Аутоиммунный ингибитор и его применение

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены антитело или его функциональный фрагмент, специфически связывающиеся с IL-4Rα. Также предложены молекула нуклеиновой кислота, кодирующая антитело по изобретению, экспрессионный вектор и клетка для экспрессии указанного антитела или его функционального фрагмента. Также изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело по изобретению, и к применению антитела для лечения аллергических заболеваний, астмы или хронического обструктивного заболевания легких у млекопитающих. Изобретение обеспечивает специфическое высокоаффинное связывание с IL-4Rα и ингибирование, нацеленное на интерлейкин-4 и интерлейкин-13 человека. 7 н. и 6 з.п. ф-лы, 22 ил., 1 табл.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антителу с двойным ингибированием, которое нацелено на интерлейкин-4 и интерлейкин-13, к способу его получения и к его применению.

Предшествующий уровень техники

Интерлейкин-4 (IL-4) является ключевым движущим фактором для иммунных ответов, опосредованных хелперными клетками Th2. Эозинофильные гранулоциты, базофильные гранулоциты, тучные клетки или врожденные лимфоидные клетки секретируют IL-4 после активации иммуногенами, IL-4 может индуцировать антиген-активированные наивные Т-клетки дифференцироваться в клетки Th2. Клетки Th2 экспрессируют цитокины, такие как IL-4, IL-5 и IL-13, а IL-4 действует на сами клетки Th2, которые могут образовывать петлю, усиливающую и активирующую эффект.

IL-4 и IL-13 проявляют биологическую активность, связываясь со специфическими рецепторами на поверхности клетки и передавая сигналы внутрь клетки. Действуя на В-клетки, IL-4 и IL-13 могут усиливать экспрессию антигенов МНС класса II и усиливать способность В-клеток презентировать антигены, что заставляет иммунную систему вызывать врожденный иммунный ответ на стимуляцию небольшими количествами антигенов, и индуцирует переключение класса антител в B-клетках, продуцируя IgG1 и IgE. Связывание IL-4 и IgE с тучными клетками приводит к активации тучных клеток с высвобождением гистаминов, серотонинов и т.д. Эозинофильные гранулоциты могут быть рекрутированы и активированы IL-4, IL-5 и IL-13, секретируемыми клетками Th2. IL-13 действует на эпителиальные клетки и клетки гладких мышц, приводя к пролиферации эпителиальных бокаловидных клеток дыхательных путей и сокращению гладких мышц.

IL-4Rα (Uniprot P24394), трансмембранный белок типа I с молекулярной массой приблизительно 140 кДа, является корецептором для IL-4 и IL-13. IL-4 связывается с IL-4Rα с высокой аффинностью и образует комплекс с γc на поверхности клетки, который передает сигнал через γc и называется рецепторным комплексом типа I IL-4Rα/IL-4Rγc; в отличие от IL-4, IL-13 связывается с IL-13Rα1 с низкой аффинностью, а затем связывается с IL-4Rα с образованием рецептора с высокой аффинностью, который передает сигнал через IL-13Rα1 и упоминается как рецепторный комплекс IL-4Rα/IL-13Rα1 II типа. IL-4 может функционировать через рецепторы типа I и рецепторы типа II, тогда как IL-13 может функционировать только через рецепторы типа II. Различия в экспрессии на эффекторных клетках между рецепторами типа I и рецепторами типа II приводят к тому, что IL-4 и IL-13 вызывают частичное перекрывание биологических эффектов и их соответствующих специфических функций.

Интерлейкин (IL) -13 считается ключевым медиатором воспаления на основе хелперных Т-клеток типа 2 (Th2), а повышенный уровень IL-13 связан с различными заболеваниями, включая, без ограничения указанным, астму, воспалительная болезнь кишечника, идиопатический легочный фиброз (IPF), хроническая обструктивная болезнь легких (COPD), атопический дерматит и другие (Oh CK et al., Eur Respir Rev 19: 46-54 (2010); Fahy JV et al., Nat Rev Immunol 15 : 57-65 [2015]). IL-13 продуцируется рядом типов клеток, включая клетки Th2, базофильные гранулоциты, эозинофильные гранулоциты, тучные клетки, эпителиальные клетки дыхательных путей и врожденные лимфоидные клетки типа 2. IL-13 связывается с гетеродимерным рецептором IL-4Rα/IL-13Rα1, который также является рецептором для IL-4, и активирует сигнальный путь STAT-6 (Hershey GK, J Allergy Clin Immunol 111 (4): 677-90 [2003]). В некоторых случаях IL-13 ассоциируется с клиническими проявлениями астмы, включая продуцирование слизи, субэпидермальный фиброз, продуцирование IgE, гиперплазию гладких мышц, а также рекрутирование и активацию воспалительных клеток (Hershey GK, J Allergy Clin Immunol 111 (4): 677 -90 [2003]; Fahy JV et al., Nat Rev Immunol 15: 57-65 [2015]). Поскольку воспаление Th2 включает активность нескольких типов клеток, отличных от клеток Th2, включая врожденные лимфоидные клетки 2-го типа (ILC2), «воспаление Th2» в последнее время в научной литературе называют «воспалением 2-го типа». Помимо клеток Th2, ILC2 также были идентифицированы как важный источник цитокинов, таких как IL-5 и IL-13. Поэтому цитокины, такие как IL-13 и IL-5, которые ранее были идентифицированы как цитокины Th2, теперь также упоминаются как цитокины типа 2 в научной литературе. Аналогичным образом, болезненные состояния, связанные с такими цитокинами, теперь также называют заболеваниями, вызванными типом 2, или заболеваниями, связанными с типом 2. См., например, Noonan et al., J. Allergy Clin Immunol., 132 (3): 567-574 (2013); Hanania et al., Thorax 70 (8): 748-56 (2015); и Cai et al., Bioanalysis 8 (4): 323-332 (2016). Например, термин «астма 2 типа», используемый в научной литературе, отражает эволюционный процесс понимания астмы и характеризуется высоким уровнем интерлейкинов (включая IL-5 и IL-13) в ткани легких. Следовательно, «Th2» и «тип 2» используются в данном документе взаимозаменяемо.

Астма - это хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей. Пациенты с астмой имеют гиперчувствительность дыхательных путей и различную степень обратимой обструкции дыхательных путей, а длительные периодические приступы вызывают ремоделирование дыхательных путей (с участием коллагеновых волокон и гладких мышц), что приводит к утолщению дыхательных путей и стенозу, что приводит к обструктивной эмфиземе. Около 50% пациентов с тяжелой астмой имеют воспалительную реакцию II типа, опосредованную клетками Th2. По сравнению с нормальным человеком, у пациентов с астмой повышены уровни IL-4 и IL-13 в сыворотке или биопсиях бронхов. Установлено, что после стимуляции аллергенами уровни IL-4 и IL-13 увеличиваются в жидкости бронхоальвеолярного лаважа у пациентов с астмой. Вдыхание IL-4 у пациентов с аллергической астмой может вызывать характерные симптомы астмы, такие как гиперчувствительность дыхательных путей и увеличение количества эозинофильных гранулоцитов в мокроте. Исследования показывают, что возникновение аллергической астмы тесно связано с соотношением дисбаланса клеток Th1/Th2-типа, в результате чего вырабатывается избыточный цитокин IL-4. IL-4 является единственным цитокином, который определяет дифференцировку Th1 в клетки Th2 и способствует синтезу IgE В-клетками, тогда как IL-13 является доминирующим партнером, который запускает гиперреактивность дыхательных путей, ремоделирование дыхательных путей и избыточную секрецию слизи (Annu Rev Immunol, Wynn et al., 2003).

Эозинофильные гранулоциты присутствуют в периферической крови пациентов с атопическим дерматитом, а молекулы, связанные с активацией пути Th2, обнаруживаются в неповрежденной коже пациентов с атопическим дерматитом, но не в нормальной коже здоровых контролей. Кроме того, уровень тимус-ассоциированного регуляторного хемокина CCL17 повышен в сыворотке пациентов с атопическим дерматитом, а CCL17 представляет собой индуцированный IL-4 и IL-13 хемокин, который избирательно индуцирует активацию Т-клеток. Терапия широкого спектра, такая как местные кортикостероиды и пероральный циклоспорин А, может вызвать быстрое снижение уровней TARC, что тесно связано с тяжестью атопического дерматита, демонстрируя, что потенциальное воспаление II типа приводит к атопическому дерматиту при заболевании. Атопический дерматит обычно осложняется другими аллергическими заболеваниями, такими как аллергический ринит и астма.

Считается, что патогенез атопического ринита является Th2-опосредованной аллергией на распространенные аллергены, такие как пыльца, плесень и клещи домашней пыли. По сравнению с контрольной группой более молодые группы с сезонным атопическим ринитом имеют повышенный уровень IL-4 в назальном лаваже. Уровни IL-4 и IL-13 повышены в назальных тучных клетках у пациентов с многолетним атопическим ринитом по сравнению с носовыми тучными клетками у пациентов с хроническим инфекционным ринитом. IL-4 индуцирует активацию мРНК Fc RI и экспрессию белка клеточной поверхности в назальных тучных клетках. Атопический ринит может развиться в хронический синусит, сопровождающийся полипами в носу, и полипы в носу также имеют ответ Th2-типа, что приводит к повышенным уровням эозинофильных гранулоцитов, IL-5, IgE и хемокинов эозинофильных гранулоцитов в тканях. Слизистая оболочка пациентов с хроническим синуситом с носовыми полипами содержит больше врожденных лимфоидных клеток ILC2, чем слизистая у пациентов с хроническим синуситом без носовых полипов или с нормальной слизистой оболочкой, где врожденные лимфоидные клетки ILC2 секретируют высокие уровни IL-13 при стимуляции IL- 33.

Хроническая обструктивная болезнь легких - это обструктивная болезнь легких, характеризующаяся значительным легочным и системным воспалением. У пациентов воспаление в большинстве дыхательных путей пациентов приводит к хроническому бронхиту и воспалению в малых дыхательных путях, что приводит к уменьшению просвета и увеличению сопротивления воздушному потоку. В отличие от астмы ограничение воздушного потока при хронической обструктивной болезни легких необратимо. Исследования показали, что лимфоциты, полученные из бронхоальвеолярного лаважа у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких, имеют смешанный фенотип. По сравнению с пациентами с нехронической обструктивной болезнью легких пациенты с хронической обструктивной болезнью легких имеют более высокую долю IL-4 + CD4, IL-4 + CD8 и IL-13 + CD8 T-клеток. У 30% пациентов с острым обострением хронической обструктивной болезни легких есть респираторные вирусы, 77% из которых представляют собой риновирусы, и риновирусы являются важной причиной, вызывающей обострение хронической обструктивной болезни легких. Пациенты, испытывающие ухудшение хронической обструктивной болезни легких, имеют ответы Th1 и Th2 в легких и периферической крови; IFNγ не экспрессируется повсеместно у этих пациентов, что не имеет существенных различий по сравнению с пациентами в стабильной фазе и контрольной группе; напротив, у этих пациентов IL-4 экспрессируется повсеместно, что вызывает повышенную регуляцию по сравнению с пациентами в стабильной фазе и контрольной группе. Исследования показали, что контроль уровня эозинофильных гранулоцитов может принести очень значительную клиническую пользу пациентам с хронической обструктивной болезнью легких, уменьшая ухудшение на 62%. Использование берализумаба у пациентов с эозинофильными гранулоцитами > 200 на микролитр может эффективно удалить эозинофильные гранулоциты у пациентов, уменьшить симптомы острого обострения хронической обструктивной болезни легких и улучшить показатели FEV1 и симптомов (Brightling CE et al., Lancet Respir Med. 2014). Астма/хроническая обструктивная болезнь легких в настоящее время признаны болезнью с двумя ключевыми аспектами, астмой и хронической обструктивной болезнью легких.

Принимая во внимание эффект и функцию IL-4Rα и IL-13 при различных связанных заболеваниях, в данной области техники остается потребность в разработке улучшенных анти-IL-4Rα-специфических антител, подходящих для лечения пациентов.

Сущность изобретения

Путем обширных, глубоких исследований и массового скрининга авторы изобретения неожиданно получили анти-IL-4Rα антитело, обладающее исключительно высокой аффинностью и специфичностью, и гуманизированное антитело, полученное на основе данного анти-IL-4Rα антитела. Антитело по настоящему изобретению способно связывать антигены IL-4Rα с высокой специфичностью и высокой аффинностью и значительно ингибирует связывание IL-4Rα с IL-4 и IL-4Rα с IL-13. Кроме того, антитело по настоящему изобретению не имеет видимых побочных эффектов у млекопитающих. Настоящее изобретение было выполнено на основе вышеизложенного.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, которые специфически связываются с IL-4Rα.

Антитело или его функциональный фрагмент в соответствии с предшествующим аспектом, включающее CDR тяжелой цепи, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-4, 12-14, 22-24, 32-34, 42-44, 52 -54, 62-64, 72-74, 82-84, 92-94, 102-104, 112-114, 122-124, 132-134, 142-144, 152-154, 162-164, 172-174, 177-179, 182-184, 187-189, 192-194, 197-199, 202-204 и 207-209 или любого их варианта, и/или CDR легкой цепи, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 7-9, 17-19, 27-29, 37-39, 47-49, 57-59, 67-69, 77-79, 87-89, 97-99, 107-109, 117-119, 127 -129, 137-139, 147-149, 157-159, 167-169, 212-214, 217-219, 222-224, 227-229 или любого их варианта.

Антитело или его функциональный фрагмент по любому из предшествующих аспектов, включающее CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2, 12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 177, 182, 187, 192, 197, 202, 207 или любой их вариант, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, 133, 143, 153, 163, 173, 178, 183, 188, 193, 198, 203, 208 или любого их варианта, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 4, 14, 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 179, 184, 189, 194, 199, 204, 209 или любого их варианта; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 212, 217, 222, 227 или любого их варианта, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 8, 18, 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 213, 218, 223, 228 или любого их варианта, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 9, 19, 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 214, 219, 224, 229 или любого их варианта.

Антитело или его функциональный фрагмент по любому из предшествующих аспектов, включающее вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 176, 181, 186, 191, 196, 201, 206 или любого их варианта и/или вариабельной области легкой цепи, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 6, 16, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106, 116, 126, 136, 146, 156, 166, 211, 216, 221, 226 или любого их варианта.

Антитело или его функциональный фрагмент по любому из предшествующих аспектов, включающее вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 171, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 221, или любой ее вариант.

Антитело или его функциональный фрагмент по любому из предшествующих аспектов, включающее вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 176, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 221, или любой ее вариант.

Антитело или его функциональный фрагмент по любому из предшествующих аспектов, включающее вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 196, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 211, или любой ее вариант.

Антитело или его функциональный фрагмент по любому из предшествующих аспектов, включающее вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 196, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 216, или любой ее вариант.

Антитело или его функциональный фрагмент по любому из предшествующих аспектов, где антитело представляет собой фрагмент антитела.

Антитело или его функциональный фрагмент по любому из предшествующих аспектов, где антитело или его функциональный фрагмент ингибирует взаимодействие hIL-4 с hIL-4Rα; предпочтительно антитело или его функциональный фрагмент также ингибирует связывание hIL-4Rα с комплексом hIL-13Rα/hIL-13.

Антитело или его функциональный фрагмент по любому из предшествующих аспектов, где антитело или его функциональный фрагмент гуманизированы.

Антитело или его функциональный фрагмент, имеющие, по меньшей мере, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности к антителу или его функциональному фрагменту по любому из предшествующих аспектов.

Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его функциональный фрагмент по любому из предшествующих аспектов, или молекула нуклеиновой кислоты, имеющая, по меньшей мере, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с ней.

Вектор, включающий нуклеиновую кислоту по любому из предшествующих аспектов.

Клетка, содержащая вектор по любому из предшествующих аспектов.

Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его функциональный фрагмент или нуклеиновую кислоту, кодирующую его по любому из предшествующих аспектов, и фармацевтически приемлемый носитель.

Способ лечения аллергических заболеваний у млекопитающего, включающий стадию введения млекопитающему терапевтически эффективного количества антитела или его функционального фрагмента, или молекулы нуклеиновой кислоты, или вектора, или клетки, или фармацевтической композиции по любому из предшествующих аспектов.

Способ лечения рака, включающий стадию введения млекопитающему терапевтически эффективного количества антитела или его функционального фрагмента, или молекулы нуклеиновой кислоты, или вектора, или клетки, или фармацевтической композиции по любому из предшествующих аспектов.

Способ лечения астмы у млекопитающего, включающий стадию введения млекопитающему терапевтически эффективного количества антитела или его функционального фрагмента, или молекулы нуклеиновой кислоты, или вектора, или клетки, или фармацевтической композиции по любому из предшествующих аспектов.

Способ лечения хронического обструктивного заболевания легких у млекопитающего, включающий стадию введения млекопитающему терапевтически эффективного количества антитела или его функционального фрагмента, или молекулы нуклеиновой кислоты, или вектора, или клетки, или фармацевтической композиции по любому из предшествующих аспектов.

Способ лечения заболеваний, связанных с аномальной выработкой IL-4 и/или IL-13 у млекопитающего, включающий стадию введения млекопитающему терапевтически эффективного количества антитела или его функционального фрагмента или молекулы нуклеиновой кислоты, или вектора, или клетки, или фармацевтической композиции по любому из предшествующих аспектов.

Способ ингибирования TH-2-опосредованного ответа у млекопитающего, включающий стадию введения млекопитающему терапевтически эффективного количества антитела или его функционального фрагмента, или молекулы нуклеиновой кислоты, или вектора, или клетки, или фармацевтической композиции по любому из предшествующих аспектов.

Применение антитела или его функционального фрагмента, или молекулы нуклеиновой кислоты, или вектора, или клетки, или фармацевтической композиции по любому из предшествующих аспектов при приготовлении лекарственного средства для лечения аллергических заболеваний у млекопитающего.

Применение антитела или его функционального фрагмента, или молекулы нуклеиновой кислоты, или вектора, или клетки, или фармацевтической композиции по любому из предшествующих аспектов при приготовлении лекарственного средства для лечения астмы у млекопитающего.

Применение антитела или его функционального фрагмента, или молекулы нуклеиновой кислоты, или вектора, или клетки, или фармацевтической композиции по любому из предшествующих аспектов при приготовлении лекарственного средства для лечения хронической обструктивной болезни легких у млекопитающего.

Применение антитела или его функционального фрагмента, или молекулы нуклеиновой кислоты, или вектора, или клетки, или фармацевтической композиции по любому из предшествующих аспектов при приготовлении лекарственного средства для лечения заболеваний, связанных с аномальным продуцированием IL- 4 и/или IL-13.

Применение антитела или его функционального фрагмента, или молекулы нуклеиновой кислоты, или вектора, или клетки, или фармацевтической композиции по любому из предшествующих аспектов при получении лекарственного средства для лечения опосредованного TH-2 ответа у млекопитающего.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1А показано, что белок внеклеточной области IL-4Rα человека имеет размер приблизительно 40 килодальтон; на фигуре 1В показано, что белок внеклеточной области IL-4Rα яванского макака имеет размер приблизительно 40 килодальтон; на фигуре 1C показано, что белок IL-4 человека имеет размер приблизительно 20 килодальтон; и на фигуре 1D показано, что белок внеклеточной области человеческого IL-13Rα1 имеет размер приблизительно 55 килодальтон.

На фигуре 2 показаны моноклональные клетки HEK293, стабильно экспрессирующие hIL-4Rα.

Фигура 3А показывает, что титры антител в сыворотке 5 иммунизированных мышей могут все достигать 1: 819200; на фигуре 3В показано, что антитела в сыворотке иммунизированных мышей #3 и #4 могут ингибировать связывание человеческих рецепторов IL-4 и IL-4; на фигуре 3C показано, что все антитела, предварительно подвергнутые скринингу с помощью ELISA, специфически связываются со стабильно трансфицированными клетками HEK293, экспрессирующими IL-4Rα; на фигуре 3D показано, что 15 антител в положительных колониях, предварительно подвергнутых скринингу с помощью ELISA, могут ингибировать связывание стабильно трансфицированных клеток, экспрессирующих hIL-4Rα, с IL-4 человека.

На фигуре 4А показано, что hIL-4Rα может связываться с комплексом hIL-13Rα/hIL-13; на фигуре 4В показано, что антитело-кандидат может ингибировать связывание hIL-4Rα с комплексом hIL-13Rα/hIL-13.

На фигуре 5А показано, что гуманизированные антитела-кандидаты могут специфически связываться со стабильно трансфицированными клетками НЕК293, экспрессирующими IL-4Rα; на фигуре 5В показано, что антитело-кандидат может ингибировать связывание IL-4 человека с клетками, экспрессирующими hIL-4Rα.

На фигуре 6А показано, что hIL-4 может стимулировать пролиферацию клеток TF-1; на фигуре 6В показано, что hIL-13 может стимулировать пролиферацию клеток TF-1. Фигура 6С показывает, что гуманизированные антитела могут ингибировать hIL-4-стимулированную пролиферацию клеток TF-1; на фигуре 6D показано, что гуманизированные антитела ингибируют стимулированную hIL-13 пролиферацию клеток TF-1; на фигуре 6E показано, что гуманизированные антитела могут одновременно ингибировать пролиферацию клеток TF-1, стимулированную hIL-4 и hIL-13.

На фигуре 7А показано, что гуманизированные антитела-кандидаты связываются с человеческим белком IL-4Rα; на фигуре 7В показаны гуманизированные антитела-кандидаты, связывающиеся с белком IL-4Rα яванского макака; на фигуре 7C показано, что гуманизированные антитела-кандидаты не связываются с белком IL-4Rα мыши; на фигуре 7D показано, что гуманизированные антитела-кандидаты связываются с белком IL-4R крысы.

Подробное описание воплощений

В настоящем изобретении все научные и технические термины, используемые в данном документе, имеют значения, обычно понимаемые специалистом в данной области, если не указано иное. Кроме того, термины и стадии лабораторных операций, относящиеся к химии белка и нуклеиновых кислот, молекулярной биологии, клеточной и тканевой культуре, микробиологии и иммунологии, используемые в данном документе, представляют собой термины и обычные стадии, которые широко используются в соответствующей области техники. Чтобы лучше понять настоящее изобретение, ниже приведены определения и объяснения связанных терминов.

«Интерлейкин-4» (IL-4) относится к встречающемуся в природе или эндогенному белку IL-4 млекопитающего или белку, имеющему ту же аминокислотную последовательность, что и соответствующий встречающийся в природе или эндогенный белок IL-4 млекопитающего (например, рекомбинантный белок и синтетический белок (т.е. белок, полученный химическим способом органического синтеза)). Соответственно, как определено в данном документе, термин включает зрелый белок IL-4, полиморфные или аллельные варианты, другие изоформы IL-4 и модифицированные или немодифицированные формы вышеуказанного (например, липидированные или гликозилированные). Встречающийся в природе или эндогенный IL-4 включает белки дикого типа, такие как зрелый IL-4, полиморфные или аллельные варианты и другие изоформы и мутантные формы, которые встречаются в природе у млекопитающих (например, у людей и приматов, не являющихся человеком). Такие белки могут быть извлечены или выделены, например, из источника, который естественным образом продуцирует IL-4. Эти белки и белки, имеющие ту же аминокислотную последовательность, что и соответствующий встречающийся в природе или эндогенный IL-4, упоминаются под названием соответствующего млекопитающего. Например, если соответствующее млекопитающее является человеком, белок обозначается как человеческий IL-4. В данной области известно несколько мутантных белков IL-4, как описано в WO 03/038041.

«Интерлейкин-13» (IL-13) относится к встречающемуся в природе или эндогенному белку IL-13 млекопитающих или белку, имеющему ту же аминокислотную последовательность, что и соответствующий встречающийся в природе или эндогенный белок IL-13 млекопитающих (например, рекомбинантный белок и синтетический белок (т.е. белок, полученный химическим способом органического синтеза)). IL-13 является цитокином, секретируемым многими типами клеток, включая клетки Т-хелперов 2-го типа (Th2). Соответственно, как определено в данном документе, термин включает зрелый белок IL-13, полиморфные или аллельные варианты, другие изоформы IL-13 (например, полученные из альтернативного сплайсинга или других клеточных процессов), а также модифицированные или немодифицированные формы вышеуказанного (например, липидизированные или гликозилированные). Встречающийся в природе или эндогенный IL-13 включает белки дикого типа, такие как зрелый IL-13, полиморфные или аллельные варианты и другие изоформы и мутантные формы, которые встречаются в природе у млекопитающих (например, у людей и приматов, не являющихся человеком). Например, используемый в данном документе IL-13 включает варианты человеческого IL-13, в которых Arg в положении 110 зрелого человеческого IL-13 заменен Gin (положение 110 зрелого IL-13 соответствует положению 130 белка-предшественника), а Gin ассоциирован с астмой (атопическая и неатопическая астма) и другими вариантами IL-13 (Heinzmann et al., Hum MoI Genet 9: 549-559 (2000)). Такие белки могут быть извлечены или выделены, например, из источника, который естественным образом продуцирует IL-13. Эти белки и белки, имеющие ту же аминокислотную последовательность, что и соответствующий встречающийся в природе или эндогенный IL-13, упоминаются под названием соответствующего млекопитающего. Например, если соответствующее млекопитающее является человеком, белок обозначается как IL-13 человека. В данной области известно несколько мутантных белков IL-13, описанных в WO 03/035847. Аминокислотная последовательность типичного IL-13 человека может быть найдена, например, под учетным номером UniProtKB P35225. IL-13 связывается с рецептором IL-13, где рецептор IL-13 может включать альфа-рецептор IL-4 (IL4Rα) в комплексе с субъединицей рецептора IL-13 α (IL13RA1) или субъединицей α2 рецептора IL-13 (IL13RA2). Например, IL-13 может связываться с комплексом альфа-рецептора IL-4 и субъединицы альфа 1 рецептора IL-13.

Фраза «по существу идентичная» в отношении полипептидной последовательности цепи антитела может быть истолкована как цепь антитела, имеющая, по меньшей мере, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%. 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с эталонной полипептидной последовательностью. Термин в отношении последовательности нуклеиновой кислоты может быть истолкован как последовательность нуклеотидов, проявляющая, по меньшей мере, приблизительно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с эталонной последовательностью нуклеиновой кислоты.

Термины «идентичность» или «гомология» могут означать процент нуклеотидных оснований или аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны остатку соответствующей последовательности, с которой она сравнивается, после выравнивания последовательностей и введения разрывов, если необходимо, чтобы достичь максимального процента идентичности для всей последовательности, и не рассматривать какие-либо консервативные замены как часть идентичности последовательности. Ни N-концевые, ни C-концевые удлинения или вставки не должны истолковываться как уменьшающие идентичность или гомологию. Способы и компьютерные программы для выравнивания легкодоступны и хорошо известны в данной области. Идентичность последовательности может быть измерена с использованием программного обеспечения для анализа последовательности.

Фразы и термины «функциональный фрагмент, вариант, производное или аналог» и тому подобное, а также различные формы антитела или антигена представляют собой соединение или молекулу, обладающую качественной биологической активностью, общей с полноразмерным антителом или представляющим интерес антигеном. Например, функциональный фрагмент или аналог антитела против IL-4 представляет собой фрагмент, который может связываться с молекулой IL-4, или фрагмент, который может предотвращать или существенно снижать способность лиганда или агонистического или антагонистического антитела связываться с IL-4.

Вариантами с «заменами» являются те, у которых, по меньшей мере, один аминокислотный остаток в нативной последовательности удален и заменен другой аминокислотой, вставленной на его место в том же положении. Замены могут быть единичными, когда в молекуле замещена только одна аминокислота, или могут быть множественными, когда две или более аминокислот замещены в одной молекуле. Множественные замены могут быть в последовательных сайтах. Кроме того, одна аминокислота может быть замещена несколькими остатками, и в этом случае такой вариант включает как замену, так и вставку. Варианты со «вставками» представляют собой варианты с одной или несколькими аминокислотами, вставленными непосредственно рядом с аминокислотой в определенном положении в нативной последовательности. Непосредственно смежный с аминокислотой означает связанный с α-карбоксильной или α-амино-функциональной группой аминокислоты. «Делеционные» варианты представляют собой варианты, в которых одна или несколько аминокислот в нативной аминокислотной последовательности удалены. Обычно делеционные варианты будут иметь одну или две аминокислоты, удаленные в конкретной области молекулы.

Используемый в данном документе термин «антитела» используется в самом широком смысле и конкретно охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифичные антитела), фрагменты антител или синтетические полипептиды, несущие одну или несколько CDR или последовательностей, полученных из CDR, при условии, что полипептиды проявляют искомую биологическую активность. Антитела (Ab) и иммуноглобулины (Ig) представляют собой гликопротеины, имеющие одинаковые структурные характеристики. «Антитела» могут также относиться к иммуноглобулинам и фрагментам иммуноглобулина, независимо от того, получены ли они естественным или частично или полностью синтетическим путем (например, рекомбинантно), включая любой их фрагмент, который содержит, по меньшей мере, частичную вариабельную область молекулы иммуноглобулина и сохраняет специфичность связывания полноразмерной молекулы иммуноглобулина. Таким образом, антитела включают любой белок, имеющий домен связывания, который гомологичен или по существу гомологичен домену связывания антигена иммуноглобулина (сайту связывания антитела). Антитела включают фрагменты антител, такие как фрагменты антител против опухолевых стволовых клеток. Используемый в данном документе термин антитело, таким образом, включает синтетические антитела, рекомбинантно продуцируемые антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифичные антитела), человеческие антитела, нечеловеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, интратела и фрагменты антител, например, без ограничения указанным, фрагменты Fab, фрагменты Fab', фрагменты F(ab')2, фрагменты Fv, дисульфид-связанные Fv (dsFv), фрагменты Fd, фрагменты Fd', одноцепочечные Fv (scFv), одноцепочечные Fab (scFab), диатела, антиидиотипические (анти-Id) антитела или антигенсвязывающие фрагменты любого из вышеупомянутых антител. Антитела, представленные в настоящем документе, включают любой класс иммуноглобулинов (например, IgG, IgM, IgD, IgE, IgA и IgY) и представители любого типа (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подтипа (например, IgG2a и IgG2b).

Антитела по настоящему изобретению могут быть антителами любого класса (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и т.д.) или подкласса (например, IgG₁, IgG₂, IgG_2a, IgG₃, IgG₄, IgA₁, IgA₂ и т.д.) («тип» и «класс», а также «подтип» и «подкласс» используются в данном документе взаимозаменяемо). Антитела и иммуноглобулины нативного или дикого типа (то есть полученные из не подвергнутого искусственному воздействию представителя популяции) обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой около 150000 дальтон, которые состоят из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH), за которым следует ряд константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на одном конце (VL) и константный домен на другом конце. Термин «не подвергнутый искусственному воздействию» означает не обработанный так, чтобы содержать или экспрессировать чужеродную антигенсвязывающую молекулу. Дикий тип может относиться к наиболее распространенному аллелю или виду, встречающемуся в популяции, или к антителу, полученному от не подвергнутого искусственному воздействию животного, по сравнению с аллелем или полиморфизмом, или вариантом или производным, полученным с помощью манипуляций, таких как мутагенез, применение рекомбинантных способов и т.д. для замены аминокислоты антигенсвязывающей молекулы.

Используемый в данном документе термин «анти-IL-4 антитело» означает антитело или полипептид, полученный из него (производное), которое специфически связывается с IL-4, как определено в настоящем документе, включая, без ограничения указанным, молекулы, которые ингибируют или существенно уменьшают связывание IL-4 с его лигандами или ингибируют активность IL-4.

Термин «вариабельный» в контексте вариабельного домена антител относится к определенным частям соответствующих молекул, которые сильно различаются по последовательности между антителами и среди антител и используются при специфическом распознавании и связывании конкретного антитела с его конкретной мишенью. Однако вариабельность неравномерно распределена по вариабельным доменам антител. Вариабельность сконцентрирована в трех сегментах, называемых областями, определяющими комплементарность (CDR; т.е. CDR1, CDR2 и CDR3) или гипервариабельными областями, как в вариабельных доменах легкой цепи, так и в вариабельных областях тяжелой цепи. Более высоко консервативные части вариабельных доменов называются каркасными (FR) областями или последовательностями. Каждый из вариабельных доменов нативных тяжелых и легких цепей содержит четыре области FR, в значительной степени принимающих конфигурацию β-листа, связанных тремя CDR, причем CDR образуют петли, соединяющие и в некоторых случаях являющиеся частью структуры β-листа. CDR в каждой цепи часто удерживаются вместе в непосредственной близости от областей FR и вместе с CDR из другой цепи способствуют образованию целевого (эпитопного или детерминантного) сайта связывания антител (см. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, NationalInstitute of Health, Bethesda, MD (1987)). При использовании в данном документе, нумерация аминокислотных остатков иммуноглобулина осуществляется с использованием системы нумерации аминокислотных остатков иммуноглобулина Kabat et al., если не указано иное. Один CDR может обладать способностью специфически связываться с когнатным эпитопом.

Используемый в данном документе термин «шарнир» или «шарнирный участок» относится к гибкому полипептиду, содержащему аминокислоты между первым и вторым константными доменами антитела.

Используемый в данном документе термин «фрагменты антител» или «антигенсвязывающие фрагменты» антител относится к любой части полноразмерного антитела, которая меньше полноразмерного, но содержит, по меньшей мере, часть вариабельной области антитела, которая связывается с антигеном (например, один или несколько CDR и/или один или несколько сайтов связывания антител) и, таким образом, сохраняют специфичность связывания, а также, по меньшей мере, частичную специфическую способность связывания полноразмерного антитела. Таким образом, антигенсвязывающие фрагменты относятся к фрагментам антитела, содержащим антигенсвязывающую часть, которая связывается с тем же антигеном, что и антитело, из которого получены фрагменты антитела. Фрагменты антител включают производные антител, полученные ферментативной обработкой полноразмерных антител, и производные, полученные синтезом, такие как производные рекомбинантного происхождения. Антитела включают фрагменты антител. Примеры фрагментов антител включают, без ограничения указанным, Fab, Fab', F(ab')2, одноцепочечные Fv (scFv), Fv, dsFv, диатела, фрагменты Fd и Fd' и другие фрагменты, включая модифицированные фрагменты (см., например, Methods in Molecular Biology, Vol 207: Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003); Chapter 1; p 3-25, Kipriyanov). Фрагменты могут содержать множество цепей, соединенных вместе, например, через дисульфидную связь и/или через пептидный линкер. Фрагменты антител обычно содержат, по меньшей мере, или около 50 аминокислот, и, как правило, по меньшей мере, или около 200 аминокислот. Антигенсвязывающие фрагменты включают любые фрагменты антител, если исходить из того, что фрагменты антител вставляются в каркас антитела (например, путем замены соответствующей области), при этом получается антитело, которое иммуноспецифично связывается с антигенами (т.е. демонстрирует Ка, по меньшей мере, или, по меньшей мере, около 107-108 M-1). «Функциональные фрагменты» или «аналоги антител против IL-4 и/или IL-13» представляют собой фрагменты или аналоги, которые предотвращают или существенно снижают способность рецепторов связываться с лигандами или инициировать передачу сигнала. Используемые в настоящем документе функциональные фрагменты обычно имеют то же значение, что и «фрагменты антител», и, в случае антител, могут относиться к фрагментам, которые предотвращают или существенно уменьшают способность рецепторов связываться с лигандами или инициировать передачу сигнала, такую как Fv, Fab и F (ab')2. Фрагменты «Fv» состоят из димеров (димеров VH-VL), образованных вариабельным доменом тяжелой цепи и вариабельным доменом легкой цепи путем нековалентного связывания. Именно в этой конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют для определения целевого сайта связывания на поверхности димера VH-VL, как в случае интактного антитела. В совокупности шесть CDR придают антигенсвязывающую специфичность интактному антителу. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только 3 CDR, специфичных для цели) обладает способностью распознавать и связывать цели.

Фрагменты антител «одноцепочечные Fv», «sFv» или «scab» содержат домены антител VH и VL, где эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Как правило, полипептид Fv дополнительно включает полипептидный линкер между VH и VL, который обычно является гибкой молекулой, которая позволяет sFv образовывать искомую структуру для связывания с мишенью.

Термин «диатело» относится к фрагментам антитела, имеющим два антигенсвязывающих сайта, причем фрагменты антитела могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одной и той же полипептидной цепи. Используя линкер, который является слишком коротким, чтобы разрешить спаривание между двумя вариабельными доменами в одной и той же цепи, домены диатела вынуждены спариваться с доменами связывания другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта.

Фрагменты Fab включают вариабельный и константный домены легкой цепи, а также вариабельный и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Фрагменты Fab' отличаются от фрагментов Fab добавлением нескольких остатков на карбоксильном конце домена CH1 для включения одного или нескольких цистеинов из шарнирной области антитела. Fab' фрагменты могут быть получены путем расщепления дисульфидной связи на шарнирных цистеинах продукта расщепления пепсином F(ab')2. Дополнительная ферментативная и химическая обработка антител может привести к появлению других функциональных фрагментов, представляющих интерес.

Термин «линейный Fab» относится к четырехвалентному антителу, описанному Miller et al. (Miller et al. (2003), J Immunol. 170: 4854-4861). «Линейный Fab» состоит из тандема одного и того же домена CH1-VH, спаренного с идентичной легкой цепью в каждом положении CH1-VH. Эти молекулы были разработаны для того, чтобы увеличить валентность антитела для повышения его функциональной аффинности за счет эффекта авидности, но они являются моноспецифичными.

Используемый в данном документе термин «моноклональное антитело» относится к популяции идентичных антител, в которой каждая отдельная молекула антитела в популяции моноклонального антитела идентична другим молекулам антитела. Это свойство отличается от свойства поликлональной популяции антител, которая включает антитела, имеющие множество различных последовательностей. Моноклональные антитела могут быть получены многими известными способами (Smith et al. (2004) J. Clin. Pathol. 57,912-917; и Nelson et al., J Clin Pathol (2000), 53,111-117). Например, моноклональные антитела могут быть получены путем иммортализации В-клеток, например, путем слияния с клетками миеломы для получения линии клеток гибридомы или путем заражения В-клеток вирусом, таким как EBV. Рекомбинантные методы также могут быть использованы для получения антител из клональной популяции клеток-хозяев путем трансформации in vitro клеток-хозяев плазмидой, несущей искусственную последовательность нуклеотида, кодирующего антитела.

Используемый в данном документе термин «гибридома» или «гибридомная клетка» относится к клетке или клеточной линии (обычно клетке миеломы или лимфомы), полученным слиянием антителопродуцирующих лимфоцитов и антителопродуцирующих злокачественных опухолевых клеток. Как известно специалисту в данной области, гибридомы могут пролиферировать и продолжать продуцировать специфические моноклональные антитела. Способы получения гибридом известны в данной области (см., например, Harlow & Lane, 1988). Термин «гибридома» или «гибридомная клетка» при упоминании в настоящем документе также включает субклоны и клетки-потомки гибридомы.

Используемый в данном документе термин «обычное антитело» относится к антителу, содержащему две тяжелые цепи (которые могут быть обозначены как H и H') и две легкие цепи (которые могут быть обозначены как L и L'), и два антигенсвязывающих сайта, где каждая тяжелая цепь может представлять собой тяжелую цепь иммуноглобулина полной длины или любую ее функциональную область, которая сохраняет антигенсвязывающую способность (например, тяжелые цепи включают, без ограничения указанным, цепи VH, цепи VH-CH1 и цепи VH-CH1-CH2-CH3), и каждая легкая цепь может представлять собой легкую цепь полной длины или любую функциональную область (например, легкие цепи включают, без ограничения указанным, цепи VL и цепи VL-CL). Каждая тяжелая цепь (H и H') связана с легкой цепью (L и L', соответственно).

Используемое в настоящем документе полноразмерное антитело представляет собой антитело, содержащее две тяжелые цепи полной длины (например, VH-CH1-CH2-CH3 или VH-CH1-CH2-CH3-CH4) и две легкие цепи полной длины (VL-CL) и шарнирную область, например, антитело, естественно продуцируемое секрецией антитела В-клетками, и синтетически продуцированное антитело, имеющее тот же домен.

Используемый в данном документе термин dsFv относится к Fv, имеющему сконструированную межмолекулярную дисульфидную связь, которая стабилизирует пару VH-VL.

Используемый в данном документе фрагмент Fab представляет собой фрагмент антитела, который является результатом расщепления полноразмерного иммуноглобулина с помощью папаина или фрагмент, имеющий такую же структуру, который синтезируется или продуцируется, например, рекомбинантными способами. Фрагмент Fab содержит легкую цепь (включающую VL и CL) и другую цепь, содержащую вариабельный домен (VH) тяжелой цепи и константный домен (CH1) тяжелой цепи.

Используемый в данном документе фрагмент F(ab')2 представляет собой фрагмент антитела, полученный в результате расщепления иммуноглобулина пепсином при рН 4,0-4,5, или фрагмент, имеющий такую же структуру, который синтезируется или продуцируется, например, рекомбинантными способами. Фрагмент F(ab')2, по существу, содержит два фрагмента Fab, где каждая часть тяжелой цепи содержит дополнительные несколько аминокислот, включая цистеины, которые образуют дисульфидную связь, соединяющую два фрагмента.

Используемый в данном документе фрагмент Fab' представляет собой фрагмент, включающий половину фрагмента F(ab')2 (включающего тяжелую цепь и одну легкую цепь).

Используемый в настоящем описании фрагмент scFv относится к фрагменту антитела, содержащему вариабельную легкую цепь (VL) и вариабельную тяжелую цепь (VH), ковалентно связанные полипептидным линкером в любом порядке. Линкер имеет такую длину, что два вариабельных домена соединяются без существенных помех. Типичными линкерами являются (Gly-Ser) n остатки с некоторыми остатками Glu или Lys, диспергированными повсюду для увеличения растворимости.

Термин «химерное антитело» относится к антителу, в котором последовательность вариабельной области получена из одного вида, а последовательность константной области получена из другого вида, например, в которой последовательность вариабельной области получена из антитела мыши, а последовательность константной области происходит из антитела человека.

«Гуманизированное» антитело относится к форме антител, отличных от человека (например, мыши), которая представляет собой химерный иммуноглобулин, цепь иммуноглобулина или ее фрагмент (например, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антиген-связывающие подпоследовательности антител) и содержит минимальные последовательности, полученные из нечеловеческих иммуноглобулинов. Предпочтительно гуманизированное антитело представляет собой человеческий иммуноглобулин (антитело-реципиент), в котором остатки определяющей комплементарность области (CDR) антитела-реципиента заменены остатками CDR нечеловеческого вида (донорное антитело), имеющего искомую специфичность, аффинность и функциональная активность, такого как мышь, крыса, кролик.

Кроме того, в процессе гуманизации также возможно мутировать аминокислотные остатки в областях CDR1, CDR2 и/или CDR3 VH и/или VL, тем самым улучшая одно или несколько свойств связывания (например, аффинности) антитела. Мутации могут быть введены, например, с помощью ПЦР-посредничества, влияние мутаций на связывание антител или другие функциональные свойства можно оценить с использованием анализов in vitro или in vivo, как описано в настоящем документе. Обычно вводятся консервативные мутации. Такими мутациями могут быть аминокислотные замены, добавления или делеции. Кроме того, число мутаций в CDR обычно составляет одну или максимум две. Таким образом, гуманизированные антитела по настоящему изобретению также включают антитела, содержащие одну или две аминокислотные мутации в CDR.

Используемый в данном документе термин «эпитоп» относится к любой антигенной детерминанте на антигене, с которой связывается паратоп антитела. Эпитопные детерминанты обычно включают химически активные поверхностные группировки молекул, таких как боковые цепи аминокислот или сахара, и обычно имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда.

Используемый в данном документе вариабельный домен или вариабельная область представляет собой специфический Ig-домен тяжелой или легкой цепи антитела, содержащий аминокислотную последовательность, которая варьирует между различными антителами. Каждая легкая цепь и каждая тяжелая цепь имеют домен вариабельной области VL и VH, соответственно. Вариабельный домен обеспечивает антигенную специфичность и поэтому отвечает за распознавание антигена. Каждая вариабельная область содержит CDR и каркасную область (FR), где CDR является частью домена антигенсвязывающего сайта.

Используемый в данном документе термин «антигенсвязывающий домен» и «антигенсвязывающий сайт» используются как синонимы для обозначения домена в антителе, который распознает и физически взаимодействует с когнатным антигеном. Нативные обычные молекулы полноразмерного антитела имеют два обычных антигенсвязывающих сайта, каждый из которых содержит участок вариабельной области тяжелой цепи и участок вариабельной области легкой цепи. Обычные антигенсвязывающие сайты содержат петлю, соединяющую антипараллельные бета-цепи внутри домена вариабельной области. Антигенсвязывающий сайт может содержать другие части домена вариабельной области. Каждый обычный антигенсвязывающий сайт содержит 3 гипервариабельные области из тяжелой цепи и 3 гипервариабельные области из легкой цепи. Гипервариабельные области также называют областями, определяющими комплементарность (CDR).

Используемые в данном документе термины «гипервариабельная область», «HV», «определяющая комплементарность область» и «CDR» и «CDR антитела» используются взаимозаменяемо для обозначения одной из множества частей в каждой вариабельной области, которые вместе образуют участок связывания антигена антитела. Каждый домен вариабельной области содержит 3 CDR, обозначенные как CDR1, CDR2 и CDR3. Например, домен вариабельной области легкой цепи содержит 3 CDR, обозначенные как VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3; домен вариабельной области тяжелой цепи включает 3 CDR, обозначенные как VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3. 3 CDR в вариабельной области расположены дискретно вдоль линейной аминокислотной последовательности, но находятся в непосредственной близости в свернутом полипептиде. CDR расположены внутри петли, соединяющей параллельные цепи бета-листа вариабельных доменов. Как описано в данном документе, специалист в данной области осведомлен и может идентифицировать CDR на основе нумерации Kabat или Chothia (см., например, Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; и Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917).

При использовании в настоящем документе, каркасная область (FR) представляет собой домен в домене вариабельной области антитела в бета-листе; в рамках аминокислотной последовательности, область FR является относительно более консервативной, чем гипервариабельная область.

Используемый в данном документе термин «домен константной области» представляет собой домен в тяжелой или легкой цепи антитела, который содержит аминокислотную последовательность, которая является относительно более консервативной, чем аминокислотная последовательность домена вариабельной области. В обычной молекуле полноразмерного антитела каждая легкая цепь имеет один домен константной области (CL) легкой цепи, а каждая тяжелая цепь содержит один или несколько доменов константной области (СН) тяжелой цепи, включая СН1, СН2, СН3 и СН4. Полноразмерные изотипы IgA, IgD и IgG включают CH1, CH2, CH3 и шарнирную область, тогда как IgE и IgM включают CH1, CH2, CH3 и CH4. Домены CH1 и CL расширяют Fab плечо молекулы антитела, тем самым облегчая взаимодействие с антигеном и вращение плеча антитела. Константная область антитела может выполнять эффекторную функцию, например, без ограничения указанным, клиренс антигенов, патогенов и токсинов, с которыми антитело специфически связывается, например, путем взаимодействия с различными клетками, биомолекулами и тканями.

При использовании в данном документе, функциональная область антитела представляет собой часть антитела, содержащую, по меньшей мере, VH, VL, CH (например, CH1, CH2 или CH3), CL или домен шарнирной области или, по меньшей мере, их функциональную область антитела.

При использовании в данном документе, функциональная область домена VH представляет собой, по меньшей мере, часть интактного домена VH, которая сохраняет, по меньшей мере, часть специфичности связывания всего домена VH (например, путем сохранения одного или нескольких CDR всего домена VH), так, что функциональная область домена VH связывается с антигеном либо отдельно, либо в комбинации с другим доменом антитела (например, доменом VL) или его областью. Функциональная область примерного домена VH представляет собой область, содержащую CDR1, CDR2 и/или CDR3 домена VH.

При использовании в данном документе, функциональная область домена VL является, по меньшей мере, частью интактного домена VL, который сохраняет, по меньшей мере, часть специфичности связывания всего домена VL (например, сохраняя один или несколько CDR всего домена VL) так, что функциональная область домена VL связывается с антигеном либо отдельно, либо в комбинации с другим доменом антитела (например, доменом VH) или его областью. Функциональная область примерного домена VL представляет собой область, содержащую CDR1, CDR2 и/или CDR3 домена VL.

Используемый в данном документе термин «специфически связывать» или «иммуноспецифически связывать» в отношении антитела или его антигенсвязывающего фрагмента используется в данном документе взаимозаменяемо и относится к способности антитела или антигенсвязывающего фрагмента образовывать одну или несколько нековалентных связей с аллоантигеном через нековалентные взаимодействия между антителом и антитело-связывающим сайтом антигена. Антиген может быть выделенным антигеном или присутствовать в опухолевой клетке. Как правило, антитело, которое иммуноспецифично связывается (или специфически связывается) с антигеном, связывается с антигеном с константой аффинности Kа около 1 × 10⁷ M^-1 или 1 × 10⁸ M^-1 или более (или с константой диссоциации (Kd) 1 × 10^-7 M или 1 × 10^-8 M или менее). Константы аффинности могут быть определены стандартными кинетическими способами ответов антител, например, иммуноанализом, поверхностным плазмонным резонансом (SPR) (Rich and Myszka (2000) Curr. Opin. Biotechnol 11:54; Englebienne (1998) Analyst.123:1599), изотермической титрационной калориметрией (ITC) или другими анализами кинетического взаимодействия, известными в данной области (см., например, Paul, ed., Fundamental Immunology, 2nd ed., Raven Press, New York, стр. 332-336 (1989); см. также патент США № 7229619, в котором описаны примерные методы SPR и ITC для расчета аффинности связывания антител). Инструменты и способы для обнаружения и мониторинга скорости связывания в реальном времени известны и коммерчески доступны (см. BiaCore 2000, Biacore AB, Upsala, Sweden and GE Healthcare Life Sciences; Malmqvist (2000) Biochem.Soc.Trans.27: 335).

Используемый в данном документе термин «конкурирующий» в отношении антитела означает, что первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с эпитопом способом, достаточно сходным со вторым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, и, таким образом, результат связывания первого антитела со связанным с ним эпитопом заметно снижается в присутствии второго антитела по сравнению с таковым в отсутствие второго антитела; альтернативно, связывание второго антитела с его связываемым эпитопом может, но не обязательно, заметно уменьшаться в присутствии первого антитела по сравнению с таковым в отсутствие первого антитела. То есть первое антитело может ингибировать связывание второго антитела с его эпитопом, однако второе антитело необязательно должно ингибировать связывание первого антитела с его соответствующим эпитопом. Однако в том случае, когда каждое антитело может детектируемо ингибировать связывание другого антитела с ассоциированным эпитопом или его лигандом, в идентичной, более высокой или более низкой степени, антитела называются «перекрестно-конкурентно» связывающимися с соответствующим эпитопом. Как конкурирующие, так и перекрестно-конкурирующие антитела охватываются настоящим изобретением. Независимо от механизма такой конкуренции или перекрестной конкуренции (например, стерическое затруднение, конформационное изменение или связывание с общим эпитопом или его фрагментом) специалист в данной области техники поймет, что на основе идей, представленных в настоящем в настоящем изобретении такие конкурирующие и/или перекрестно конкурирующие антитела охватываются настоящим изобретением и могут быть использованы в способах, раскрытых в данном документе.

Используемый в данном документе термин «полипептид» относится к двум или более аминокислотам, которые связаны ковалентно. Термины «полипептид» и «белок» используются в данном документе взаимозаменяемо.

«Выделенный белок», «выделенный полипептид» или «выделенное антитело» относится к белку, полипептиду или антителу: (1) которые не связаны с естественно ассоциированными компонентами, которые сопровождают его в нативном состоянии; (2) которые не содержат других белков того же вида; (3) которые экспрессируются клеткой другого вида; или (4) которые не встречаются в природе. Таким образом, полипептид, который химически синтезируется или синтезируется в клеточной системе, отличной от клетки, из которой он естественным образом происходит, будет «выделен» из его естественно ассоциированных компонентов. Белок также может быть сделан по существу свободным от естественно ассоциированных компонентов путем выделения, то есть с использованием способа очистки белка, хорошо известного в данной области.

Подходящие консервативные аминокислотные замены в пептидах или белках известны специалисту в данной области и, как правило, могут проводиться без изменения биологической активности получаемой молекулы. Как правило, специалист в данной области поймет, что одна аминокислотная замена в несущественной области полипептида существенно не изменяет биологическую активность (см., например, Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4^th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub.co., p.224).

Используемые в данном документе термины «полинуклеотид» и «молекула нуклеиновой кислоты» относятся к олигомеру или полимеру, содержащему, по меньшей мере, два связанных нуклеотида или производных нуклеотидов, включая дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК), которые обычно связаны посредством фосфодиэфирной связи.

Используемый в данном документе термин «выделенная молекула нуклеиновой кислоты» представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая выделена из других молекул нуклеиновой кислоты, присутствующих в природном источнике молекулы нуклеиновой кислоты. «Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты, например, молекулы кДНК, может быть по существу свободной от другого клеточного материала или культуральной среды, если она получена рекомбинантными методами, или по существу не содержит химических предшественников или других химических компонентов химического синтеза. Типичные выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, представленные в настоящем документе, включают выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие предоставленные антитела или антигенсвязывающие фрагменты.

«Идентичный» или «идентичность» в отношении последовательности имеет общепризнанное значение в данной области техники, и процент идентичности последовательности между двумя молекулами или участками нуклеиновой кислоты или полипептида может быть рассчитан с использованием раскрытых методик. Идентичность последовательности может быть измерена по всей длине полинуклеотида или полипептида или вдоль области молекулы. (См., например, Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; и Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). Хотя существует много способов измерения идентичности между двумя полинуклеотидами или полипептидами, термин «идентичность» хорошо известен специалисту в данной области (Carrillo, H. & Lipman, D., SIAM J Applied Math 48: 1073 (1988)).

Используемый в данном документе термин «функционально связанный» в отношении последовательности, области, элемента или домена нуклеиновой кислоты означает, что области нуклеиновой кислоты функционально связаны друг с другом. Например, промотор может быть функционально связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, который позволяет промотору регулировать или опосредовать транскрипцию нуклеиновой кислоты.

Используемый в данном документе термин «экспрессия» относится к процессу, с помощью которого полипептид получали путем транскрипции и трансляции полинуклеотида. Уровень экспрессии полипептида может быть оценен с использованием любого способа, известного в данной области, включая, например, способы определения количества полипептидов, продуцируемых из клетки-хозяина. Такие способы могут включать, без ограничения указанным, количественное определение полипептидов в клеточных лизатах с помощью ELISA, окрашивания кумасси синим после гель-электрофореза, анализа белка по Лоури и анализа белка по Брэдфорд.

Используемый в данном документе термин «клетка-хозяин» относится к клетке, используемой для получения, поддержания, репликации и амплификации вектора. Клетки-хозяева также можно использовать для экспрессии полипептида, кодируемого вектором. Нуклеиновая кислота, содержащаяся в векторе, реплицируется при делении клетки-хозяина, тем самым амплифицируя нуклеиновую кислоту. Клетки-хозяева могут быть эукариотическими клетками или прокариотическими клетками. Подходящие клетки-хозяева включают, без ограничения указанным, клетки СНО, различные клетки COS, клетки HeLa, клетки HEK, такие как клетки HEK 293.

«Оптимизация кодонов» относится к способу модификации последовательности нуклеиновой кислоты для усиления экспрессии в интересующей клетке-хозяине путем замены, по меньшей мере, одного кодона (например, около или более чем около 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 или более кодонов) нативной последовательности с кодонами, которые более часто или наиболее часто используются в генах клетки-хозяина при сохранении нативной аминокислотной последовательности. Различные виды проявляют особую склонность к определенным кодонам определенной аминокислоты. Предпочтение кодонов (различие в использовании кодонов между организмами) обычно коррелирует с эффективностью трансляции информационной РНК (мРНК), которая, в свою очередь, как считается, зависит от свойств транслируемых кодонов и доступности молекул конкретных транспортных РНК (тРНК). Преобладание выбранных тРНК в клетке обычно является отражением кодонов, наиболее часто используемых в синтезе пептидов. Соответственно, гены могут быть адаптированы для оптимальной экспрессии генов в данном организме на основе оптимизации кодонов. Таблицы использования кодонов легкодоступны, например, в базе данных использования кодонов, доступной по адресу www.kazusa.orjp/codon/, и эти таблицы можно адаптировать различными способами. См. Nakamura Y. et al., “Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucl. Acids Res., 28:292(2000).

Используемый в данном документе термин «вектор» представляет собой реплицируемую нуклеиновую кислоту, и когда вектор трансформируется в подходящую клетку-хозяина, один или несколько гетерологичных белков могут быть экспрессированы из вектора. Используемый в данном документе вектор включает вектор, в который может быть введена нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид или его фрагмент, обычно путем рестрикционного гидролиза и лигирования. Используемый в данном документе вектор также включает вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид. Вектор используется для введения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, в клетку-хозяина, для амплификации нуклеиновых кислот или для экспрессии/презентации полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой. Вектор обычно остается свободным, но может быть сконструирован для интеграции гена или его части в хромосому генома. Векторы искусственных хромосом, такие как дрожжевые искусственные векторы и искусственные хромосомы млекопитающих, также принимаются во внимание. Выбор и применение таких носителей хорошо известны специалисту в данной области.

Используемые в данном документе векторы также включают «вирусные векторы» или «векторы вирусов». Вектор вируса представляет собой сконструированный вирус, который может быть функционально связан с экзогенным геном для переноса (в качестве носителя или челнока) экзогенного гена в клетку.

Используемый в данном документе термин «экспрессирующий вектор» включает вектор, способный экспрессировать ДНК, которая может быть функционально связана с регуляторной последовательностью, такой как область промотора, которая способна влиять на экспрессию таких фрагментов ДНК. Такие дополнительные фрагменты могут включать последовательности промотора и терминатора и могут необязательно включать один или несколько источников репликации, один или несколько селектируемых маркеров, энхансер, сигнал полиаденилирования и т.д. Векторы экспрессии обычно происходят из плазмидной или вирусной ДНК или могут содержать элементы обоих. Таким образом, экспрессирующий вектор относится к рекомбинантной конструкции ДНК или РНК, такой как плазмида, фаг, рекомбинантный вирус или другой вектор, которая при введении в подходящую клетку-хозяина приводит к экспрессии клонированной ДНК. Подходящие экспрессирующие векторы хорошо известны специалисту в данной области и включают экспрессирующие векторы, которые реплицируются в эукариотических клетках и/или прокариотических клетках, и экспрессирующие векторы, которые сохраняют свободные векторы, или экспрессирующие векторы, которые интегрированы в геном клетки-хозяина.

При использовании в данном документе, «лечение» индивидуума, имеющего заболевание или состояние, означает, что симптомы индивидуума частично или полностью облегчены или не изменились после лечения. Таким образом, лечение включает предотвращение, обработку и/или лечение. Предотвращение относится к профилактике основных заболеваний и/или профилактике обострения симптомов или прогрессирования заболевания. Обработка также включает любое фармацевтическое применение любого из предоставленных антител или его антигенсвязывающих фрагментов и композиций, представленных в настоящем документе.

Используемый в данном документе термин «терапевтический эффект» относится к эффекту, вызванному лечением у индивидуума, который изменяет, обычно ослабляет или улучшает симптомы заболеваний или состояний или излечивает заболевания или состояния.

Используемый в данном документе термин «терапевтически эффективное количество» или «терапевтически эффективная доза» относится к количеству вещества, соединения, материала или композиции, содержащему соединение, которое, по меньшей мере, достаточно для создания терапевтического эффекта при введении объекту. Таким образом, это количество необходимо для предотвращения, лечения, улучшения, блокирования или частичного блокирования симптомов заболевания или состояния.

Используемый в данном документе термин «профилактически эффективное количество» или «профилактически эффективная доза» относится к количеству вещества, соединения, материала или композиции, содержащему соединение, которое оказывает желаемый профилактический эффект при введении объекту, например, для предотвращения или задержки начало или рецидив заболевания или симптома, уменьшить вероятность возникновения или рецидива заболевания или симптома. Полная эффективная профилактическая доза не обязательно происходит при введении одной дозы и может происходить при введении ряда доз. Таким образом, профилактически эффективное количество может быть введено за одно или несколько введений.

Используемый в данном документе термин «пациент» относится к млекопитающему, такому как человек.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR тяжелой цепи, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-4, 12-14, 22-24, 32-34, 42-44 52-54, 62-64, 72-74, 82-84, 92-94, 102-104, 112-114, 122-124, 132-134, 142-144, 152-154, 162-164, 172 -174, 177-179, 182-184, 187-189, 192-194, 197-199, 202-204, 207-209 или любого их варианта, и/или CDR легкой цепи, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 7-9, 17-19, 27-29, 37-39, 47-49, 57-59, 67-69, 77-79, 87-89, 97-99, 107-109, 117-119, 127-129, 137-139, 147-149, 157-159, 167-169, 212-214, 217-219, 222-224, 227-229 или любого их варианта.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2, 12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 177, 182, 187, 192, 197, 202, 207 или любого их варианта, CDR2 тяжелой цепи, выбранный из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, 133, 143, 153, 163, 173, 178, 183, 188, 193, 198, 203, 208 или любой их вариант и CDR3 тяжелой цепи, выбранные из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 4, 14, 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 179, 184, 189, 194, 199, 204, 209 или любого их варианта; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 212, 217, 222, 227 или любого их варианта, CDR2 легкой цепи, выбранный из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 8, 18, 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 213, 218, 223, 228 или любого их варианта, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 9, 19, 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 214, 219, 224, 229 или любого их варианта.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 176, 181, 186, 191, 196, 201, 206 или любого их варианта и/или вариабельной области легкой цепи, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 6, 16, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106, 116, 126, 136, 146, 156, 166, 211, 216, 221, 226 или любого их варианта.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 22, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 28, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 38, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 43, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 44; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 47, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 48, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 49.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 54; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 58, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 59.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 62, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 63, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 64; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 67, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 69.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 72, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 73, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 74; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 77, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 78, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 79.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 82, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 83, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 84; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 87, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 88, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 89.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 92, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 93, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 94; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 97, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 98, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 99.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 102, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 103, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 104; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 107, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 108, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 109.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 112, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 113, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 114; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 117, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 118, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 119.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 122, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 123, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 124; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 127, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 128, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 129.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 132, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 133, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 134; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 137, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 138, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 139.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 142, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 143, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 144; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 147, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 148, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 149.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 152, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 153, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 154; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 157, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 158, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 159.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 162, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 163, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 164; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 167, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 168, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 169.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 172, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 173, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 174; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 212, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 213, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 214.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 182, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 183, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 184; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 212, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 213, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 214.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 187, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 188, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 189; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 212, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 213, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 214.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 192, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 193, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 194; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 212, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 213, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 214.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 197, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 198, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 199; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 212, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 213, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 214.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 202, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 203, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 204; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 212, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 213, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 214.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 207, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 208, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 209; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 212, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 213, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 214.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 172, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 173, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 174; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 217, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 218, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 219.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 177, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 178, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 179; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 217, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 218, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 219.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 182, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 183, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 184; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 217, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 218, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 219.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 187, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 188, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 189; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 217, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 218, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 219.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 192, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 193, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 194; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 217, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 218, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 219.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 197, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 198, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 199; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 217, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 218, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 219.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 202, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 203, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 204; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 217, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 218, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 219.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 207, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 208, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 209; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 217, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 218, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 219.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 172, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 173, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 174; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 222, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 223, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 224.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 177, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 178, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 179; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 222, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 223, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 224.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 182, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 183, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 184; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 222, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 223, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 224.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 187, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 188, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 189; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 222, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 223, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 224.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 192, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 193, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 194; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 222, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 223, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 224.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 197, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 198, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 199; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 222, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 223, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 224.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 202, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 203, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 204; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 222, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 223, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 224.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 207, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 208, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 209; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 222, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 223, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 224.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 172, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 173, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 174; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 227, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 228, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 229.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 177, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 178, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 179; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 227, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 228, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 229.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 182, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 183, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 184; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 227, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 228, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 229.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 187, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 188, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 189; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 227, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 228, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 229.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 192, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 193, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 194; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 227, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 228, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 229.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 197, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 198, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 199; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 227, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 228, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 229.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 202, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 203, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 204; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 227, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 228, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 229.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему CDR1 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 207, CDR2 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 208, и CDR3 тяжелой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 209; и/или CDR1 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 227, CDR2 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 228, и CDR3 легкой цепи, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 229.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 46, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 51, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 61, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 66, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 71, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 76, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 81, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 86, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 91, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 96, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 101, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 106, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 111, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 116, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 111, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 116, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 121, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 126, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 131, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 136, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 141, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 146, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 151, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 156, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 161, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 166, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 171, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 211, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 176, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 211, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 181, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 211, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 186, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 211, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 191, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 211, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 196, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 211, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 201, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 211, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 206, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 211, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 171, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 216, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 176, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 216, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 181, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 216, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 186, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 216, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 191, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 216, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 196, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 216, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 201, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 216, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 206, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 216, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 171, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 221, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 176, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 221, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 181, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 221, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 186, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 221, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 191, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 221, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 196, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 221, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 201, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 221, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 206, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 221, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 171, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 226, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 176, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 226, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 181, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 226, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 186, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 226, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 191, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 226, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 196, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 226, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 201, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 226, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 206, или любой ее вариант, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 226, или любой ее вариант.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 176, 181, 186, 191, 196, 201, 206 или любого их варианта и/или вариабельной области легкой цепи, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 6, 16, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106, 116, 126, 136, 146, 156, 166, 211, 216, 221, 226 или любого их варианта.

В одном аспекте раскрытие относится к выделенной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело или его функциональный фрагмент или вариант, как раскрыто в данном документе, векторной конструкции, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или часть, связывающую IL-4 и/или IL-13, из функционального фрагмента антитела по настоящему изобретению, клетке-хозяину, содержащей вектор, и рекомбинантной технологии получения полипептидов.

В одном аспекте раскрытие дополнительно включает наборы, например, наборы включают антитела и фрагменты, гомологи и их производные и т.д. раскрытия, такие как меченые или цитотоксические конъюгаты, и инструкции по применению антитела, конъюгатов, которые убивают определенные типы клеток и т.д. Инструкции могут содержать руководство по применению антител и конъюгатов in vitro, in vivo или ex vivo и т.д. Антитело может быть в жидкой форме или в твердой форме, обычно в лиофилизированной форме. Набор может содержать другие подходящие агенты, такие как буферы, растворы для разведения и другие необходимые ингредиенты для предполагаемого применения. Предусмотрена упакованная комбинация с заранее определенными количествами агентов и инструкциями по применению, причем применение предназначено, например, для терапевтического применения или для проведения диагностических анализов. Когда антитело мечено, например, помечено ферментом, набор может содержать субстрат и кофактор, необходимые для фермента (например, предшественник субстрата, который обеспечивает обнаруживаемый хромофор или флуорофор). Кроме того, могут быть также включены другие добавки, такие как стабилизаторы и буферы (например, блокирующие буферы или буферы для лизиса). Относительные количества различных агентов можно варьировать, чтобы получить концентрат раствора агента, который обеспечивает гибкость пользователя, экономию пространства, экономию агента и т.д. Эти агенты могут также предоставляться в форме сухого порошка, обычно в лиофилизированной форме, включая наполнители, которые при растворении дают раствор агента с соответствующей концентрацией.

Антитела по настоящему изобретению полезны при лечении млекопитающих. В одном воплощении, например, представляющее интерес антитело или его эквивалент вводят млекопитающему, не являющемуся человеком, с целью получения доклинических данных. Типичные млекопитающие, не являющиеся человеком, подлежащие лечению, включают приматов, не являющихся людьми, собак, кошек, грызунов и других млекопитающих, на которых проводили доклинические исследования. Таких млекопитающих можно использовать для создания животных моделей заболевания, подлежащего лечению антителом, или их можно использовать для изучения токсичности интересующего антитела. В каждом из этих воплощений исследования повышения дозы могут быть выполнены на млекопитающем.

Антитело, независимо от того, имеет ли он второй компонент (такой как компонент терапевтического агента, конъюгированный с ним), можно использовать в качестве терапевтического агента, отдельно или в сочетании с цитотоксическим фактором. Настоящее изобретение относится к терапии на основе антител, которая включает введение антител по настоящему изобретению животному, млекопитающему или человеку для лечения опосредованного IL-4 и/или IL-13 заболевания, расстройства или состояния.

Термин «осуществлять лечение/лечение/лечить», используемый в настоящем изобретении, относится к терапевтическому лечению и профилактическим или профилактическим мерам. Термин относится к предотвращению, лечению, обращению, смягчению, ослаблению, минимизации, подавлению или прекращению вредного воздействия болезненного состояния, прогрессирования заболевания, факторов, вызывающих заболевание (например, бактерий или вирусов) или других ненормальных состояний.

Соответственно, настоящее изобретение также охватывает мультивалентные антитела, в том числе биспецифичные антитела против IL-4/IL-13, имеющие присоединенные эффекторные молекулы, атомы или другие вещества с диагностическими или терапевтическими функциями. Например, антитело может иметь радиодиагностическую метку или радиоактивный цитотоксический атом или металл или цитотоксическое вещество, такое как цепь рицина, которые присоединены к антителу для диагностики in vivo или лечения онкологического заболевания.

Кроме того, антитела по настоящему изобретению также можно использовать в иммуноанализах, способах очистки и других способах, в которых используются иммуноглобулины или их фрагменты. Такое применение хорошо известно в данной области.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим антитело против IL-13 и/или против IL-4 или его фрагмент по настоящему изобретению, где антитело удобно комбинировать с фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или наполнителями, которые являются распространенными средствами в данной области.

Используемый в данном документе термин «фармацевтическая композиция» относится к составам различных препаратов. Составы, содержащие терапевтически эффективные количества многовалентных антител, представляют собой стерильные жидкие растворы, жидкие суспензии или лиофилизированные формы и необязательно содержат стабилизаторы или наполнители.

Используемый в данном документе термин «расстройство» относится к любому состоянию, которое было бы полезным при лечении антителом по настоящему изобретению. Это включает хронические и острые расстройства или заболевания, включая те патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающее, особенно человека к расстройству. Примеры неограничивающих нарушений, подлежащих лечению, включают рак, воспаление, аутоиммунные заболевания, инфекции, сердечно-сосудистые заболевания, респираторные заболевания, неврологические заболевания и метаболические заболевания.

Антитела по настоящему изобретению можно использовать для лечения, ингибирования или предотвращения заболеваний, таких как аллергические заболевания, Th2-опосредованные заболевания, IL-13-опосредованные заболевания, IL-4-опосредованные заболевания и/или IL-4/IL-13-опосредованные заболевания. Примеры таких заболеваний включают болезнь Ходжкина, астму, аллергическую астму, атопический дерматит, атопическую аллергию, язвенный колит, склеродермию, аллергический ринит, идиопатический легочный фиброз COPD, хронический отторжение трансплантата, блеомицин-индуцированный легочный фиброз, радиационно-индуцированный легочный фиброз, фиброз легких, прогрессирующий системный склероз, шистосомоз, фиброз печени, рак почки, лимфому Беркитта, болезнь Ходжкина, неходжкинскую болезнь, синдром Сезари, астму, септический артрит, герпесоподобный дерматит, хроническую идиопатическую крапивницу, язвенный колит, склеродерму, гипертрофический рубец, синдром Уипла, доброкачественную гиперплазию предстательной железы, легочное расстройство, при котором действует рецептор IL-4, состояние, при котором рецептор IL-4 опосредует разрушение эпителиального барьера, расстройство пищеварительной системы, при котором действует рецептор IL-4, аллергические реакции на лекарства, Болезнь Кавасаки, серповидноклеточную анемию, синдром Чурга-Штрауса, болезнь Грейвса, преэклампсию, синдром Шёгрена, аутоиммунный лимфопролиферативный синдром, аутоиммунную гемолитическую анемию, пищевод Барретта, аутоиммунный увеит, туберкулез, муковисцидоз, аллергический бронхолегочный микоз, хроническую обструктивную болезнь легких, блеомицин-индуцированную болезнь легких и фиброз, лёгочно-альвеолярный протеиноз, синдром расстройства дыхания у взрослых, саркоидоз, гипер-IgE-синдром, идиопатический гиперэозинофильный синдром, аутоиммунную пузырчатку, пузырчатку обыкновенную, буллезный пемфигоид, миастению гравис, синдром хронической усталости и заболевание почек.

Термин «аллергическое заболевание» относится к патологическому состоянию, при котором пациент является гиперчувствительным и имеет иммунный ответ на вещество, которое обычно не является иммуногенным. Общая характеристика аллергических заболеваний заключается в том, что IgE активирует тучные клетки и вызывает воспалительные реакции (например, местные реакции, системные реакции), причем эти реакции могут приводить к доброкачественным симптомам, таким как насморк, а также могут вызывать опасный для жизни анафилактический шок и смерть. Примеры аллергических заболеваний включают, без ограничения указанным, аллергический ринит (например, поллиноз), астму (например, аллергическую астму), аллергический дерматит (например, экзема), контактный дерматит, пищевую аллергию и уртикарию (крапивницу).

Используемый в данном документе термин «Th2-опосредованное заболевание» относится к заболеванию, патология которого (полностью или частично) вызвана иммунным ответом (иммунный ответ типа Th2), регулируемым лимфоидными клетками CD4 + Th2T, и который характеризуется образование IL-4, IL-5, IL-9 и IL-13. Иммунные ответы Th2-типа связаны с выработкой определенных цитокинов (например, IL-4, IL-13) и определенных классов антител (например, IgE) и гуморальным иммунитетом. Опосредованные Th2 заболевания характеризуются наличием повышенных уровней цитокинов Th2 (например, IL-4, IL-13) и/или определенных классов антител (например, IgE) и включают, например, аллергические заболевания (например, аллергический ринит, идиопатический дерматит, астму (такая как идиопатическая астма), аллергическое заболевание дыхательных путей (AAD), анафилактический шок и конъюнктивит), аутоиммунные нарушения, связанные с повышенными уровнями IL-4 и/или IL-13 (например, ревматоидный артрит, болезнь «трансплантат против хозяина», заболевание почек (например, нефротический синдром, волчаночный нефрит)) и инфекции, связанные с повышенными уровнями IL-4 и/или IL-13 (например, инфекции вирусами, паразитами, грибами (такие как C. albicans)). Некоторые виды онкологических заболеваний связаны с повышенными уровнями IL-4 и/или IL-13, или с IL-4-индуцированной и/или IL-13-индуцированной пролиферацией злокачественных опухолевых клеток (например, B-клеточная лимфома, T-клеточная лимфома, множественные миелома, рак головы и шеи, рак молочной железы и рак яичников). Эти онкологические заболевания можно лечить, ингибировать или предотвращать с помощью антитела по настоящему изобретению.

Термины «онкологическое заболевание» или «рак», используемые в настоящем изобретении, относится или описывает физиологическое состояние млекопитающего, особенно человека, которое обычно характеризуется неконтролируемым и нерегулируемым ростом клеток. Примеры раков включают, без ограничения указанным, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз.

Используемый в данном документе термин «аутоиммунное(ые) заболевание(ия)» относится к незлокачественному заболеванию или расстройству, возникающему и направленному против собственных тканей индивидуума. Примеры аутоиммунных заболеваний или расстройств включают, без ограничения указанным, воспалительные реакции, такие как воспалительный дерматоз, включая псориаз и дерматит; аллергические состояния, такие как экзема и астма; другие симптомы, включающие инфильтрацию Т-клеток и хронические воспалительные реакции; атеросклероз, сахарный диабет (например, сахарный диабет типа I или инсулинозависимый сахарный диабет); рассеянный склероз и воспалительные заболевания центральной нервной системы.

Антитела по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве композиций для введения по отдельности или могут быть использованы в комбинации с другими активными агентами. Антитела могут быть использованы в комбинированной терапии с существующей терапией IL-13 (например, с существующими активными агентами IL-13, такими как анти-IL-13R1, IL-4/13Trap, анти-IL-13) плюс анти-IL-4 антитела, а также существующие активные агенты IL-4 (например, анти-IL-4R, мутантный белок IL-4, IL-4/13Trap) плюс антитело против IL-13 и IL-4 антитело (например, WO 05/0076990 (CAT), WO 03/092610 (Regeneron), WO 00/64944 (Genetic Inst.) И WO 2005/062967 (Tanox)).

Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его функциональный фрагмент по любому из предшествующих аспектов.

Вектор, включающий нуклеиновую кислоту по любому из предшествующих аспектов.

Клетка, содержащая вектор по любому из предшествующих аспектов.

Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его функциональный фрагмент или нуклеиновую кислоту, кодирующую его по любому из предшествующих аспектов, и фармацевтически приемлемый носитель.

Способ лечения аллергических заболеваний у млекопитающего, включающий стадию введения млекопитающему терапевтически эффективного количества антитела или его функционального фрагмента или нуклеиновой кислоты, кодирующей его, по любому из предшествующих аспектов.

Способ лечения аллергических заболеваний у млекопитающего, включающий стадию введения млекопитающему терапевтически эффективного количества антитела или его функционального фрагмента или нуклеиновой кислоты, кодирующей его, по любому из предшествующих аспектов.

Способ лечения рака, включающий стадию введения млекопитающему терапевтически эффективного количества антитела или его функционального фрагмента или нуклеиновой кислоты, кодирующей его, по любому из предшествующих аспектов.

Способ лечения астмы у млекопитающего, включающий стадию введения млекопитающему терапевтически эффективного количества антитела или его функционального фрагмента или нуклеиновой кислоты, кодирующей его, по любому из предшествующих аспектов.

Способ лечения заболеваний, связанных с аномальной выработкой IL-4 и/или IL-13 у млекопитающего, включающий стадию введения млекопитающему терапевтически эффективного количества антитела или его функционального фрагмента или нуклеиновой кислоты, кодирующей его, по любому из предыдущих аспектов.

Способ ингибирования TH-2-опосредованного ответа у млекопитающего, включающий стадию введения млекопитающему терапевтически эффективного количества антитела или его функционального фрагмента или нуклеиновой кислоты, кодирующей его, по любому из предшествующих аспектов.

Используемый в данном документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» предназначен для включения любых и всех растворителей, дисперсионных сред, покрытий, антибактериальных и противогрибковых агентов, изотонических и задерживающих абсорбцию агентов и т.д., которые совместимы с фармацевтическим введением. Подходящие носители описаны в самом последнем издании Remington's Pharmaceutical Sciences, стандартном справочном тексте в данной области, который включен в настоящий документ ссылкой. Предпочтительные примеры таких носителей или разбавителей включают, без ограничения указанным, воду, физиологический раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и 5% человеческий сывороточный альбумин. Также могут быть использованы липосомы и неводные носители, такие как жирные масла. Использование таких сред и агентов с фармацевтически активными веществами хорошо известно в данной области. За исключением случаев, когда какой-либо обычный носитель или агент несовместим с антителом, предполагается их применение в композициях.

Составы, используемые для введения in vivo, должны быть стерильными. Это легко достигается путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.

Фармацевтические композиции воплощений составлены так, чтобы быть совместимыми с их предполагаемым путем введения. Примеры способов введения включают парентеральное, такое как внутривенное, внутрикожное, подкожное, пероральное (например, ингаляционное), трансдермальное (то есть местное), трансмукозальное и ректальное введение. Растворы или суспензии, используемые для парентерального, внутрикожного или подкожного введения, могут включать следующие компоненты: стерильные разбавители для инъекций, такие как вода, физиологический раствор, жирное масло, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатообразующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA); буферы, такие как ацетаты, цитраты и фосфаты; и агенты для регулирования осмотического давления, такие как хлорид натрия или декстроза. pН можно регулировать кислотой или основанием, таким как соляная кислота или гидроксид натрия. Парентеральный состав может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы для многократных доз, сделанные из стекла или пластика.

Фармацевтические композиции, подходящие для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы (растворимые в воде) или дисперсии и стерильные порошки для немедленного приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсии. Для внутривенного введения подходящие носители включают физиологический раствор, бактериостатическую воду, Кремофор EL^TM (BASF, Parsippany, N.J.) или фосфатно-солевой буферный раствор (PBS). Во всех случаях композиция должна быть стерильной и должна быть жидкой до такой степени, чтобы ее можно было легко вводить через шприц. Она должна быть стабильной в условиях производства и хранения и должна быть защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носителем может быть растворитель или дисперсионная среда, содержащая, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.д.) и их подходящие смеси. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ. Предотвращение действия микроорганизмов может быть достигнуто с помощью различных антибактериальных и противогрибных агентов, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и др. Во многих случаях может быть предпочтительным включение в композицию изотонических агентов, например сахаров, многоатомных спиртов, таких как маннит, сорбит, хлорид натрия. Пролонгированная абсорбция инъецируемых композиций может быть достигнута включением в композицию агента, который задерживает абсорбцию, например моностеарата алюминия и желатина.

Стерильные растворы для инъекций могут быть приготовлены путем включения антитела или антител в необходимом количестве в подходящем растворителе с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по мере необходимости, с последующей стерилизацией фильтрацией. Как правило, дисперсии готовят путем включения антитела или антител в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и требуемые другие ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций способы приготовления представляют собой вакуумную сушку и лиофилизацию, что дает порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желательный ингредиент из стерильно отфильтрованного раствора вышеуказанных ингредиентов.

Для введения путем ингаляции соединение доставляется в форме аэрозольного спрея из находящегося под давлением контейнера, или дозатора, или распылителя, который содержит подходящий пропеллент, такой как диоксид углерода.

Системное введение также может осуществляться трансмукозальным или трансдермальным способом. Для трансмукозального или трансдермального введения в препарате используются пенетранты, подходящие для проникновения через барьер. Такие пенетранты, как правило, известны в данной области и включают, например, трансмукозальное введение, детергенты, соли желчных кислот и производные фусидовой кислоты. Введение через слизистую оболочку может быть достигнуто путем использования назальных спреев или суппозиториев. Для трансдермального введения одно или несколько антител могут быть приготовлены в виде мазей, бальзамов, гелей или кремов, как обычно известно в данной области.

Соединения также могут быть получены в форме суппозиториев (например, с обычными основами для суппозиториев, такими как масло какао и другие глицериды) или удерживающих клизм для ректальной доставки.

В одном воплощении антитела могут быть получены с носителями, которые будут защищать антитела от быстрого выведения из организма, такими как состав с замедленным высвобождением/контролируемым высвобождением, включая имплантаты и микрокапсулированные системы доставки. Могут быть использованы биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы приготовления таких составов будут очевидны для специалиста в данной области.

Например, эти активные ингредиенты могут быть инкапсулированы в микрокапсулы, приготовленные, например, методами коацервации или методами межфазной полимеризации, например, микрокапсулами гидроксиметилцеллюлозы или желатина и поли (метилметакрилатными) микрокапсулами, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарств (например, липосомами, альбуминовыми микросферами, микроэмульсиями, наночастицами и нанокапсулами) или в макроэмульсиях.

Может быть приготовлена композиция с замедленным высвобождением. Примеры подходящих составов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитела, причем эти матрицы находятся в форме профилированных изделий, например пленок или микрокапсул. Примеры матриц для замедленного высвобождения включают сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли (2-гидроксиэтилметилпропионат) или поли(виниловый спирт), полилактид (Патент США 3771919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, неразлагаемые этиленвинилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT^TM (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и ацетата лейпролида) и поли-D-(-)-3-гидрокси-масляную кислоту. Хотя такие полимеры, как этилен-винилацетат и молочная кислота-гликолевая кислота, позволяют высвобождать молекулы в течение более 100 дней, некоторые гидрогели высвобождают белки в течение более коротких периодов времени.

Липосомные суспензии (включая липосомы, нацеленные на инфицированные клетки с моноклональными антителами против вирусных антигенов) также могут быть использованы в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Они могут быть получены в соответствии со способами, известными специалисту в данной области, например способами, описанными в Пат. США № 4522811.

Особенно выгодно составлять парентеральные композиции в единичной дозированной форме для простоты введения и однородности дозировки. Используемая в данном документе единичная дозированная форма относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз для объектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит заранее определенное количество одного или нескольких антител, рассчитанных для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с необходимыми фармацевтическими носителями. Спецификации для единичных дозированных форм воплощений диктуются и напрямую зависят от: уникальных характеристик антител и конкретного терапевтического эффекта, который должен быть достигнут; и ограничений, присущих в данной области при разработке рецептур с такими антителами для лечения индивидуумов.

Фармацевтическая композиция может быть помещена в контейнер, упаковку или дозатор вместе с инструкциями по введению.

Состав в данном документе может также содержать более одного антитела, которое необходимо для конкретного показания, подвергаемого лечению, предпочтительно с дополнительными активностями, которые не оказывают вредного влияния друг на друга. Альтернативно или в дополнение, композиция может содержать агент, который усиливает ее функцию, такой как цитотоксический агент, цитокин, химиотерапевтический агент или агент, ингибирующий рост. Такие молекулы подходящим образом присутствуют в комбинации в количествах, которые эффективны для предполагаемой цели.

В одном воплощении одно или несколько антител можно вводить в комбинированной терапии, то есть в сочетании с другими агентами, такими как терапевтические агенты (которые можно использовать для лечения патологических состояний или расстройств, таких как различные формы рака, аутоиммунные расстройства и воспалительные расстройства). Используемый в данном документе термин «в сочетании с» относится к введению агентов по существу одновременно, одновременно или последовательно. При последовательном введении первое соединение из двух соединений все еще предпочтительно обнаруживается в эффективной концентрации в месте лечения после начала введения второго соединения.

Например, комбинированная терапия может включать одно или несколько антител, описанных в настоящем документе, которые совместно включаются в рецептуру и/или вводятся совместно с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами (например, одним или несколькими ингибиторами цитокинов и факторов роста, иммунодепрессантами, противовоспалительными агентами, метаболическими ингибиторами, ферментными ингибиторами и/или цитотоксинами или цитостатическими агентами, как описано более подробно ниже). Такая комбинированная терапия может преимущественно использовать более низкие дозы вводимых терапевтических агентов, таким образом, избегая возможных токсических эффектов или осложнений, связанных с различными монотерапиями.

Предпочтительными терапевтическими агентами для применения в сочетании с антителами, описанными в данном документе, являются те, которые влияют на различные стадии воспалительного ответа. В одном воплощении одно или несколько антител, описанных в настоящем документе, можно совместно включать в рецептуру и/или совместно вводить с одним или несколькими дополнительными агентами, такими как другие цитокины или антагонисты фактора роста (например, растворимые рецепторы, пептидные ингибиторы, малые молекулы, гибриды лигандов); или антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с другими мишенями (например, антитела, которые связываются с другими цитокинами или факторами роста, их рецепторами или другими молекулами клеточной поверхности); и противовоспалительные цитокины или их агонисты.

В других воплощениях антитела, описанные в данном документе, используются в качестве вакцинных адъювантов для аутоиммунных расстройств, воспалительных заболеваний и т.д. Комбинации адъювантов для лечения этих типов расстройств являются подходящими для применения в комбинации с различными антигенами, где антигены получены из целевых аутоантигенов, то есть аутоантигенов, участвующих в аутоиммунитете, таких как основной белок миелина; воспалительные аутоантигены, такие как амилоидный пептидный белок; или трансплантационные антигены, такие как аллоантигены. Антигены могут включать пептиды или полипептиды, полученные из белков и фрагментов любого из следующего: сахара, белки, полинуклеотиды или олигонуклеотиды, аутоантигены, белки амилоидных пептидов, антигены трансплантации, аллергены или другие макромолекулярные компоненты. В некоторых примерах в антигенную композицию входит более одного антигена.

В целях ясности и краткого описания, признаки описаны в данном документе как часть одинаковых или отдельных воплощений, однако следует понимать, что объем настоящего изобретения может включать некоторые воплощения, имеющие комбинации всех или некоторых из описанных признаков.

Воплощения

1. Рекомбинантная экспрессия белка внеклеточной области IL-4Rα в эукариотических клетках

Синтезировали плазмидный ген AgH01-pUC57-Amp (SynbioTech), содержащий внеклеточную область человеческого IL-4Rα (Uniprot P24394, 26-232). Используя эту плазмиду в качестве матрицы, 5’-ctgagaggtgccagatgtatgaaggtgctgcag-3 ’в качестве прямого праймера и 5’-tccgcctccgccgctagcgtgctgctcgaaggg-3’ в качестве обратного праймера, амплифицировали внеклеточный фрагмент человеческого IL-4Rα с помощью ПЦР. Амплифицированные продукты лигировали с использованием NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (NEB, Cat: M0530L) и клонировали в самостоятельно сконструированную эукариотическую экспрессирующую плазмидную систему (гибридный белок с C-концевой меткой 6 × his). Аналогично, последовательность ДНК, кодирующую внеклеточную область IL-4Rα яванского макака (Uniprot Q6JHZ9, 24-231), клонировали в систему экспрессирующих плазмид эукариот с помощью синтетической плазмиды AgC01-pUC57-Amp в качестве матрицы. Ген, кодирующий человеческий IL-4 (Uniprot P05112, 25-153), клонировали в систему эукариотических экспрессирующих плазмид, используя синтетическую плазмиду Ag1104-PUC57-Amp в качестве матрицы. Ген, кодирующий человеческий IL13Rα1 (Uniprot P78552, 27-343), клонировали в систему эукариотических экспрессирующих плазмид с использованием приобретенной клонирующей плазмиды кДНК IL13Rα1 (Sino Biological, Cat: HG10943-M) в качестве матрицы. После трансфекции клеток HEK293-6E этими плазмидами в течение 7 дней культуральную надосадочную жидкость собирали и очищали никель-хелатной колонкой для получения рекомбинантных белков внеклеточной области IL-4Rα человека (hIL-4Rα), внеклеточной области IL-4Rα яванского макака (cynoIL-4Rα), внеклеточной области IL-13Rα1 человека (hIL-13Rα1) и IL-4 человека (hIL-4).

Результаты представлены на фигурах 1А, 1В, 1С и 1D, где показано, что размер белков внеклеточных областей IL-4Rα человека и яванского макака составляет около 40 килодальтон; размер белка внеклеточной области человеческого IL-13Rα1 составляет около 55 килодальтон; и размер белка человеческого IL-4 составляет около 20 килодальтон.

2. Получение стабильно трансфицированной клеточной линии HEK293-hIL-4Rα

Экспрессирующую плазмиду, содержащую полноразмерную последовательность hIL-4Rα, смешивали с PEI в соотношении 1: 3 в среде Opti-MEM и оставляли при комнатной температуре на 20 минут. Клетки, инокулированные в 6-луночный планшет накануне, вынимали, и конфлюентность клеток, наблюдавшаяся под микроскопом составляла около 80%. Среду DMEM (Gibco) аспирировали и добавляли 4,5 мл предварительно нагретой среды Opti-MEM (Gibco). Затем смесь плазмида-PEI по каплям добавляли в клетки, осторожно встряхивали и культивировали в инкубаторе с диоксидом углерода при 37°С; спустя 24 часа для скрининга культуры добавляли пуромицин (Gibco), вещество для скрининга эукариот, в концентрации 1 мкг/мл. Клетки, выращенные в среде для скрининга, наблюдали под микроскопом, а субклоны получали путем скрининга посредством ограниченного разведения. Анализ FACS проводили после достижения конфлуентности моноклональными клетками в лунках.

Среду аспирировали, клетки промывали буфером PBS, добавляли 200 мкл трипсина для гидролиза в течение короткого времени и добавляли 700 мкл полной среды для прекращения гидролиза. Отбирали 300 мкл клеточной суспензии для окрашивания, а оставшиеся клетки помещали в инкубатор при 37°С для продолжения культивирования. Добавляли 500 мкл 0,5% BSA/PBS к клеткам, используемым для окрашивания в каждой пробирке, и затем центрифугировали при 200 g в течение 3 минут и дважды промывали. 2 мкл контрольного антитела (Sino Biological, Cat: 10402-R209) добавляли в качестве первичного антитела к 800 мкл 1% раствора BSA/PBS до конечной концентрации 10 мкг/мл; 100 мкл того же добавляли в каждую пробирку и инкубировали на льду и в темноте в течение 1 часа. Аналогично, добавляли 500 мкл 0,5% BSA/PBS в каждую пробирку, центрифугировали при 200g в течение 3 минут и дважды промывали. Вторичное антитело, конъюгированное с FITC, козье антитело против IgG кролика (BD Biosciences, Cat: 554020) добавляли в разведении 1: 200, 100 мкл того же добавляли в каждую пробирку и инкубировали на льду в течение 1 часа в темноте. Аналогично, добавляли 500 мкл 0,5% BSA/PBS в каждую пробирку, центрифугировали при 200g в течение 3 минут и промывали три раза. Клетки ресуспендировали с добавлением 300 мкл раствора PBS и детектировали на проточном цитометре. Результаты, представленные на фигуре 2, показывают, что получены моноклональные клетки HEK293, стабильно экспрессирующие hIL-4Rα.

3. Получение антитела против hIL-4Rα

3.1. Иммунизация животных

Рекомбинантный белок hIL-4Rα смешивали в виде антигена с равным количеством иммунологического адъюванта (адъюванта Фрейнда), и иммунизировали пять 6-недельных самок мышей Balb/c подкожной инъекцией в брюшную область. После примирующей иммунизации бустерную иммунизацию проводили каждые две недели. После четырех иммунизаций кровь брали из хвоста, и титр сыворотки и ингибирование связывания с лигандом hIL-4 у 5 мышей определяли с помощью ELISA, соответственно.

Брали один 96-луночный планшет для ELISA (Thermo Maxisorp), добавляли 100 мкл PBS (ZSGB-BIO, Item No. ZLI-9063) в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Извлекали 5 мкл рекомбинантного белка IL-4Rα с концентрацией 1 мг/мл, добавляли к 5 мл 0,05 М карбонатного покрывающего буфера (рН 9,5) и перемешивали вверх-вниз до получения 1 мкг/мл антигенного покрывающего раствора. Раствор PBS в лунках планшета отбрасывали, и 100 мкл антигенного покрывающего раствора добавляли в каждую лунку и инкубировали при 4°С в течение ночи. Раствор для покрытия отбрасывали из покрытых лунок планшета, который затем промывали 3 раза PBS-T, и дополнительно добавляли 200 мкл 2% молока/PBS в каждую лунку и затем блокировали при комнатной температуре в течение 2 часов; отбрасывали блокирующий раствор, а лунки трижды промывали PBS для использования. Для экспериментов с титром сыворотки образцы сыворотки от 5 мышей разбавляли серийно 1: 200, 1: 800, 1: 3200, 1: 12800, 1: 51200, 1: 204800 и 1: 81200 и 100 мкл каждого разведения добавляли в лунки планшета и инкубировали при 37°С в течение 1,5 часов. Лунки трижды промывали PBS-T и PBS и сушили центрифугированием. Вторичное антитело против mIgG Fc-HRP (Jackson, Cat: 115035071) разводили в соотношении 1: 4000 0,5% BSA, и 100 мкл того же добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Для эксперимента по блокированию сыворотки образцы сыворотки 5 мышей разводили в 1:20, 1: 200 и 1: 2000, и добавляли по 50 мкл их в каждую лунку и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Брали EP-пробирку объемом 5 мл, отбирали блокирующий раствор, добавляли 3 мл 0,5% БСА и дополнительно добавляли 1,1 мкл меченного биотином человеческого IL-4 до конечной концентрации 625 нг/мл; 50 мкл того же добавляли в каждую лунку и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Лунки трижды промывали PBS-T и PBS и сушили центрифугированием. Вторичное антитело SA-HRP (BD bioscience, Cat: 6222697) разводили в соотношении 1: 8000 с 0,5% BSA, и 100 мкл его добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Лунки трижды промывали PBS-T и PBS и сушили центрифугированием. 100 мкл раствора субстрата TMB (Sigma, Cat: T2885) добавляли в каждую лунку, и реакцию проводили при 37°C в темноте; когда субстрат умеренно окрашен, затем в каждую лунку добавляли 50 мкл H2SO4 для прекращения реакции и измеряли оптическую плотность 450 нм с использованием считывающего устройства для микропланшетов (BioTek, Synergy HT) в течение 15 минут; данные собирали и результаты рассчитывали с использованием программного обеспечения Graph Pad Prism 5. Результаты, представленные на фигуре 3А, показывают, что титр антител в сыворотке 5 иммунизированных мышей может достигать 1: 819200. Результаты, представленные на фигуре 3В, показывают, что антитела в сыворотке иммунизированных мышей № 3 и № 4 могут ингибировать связывание человеческого IL-4 с рецептором IL-4.

3.2. Приготовление антительной библиотеки фагового дисплея

Через три дня после стимуляции через хвостовую вену иммунизированных мышей № 3 и № 4, как указано выше, умерщвляли смещением шейных позвонков и собирали селезенку и периферические лимфатические узлы мышей; после размалывания в буфере PBS отбирали суспензию, обогащенную В-клетками, и собирали В-клетки центрифугированием. Общую РНК экстрагировали из В-клеток с использованием набора для экстракции РНК Trizol, и получали библиотеку кДНК тяжелой цепи антитела путем обратной транскрипции с использованием специфического для тяжелой цепи праймера с помощью набора для обратной транскрипции (SuperScriptTM First-Strand Synthesis System, Каталожный номер: 18080051), используя кДНК в качестве матрицы, фрагмент вариабельной области тяжелой цепи антитела амплифицировали с помощью ПЦР с использованием набора праймеров вариабельной области тяжелой цепи; после двойного расщепления NcoI и NheI фрагмент вариабельной области тяжелой цепи амплифицированного антитела клонировали в фагмиду pDS-mHC, сконструированную самостоятельно. Аналогично, библиотеку кДНК легкой цепи получали путем обратной транскрипции с использованием специфического для легкой цепи праймера. Используя кДНК в качестве матрицы, фрагмент вариабельной области легкой цепи антитела амплифицировали с помощью ПЦР с использованием набора праймеров вариабельной области легкой цепи; после двойного расщепления NcoI и BsiWI фрагмент вариабельной области легкой цепи антитела клонировали в фагмиду pDS-LC, сконструированную самостоятельно. Затем конструировали библиотеку фагового дисплея с Fab мыши на основе нитчатого фага M13 с емкостью библиотеки 6 × 10⁹.

3.3. ELISA-скрининг антител, которые связываются с hIL-4Rα

Fab-антитело со специфичностью в отношении IL-4Rα выделяли из библиотеки фагового дисплея с использованием обычного биопэннинга серии рекомбинантных белков IL-4Rα человека. Вкратце, отбирали 25 мкл рекомбинантного белка IL-4Rα с концентрацией 1 мг/мл и добавляли к 5 мл PBS (ZSGB-BIO, № ZLI-9063) покрывающего раствора и смешивали вверх-вниз для получения 5 мкг/мл антигенного покрывающего раствора. IL-4R, приготовленный в 0,05 М карбонатном покрывающем буфере (рН 9,5), наносили на иммунопробирку (Immunotube Maxisorp, Nunc) при 4°С в течение ночи. Иммунопробирку промывали PBS и затем блокировали 5% BSA в течение 2 часов. Очищенный фаг Fan, полученный с BSA в конечной концентрации 1%, добавляли в иммунопробирку и оставляли связываться с покрытым антигеном в течение 1 часа. Проводили многократные промывки с помощью PBS-Tween (0,5% об./об.) и PBS для удаления несвязанного фага, и связанные частицы фагов элюировали 100 мМ триэтиламином; после нейтрализации 1 М трис-HCl (рН 7,4) элюированными частицами фага инфицировали бактерии E. coli TG1 и извлекали для следующего цикла скрининга обогащения. После двух раундов биопэннинга одиночные колонии отбирали в 96-луночные планшеты U-типа для индуцированной IPTG экспрессии, а надосадочную жидкость отбирали для скрининга ELISA.

10 мкл раствора 1 мг/мл hIL-4Rα извлекали, добавляли к 10 мл 0,05 М карбонатного покрывающего буфера (рН 9,5) и перемешивали вверх-вниз до получения 1 мкг/мл антигенного покрывающего раствора. Приготовленный антигенный покрывающий раствор добавляли в 96-луночный планшет для ELISA (Thermo Maxisorp) по100 мкл на лунку. 96-луночный планшет ELISA обертывали герметизирующей мембраной и инкубировали в течение ночи при 4°С. На следующий день планшет для ELISA извлекали, помещали в устройство для мойки планшетов (BioTek, Synergy HT) и трижды промывали PBS; раствор PBS, содержащий 2% BSA, добавляли с 200 мкл на лунку и блокировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем блокирующий раствор отбрасывали и планшет трижды промывали PBS. Индуцированную надосадочную жидкость последовательно добавляли в соответствующие лунки по 50 мкл на лунку, лунки инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, отбрасывали надосадочную жидкость и промывали лунки 3 раза PBS-T и PBS, соответственно. Раствор ТМВ (Sigma, номер по каталогу: T2885) добавляли в 96-луночный планшет для ELISA ряд за рядом по 100 мкл на лунку. После выдерживания при 37°С в течение 5 минут реакцию немедленно останавливали путем добавления 50 мкл 2 М концентрированного раствора серной кислоты в 96-луночный планшет для ELISA. 96-луночный планшет для ELISA помещали в считывающее устройство для микропланшетов (BioTek, Synergy HT), считывали значение OD450, собирали данные и рассчитывали результаты с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5. Всего из-за индукции IPTG отбирали 3100 отдельных колоний, и 576 из них определили с помощью ELISA как связывающиеся с антигеном hIL-4Rα.

3.3. ELISA-скрининг антител, которые ингибируют взаимодействие между человеческими IL-4 и hIL-4Rα

576 положительных одиночных колоний, связывающихся с антигеном hIL-4Rα, реиндуцировали с помощью IPTG, и надосадочную жидкость отбирали для скрининга с помощью ELISA. Брали семь 96-луночных планшетов для ELISA (Thermo Maxisorp) и 100 мкл PBS (ZSGB-BIO, Item No. ZLI-9063) добавляли в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Извлекали 35 мкл рекомбинантного белка IL-4Rα с концентрацией 1 мг/мл, добавляли к 35 мл 0,05 М карбонатного покрывающего буфера (рН 9,5) и перемешивали вверх-вниз до получения 1 мкг/мл антигенного покрывающего раствора. Раствор PBS в лунках планшета отбрасывали, и 100 мкл антигенного покрывающего раствора добавляли в каждую лунку и инкубировали при 4°С в течение ночи. Раствор для покрытия отбрасывали из покрытых лунок планшета, который затем трижды промывали PBS-T, и в каждую лунку добавляли дополнительные 200 мкл 2% молока/PBS и затем блокировали при комнатной температуре в течение 2 часов; блокирующий раствор отбрасывали, а лунки трижды промывали PBS. 50 мкл антитела пипетировали из каждой лунки для индукции надосадочной жидкости, добавляли в планшет для ELISA с 50 мкл на лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Брали EP-пробирку объемом 5 мл, отбирали блокирующий раствор, добавляли 3 мл 0,5% BSA и дополнительно добавляли 1,1 мкл меченного биотином IL-4 до конечной концентрации 625 нг/мл; 50 мкл того же самого добавляли в каждую лунку и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Лунки трижды промывали PBS-T и PBS и сушили центрифугированием. Вторичное антитело SA-HRP (BD bioscience, Cat: 6222697) разводили в соотношении 1: 8000 с 0,5% BSA, и 100 мкл его добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Лунки трижды промывали PBS-T и PBS и сушили центрифугированием. 100 мкл раствора субстрата TMB добавляли в каждую лунку, и реакцию проводили при 37°C в темноте, субстрат умеренно окрашен, затем в каждую лунку добавляли 50 мкл H₂SO₄ для прекращения реакции, и OD 450 нм измеряли с использованием фермент-связанного детектора (BioTek, Synergy HT) в течение 15 минут, собирали данные и рассчитывали результаты с использованием программного обеспечения Graph Pad Prism 5. Среди положительных колоний, полученных в результате 3.2 ELISA, 120 отдельных колоний ингибируют связывание человеческого IL-4 с hIL-4Rα.

3.4. Анализ FACS на антитела, которые связываются с hIL-4Rα, экспрессируемым на поверхности клеточных мембран

Надосадочные жидкости вышеуказанных обнаруженных 120 положительных одиночных колоний, которые ингибируют связывание человеческого IL-4 с человеческим hIL-4Rα, отбирали для анализа FACS. Клетки HEK293 и стабильно трансфицированную клеточную линию HEK293-hIL-4Rα готовят с 5 × 10⁴ клеток на лунку, и количество CMFDA Cell Tracker Green (Invitrogen, Cat: C2925) для окрашивания клеток составляет 100 мкл зеленого раствора для отслеживания клеток на 1 × 10⁶ клеток, и инкубацию проводили в течение 30 минут в инкубаторе при 37°С; добавляли 5 мл 0,5% BSA/PBS и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3 минут и промывали 3 раза. Каждые 1 × 10⁶ клеток соответствовали 100 мкл 3% раствора BSA/PBS, и раствор блокировали при 4°С в течение 20 минут; подготовленные клетки добавляли в 96-луночный планшет U-типа в объеме 100 мкл/лунку и центрифугировали при 1100 об/мин в течение 3 минут, и отбрасывали надосадочную жидкость; добавляли раствор первичного антитела и инкубировали в течение 1 часа на льду. Очищенные антитела Fab разводили в сериях из 5 концентраций с начальной концентрацией 500 нМ (12,5 мкг/мл) и разводили в соответствии с серией 1:5. После инкубации с раствором первичного антитела дополнительно добавляли 0,5% BSA/PBS до объема 150 мкл, центрифугировали при 1100 об/мин в течение 3 минут и отбрасывали надосадочную жидкость; Затем добавляли 150 мкл 0,5% BSA/PBS, центрифугировали при 1100 об/мин в течение 3 минут и отбрасывали надосадочную жидкость; перед добавлением вторичного антитела против человеческого IgG, Fab’2-AF647 (Jackson), его разбавляли в соотношении 1: 300 с 1% BSA/PBS; 40 мкл разбавленного раствора вторичного антитела добавляли в каждую лунку и инкубировали на льду в течение 45 минут. После инкубации с раствором вторичного антитела дополнительно добавляли 0,5% BSA/PBS до объема 150 мкл, центрифугировали при 1100 об/мин в течение 3 минут и отбрасывали надосадочную жидкость; затем добавляли 150 мкл 0,5% BSA/PBS, центрифугировали при 1100 об/мин в течение 3 минут и отбрасывали надосадочную жидкость; добавляли 20-100 мкл PBS для ресуспендирования клеток до 1 × 10⁶ клеток на мл, и полученную суспензию загружали в проточный цитометр (I-Que screener). После открытия прибора и операционной системы в соответствии с правильным процессом и установки правильных параметров клетки загружали в тестовый планшет, где и обнаруживается флуоресцентный сигнал; анализ выполнялся с использованием программного обеспечения Graph Pad Prism 5, а результаты представлены на фигуре 3C, демонстрируя, что антитела, подвергнутые скринингу с помощью предварительного ELISA, специфически связаны со стабильно трансфицированными клетками HEK293, экспрессирующими IL-4Rα.

3.5. Анализ FACS на антитела, которые ингибируют взаимодействие между человеческим IL-4 и hIL-4Rα

Надосадочную жидкость первых 100 положительных одиночных колоний с сильным связыванием с hIL-4Rα, анализированных с помощью FACS, брали для экспериментов по ингибированию с рецепторами, экспрессирующимися на поверхности клетки. Клетки HEK293 и стабильно трансфицированные клетки HEK293-hIL-4Ra готовили в количестве 3 × 10⁴ клеток на лунку, а количество Cell Tracker™ Green CMFDA (Invitrogen, Cat: C2925) для окрашивания клеток составляло 100 мкл зеленого раствора для клеточного трекера на 1 × 10⁶ клеток, и инкубацию проводили в течение 30 минут в инкубаторе при 37°С; затем добавляли еще 5 мл 0,5% BSA/PBS, и их же центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3 минут и промывали 3 раза. Каждые 1 × 10⁶ клеток соответствуют 100 мкл 3% раствора BSA/PBS, и раствор блокировали при 4°С в течение 20 минут. Подготовленные клетки добавляли в 96-луночный планшет U-типа в объеме 100 мкл/лунку и центрифугировали при 1100 об/мин в течение 3 минут, и отбрасывали надосадочную жидкость; и раствор первичного антитела добавляли и инкубировали в течение 1 часа на льду. Очищенные антитела Fab разводили серийно на 5 концентраций с начальной концентрацией 100 нМ и разводили в соответствии с серией 1: 5. После инкубации с раствором первичного антитела дополнительно добавляли 0,5% BSA/PBS до объема 150 мкл, центрифугировали при 1100 об/мин в течение 3 минут и отбрасывали надосадочную жидкость; затем добавляли 150 мкл 0,5% BSA/PBS, центрифугировали при 1100 об/мин в течение 3 минут и отбрасывали надосадочную жидкость; Fc-меченный биотином человеческий IL-4-mIgG2a в конечной концентрации 0,15 мкг/мл добавляли и инкубировали на льду в течение 45 минут. Вторичное антитело SA-PE разводили в 1: 300 1% BSA/PBS; 40 мкл раствора вторичного антитела добавляли в каждую лунку и инкубировали на льду в течение 45 минут. После инкубации с раствором вторичного антитела дополнительно добавляли 0,5% BSA/PBS до объема 150 мкл, центрифугировали при 1100 об/мин в течение 3 минут и отбрасывали надосадочную жидкость; затем добавляли 150 мкл 0,5% BSA/PBS, центрифугировали при 1100 об/мин в течение 3 минут и отбрасывали надосадочную жидкость; добавляли 20-100 мкл PBS для ресуспендирования клеток до 1 × 10⁶ клеток на мл, и полученную суспензию загружали в проточный цитометр (I-Que screener). После открытия прибора и операционной системы в соответствии с правильным процессом и установки правильных параметров клетки загружали в тестовый планшет, где и обнаруживался флуоресцентный сигнал; анализ выполняли с использованием программного обеспечения Graph Pad Prism 5. Результаты, представленные на фигуре 3D, показывают, что 15 антител из положительных одиночных колоний, проверенных с помощью предварительного ELISA, могут ингибировать связывание стабильно трансфицированных клеток, экспрессирующих hIL-4Rα, с IL-4 человека.

4. Скрининг с помощью Fortebio на Fab-антитела, которые ингибируют связывание hIL-4Rα с комплексом hIL-13Rα/hIL-13

4.1. Обнаружение связывания hIL-4Rα с комплексом hIL-13Rα/hIL-13

1 мл hIL-13Rα (в концентрации 400 нг/мл) и 1 мл hIL-13 (Sino Biological, кат. № 10369-HNAC, в концентрации 400 нг/мл) брали и перемешивали при соотношении 1:1 с рабочей концентрацией 200 нг/мл, отстаивали, инкубировали и давали связаться при комнатной температуре в течение 2 часов. Комплекс hIL-13Rα/hIL-13, имевший начальную концентрацию 200 нг/мл и разбавляли серийно 1:1; готовили три серийных разведения: 200 нг/мл, 100 нг/мл и 50 нг/мл, при 100 мкл на лунку в 96-луночном планшете и устанавливали группы пустого контроля. Вначале меченный биотином hIL-4Rα иммобилизовали и связывали с зондом SA (при рабочей концентрации 10 нг/мл), в каждую лунку добавляли 100 мкл этого же вещества, а связывание с hIL-13Rα/hIL-13 детектировали с помощью Fortebio; экспериментальный способ редактировали для прогона, и результаты эксперимента анализировали в программном обеспечении Fortebio. Результаты, представленные на фигуре 4А, показывают, что hIL-4Rα может связываться с комплексом hIL-13Rα/hIL-13.

4.2. Обнаружение антител, которые ингибируют связывание hIL-4Rα с комплексом hIL-13Rα/hIL-13

Вышеуказанные эксперименты демонстрируют, что hIL-4Rα может связываться с комплексом hIL-13Rα/hIL-13, и на этом основании Fab-антитела, которые ингибируют связывание hIL-4Rα с комплексом hIL-13Rα/hIL-13, подвергали дополнительному скринингу, в котором сравнивали ингибирующий эффект потенциальных Fab-антител, прошедших скрининг в предыдущем периоде, при этом рабочий буфер брали в качестве группы отрицательного контроля. Меченный биотином hIL-4Rα иммобилизовали зондом (в концентрации 10 нг/мл), и рабочие концентрации Fab-антител-кандидатов доводили до 100 мкг/мл, а концентрация комплекса hIL-13Rα/hIL-13 составляла 200 нг/мл; вначале меченный биотином hIL-4Rα иммобилизовали зондом SA (в рабочей концентрации 10 нг/мл), в каждую лунку добавляли 100 мкл этого же вещества, и ингибирующий эффект антител Fab-кандидатов на hIL-4Rα и комплекс hIL-13Rα/hIL-13 выявляли с помощью Fortebio; экспериментальный способ редактировали для прогона, и результаты эксперимента анализировали в программном обеспечении Fortebio. Результаты, представленные на фигуре 4В, показывают, что антитела-кандидаты могут ингибировать связывание hIL-4Rα с комплексом hIL-13Rα/hIL-13.

5. Последовательность вариабельной области кандидатного положительного моноклонального антитела

Положительные моноклональные плазмиды экстрагировали и секвенировали для получения последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей потенциальных положительных колоний:

Клон 1А6:

Тяжелая цепь

Нуклеотидная последовательность

Легкая цепь

Нуклеотидная последовательность

Клон 1D8:

Тяжелая цепь

Нуклеотидная последовательность

Легкая цепь

Нуклеотидная последовательность

Клон 1H9:

Тяжелая цепь

Нуклеотидная последовательность

Легкая цепь

Нуклеотидная последовательность

Клон 2H1:

Тяжелая цепь

Нуклеотидная последовательность

Легкая цепь

Нуклеотидная последовательность

Клон 2F8:

Тяжелая цепь

Нуклеотидная последовательность

Легкая цепь

Нуклеотидная последовательность

Клон 9B4:

Тяжелая цепь

Нуклеотидная последовательность

Легкая цепь

Нуклеотидная последовательность

Клон 9E7:

Тяжелая цепь

Нуклеотидная последовательность

Легкая цепь

Нуклеотидная последовательность

Клон 24G10:

Тяжелая цепь

Нуклеотидная последовательность

Легкая цепь

Нуклеотидная последовательность

Клон 25D6:

Тяжелая цепь

Нуклеотидная последовательность

Легкая цепь

Нуклеотидная последовательность

Клон 25G9:

Тяжелая цепь

Нуклеотидная последовательность

Легкая цепь

Нуклеотидная последовательность

Клон 35A7:

Тяжелая цепь

Нуклеотидная последовательность

Легкая цепь

Нуклеотидная последовательность

Клон 31B9:

Тяжелая цепь

Нуклеотидная последовательность

Легкая цепь

Нуклеотидная последовательность

Клон 34A2:

Тяжелая цепь

Нуклеотидная последовательность

Легкая цепь

Нуклеотидная последовательность

Клон 34H11:

Тяжелая цепь

Нуклеотидная последовательность

Легкая цепь

Нуклеотидная последовательность

Клон 35D5:

Тяжелая цепь

Нуклеотидная последовательность

Легкая цепь

Нуклеотидная последовательность

Клон 35A7:

Тяжелая цепь

Нуклеотидная последовательность

Легкая цепь

Нуклеотидная последовательность

Клон 36F4:

Тяжелая цепь

Нуклеотидная последовательность

Легкая цепь

Нуклеотидная последовательность

6. Конструирование экспрессирующего вектора химерного антитела

Фрагменты последовательностей вариабельной области тяжелой и легкой цепей, описанные выше, амплифицировали с помощью ПЦР, и вариабельную область тяжелой цепи клонировали в вектор, содержащий константную область тяжелой цепи человека и регуляторные элементы для экспрессии всей тяжелой цепи IgG в клетках млекопитающих. Аналогично, вариабельную область легкой цепи клонировали в вектор, содержащий константную область легкой цепи человека и регуляторные элементы для экспрессии всей легкой цепи IgG в клетках млекопитающих. После подтверждающего секвенирования вектор трансфицировали в клетки млекопитающих HEK293-6E, которые секретировали IgG в культуральную среду путем экспрессии, после чего надосадочную жидкость объединяли, собирали и очищали фильтрацией. IgG очищали хроматографией на белке А, надосадочную жидкость культуры загружали в колонку с белком А надлежащего размера и промывали 50 мМ Трис-HCl (рН 8,0) и 250 мМ NaCl, и элюировали связанный IgG с помощью 0,1 М глицина-HCl (рН 3,0). Белок концентрировали ультрафильтрацией с использованием концентрирующей пробирки (Millipore), определяли OD280, а концентрацию IgG определяли спектрофотометрически. Агрегацию или деградацию очищенного IgG анализировали с помощью SDS-PAGE.

7. Анализ аффинности антител с помощью Fortebio

PBS добавляли в любую колонку 96-луночного планшета, 100 мкл/лунку, и 96-луночный планшет помещали в кассету держателя зонда. При извлечении зонда необходимо быть осторожными, при подвешивании его на держатель так, чтобы датчик не касался держателя. Иммобилизованный меченный биотином hIL-4Ra разводили до 5 мкг/мл PBS; брали новый 96-луночный планшет, и разбавленный иммобилизованный материал добавляли столбец за столбцом, по 100 мкл/лунку. Антитело разводили до 50 мкг/мл с помощью PBS, а затем разводили в 1: 1 для приготовления 6 серий концентраций: 50 мкг/мл, 25 мкг/мл, 12,5 мкг/мл, 6,25 мкг/мл, 3,125 мкг/мл, 0 мкг/мл, с 100 мкл на лунку, это количество может быть соответствующим образом отрегулировано в зависимости от способности связывания конкретного аналита. Брали новый 96-луночный планшет и добавляли PBS в столбцы 1 и 2, по 100 мкл/лунку (один и тот же буфер как для исходного уровня, так и для диссоциации); добавляли разбавленный иммобилизованный материал в столбец 3; аналит, разведенный в соответствии с серией, добавляли в столбец 4; добавляли 10 мМ HCl (pH 1,9) в столбец 11; и добавляли PBS в столбец 12. Зонд SA очень сильно связывается с иммобилизованным биотиновым материалом. При регенерации иммобилизованный материал все еще связан с зондом, поэтому его можно использовать повторно после иммобилизации только один раз. Затем устанавливали экспериментальный способ в программном обеспечении Fortebio, а затем запускали экспериментальную программу для детекции. Результаты определения аффинности антител представлены в таблице 1 ниже.

Таблица 1

No.	KD (нм)	kon (1/мс)	kdis (1/с)
31H7	9,6	2,66E + 04	2,56E-04
31B9	1,9	3,30E + 04	6,28E-05
34A2	0,001	2,90E + 04	1,00Е-07
34H11	6,6	2,69E + 04	1,76E-04
35D5	1,3	3,87E + 04	5,05E-05
35A7	0,001	2,47E + 04	1,00Е-07
36F4	1,8	5,09E + 04	9,37E-05
24G10	0,94	2,53E + 04	2,37E-05
25D6	5,9	2,65E + 04	1,57E-04
25G9	0,001	3,79E + 04	1,00Е-07
1D8	8,06	7,01E + 04	5,66E-04
2H1	5,27	7,16E + 04	3,77E-04
1B6	20,78	2,46E + 04	5,10E-04
1A6	11,3	5,30E + 04	6,02E-04
1H9	8,9	2,93E + 04	2,62E-04
2F8	0,9	2,93E + 04	8,68E-06

8. Гуманизация антител

Выбранную последовательность вариабельной области моноклонального антитела выравнивают с последовательностями зародышевой линии антител человека, чтобы найти последовательность с высокой гомологией для прививки CDR; затем использовали компьютер для моделирования гомологии, анализировали аминокислотные последовательности области CDR и окружающей ее структуры каркаса, и исследовали их пространственную стереоскопическую комбинацию. Посредством расчета электростатической силы, силы Ван-дер-Ваальса, гидрофильности и энтропии анализировали ключевые индивидуальные аминокислоты, которые могут взаимодействовать с IL-4Rα и поддерживать пространственную структуру в последовательности гена положительного моноклонального антитела, и на основании этого разрабатывали сайты мутации реверсии. Аффинность HLA-DR анализировали и исследовали для отбора эмбриональной каркасной последовательности человека с низкой иммуногенностью.

Всего разработали 8 производных тяжелых цепей (от VH1021 до VH1028) и 4 производных легких цепей (от VL1011 до VL1014); производные легкой и тяжелой цепи синтезировали отдельно (SynbioTech, Suzhou и GENE WIZ, Suzhou) и клонировали в векторы pHCT2 и HCT1, содержащие константную область цепи каппа антитела Ckappa или константную область IgG1 человека CH1-CH3; подбирали и использовали плазмиды для трансфекции клеток HEK293.6E для экспрессии в течение 5-6 дней; отбирали и очищали надосадочную жидкость с помощью колонки с белком А.

Последовательности вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела:

VH1021:

VH1022:

VH1023:

VH1024:

VH1025:

VH1026:

VH1027:

VH1028:

Последовательности вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела:

VL1011:

VL1012:

VL1013:

VL1014:

9. FACS-анализ связывания гуманизированных антител-кандидатов с IL-4Rα

9.1. FACS-анализ связывания гуманизированных антител-кандидатов со стабильно трансфицированной клеточной линией HEK293-IL-4Rα

Для дальнейшей проверки связывания гуманизированных антител-кандидатов с IL-4Rα с помощью FACS, клетки HEK293 и стабильно трансфицированные клетки 293-hIL-4Rα получали в количестве 5 × 10⁴ клеток на лунку; добавляли 5 мл 0,5% BSA/PBS и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3 минут и промывали 3 раза. Каждые 1 × 10⁶ клеток соответствуют 100 мкл 3% раствора BSA/PBS, и раствор блокировали при 4°С в течение 20 минут. Подготовленные клетки добавляли в 96-луночный планшет U-типа в объеме 100 мкл/лунку и центрифугировали при 1100 об/мин в течение 3 минут, и отбрасывали надосадочную жидкость; и раствор первичного антитела добавляли и инкубировали в течение 1 часа на льду. Очищенные антитела Fab разводили в сериях из 5 концентраций с начальной концентрацией 500 нМ (12,5 мкг/мл) и разводили в соответствии с серией 1:5. После инкубации с раствором первичного антитела дополнительно добавляли 0,5% BSA/PBS до объема 150 мкл, центрифугировали при 1100 об/мин в течение 3 минут и отбрасывали надосадочную жидкость. Затем добавляли 150 мкл 0,5% BSA/PBS, центрифугировали при 1100 об/мин в течение 3 минут и отбрасывали надосадочную жидкость; перед добавлением вторичного антитела против человеческого IgG, Fab’2-AF647, его разбавляли в соотношении 1: 300 1% BSA/PBS. 40 мкл раствора вторичного антитела добавляли в каждую лунку и инкубировали на льду в течение 45 минут. После инкубации с раствором вторичного антитела дополнительно добавляли 0,5% BSA/PBS до объема 150 мкл, центрифугировали при 1100 об/мин в течение 3 минут и отбрасывали надосадочную жидкость; затем добавляли 150 мкл 0,5% BSA/PBS, центрифугировали при 1100 об/мин в течение 3 минут и отбрасывали надосадочную жидкость; добавляли 20-100 мкл PBS для ресуспендирования клеток до 1 × 10⁶ клеток на мл, и полученную суспензию загружали в проточный цитометр (I-Que screener). После открытия прибора и операционной системы в соответствии с правильным процессом и установки правильных параметров клетки загружали в тестовый планшет, где и обнаруживался флуоресцентный сигнал; анализ выполняли с использованием программного обеспечения Graph Pad Prism 5. Результаты, представленные на фигуре 5А, показывают, что гуманизированные антитела-кандидаты специфически связываются со стабильно трансфицированными клетками HEK293, экспрессирующими IL-4Rα.

9.2. FACS-анализ ингибирования гуманизированными антителами-кандидатами связывания человеческого IL-4 со стабильно трансфицированными клетками HEK293-IL-4Rα

Клетки HEK293 и стабильно трансфицированные клетки 293-hIL-4Rα получали в количестве 3 × 10⁴ клеток на лунку; добавляли 5 мл 0,5% BSA/PBS и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3 минут и промывали 3 раза. Каждые 1 × 10⁶ клеток соответствуют 100 мкл 3% раствора BSA/PBS, и раствор блокировали при 4°С в течение 20 минут. Подготовленные клетки добавляли в 96-луночный планшет U-типа в объеме 100 мкл/лунку, центрифугировали при 1100 об/мин в течение 3 минут, и отбрасывали надосадочную жидкость; раствор первичного антитела добавляли и инкубировали в течение 1 часа на льду. Очищенные антитела-кандидаты превращали в 5 концентрационных серий с начальной концентрацией 100 нМ и разбавляли в соответствии с серией 1:5. После инкубации с раствором первичного антитела дополнительно добавляли 0,5% BSA/PBS до объема 150 мкл, центрифугировали при 1100 об/мин в течение 3 минут и отбрасывали надосадочную жидкость. Затем добавляли 150 мкл 0,5% BSA/PBS, центрифугировали при 1100 об/мин в течение 3 минут и отбрасывали надосадочную жидкость; добавляли меченный биотином IL-4 в конечной концентрации 0,15 мкг/мл и инкубировали на льду в течение 45 минут. Вторичное антитело SA-PE разводили в 1: 300 1% BSA/PBS; 40 мкл раствора вторичного антитела добавляли в каждую лунку и инкубировали на льду в течение 45 минут. После инкубации с раствором вторичного антитела дополнительно добавляли 0,5% BSA/PBS до объема 150 мкл, центрифугировали при 1100 об/мин в течение 3 минут и отбрасывали надосадочную жидкость; затем добавляли 150 мкл 0,5% BSA/PBS, центрифугировали при 1100 об/мин в течение 3 минут и отбрасывали надосадочную жидкость. Добавляли 20-100 мкл PBS для ресуспендирования клеток до 1 × 10⁶ клеток на мл, и полученную суспензию загружали в проточный цитометр (I-Que screener). После открытия прибора и операционной системы в соответствии с правильным процессом и установки правильных параметров клетки загружали в тестовый планшет, где и обнаруживался флуоресцентный сигнал; анализ выполняли с использованием программного обеспечения Graph Pad Prism 5. Результаты, представленные на фигуре 5В, показывают, что антитела-кандидаты могут ингибировать связывание человеческого IL-4 с клетками, экспрессирующими hIL-4Rα.

10. Ингибирование гуманизированными антителами-кандидатами влияния hIL-4 или hIL-13 на пролиферацию клеток TF-1

10.1. Эксперимент по стимуляции пролиферации клеток TF-1 с помощью hIL-4 или hIL-13

Криоконсервированные клетки TF-1 (ATCC: CRL-2003TM) извлекали из резервуара с жидким азотом и осторожно встряхивали на водяной бане при 37°C для быстрого оттаивания. Оттаянную клеточную суспензию переносили в центрифужную пробирку на 50 мл, содержащую 10 мл предварительно нагретой среды 1640 (Gibco, Cat: C11875500BT), и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3 минут; надосадочную жидкость отбрасывали, добавляли полную среду 1640, содержащую GM-CSF, и переносили во флакон T75 для культивирования клеток и помещали в инкубатор для клеток с 5% диоксида углерода при 37°C для статического культивирования. Суспензию клеток вынимали каждые 2-3 дня и центрифугировали при 800 об/мин в течение 3 минут; клетки ресуспендировали с добавлением 15 мл полной среды 1640, и 1 × 10⁶ клеток брали и помещали во флакон Т75 для культивирования, содержащий 10 мл полной среды 1640, в течение 2-3 последовательных пассажей. Когда клетки становились кристально чистыми, в одноклеточном и суспензионном состоянии и слегка нерегулярными по морфологии, а жизнеспособность клеток превышала 90%, проводили эксперимент по обнаружению активности клеток.

Согласно экспериментальному плану готовили клеточный раствор, содержащий 1,5 × 10⁶ клеток, центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут, а затем отбрасывали надосадочную жидкость; клеточный осадок ресуспендировали в полной среде без GM-CSF, центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут, отбрасывали надосадочную жидкость и полученный клеточный осадок ресуспендировали в 4,2 мл полной среды без GM-CSF. Образцы подсчитывали под микроскопом, и плотность клеток в жидкости доводили до 3 × 10⁵ клеток/мл на основании результата подсчета. Затем раствор клеток и культуральную среду добавляли в 96-луночный планшет, 100 мкл/лунку, 200 мкл PBS добавляли к группам с пустыми образцами и планшет культивировали в инкубаторе в течение 24 часов в условиях 37°С и 5% CO₂. Сначала hIL-4 (Sino Biological, кат. № 11846-HNAC) и hIL-13 (Sino Biological, кат. № 10369-HNAC) разводили до 100 нг/мл и 800 нг/мл, соответственно, затем его разводили 9 раз в 2х сериях и в соответствии с планом эксперимента разведенные IL-4 и IL-13 добавляли в лунки планшета с помощью многоканальной пипетки по 10 мкл на лунку и равномерно перемешивали. Планшет возвращали в инкубатор еще на 72 часа, планшет вынимали, клетки равномерно смешивали с помощью многоканальной пипетки, и 80 мкл раствора клеток равномерно пипетировали и добавляли в соответствующую лунку 96-луночного черного планшета для ELISA. Затем в каждую лунку добавляли 80 мкл Cell titer-Glo (Promega, Cat: G7570), предварительно растворенного и равномерно перемешанного, и затем осторожно встряхивали 96-луночный черный планшет для ELISA (JET, кат. № LTP-021-896) в шейкере (Thermo, кат. № 8880024) в течение 2 минут и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре для получения стабильного люминесцентного сигнала. Свечение детектировали с помощью считывающего устройства для ELISA, а время обнаружения устанавливали равным 1 секунде. Результаты, представленные на фигурах 6А и 6В, демонстрируют, что hIL-4 может стимулировать пролиферацию клеток TF-1 и что hIL-13 может стимулировать пролиферацию клеток TF-1, соответственно.

10.2. ELISA-детекция ингибирования влияния hIL-4 или hIL-13 на пролиферацию клеток TF-1 под действием гуманизированных антител-кандидатов

Клетки TF-1 культивировали, как описано в 5.1, добавляли по 100 мкл клеточного раствора (3 × 10⁵ клеток/мл) в 96-луночный планшет в соответствии с планом эксперимента и культивировали в течение 24 часов в условиях без каких-либо цитокинов, при этом краевые отверстия закрывали с помощью PBS. Антитело разводили до концентрации 1 мМ, hIL-4 разводили до 3 нг/мл, а hIL-13 разводили до 30 нг/мл. Антитело разводили в 2х сериях и добавляли к клеткам с 10 мкл/лунку, равномерно перемешивали и инкубировали в течение 1 часа в условиях 37°С и 5% СО₂; 10 мкл среды 1640 добавляли к контрольных группам, равномерно перемешивали и инкубировали в течение 1 часа в условиях 37°С и 5% СО₂. Согласно экспериментальному плану, hIL-4 и hIL-13 добавляли к клеткам с 10 мкл/лунку, равномерно перемешивали и культивировали в течение 72 часов в условиях 37°C и 5% CO₂; 10 мкл среды 1640 добавляли к контрольным группам, равномерно перемешивали и культивировали в течение 72 часов в условиях 37°С и 5% СО₂. Равномерно смешанный раствор клеток инокулировали в 96-луночный черный планшет для ELISA, 80 мкл/лунку; 80 мкл Cell Titer-Glo добавляли в каждую лунку, и планшет с микролунками осторожно встряхивали и равномерно перемешивали на шейкере в течение 2 минут и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре для получения стабильного люминесцентного сигнала. Свечение детектировали с помощью считывающего устройства для ELISA, а время обнаружения устанавливали равным 1 секунде. Результаты, показанные на фигуре 6C, фигуре 6D и фигуре 6E, демонстрируют, что гуманизированные антитела могут ингибировать пролиферацию клеток TF-1, стимулированную hIL-4, гуманизированные антитела могут ингибировать пролиферацию клеток TF-1, стимулированную hIL-13, гуманизированные антитела, могут одновременно ингибировать hIL-4-стимулированную и hIL-13-стимулированную пролиферацию клеток TF-1, соответственно.

11. Связывание гуманизированных антител-кандидатов с белками IL-4Rα яванского макака, мыши и крысы

1 мкг/мл hIL-4Rα человека, 10 мкг/мл cynoIL-4Rα яванского макака, 1 мкг/мл mIL-4Rα мыши (Sino Biological, кат. № 80198-R08H) и 1 мкг/мл ratIL-4Rα из крысы (Sino Biological кат. № 51180-M08H) разводили в 0,05 М карбонатном покрывающем буфере (рН 9,5) при 4°С в течение ночи. Раствор в лунках отбрасывали на следующий день, и лунки промывали 3 раза промывочным буфером PBS. Затем добавляли раствор PBS, содержащий 2% BSA, для блокирования в течение 2 часов. После промывки 3 раза буфером для промывки PBS добавляли 100 мкл гуманизированных антител-кандидатов в различных разбавленных концентрациях, инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре и затем 3 раза промывали буфером для промывки PBS; антитело, перекрестно-сшитое с HRP (Jackson Immuno Research) разводили в 1: 10000 промывочным буфером PBS и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывки 3 раза промывочным буфером PBS добавляли 100 мкл раствора субстрата TMB для проявления окраски и после реакции при комнатной температуре в течение 10 минут реакцию останавливали добавлением 50 мкл 0,5 М концентрированного раствора серной кислоты и измеряли оптическую плотность при 450 нм. Результаты: на фигуре 7А показано, что гуманизированные антитела-кандидаты связываются с человеческим белком IL-4Rα; на фигуре 7В показано, что гуманизированные антитела-кандидаты связываются с белком IL-4Rα яванского макака; на фигуре 7C показано, что гуманизированные антитела-кандидаты не связываются с белком IL-4Rα мыши; на фигуре 7D показано, что гуманизированные антитела-кандидаты связываются с белком IL-4R крысы; Можно видеть, что гуманизированные антитела могут связываться с белком IL-4Rα человека или яванского макака или крысы со схожей аффинностью, но не взаимодействуют с белком IL-4Rα мыши.

1. Антитело или его функциональный фрагмент, которое(ый) специфически связывается с IL-4Rα, выбранное(ый) из:

(1) антитела, содержащего CDR1 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 2, CDR2 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 3, и CDR3 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 4; и CDR1 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 7, CDR2 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 8, CDR3 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 9;

(2) антитела, содержащего CDR1 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 12, CDR2 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 13, и CDR3 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 14; и CDR1 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 17, CDR2 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 18, CDR3 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 19;

(3) антитела, содержащего CDR1 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 22, CDR2 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 23, и CDR3 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 24; и CDR1 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 27, CDR2 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 28, CDR3 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 29;

(4) антитела, содержащего CDR1 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 32, CDR2 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 33, и CDR3 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 34; и CDR1 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 37, CDR2 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 38, CDR3 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 39;

(5) антитела, содержащего CDR1 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 42, CDR2 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 43, и CDR3 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 44; и CDR1 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 47, CDR2 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 48, CDR3 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 49;

(6) антитела, содержащего CDR1 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 72, CDR2 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 73, и CDR3 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 74; и CDR1 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 77, CDR2 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 78, CDR3 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 79;

(7) антитела, содержащего CDR1 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 82, CDR2 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 83, и CDR3 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 84; и CDR1 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 87, CDR2 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 88, CDR3 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 89;

(8) антитела, содержащего CDR1 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 92, CDR2 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 93, и CDR3 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 94; и CDR1 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 97, CDR2 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 98, CDR3 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 99;

(9) антитела, содержащего CDR1 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 102, CDR2 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 103, и CDR3 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 104; и CDR1 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 107, CDR2 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 108, CDR3 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 109;

(10) антитела, содержащего CDR1 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 112, CDR2 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 113, и CDR3 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 114; и CDR1 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 117, CDR2 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 118, CDR3 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 119;

(11) антитела, содержащего CDR1 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 122, CDR2 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 123, и CDR3 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 124; и CDR1 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 127, CDR2 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 128, CDR3 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 129;

(12) антитела, содержащего CDR1 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 132, CDR2 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 133, и CDR3 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 134; и CDR1 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 137, CDR2 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 138, CDR3 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 139;

(13) антитела, содержащего CDR1 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:142, CDR2 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 143, и CDR3 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 144; и CDR1 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 147, CDR2 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 148, CDR3 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 149;

(14) антитела, содержащего CDR1 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 162, CDR2 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 163, и CDR3 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 164; и CDR1 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 167, CDR2 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 168, CDR3 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 169;

(15) антитела, содержащего CDR1 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:197, CDR2 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 198, и CDR3 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 199; и CDR1 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 212, CDR2 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 213, CDR3 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 214;

(16) антитела, содержащего CDR1 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:197, CDR2 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 198, и CDR3 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 199; и CDR1 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 217, CDR2 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 218, CDR3 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 219;

(17) антитела, содержащего CDR1 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:172, CDR2 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 173, и CDR3 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 174; и CDR1 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 222, CDR2 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 223, CDR3 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 224;

(18) антитела, содержащего CDR1 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:177, CDR2 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 178, и CDR3 тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 179; и CDR1 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 222, CDR2 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 223, CDR3 легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 224.

2. Антитело или его функциональный фрагмент, которое(ый) специфически связывается с IL-4Rα по п. 1, выбранное из:

(1) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6;

(2) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, и вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16;

(3) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26;

(4) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31, и вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36;

(5) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41, и вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 46;

(6) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 71, и вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 76;

(7) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 81, и вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 86;

(8) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 91, и вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 96;

(9) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 101, и вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 106;

(10) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 111, и вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 116;

(11) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 121, и вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 126;

(12) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 131, и вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 136;

(13) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 141, и вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 146;

(14) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 161, и вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 166;

(15) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 196, и вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 211;

(16) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 196, и вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 216;

(17) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 171, и вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 221;

(18) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 176, и вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 221.

3. Антитело или его функциональный фрагмент по п. 1 или 2, где антитело или его функциональный фрагмент ингибирует взаимодействие hIL-4 с hIL-4Rα; предпочтительно, антитело или его функциональный фрагмент также ингибирует связывание hIL-4Rα с комплексом hIL-13Rα/hIL-13; и, необязательно, антитело или его функциональный фрагмент является гуманизированным.

4. Антитело или его функциональный фрагмент по любому из пп. 1-3, где антитело или его функциональный фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 171 и вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 221.

5. Антитело или его функциональный фрагмент по любому из пп.1-4, где антитело или его функциональный фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 176, и вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 221.

6. Антитело или его функциональный фрагмент по любому из пп.1-5, где антитело или его функциональный фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 196, и вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 211.

7. Антитело или его функциональный фрагмент по любому из пп.1-6, где антитело или его функциональный фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 196, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 216.

8. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его функциональный фрагмент по любому из пп. 1-7.

9. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.8.

10. Клетка, содержащая вектор по п.9, или молекулу нуклеиновой кислоты по п.8, где клетка предназначена для экспрессии антитела или его функционального фрагмента по любому из пп.1-7.

11. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его функциональный фрагмент по любому из пп.1-7 и фармацевтически приемлемый носитель, где фармацевтическая композиция предназначена для лечения аллергических заболеваний, опосредованных Th2 заболеваний, опосредованных IL-13 заболеваний, опосредованных IL-4 заболеваний и/или опосредованных IL-4/IL-13 заболеваний.

12. Применение антитела или его функционального фрагмента по любому из пп.1-7 или фармацевтической композиции по п.11 при приготовлении лекарственного средства для лечения аллергических заболеваний, или астмы или хронического обструктивного заболевания легких у млекопитающих.

13. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по п.8, вектора экспрессии по п.9 или клетки по п.10 при получении антитела или функционального фрагмента по любому из пп.1-7.