупомянутых факторов. Если схема предусматривает непрерывную инфузию, то доза может находиться в диапазоне от 1 мкг до 10 мг/кг массы тела в минуту.
В некоторых вариантах осуществления доза рассматриваемого анти-LAG-3 антитла находится в диапазоне от 0,001 мкг до 100 мг, например, от 0,001 мкг до 10 мг, от 0,001 мкг до 1 мг, от 0,001 мкг до 0,1 мг, от 0,01 мкг до 10 мг, от 0,1 мкг до 10 мг, от 0,1 мкг до 1 мг или от 0,1 мкг до 0,1 мг, или от 0,01 мг до 100 мг, от 0,01 мг до 10 мг, от 0,01 мг до 1 мг, от 0,01 мг до 0,1 мг, от 0,1 мг до 100 мг, от 0,1 мг до 10 мг, от 0,1 мг до 1 мг.
В некоторых вариантах осуществления доза может изменяться, например, от около 0,0001 до 100 мг/кг, или от около 0,01 до 5 мг/кг (например, от 0,02 до 5 мг/кг, от 0,25 до 5 мг/кг, от 0,5 до 5 мг/кг, от 0,75 до 5 мг/кг, от 1 до 5 мг/кг, от 2 до 5 мг/кг, и т.д.) массы тела. Например, дозы могут составлять 0,1, 1 или 10 мг/кг массы тела или находиться в пределах диапазона 0,01-10 мг/кг, или составлять по меньшей мере 0,1 мг/кг.
В конкретных вариантах осуществления доза анти-LAG-3 антитела согласно изобретению или его фрагмента составляет до 0,5 мг/кг массы тела, например, находится в диапазоне от 0,0001 до 0,5 мг/кг, от 0,001 до 0,5 мг/кг, от 0,01 до 0,5 мг/кг, от 0,1 до 0,5 мг/кг, от 0,0001 до 0,1 мг/кг, от 0,001 до 0,1 мг/кг, от 0,01 до 0,1 мг/кг массы тела.
В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое анти-LAG-3 антитело вводят в количестве, которое обеспечивает максимальную концентрацию в сыворотке примерно от 0,001 мкг/мл до 1 мг/мл, например, от 0,0001 мкг/мл до 1 мкг/мл, от 0,001 мкг/мл до 1 мкг/мл, от 0,001 мкг/мл до 0,1 мкг/мл, от 0,01 до 1, или от 0,01 до 0,1 мкг/мл, или примерно от 0,005 мкг/мл до 1 мкг/мл, или примерно от 0,1 мкг/мл до 1 мкг/мл, или примерно от 1 мкг/мл до 2,5 мкг/мл, примерно от 2,5 мкг/мл до 5 мкг/мл, примерно от 5 мкг/мл до 7,5 мкг/мл, примерно от 7,5 мкг/мл до 10 мкг/мл, примерно от 10 мкг/мл до 25 мкг/мл, примерно от 25 мкг/мл до 50 мкг/мл, примерно от 50 мкг/мл до 100 мкг/мл, примерно от 100 мкг/мл до 250 мкг/мл, примерно от 250 мкг/мл до 500 мкг/мл, примерно от 500 мкг/мл до 750 мкг/мл, или примерно от 750 мкг/мл до 1000 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое, анти-LAG-3 антитело вводят в количестве, которое обеспечивает максимальную концентрацию в сыворотке, составляющую более 1 мг/мл, например, примерно от 1 мг/мл до 2 мг/мл, примерно от 2 мг/мл до 5 мг/мл, или примерно от 5 мг/мл до 10 мг/мл. В других вариантах осуществления анти-LAG-3 антитело согласно изобретению или его фрагмент вводят в количестве, которое обеспечивает максимальную концентрацию в сыворотке вплоть до 1 мкг/мл, например, в диапазоне от 0,0001 мкг/мл до 1 мкг/мл, от 0,001 мкг/мл до 1 мкг/мл, от 0,01 мкг/мл до 1 мкг/мл, от 0,1 до 1 мкг/мл, от 0,0001 мкг/мл до 0,1 мкг/мл, от 0,001 мкг/мл до 0,1 мкг/мл, или от 0,01 мкг/мл до 0,1 мкг/мл. Подходящим образом такое введение осуществляют путем подкожной инъекции.
Индивидуумам можно вводить такие дозы ежедневно, через день, один раз в неделю или согласно любой другой схеме, определенной путем эмпирического анализа. Иллюстративное лечение предусматривает введение множества доз в течение длительного периода, например, по меньшей мере шести месяцев. Дополнительные иллюстративные режимы лечения предусматривают введение один раз каждые две недели или один раз в месяц или один раз каждые 3-6 месяцев.
Иллюстративные режимы дозирования включают от 0,01 до 1 мг/кг, от 0,01 до 0,1 мг/кг, от 0,1 до 1 мг/кг, от 1 до 10 мг/кг или 15 мг/кг в последующие дни, от 0,02 до 20 мг/кг, например, 0,2 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг или 20 мг/кг через день, или от 0,1 до 100 мг/кг, например, 1 мг/кг, 10 мг/кг, 20 мг/кг, 30 мг/кг, 40 мг/кг, 50 мг/кг или 60 мг/кг один раз в неделю. В некоторых способах два или более моноклональных антител с различными специфичностями связывания вводят одновременно, и в этом случае доза каждого вводимого антитела находится в пределах указанных диапазонов. Прогресс можно наблюдать путем периодической оценки.
Число CD4+ и/или CD8+ Т-клеток, экспрессирующих LAG-3, у субъекта является относительно низким. Предполагается, что однократное введение антитела согласно изобретению (в частности, антитела согласно изобретению, которое имеет время полужизни в сыворотке, составляющее по меньшей мере две недели, и которое лишено значительной активности CDC и ADCC, такое как изотип IgG человека (которое лишено активности CDC и ADCC), или антитела, которое содержит одну или более мутаций для уменьшения или устранения активности CDC и ADCC) может быть эффективным в отношении ингибирования антиген-индуцированной CD4+ и/или CD8+ Т-клеточной пролиферации в течение по меньшей мере нескольких недель. Ввиду этого, подходящий режим лечения может включать введение антитела согласно изобретению (например, от 0,01 до 1 мг/кг антитела) один раз каждые четыре, шесть, восемь или десять недель, или один раз каждые два или три месяца. Такое лечение может быть обеспечено в течение периода, составляющего по меньшей мере шесть месяцев или по меньшей мере один, два, три, четыре или пять лет, или дольше, например, на протяжении течения заболевания, которое подвергают лечению путем введения, или на протяжении жизни субъекта.
Специалистам в данной области должно быть понятно, что уровни доз и схемы введения могут изменяться в зависимости от конкретного антитела, тяжести симптомов и подверженности субъекта побочным эффектам. Специалисты в данной области легко смогут определить предпочтительные дозы и схемы введения для данного соединения различными способами.
Способы введения
Рассматриваемое антитело вводят индивидууму любым доступным способом или путем, подходящим для доставки лекарственного средства, включая способы in vivo и ex vivo, а также системные и местные способы введения.
Обычные и фармацевтически приемлемые способы введения включают интраназальную, внутримышечную, внутритрахеальную, интракраниальную, подкожную, интрадермальную, местную, внутривенную, интраперитонеальную, внутриартериальную (например, через сонную артерию), спинальную доставку или доставку в головной мозг, ректальный, назальный, пероральный и другие энтеральные и парентеральные способы введения. Способы введения можно комбинировать, по желанию, или подбирать в зависимости от антитела и/или желаемого эффекта. Композицию рассматриваемого антитела можно вводить в виде однократной дозы или множественных доз. В некоторых вариантах осуществления композицию рассматриваемого антитела вводят перорально. В некоторых вариантах осуществления композицию рассматриваемого антитела вводят путем ингаляции. В некоторых вариантах осуществления композицию рассматриваемого антитела вводят интраназально. В некоторых вариантах осуществления композицию рассматриваемого антитела вводят локально. В некоторых вариантах осуществления композицию рассматриваемого антитела вводят интракраниально. В некоторых вариантах осуществления композицию рассматриваемого антитела вводят внутривенно. В некоторых вариантах осуществления композицию рассматриваемого антитела вводят интратекально.
Антитело согласно настоящему изобретению может быть введено в организм любым стандартным способом и путем, подходящим для доставки обычных лекарственных средств, включая системные или локальные пути. В целом, предусмотренные способы введения включают, но без особых ограничений, энтеральное, парентеральное или ингаляционное введение.
Парентеральные способы введения, помимо ингаляции, включают, но без особых ограничений, местное, трансдермальное, подкожное, внутримышечное, интраорбитальное, интракапсулярное, интраспинальное, интрастернальное, интратекальное и внутривенное введение, то есть любой способ введения, кроме как через пищеварительный тракт. Парентеральное введение может осуществляться для системной или локальной доставки рассматриваемого антитела. Если требуется системная доставка, то введение обычно включает инвазивное либо топическое или или мукозальное введение действующих системно фармацевтических препаратов.
Рассматриваемое антитело также может вводиться субъекту энтерально. Энтеральные способы введения включают, без особых ограничений, пероральное и ректальное (например, с помощью суппозитория) введение.
Под «лечением» подразумевается по меньшей мере ослабление симптомов, связанных с патологическим состоянием у хозяина, при этом ослабление используется в широком смысле и означает по меньшей мере уменьшение величины параметра, например, симптома, связанного с патологическим состоянием, подлежащим лечению, таким как иммунное нарушение. Таким образом, лечение также охватывает ситуации, при которых патологическое состояние или по меньшей мере связанные с ним симптомы полностью подавлялись, например, не возникали или прерывались, например, прекращались с тем, чтобы организм больше не страдал от патологического состояния или по меньшей мере от симптомов, которые характеризуют патологическое состояние.
В некоторых вариантах осуществления рассматриваемое антитело вводят посредством инъекции и/или уколом, например, в артерию головного мозга или прямо в ткань мозга. Рассматриваемое антитело также можно вводяить непосредственно в намеченное место, например, посредством биолистической доставки в намеченное место.
Разнообразные хозяева (при этом термин «хозяин» применяется взаимозаменяемо в настоящем документе с терминами «субъект», «индивидуум» и «пациент») могут быть подвергнуты лечению в соответствии с рассматриваемыми способами. Как правило, такие хозяева представляют собой «млекопитающих» или «относяться к млекопитающим», причем эти термины используются в широком смысле для обозначения организмов из класса млекопитающих, включая отряды плотоядных животных (например, кошки), травоядных животных (например, крупный рогатый скот, лошади и овцы), всеядных животных (например, собак, коз и свиней), грызунов (например, мышей, морских свинок и крыс) и приматов (например, человека, шимпанзе и обезьян). В некоторых вариантах осуществления хозяин представляет собой индивидуума, который обладает системой комплемента, такой как млекопитающее, рыба или позвоночное. В некоторых вариантах осуществления хозяин представляет собой млекопитающее, содержащее систему комплемента, рыбу или беспозвоночное домашнее животное, сельскохозяйственное животное, рабочее животное, животное зоопарка или лабораторное животное. В некоторых вариантах осуществления хозяин представляет собой человека.
Варианты осуществления включают композиции, содержащиеся в подходящем контейнере, включающие рассматриваемое анти-LAG-3 антитело для введения индивидууму. Например, рассматриваемое антитело может находиться внутри контейнера, подходящего для содержания фармацевтической композиции. Контейнер может представлять собой, например, бутыль (например, с закрывающим устройством, таким как крышка), блистерную упаковку (например, которая может содержать одну или более доз на блистер), флакон, гибкую упаковку (например, герметичные майларовые или пластиковые мешки), ампулу (для однократных доз в растворе), пипетку, шприц, тонкую пленку, пробирку и т.п. В некоторых вариантах осуществления контейнер, такой как стерильный контейнер, содержит рассматриваемую фармацевтическую композицию. В некоторых вариантах осуществления контейнер представляет собой бутыль или шприц. В некоторых вариантах осуществления контейнер представляет собой бутыль. В некоторых вариантах осуществления контейнер представляет собой шприц.
Предлагаются наборы с единичными дозами рассматриваемого антитела, например, в пероральных или инъекционных дозах. В таких наборах, дополнительно к контейнерам, содержащим единичные дозы, прилагается информационный листок-вкладыш с описанием применения и соответствующих преимуществ антитела в лечении представляющего интерес патологического состояния. Предпочтительные соединения и однократные дозы представляют собой такие, которые описаны в настоящем документе выше.
Способы лечения
В соответствии с изобретением предлагается также антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент, или фармацевтическая композиция согласно изобретению для применения в качестве лекарственного средства.
Антитело, фрагмент или композиция согласно настоящему изобретению может быть использована в любой терапии, в которой желательно повысить эффекты LAG-3 у субъекта.
Термин «субъект» включает любого человека или животное, отличное от человека. Термин «животное, отличное от человека» включает всех позвоночных, например, млекопитающих и немлекопитающих, таких как приматы, отличные от человека, овцы, собаки, кошки, коровы, лошади, куры, земноводные и пресмыкающиеся, хотя млекопитающие являются предпочтительными, такие как приматы, отличные от человека, овцы, собаки, кошки и коровы и лошади.
Антитело, фрагмент или композицию можно применять в любой терапии, когда желательно негативно регулировать пролиферацию и/или функцию Т-клеток.
Также, в соответствии с изобретением предлагается антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент, или фармацевтическая композиция согласно изобретению для применения в лечении нарушения, связанного с пролиферацией или активностью CD4+ и/или CD8+ Т-клеток у субъекта, или нарушения, связанного с пониженной экспрессией и/или активностью LAG-3 у субъекта.
Также, в соответствии с изобретением предлагается применение антитела согласно изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента, или фармацевтической композиции согласно изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения нарушения, связанного с пролиферацией или активностью CD4+ и/или CD8+ Т-клеток у субъекта, или нарушения, связанного с пониженной экспрессией и/или активностью LAG-3 у субъекта.
Кроме того, в соответствии с изобретением предлагается способ лечения нарушения, связанного с пролиферацией или активностью CD4+ и/или CD8+ Т-клеток у субъекта, или нарушения, связанного с пониженной экспрессией и/или активностью LAG-3 у субъекта, который включает введение эффективного количества антитела согласно изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента, или фармацевтической композиции согласно изобретению субъекту, нуждающемуся в таком лечении.
Нарушение, связанное с пролиферацией или активностью CD4+ и/или CD8+ Т-клеток может представлять собой иммунное нарушение, в частности, иммунное нарушение, опосредованное Т-клетками, такое как воспалительное заболевание или аутоиммунное нарушение.
Антитело, фрагмент или композицию можно применять для уменьшения воспалительного процесса или для предупреждения возникновения воспалительного процесса. В одном варианте осуществления предлагается in vivo уменьшение пролиферации или активации Т-клеток, в частности, вовлеченных в ненадлежащие воспалительные иммунные ответы, например, рекрутированные в близлежащую область/локализацию такого ответа.
Уменьшение пролиферации или активации Т-клеток, как используется в настоящем документе, может представлять собой уменьшение на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или более процентов по сравнению с состоянием до лечения или отсутствием лечения.
Предпочтительно лечение антителом, фрагментом или композицией согласно настоящему изобретению может обеспечить уменьшение пролиферации или активации Т-клеток без уменьшения общего уровня Т-клеток у пациента (неактивированных Т-клеток). Это может привести к меньшему количеству побочных эффектов и предотвратить истощение Т-клеток у пациента.
Иммунное нарушение может, например, быть выбрано из группы, состоящей из инфекций (вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных), эндотоксического шока, связанного с инфекцией, сепсиса, артрита, ревматоидного артрита, астмы, COPD (хронической обструктивной болезни легких), воспалительного заболевания органов малого таза, болезни Альцгеймера, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, болезни Пейрони, глютеновой болезни, заболевания желчного пузыря, пилонидальной болезни, перитонита, псориаза, васкулита, послеоперационных спаек, инсульта, диабета типа I, болезни Лайма, артрита, менингоэнцефалита, аутоиммунного увеита, иммуно-опосредованных воспалительных нарушений центральной и периферической нервной системы, таких как множественный склероз, красная волчанка (такая как системная красная волчанка) и синдром Гийена-Барре, атонического дерматита, аутоиммунного гепатита, фиброзирующего альвеолита, заболевания Грейвса, IgA-нефропатии, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, синдрома Меньера, пузырчатки, первичного билиарного цирроза, саркоидоза, склеродермии, синдрома Вегенера, других аутоиммунных нарушений, панкреатита, травмы (хирургического вмешательства), реакции «трансплантат против хозяина», отторжения трансплантата, заболевания сердца, включая ишемические заболевания, такие как инфаркт миокарда, а также атеросклероза, внутрисосудистого свертывания, резорбции кости, остеопороза, остеоартрита, периодонтита и гипохлоргидрии или бесплодия, связанного с отсутствием фетально-материнской толерантности.
Антитело, фрагмент или композицию согласно изобретению можно применять в любой терапии, когда желательно ингибировать связывание LAG-3 с молекулами МНС класса II, чтобы антагонизировать активирующий МНС класса II сигнал в антигенпредставляющие клетки (АРС), или ингибировать индуцированную LAG-3 активацию АРС.
Также, в соответствии с изобретением предлагается антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент, или фармацевтическая композиция согласно изобретению для применения в лечении нарушения, связанного с активацией АРС у субъекта.
Также, в соответствии с изобретением предлагается применение антитела согласно изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента, или фармацевтической композиции согласно изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения нарушения, связанного с активацией АРС у субъекта.
Кроме того, в соответствии с изобретением предлагается способ лечения нарушения, связанного с активацией АРС у субъекта, который включает введение эффективного количества антитела согласно изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента, или фармацевтической композиции согласно изобретению субъекту, нуждающемуся в таком лечении.
Используемые здесь термины «терапия», «лечение», «лечить» и т.п. относятся к получению желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим с точки зрения полного или частичного предупреждения возникновения заболевания или его симптома, и/или может быть терапевтическим с точки зрения частичного или полного излечения от заболевания и/или неблагоприятного эффекта, вызванного заболеванием. «Терапия», как используется здесь, охватывает любое лечение заболевания у млекопитающего, в частности, у человека, и включает: (а) предупреждение возникновения заболевания у субъекта, который может быть предрасположен к заболеванию, но у которого оно еще не было диагностировано; (b) ингибирование заболевания, то есть купирование его развития; и (с) ослабление заболевания, то есть вызывание регрессии заболевания.
Термины «индивидуум», «субъект», «хозяин» и «пациент», используемые здесь взаимозаменяемо, включают человека или животное, отличное от человека. Термин «животное, отличное от человека» включает всех позвоночных, например, млекопитающих и немлекопитающих, таких как приматы, отличные от человека, овцы, собаки, кошки, коровы, лошади, куры, земноводные и пресмыкающиеся, хотя млекопитающие являются предпочтительными, такие как приматы, отличные от человека, овцы, собаки, кошки и коровы и лошади.
«Терапевтически эффективное количество» или «эффективное количество» относится к количеству анти-LAG-3 антитела, которое при введении млекопитающему или другому субъекту для лечения заболевания является достаточным для лечения заболевания. «Терапевтически эффективное количество» будет изменяться в зависимости от анти-LAG-3 антитела, заболевания и его тяжести, а также возраста, веса и т.п. пациента, подлежащего лечению.
Все упомянутые здесь публикации включены в качестве ссылок для раскрытия и описания способов и/или материалов, применительно к которым эти публикации цитируются. Варианты осуществления изобретения теперь будут описаны только в качестве примера со ссылкой на прилагаемые чертежи, на которых:
на фигуре 1 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 27) зрелого человеческого белка LAG-3. Четыре внеклеточных домена надсемейства Ig находятся в аминокислотных остатках: 1-149 (D1); 150-239 (D2); 240-330 (D3); и 331-412 (D4). Аминокислотная последовательность структуры внешней петли домена D1 белка LAG-3 человека показана подчеркнутой и выделенной жирным шрифтом (SEQ ID NO: 40);
на фигуре 2 показано графическое изображение петель CDR vh моноклонального антитела 13Е2 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003));
на фигуре 3 показана аминокислотная последовательность домена vh моноклонального антитела 13Е2, выровненная с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты;
на фигуре 4 показано графическое изображение петель CDR vl моноклонального антитела 13Е2 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003));
на фигуре 5 показана аминокислотная последовательность домена vl моноклонального антитела 13Е2, выровненная с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты;
на фигуре 6 показано графическое изображение петель CDR vh моноклонального антитела 34F4 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003));
на фигуре 7 показана аминокислотная последовательность домена vh моноклонального антитела 34F4, выровненная с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты;
на фигуре 8 показано графическое изображение петель CDR vl моноклонального антитела 34F4 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003));
на фигуре 9 показана аминокислотная последовательность домена vl моноклонального антитела 34F4, выровненная с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты;
на фигуре 10 показаны наилучшие выравнивания BLAST зародышевой линии V-D-J для нуклеотидной последовательности, кодирующей область vh моноклонального антитела 13Е2;
на фигуре 11 показаны наилучшие выравнивания BLAST зародышевой линии V-J для нуклеотидной последовательности, кодирующей область vl моноклонального антитела 13Е2;
на фигуре 12 показаны наилучшие выравнивания BLAST зародышевой линии V-D-J для нуклеотидной последовательности, кодирующей область vh моноклонального антитела 34F4;
на фигуре 13 показаны наилучшие выравнивания BLAST зародышевой линии V-J для нуклеотидной последовательности, кодирующей область vl моноклонального антитела 34F4;
на фигуре 14 показаны результаты связывания различных концентраций агонистических анти-LAG-3 моноклональных антител 13Е2 и 34F4, и антагонистического анти-LAG-3 моноклонального антитела 17В4 с клетками яичника китайского хомячка (СНО), трансфицированными LAG-3, по сравнению с изотипическим контрольным антителом (mIgG1);
на фигуре 15 показаны результаты связывания различных концентраций агонистических анти-LAG-3 моноклональных антител 13Е2 и 34F4, и антагонистического анти-LAG-3 моноклонального антитела 17В4 с CD4+ и CD8+ первичными клетками (SEB-стимулированные РВМС), по сравнению с изотипическим контрольным антителом (mIgG1) от здорового донора (донор 1);
на фигуре 16А показаны результаты ингибирования связывания IMP321 (LAG-3 Ig, 1 мкг/мл) с МНС класса II-положительными В-клетками различными концентрациями агонистических анти-LAG-3 моноклональных антител 13Е2 и 34F4, и антагонистического анти-LAG-3 моноклонального антитела 17В4 по сравнению с изотипическим контрольным антителом (mIgG1). На фигуре 16В показаны результаты ингибирования активации клеток ТНР-1 с помощью IMP321 (20 нг/мл) в присутствии различных концентраций агонистических анти-LAG-3 моноклональных антител 13А2 и 34F4, и антагонистического анти-LAG-3 моноклонального антитела 17В4 по сравнению с изотипическим контрольным антителом (mIgG1);
на фигуре 17 (А) показаны CMV-индуцированные профили пролиферации CD8+ Т-клеток одного донора в присутствии mIgG1, 17В4, 13Е2 или 34F4, подвергнутые анализу методом проточной цитометрии, и стратегия гейтирования, используемая для анализа, описанного в примере 10. На фигуре 17(В) показаны результаты анализа ингибирования пролиферации CD8+ Т-клеток антителами 13Е2, 34F4 и 17В4 по сравнению с изотипическим контрольным антителом (mIgG1) для того же самого донора. Также, показана исходная пролиферация (No Stim);
на фигуре 18 показаны результаты анализа ингибирования пролиферации CD4+ или CD8+ Т-клеток антителами 13Е2 или 34F4 по сравнению с изотипическим контрольным антителом (mIgG1) у нескольких разных доноров;
на фигуре 19 показано влияние различных концентраций агонистических анти-LAG-3 моноклональных антител 13Е2 и 34F4 на пролиферацию CD8+ Т-клеток;
на фигуре 20 показана аминокислотная последовательность тяжелой цепи химерного 13Е2-человеческого IgG4 Fc антитела (аминокислотная последовательность тяжелой цепи химерного 13Е2-человеческого IgG4 Fc обозначена как 13E2IgG4mut на фигуре), и аминокислотная последовательность легкой цепи химерного 13Е2-человеческого IgK антитела (аминокислотная последовательность легкой цепи химерного 13Е2-человеческого IgK обозначена как 13E2IgK на фигуре);
на фигуре 21 показаны различные эффекты на Т-клетки истощающих, антагонистических и агонистических анти-LAG-3 антител;
на фигуре 22 показано выравнивание вариабельных областей гуманизированных вариантов 1-4 VH (VH1, VH2, VH3 и VH4) и выравнивание вариабельных областей гуманизированных вариантов 1-4 VL (VL1, VL2, VL3 и VL4) с соответствующей последовательностью исходного мышиного моноклонального антитела 13Е2 (VH 13Е2 и VL 13Е2, соответственно). Последовательности CDR выделены серым цветом. Изменения в гуманизированных каркасных последовательностях вариантов по сравнению с исходной мышиной последовательностью показаны подчеркнутыми и выделенными жирным шрифтом;
на фигуре 23 показана аминокислотная последовательность тяжелой цепи гуманизированного 13Е2-человеческого IgG4 Fc антитела (IMP761), выровненная с химерной аминокислотной последовательностью тяжелой цепи 13Е2-человеческого IgG4 Fc (13E2IgG4mut) антитела Chim13E2IgG4. Область vh выделена жирным шрифтом, и область Fc выделена. Аминокислотные остатки гуманизированной последовательности IMP761, которая отличаются от соответствующих остатков химерной последовательности 13E2IgG4mut, подчеркнуты одинарной линией. Последовательности CDR (на основе объединенной идентификации последовательностей CDR IMGT/Kabat) почеркнуты двойной линией;
на фигуре 24 показана аминокислотная последовательность легкой цепи гуманизированного 13Е2-человеческого IgE антитела (IMP761), выровненная с химерной аминокислотной последовательностью легкой цепи 13Е2-человеческого IgK (13E2IgK) антитела Chim13E2IgG4. Область vl выделена жирным шрифтом, и область IgK выделена. Аминокислотные остатки гуманизированной последовательности IMP761, которые отличаются от соответствующих остатков химерной последовательности 13E2Ig, подчеркнуты одинарной линией. Последовательности CDR (на основе объединенной идентификации последовательностей CDR IMGT/Kabat) показаны двойным подчеркиванием;
на фигуре 25 показаны результаты анализа, проведенного для тестирования связывания химерного 13Е2-человеческого IgG4 Fc антитела (Chim13E2IgG4) и IMP761 с клетками CHO-LAG-3+;
на фигуре 26 показаны результаты анализа, проведенного для тестирования эффекта IMP761 и Chim13E2IgG4 на: (а) антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток; и (b) экспрессию CD25 в CD8+ Т-клетках;
на рис. 27 показан эффект IMP761 и Chim13E2IgG4 на антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток и экспрессию CD25 в виде графика: (а) процентного ингибирования пролиферации CD8+ Т-клеток; и (b) процентного ингибирования экспрессии CD25 в CD8+ Т-клетках по сравнению с изотипически сходным контролем;
на фигуре 28 показан эффект различных концентраций IMP761 и Chim13E2IgG4 на антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток;
на фигуре 29 показаны результаты анализов ADCC, проводимых для определения, обладает ли IMP761 цитотоксической активностью в отношении клеток, экспрессирующих LAG-3, с использованием: ADCC Reporter Bioassay, доступного от фирмы Promega (а); и анализа ADCC с использованием IL-2-стимулированных РВМС в качестве эффекторных клеток - результаты нанесены на график в виде процента: CD4+ и CD8+ Т-клеток (b); или LAG-3+ CD4+ и LAG-3+ CD8+ Т-клеток (с) в популяции РВМС;
на фигуре 30 показаны результаты анализов CDC с использованием кроличьего комплемента для определения, обладает ли IMP761 цитотоксической активностью в отношении клеток, экспрессирующих LAG-3 - результаты нанесены на график в виде процента: (а) CD4+ и CD8+ Т-клеток; или (b) LAG-3+ CD4+ и LAG-3+ CD8+ Т-клеток в популяции РВМС; и
на фигуре 31 показаны результаты анализа для определения, обладает ли IMP761 цитотоксической активностью в отношении клеток, экспрессирующих LAG-3, после культивирования антиген-стимулированных РВМС с антителом в течение 3 дней. Результаты нанесены на график в виде: (а) процента CD4+ и CD8+ Т-клеток в популяции РВМС; и (b) процента LAG-3+ клеток в субпопуляции CD4+ и CD8+ Т-клеток.
Пример 1
Получение анти-LAG-3 моноклонального антитела 13Е2
Для получения анти-LAG-3 антител 15 мышей Balb/c (называемых как мыши под номерами 1-15 ниже) иммунизировали в соответствии с протоколом иммунизации, описанным ниже.
Тринадцать мышей, каждую, иммунизировали путем подкожных (s.c.) инъекций 100 мкг IMP321 (LAG-3Ig), партия клинического применения S017/LC1/041011 (называемая ниже как «LC1»): 3 раза (мышь под номером 12); 4 раза (мышь под номером 9); 5 раз (мышей под номерами 5 и 14); или 6 раз (мышей под номерами 3 и 11) на День 0, День 15, День 30, День 50, День 67 и День 108. Мышей под номерами 1, 2, 4, 8, 10, 13 и 15 иммунизировали до 4-х дополнительных раз. Параллельно двух мышей (мышь под номером 6 и мышь под номером 7), используемых в качестве контролей, иммунизировали 10 мкг LC1 в полном адъюванте Фрейнда (CFA) один раз на День 0 и такой же дозой антигена в неполном адъюванте Фрейнда (IFA) на День 15, День 30, День 50, День 67 и День 108.
Через 12 дней после 6-й иммунизации у мышей под номерами 1, 2, 3, 4, 8, 10, 11, 13 и 15 отбирали сыворотку (мыши под номерами 5, 9, 12 и 14 уже были умерщвлены) и анализировали в ферментном иммуносорбентном анализе (ELISA) с использованием D1-D4 LAG-3 в качестве покрытого антигена, очищенного анти-LAG-3 мышиного моноклонального антитела 17В4 в качестве эталона, и козьего антимышиного Ig-HRP в качестве меченого вторичного антитела для определения концентрации анти-LAG-3 антител, присутствующих в сыворотке. Результаты показаны в таблице 2 ниже:
После шести иммунизации сыворотка от нескольких мышей (включая мышь под номером 3) неожиданно показала результаты лучше, чем сыворотка от двух положительных контрольных мышей (под номерами 6 и 7), хотя эти мыши были иммунизированы IMP321 в отсутствие CFA или IFA в качестве адъюванта. Этот нетрадиционный метод (то есть иммунизация с помощью IMP321 в PBS без использования CFA или IFA в качестве адъюванта) также дала хорошие результаты по сравнению с другими экспериментами, проводимыми с использованием LAG-3-экспрессирующих клеток СНО в IFA (данные не показаны). Без привязки к какой-либо теории полагают, что это может быть обусловлено тем, что IMP321 сам по себе является адъювантом, то есть напрямую запускает активацию и созревание дендритных клеток.
Те же образцы сыворотки оценивали на их способность ингибировать связывание IMP321 с его лигандом, МНС класса II, экспрессируемым на клетках Raji В. Десять микролитров раствора Alexa Fluor488-конъюгированного IMP321 при концентрации 10 мкг/мл предварительно инкубировали с 5 мкл сыворотки, собранной от каждой мыши, или без нее, или нативной сыворотки в течение 30 мин при 4°С. Затем клетки Raji добавляли к конечному объему 50 мкл и инкубировали в течение 30 минут при 4°С.
Связанную клетками флуоресценцию анализировали с помощью проточной цитометрии.
Была выбрана мышь под номером 3, так как сыворотка от этой мыши показала высокий титр (423 мкг/мл) в анализе ELISA сыворотки D1-D4 (таблица 1) и высокую способность ингибировать связывание IMD321 с МНС класса II+-клетками Raji В.
Через 12 дней после шестой иммунизации мышь под номером 3 получала внутривенную (i.v.) стимуляцию 10 мкг D1-D4 LAG-3 (без Fc-хвоста) рекомбинантного белка (продуцируемого в клетках СНО и очищенного). Через три дня после i.v. стимулирующей инъекции мышь под номером 3 умерщвляли и удаляли селезенку. Спленоциты выделяли путем сжимания кусочков селезенки с помощью резинового поршня шприца 5 мл в чашке Петри, содержащей полную безсывороточную среду DMEM. Спленоциты и клетки миеломы Sp2/0 (культивированные в среде RPMI 1640+10% FCS+2 мМ глутамина + 0,5% P/S) промывали в бессывороточной среде. Два типа клеток смешивали вместе в соотношении 5:1 спленоцитькмиелома, а затем осаждали центрифугированием. Агент слияния (PEG-1500, раствор полиэтиленгликоля, 50% масса/объем в PBS, Roche 10783641001, 1 мл на 108 клеток) предварительно нагревали при 37°С и по каплям добавляли к клеточному осадку. Клетки осторожно ресуспендировали и разбавляли путем удвоения объема через 90 секунд. Клетки дополнительно разбавляли через регулярные интервалы до конечного разведения 1 к 15 в течение примерно 5 минут. Затем клетки центрифугировали и ресуспендировали в среде, содержащей 10% FBS, и инкубировали в течение приблизительно одного часа при 37°С. Затем клетки (10000 клеток/лунку) высевали в 46 96-луночных планшетов в полной среде RPMI, содержащей 10% Ultralow Ig FBS (Gibco 16250), 2% HAT (Gibco 21060) и дополняли 10% ВМ Condimed H1 (добавка к культуральной среде для поддержки роста В-клеточной гибридомы после слияния и во время клонирования, Roche 11088947001), и культивировали до скрининга.
Скрининг выполняли путем цитометрии с использованием клеток СНО с экспрессируемым мембраной LAG-3 для анализа связывающей способности антител, присутствующих в супернатантах растущих гидридом, выявленных с помощью FITC-конъюгированного козьего антимышиного Ig. Положительные гибридомы размножали и повторно подвергали скринингу на клетках LAG-3+ СНО и клетках СНО дикого типа. Из этого слияния в общей сложности 632 лунки были подвергнуты скринингу с помощью анализа FACS на экспрессирующих LAG-3 клетках СНО (выход 14%). Было обнаружено, что 4 клона гибридом стабильно экспрессировали анти-LAG-3 антитело, включая 13Е2.
Затем гибридому субклонировали путем предельного разведения.
Пример 2
Аминокислотная последовательность вариабельной области антитела 13Е2
Аминокислотная последовательность VH:
SEQ ID NO: 7 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH) антитела 13Е2. Подчеркнуты участки, определяющие комплементарность (CDR), определенные в соответствии с системой нумерации IMGT (Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212 (1999)). CDR-участки, определенные в соответствии с системой нумерации Kabat, выделены жирным шрифтом.
На фигуре 2 показано графическое изображение петель CDR vh моноклонального антитела 13Е2 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)). Затемненные круги (остатки под номерами 4, 12, 13, 19, 21, 23, 25, 41, 50, 52, 53, 71, 76, 78, 87, 89, 91, 94, 100) представляют собой гидрофобные (неполярные) остатки в каркасных областях 1-3 на сайтах, которые являются гидрофобными в большинстве антител. Квадраты представляют собой ключевые остатки в начале и в конце каждого CDR-участка.
Аминокислотные остатки под номерами 23, 41, 89, 104, 118 в каркасной области представляют собой структурно консервативные аминокислоты;
Аминокислотная последовательность vl:
SEQ ID NO: 8 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи (vl) антитела 13Е2. Подчеркнуты участки, определяющие комплементарность (CDR), определенные в соответствии с системой нумерации IMGT (Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212 (1999)). CDR-участки, определенные в соответствии с системой нумерации Kabat, выделены жирным шрифтом.
На фигуре 4 показано графическое изображение петель CDR vl моноклонального антитела 13Е2 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)). Затемненные круги (остатки под номерами 4, 1 1, 19, 21, 23, 25, 40, 41, 52, 53, 54, 71, 76, 87, 89, 91, 94, 96, 100, 101) представляют собой гидрофобные (неполярные) остатки в каркасных областях 1-3 в сайтах, которые являются гидрофобными в большинстве антител. Квадраты представляют собой ключевые остатки в начале и в конце каждого CDR. Остатки аминокислот под номерами 23, 41, 89, 104, 118 в каркасной области представляют собой структурно консервативные аминокислоты.
Пример 3
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельные домены антитела 13Е2
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая VH-домен моноклонального антитела 13Е2, показана на фигуре 3 и ниже:
Выравнивание последовательностей нуклеиновых кислот при помощи программы BLAST показало, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая VH-домен моноклонального антитела 13Е2, обладает значительной идентичностью с последовательностью следующих генов зародышевой линии: IGHV8-8*01, IGHV8-11*01, IGHV8-12*01, IGHD2-12*01, IGHD1-1*01, IGHJ1*01, IGHJ1*02, IGHJ1*03.
На фигуре 10 показано выравнивание последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей VH-домен антитела 13Е2, с ее наилучшим совпадением с геном зародышевой линии. На фиг.10 показано, что часть, содержащая нуклеотиды 1-301 VH-области 13Е2 (которая охватывает каркасные области тяжелой цепи FR1, FR2 и FR3), имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая на 92,7% идентична нуклеотидной последовательности V гена IGHV8-8*01.
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая VL-домен моноклонального антитела 13Е2, показана на фигуре 5 и ниже:
Выравнивание последовательностей нуклеиновых кислот при помощи программы BLAST показало, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая VL-домен моноклонального антитела 13Е2, обладает значительной идентичностью с последовательностью следующих генов зародышевой линии: IGKV6-17*01, IGKV6-25*01, IGKV6-23*01, IGKJ2*01, IGKJ2*03, IGKJ2*02.
На фигуре 11 показано выравнивание последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей VL-домен антитела 13Е2, с ее наилучшим совпадением с генами зародышевой линии. На фигуре 11 показано, что часть, содержащая нуклеотиды 1-284 области VL 13Е2 (которая охватывает каркасные области легкой цепи FR1, FR2 и FR3), имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая на 94,7% идентична нуклеотидной последовательности V-гена IGKV6-17*01.
Пример 4.
Создание анти-LAG-3 моноклонального антитела 34F4
Каждую из 4 мышей линии Balb/c (называемых ниже как мыши под номерами 1-4) иммунизировали с помощью четырех (мыши под номерами 2 и 4) или пяти (мыши под номерами 1 и 3) подкожных (s.c.) инъекций 100 мкг IMP321 (LAG-3Ig), партия клинического применения S017/LC1/041011 (названная ниже как «LC1»), на День 0, День 14, День 28, День 43 и День 70. Дополнительную мышь Balb/c (называемую ниже как мышь под номером 5) иммунизировали с помощью трех подкожных (s.c.) инъекций D1-D4 LAG-3.
Через две недели после третьей инъекции сыворотку от каждой мыши тестировали на содержание анти-LAG-3 антитела в анализе ELISA (как описано в примере 1).
Результаты представлены ниже в таблице 7:
Способность сыворотки от каждой мыши ингибировать связывание IMP321 с клетками Raji В определяли с помощью анализа FACS (как описано в примере 1).
Как видно из таблицы 7, титры антитела были низкими у всех мышей. Ни одна из сывороток не ингибировала связывание IMP321 с МНС класса II+ В-клетками Raji после трех иммунизации. Других отборов не проводилось для тестирования титров сыворотки и ингибирующей способности. Процесс иммунизации продолжали и мышь под номером 3, которая получила пять s.c. инъекций LC1, стимулировали 10 мкг D1-D4 LAG-3 i.v. на День 92.
Через три дня послестимулирующей внутривенной (i.v.) инъекции 73 миллиона спленоцитов от мыши под номером 3 сливали с 15 миллионами клеток миеломы Sp2/0, следуя такой же процедуре, которая описана в примере 1. В лунки 40 96-луночных планшетов высевали приблизительно 25500 клеток на лунку, а затем культивировали с добавлением культуральной среды, содержащей 10% ВМ Condimed H1. 2256 лунок подвергали скринингу с помощью анализа FACS на экспрессирующие LAG-3 клетки СНО (выход 59%). Были выбраны две устойчивые анти-LAG-3 гибридомы, включая 34F4 (см. таблицу 8 ниже).
Пример 5
Аминокислотная последовательность вариабельной области антитела 34F4
Аминокислотная последовательность VH;
SEQ ID NO: 17 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (NH) антитела 34F4. Подчеркнуты участки, определяющие комплементарность (CDR), определенные в соответствии с системой нумерации IMGT (Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212 (1999)), CDR-участки, определенные в соответствии с системой нумерации Kabat, выделены жирным шрифтом.
На фигуре 6 показано графическое изображение петель vh CDR моноклонального антитела 34F4 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)). Закрашенные круги (остатки под номерами 4, 12, 13, 19, 21, 23, 25, 41, 50, 52, 53, 71, 76, 78, 87, 89, 91, 94, 100) представляют собой гидрофобные (неполярные) остатки в каркасных областях 1-3 в сайтах, которые являются гидрофобными в большинстве антител. Квадраты представляют собой ключевые остатки в начале и в конце каждого CDR. Аминокислотные остатки под номерами 23, 41, 89, 104, 118 в каркасной области являются структурно консервативными аминокислотами.
Аминокислотная последовательность vl:
SEQ ID NO: 18 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи (vl) антитела 34F4. Подчеркнуты участки, определяющие комплементарность (CDR), определенные в соответствии с системой нумерации IMGT (Lefranc, M.-P. et al. Nucleic Acids Research, 27, 209-212 (1999)), CDR-участки, определенные в соответствии с системой нумерации Kabat, выделены жирным шрифтом.
На фигуре 8 показано графическое изображение петель CDR vl моноклонального антитела 34F4 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)). Закрашенные круги (остатки под номерами 4, 11, 19, 21, 23, 25, 40, 41, 52, 53, 54, 71, 76, 87, 89, 91, 94, 96, 100, 101) представляют собой гидрофобные (неполярные) остатки в каркасных областях 1-3 в сайтах, которые являются гидрофобными в большинстве антител. Квадраты представляют собой ключевые остатки в начале и в конце каждого CDR. Аминокислотные остатки под номерами 23, 41, 89, 104, 118 в каркасной области представляют собой структурно консервативные аминокислоты.
Пример 6.
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельные домены антитела 34F4
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая VH-домен моноклонального антитела 34F4, показана на фигуре 7 и ниже:
Выравнивание последовательности нуклеиновых кислот при помощи программы BLAST показывает, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая VH-домен моноклонального антитела 34F4, имеет значительную идентичность с последовательностью следующих генов зародышевой линии: IGHV8-8*01, IGHV8-12*01, IGHV8-11*01, IGHD1-1*01, IGHD1-2*01, IGHD2-3*01, IGHJ2*01, IGHJ2*02, IGHJ2*03.
На фигуре 12 показано выравнивание последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей VH-домен антитела 34F4, с ее наилучшим совпадением с генами зародышевой линии. На фигуре 12 показано, что часть, содержащая нуклеотиды 1-301 области VH 34F4 (которая охватывает каркасные области тяжелой цепи FR1, FR2 и FR3), имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая на 94,4% идентична нуклеотидной последовательности V гена IGHV8-8*01.
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая VL-домен моноклонального антитела 34F4, показана на фигуре 9 и ниже:
Выравнивание последовательностей нуклеиновых кислот при помощи программы BLAST показывает, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая VL-домен моноклонального антитела 34F4, имеет значительную идентичность с последовательностью следующих генов зародышевой линии: IGKV6-17*01, IGKV6-25*01, IGKV6-23*01, IGKJ1*01, IGKJ1*02, IGKJ2*01.
На фигуре 13 показано выравнивание последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей VL-домен антитела 34F4, с ее наилучшим совпадением с генами зародышевой линии. На фигуре 13 показано, что часть, содержащая нуклеотиды 1-284 VL-области 34F4 (которая охватывает каркасные области легкой цепи FR1, FR2 и FR3), имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая на 94,7% идентична нуклеотидной последовательности V гена IGKV6-17*01.
Пример 7.
Связывание агонистических моноклональных антител 13Е2 и 34F4 с LAG-3+ трансфицированными и первичными клетками по сравнению с антагонистическим моноклональным антителом 17В4 LAG-3+-трансфицированные клетки СНО или SEB-стимулированные РВМС от здорового донора инкубировали с анти-LAG-3 моноклональным антителом или изотипическим контролем (mIgG1) в течение 30 минут в PBS, 0,5% BSA, 0,1% азиде при 4°С. Клетки промывали, и клеточно-связанное антитело выявляли с помощью FITC-конъюгированного козьего F(ab')2-антимышиного Ig (H+L) (Coulter). Вторичное антитело вымывали, и клетки СНО напрямую анализировали с помощью проточной цитометрии. РВМС фенотипировали с использованием CD4-PE-Cy7 и CD8-APC-Cy7.
Связывание с LAG-3+ клетками СНО
Результаты представлены в виде средней интенсивности флуоресценции (MFI) клеток СНО, трансфицированных плазмидой, кодирующей человеческий LAG-3, в зависимости от концентрации антител. Результаты показаны в таблице 12 ниже и на фигуре 14.
На основании результатов, показанных в таблице 12, значение ЕС50 для связывания каждого антитела с LAG-3-экспрессирующими клетками СНО составило: 17В4: 0,7 нМ; 13Е2: 0,3 нМ; 34F4: 0,5 нМ.
Средние значения ЕС50 из четырех независимых экспериментов (данные не показаны) для связывания каждого антитела с экспрессирующими LAG-3 клетками СНО составляют: 17В4: 0,7 нМ; 13Е2: 0,4 нМ; 34F4: 0,5 нМ. Среднее значение ЕС50 13E2 из четырех независимых экспериментов в 2,7 раз превышает среднее значение ЕС50 17В4.
Среднее значение ЕС50 34F4 из четырех независимых экспериментов в 1,6 раз превышает среднее значение ЕС50 17В4.
Связывание с SEB-стимулированными РВМС.
Результаты представлены в виде средней интенсивности флуоресценции на CD4+ или CD8+ клетках из РВМС донора (Донор 1), стимулированных в течение трех дней 0,5 мкг/мл SEB в зависимости от концентрации антитела. Результаты по связыванию с CD4+ и CD8+ клетками для Донора 1 показаны в таблице 13 ниже и на фигуре 15.
На основании результатов, представленных в таблице 13, значение ЕС50 для связывания каждого антитела с CD4+ клетками составило: 17В4: 0,5 нМ; 13Е2: 0,1 нМ; 34F4: 0,1 нМ.
Среднее значение ЕС50 от трех доноров (данные не показаны) для связывания каждого антитела с CD4+ клетками составило: 17В4: 0,8 нМ; 13Е2: 0,2 нМ; 34F4: 0,2 нМ.
Среднее значение ЕС50 CD4+ 13Е2 и 34F4 от трех доноров в 3,8 раза превысило среднее значение ЕС50 17В4.
На основании результатов, показанных в таблице 13, значение ЕС50 для связывания каждого антитела с CD8+ клетками составило: 17В4: 0,7 нМ; 13Е2: 0,3 нМ; 34F4: 0,2 нМ.
Среднее значение ЕС50 от трех доноров (данные не показаны) для связывания каждого антитела с CD8+ клетками составило: 17В4: 1 нМ; 13Е2: 0,4 нМ; 34F4: 0,5 нМ.
Среднее значение ЕС50 CD8+ 13Е2 и 34F4 от трех доноров в 2,5 раза превысило среднее значение ЕС50 17В4.
Результаты показали, что моноклональные антитела 13Е2 и 34F4, каждое, связывается с клетками СНО, экспрессирующими LAG-3+, и с CD4+-T клетками и CD8+-Т-клетками с более высокой аффинностью, чем 17В4.
Анализ Biacore с LAG-3 Ig на чипе и антителом 17В4 в подвижном буфере показал следующие результаты:
| ka (1/Ms) | 1,09 × 106 |
| kd (1/s) | 1,32 × 10-4 |
| KD (M) | 1,21 × 10-10 |
Анализ Biacore с антителом 17В4 на чипе и LAG-3 Ig в подвижном буфере дал следующие результаты:
| ka (1/Ms) | 2,22 × 105 |
| kd (1/s) | 8.18 × 10-4 |
| KA(1/M) | 2.71 × 108 |
| KD(M) | 3.69 × 10-9 |
Пример 8
Ингибирование связывания IMP321 (LAG-3Ig) с МНС класса II-положительными клетками с помощью 13Е2 и 34F4
Связывание конъюгата IMP321 (LAG-3 Ig-Alexa 488) с MHC класса II-положительными В-клетками (клетки Raji) определяли после предварительной инкубации конъюгата (1 мкг/мл при 4°С) с анти-LAG-3 моноклональным антителом (13Е2, 34F4 или 17В4) или изотипическим контролем (mIgG1). Анализ клеточно-связанной флуоресценции осуществляли с использованием сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS).
Средняя интенсивность флуоресценции (MFI), соответствующая клеточно-связанному LAG-3Ig в зависимости от концентрации антитела показана в таблице 14 ниже и на фигуре 16А.
Результаты показали, что связывание IMP321 с клетками Raji было ингибировано путем предварительной инкубации с каждым из LAG-3-специфических моноклональных антител.
Пример 9
Ингибирование IMP321 (LAG-3Ig)-индуцированной активации моноцитов с помощью 13Е2 и 34F4
IMP321 (20 нг/мл) предварительно инкубировали с анти-LAG-3 моноклональным антителом 13Е2, 34F4 или 17В4, или изотипическим контролем (mIgG1) в течение 5 минут при 37°С перед инкубацией смеси с клетками ТНР-1 в течение 4 часов при 37°С.
Количество CCL4, секретируемое клетками ТНР-1 использовали для определения уровня активации моноцитов.
Концентрация CCL4 (выраженная в пг/мл) в зависимости от концентрации Ab показана в таблице 15 ниже и на фигуре 16В.
Результаты показали, что IMP321-индуцированная активация моноцитов ингибирована путем предварительной инкубации IMP321 с антагонистическим анти-LAG-3 моноклональным антителом 17В4, а также путем предварительной инкубации с агонистическими моноклональными антителами 13Е2 и 34F4.
На основании этих результатов и результатов, полученных в примере 8, можно сделать вывод о том, что агонистические моноклональные антитела 13Е2 и 34F4, подобно антагонистическому моноклональному антителу 17В4, взаимодействуют с участком связывания MHC класса II с LAG-3 или вблизи него, о чем свидетельствует их способность блокировать связывание и активность LAG-3 Ig (IMP321).
Пример 10
Ингибирование пролиферации Т-клеток с помощью 13Е2 и 34F4 по сравнению с 17В4
РВМС от 3 здоровых доноров (0,2 × 106 клеток/лунку, при 1 × 106/мл в полной среде RPMI + 10% FBS) метили сложным сукцинимидиловым эфиром карбоксифлуоресцеина (CFSE) и инкубировали с пулом пептидов, покрывающих последовательность CMV рр35, в присутствии моноклонального анти-LAG-3 антитела 13Е2, 34F4, 17В4 или изотипического контроля (mIgG1) (сверхоптимальная доза, 300 нг/мл для донора №1 и №2, 100 нг/мл для донора №3).
Т-клеточный ответ исследовали путем измерения пролиферации CD4+ или CD8+ Т-клеток на основе CFSE на день 5. Профили FACS для CD8+ Т-клеток донора №1 в присутствии каждого антитела, а также стратегия гейтирования показаны на фигуре 17(А). На фигуре 17 (В) показан процент CD8+ Т-клеток под каждым пиком деления в зависимости от клеточного деления для того же донора. Результаты для 3 доноров показаны в таблице 16 ниже. Также, измеряли исходную пролиферацию без антигенных пептидов (без стимула) (см. фигуру 17(А), нижняя панель, и таблицу 16). CD4+ Т-клетки донора №1 не показали какой-либо CMV-специфической пролиферации, поэтому результаты для этой популяции не включены.
Индекс пролиферации (PI) (рассчитанный как сумма: процента CD4+ или CD8+ T-клеток под каждым пиком деления, умноженная на число делений) показан в таблице 17.
Этот индекс обозначает процент клеток, которые испытали несколько кругов деления. В таблице 17 также указано процентное ингибирование для каждого антитела по сравнению с изотипическим контролем (mIgG1) на основе значений PI.
Результаты показали, что моноклональные антитела 13Е2 и 34F4 сопоставимо ингибируют пролиферацию CD4+ и CD8+ Т-клеток, индуцированную антигенными пептидами, тогда как моноклональное антитело 17В4 имеет незначительный положительный эффект при тестируемой концентрации.
РВМС от 12 здоровых доноров (0,2 × 106 клеток/лунку, при 1 × 106 /мл в полной среде RPMI + 10% FBS) метили CFSE и инкубировали с пулом пептидов, покрывающих последовательность CMV рр35 в присутствии моноклонального анти-LAG-3 антитела 13Е2, 34F4 или изотипического контроля (mIgG1).
Т-клеточный ответ исследовали на 5-й день путем измерения пролиферации CD4+ или CD8+ Т-клеток на основе CFSE. Процент CD4+ или CD8+ Т-клеток под каждым пиком деления рассчитывали как функцию деления клеток, используя стратегию гейтирования, показанную на фигуре 17(А). Также, измеряли исходную пролиферацию без антигенных пептидов (нет стимула). CD4+ Т-клетки доноров №1, №5 и №12 не показали какой-либо CMV-специфической пролиферации, поэтому результаты для этих образцов не были включены.
Индекс пролиферации (PI) (рассчитанный как сумма: процента CD4+ или CD8+ Т-клеток под каждым пиком деления, умноженная на число делений) для каждого донора показан в таблице 18, и результаты нанесены на график на фигуре 18. В таблице 18 также указано процентное ингибирование для каждого антитела по сравнению с изотипическим контролем (mIgG1) на основе значений PI.
Донор №1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9: 300 нг/мл; Донор №3: 10 нг/мл; Донор №10, 11, 12: 1000 нг/мл
Средние значения этих результатов приведены в таблице 19.
Результаты показали, что моноклональные анти-LAG-3-антитела 13Е2 и 34F4 ингибируют пролиферацию CD4+ и CD8+ Т-клеток, индуцированную антигенными пептидами. Результаты дают основание предположить, что ингибирующий эффект каждого антитела может быть более выраженным для CD8+ Т-клеток, чем для CD4+ Т-клеток. У большинства подвергнутых тестированию доноров эффекты антител 13Е2 и 34F4 имели высокое сходство, таким образом, антитела, по всей видимости, обладают сравнимой активностью.
Пример 12
Дозозависимый эффект агонистического антитела на пролиферацию CD8+ Т-клеток CFSE-меченые РВМС стимулировали CMV-пептидом, как описано выше, в присутствии различных концентраций агонистического анти-LAG-S моноклонального антитела 13Е2, 34F4 или изотипического контроля (mIgG1).
Т-клеточный ответ исследовали путем измерения на 5-й день пролиферации CD8+ Т-клеток на основе CFSE. Индекс пролиферации (рассчитанный как сумма процента CD8+ Т-клеток под каждым пиком деления, умноженная на число делений) показан в таблице 20.
В таблице 21 ниже указан индекс пролиферации CD8+ Т-клеток в зависимости от концентрации антител. Результаты в таблице 21 нанесены на график на фигуре 19.
Результаты показали, что доза всего лишь 30 нг/мл моноклонального анти-LAG-3-антитела 13Е2 или 34F4 вызывает максимальное ингибирование пролиферации CD8+ Т-клеток. Результаты также показали, что эффекты антител являются очень схожими.
Пример 13
Ингибирование пролиферации CD8+ Т-клеток с помощью 34F4 изменяется путем предварительной инкулации с IMP321
CFMS-меченые РВМС от 2 доноров стимулировали CMV-пептидом, как описано выше, в присутствии различных концентраций антитела 34F4. Дозу 1 мкг/мл 34F4 также оценивали после нейтрализации 10-кратным избытком IMP321.
Т-клеточный ответ исследовали путем измерения на 5-й день основанной на CFSE пролиферации CD8+ Т-клеток. Процент ингибирования пролиферации CD8+ Т-клеток рассчитывали исходя из процента делящихся клеток, наблюдаемых в присутствии антитела 34F4 или антитела 34F4 и IMP321 (LAG-31g), по сравнению с контролем с IMP321 или без него.
Результаты показаны в таблице 22 ниже.
Результаты показали, что предварительная инкубация антитела 34F4 с IMP321 изменяет ингибирующий эффект антитела 34F4 на пролиферацию CD8+ Т-клеток. Это показывает, что ингибирование пролиферации CD8+ Т-клеток, опосредованное 34F4, зависит от связывания антитела 34F4 с LAG-3.
Пример 14
Ингибирование пролиферации CD8+ Т-клеток антителами 13Е2 и 34F4 не изменяется под влиянием IL-2
CFSE-меченые РВМС стимулировали CMV-пептидами, как описано выше, в присутствии антитела 13Е2 или 34F4 с IL-2 или без него.
Т-клеточный ответ исследовали на 5-й день путем измерения основанной на CFSE пролиферации CD8+ Т-клеток. Процент ингибирования пролиферации CD8+ Т-клеток рассчитывали исходя из процента делящихся клеток, наблюдаемых в присутствии антитела 13Е2 или 34F4 с IL-2 или без него по сравнению с изотипическим контролем с IL или без него.
Результаты показаны в таблице 23 ниже.
Результаты показали, что добавление экзогенного IL-2 не смогло преодолеть ингибирующий эффект антитела 13Е2 или 34F4 на пролиферацию CD8+ Т-клеток. Из этих результатов можно сделать вывод о том, что антитела 13Е2 и 34F4, каждое, непосредственно ингибируют сигнал 1 (ответ на антиген CMV, путь, зависимый от Т-клеточного рецептора), но не сигнал 2 (ответ на IL-2, который является помощью от CD4-клеток) в CD8+ Т-клетках.
Пример 15 Эффект 13Е2 на секрецию маркера активации Т-клеток
Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) включают лимфоциты (Т-клетки, В-клетки и NK-клетки), моноциты и дендритные клетки. IFN-γ преимущественно секретируется активированными CD4+ и CD8+ Т-клетками памяти и эффекторными Т-клетками и NK-клетками при активации. После повторной стимуляции специфическим антигеном in vitro индуцируется секреция IFN-γ.
РВМС от четырех здоровых доноров (0,2×106 клеток/лунку при 1×106/мл в полной среде RPMI+10% FBS) метили CFSE и инкубировали с пулом пептидов, покрывающих последовательность CMV рр35 в присутствии моноклонального анти-LAG-3-антитела 13Е2 или изотипического контроля (mIgG1). Т-клеточный ответ исследовали путем измерения высвобождения IFN-γ в клеточном супернатанте на день 2. Концентрация IFN-γ и процентное ингибирование секреции IFN-γ антителом 13Е2 показаны ниже в таблице 24.
Результаты показали, что моноклональное антитело 13Е2 ингибирует секрецию ifn-γ у каждого из тестируемых доноров. Это свидетельствует о том, что моноклональное антитело 13Е2 ингибирует активацию Т-клеток.
Пример 16 Эффект 13Е2 и 34F4 на экспрессию маркера активации Т-клеток
РВМС от четырех здоровых доноров (0,2×106 клеток/лунку, при 1×106/мл в полной среде RPMI+10% FBS) метили CFSE и инкубировали с пулом пептидов, покрывающих последовательность CMV рр35, в присутствии моноклонального анти-LAG-3 антитела 13Е2 или 34F4, или изотипического контроля (mIgG1).
Т-клеточный ответ исследовали путем измерения на 5- день экспрессии CD25, в качестве маркера активации, на CD8+ Т-клетках. Процент CD8+ Т-клеток, экспрессирующих CD25, а также процентное ингибирование экспрессии CD25 антителом 13Е2 или 34F4 представлено в таблице 25 ниже.
Результаты показали, что каждое моноклональное антитело, 13Е2 и 34F4, значительно ингибировало экспрессию CD25 на CD8+ Т-клетках. Это свидетельствует о том, что каждое антитело ингибирует активацию CD8+ Т-клеток.
Пример 17 Последовательности химерного человеческого антитела 13Е2
Нуклеотидные последовательности, кодирующие мышиную вариабельную область тяжелой и легкой цепей 13Е2, сливали с последовательностями, кодирующими константную область тяжелой цепи и легкой каппа-цепи IgG4 человека, соответственно. Эти синтетические химерные последовательности субклонировали в экспрессионный вектор и экспрессировали в клетках СНО, выращенных в суспензии.
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи химерного человеческого антитела 13Е2 к Fc-фрагменту IgG4 показана ниже и на фигуре 20(А). Антитело содержит домен vh мышиного моноклонального антитела 13Е2 и Fc-фрагмент IgG4 человека с мутацией S228P (для отмены обмена Fab-фрагментами) (13E2IgG4mut). На фигуре область vh показана жирным шрифтом и Fc-область показана выделенной цветом.
3E2IgG4mut
MGWTLVFLFLLSVTAGVHSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLGWIRQPSGKGLEWLTHIWWDDIKRYNPDLRSRLTISKDTSSSQIFLKIASVDTADTATYYCARIVEGSYSSSYFDVWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 30)
Аминокислотная последовательность легкой цепи химерного человеческого антитела 13Е2 класса IgK показана ниже и на фигуре 20(В). Антитело содержит домен vl моноклонального антитела 13Е2 и человеческую С-область каппа-цепи Ig (IgK) дикого типа (13E2IgK). На фигуре область vl выделена жирным шрифтом, и область IgK показана выделенной цветом.
13E2IgK
MVSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIVMTQPHKFMSTSVEDRVTITCKASQDVIFDVAWYQQKPGQSPKLLIYSASSRVSGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPYTFGGGTTLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 37)
Химерное человеческое антитело 13Е2 (называемое как Chim13E2IgG4) содержит химерные тяжелую и легкую цепи: 13E2IgG4mut; и 13E2IgK.
Пример 18 Последовательности гуманизированного моноклонального антитела 13Е2 (IMP761)
Для оптимального удержания конформации петли CDR использовали комбинированную идентификацию последовательностей CDR в соответствии с IMGT/Kabat для прививки CDR мышиного антитела 13Е2 в человеческие каркасы для получения гуманизированной версии 13Е2. Эти синтетические химерные последовательности субклонировали в экспрессионный вектор и экспрессировали в клетках СНО, выращенных в суспензии.
Ниже показаны аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей гуманизированного моноклонального антитела 13Е2 (называемого как IMP761). Вариабельные домены выделены жирным шрифтом, последовательности CDR показаны подчеркнутыми.
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи IMP761
MGWTLVFLFLLSVTAGVHSQITLKESGPTLVKPTOTLTLTCTFSGFSLSTSGMGLGWIROPPGKTLEWLTHIWWDDIKRYNPDLRSRLSITKDTSKNOWLTMTNMDPLDTGTYYCAMVEGSYSSSYFDVWGOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS LGK (SEQ ID NO: 84)
Выравнивание этой последовательности (тяжелая цепь IMP761) с химерной последовательностью тяжелой цепи, 13E2IgG4mut, из примера 17 показано на фигуре 23. На этой фигуре область vh выделена жирным шрифтом и Fc-область показана выделенной цветом. Аминокислотные остатки гуманизированной последовательности IMP761, которые отличаются от соответствующих остатков химерной последовательности 13E2IgG4mut, подчеркнуты одинарной линией. Последовательности CDR (на основе комбинированной идентификации последовательностей CDR в соответствии с IMGT/Kabat) подчеркнуты двойной линией. Замененные остатки в гуманизированной последовательности также приведены ниже в таблице 26 (как VH-вариант 4, VH4, а также замененные остатки в трех других гуманизированных вариантах исходной последовательности тяжелой цепи 13Е2: VH-варианты 1, 2 и 3, VH1, VH2 и VH3).
Каркасные последовательности тяжелой цепи гуманизированного антитела (антитело IMP761) представляют собой следующие:
VH FR1: QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFS (SEQ ID NO: 64);
VH FR2: WIRQPPGKTLEWLT (SEQ ID NO: 65);
VH FR3: RLSITKDTSKNQVVLTMTNMDPLDTGTYYC (SEQ ID NO: 66); и
VH FR4: WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 67).
Аминокислотная последовательность легкой цепи IMP761
MVSSAQFLGLLLLCFQGTRCPIVMTQTPSSLSASVGPRVTITCKASQDVIFPVAWYQORPGOAPKLLIYSASSRVSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEPFATYYCQQHYSTPYTFGQGTRLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG EC (SEQ ID NO: 85)
Выравнивание этой последовательности (легкая цепь IMP761) с химерной последовательностью легкой цепи, 13E2Ig, из примера 17 показано на фигуре 24. На этой фигуре область vl выделена жирным шрифтом, и область IgK выделена цветом. Аминокислотные остатки гуманизированной последовательности IMP761, которые отличаются от соответствующих остатков химерной последовательности 13E2Ig, подчеркнуты одинарной линией. Последовательности CDR (на основе комбинированной идентификации последовательностей CDR в соответствии с IMGT/Kabat) подчеркнуты двойной линией. Замененные остатки в гуманизированной последовательности показаны ниже в таблице 27 (как VL-вариант 3, VH3, а также замененные остатки в трех других гуманизированных вариантах исходной последовательности легкой цепи 13Е2: VL-варианты 1, 2 и 4, VL1, VL2 и VL4).
Каркасные последовательности легкой цепи гуманизированного антитела (антитело IMP761) представляют собой:
VL FR1: DIVMTQTPSSLSASVGDRVT1TC (SEQ ID NO: 64);
VL FR2: WYQQRPGQAPKLLIY (SEQ ID NO: 65);
VL FR3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 66); и
VL FR4: FGQGTRLDIK (SEQ ID NO: 67)
Пример 19
Связывание химерного 13Е2-человеческого антитела (Cbim13E2IgG4) и гуманизированного антитела 13Е2 (IMP761) с CHQ-LAG-3+ клетками
Клетки СНО, экспрессирующие на своей поверхности LAG-3 (0,05×106 клеток/лунку в PBS, 0,5% BSA, 0,1% азида) инкубировали с различными концентрациями химерного 13Е2-человеческого антитела (называемого как Chim13E2IgG4), содержащего химерные тяжелые и легкие цепи, описанные в примере 17 (тяжелая цепь: 13E2IgG4mut; легкая цепь: 13E2IgK), IMP761 или человеческий IgG4 (в качестве изотипически сходного отрицательного контроля). Вторичное козье антитело против человеческого IgG-FITC использовали для детекции присутствия антител на поверхности LAG-3+ клеток СНО. Среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) FITC определяли после анализа методом проточной цитометрии. Результаты показаны ниже в таблице 28 и на фигуре 25.
Результаты показали, что гуманизированное моноклональное антитело IMP761 связывается с клетками СНО, экспрессирующими LAG-3 на своей поверхности, очень сходным образом с химерным антителом.
Пример 20
Аффинность связывания химерного 13Е2-человеческого антитела (Chim13E2IgG4) и гуманизированного антитела 13Е2 (IMP761) с человеческим белком LAG-3Ig
Анализ методом плазмонного поверхностного резонанса Biacore™ проводили с использованием химерного антитела Chim13E2IgG4 (содержащего химерную тяжелую цепь 13E2IgG4mut и химерную легкую цепь 13E2IgK, описанную в примере 17), или гуманизированного антитела 13Е2 (IMP761), описанного в примере 18, ковалентно иммобилизованного на сенсорном чипе С1. Покрытие проводили в 10 мМ ацетате натрия, рН 5,0, до достижения 13±1 RU. Затем рекомбинантный человеческий белок LAG-3Ig (IMP321) пропускали над захваченными антителами в 6 различных концентрациях в диапазоне 0,078-2,5 нМ в аналитическом буфере (10 мМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% Tween 20) при 25°С с регенерацией в каждом цикле. Анализ проводили с помощью прибора Biacore™ T200 и данные подгоняли с использованием модели кинетической глобальной подгонки (Langmuir 1:1). Параметры кинетики показаны в таблице 29 и представляют среднее значение трех прогонов.
Результаты показали, что гуманизированное моноклональное антитело IMP761 обладало такой же аффинностью к человеческому белку LAG-3Ig, как химерное антитело. Оба антитела показали очень высокую скорость ассоциации, что объясняет высокую аффинность антител, происходящих из 13Е2, в отношении LAG-3.
Пример 21
Эффект гуманизированного антитела 13Е2 (IMP761) на пролиферацию CD8+ Т-клеток и экспрессию CD25, индуцированную антигенной стимуляцией
CFMS-меченные РВМС от здоровых доноров (0,2×106 клеток/лунку в полной среде RPMI+10%FBS) инкубировали с пулом пептидов, покрывающих последовательность CMV рр35, в трех повторах с 300 нг/мл IgG4 человека (изотипический контроль), Chim13E2IgG4 или IMP761. Т-клеточный ответ оценивали путем измерения пролиферации, оцененной с использованием индекса пролиферации (рассчитанного как сумма процента CD8+ Т-клеток под пиком деления, умноженная на число делений) и экспрессии CD25 на 5-й день методом проточной цитометрии. Процентное ингибирование для каждого антитела по сравнению с изотипически сходным отрицательным контролем (huIgG4) рассчитывали исходя из значений индекса пролиферации процента GD25+ Т-клеток в популяции CD8+ Т-клеток. Результаты показаны в таблицах 30 и 31, и на фигурах 26 и 27.
Результаты показали, что гуманизированное моноклональное антитело IMP761 имело эффект на ингибирование антиген-индуцированной пролиферации CD8+ Т-клеток и экспрессию CD25+ Т-клеток, сходный с химерным антителом Chim13E2IgG4. Оба антитела вызывали в среднем примерно 60% ингибирования антиген-индуцированной пролиферации CD8+ Т-клеток и приблизительно 45% ингибирования CD25+ Т-клеток в CD8+ популяции Т-клеток. Пример 22
Эффект различных доз химерного 13Е2-человеческого антитела (Chim13E2IgG4) и гуманизированного антитела 13Е2 (IMP761) на ответ CD8+ Т-клеток
CFMS-меченые РВМС от здоровых доноров (0,2×106 клеток/лунку в полной среде RPMI+10%FBS) инкубировали с пулом пептидов, покрывающих последовательность CMV рр35, в трех повторах с различными дозами Chim13E2IgG4, IMP761 или IgG4 человека (изотипически сходный отрицательный контроль). Ответ Т-клеток оценивали путем измерения пролиферации (разбавление CFSE) на 5-й день с помощью проточной цитометрии. Процентное содержание CD8+ Т-клеток для каждого числа делений рассчитывали для различных используемых доз антител.
Результаты показаны ниже в таблице 32 и на фигуре 28.
Результаты показали, что ингибирующий эффект IMP761 и Chim13E2IgG4 на антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток был дозозависимым. В частности, ингибирующий эффект каждого антитела увеличивался при увеличении дозы от 10 нг/мл до 100 нг/мл антитела. При 300 нг/мл антитела ингибирующий эффект был аналогичен эффекту 100 нг/мл антитела. Ингибирующий эффект IMP761 был аналогичен эффекту Chim13E2IgG4 при всех тестируемых дозах.
Пример 23
Гуманизированное антитело 13Е2 (IMP761) не обладают цитотоксической активностью против LAG-3-экспрессирующих клеток
Несколько типов анализов использовали для подтверждения того, что гуманизированное антитело 13Е2 (IMP761) не обладает цитотоксической активностью против клеток, экспрессирующих LAG-3. 1) ADCC Reporter Bioassay (Promega, G7015)
В этом анализе первичные донорские РВМС или NK-клетки заменяли клетками Jurkat, стабильно экспрессирующими человеческий FcγRIIIa (высокоаффинный V158-рецептор) и NFAT-чувствительный элемент, стимулирующий экспрессию репортерного гена люциферазы. Если тестируемое антитело обладает активностью ADCC, оно будет связывать вместе клетку-мишень и рецептор FcγRIIIa клетки Jurkat. Результирующая активация сигнального пути даунстрим рецептора FcγRIIIa приводит к активации пути NFAT, тем самым индуцируя экспрессию репортерного гена люциферазы. Активность люциферазы количественно определяли путем считывания люминесценции.
LAG-3-трансфицированные клетки СНО и Jurkat, и РВМС, стимулированные SEB в течение 2 дней, чтобы вызвать экспрессию LAG-3 (55% РВМС были LAG-3+), использовали в качестве клеток-мишеней для анализа ADCC-активности IMP761 по сравнению с изотипически сходным отрицательным контрольным антителом, hIgG4 (рекомбинантное mAb от BioRad). В качестве положительного контроля использовали антитело против CD20 и клетки Raji, обеспеченные в наборе для анализа. Антитело против CD20 также тестировали на SEB-стимулированных РВМС. Анализы проводили, следуя инструкциям производителя, используя 75000 эффекторных клеток с 12500 клетками-мишенями. После инкубации в течение 6 часов при 37°С в соответствии с инструкциями изготовителя использовали систему анализа люциферазы Bio-Glo для измерения люминесценции с использованием люминометра PerkinElmer EnVision 2103 (время интегрирования 0,5 сек/лунку).
Результаты показаны ниже в таблице 33 и на фигуре 29(а). Результаты представлены в виде кратного изменения интенсивности сигнала люминесценции (RLU), рассчитанного путем деления величины RLU, полученной в присутствии тестируемого антитела (при максимальной концентрации, рекомендованной изготовителем, 3 мкг/мл), на величину RLU, полученную без антитела.
Результаты показали, что кратное изменение RLU для антитела IMP761 было приблизительно однократным для каждой из различных тестируемых клеток-мишеней, независимо от того, экспрессировала клетка-мишень LAG-3 или нет. Кратное изменение величины RLU, полученной для изотипически сходного негативного контрольного антитела, hIgG4, было немного выше и варьировалось от 1,4 до 2,5 раз для разных клеток-мишеней. Положительное контрольное анти-CD20 антитело показало значительную ADCC-активность против клеток Raji (В-клеточная линия) и против SEB-стимулированных РВМС, содержащих незначительный процент В-клеток.
Из этих результатов было сделано заключение о том, что антитело IMP761 не обладает какой-либо ADCC-активностью против клеток, экспрессирующих LAG-3. 2) Общепринятый анализ ADCC
В этом анализе использовали РВМС, стимулированные в течение одного дня в среде X-Vivo 10 (Lonza) со 100 МЕ/мл IL-2 (Roche) и CFSE-меченых РВМС, стимулированных SEB в течение двух дней для обеспечения экспрессии LAG-3 на Т-клетках. Анализ проводили в среде X-Vivo 10 при соотношении эффектор:мишень 50:1, с высокой дозой (3 мкг/мл) IMP761 или изотипически сходного отрицательного контрольного антитела, hIG4. Через 4 часа клеточные смеси собирали и окрашивали на CD4, CD8, CD25 и LAG-3 с использованием конъюгированных с флуорохромом антител. Жизнеспособность клеток в каждой популяции клеток крови оценивали; с помощью проточной цитометрии после исключения клеток, которые оказались положительными на окрашивание 7-амино-актиномицином D (7-AAD), флуоресцентным красителем, который метит клетки, утратившие свою мембранную целостность, явление, которое быстро появляется после гибели клетки.
Результаты показаны в таблице 34 и на фигуре 29(b) и (с). Результаты представлены в виде процентного содержания живых CD4+ или CD8+ клеток в популяции РВМС (b), и процентного содержания живых LAG-3+CD4+ или LAG-3+CD8+ клеток в популяции РВМС (с).
Результаты показали, что антитело IMP761 не снижает процентное содержание CD8+ или CD4+ Т-клеток в популяции РВМС, или процентное содержание LAG-3+CD8+ цитотоксических Т-клеток или LAG-3+CD4+ хелперных Т-клеток в популяции РВМС. Изотипически сходное отрицательное контрольное антитело, hIgG4, вызвало незначительное снижение жизнеспособности Т-клеток в популяции РВМС, особенно активированных Т-клеток, экспрессирующих LAG-3.
Из этих результатов можно сделать вывод о том, что антитело IMP761 не обладает какой-либо ADCC-активностью против LAG-3-экспрессирующих Т-клеток. 3) CDC-анализ.
Для тестирования CDC SEB-стимулированные клетки, используемые в качестве клеток-мишеней, инкубировали с 3 мкг/мл IMP761, изотипически сходным отрицательным контрольным антителом, hIgG4, CDC-положительным анти-CD3-контрольным антителом (клон MEM-57, Cerdalane) или изотипически сходным отрицательным контрольным мышиным антителом, mIgG2a, в течение 45 минут в PBS, 0,5% BSA. Затем несвязанные антитела вымывали и клетки инкубировали с кроличьим комплементом, разбавленным 3 объемами в среде RPMI, в течение 1 часа при 37°С. Клетки окрашивали на CD4, CD8, CD25 и LAG-3 с использованием конъюгированных с флуорохромом антител. Жизнеспособность клеток в каждой популяции клеток крови оценивали с помощью проточной цитометрии после исключения клеток, меченных 7-AAD.
Результаты показаны в таблице 35 и на фигуре 30. Результаты представлены в виде процентного содержания живых CD4+ или CD8+ клеток в популяции РВМС (а), и процентного содержания живых LAG-3+CD4+ или LAG-3+CD8+ клеток в популяции РВМС (b).
Результаты показали, что антитело IMP761 не уменьшает процентного содержания CD8+ или CD4+ Т-клеток в популяции РВМС, или процентного содержания LAG-3+CD8+ цитотоксических Т-клеток, или LAG-3+CD4+ хелперных Т-клеток в популяции РВМС. Как и ожидалось, анти-CD3-положительное контрольное антитело действительно вызвало уменьшение процентного содержания Т-клеток в популяции РВМС и активированных Т-клеток, экспрессирующих LAG-3.
На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что антитело IMP761 не обладает какой-либо CDC-активностью против LAG-3-экспрессирующих Т-клеток. 4) Оценка цитотоксичности в анализе пролиферации Т-клеток
Антитело IMP761 не показало цитотоксической активности в любом из коротких анализов цитотоксичности, описанных выше в пунктах (1)-(3). Цитотоксичность IMP761 в отношении LAG-3-экспрессирующих Т-клеток также оценивали после культивирования антиген-стимулированных РВМС в течение нескольких дней. Аналогично описанным в предыдущих примерах анализам пролиферации, РВМС от здоровых доноров (0,2×106 клеток/лунку в полной среде RPMI+10% FBS) инкубировали в трех повторах с пулом пептидов, покрывающих последовательность CMV рр35, в присутствии 300 нг/мл IMP761 или IgG4 человека (в качестве изотипически сходного отрицательного контроля). Через три дня процентное содержание CD8+ и CD4+ Т-клеток, гейтированных по живым лимфоцитам, а также процентное содержание LAG-У клеток в этих поднаборах Т-клеток, измеряли с помощью проточной цитометрии.
Результаты показаны в таблице 36 и на фигуре 31.
Результаты показали, что антитело IMP761 не уменьшает процентное содержание CD8+ или CD4+ Т-клеток в популяции лимфоцитов, или процентное содержание LAG-3+CD8+ цитотоксических Т-клеток или LAG-3+CD4+ хелперных Т-клеток в популяции лимфоцитов.
На основании этих результатов можно сделать вывод о том, что антитело IMP761 не проявляет какой-либо цитотоксической активности против Т-клеток, экспрессирующих LAG-3, в этом анализе пролиферации.
На основании представленных в этом примере результатов можно сделать вывод о том, что антитело IMP761 не обладает цитотоксической активностью, таким образом, ингибирование антиген-индуцированной пролиферации и активации Т-клеток этим антителом не обусловлено какой-либо цитотоксической активностью против активированных Т-клеток.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ИММУТЕП С.A.С.
<120> Анти-LAG-3 антитела
<130> P/73968.WO01
<150> GB 1515572.4
<151> 2015-09-02
<150> GB 1612437.2
<151> 2016-07-18
<160> 85
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 1
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly
1 5 10
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 2
Ile Trp Trp Asp Asp Ile Lys
1 5
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 3
Ala Arg Ile Val Glu Gly Ser Tyr Ser Ser Ser Tyr Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 4
Gln Asp Val Ile Phe Asp
1 5
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 5
Ser Ala Ser
1
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 6
Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 7
<211> 123
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 7
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Leu Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Thr His Ile Trp Trp Asp Asp Ile Lys Arg Tyr Asn Pro Asp
50 55 60
Leu Arg Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Ser Gln Ile
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Val Glu Gly Ser Tyr Ser Ser Ser Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Pro His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Glu
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ile Phe Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 370
<212> DNA
<213> Balb/c mouse
<400> 9
caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtctagg ctggattcgt 120
cagccatcag ggaagggtct ggagtggctg acacacattt ggtgggatga tatcaagcgc 180
tataacccag acctgaggag ccgactgact atctccaagg atacctccag cagccagatt 240
ttcctcaaga tcgccagtgt ggacactgca gatactgcca catattactg tgctcgaata 300
gtggagggtt catacagtag tagttacttc gatgtctggg gcgcagggac cacggtcacc 360
gtctcctcag 370
<210> 10
<211> 322
<212> DNA
<213> Balb/c mouse
<400> 10
gacattgtga tgacccagcc tcacaaattc atgtccacat cagtggaaga cagggtcacc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgatt tttgatgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggacaatctc ctaaattact gatttactcg gcatcctccc gggtcagtgg agtccctgat 180
cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagtag tgtgcaggct 240
gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cactatagta ctccgtacac gttcggaggg 300
gggaccacgc tggaaataaa ac 322
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 11
Gly Phe Ser Leu Asn Thr Ser Gly Met Gly
1 5 10
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 12
Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys
1 5
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 13
Ala Arg Ile Glu Gly Asp Thr Tyr Tyr Asp Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 14
Gln Asp Val Ser Ile Ala
1 5
<210> 15
<211> 3
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 15
Ser Ala Ser
1
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 16
Gln Gln His Tyr Ser Ile Pro Trp Thr
1 5
<210> 17
<211> 123
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 17
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Thr His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Ser Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Glu Gly Asp Thr Tyr Tyr Asp Tyr Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Val Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Leu Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Gly Leu Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala
20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ile Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 370
<212> DNA
<213> Balb/c mouse
<400> 19
caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgaac acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt 120
cagccatcag ggaagggtct ggagtggctg acacacattt ggtgggatga tgtcaagcgc 180
tataatccag ccctgaagag ccgactgact atctccaagg atacctccag cagccaggta 240
ttcctcaaga tcgccagtgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcgaata 300
gagggggata cttactacga ctattacttt gactactggg gccaaggcgt cactctcaca 360
gtctcctcag 370
<210> 20
<211> 322
<212> DNA
<213> Balb/c mouse
<400> 20
gacattgtga tgacccagtc tcacaaactc atgtccacat cagttggaga cgggctcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgagc attgctgtag tctggtatca acagaaacca 120
ggacaatctc ctaaactgct gatttactcg gcatccttcc ggtacactgg agtccctgat 180
cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240
gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagta ttccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa ac 322
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 21
Thr Ser Gly Met Gly Leu Gly
1 5
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 22
His Ile Trp Trp Asp Asp Ile Lys Arg Tyr Asn Pro Asp Leu Arg Ser
1 5 10 15
<210> 23
<211> 13
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 23
Ile Val Glu Gly Ser Tyr Ser Ser Ser Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 24
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ile Phe Asp Val Ala
1 5 10
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 25
Ser Ala Ser Ser Arg Val Ser
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 26
Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 27
<211> 502
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala
1 5 10 15
Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser
20 25 30
Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly
35 40 45
Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu
65 70 75 80
Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro
85 90 95
Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu
100 105 110
Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala
115 120 125
Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu
130 135 140
Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser
145 150 155 160
Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala
165 170 175
Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg
180 185 190
Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln
195 200 205
Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg
210 215 220
Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu
225 230 235 240
Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg Val
245 250 255
Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe Leu
260 265 270
Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val Thr
275 280 285
Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala
290 295 300
Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln Leu
305 310 315 320
Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe
325 330 335
Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Val
340 345 350
Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser Leu Asp Thr Pro Ser Gln
355 360 365
Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala Gln Glu Ala Gln Leu Leu
370 375 380
Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln Gly Glu Arg Leu Leu Gly
385 390 395 400
Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser Pro Gly Ala Gln Arg Ser
405 410 415
Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly His Leu Leu Leu Phe Leu
420 425 430
Thr Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu Val Thr Gly Ala Phe Gly
435 440 445
Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro Arg Arg Phe Ser Ala Leu
450 455 460
Glu Gln Gly Ile His Pro Gln Ala Gln Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu
465 470 475 480
Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu
485 490 495
Pro Glu Pro Glu Gln Leu
500
<210> 28
<211> 149
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala
1 5 10 15
Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser
20 25 30
Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly
35 40 45
Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu
65 70 75 80
Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro
85 90 95
Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu
100 105 110
Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala
115 120 125
Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu
130 135 140
Gly Gln Ala Ser Met
145
<210> 29
<211> 90
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Thr Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu
1 5 10 15
Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe
20 25 30
Arg Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His
35 40 45
His Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp
50 55 60
Ser Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val
65 70 75 80
Ser Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly
85 90
<210> 30
<211> 469
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> VH domain of mouse monoclonal antibody 13E2, and a human IgG4 Fc
portion with an S228P mutation
<400> 30
Met Gly Trp Thr Leu Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln
20 25 30
Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Ser Thr Ser Gly Met Gly Leu Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Leu Thr His Ile Trp Trp Asp Asp Ile Lys Arg Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Asp Leu Arg Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Gln Ile Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala
100 105 110
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Val Glu Gly Ser Tyr Ser Ser Ser Tyr
115 120 125
Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
145 150 155 160
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
165 170 175
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
180 185 190
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
195 200 205
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr
210 215 220
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
225 230 235 240
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
340 345 350
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Gly Lys
465
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 31
Thr Ser Gly Met Gly Val Gly
1 5
<210> 32
<211> 16
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 32
His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 33
<211> 13
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 33
Ile Glu Gly Asp Thr Tyr Tyr Asp Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 34
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala Val Val
1 5 10
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 35
Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> Balb/c mouse
<400> 36
Gln Gln His Tyr Ser Ile Pro Trp Thr
1 5
<210> 37
<211> 234
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> VL domain of monoclonal antibody 13E2, and a wild-type human Ig
kappa (IgK) chain C portion
<400> 37
Met Val Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
1 5 10 15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Pro His Lys Phe Met Ser
20 25 30
Thr Ser Val Glu Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Val Ile Phe Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Val Ser Gly Val Pro Asp
65 70 75 80
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
100 105 110
Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 38
<211> 525
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp
1 5 10 15
Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val
20 25 30
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile
35 40 45
Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln
50 55 60
His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu
65 70 75 80
Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro
85 90 95
Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly
100 105 110
Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln
115 120 125
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala
130 135 140
Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser
180 185 190
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln
195 200 205
Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser
210 215 220
Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly
225 230 235 240
Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn
245 250 255
Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala
260 265 270
Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val
275 280 285
Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu
305 310 315 320
Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His
325 330 335
Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr
340 345 350
Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu
355 360 365
Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser
370 375 380
Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala
385 390 395 400
Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln
405 410 415
Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser
420 425 430
Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly
435 440 445
His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu
450 455 460
Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro
465 470 475 480
Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln
485 490 495
Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro
500 505 510
Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln Leu
515 520 525
<210> 39
<211> 91
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg
1 5 10 15
Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe
20 25 30
Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val
35 40 45
Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln
50 55 60
Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln
65 70 75 80
Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr
85 90
<210> 40
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His
1 5 10 15
Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr
20 25 30
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Hemagglutinin epitope tag
<400> 41
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> FLAG epitope tag
<400> 42
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> c-myc epitope tag
<400> 43
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> His5 affinity domain
<400> 44
His His His His His
1 5
<210> 45
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HisX6 affinity domain
<400> 45
His His His His His His
1 5
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> c-myc affinity domain
<400> 46
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 47
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> StrepTag affinity domain
<400> 47
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 48
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Affinity domain
<400> 48
Arg Tyr Ile Arg Ser
1 5
<210> 49
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Affinity domain
<400> 49
Phe His His Thr
1
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Affinity domain
<400> 50
Trp Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Cys Cys Arg Glu Cys Cys Ala Arg
1 5 10 15
Ala
<210> 51
<211> 82
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu
1 5 10 15
Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser
20 25 30
Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala
35 40 45
Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln
50 55 60
Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser
65 70 75 80
Pro Gly
<210> 52
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 52
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser
20 25
<210> 53
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 53
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 54
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 54
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Ile Leu Asn
1 5 10 15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 55
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 56
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 56
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser
20 25
<210> 57
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 57
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 58
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 58
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1 5 10 15
Met Ala Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 59
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 59
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 60
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 60
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Thr Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser
20 25
<210> 61
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 61
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val Thr
1 5 10
<210> 62
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 62
Arg Val Thr Ile Arg Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ala Leu Thr
1 5 10 15
Met Thr Asn Met Asp Pro Leu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 63
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 63
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 64
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 64
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser
20 25
<210> 65
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 65
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Thr Leu Glu Trp Leu Thr
1 5 10
<210> 66
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 66
Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1 5 10 15
Met Thr Asn Met Asp Pro Leu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 67
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 67
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 68
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 68
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys
20
<210> 69
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 69
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 70
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 70
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 71
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 71
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 72
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 72
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 73
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 73
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Phe
1 5 10 15
<210> 74
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 74
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Leu Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 75
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 75
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 76
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 76
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 77
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 77
Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 78
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 78
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 79
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 79
Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Asp Ile Lys
1 5 10
<210> 80
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 80
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys
20
<210> 81
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 81
Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 82
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 82
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asp Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 83
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 83
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 84
<211> 469
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Heavy chain amino acid sequences of humanized 13E2 monoclonal
antibody
<400> 84
Met Gly Trp Thr Leu Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys
20 25 30
Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Ser Thr Ser Gly Met Gly Leu Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
50 55 60
Thr Leu Glu Trp Leu Thr His Ile Trp Trp Asp Asp Ile Lys Arg Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Asp Leu Arg Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys
85 90 95
Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Leu Asp Thr Gly
100 105 110
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Val Glu Gly Ser Tyr Ser Ser Ser Tyr
115 120 125
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
145 150 155 160
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
165 170 175
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
180 185 190
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
195 200 205
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr
210 215 220
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
225 230 235 240
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
340 345 350
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Gly Lys
465
<210> 85
<211> 234
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Light chain amino acid sequence of humanized 13E2 monoclonal
antibody
<400> 85
Met Val Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
1 5 10 15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Val Ile Phe Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Val Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
100 105 110
Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Asp Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<---
1. Выделенное агонистическое антитело против гена активации лимфоцитов-3 (LAG-3) или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с LAG-3 и ингибирует: антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток и/или антиген-индуцированную активацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток, которое содержит:
определяющие комплементарность участки (CDR) вариабельной области тяжелой цепи (VH) антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и CDR-участки вариабельной области легкой цепи (VL) антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; или
CDR-участки VH-области антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и CDR-участки VL-области антитела, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
2. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, которое ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ Т-клеток и антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток.
3. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, которое ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD8+ Т-клеток больше, чем антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ Т-клеток.
4. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, отличающееся тем, что ингибирование антиген-индуцированной пролиферации CD8+ Т-клеток является зависимым от LAG-3 и независимым от IL-2.
5. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое ингибирует антиген-индуцированную пролиферацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток, и антиген-индуцированную активацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток.
6. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое связывается с LAG-3 с более высокой аффинностью, чем моноклональное антитело 17В4.
7. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое ингибирует связывание LAG-3 или IMP321 с МНС класса II-положительными клетками.
8. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое ингибирует LAG-3-индуцированную активацию антигенпредставляющих клеток (АРС) или IMP321-индуцированную активацию моноцитов.
9. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое связывается с эпитопом LAG-3, который перекрывается с участком связывания МНС класса II LAG-3.
10. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, отличающееся тем, что CDR-участки VH-области антитела выбраны из CDR-участков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 21, 22 и 23, и CDR-участки VL-области антитела выбраны из CDR-участков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, 5, 6, 24, 25 и 26.
11. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 10, которое содержит VH-область антитела, содержащую CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, при этом CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21, и/или CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22, и/или CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23.
12. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 11, отличающееся тем, что:
CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21, и CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22;
CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23;
CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; или
CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21, CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23.
13. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое содержит VL-область антитела, содержащую CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, отличающееся тем, что CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24, и/или CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25, и/или CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26.
14. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 13, отличающееся тем, что:
CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24, и CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25;
CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26;
CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; или
CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24, CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26.
15. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 11-14, отличающееся тем, что CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21, CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и/или CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24, CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26.
16. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, отличающееся тем, что:
CDR-участки VH-области антитела представляют собой CDR-участки аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 и 3, CDR-участки VL-области антитела представляют собой CDR-участки аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, 5 и 6; или
CDR-участки VH-области антитела представляют собой CDR-участки аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21, 22 и 23, и CDR-участки VL-области антитела представляют собой CDR-участки аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24, 25 и 26.
17. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое содержит:
VH-область антитела с CDR-участками, содержащими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2 и 3, и/или VL-область антитела с CDR-участками, содержащими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4, 5 и 6; или
VH-область антитела с CDR-участками, содержащими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 21, 22 и 23, и/или VL-область антитела с CDR-участками, содержащими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 24, 25 и 26.
18. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое содержит VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, и/или VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8.
19. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 18, которое содержит:
VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, и VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8;
VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, и VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8;
VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8; или
VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
20. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-19, отличающееся тем, что CDR-участки VH-области антитела выбраны из CDR-участков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, 12, 13, 31, 32 и 33, и CDR-участки VL-области антитела выбраны из CDR-участков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14, 15, 16, 34, 35 и 36.
21. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 20, которое содержит VH-область антитела, содержащую CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, отличающееся тем, что CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31, и/или CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32, и/или CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33.
22. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 21, отличающееся тем, что:
CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31, и CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32;
CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33;
CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; или
CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31, CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33.
23. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 20-22, которое содержит VL-область антитела, содержащую CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, при этом CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34, и/или CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35, и/или CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36.
24. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 23, отличающееся тем, что:
CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34, и CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35;
CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36;
CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36; или
CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34, CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36.
25. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 21-24, отличающееся тем, что CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31, CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; и/или CDR1 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34, CDR2 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35, и CDR3 VL имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36.
26. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 20-25, отличающееся тем, что:
CDR-участки VH-области антитела представляют собой CDR-участки аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, 12 и 13, и CDR-участки VL-области антитела представляют собой CDR-участки аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14, 15 и 16; или
CDR-участки VH-области антитела представляют собой CDR-участки аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31, 32 и 33, и CDR-участки VL-области антитела представляют собой CDR-участки аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34, 35 и 36.
27. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое содержит:
VH-область антитела с CDR-участками, содержащими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11, 12 и 13, и/или VL-область антитела с CDR-участками, содержащими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 14, 15 и 16; или
VH-область антитела с CDR-участками, содержащими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 31, 32 и 33, и/или VL-область антитела с CDR-участками, содержащими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 34, 35 и 36.
28. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое содержит VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17, и/или VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18.
29. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 28, которое содержит:
VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17, и VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18;
VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентичная аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17, и VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18;
VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18; или
VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
30. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое представляет собой гуманизированное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
31. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое содержит гуманизированную каркасную область легкой цепи.
32. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 31, отличающееся тем, что гуманизированная каркасная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность с любыми из аминокислотных замен, показанных для VL1, VL2, VL3 или VL4 в таблице ниже:
33. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 31 или 32, отличающееся тем, что гуманизированная каркасная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 68-83.
34. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 33, которое содержит:
каркасную область 1 VL (FR1 VL) последовательности SEQ ID NO: 68; FR2 VL последовательности SEQ ID NO: 69; FR3 VL последовательности SEQ ID NO: 70; и FR4 VL последовательности SEQ ID NO: 71;
каркасную область 1 VL (FR1 VL) последовательности SEQ ID NO: 72; FR2 VL последовательности SEQ ID NO: 73; FR3 VL последовательности SEQ ID NO: 74; и FR4 VL последовательности SEQ ID NO: 75;
каркасную область 1 VL (FR1 VL) последовательности SEQ ID NO: 76; FR2 VL последовательности SEQ ID NO: 77; FR3 VL последовательности SEQ ID NO: 78; и FR4 VL последовательности SEQ ID NO: 79; или
каркасную область 1 VL (FR1 VL) последовательности SEQ ID NO: 80; FR2 VL последовательности SEQ ID NO: 81; FR3 VL последовательности SEQ ID NO: 82; и FR4 VL последовательности SEQ ID NO: 83.
35. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 31-34, которое содержит VL-область антитела, содержащую:
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; CDR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и 34; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16 и 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83;
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83; или
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83.
36. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое содержит гуманизированную каркасную область тяжелой цепи.
37. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 36, отличающееся тем, что гуманизированная каркасная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность с любыми из аминокислотных замен, показанных для VH1, VH2, VH3 или VH4 в таблице ниже:
38. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 36 или 37, отличающееся тем, что гуманизированная каркасная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 52-67.
39. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 38, которое содержит:
каркасную область 1 VH (FR1 VH) последовательности SEQ ID NO: 52; FR2 VH последовательности SEQ ID NO: 53; FR3 VH последовательности SEQ ID NO: 54; и FR4 VH последовательности SEQ ID NO: 55;
каркасную область 1 VH (FR1VH) последовательности SEQ ID NO: 56; FR2 VH последовательности SEQ ID NO: 57; FR3 VH последовательности SEQ ID NO: 58; и FR4 VH последовательности SEQ ID NO: 59;
каркасную область 1 VH (FR1 VH) последовательности SEQ ID NO: 60; FR2 VH последовательности SEQ ID NO: 61; FR3 VH последовательности SEQ ID NO: 62; и FR4 VH последовательности SEQ ID NO: 63; или
каркасную область 1 VH (FR1 VH) последовательности SEQ ID NO: 64; FR2 VH последовательности SEQ ID NO: 65; FR3 VH последовательности SEQ ID NO: 66; и FR4 VH последовательности SEQ ID NO: 67.
40. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 36-39, которое содержит VH-область антитела, содержащую:
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21; a FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11 и 31; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 12 и 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13 и 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67;
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67; или
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67.
41. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое содержит:
VH-область антитела, содержащую: FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21; FR2 VH имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67; и VL-область антитела, содержащую: FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79.
42. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое содержит:
VH-область антитела, содержащую: FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67; и VL-область антитела, содержащую: FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79.
43. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое содержит:
VH-область антитела, содержащую: FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67; и VL-область антитела, содержащую: FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79.
44. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое представляет собой молекулу химерного антитела или его антигенсвязывающий фрагмент.
45. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 44, которое содержит аминокислотную последовательность человеческой константной области.
46. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое лишено комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) и антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC).
47. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое связывается с человеческим белком LAG-3 с константой диссоциации (KD), составляющей не более 100 пМ, не более 90 пМ, не более 80 пМ, не более 70 пМ, не более 60 пМ, не более 50 пМ, не более 40 пМ, не более 30 пМ или не более 25 пМ, например, как определено с помощью анализа Biacore.
48. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 47, которое связывается с человеческим белком LAG-3Ig с константой диссоциации (Kd), составляющей не более 100 пМ, не более 90 пМ, не более 80 пМ, не более 70 пМ, не более 60 пМ, не более 50 пМ, не более 40 пМ, не более 30 пМ или не более 25 пМ, например, как определено с помощью анализа Biacore.
49. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту, которое не связывается с последовательностью внешней петли, состоящей из 30 аминокислот SEQ ID NO: 40, первого N-концевого домена D1 человеческого белка LAG-3.
50. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-19, 30-38 или 46-49, которое содержит:
VL-область антитела, содержащую:
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79; и
VH-область антитела, содержащую:
FR1 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; CDR1 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и 21; FR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR2 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и 22; FR3 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; CDR3 VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3 и 23; и FR4 VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55; или
модифицированный вариант указанного антитела или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит одну или более аминокислотных замен, что приводит в результате к уничтожению одного или более сайтов гликозилирования каркаса вариабельных областей, чтобы тем самым устранить гликозилирование по этому сайту.
51. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-19, 30-38 или 46-49, которое содержит:
VL-область антитела, содержащую:
FR1 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; CDR1 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 и 24; FR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; CDR2 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 5 и 25; FR3 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; CDR3 VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6 и 26; и FR4 VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79; и
VH-область антитела, содержащую:
CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, при этом CDR1 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:l и 21, CDR2 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:2 и 22, и CDR3 VH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:3 и 23; и гуманизированную каркасную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 52-67.
52. Выделенное агонистическое антитело против гена активации лимфоцитов-3 (LAG-3), или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с LAG-3 и ингибирует: антиген-индуцированную пролиферацию CD4+и/или CD8+Т-клеток и/или антиген-индуцированную активацию CD4+ и/или CD8+ Т-клеток, которое содержит:
вариабельную область тяжелой цепи (VH) антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:7, и вариабельную область легкой цепи (VL) антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:8; или
VH-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 17, и VL-область антитела, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18.
53. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому предшествующему пункту.
54. Нуклеиновая кислота по п. 53, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 9, 10, 19 или 20, или нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична нуклеотидной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 9, 10, 19 или 20.
55. Рекомбинантный экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 53 или 54.
56. Рекомбинантная клетка для получения антитела, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 53 или 54, или рекомбинантный экспрессионный вектор по п. 55.
57. Фармацевтическая композиция для лечения опосредованного Т-клетками иммунного нарушения, содержащая эффективное количество выделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-52 и фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательное вещество или разбавитель.
58. Применение выделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-52 или фармацевтической композиции по п. 57 в лечении опосредованного Т-клетками иммунного нарушения, выбранного из воспалительного заболевания и аутоиммунного нарушения.
59. Применение выделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-52 или фармацевтической композиции по п. 57 в изготовлении лекарственного средства для лечения опосредованного Т-клетками иммунного нарушения, выбранного из воспалительного заболевания и аутоиммунного нарушения.
60. Способ лечения опосредованного Т-клетками иммунного нарушения, выбранного из воспалительного заболевания и аутоиммунного нарушения, который включает введение эффективного количества выделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-52 или фармацевтической композиции по п. 57 субъекту, нуждающемуся в таком лечении.
61. Применение по п. 58 или 59, отличающееся тем, что опосредованное Т-клетками иммунное нарушение выбрано из группы, состоящей из инфекций, эндотоксического шока, связанного с инфекцией, сепсиса, артрита, ревматоидного артрита, астмы, COPD (хронической обструктивной болезни легких), воспалительного заболевания органов малого таза, болезни Альцгеймера, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, болезни Пейрони, глютеновой болезни, заболевания желчного пузыря, пилонидальной болезни, перитонита, псориаза, васкулита, послеоперационных спаек, инсульта, диабета типа I, болезни Лайма, артрита, менингоэнцефалита, аутоиммунного увеита, иммуно-опосредованных воспалительных нарушений центральной и периферической нервной системы, такой как множественный склероз, красная волчанка и синдром Гийена-Барре, атопического дерматита, аутоиммунного гепатита, фиброзирующего альвеолита, заболевания Грейвса, IgA-нефропатии, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, синдрома Меньера, пузырчатки, первичного билиарного цирроза, саркоидоза, склеродермии, синдром Вегенера, других аутоиммунных нарушений, панкреатита, травмы, реакции «трансплантат против хозяина», отторжения трансплантата, заболевания сердца, включая ишемические заболевания, такие как инфаркт миокарда, а также атеросклероз, внутрисосудистого свертывания, резорбции кости, остеопороза, остеоартрита, периодонтита и гипохлоргидрии или бесплодия, связанного с отсутствием фетально-материнской толерантности.
62. Применение по п. 61, отличающееся тем, что инфекции представляют собой вирусные, бактериальные, грибковые или паразитарные инфекции, или что волчанка представляет собой системную красную волчанку, или что травма представляет собой травму хирургического вмешательства.
63. Способ по п. 60, отличающийся тем, что опосредованное Т-клетками иммунное нарушение выбрано из группы, состоящей из инфекций, эндотоксического шока, связанного с инфекцией, сепсиса, артрита, ревматоидного артрита, астмы, COPD (хронической обструктивной болезни легких), воспалительного заболевания органов малого таза, болезни Альцгеймера, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, болезни Пейрони, глютеновой болезни, заболевания желчного пузыря, пилонидальной болезни, перитонита, псориаза, васкулита, послеоперационных спаек, инсульта, диабета типа I, болезни Лайма, артрита, менингоэнцефалита, аутоиммунного увеита, иммуно-опосредованных воспалительных нарушений центральной и периферической нервной системы, такой как множественный склероз, красная волчанка и синдром Гийена-Барре, атопического дерматита, аутоиммунного гепатита, фиброзирующего альвеолита, заболевания Грейвса, IgA-нефропатии, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, синдрома Меньера, пузырчатки, первичного билиарного цирроза, саркоидоза, склеродермии, синдром Вегенера, других аутоиммунных нарушений, панкреатита, травмы, реакции «трансплантат против хозяина», отторжения трансплантата, заболевания сердца, включая ишемические заболевания, такие как инфаркт миокарда, а также атеросклероз, внутрисосудистого свертывания, резорбции кости, остеопороза, остеоартрита, периодонтита и гипохлоргидрии или бесплодия, связанного с отсутствием фетально-материнской толерантности.
64. Способ по п. 63, отличающиеся тем, что инфекции представляют собой вирусные, бактериальные, грибковые или паразитарные инфекции, или что волчанка представляет собой системную красную волчанку, или что травма представляет собой травму хирургического вмешательства.
