Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности аденовирусов человекообразных обезьян, исключая человека, содержащие их векторы, и их применения

Авторы патента:

НИКОСИА, Альфредо (IT)

КОЛЛОКА, Стефано (IT)

ЛАМ, Армин (IT)

C12N7/00 - Вирусы, например бактериофаги; их композиции; приготовление или очистка их (лекарственные препараты, содержащие вирусы A61K 35/76; получение лекарственных составов, содержащих вирусные антигены или антитела, например вакцин из вирусов A61K 39/00)

C12N15/86 - вирусные векторы

C07K14/005 - из вирусов

A61K39/235 - аденовирус

Владельцы патента RU 2762854:

НОУСКОМ АГ (CH)

Изобретение относится к биотехнологии. Описаны аденовирусы с высокой иммуногенностью и отсутствием ранее существовавшего иммунитета в общей популяции людей. Отсутствие ранее существовавшего иммунитета обусловлено новыми гипервариабельными областями в аденовирусном капсидном белке гексоне. Настоящее изобретение относится к нуклеотидным и аминокислотным последовательностям этих новых штаммов аденовирусов, а также рекомбинантным вирусам, вирусоподобным частицам и векторам на основе этих штаммов. Кроме того, предусмотрены фармацевтические композиции и медицинские применения в терапии или профилактике заболевания и способы получения аденовируса или вирусоподобных частиц с использованием новых последовательностей, рекомбинантных вирусов, вирусоподобных частиц и векторов. Новые штаммы аденовирусов также обладают улучшенной способностью к размножению. Таким образом, изобретение расширяет арсенал терапевтических средств. 9 н. и 6 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 табл., 6 пр.

Настоящее изобретение относится к новым штаммам аденовирусов с высокой иммуногенностью и отсутствием ранее существовавшего иммунитета в общей популяции людей. Отсутствие ранее существовавшего иммунитета обусловлено новыми гипервариабельными областями в аденовирусном капсидном белке гексоне. Новые штаммы аденовирусов также обладают улучшенной способностью к размножению. Настоящее изобретение относится к нуклеотидным и аминокислотным последовательностям этих новых штаммов аденовирусов, а также рекомбинантным вирусам, вирусоподобным частицам и векторам на основе этих штаммов. Кроме того, предусмотрены фармацевтические композиции и медицинские применения в терапии или профилактике заболевания и способы получения аденовируса или вирусоподобных частиц с использованием новых последовательностей, рекомбинантных вирусов, вирусоподобных частиц и векторов.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Аденовирусы (Ad) представляют собой большое семейство двухцепочечных ДНК-вирусов, обнаруженных у амфибий, птиц и млекопитающих, которые характеризуются неразвитой структурой икосаэдрического капсида (Straus, Adenovirus infections in humans; The Adenoviruses, 451-498, 1984; Hierholzer et al., J. Infect.Dis.,158: 804-813,1988; Schnurr and Dondero, Intervirology., 36: 79-83,1993; Jong et al., J. Clin. Microbiol, 37: 3940-3945: 1999). В отличие от ретровирусов аденовирусы могут трансдуцировать многочисленные типы клеток нескольких видов млекопитающих, включая в себя как делящиеся, так и неделящиеся клетки, без интеграции в геном клетки-хозяина.

Вообще говоря, аденовирусная ДНК, как правило, является очень стабильной и остается эписомной (например, внехромосомной), если только не происходит трансформация или опухолеобразование. Кроме того, аденовирусные векторы могут размножаться с высокими выходами в четко определенных производственных системах, которые легко поддаются фармацевтическому крупносерийному производству композиций клинического качества. Эти характеристики и их хорошо охарактеризованная молекулярная генетика делают рекомбинантные аденовирусные векторы хорошими кандидатами для использования в качестве носителей вакцин. Производство рекомбинантных аденовирусных векторов может зависеть от использования пакующей клеточной линии, которая способна дополнять функции продуктов аденовирусных генов, которые были либо удалены, либо сконструированы так, чтобы быть нефункциональными.

В настоящее время два хорошо охарактеризованных серотипа аденовируса человека подгруппы С (т.е. hAd2 и hAd5) широко используют в качестве источников вирусного остова для большинства аденовирусных векторов, которые используют для генной терапии. Дефектные по репликации векторы аденовируса человека также протестировали в качестве носителей вакцин для доставки различных иммуногенов, полученных из различных инфекционных агентов. Исследования, проведенные на экспериментальных животных (например, на грызунах, собаках и приматах, отличных от человека), показывают, что рекомбинантные дефектные по репликации векторы аденовируса человека, несущие трансгены, кодирующие иммуногены, а также другие антигены, вызывают как гуморальный, так и клеточно-опосредованный иммунные ответы против трансгенного продукта. Вообще говоря, исследователи сообщают об успешном использовании векторов аденовируса человека в качестве носителей вакцины в экспериментальных системах, не относящихся к человеку, либо с использованием протоколов иммунизации, в которых используют высокие дозы рекомбинантных аденовирусных векторов, которые, как прогнозируют, вызывают иммунные ответы; либо с помощью протоколов иммунизации, в которых используют последовательное введение аденовирусных векторов, которые получены из разных серотипов, но которые несут тот же трансгенный продукт, что и бустер-иммунизации (Mastrangeli, et al., Human Gene Therapy, 7: 79-87 (1996)).

Векторы, полученные из аденовирусов вида С (например, Ad5, Ad6 и ChAd63), являются наиболее иммуногенными (Colloca et al., Sci. Transl. Med. 4 (115), 2012). В частности, вирусные векторы на основе аденовируса 5 типа человека (Ad5) были разработаны для генной терапии и применения в вакцинах. Хотя векторы на основе Ad5 чрезвычайно эффективны в моделях на животных, наличие ранее существовавшего иммунитета у людей против вируса Ad5 дикого типа в клинических испытаниях продемонстрировало снижение эффективности трансдукции генов (Moore JP et al. Science. 2008 May 9; 320(5877):753-5). Таким образом, иммунитет в общей популяции ограничивает широкое применение основанных на Ad-векторах вакцин на основе Ad5. С другой стороны, редкие аденовирусы человека являются менее иммуногенными, чем Ad5 (Colloca et al., Sci. Transl. Med. 4 (115), 2012). Векторы, основанные на аденовирусах, не относящихся к человеку, не обладают ранее существовавшим иммунитетом в общей популяции людей (Farina et al., J. Virol. 75 (23), 11603-11613, 2001).

Таким образом, существует потребность в аденовирусных векторах с высокой иммуногенностью и низким или отсутствующим ранее существовавшим иммунитетом у людей. Предпочтительно эти аденовирусные векторы обладают высокой продуктивностью с точки зрения их репликации.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему аденовирусный гексоновый белок, содержащему следующее:

A) (i) первая гипервариабельная область HVR1, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 11 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 11, и отсутствием А и предпочтительно с V в положении 27,

(ii) вторая гипервариабельная область HVR2, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 12 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 12 и отсутствием L и предпочтительно с I в положении 1,

(iii) третья гипервариабельная область HVR3, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 13 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 13 и отсутствием V и предпочтительно с А в положении 7,

(iv) четвертая гипервариабельная область HVR4, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 14 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 14,

(v) пятая гипервариабельная область HVR5, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 15 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 15,

(vi) шестая гипервариабельная область HVR6, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 16 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 16, и

(vii) седьмая гипервариабельная область HVR7, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 17 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 17 без I и предпочтительно с V в положении 1; или

B) (i) первая гипервариабельная область HVR1, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 18 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 18 без V и предпочтительно с Е в положении 8, без D и предпочтительно с Е в положении 12, без Е и предпочтительно с D в положении 13 и/или без L и предпочтительно с V в положении 14,

(ii) вторая гипервариабельная область HVR2, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 19 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 19 без D и предпочтительно с Е в положении 10,

(iii) третья гипервариабельная область HVR3, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 20 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 20 без Т и предпочтительно с А в положении 6,

(iv) четвертая гипервариабельная область HVR4, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 21 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 21 без L и предпочтительно с М в положении 9,

(v) пятая гипервариабельная область HVR5, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 22 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 22 без Т и предпочтительно с S в положении 3,

(vi) шестая гипервариабельная область HVR6, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 23 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 23 без I и предпочтительно с V в положении 9, и

(vii) седьмая гипервариабельная область HVR7, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 24 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 24 без I и предпочтительно с V в положении 8; или

C) (i) первая гипервариабельная область HVR1, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 25 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 25,

(ii) вторая гипервариабельная область HVR2, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 26 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 26,

(iii) третья гипервариабельная область HVR3, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 27 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 27 без V и предпочтительно с А в положении 7,

(iv) четвертая гипервариабельная область HVR4, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 28 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 28 без Е и предпочтительно с Q в положении 10,

(v) пятая гипервариабельная область HVR5, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 29 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 29 без Т и предпочтительно с S в положении 3,

(vi) шестая гипервариабельная область HVR6, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 30 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 30 без I и предпочтительно с V в положении 9, и

(vii) седьмая гипервариабельная область HVR7, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 31 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 31 без I и предпочтительно с V в положении 8 и/или без Т и предпочтительно с S в положении 11; или

D) (i) первая гипервариабельная область HVR1, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 32 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 32,

(ii) вторая гипервариабельная область HVR2, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 33 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 33,

(iii) третья гипервариабельная область HVR3, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO:34 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 34 без Т и предпочтительно с А в положении 6,

(iv) четвертая гипервариабельная область HVR4, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 35 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 35 без Q и предпочтительно с K в положении 6 и/или без Е и предпочтительно с Q в положении 10,

(v) пятая гипервариабельная область HVR5, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 36 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 36 без Т и предпочтительно с S в положении 3,

(vi) шестая гипервариабельная область HVR6, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 37 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 37 без K и предпочтительно с Т в положении 1 и/или без I и предпочтительно с V в положении 9, и

(vii) седьмая гипервариабельная область HVR7, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 38 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 38 без I и предпочтительно с V в положении 8; или

Е) (i) первая гипервариабельная область HVR1, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 39 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 39 без А и предпочтительно с V в положении 27,

(ii) вторая гипервариабельная область HVR2, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 40 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 40,

(iii) третья гипервариабельная область HVR3, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 41 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 41,

(iv) четвертая гипервариабельная область HVR4, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 42 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 42,

(v) пятая гипервариабельная область HVR5, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 43 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 43,

(vi) шестая гипервариабельная область HVR6, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 44 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 44, и

(vii) седьмая гипервариабельная область HVR7, содержащая аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 45 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 45 без I и предпочтительно с V в положении 1.

Согласно второму аспекту настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему аденовирус, предпочтительно неспособный к репликации аденовирус, содержащий полинуклеотид согласно первому аспекту.

Согласно третьему аспекту настоящее изобретение относится по меньшей мере к одному выделенному аденовирусному капсидному полипептиду, кодируемому выделенным полинуклеотидом согласно первому аспекту.

Согласно четвертому аспекту настоящее изобретение относится к следующему: аденовирус, кодируемый выделенным полинуклеотидом согласно первому аспекту, или выделенный аденовирус, предпочтительно неспособный к репликации аденовирус, содержащий выделенный полинуклеотид согласно первому аспекту и/или по меньшей мере один выделенный аденовирусный капсидный полипептид согласно третьему аспекту.

Согласно пятому аспекту настоящее изобретение относится к вирусоподобной частице, кодируемой выделенным полинуклеотидом согласно первому аспекту.

Согласно шестому аспекту настоящее изобретение относится к вектору, содержащему выделенный полинуклеотид согласно первому аспекту.

Согласно седьмому аспекту настоящее изобретение относится к композиции, содержащей следующее: (i) адъювант, (ii) выделенный полинуклеотид согласно первому или второму аспекту, по меньшей мере один выделенный аденовирусный капсидный полипептид согласно третьему аспекту, аденовирус согласно четвертому аспекту, вирусоподобная частица согласно пятому аспекту или вектор согласно шестому аспекту и необязательно (iii) фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

Согласно восьмому аспекту настоящее изобретение относится к клетке, содержащей выделенный полинуклеотид согласно первому или второму аспекту, по меньшей мере один выделенный аденовирусный капсидный полипептид согласно третьему аспекту, аденовирус согласно четвертому аспекту, вирусоподобную частица согласно пятому аспекту или вектор согласно шестому аспекту.

Согласно девятому аспекту настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду согласно первому или второму аспекту, по меньшей мере одному выделенному аденовирусному капсидному полипептиду согласно третьему аспекту, аденовирусу согласно четвертому аспекту, вирусоподобной частице согласно пятому аспекту или вектору согласно шестому аспекту и/или композиции согласно седьмому аспекту для применения при лечении или профилактике заболевания.

Согласно десятому аспекту настоящее изобретение относится к in vitro способу получения аденовируса или аденовирусоподобной частицы, предусматривающему следующие стадии:

(i) экспрессия выделенного полинуклеотида согласно первому или второму аспекту в клетке, так что аденовирус или аденовирусоподобная частица собираются в клетке,

(ii) выделение аденовируса или аденовирусоподобной частицы из клетки или среды, окружающей клетку.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Прежде чем настоящее изобретение будет подробно описано ниже, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретной методологией, протоколами и реагентами, описанными в настоящем документе, поскольку они могут варьироваться. Также следует понимать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют те же значения, которые обычно понимаются специалистом в настоящей области техники.

Предпочтительно, используемые в настоящем документе термины определены, как описано в "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Klbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland) и как описано в "Pharmaceutical Substances: Syntheses, Patents, Applications" Axel Kleemann and Jurgen Engel, Thieme Medical Publishing, 1999; "Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals", под редакцией Susan Budavari et al., CRC Press, 1996 и в Фармакопее США-25/Национальном формуляре-20, опубликованном United States Pharmcopeial Convention, Inc., Rockville Md., 2001.

Во всем настоящем описании и в формуле изобретения, которая следует ниже, если контекст не требует иного, будет подразумеваться, что слово «содержат» и такие варианты, как «содержит» и «содержащий», подразумевают включение указанного признака, целого числа или стадии или группы признаков, целых чисел или стадий, но не исключая какой-либо другой признак, целое число или стадию или группу целых чисел или стадий. В следующих параграфах различные аспекты настоящего изобретения определены более подробно. Каждый определенный таким образом аспект можно объединить с любым другим аспектом или аспектами, если явно не указано иное. В частности, любой признак, указанный как предпочтительный или полезный, можно сочетать с любым другим признаком или признаками, указанными как предпочтительные или полезные.

Несколько документов цитируют по всему тексту настоящего описания изобретения. Каждый из документов, процитированных в настоящем документе (включая в себя все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации производителя, инструкции и т.д.), будь то выше или ниже, тем самым полностью включен в настоящий документ посредством ссылки. Ничто в настоящем документе не должно быть истолковано как признание того, что изобретение не имеет права предшествовать такому раскрытию в силу предшествующего изобретения.

Описание фигур

Фигура 1: Схематическое изображение челночного вектора ВАС GAd-GAG A/L/S.

Фигура 2: Схематическое изображение ВАС-плазмиды GAdNou19 GAG с делецией Е1 и Е3 (DE1E3).

Фигура 3: Схематическое изображение ВАС-плазмиды GAdNou20 GAG с делецией Е1 и Е3 (DE1E3).

Фигура 4: Продуктивность GADNOU19 и GADNOU20 в Hek293 по сравнению с эталонным вектором Ad5, несущим такую же экспрессионную кассету.

Фигура 5: Иммуногенность векторов GADNOU19 и GADNOU20, кодирующих антиген GAG. Иммунологическую активность векторов GADNOU19 GAG (DE1DE3) и GADNOU20 GAG (DE1DE3) определяли с помощью IFN-γ ELISpot. Т-клеточные ответы измеряют через 3 недели после иммунизации с помощью 3×10⁷ и 3×10⁶ вирусных частиц каждого вектора. Показано количество Т-клеток, производящих IFNγ на миллионы спленоцитов в ответ на стимуляцию с помощью иммунодоминантного пептида gag, кодирующего CD8+ эпитоп.

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности

В приведенной ниже таблице 1 представлен обзор последовательностей, упомянутых в настоящем документе (GADNOU + номер: выделенный аденовирусный штамм; *: соответствующая нуклеотидная последовательность генома GADNOU, кодирующего аминокислотную последовательность, соответствие последовательности соответствует перечисленному порядку, например, для SEQ ID NO: 11, HVR1 GADNOU 20 соответствует x-x согласно SEQ ID NO: 1, HVR1 GADNOU 21 соответствует x-x согласно SEQ ID NO: 2, и HVR1 GADNOU 25 соответствует x-x согласно SEQ ID NO: 3). GADNOU представляет собой присвоенное авторами настоящего изобретения обозначение штамма. Протяженность геномных координат для гексона, пентона, фибера, представленных ниже (SEQ ID NO 46-54 в геномах GADNOU), не включает в себя конечный стоп-кодон, который необязательно включен/добавлен в настоящее раскрытие при ссылке на полинуклеотид, кодирующий гексон, пентон или фибер с использованием координат.

В следующих таблицах 2a и 2b представлены геномные границы/координаты CDS, РНК и ITR в геномах GADNOU. Они применимы к любой ссылке на геномные элементы в настоящем документе, которые перечислены в этих таблицах и включены, что является предпочтительным, в соответствующие варианты осуществления.

Таблица 2а: Геномные границы CDS, РНК и ITR для GADNOU 19, GADNOU20, GANOU21, GADNOU29, GADNOU30, GADNOU31. Е3_Orf2* обозначает предполагаемую открытую рамку считывания, характеризующуюся GTG в качестве начального кодона. гс обозначает обратнокомплементарный. Продукты, полученные путем сплайсинга, обозначены несколькими парами координат.

Таблица 2b: Геномные границы CDS, РНК и ITR для GADNOU25, GADNOU26, GANOU27, GADNOU28. Е3_Orf2* обозначает предполагаемую открытую рамку считывания, характеризующуюся GTG в качестве начального кодона. rc обозначает обратнокомплементарный. Продукты, полученные путем сплайсинга, обозначены несколькими парами координат.

Аспекты настоящего изобретения и их конкретные варианты осуществления

Настоящее изобретение относится к некоторым аспектам, представленным выше в кратком раскрытии настоящего изобретения. Указанные аспекты содержат альтернативные варианты осуществления и предпочтительные варианты осуществления, которые описаны ниже.

Согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему аденовирусный гексоновый белок, как определено в кратком раскрытии настоящего изобретения выше.

Согласно предпочтительному варианту осуществления варианты HVR характеризуются по меньшей мере 90% и более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичности последовательности по отношению к соответствующей SEQ ID NO. Альтернативно определению с помощью уровня идентичности последовательности в процентах HVR можно определить так, чтобы они характеризовались определенным числом аминокислотных мутаций в пределах соответствующей SEQ ID NO. Число мутаций тогда является следующим: вместо по меньшей мере 85% идентичности последовательности, вплоть до 4 мутаций в любой HVR1, вплоть до 2 мутаций в любой HVR2, вплоть до 1 мутации в любой HVR3, вплоть до 1 мутации в любой HVR4, вплоть до 2 мутаций в любой HVR5, вплоть до 1 мутации в любой HVR6 и вплоть до 3 мутаций в любой HVR7; вместо по меньшей мере 90% идентичности последовательности, вплоть до 2 мутаций в любой HVR1, вплоть до 1 мутации в любой HVR2, вплоть до 1 мутации и предпочтительно отсутствие мутации в любой HVR3, вплоть до 1 мутации в любой HVR4, вплоть до 1 мутации в любой HVR5, вплоть до 1 мутации и предпочтительно отсутствие мутации в любой HVR6 и вплоть до 2 мутаций в любой HVR7; вместо по меньшей мере 95% идентичности последовательности, вплоть до 1 мутации в любой HVR1, вплоть до 1 мутации и предпочтительно отсутствие мутации в любой HVR2, вплоть до 1 мутации и предпочтительно отсутствие мутации в любой HVR3, вплоть до 1 мутации и предпочтительно отсутствие мутации в любой HVR4, вплоть до 1 мутации и предпочтительно отсутствие мутации в любой HVR5, вплоть до 1 мутации и предпочтительно отсутствие мутации в любой HVR6 и вплоть до 1 мутации в любой HVR7.

Как известно в настоящей области техники, например, от Bradley с соавт.(J Virol., 2012 Jan; 86(2): 1267-72), нейтрализующие аденовирус антитела нацелены на гипервариабельные области гексона, и путем замены областей HVR аденовируса с высокой частотой положительных серологических реакций этот аденовирус может уклониться от иммунной системы у иммунного хозяина. Таким образом, хотя вышеуказанные HVR можно использовать с соответствующими гексоновыми белками, определенными ниже, они применимы независимо от этих гексоновых белков, а также от указанных ниже пентоновых и фиберных белков, а именно путем замены гексоновых HVR в другом аденовирусе, характеризующимся другим гексоновым, пентоновым и/или фиберным белками.

Согласно предпочтительному варианту осуществления гексоновый белок согласно:

A) содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 46 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 46,

B) содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 47 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 47,

C) содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 48 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 48,

D) содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 49 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 49, и/или

Е) содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 50 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 50.

Согласно предпочтительному варианту осуществления варианты гексона характеризуются по меньшей мере 90% и предпочтительно по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности по отношению к соответствующей SEQ ID NO. Альтернативно определению с помощью уровня идентичности последовательности в процентах варианты гексона можно определить так, чтобы они характеризовались определенным числом аминокислотных мутаций в пределах соответствующей SEQ ID NO. Число мутаций тогда является следующим: вместо по меньшей мере 85% идентичности последовательности, вплоть до 143 мутаций в любом гексоне; вместо по меньшей мере 90% идентичности последовательности, вплоть до 95 мутаций в любом гексоне; вместо по меньшей мере 95% идентичности последовательности, вплоть до 47 мутаций в любом гексоне; вместо по меньшей мере 96% идентичности последовательности, вплоть до 38 мутаций в любом гексоне; вместо по меньшей мере 97% идентичности последовательности, вплоть до 28 мутаций в любом гексоне; вместо по меньшей мере 98% идентичности последовательности, вплоть до 19 мутаций в любом гексоне; вместо по меньшей мере 99% идентичности последовательности, вплоть до 9 мутаций в любом гексоне. Следует понимать, что варианты гексона не характеризуются меньшей идентичностью последовательности или большим количеством мутаций в их HVR, чем определено для соответствующих HVR выше.

Согласно одному варианту осуществления выделенный полинуклеотид согласно первому аспекту дополнительно кодирует аденовирусный пентоновый белок, содержащий аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 51 или 52 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 51 или 52. Согласно предпочтительному варианту осуществления варианты пентона характеризуются по меньшей мере 90% и предпочтительно по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности по отношению к соответствующей SEQ ID NO. Альтернативно определению с помощью уровня идентичности последовательности в процентах варианты пентона можно определить так, чтобы они характеризовались определенным числом аминокислотных мутаций в пределах соответствующей SEQ ID NO. Число мутаций тогда является следующим: вместо по меньшей мере 85% идентичности последовательности, вплоть до 97 мутаций в любом пентоне; вместо по меньшей мере 90% идентичности последовательности, вплоть до 65 мутаций в любом пентоне; вместо по меньшей мере 95% идентичности последовательности, вплоть до 32 мутаций в любом пентоне; вместо по меньшей мере 96% идентичности последовательности, вплоть до 26 мутаций в любом пентоне; вместо по меньшей мере 97% идентичности последовательности, вплоть до 19 мутаций в любом пентоне; вместо по меньшей мере 98% идентичности последовательности, вплоть до 13 мутаций в любом пентоне; вместо по меньшей мере 99% идентичности последовательности, вплоть до 6 мутаций в любом пентоне.

Предпочтительно каждый из вариантов пентона согласно SEQ ID NO 51 и 52 не содержит D и содержит предпочтительно G в положении 289 и не содержит D и содержит предпочтительно N в положении 341. Более предпочтительно вариант согласно SEQ ID NO: 52 также не содержит А и более предпочтительно содержит Т в положении 442.

Согласно другому варианту осуществления выделенный полинуклеотид согласно первому аспекту дополнительно (т.е. рядом с гексоновым и, возможно, пентоновым белком) кодирует аденовирусный фиберный белок, содержащий аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 53 или 54 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 53 или 54. Согласно предпочтительному варианту осуществления варианты фибера характеризуются по меньшей мере 90% и предпочтительно по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности по отношению к соответствующей SEQ ID NO. Альтернативно определению с помощью уровня идентичности последовательности в процентах варианты фибера можно определить так, чтобы они характеризовались определенным числом аминокислотных мутаций в пределах соответствующей SEQ ID NO. Число мутаций тогда является следующим: вместо по меньшей мере 85% идентичности последовательности, вплоть до 89 мутаций в любом фибере; вместо по меньшей мере 90% идентичности последовательности, вплоть до 59 мутаций в любом фибере; вместо по меньшей мере 95% идентичности последовательности, вплоть до 29 мутаций в любом фибере; вместо по меньшей мере 96% идентичности последовательности, вплоть до 23 мутаций в любом фибере; вместо по меньшей мере 97% идентичности последовательности, вплоть до 17 мутаций в любом фибере; вместо по меньшей мере 98% идентичности последовательности, вплоть до 11 мутаций в любом фибере; вместо по меньшей мере 99% идентичности последовательности, вплоть до 5 мутаций в любом фибере.

Предпочтительно варианты фибера согласно SEQ ID NO: 53 не содержат А и предпочтительно содержат Р в положении 181, не содержат V и предпочтительно содержат I в положении 474 и/или не содержат вставку S и предпочтительно не содержат аминокислотную вставку между положениями 4 и 5. Предпочтительно варианты фибера согласно SEQ ID NO: 54 не содержат Т и предпочтительно содержат I в положении 90 и/или S в положении 7 (предпочтительно S в каждом из положений 4-7).

Согласно другому варианту осуществления выделенный полинуклеотид согласно первому аспекту дополнительно (т.е. рядом с гексоновым и, возможно, пентоновым и/или фиберным белком) кодирует некодирующую РНК VA РНК (вирус-ассоциированную РНК) II, содержащую нуклеотидную последовательность согласно SEQ ID NO: 57 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 57. Альтернативно или дополнительно он может кодировать некодирующую РНК VA РНК I, содержащую нуклеотидную последовательность согласно SEQ ID NO: 55 или 56 или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 55 или 56, соответственно. Согласно предпочтительному варианту осуществления варианты VA РНК характеризуются по меньшей мере 90% и предпочтительно по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности по отношению к соответствующей SEQ ID NO. Альтернативно определению с помощью уровня идентичности последовательности в процентах варианты VA РНК можно определить так, чтобы они характеризовались определенным числом нуклеотидных мутаций в пределах соответствующей SEQ ID NO. Число мутаций тогда является следующим: вместо по меньшей мере 85% идентичности последовательности, вплоть до 25 мутаций в VA РНК I и вплоть до 26 мутаций в VA РНК II; вместо по меньшей мере 90% идентичности последовательности, вплоть до 16 мутаций в VA РНК I и вплоть до 17 мутаций в VA РНК II; вместо по меньшей мере 95% идентичности последовательности, вплоть до 8 мутаций в любой VA РНК; вместо по меньшей мере 96% идентичности последовательности, вплоть до 6 мутаций в любой VA РНК; вместо по меньшей мере 97% идентичности последовательности, вплоть до 5 мутаций в любой VA РНК; вместо по меньшей мере 98% идентичности последовательности, вплоть до 3 мутаций в любой VA РНК; вместо по меньшей мере 99% идентичности последовательности, вплоть до 1 мутации в любой VA РНК.

Предпочтительно вариант VA РНК II согласно SEQ ID NO: 57 (а) не содержит С в положении 79 и/или не содержит А в положении 80 и предпочтительно содержит Т в положении 79 и/или G в положении 80, и (b) не содержит А в положении 81 и предпочтительно содержит G в положении 81. Вариант VA РНК I согласно SEQ ID NO: 55 предпочтительно не содержит G в положении 80 и предпочтительно содержит А в положении 80.

VA РНК согласно настоящему изобретению приводит к улучшенной продукции аденовирусов или аденовирусоподобных частиц, как показано в примере 5.

Предпочтительным является то, что полинуклеотид согласно первому аспекту дополнительно содержит другие аденовирусные гены и нуклеотидные сегменты, которые являются смежными с геном гексона, пентона и/или фибера в геноме аденовируса, с использованием SEQ ID NO 1-10 в качестве ссылки. Особенно предпочтительным является то, что полинуклеотид также содержит последовательности, необходимые для упаковки полинуклеотида в аденовирусную частицу.

Как правило, предпочтительным является то, что выделенный полинуклеотид согласно первому аспекту содержит по меньшей мере одно из следующего:

(a) аденовирусный 5'-конец, предпочтительно аденовирусный 5' инвертированный концевой повтор;

(b) аденовирусная область Еlа или ее фрагмент, выбранный из областей 13S, 12S

и 9S;

(d) аденовирусная область VA РНК или ее фрагмент, выбранный из группы, состоящей из областей VA РНК I и VA РНК II;

(e) аденовирусная область E2b или ее фрагмент, выбранный из группы, состоящей из областей малой рТР, полимеразы и IVa2;

(f) аденовирусная область L1 или ее фрагмент, причем указанный фрагмент кодирует аденовирусный белок, выбранный из группы, состоящей из белка 28,1 кДа, полимеразы, агнопротеина, белка 52/55 кДа и белка IIIa;

(g) аденовирусная область L2 или ее фрагмент, причем указанный фрагмент кодирует аденовирусный белок, выбранный из группы, состоящей из пентонового белка, как определено выше, белка VII, V и X;

(h) аденовирусная область L3 или ее фрагмент, причем указанный фрагмент кодирует аденовирусный белок, выбранный из группы, состоящей из белка VI, гексонового белка, как определено выше, и эндопротеазы;

(i) аденовирусная область Е2а или ее фрагмент, причем указанный фрагмент кодирует аденовирусный белок, состоящий из белка DBP;

(j) аденовирусная область L4 или ее фрагмент, причем указанный фрагмент кодирует аденовирусный белок, выбранный из группы, состоящей из белка 100 кДа, гомолога 22 кДа, гомолога 33 кДа и белка VIII;

(k) аденовирусная область Е3 или ее фрагмент, выбранный из группы, состоящей из Е3 ORF1, Е3 ORF2, Е3 ORF3, Е3 ORF4, Е3 ORF5, Е3 ORF6, Е3 ORF7, Е3 ORF8 и Е3 ORF9;

(l) аденовирусная область L5 или ее фрагмент, причем указанный фрагмент кодирует фиберный белок, как определено выше;

(m) аденовирусная область Е4 или ее фрагмент, выбранный из группы, состоящей из Е4 ORF6/7, Е4 ORF6, Е4 ORF5, Е4 ORF4, Е4 ORF3, Е4 ORF2 и Е4 ORF1; и/или

(n) аденовирусный 3'-конец, предпочтительно аденовирусный 3' инвертированный концевой повтор.

Эти элементы могут происходить из того же аденовируса, что и HVR и/или гексон полинуклеотида согласно первому аспекту в соответствии с таблицей 1 (т.е. из того же GADNOU), или из другого аденовируса, в частности, из одного из других видов, например, аденовируса человека, с образованием химерного аденовируса.

Согласно некоторым вариантам осуществления вышеупомянутого полинуклеотида может быть желательно, чтобы полинуклеотид не содержал одну или несколько областей генома, как указано выше (как в (а) - (m), такие как, например, область Е3 и/или Е4), и/или чтобы содержал аденовирусный ген, который содержит делецию и/или мутацию, которая делает по меньшей мере один ген нефункциональным. Согласно этим предпочтительным вариантам осуществления подходящие аденовирусные области модифицируют, чтобы они не включали вышеупомянутую(ые) область(и)/ген(ы) или чтобы сделать выбранную(ые) область(и)/ген(ы) нефункциональными. Одна возможность сделать их нефункциональными - это ввести один или несколько искусственных стоп-кодонов (например, ТАА) в открытую рамку считывания этих генов. Способы сделать вирус дефектным по репликации хорошо известны в настоящей области техники (см., например, Brody et al., 1994 Ann NY Acad Sci., 716: 90-101). Делеция может создать пространство для вставки трансгенов, предпочтительно в пределах экспрессионной кассеты, такой как минигенная кассета, как описано в настоящем документе. Кроме того, делеции можно использовать для создания аденовирусных векторов, которые неспособны реплицироваться без использования пакующей клеточной линии или вируса-помощника, как хорошо известно в настоящей области техники. Таким образом, конечный рекомбинантный аденовирус, содержащий полинуклеотид, как указано выше, который содержит одну или несколько из указанных делеций гена/области или мутаций с потерей функции, может обеспечить более безопасный рекомбинантный аденовирус, например, для генной терапии или вакцинации.

Хотя полинуклеотид может не содержать по меньшей мере одну геномную область/ген, как указано в настоящем документе (например, область Е3 и/или Е4), в частности, Е1А, Е1 В, Е2А, Е2 В, Е3 ORF1, Е3 ORF2, Е3 ORF3, Е3 ORF4, Е3 ORF5, Е3 ORF6, Е3 ORF7, Е3 ORF8, Е3 ORF9, Е4 ORF6/7, Е4 ORF6, Е4 ORF5, Е4 ORF4, Е4 ORF3, Е4 ORF2 и/или Е4 ORF1, предпочтительно Е1А, Е1 В, Е2А, Е2 В, Е3 и/или Е4, и/или содержит аденовирусный ген, который содержит делецию и/или мутацию, которая делает по меньшей мере один ген нефункциональным, желательно сохранить интактную область Ela и/или Elb. Такая интактная область Е1 может быть расположена в своем нативном положении в аденовирусном геноме или помещена в сайт делеций в нативном аденовирусном геноме (например, в области Е3).

Согласно предпочтительному варианту осуществления выделенный полинуклеотид согласно первому аспекту дополнительно кодирует один или несколько, предпочтительно все из следующих аденовирусных белков: белок VI, белок VIII, белок IX, белок IIIa и белок IVa2.

Средний специалист в области аденовирусов хорошо знает, как определить открытые рамки считывания, которые кодируют указанные выше аденовирусные белки. Он также знает о структуре аденовирусных геномов и может без излишнего труда отобразить отдельные аденовирусные области и ORF, указанные в настоящем документе, для любого аденовирусного генома.

Согласно другому варианту осуществления выделенный полинуклеотид согласно первому аспекту дополнительно кодирует один или несколько гетерологичных белков или их фрагментов. Один или несколько гетерологичных белков или их фрагментов предпочтительно представляют собой неаденовирусные белки или их фрагменты. Согласно предпочтительному варианту осуществления один или несколько неаденовирусных белков или их фрагментов представляют собой один или несколько антигенных белков или их фрагментов. Предпочтительно один или несколько гетерологичных белков или их фрагментов являются частью одной или нескольких экспрессионных кассет. Последовательности, кодирующие гетерологичный белок и предпочтительно экспрессионную кассету, содержащую такую(ие) последовательность(и), кодирующую(ие) гетерологичный белок, могут быть вставлены, например, в удаленные области аденовирусного генома, определенные в настоящем документе. Иллюстративный гетерологичный белок представляет собой полипептид согласно SEQ ID NO: 74 или его вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 74.

Согласно второму аспекту настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, который кодирует аденовирус, который содержит полинуклеотид согласно первому аспекту, предпочтительно содержащий аденовирусный геном согласно любой из SEQ ID NO 1-10 или ее варианту, характеризующемуся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO 1-10 соответственно.

Согласно предпочтительному варианту осуществления он кодирует неспособный к репликации аденовирус, предпочтительно содержащий аденовирусный геном согласно любой из SEQ ID NO 1-10, в котором отсутствует один или несколько геномных областей/генов Е1А, Е1В, Е2А, Е2В, Е3 и Е4.

Наиболее предпочтительно он кодирует рекомбинантный аденовирус, предпочтительно содержащий аденовирусный геном согласно любой из SEQ ID NO 1-10 или ее варианту, характеризующемуся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO 1-10 соответственно, предпочтительно в который вставлен один или несколько гетерологичных белков или их фрагментов (носитель-аденовирус). Предпочтительно один или несколько гетерологичных белков или их фрагментов вставлены путем замены одной или нескольких геномных областей/генов Е1А, Е1В, Е2А, Е2В, Е3 ORF1, Е3 ORF2, Е3 ORF3, Е3 ORF4, Е3 ORF5, Е3 ORF6, Е3 ORF7, Е3 ORF8, Е3 ORF9, Е4 ORF6/7, Е4 ORF6, Е4 ORF5, Е4 ORF4, Е4 ORF3, Е4 ORF2 и Е4 ORF1, более предпочтительно Е1, Е3 и/или Е4. Гетерологичные белки или их фрагменты предпочтительно вставлены как часть экспрессионной кассеты. Необязательно носитель-аденовирус является также неспособным к репликации, как описано в настоящем документе, т.е. в нем отсутствует одна или несколько геномных областей/генов Е1А, Е1В, Е2А, Е2В, Е3 и Е4.

Согласно иллюстративному варианту осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, который кодирует аденовирус, который содержит полинуклеотид согласно SEQ ID NO 72 или 73 или его вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO 72 или 73, соответственно.

Согласно предпочтительному варианту осуществления варианты аденовирусного генома характеризуются, вместо по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% и предпочтительно по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5 или 99,9% идентичности последовательности по отношению к соответствующей SEQ ID NO 1, по меньшей мере 90% и предпочтительно по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5 или 99,9% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO 2, по меньшей мере 90% и предпочтительно по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5 или 99,9% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO 3, по меньшей мере 90% и предпочтительно по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5 или 99,9% идентичности последовательности по отношению к соответствующей SEQ ID NO 4, по меньшей мере 90% и предпочтительно по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5 или 99,9% идентичности последовательности по отношению к соответствующей SEQ ID NO 5, по меньшей мере 90% и предпочтительно по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5 или 99,9% идентичности последовательности по отношению к соответствующей SEQ ID NO 6, по меньшей мере 90% и предпочтительно по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5 или 99,9% идентичности последовательности по отношению к соответствующей SEQ ID NO 7, по меньшей мере 90% и предпочтительно по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5 или 99,9% идентичности последовательности по отношению к соответствующей SEQ ID NO 8, по меньшей мере 90% и предпочтительно по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5 или 99,9% идентичности последовательности по отношению к соответствующей SEQ ID NO 9, или по меньшей мере 90% и предпочтительно по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5 или 99,9% идентичности последовательности по отношению к соответствующей SEQ ID NO 10 (в каждом случае с учетом делеций, как определено выше).

Согласно одному варианту осуществления выделенный полинуклеотид согласно второму аспекту кодирует рекомбинантный аденовирус, где по меньшей мере одна аденовирусная геномная область рекомбинантного аденовируса получена из аденовируса, не содержащего гексоновые HVR или гексоновый белок, как определено выше (химерный аденовирус). Предпочтительно химерный аденовирус является химерным главным образом или предпочтительно только в отношении гексоновой HVR или гексонового белка и необязательно также пентонового и/или фиберного белка, как определено в настоящем документе. Иными словами, полинуклеотид кодирует гексоновые HVR или гексоновый белок, как определено выше, и необязательно также пентоновый и/или фиберный белок, как определено выше, но одна или несколько, предпочтительно все другие геномные области получены из другого аденовируса, в частности, отличного от аденовируса согласно SEQ ID NO 1-10. Отличающийся аденовирус предпочтительно представляет собой аденовирус, встречающийся в природе в другом хозяине, более предпочтительно аденовирус человека. Этот полинуклеотид предпочтительно кодирует также один или несколько гетерологичных неаденовирусных белков или их фрагментов, как определено выше. Таким образом, один или несколько гетерологичных неаденовирусных генов вставлены в аденовирусный геном химерного аденовируса. Соответственно, аденовирусный геном химерного аденовируса, за исключением ДНК, кодирующей гексоновые HVR или гексоновый белок, как определено выше, и необязательно ДНК, кодирующей пентоновый и/или фиберный белки, как определено выше, получен из аденовируса, не относящегося к обезьянам, например, аденовируса человека, предпочтительно носитель-аденовирус, не относящийся к обезьянам, например, носитель-аденовирус, относящийся к человеку.

Как правило, предпочтительно, чтобы аденовирус являлся неспособным к репликации. Для этого предпочтительно, чтобы у аденовируса отсутствовала одна или несколько геномных областей Е1А, Е1В, Е2А, Е2В, Е3 и Е4, или он содержал в них делецию и/или мутацию, которая делает геномную область или кодируемый ею продукт экспрессии нефункциональными.

Согласно одному особенно предпочтительному варианту осуществления выделенный полинуклеотид согласно первому или второму аспекту во всех его вариантах, описанных в настоящем документе, может содержать функционально нарушенный ген IVa2, предпочтительно делецию или нуль-мутацию в нем. Этот ген участвует в упаковке вирусной ДНК, и его нарушение приводит к продукции вирусоподобных частиц. Согласно этому варианту осуществления выделенный полинуклеотид согласно первому или второму аспекту предпочтительно кодирует один или несколько неаденовирусных В-клеточных эпитопов и/или Т-клеточных эпитопов.

Согласно третьему аспекту настоящее изобретение относится по меньшей мере к одному выделенному аденовирусному капсидному полипептиду, кодируемому полинуклеотидом согласно первому или второму аспекту. По меньшей мере один выделенный аденовирусный капсидный полипептид содержит по меньшей мере гексон с HVR, как определено выше, предпочтительно гексоновый белок, определенный выше, и необязательно также пентоновый и/или фиберный белок, определенный выше.

По меньшей мере один выделенный аденовирусный капсидный полипептид можно получить путем экспрессии в клетке. Экспрессированный(е) полипептид(ы) можно необязательно очистить с использованием стандартных техник. Например, клетки можно лизировать либо механически, либо осмотическим шоком, прежде чем подвергнуть стадиям осаждения и хроматографии, природа и последовательность которых будут зависеть от конкретного рекомбинантного материала, подлежащего извлечению.

Альтернативно, экспрессированный(е) полипептид(ы) можно подвергать секреции и извлекать из среды культивирования, в которой культивировали рекомбинантные клетки, как известно в области экспрессии белка.

Согласно четвертому аспекту настоящее изобретение относится к аденовирусу (в настоящем документе также носящему название вектор аденовируса или аденовирусный вектор), содержащему выделенный полинуклеотид согласно первому или второму аспекту и/или аденовирусные капсидные полипептиды согласно третьему аспекту. Соответственно, аденовирус может представлять собой, например, аденовирус, кодируемый любой из SEQ ID NO 1-10, или рекомбинантный аденовирус, такой как аденовирус-носитель или химерный аденовирус, как определено выше. Предпочтительно аденовирус представляет собой выделенный аденовирус.

Согласно иллюстративному варианту осуществления настоящее изобретение относится к аденовирусу, содержащему полинуклеотид согласно SEQ ID NO 72 или 73 или его вариант, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO 72 или 73 соответственно.

Аденовирус может содержать или не содержать полинуклеотид согласно первому или второму аспекту. В случае, если этот полинуклеотид не содержится в аденовирусе, предпочтительно, чтобы он был представлен в транс-конфигурации (т.е. генетический элемент, который не является геномом аденовируса, включенным в аденовирус). Как правило, он обеспечен конструктом-помощником (например, плазмидой или вирусом) или геномом или конструктом-помощником в пакующей клетке-хозяине (дополняющей клетке, как описано в настоящем документе). Кроме того, предпочтительно, чтобы полинуклеотиды, представленные в транс-конфигурации, не содержались в геноме, включенном в аденовирус, включая в себя гомологи или другие варианты последовательности этих полинуклеотидов. Например, если полинуклеотид, предоставленный в транс-конфигурации, содержит ген гексона, пентона и/или фибера, геном, включенный в аденовирус, не содержит какой-либо полинуклеотид, кодирующий белок гексона, пентона и/или фибера соответственно. Наиболее предпочтительно полинуклеотид, предоставленный в транс-конфигурации, кодирует по меньшей мере один аденовирусный капсидный полипептид, как определено в третьем аспекте, т.е. гексон с HVR, как определено в первом или втором аспекте, предпочтительно гексоновый белок, как определено в первом или втором аспекте, и необязательно также пентоновый и/или фиберный белок, как определено в первом или втором аспекте.

При конструировании аденовирусных векторов для доставки гена хозяину, например, клетке человека или другого млекопитающего, можно использовать ряд последовательностей нуклеиновых кислот аденовируса. Например, весь или часть задержанно раннего гена Е3 аденовируса можно удалить из последовательности аденовируса, которая образует часть рекомбинантного вируса. Считается, что функция Е3 обезьян не имеет отношения к функции и продукции рекомбинантной вирусной частицы. Согласно некоторым вариантам осуществления можно также сконструировать аденовирусные векторы, характеризующиеся делецией по меньшей мере области ORF6 гена Е4 и, что более желательно, из-за избыточности в функции этой области, всей области Е4. Еще один вектор согласно настоящему изобретению содержит делецию в задержанно раннем гене Е2а. Делеций также можно произвести в любом из поздних генов L1-L5 генома аденовируса обезьян. Аналогично, делеций в промежуточных генах IX и IVa2 могут являться применимыми для некоторых целей. Другие делеций можно осуществить в других структурных или неструктурных генах аденовируса. Вышеуказанные делеций можно использовать индивидуально, т.е. последовательность аденовируса для применения в настоящем изобретении может содержать делеций только в одной области. Альтернативно, делеций целых генов или их частей, эффективные для разрушения их биологической активности, можно использовать в любой комбинации. Например, последовательность аденовируса может характеризоваться делециями областей Е1 и Е4 или областей Е1, Е2а и Е3 или областей Е1 и Е3 или областей Е1, Е2а и Е4 с делецией Е3 или без нее, и так далее. Такие делеций можно использовать в сочетании с другими мутациями аденовирусных генов, такими как чувствительные к температуре мутации, для достижения требуемого результата.

Аденовирусный вектор, не содержащий каких-либо необходимых аденовирусных последовательностей (например, область, выбранную из E1a, E1b, Е2а, E2b, Е4 ORF6, L1 или L4), можно культивировать в присутствии отсутствующих аденовирусных генных продуктов, которые необходимы для вирусной инфекционности и размножения аденовирусной частицы. Эти вспомогательные функции можно обеспечить путем культивирования аденовирусного вектора в присутствии одного или нескольких конструктов-помощников (например, плазмиды или вируса) или пакующей клетки-хозяина (дополняющей клетки, как описано в настоящем документе). См., например, техники, описанные для получения «минимального» человеческого аденовирусного вектора в международной патентной публикации W096/13597).

Применимые конструкты-помощники содержат выбранные последовательности генов аденовируса, которые дополняют соответствующие гены, которые подвергают делеции и/или которые не экспрессируются вектором и клеткой, в которую вектор трансфицируется. Согласно одному варианту осуществления конструкт-помощник является дефектным по репликации и содержит необходимые и необязательно дополнительные гены аденовируса.

Конструкты-помощники также могут быть сформированы в поликатионные конъюгаты, как описано в Wu et al, J. Biol. Chem., 264: 16985-16987 (1989); K. J. Fisher and J. M. Wilson, Biochem. J., 299: 49 (April 1, 1994). Конструкт-помощник может необязательно содержать репортерный ген. Ряд таких репортерных генов известен в настоящей области техники. Присутствие репортерного гена в конструкте-помощнике, который отличается от трансгена на аденовирусном векторе, позволяет независимо контролировать как аденовирус, так и конструкт-помощник. Этот второй репортер можно использовать для облегчения разделения полученного рекомбинантного аденовируса и конструкта-помощника после очистки. Предпочтительным конструктом-помощником является вирус-помощник.

Для создания рекомбинантных аденовирусов (Ad) с делецией в любом из генов, описанных в контексте предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения, функцию области гена, подвергнутой делеций, если она необходима для репликации и инфекционности вируса, предпочтительно обеспечивают рекомбинантному вирусу с помощью конструкта-помощника или клетки, т.е. дополняющей или пакующей клетки. Во многих случаях конструкт/клетку, экспрессирующие человеческий Е1, можно использовать для транскомплементации вектора, используемого для создания рекомбинантных аденовирусов. Это особенно благоприятно, потому что из-за разнообразия между полинуклеотидными последовательностями согласно настоящему изобретению и человеческими аденовирусными последовательностями Е1, обнаруженными в доступном в настоящее время пакующем конструкте/клетках, использование современных содержащих Е1 человека конструктов/клеток будет предотвращать создание способных к репликации аденовирусов в процессе репликации и продукции. Однако в определенных обстоятельствах будет желательно использовать конструкт/клетку, которые экспрессируют продукты гена Е1, для продукции рекомбинантного аденовируса с делецией Е1.

При необходимости можно использовать последовательности, представленные в настоящем документе, для создания конструкта-помощника/клетки-помощника или клеточной линии, которая экспрессирует, как минимум, ген аденовируса Е1 из аденовируса в соответствии с любым из SEQ ID NOS 1-10 под транскрипционным контролем промотора для экспрессии в выбранной родительской клеточной линии, такой как, например, клетка HeLa. Для этой цели можно использовать индуцируемые или конститутивные промоторы. Примеры промоторов предоставлены, например, в примерах, описанных в настоящем документе. Такие Е1-экспрессирующие клетки являются применимыми для создания рекомбинантных аденовирусных векторов с делецией Е1. Дополнительно или альтернативно настоящее изобретение относится к конструктам/клеткам, которые экспрессируют один или несколько аденовирусных генных продуктов, например, Ela, Elb, Е2а и/или Е4 ORF6, предпочтительно Ad5, Е4 ORF6, которые можно сконструировать с использованием по существу тех же процедур для использования в создании рекомбинантных аденовирусных векторов. Такие конструкты/клетки можно использовать для транскомплементации аденовирусных векторов с делециями необходимых генов, которые кодируют эти продукты, или для обеспечения вспомогательных функций, необходимых для упаковки зависимого от помощника вируса (например, аденоассоциированного вируса).

Как правило, при доставке аденовирусного вектора путем трансфекции вектор доставляют в количестве от приблизительно 0,1 мкг до приблизительно 100 мкг ДНК и предпочтительно от приблизительно 10 до приблизительно 50 мкг ДНК до приблизительно 1 × 10⁴ клеток до приблизительно 1 × 10³ клеток и предпочтительно приблизительно 105 клеток. Однако относительные количества векторной ДНК к клеткам-хозяевам можно скорректировать с учетом таких факторов, как выбранный вектор, способ доставки и выбранные клетки-хозяева. Введение вектора в клетку-хозяина может быть достигнуто любыми способами, известными в настоящей области техники или раскрытыми в настоящем документе, включая в себя трансфекцию и инфекцию, например, с использованием трансфекции CaPO₄ или электропорации.

Для конструирования и сборки требуемого рекомбинантного аденовируса аденовирусный вектор можно в одном примере трансфицировать in vitro в присутствии конструкта-помощника в пакующую клеточную линию, позволяя происходить гомологичной рекомбинации между последовательностями вектора-помощника и аденовирусного вектора, что позволяет реплицировать аденовирусные трансгенные последовательности в векторе и упаковывать его в капсиды вириона, что приводит к образованию рекомбинантных вирусных векторных частиц, что хорошо известно в настоящей области техники. Рекомбинантный аденовирус согласно настоящему изобретению применим, например, в переносе выбранного трансгена в выбранную клетку-хозяина.

Согласно предпочтительному варианту осуществления аденовирус согласно четвертому аспекту характеризуется частотой положительных серологических реакций у менее чем 5% субъектов-людей и предпочтительно отсутствием положительных серологических реакций у людей, наиболее предпочтительно характеризуется отсутствием положительных серологических реакций у людей, которые ранее не контактировали с аденовирусом человекообразных обезьян за исключением человека, более предпочтительно с одним или несколькими, особенно со всеми аденовирусами в соответствии с SEQ ID NO: 1-10. В этом контексте предпочтительно, чтобы субъекты-люди принадлежали к этнической группе, выбранной из европейцев, коренных народов Африки, азиатов, коренных народов Америки и коренных народов Океании. Способы идентификации этнического происхождения человека описаны в настоящей области техники (см., например, международную патентную публикацию WO2003/102236).

Согласно дополнительному предпочтительному варианту осуществления рекомбинантного аденовируса ДНК аденовируса способна проникать в клетку-мишень млекопитающего, т.е. она является инфекционной. Инфекционные рекомбинантные аденовирусы согласно настоящему изобретению можно использовать в качестве вакцины и для генной терапии, как также описано в настоящем документе. Таким образом, согласно другому варианту осуществления предпочтительным является то, что рекомбинантный аденовирус содержит молекулу для доставки в клетку-мишень. Предпочтительно клетка-мишень представляет собой клетку млекопитающего, например клетку человекообразных обезьян, клетку грызуна или клетку человека. Например, молекула для доставки в клетку-мишень может представлять собой полинуклеотид, кодирующий гетерологичный белок (т.е. гетерологичный ген), как определено в настоящем документе, предпочтительно внутри экспрессионной кассеты. Способы введения экспрессионной кассеты в геном аденовируса хорошо известны в настоящей области техники. В одном примере рекомбинантный аденовирус согласно настоящему изобретению, который содержит экспрессионную кассету, кодирующую, например, гетерологичный ген, можно получить путем замены геномной области аденовируса, выбранной из Е1А, Е1В, Е2А, Е2В, Е3 и Е4, указанной экспрессионной кассетой. Геномные области Е1А, Е1В, Е2А, Е2В, Е3 и Е4 аденовирусов согласно настоящему изобретению можно легко идентифицировать с помощью выравнивания с известными и аннотированными аденовирусными геномами, например, из Ad5 человека (см.: Birgitt and Thomas Dobner, Oncogene (2001) 20, p.7847 - 7854; a также: Andrew J. Davison, et al., "Genetic content and evolution of adenoviruses", Journal of General Virology (2003), 84, p.2895-2908).

Молекула для доставки в клетку-мишень предпочтительно представляет собой гетерологичный полинуклеотид, но также может представлять собой полипептид или низкомолекулярное химическое соединение, предпочтительно обладающее терапевтической или диагностической активностью. Согласно одному особенно предпочтительному варианту осуществления молекула для доставки в клетку-мишень представляет собой гетерологичный полинуклеотид, который содержит 5' последовательность инвертированного концевого повтора аденовируса (ITR) и 3'-ITR. Специалисту в настоящей области техники будет очевидно, что размер молекулы должен быть выбран так, чтобы капсид мог образовываться вокруг и упаковывать молекулу, когда продуцируется рекомбинантный аденовирус, например, в упаковывающей клетке. Таким образом, предпочтительно гетерологичный ген представляет собой миниген, который может содержать, например, вплоть до 7000 и максимально вплоть до 8000 пар оснований.

Согласно пятому аспекту настоящее изобретение относится к вирусоподобной частице (VLP), кодируемой полинуклеотидом согласно первому или второму аспекту. Соответственно, VLP содержит по меньшей мере один выделенный аденовирусный капсидный полипептид согласно третьему аспекту. Согласно одному варианту осуществления полинуклеотид, кодирующий VLP, характеризуется подвергнутым делеций геном Iva2 или содержит нуль-мутацию в гене Iva2.

Согласно приведенному ниже определению VLP VLP согласно пятому аспекту по существу не содержит вирусную геномную ДНК. VLP, включая в себя VLP аденовируса, использовали для вакцинации, генной терапии или для прямой доставки лекарственного средства, например, противораковых лекарственных средств (Chroboczek et al., ACTA АВР BIOCHIMICA POLONICA, том 61, №3/2014). Соответственно, VLP согласно пятому аспекту может содержать один или несколько неаденовирусных В-клеточных и/или неаденовирусных Т-клеточных эпитопов, один или несколько неаденовирусных генов для генной терапии и/или один или несколько фармацевтических средств, например противораковые средств. Согласно одному варианту осуществления VLP включает в себя, предпочтительно представляет один или несколько неаденовирусных В-клеточных эпитопов и/или включает в себя один или несколько неаденовирусных Т-клеточных эпитопов.

Согласно шестому аспекту настоящее изобретение относится к вектору, содержащему полинуклеотид согласно первому или второму аспекту. Согласно предпочтительному варианту осуществления вектор представляет собой плазмидный вектор, например, экспрессионный вектор. Плазмидный вектор можно преимущественно использовать для получения рекомбинантного аденовируса, как описано в настоящем документе. Когда предоставлена информация о последовательности новых белков гексона, пентона и фибера и VA РНК согласно настоящему изобретению, указанный рекомбинантный аденовирус можно получить, например, путем конструирования рекомбинантного аденовируса, который кодируется полинуклеотидом согласно первому или второму аспекту и любой другой аденовирусной геномной областью. Способы конструирования рекомбинантных аденовирусов хорошо известны в настоящей области техники. Применимые техники получения рекомбинантных аденовирусов, например, рассмотрены в Graham & Prevec, 1991 в Methods in Molecular Biology: Gene Transfer and Expression Protocols, (Ed. Murray, EJ.), p.109; и Hitt et al., 1997 "Human Adenovirus Vectors for Gene Transfer into Mammalian Cells" Advances in Pharmacology 40:137-206. Дополнительные способы описаны в международной патентной публикации WO 2006/086284.

Для экспрессии полинуклеотид а согласно первому или второму аспекту можно субклонировать указанный полинуклеотид в экспрессионный вектор, который содержит сильный промотор для прямой транскрипции, предпочтительно с экспрессионной кассетой. Подходящие бактериальные промоторы хорошо известны в настоящей области техники, например, Е. coli, Bacillus sp.и Salmonella, и наборы для таких систем экспрессии являются коммерчески доступными. Аналогично, эукариотические системы экспрессии для клеток млекопитающих, дрожжей и клеток насекомых хорошо известны в настоящей области техники и также являются коммерчески доступными. Смотрите ниже для получения дополнительной информации об экспрессионных кассетах.

Конкретный экспрессионный вектор, применимый для транспортировки генетической информации в клетку, не имеет особого значения. Можно использовать любой из общепринятых векторов, используемых для экспрессии в эукариотических или прокариотических клетках. Стандартные бактериальные экспрессионные векторы включают в себя плазмиды, такие как плазмиды на основе pBR322, pSKF, pET23D, и слитые экспрессионные системы, такие как GST и LacZ, но специалистам в настоящей области техники известно намного больше экспрессионных векторов, которые могут быть с успехом использованы. Экспрессионные векторы, содержащие регуляторные элементы из эукариотических вирусов, как правило, используют в эукариотических экспрессионных векторах, например, векторы SV40, векторы вируса папилломы и векторы, полученные из вируса Эпштейна-Барр. Другие иллюстративные эукариотические векторы включают в себя pMSG, pAV009/A.sup.+, pMTO10/A.sup.+, pMAMneo-5, бакуловирус pDSVE, pcDNA3.1, pIRES и любой другой вектор, позволяющий экспрессировать белки под управлением, например, немедленно раннего промотора HCMV, раннего промотора SV40, позднего промотора SV40, промотора металлотионеина, промотора вируса опухоли молочной железы мыши, промотора вируса саркомы Рауса, промотора полиэдрина или других промоторов, которые, как было показано, являются эффективными для экспрессии в эукариотических клетках. Некоторые системы экспрессии содержат маркеры, которые обеспечивают амплификацию генов, такие как тимидинкиназа, фосфотрансфераза гигромицина В и дигидрофолатредуктаза. Альтернативно, также подходят системы экспрессии с высоким выходом, не предусматривающие генную амплификацию. Элементы, которые также могут быть включены в экспрессионные векторы, включают в себя репликон, который функционирует в Е.coli, ген, кодирующий устойчивость к лекарственному средству для осуществления отбора бактерий, которые содержат рекомбинантные плазмиды, и уникальные сайты рестрикции в несущественных областях плазмиды для осуществления вставки эукариотических последовательностей. Конкретный выбранный ген устойчивости к лекарственному средству не является критически важным - подходит любой из многих известных в настоящей области техники генов устойчивости к лекарственному средству. Последовательности прокариот необязательно выбирают так, чтобы при необходимости они не мешали репликации ДНК в эукариотических клетках.

Согласно седьмому аспекту настоящее изобретение относится к композиции, содержащей (i) адъювант, (ii) выделенный полинуклеотид согласно первому или второму аспекту, по меньшей мере один выделенный аденовирусный капсидный полипептид согласно третьему аспекту, аденовирус согласно четвертому аспекту, вирусоподобную частицу согласно пятому аспекту или вектор согласно шестому аспекту и необязательно (iii) фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. Предпочтительно адъювант представляет собой агонист рецептора, выбранного из группы, состоящей из цитокиновых рецепторов I типа, цитокиновых рецепторов II типа, рецепторов TNF, рецептора витамина D, действующего как транскрипционный фактор, и Toll-подобных рецепторов 1 (TLR1), TLR-2, TLR 3, TLR4, TLR5, TLR-6, TLR7 и TLR9.

Композицию, которая содержит адъювант, можно использовать в качестве вакцины, например, для субъектов-людей. Например, активация специфических рецепторов может стимулировать иммунный ответ. Такие рецепторы известны специалисту в настоящей области техники и включают в себя, например, цитокиновые рецепторы, в частности цитокиновые рецепторы I типа, цитокиновые рецепторы II типа, рецепторы TNF; и рецептор витамина D, действующий как фактор транскрипции; и Toll-подобные рецепторы 1 (TLR1), TLR-2, TLR 3, TLR4, TLR5, TLR-6, TLR7 и TLR9. Агонисты таких рецепторов обладают адъювантной активностью, т.е. являются иммуностимулирующими. Согласно предпочтительному варианту осуществления адъювант композиции может представлять собой один или несколько агонистов Toll-подобных рецепторов. Согласно более предпочтительному варианту адъювант представляет собой агонист Toll-подобного рецептора 4. Согласно конкретному предпочтительному варианту осуществления адъювант представляет собой агонист Toll-подобного рецептора 9. Примеры адъювантов см. ниже. Также предпочтительные фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества указаны ниже.

Согласно восьмому аспекту настоящее изобретение относится к клетке, содержащей полинуклеотид согласно первому или второму аспекту, по меньшей мере один выделенный аденовирусный капсидный полипептид согласно третьему аспекту, аденовирус согласно четвертому аспекту, вирусоподобную частицу согласно пятому аспекту или вектор согласно шестому аспекту.

Предпочтительно клетка представляет собой клетку-хозяина, которая экспрессирует по меньшей мере один аденовирусный ген или предпочтительно все аденовирусные гены, который(е) подвергнут(ы) делеции или лишены функциональности, как объяснено выше, чтобы сделать аденовирус неспособным к репликации. Путем экспрессии этого по меньшей мере одного гена клетка-хозяин предпочтительно обеспечивает репликацию неспособного к репликации аденовируса. Согласно одному варианту осуществления клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один аденовирусный ген, выбранный из группы, состоящей из Е1А, Е1В, Е2А, Е2В, Е3 и Е4. В частности, этот по меньшей мере один аденовирусный ген подвергнут делеций или лишен функциональности в аденовирусном геноме. Такую дополняющую клетку можно использовать для размножения и спасения аденовирусов, которые неспособны к репликации, потому что они не содержат, например, один из вышеупомянутых генных продуктов.

Клетку можно выбрать из бактериальной клетки, такой как клетка E.coli, дрожжевая клетка, такая как Saccharomyces cerevisiae или Pichia pastoris, клетка растения, клетка насекомого, такая как клетки SF9 или Hi5, или клетка млекопитающего. Предпочтительными примерами клеток млекопитающих являются клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки эмбриональной почки человека (НЕК 293), клетки HELA, клетки гепатомы человека (например, Huh7.5), клетки гепатомы человека Hep G2, клетки гепатомы человека Hep 3В и т.п.

Если клетка содержит полиуклеотид в соответствии с первым или вторым аспектом, этот полинуклеотид может присутствовать в клетке либо (i) свободно диспергированным как таковой, либо (ii) интегрированным в геном клетки или митохондриальную ДНК.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления клетка представляет собой клетку-хозяина, предпочтительно клетку 293 или клетку PER.C6™, которая экспрессирует по меньшей мере один аденовирусный ген, выбранный из группы, состоящей из E1a, E1b, Е2а, E2b, Е4, L1, L2, L3, L4 и L5.

Стандартные способы трансфекции можно использовать для получения бактериальных насекомых клеточных линий, насекомых клеточных линий млекопитающих, дрожжей или насекомых. Можно использовать любую из хорошо известных процедур для введения чужеродных полинуклеотидных последовательностей в клетки-хозяева. Например, коммерчески доступные наборы для трансфекции на основе липосом, такие как Lipofectamine™ (Invitrogen), коммерчески доступные наборы для трансфекции на липидной основе, такие как Fugene (Roche Diagnostics), трансфекция на основе полиэтиленгликоля, осаждение фосфатом кальция, генная пушка (биолистический подход), электропорация или вирусная инфекция и любые другие хорошо известные способы введения клонированной геномной ДНК, кДНК, синтетической ДНК или другого чужеродного генетического материала в клетку-хозяина. Необходимо только, чтобы конкретная используемая процедура генной инженерии была способна успешно вводить по меньшей мере один ген в клетку-хозяина, способную экспрессировать рецептор.

Дополнительные варианты осуществления клетки описаны в отношении четвертого аспекта настоящего изобретения выше.

Согласно девятому аспекту настоящее изобретение относится к следующему: полинуклеотид согласно первому или второму аспекту, по меньшей мере один выделенный аденовирусный капсидный полипептид согласно третьему аспекту, аденовирус согласно четвертому аспекту, вирусоподобная частица согласно пятому аспекту или вектор согласно шестому аспекту и/или композиция согласно седьмому аспекту, для применения в лечении или профилактике заболевания. Согласно одному варианту осуществления лечение или профилактику осуществляют с помощью вакцинации. Согласно другому варианту осуществления лечение осуществляют с помощью генной терапии. В отношении вакцинации заболевание представляет собой инфекционное заболевание, предпочтительно вызванное патогеном, как описано в настоящем документе, или неинфекционное заболевание, предпочтительно характеризующееся наличием пораженных заболеванием клеток, которые экспрессируют антигены, не экспрессируемые здоровыми клетками (такие как опухолевые клетки, экспрессирующие опухолеассоциированные антигены). В отношении генной терапии заболевание представляет собой наследственное заболевание, вызванное одной или несколькими соматическими мутациями, приводящими к потере или приобретению функции гена или белка.

Хорошо известно, что аденовирусы являются применимыми в генной терапии и в качестве вакцин. Доклинические и клинические исследования продемонстрировали применимость разработки векторов, надежной экспрессии антигенов и защитного иммунитета с использованием этой системы. Таким образом, предпочтительным вариантом осуществления является вакцинация, например, для субъектов-людей. Подробные инструкции о том, как аденовирусы используют и получают для вакцинации, представлены в виде обширной литературы, содержащейся в настоящей области техники и известной специалисту в настоящей области техники. Вирусные векторы на основе, например, аденовируса отличных от человека человекообразных обезьян представляют собой альтернативу использованию векторов на основе полученных от человека Ad для разработки генетических вакцин (Farina SF, J Virol. 2001 Dec; 75 (23): 11603-13; Fattori E, Gene Ther. 2006 Jul; 13 (14): 1088-96). Аденовирусы, выделенные из отличных от человека человекообразных обезьян, тесно связаны с аденовирусами, выделенными от человека, что продемонстрировано их эффективным размножением в клетках человеческого происхождения. Тем не менее, поскольку аденовирусы отличных от человека человекообразных обезьян и аденовирусы человека связаны, может иметь место некоторая степень или отсутствие серологической перекрестной реактивности между двумя видами вирусов. Это предположение подтвердилось, когда были выделены и охарактеризованы аденовирусы шимпанзе. Таким образом, аденовирус отличных от человека человекообразных обезьян согласно настоящему изобретению обеспечивает основу для снижения неблагоприятных эффектов, связанных с существовавшим ранее иммунитетом у людей к распространенным серотипам аденовирусов человека, и, таким образом, является ценным медицинским средством, которое можно, например, использовать для иммунизации и/или генной терапии.

Это связано с новыми последовательностями капсидных белков аденовируса, включая в себя белок гексон, пентон и фибер, но, в частности, с новыми последовательностями гексоновых HVR, которые представляют наиболее поверхностные аденовирусные эпитопы. Соответственно, ожидается, что в сыворотках крови человека не будут присутствовать или будет присутствовать очень мало нейтрализующих антител, специфических в отношении капсидных белков и, в частности, гексоновых HVR согласно настоящему изобретению. Таким образом, одно преимущество новых последовательностей состоит в том, что их можно использовать для усиления аденовирусов предшествующего уровня техники, которые были разработаны, например, для медицинских целей. Например, последовательности можно использовать, например, для замены/замещения одного или нескольких основных структурных капсидных белков или, в частности, только гексоновых HVR другого аденовируса, например, аденовируса предшествующего уровня техники для получения улучшенных рекомбинантных аденовирусов с пониженной частотой положительных серологических реакций у людей (химерные аденовирусы). Поскольку новые последовательности и, следовательно, аденовирусы, которые были заново сконструированы, как описано, не будут встречать какого-либо значительного ингибирующего иммунного ответа у людей при введении, их общая эффективность трансдукции и инфекционность будут усилены. Таким образом, такие улучшенные аденовирусы, как ожидается, будут представлять собой более эффективные вакцины, поскольку проникновение в клетки-хозяева и экспрессия антигенов не будут затруднены каким-либо значительным титром нейтрализующих антител.

Предпочтительным является то, что вакцина содержит адъювант. Предпочтительные иммунологические адъюванты упомянуты в настоящем документе и их можно использовать в такой вакцине.

Если применение представляет собой вакцинацию, рекомбинантный аденовирус согласно настоящему изобретению можно вводить в иммунологически и/или профилактически эффективной дозе, которая предпочтительно составляет от 1 × 10⁸ до 1 × 10¹¹ вирусных частиц (т.е. 1 × 10⁸, 5 × 10⁸, 1 × 10⁹, 5 × 10⁹, 1 × 10¹⁰, 2,5 × 10¹⁰ или 5 × 10¹⁰ частиц).

Более того, для вакцинации, которая требует бустер-иммунизации, предпочтительным является применение методики «гетерологичного прайм-буста»: в вакцинации полинуклеотид согласно первому или второму аспекту, по меньшей мере один выделенный аденовирусный капсидный полипептид согласно третьему аспекту, аденовирус согласно четвертому аспекту, вирусоподобную частицу согласно пятому аспекту или вектор согласно шестому аспекту и/или композицию согласно седьмому аспекту можно использовать для праймирования или для бустер-иммунизации, в частности, для вакцинации способом «гетерологичный прайм-буст». Согласно предпочтительному варианту осуществления гетерологичного прайм-буста можно использовать две различные вакцины, например, аденовирусы, причем особенно предпочтительным является то, что полинуклеотид согласно первому или второму аспекту, по меньшей мере один выделенный аденовирусный капсидный полипептид согласно третьему аспекту, аденовирус согласно четвертому аспекту, вирусоподобную частицу согласно пятому аспекту или вектор согласно шестому аспекту и/или композицию согласно седьмому аспекту используют в качестве бустер-вакцины из-за отсутствия или нейтрализующих антител, например, у людей.

Рекомбинантный аденовирус, полученный с использованием полинуклеотида или рекомбинантного аденовирусного белка или его фрагмента согласно настоящему изобретению, можно использовать для трансдукции клетки-хозяина полинуклеотидом, например, ДНК. Таким образом, предпочтительно можно получить аденовирус с дефицитом по репликации, который хотя и является инфекционным (т.е. способным проникать в клетку-хозяина), может экспрессировать любой специальный белок или полипептид в клетке-хозяине. Таким образом, согласно предпочтительному варианту осуществления терапия, описанная при применении согласно настоящему изобретению, представляет собой генную терапию. Генная терапия может представлять собой генную терапию in vivo, ex vivo или in vitro. Предпочтительно она представляет собой соматическую генную терапию. Если для генной терапии используют выделенный полинуклеотид, выделенный белок, вектор, рекомбинантный аденовирус и/или фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению, и его вводят субъекту, подлежащему лечению, предпочтительным является то, что его вводят в достаточно большой дозе, так что лечение приводит к трансфекции одной или нескольких клеток пациента, т.е. трансдукции. Если рекомбинантный аденовирус и/или фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением вводят любым из предпочтительных способов введения, раскрытых в настоящем документе, предпочтительным является то, что эффективная доза составляет предпочтительно от 1 × 10⁸ до 5 × 10¹¹ вирусных частиц (т.е. 1 × 10⁸, 5 × 10⁸, 1 × 10⁹, 5 × 10⁹, 1 × 10¹⁰, 2,5 × 10¹⁰, 5 × 10¹⁰, 1 × 10¹¹ или наиболее предпочтительно 5 × 10¹¹ частиц). Согласно предпочтительным вариантам осуществления предпочтительно гетерологичный полинуклеотид, который содержится в рекомбинантном аденовирусе согласно настоящему изобретению, способен экспрессировать белок или полипептид в клетке-хозяине субъекта, где белок или полипептид содержит сигнальный пептид, который влияет на секрецию белка или полипептид из указанной клетки-хозяина. Например, пациента, нуждающегося в определенном белке, можно лечить с использованием аденовируса согласно настоящему изобретению, который содержит кДНК, которая кодирует секретируемую форму этого белка.

Согласно дополнительному варианту осуществления применения настоящего изобретения полинуклеотид согласно первому или второму аспекту, по меньшей мере один выделенный аденовирусный капсидный полипептид согласно третьему аспекту, аденовирус согласно четвертому аспекту, вирусоподобную частицу согласно пятому аспекту или вектор согласно шестому аспекту и/или композицию согласно седьмому аспекту (далее упоминается как фармацевтическое средство согласно настоящему изобретению) составляют так, чтобы состав дополнительно содержал один или несколько фармацевтически приемлемых разбавителей; носителей; вспомогательных веществ, включая в себя наполнители, связующие, смазывающие средства, способствующие скольжению средства, улучшающие распадаемость средства и адсорбенты; и/или консерванты.

Фармацевтическое средство согласно настоящему изобретению можно вводить различными хорошо известными способами, включая в себя пероральное, ректальное, внутрижелудочное и парентеральное введение, например, внутривенный, внутримышечный, интраназальный, внутрикожный, подкожный и аналогичные пути введения. Парентеральное, внутримышечное и внутривенное введение является предпочтительным. Предпочтительно фармацевтическое средство согласно настоящему изобретению составлено в виде сиропа, раствора для инфузии или инъекции, таблетки, капсулы, капсуловидной таблетки, пастилки, липосомы, суппозитория, пластыря, лейкопластыря, капсулы замедленного действия, порошка или состава с медленным высвобождением. Предпочтительно разбавитель представляет собой воду, буфер, забуференный солевой раствор или солевой раствор, и носитель предпочтительно выбирают из группы, состоящей из масла какао и витепсола.

Особенно предпочтительными фармацевтическими формами для введения фармацевтического средства согласно настоящему изобретению во время использования согласно настоящему изобретению являются формы, подходящие для инъекционного применения, и включают в себя стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для немедленного приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсии. Как правило, такой раствор или дисперсия будет включать в себя растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, водные буферные растворы, например, биосовместимые буферы, этанол, многоатомный спирт, такой как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, их подходящие смеси, поверхностно-активные вещества или растительные масла.

Инфузионные или инъекционные растворы можно получить любым количеством известных в настоящей области техники способов, включая в себя без исключения добавление консервантов, таких как антибактериальные или противогрибковые средства, например парабен, хлорбутанол, фенол, сорбиновая кислота или тиомерсал. Кроме того, изотонические средства, такие как сахара или соли, в частности хлорид натрия, могут быть включены в растворы для инфузии или инъекции.

Предпочтительные разбавители согласно настоящему изобретению представляют собой воду, физиологически приемлемые буферы, физиологически приемлемые буферные солевые растворы или солевые растворы. Предпочтительными носителями являются масло какао и витепсол. Вспомогательные вещества, которые можно использовать с различными фармацевтическими формами фармацевтического средства согласно настоящему изобретению, можно выбрать из следующего неограничивающего списка:

a) связующие средства, такие как лактоза, маннит, кристаллический сорбит, двухосновные фосфаты, фосфаты кальция, сахара, микрокристаллическая целлюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, поливинилпирролидон и тому подобное;

b) смазывающие средства, такие как стеарат магния, тальк, стеарат кальция, стеарат цинка, стеариновая кислота, гидрогенизированное растительное масло, лейцин, глицериды и стеарилфумараты натрия;

c) средства, улучшающие распадаемость, такие как крахмалы, кроскарамелоза, метилцеллюлоза натрия, агар, бентонит, альгиновая кислота, карбоксиметилцеллюлоза, поливинилпирролидон и тому подобное.

Другие подходящие вспомогательные вещества можно найти в Справочнике фармацевтических вспомогательных веществ (Handbook of Pharmaceutical Excipients), опубликованном Американской фармацевтической ассоциацией.

Определенные количества фармацевтического средства согласно настоящему изобретению являются предпочтительными для терапии или профилактики заболевания. Тем не менее, следует понимать, что в зависимости от тяжести заболевания, типа заболевания, а также от соответствующего пациента, подлежащего лечению, например, общего состояния здоровья пациента и т.д., необходимы различные дозы фармацевтического средства согласно настоящему изобретению, чтобы вызвать терапевтический или профилактический эффект. Определение соответствующей дозы находится на усмотрении лечащего врача. Если фармацевтическое средство согласно настоящему изобретению предназначено для профилактического применения, его можно составить в виде вакцины. В этом случае фармацевтическое средство согласно настоящему изобретению предпочтительно вводят в указанных выше предпочтительных и особенно предпочтительных дозах. Предпочтительно введение вакцины повторяют по меньшей мере два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или, по меньшей мере, 10 раз в течение определенного периода времени до тех пор, пока вакцинированный субъект не произведет достаточное количество антител к фармацевтическому средству согласно настоящему изобретению, так чтобы риск развития соответствующего заболевания уменьшился. Период времени в этом случае, как правило, является переменным в зависимости от антигенности вакцины. Предпочтительно период времени составляет не более четырех недель, трех месяцев, шести месяцев или трех лет. Согласно одному варианту осуществления, если аденовирус согласно настоящему изобретению используют для целей вакцинации, по меньшей мере один из гипервариабельных доменов гексонового белка можно заменить иммуногенным эпитопом соответствующего возбудителя заболевания, против которого направлена вакцинация. Вакцины, как правило, содержат один или несколько адъювантов, как указано выше. Подробное описание использования аденовирусов для вакцинации и способов, относящихся к ним, приведено в: Bangari DS and Mittal SK (2006) Vaccine, 24(7), p.849-862; см. также: Zhou D, et al., Expert Opin Biol Ther. 2006 Jan;6(l):63-72; и Folgori A, et al., Nat Med. 2006 Feb;12(2):190-7.; см. также: Draper SJ, et al., Nat Med. 2008 Aug; 14(8):819-21. Epub 2008 Jul 27.

(ii) выделение аденовируса или аденовирусоподобной частицы из клетки или среды, окружающей клетку.

Способ необязательно предусматривает дополнительную стадию перед стадией (i) введения выделенного полинуклеотида согласно первому или второму аспекту или вектора согласно шестому аспекту в клетку, например, как описано выше.

Как правило, предпочтительным является то, что выделенный полинуклеотид кодирует аденовирус согласно четвертому аспекту или вирусоподобную частицу согласно пятому аспекту. Аденовирус является предпочтительно неспособным к репликации. Клетка представляет собой предпочтительно клетку согласно седьмому аспекту. Если выделенный полинуклеотид кодирует неспособный к репликации аденовирус, предпочтительным является то, что клетка представляет собой клетку-помощник или содержит конструкт-помощник (например, плазмиду-помощник или вирус-помощник, например, так как он трансдуцирован конструктом-помощником, предпочтительно инфицирован вирусом-помощником, перед или во время стадии (i)), как описано в настоящем документе, где клетка-помощник или конструкт-помощник, соответственно, экспрессирует гены/геномные области, которые делают аденовирус неспособным к репликации.

Фраза "так что аденовирус или аденовирусоподобная частица собираются в клетке" означает, что на стадии (i) все гены, необходимые для сборки аденовируса или аденовирусоподобной частицы, как описано в настоящем документе, экспрессируются в клетке. Она содержит все гены, необходимые для упаковки аденовируса (т.е. упаковки генома в вирусный капсид), если должен быть собран аденовирус.

Согласно предпочтительному варианту осуществления выделенный полинуклеотид кодирует некодирующую РНК VA РНК II и/или некодирующую РНК VA РНК I, как определено выше. VA РНК согласно настоящему изобретению приводит к улучшенному выходу аденовирусов или аденовирусоподобных частиц способа, как показано в примере 1.

Определения и дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения Ниже приведены некоторые определения терминов, часто используемых в настоящем описании изобретения. Эти термины, в каждом случае их использования, в оставшейся части описания имеют соответственно определенное значение и предпочтительные значения.

Используемый в настоящем документе термин «выделенный» относится к молекуле, которая по существу не содержит других молекул, с которыми она естественным образом связана. В частности, выделенный означает, что молекула не находится в теле животного или в образце тела животного. Таким образом, выделенная молекула свободна от других молекул, с которыми она может встретиться или контактировать в организме животного. Выделенный не означает выделенный из других компонентов, связанных с ним, как описано в настоящем документе, например, не выделен из других компонентов композиции, в которую входит молекула, или не выделен из вектора или клетки, в которую он входит.

Подразумевается, что термин «полинуклеотид» обозначает нуклеиновую кислоту, т.е. биологическую молекулу, состоящую из множества нуклеотидов. Он включает в себя ДНК, РНК и синтетические аналоги, например, PNA. ДНК является предпочтительной.

Термин «открытая рамка считывания» (ORF) относится к последовательности нуклеотидов, которые могут транслироваться в аминокислоты. Как правило, ORF содержит старт-кодон, последующую область, которая, как правило, характеризуется длиной, кратной 3 нуклеотидам, но не содержит стоп-кодон (TAG, ТАА, TGA, UAG, UAA или UGA) в данной рамке считывания. ORF кодирует белок, где аминокислоты, в которые он может транслироваться, образуют пептидно-связанную цепь.

Используемый в настоящем документе термин «белок», «пептид», «полипептид», «пептиды» и «полипептиды» используют взаимозаменяемо во всем описании. Эти термины относятся как к встречающимся в природе пептидам, например встречающимся в природе белкам, так и синтезированным пептидам, которые могут включать в себя природные или не встречающиеся в природе аминокислоты. Пептиды также могут быть химически модифицированы путем модификации боковой цепи или свободного амино- или карбокси-конца природной или не встречающейся в природе аминокислоты. Эта химическая модификация включает в себя добавление дополнительных химических фрагментов, а также модификацию функциональных групп в боковых цепях аминокислот, например, гликозилирование. Пептид представляет собой полимер, предпочтительно содержащий по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или по меньшей мере 100 аминокислот, наиболее предпочтительно по меньшей мере 8 или по меньшей мере 30 аминокислот. Поскольку полипептиды и белки, раскрытые в настоящем документе, получены из аденовируса, предпочтительным является то, что молекулярная масса выделенного полипептида или белка, используемого в настоящем документе, не превышает 200 кДа.

Аденовирус (Ad) представляет собой икосаэдрический вирус без оболочки, который был идентифицирован у нескольких хозяев-птиц и млекопитающих. Аденовирусы человека (hAd) принадлежат к роду Mastadenovirus, который включает в себя все известные человеческие и многие Ad животного происхождения (например, Ad крупного рогатого скота, свиньи, собаки, мыши, лошади, обезьяны и овцы). Аденовирусы человека, как правило, делят на шесть подгрупп (A-F) на основании ряда биологических, химических, иммунологических и структурных критериев, которые включают в себя свойства гемагглютинации эритроцитов крысы и макаки-резуса, гомологию ДНК, паттерны расщепления рестриктазой, процентное содержание G + С и онкогенность (Straus, 1984, в The Adenoviruses, ed. H. Ginsberg, pps.451-498, New York: Plenus Press, and Horwitz, 1990; в Virology, eds. B. N. Fields and D. M. Knipe, pps. 1679-1721).

Аденовирусный вирион характеризуется икосаэдрической симметрией и, в зависимости от серотипа, характеризуется диаметром 60-90 нм. Икосаэдрический капсид включает в себя три основных белка: белок гексон (II), основание пентона (III) и крученый фибер (IV) (W. С.Russel, J. Gen.Virol., 81: 2573-2604 (2000)). Более конкретно, аденовирусный капсид содержит 252 капсомера, из которых 240 представляют собой гексоны и 12 представляют собой пентоны. Гексоны и пептоны получены из трех различных вирусных полипептидов. Гексон содержит три идентичных полипептида, а именно полипептид II. Пентон содержит основание пентона, которое обеспечивает точку прикрепления к капсиду, и тримерный белок фибер, который нековалентно связан с основанием пентона и выступает из него. Другие белки, а именно белки IX, VI и IIIa, как правило, также присутствуют в аденовирусном капсиде. Считается, что эти белки стабилизируют вирусный капсид.

Одним из аспектов ранее существовавшего иммунитета, наблюдаемого у людей, является гуморальный иммунитет, который может приводить к выработке и сохранению антител, специфических в отношении аденовирусных белков. Гуморальный ответ, вызванный аденовирусом, в основном направлен против гипервариабельных областей структурного белка гексона. Аденовирусы, выделенные из организма отличных от человека человекообразных обезьяны, тесно связаны с аденовирусами, выделенными из организма человека, что продемонстрировано их эффективным размножением в клетках человеческого происхождения.

Капсид можно модифицировать, как описано в настоящем документе, путем включения неаденовирусных полипептидов, таких как Т- и/или В-клеточные эпитопы.

Термин «гексоновый белок» относится к белку гексону (II), содержащемуся в аденовирусе. Гексоновый белок или его вариант согласно настоящему изобретению выполняет ту же функцию, что и гексоновый белок или его фрагмент в вирионе инфекционного аденовируса. Таким образом, аденовирус, содержащий указанный гексон или его вариант, предпочтительно в виде капсидного белка, способен проникать в клетку-хозяина. Подходящий способ получения вариантов гексонового белка описан в патенте США№5922315. В этом способе по меньшей мере одна область петли гексона аденовируса заменена по меньшей мере одной областью петли другого серотипа аденовируса. Можно легко определить, может ли рекомбинантный аденовирус проникать в клетку-хозяина. Например, после контакта клетки-хозяина с аденовирусом рекомбинантную клетку-хозяина можно отмыть и лизировать, и можно определить, обнаружена ли в клетке-хозяине аденовирусная РНК и/или ДНК, например, с помощью подходящего гибридизационного зонда, специфического для аденовирусной РНК и/или ДНК. Альтернативно или дополнительно, клетку-хозяина после контакта с рекомбинантный аденовирусом можно отмыть, лизировать и зондировать специфическими антителами к аденовирусу, например, с использованием вестерн-блоттинга. В еще одной альтернативе наблюдают, например, in vivo, экспрессирует ли клетка-хозяин продукт гена, например, флуоресцентный белок при заражении рекомбинантный аденовирусом, который содержит подходящую экспрессионную кассету для экспрессии продукта гена в клетке-хозяине.

Термин «гипервариабельная область» относится к доменам с высокой вариабельностью последовательности между штаммами, расположенными на открытой для действия растворителя поверхности гексонового белка, таким образом, открытой для воздействий на наружной стороне вирусного капсида. Они являются основными детерминантами нейтрализующих антител. HVR можно идентифицировать, например, путем выравнивания последовательности с другими гексоновыми белками.

Под «аденовирусным пентоновым белком» подразумевается белок основания пентона (III), содержащийся в аденовирусе. Аденовирусный пентоновый белок характеризуется тем, что он локализуется в углах икосаэдрической симметрии капсида. Пентоновый белок или его вариант согласно настоящему изобретению выполняет ту же функцию, что и пентоновый белок в вирионе инфекционного аденовируса. Таким образом, аденовирус, содержащий указанный пентон или его вариант, предпочтительно в виде капсидного белка, способен проникать в клетку-хозяина, что можно исследовать, как описано выше. Кроме того, функциональный пентон характеризуется аффинностью по отношению к аденовирусному белку фиберу. Средний специалист в настоящей области техники хорошо знает, как проверить белок-белковую аффинность. Чтобы определить, способен ли первый белок связывать второй белок, он может использовать, например, двухгибридный генетический анализ на дрожжах или биохимический анализ, такой как аффинная адсорбция, иммуноферментный анализ (ИФА), анализ на основе флуоресцентной сортировки клеток (FACS) или анализ плазмонного резонанса. При использовании анализов аффинной адсорбции или плазмонного резонанса применимым является слияние по меньшей мере одного из белков с аффинной меткой, такой как HIS-метка, GST-метка или другая, как хорошо известно в области биохимии.

Термин «белок фибера» относится к крученому фиберному белку (IV), содержащемуся в аденовирусе. Белок фибера или его вариант согласно настоящему изобретению выполняет ту же функцию, что и белок фибера или его фрагмент в вирионе инфекционного аденовируса. Таким образом, аденовирус, содержащий указанный фибер или вариант фибера, предпочтительно в виде капсидного белка, способен проникать в клетку-хозяина, что можно исследовать, как описано выше. Кроме того, функциональный белок фибер характеризуется аффинностью по отношению к аденовирусному белку пентона. Кроме того, функциональный аденовирусный фиберный белок в его гликозилированной форме способен тримеризоваться. Таким образом, также предпочтительно, чтобы вариант был способен к гликозилированию и/или образованию тримера. Аффинность, включая в себя тримеризацию, можно испытывать, как описано выше, и анализы гликозилирования также хорошо известны в настоящей области техники.

«VA (вирус-ассоциированная) РНК» представляет собой тип некодирующего белка, обнаруженного в аденовирусе. Она играет роль в регулировании трансляции. Существует две копии этой РНК, называемые VAI или VA РНК I и VAII или VA РНК II. Два гена VA РНК представляют собой разные гены в геноме аденовируса. VA РНК I является основным видом с VA РНК II, экспрессируемым на более низком уровне. Ни один из транскриптов не является полиаденилированным, и оба транскрибируются с помощью PolIII.

Термин «идентичность» или «идентичный» в контексте полинуклеотидных, полипептидных или белковых последовательностей относится к числу остатков в двух последовательностях, которые являются идентичными, когда они выровнены для максимального соответствия. В частности, процент идентичности последовательности двух последовательностей, будь то последовательности нуклеиновых кислот или аминокислот, представляет собой количество точных совпадений между двумя выровненными последовательностями, разделенное на длину более короткой последовательности и умноженное на 100. Инструменты выравнивания, которые можно использовать для выравнивания двух последовательностей, хорошо известны специалисту в настоящей области техники и могут, например, быть получены в сети Интернет на сайтах, например, Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) для выравниваний полипептидов или MUSCLE (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/) или MAFFT (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/) для выравниваний полинуклеотидов или WATER (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/) для выравниваний полинуклеотидов и полипептидов. Выравнивания между двумя последовательностями можно выполнить с использованием настроек параметров по умолчанию, например, для MAFFT предпочтительно: матрица: BLOSUM62, штраф за внесение пропуска 1,53, штраф за удлинение пропуска 0,123, для выравнивания полинуклеотидов WATER предпочтительно: матрица: DNAFULL, штраф за внесение пропуска: 10,0, штраф за удлинение пропуска 0,5 и для выравнивания полипептидов WATER предпочтительно матрица: BLOSUM62, штраф за внесение пропуска: 10,0, штраф за удлинение пропуска: 0,5. Специалистам в настоящей области техники понятно, что может быть необходимо ввести пропуски в любой последовательности, чтобы обеспечить удовлетворительное выравнивание. «Наилучшее выравнивание последовательностей» определяется как выравнивание, которое создает наибольшее количество выровненных идентичных остатков при минимальном количестве пропусков. Предпочтительно это представляет собой глобальное выравнивание, которое включает в себя каждый остаток в каждой последовательности в выравнивании.

Термин «вариант» относится к полипептиду, как правило, к модифицированной версии полипептида, например, мутации, так что одна или несколько аминокислот полипептида могут быть удалены, вставлены, модифицированы и/или замещены. Как правило, вариант является функциональным, что означает, что аденовирус, содержащий функциональный вариант, способен инфицировать клетку-хозяина. Более конкретные функции определены в настоящем документе и имеют приоритет по отношению к общему определению. «Мутация» или «аминокислотная мутация» может представлять собой аминокислотную замену, делецию и/или вставку («и» могут применять, если присутствует более одной мутации). Предпочтительно это представляет собой замену (т.е. консервативную или неконсервативную аминокислотную замену), более предпочтительно консервативную аминокислотную замену. Согласно некоторым вариантам осуществления замена также включает в себя замену встречающейся в природе аминокислоты на не встречающуюся в природе аминокислоту. Консервативная замена включает в себя замену аминокислоты другой аминокислотой, характеризующейся химическим свойством, сходным с химическим свойством аминокислоты, которая является замещенной. Предпочтительно консервативная замена представляет собой замену, выбранную из группы, состоящей из следующего:

(i) замена основной аминокислоты другой, отличающейся основной аминокислотой;

(ii) замена кислой аминокислоты другой, отличающейся кислой аминокислотой;

(iii) замена ароматической аминокислоты другой, отличающейся ароматической аминокислотой;

(iv) замена неполярной алифатической аминокислоты другой, отличающейся неполярной алифатической аминокислотой; и

(v) замена полярной незаряженной аминокислоты другой, отличающейся полярной незаряженной аминокислотой.

Основная аминокислота предпочтительно выбрана из группы, состоящей из аргинина, гистидина и лизина. Кислая аминокислота предпочтительно представляет собой аспартат или глутамат. Ароматическая аминокислота предпочтительно выбрана из группы, состоящей из фенилаланина, тирозина и триптофана. Неполярная алифатическая аминокислота предпочтительно выбрана из группы, состоящей из глицина, аланина, валина, лейцина, метионина и изолейцина. Полярная незаряженная аминокислота предпочтительно выбрана из группы, состоящей из серина, треонина, цистеина, пролина, аспарагина и глютамина. В отличие от консервативной аминокислотной замены, неконсервативная аминокислотная замена представляет собой замену одной аминокислоты на любую аминокислоту, которая не подпадает под указанные выше консервативные замены (i) - (v).

Средства для определения идентичности последовательности описаны выше.

Аминокислоты белка также можно модифицировать, например, химически модифицировать. Например, боковую цепь или свободный амино- или карбокси-конец аминокислоты белка или полипептида можно модифицировать, например, путем гликозилирования, амидирования, фосфорилирования, убиквитинирования и т.д. Химическая модификация также может происходить in vivo, например, в клетке-хозяине, как хорошо известно в настоящей области техники. Например, подходящий мотив химической модификации, например, мотив последовательности гликозилирования, присутствующий в аминокислотной последовательности белка, будет вызывать гликозилирование белка. Если модификация не приводит к изменению идентичности модифицированной аминокислоты (например, замена или делеция), модифицированный полипептид входит в объем полипептида, как упомянуто в отношении определенной SEQ ID NO, т.е. это не является вариантом, как определено в настоящем документе.

Термин «вариант» относится к полинуклеотиду, как правило, к модифицированной версии полинуклеотида, например, мутации, так что один или несколько нуклеотидов полинуклеотида могут быть удалены, вставлены, модифицированы и/или замещены. Как правило, вариант является функциональным, что означает, что аденовирус, содержащий функциональный вариант, способен инфицировать клетку-хозяина. Более конкретные функции определены в настоящем документе и имеют приоритет над общим определением. «Мутация» может представлять собой замену, делецию и/или вставку нуклеотида («и» можно применять, если присутствует более одной мутации). Предпочтительно она представляет собой замену, более предпочтительно она вызывает аминокислотную замену, наиболее предпочтительно консервативную аминокислотную замену.

«Антигенный белок или его фрагмент» (где фрагмент также является антигенным) способен вызывать иммунный ответ у млекопитающего. Предпочтительно он представляет собой опухолевый антиген или антиген, полученный из патогена. Термин «патоген» относится к любому организму, который может вызывать заболевание у субъекта. Он включает в себя без ограничения бактерии, простейшие, грибы, нематоды, вироиды, вирусы и паразиты, причем каждый патоген способен сам по себе или совместно с другим патогеном вызывать заболевание у позвоночных, включая в себя без ограничения млекопитающих и включая в себя без ограничения людей. Используемый в настоящем документе термин «патоген» также охватывает организмы, которые обычно не могут быть патогенными для хозяина без ослабленного иммунитета, но являются таковыми у хозяина с ослабленным иммунитетом.

Вообще говоря, геном аденовируса хорошо охарактеризован. Существует общая консервативность в общей организации аденовирусного генома в отношении конкретных открытых рамок считывания, расположенных аналогично, например, расположение генов Е1А, Е1В, Е2А, Е2В, Е3, Е4, LI, L2, L3, L4 и L5 каждого вируса. Каждый конец аденовирусного генома содержит последовательность, известную как инвертированный концевой повтор (ITR), которая необходима для репликации вируса. Вирус также содержит кодируемую вирусом протеазу, которая необходима для процессинга некоторых структурных белков, необходимых для получения инфекционных вирионов. Структура аденовирусного генома описана на основе порядка, в котором вирусные гены экспрессируются после трансдукции клетки-хозяина. Более конкретно, вирусные гены называют ранними (Е) или поздними (L) генами в зависимости от того, происходит ли транскрипция до или после начала репликации ДНК. На ранней стадии трансдукции экспрессируются гены аденовируса Е1А, Е1В, Е2А, Е2В, Е3 и Е4 для подготовки клетки-хозяина к вирусной репликации. Во время поздней фазы инфекции активируются экспрессии поздних генов L1-L5, которые кодируют структурные компоненты вирусных частиц.

Используемый в настоящем документе термин «вектор» включает в себя любые векторы, известные специалисту в настоящей области техники, включая в себя плазмидные векторы, космидные векторы, фаговые векторы, такие как лямбда-фаг, вирусные векторы, такие как аденовирусные (Ad) векторы (например, нереплицирующие векторы Ad5, Ad11, Ad26, Ad35, Ad49, ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 и ChAd82 или способные к репликации векторы Ad4 и Ad7, известные из предшествующего уровня техники, например, международной патентной публикации WO 2005/071093 А2), векторы аденоассоциированного вируса (AAV) (например, AAV типа 5), векторы альфа-вируса (например, вирус венесуэльского лошадиного энцефалита (VEE), вируса Синдбис (SIN), вируса леса Семлики (SFV) и химеры VEE-SIN), векторы герпес-вируса, векторы вируса кори, векторы вируса оспы (например, вирус коровьей оспы, модифицированный вирус коровьей оспы Анкара (MVA), NYVAC (полученный из штамма коровьей оспы Копенгаген) и векторы авипоксвируса: векторы оспы канарейки (ALVAC) и вирус оспы кур (FPV)) и векторы вируса везикулярного стоматита, вирусоподобные частицы или бактериальные споры. Вектор также включает в себя экспрессионные векторы, векторы клонирования и векторы, которые являются применимыми для создания рекомбинантных аденовирусов в клетках-хозяевах.

Как указано выше, «гетерологичный белок или его фрагмент» может представлять собой неаденовирусный белок или его фрагмент, в частности антигенный белок или его фрагмент. С этой целью полинуклеотид, кодирующий гетерологичный белок, может представлять собой молекулу для доставки в клетку-мишень, например, полинуклеотид, кодирующий антигенный белок или его фрагмент, предпочтительно антигенный белок или фрагмент патогена, такого как патогенный вирус, бактерия, гриб, простейшее или паразит, или опухолевый антиген. «Антиген» относится к любому белку или пептиду, способному вызывать иммунный ответ у млекопитающего. Антиген предпочтительно содержит по меньшей мере 8 аминокислот и наиболее предпочтительно содержит от 8 до 12 аминокислот.

Термин «экспрессионная кассета» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая содержит по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, которая должна быть экспрессирована, наряду с последовательностями контроля ее транскрипции и трансляции. Изменение экспрессионной кассеты приведет к тому, что вектор, в который она включена, будет направлять экспрессию другой последовательности или комбинации последовательностей. Из-за того, что сайты рестрикции предпочтительно сконструированы так, чтобы они присутствовали на 5' и 3' концах, кассету можно легко вставить, извлечь или заменить другой кассетой. Предпочтительно экспрессионная кассета включает в себя цис-регулирующие элементы для эффективной экспрессии данного гена, такие как промотор, сайт инициации и/или сайт полиаденилирования. Более конкретно в отношении настоящего изобретения, экспрессионная кассета содержит все дополнительные элементы, необходимые для экспрессии полинуклеотида согласно первому или второму аспекту в клетках-хозяевах. Таким образом, типичная экспрессионная кассета содержит промотор, функционально связанный с полинуклеотидом согласно первому или второму аспекту, и сигналы, необходимые для эффективного полиаденилирования транскрипта, сайты связывания рибосом и терминацию трансляции. Дополнительные элементы кассеты могут включать в себя, например, энхансеры. Экспрессионная кассета также должна содержать область терминации транскрипции ниже структурного гена для обеспечения эффективного терминации. Область терминации можно получить из того же гена, что и последовательность промотора, или можно получить из разных генов.

Используемый в настоящем документе термин «миниген» относится к гетерологичному генному конструкту, в котором один или несколько функционально несущественных сегментов гена удалены по отношению к встречающемуся в природе гену. «Минигенная кассета» представляет собой экспрессионную кассету, содержащую миниген для экспрессии.

Термин «способный к репликации» рекомбинантный аденовирус (AdV) относится к аденовирусу, который может реплицироваться в клетке-хозяине при отсутствии каких-либо рекомбинантных белков-помощников, содержащихся в клетке. Предпочтительно «компетентный способный к репликации» аденовирус содержит следующие интактные или функционально важные ранние гены: Е1А, Е1В, Е2А, Е2В, Е3 и Е4. Аденовирусы дикого типа, выделенные из конкретного животного, будут способны к репликации у этого животного.

Термин «дефектный по репликации» или «неспособный к репликации» рекомбинантный AdV относится к аденовирусу, который оказался неспособным к репликации, поскольку он был сконструирован так, чтобы содержать по меньшей мере функциональную делецию, т.е. делецию, которая нарушает функцию ген, не удаляя его полностью, например, введение искусственных стоп-кодонов, делеция или мутация активных сайтов или доменов взаимодействия, мутация или делеция регуляторной последовательности гена и т.д. или полное удаление гена, кодирующего продукт гена, который необходим для репликации вируса, такой как один или несколько аденовирусных генов, выбранных из E1, Е2, Е3 и Е4. Рекомбинантные аденовирусы согласно настоящему изобретению предпочтительно являются дефектными по репликации.

Термин «рекомбинантный аденовирус» относится, в частности, к аденовирусу, который модифицирован для включения гетерологичной полинуклеотидной и/или полипептидной последовательности. «Гетерологичный» может означать от другого штамма аденовируса, в частности штамма от другого хозяина (например, чело века-хозяина, например, от аденовируса человека, такого как Ad3 или Ad5), или от неаденовирусного организма, такого как антиген, полученный из патогена, как описано в настоящем документе, или от человека, такого как опухолевый антиген человека. Как таковой, термин включает в себя химерные аденовирусы и аденовирусы-носители соответственно. Рекомбинантный аденовирус может содержать гетерологичную полинуклеотидную и/или полипептидную последовательность как от других аденовирусов, так и от неаденовирусных организмов, т.е. он может являться как химерным аденовирусом, так и аденовирусом-носителем.

Используемый в настоящем документе термин «вирусоподобная частица» или «VLP» относится к не реплицирующейся пустой вирусной оболочке, полученной в этом случае из аденовируса. VLP, как правило, состоят из одного или нескольких вирусных белков, таких как без ограничения белки, называемые белками капсида, оболочки, стенки, поверхности и/или капсулы. Они содержат функциональные вирусные белки, ответственные за проникновение в клетку вируса, что обеспечивает эффективное проникновение в клетку. VLP могут образовываться спонтанно при рекомбинантной экспрессии белка в соответствующей системе экспрессии. Способы получения конкретных VLP известны в настоящей области техники. В частности, VLP аденовируса можно получить путем функционального нарушения, например, делеций или введения нуль-мутации в ген Iva2 аденовируса, который участвует в упаковке вирусной ДНК (Ostapchuk et al. J Virol. 2011 Jun; 85(11): 5524-5531). Присутствие VLP можно обнаружить с использованием общепринятых способов, известных в настоящей области техники, таких как электронная микроскопия, рентгеновская кристаллография и тому подобное. См., например, Baker et al., Biophys. J. (1991) 60:1445-1456; Hagensee et al., J. Virol. (1994) 68:4503-4505. Например, криоэлектронную микроскопию можно выполнять на витрифицированных водных образцах рассматриваемого препарата VLP, и изображениях, записанных при соответствующих условиях воздействия.

«По существу отсутствие вирусной геномной ДНК», включенной в VLP, означает, что в VLP либо отсутствует вирусная геномная ДНК, либо недостаточно вирусной ДНК в VLP, чтобы обеспечить репликацию вируса в клетке, инфицированной VLP, и не экспрессировать ДНК, которая была бы комплементарной ДНК в VLP, так что может произойти репликация вируса.

В дополнение к вышесказанному, «эпитоп», также известный как антигенная детерминанта, представляет собой сегмент макромолекулы, который распознается иммунной системой, в частности антителами, В-клетками или Т-клетками. В контексте настоящего изобретения предпочтительно, чтобы термин «эпитоп» относился к сегменту белка или полипротеина, который распознается иммунной системой. Эпитопы, как правило, состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как боковые цепи аминокислот или сахара, и, как правило, имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Конформационные и неконформационные эпитопы отличаются тем, что связывание с первым, но не с последним, утрачивается в присутствии денатурирующих растворителей.

«Неаденовирусный Т-клеточный эпитоп» представляет собой эпитоп, который может быть представлен на поверхности антигенпрезентирующей клетки, где он связан с молекулой МНС. У людей профессиональные антигенпрезентирующие клетки специализируются на презентации пептидов МНС класса II, в то время как в большинстве ядерных соматических клеток присутствуют пептиды МНС класса I. Т-клеточные эпитопы, представленные молекулами МНС класса I, обычно представляют собой пептиды длиной от 8 до 11 аминокислот, тогда как молекулы МНС класса II представляют собой более длинные пептиды длиной 13-17 аминокислот.

«Неаденовирусный В-клеточный эпитоп» представляет собой эпитоп, который распознается В-клетками как трехмерные структуры на поверхности нативных антигенов.

В-и Т-клеточные эпитопы можно предсказать с помощью инструментов in silico, например, интерактивных инструментов прогнозирования В- или Т-клеток из ресурса IEDB Analysis Resource.

Термин «представляет один или несколько неаденовирусных В-клеточных эпитопов» означает, что один или несколько эпитопов включены в капсид таким образом, что они распознаются В-клетками. Термин «включает в себя один или несколько неаденовирусных В-/Т-клеточных эпитопов» означает, что эпитоп либо содержится в VLP без включения в капсид, либо включен в капсид. Если он включен в капсид, он может быть или может не быть представлен снаружи, так что он может быть распознан иммунными клетками.

«Иммунологический адъювант» или просто «адъювант» представляет собой вещество, которое ускоряет, продлевает и/или повышает качество и/или силу иммунного ответа на антиген/иммуноген по сравнению с введением антигена отдельно, таким образом, уменьшая количество антигена/иммуногена, необходимое в любой данной вакцине и/или частоту введения, необходимую для создания адекватного иммунного ответа на представляющий интерес антиген/иммуноген. Примерами адъювантов, которые можно использовать в контексте композиции согласно настоящему изобретению, являются гелеобразные осадки гидроксида алюминия (квасцы); AlPO₄; гидрат окиси алюминия; бактериальные продукты из наружной мембраны грамотрицательных бактерий, в частности монофосфориллипид A (MPLA), липополисахариды (LPS), мурамилдипептиды и их производные; неполный адъювант Фрейнда; липосомы, в частности нейтральные липосомы, липосомы, содержащие композицию, и необязательно цитокины; неионные блок-сополимеры; адъювант ISCOMATRLX (Drane et al., 2007); неметилированная ДНК, содержащая динуклеотиды CpG (мотив CpG), в частности ODN CpG с фосфоротиоатным (РТО) остовом (ODN CpG РТО) или фосфодиэфирным (РО) остовом (CpG РО ODN); синтетические производные липопептидов, в частности Pam₃Cys; липоарабиноманнан; пептидогликан; зимозан; белки теплового шока (HSP), в частности HSP 70; дцРНК и ее синтетические производные, в частности Poly I:poly С; поликатионные пептиды, в частности поли-L-аргинин; таксол; фибронектин; флагеллин; имидазохинолин; цитокины с адъювантной активностью, в частности, GM-CSF, интерлейкин-(IL-)2, IL-6, IL-7, IL-18, интерфероны типа I и II, в частности интерферон-гамма, TNF-альфа; 25-дигидроксивитамин D3 (кальцитриол); и синтетические олигопептиды, в частности пептиды, представленные MHCII. Неионные блок-полимеры, содержащие полиоксиэтилен (РОЕ) и полиоксипропилен (POP), такие как блок-сополимеры РОЕ-РОР-РОЕ, можно использовать в качестве адъюванта (Newman et al., 1998). Этот тип адъюванта является особенно применимым для композиций, содержащих нуклеиновые кислоты в качестве активного ингредиента.

Термин «вакцинация» в контексте настоящего изобретения представляет собой активную иммунизацию, которая представляет собой индукцию специфического иммунного ответа путем введения (например, подкожно, внутрикожно, внутримышечно, перорально, назально) антигена (вещества, которое для иммунной системы вакцинированного индивида является чужеродным и поэтому признан иммуногенным) в подходящем иммуногенном составе. Таким образом, антиген используют в качестве триггера для иммунной системы для создания специфического иммунного ответа на антиген. Вакцинацию в объеме настоящего изобретения в принципе можно проводить как в терапевтическом смысле, так и в профилактическом смысле. Она включает в себя вакцинацию против патогенов, как описано в настоящем документе, для лечения или профилактики инфекционных заболеваний, или вакцинацию для лечения или профилактики неинфекционных заболеваний, таких как рак. В случае неинфекционных заболеваний антиген предпочтительно представляет собой клеточный мембранный антиген, в частности, антиген, который экспрессируется только пораженной заболеванием клеткой, но не здоровыми клетками. Примером является ассоциированный с опухолью антиген. В этом контексте термин «ассоциированный с опухолью антиген» означает структуру, которая преимущественно представлена опухолевыми клетками и тем самым позволяет дифференцировать их от незлокачественной ткани. Предпочтительно, такой ассоциированный с опухолью антиген расположен на клеточной мембране опухолевой клетки или внутри нее. Примеры ассоциированных с опухолью антигенов описаны, например, в DeVita et al. (ред., "Biological Therapy of Cancer", 2 издание, глава 3: Biology of Tumor Antigens, Lippincott Company, ISBN 0-397-51416-6 (1995)).

Используемый в настоящем документе термин «праймирование» относится к введению вакцины для индукции/создания иммунного ответа у млекопитающего, и «бустер-иммунизация» относится к введению вакцины для усиления иммунного ответа у млекопитающего. Фраза «гетерологичный прайм-буст» означает, что вакцина для индукции/создания иммунного ответа (праймирования) у млекопитающего и вакцина для усиления иммунного ответа (бустер-иммунизации) у млекопитающего являются различными. Гетерологичный прайм-буст является применимым, если субъект, например, пациент выработал антитела к первому вектору, и требуется бустер-иммунизация. В этом контексте первая (прайм) и вторая (бустер) вакцина, например, аденовирус, являются достаточно различными, если ответ антител, индуцированный во время праймирования первой вакциной, не предотвращает проникновение более чем 70% или предпочтительно более 80% частиц второй вакцины, вводимых для бустер-иммунизации, в ядро клеток животного, которое подвергается праймированию и бустер-иммунизации.

Термин «генная терапия» можно широко определить как концепцию направленного введения чужеродного генетического материала в клетку, ткань или орган для коррекции дефектных генов с целью улучшения клинического статуса пациента. Используемый в настоящем документе термин «генная терапия» предпочтительно относится к «соматической терапии», а не к «терапии зародышевой линии», которая будет вызывать наследственные изменения, передаваемые из поколения в поколение, при этом соматическая терапия ограничивает терапевтический эффект для индивидуума, подлежащего лечению. Генную терапию, предпочтительно соматическую терапию, можно дополнительно подразделить на быстрое и простое осуществление прямого переноса гена в организм («in vivo») или сложный, но более специфический и контролируемый перенос гена в эксплантированные клетки или ткани («ех vivo» или «in vitro»), которые повторно имплантируют после лечения.

Термин «нейтрализующее антитело» относится к антителу, которое связывается с эпитопом аденовируса и предотвращает продуцирование им продуктивной инфекции в клетке-хозяине или предотвращает трансдукцию клетки-мишени неспособным к репликации вектором, экспрессирующим трансген, например, ДНК аденовируса способна проникать в клетку, в частности в клетку-хозяина.

Специалистам в настоящей области техники будут очевидны различные модификации и варианты настоящего изобретения без отступления от объема настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что заявленное настоящее изобретение не должно чрезмерно ограничиваться такими конкретными вариантами осуществления. Действительно, подразумевается, что различные модификации описанных способов осуществления настоящего изобретения, которые очевидны для специалистов в соответствующих областях техники, включены в настоящее изобретение.

Настоящее изобретение описано посредством следующих примеров, которые следует истолковывать как просто иллюстративные и не ограничивающие объем настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Выделение новых аденовирусных векторов

Конструирование векторов pGADNOU19 и pGADNOU20 проходило стадии, представленные ниже. Векторы pGADNOU19 и pGADNOU20 получали из штаммов аденовируса дикого типа, выделенных из образцов кала, полученных от здоровых человекообразных обезьян, отличных от человека, с использованием стандартных процедур. Вирусы дикого типа выделяли путем инокуляции монослоев клеток HEK 293 и А549 экстрактами кала. Клеточные монослои наблюдали ежедневно на предмет проявления цитопатического эффекта. Образцы, оцененные как положительные при наблюдении под микроскопом, собирали и затем клетки лизировали замораживанием-оттаиванием (-700°С/37°С). Осветленный клеточный лизат затем использовали для размножения вируса путем заражения монослоев свежих клеток. После двух пассажей вирусной амплификации аденовирус очищали с использованием стандартных процедур. Вирусный геном экстрагировали из очищенных вирусов путем обработки SDS/протеиназой K с последующей экстракцией фенолом-хлороформом. Очищенную ДНК аденовируса клонировали в челночный плазмидный вектор для модификации, заключающейся в следующих делециях вирусного генома:

1) делеция области Е1 (пары оснований от 461 до 3402) вирусного генома

2) делеция области Е3 (пары оснований от 28472 до 31996) вирусного генома

Пример 2: Создание челночных векторов GADNOU

Очищенные геномы ДНК вирусов GADNOU сначала секвенировали, а затем информацию о последовательности ДНК использовали для создания челночного вектора для клонирования всего генома GAd путем гомологичной рекомбинации. Челночный вектор разрабатывали для введения делеций области Е1 (координаты нуклеотидов: 461-3402). Вкратце, челночный вектор, используемый для клонирования вирусов GADNOU (называемый здесь челноком pGAd-GAG), конструировали следующим образом:

a. Левый конец GAd-GAG амплифицировали с помощью ПЦР с олигонуклеотидами FW 5'-GAACTCCgaattcgtttaaaccatcatcaataatataccttattttggattgaggccaatatgataatgaggtgggcggggcgaggcgg ggcgggtgacgtagg-3' (SEQ ID NO: 58) и RV 5'-cataatcGGCCGCAGCGGCCCGTCAG ATGACGGCGACAATAAA-3' (SEQ ID NO: 59), обработанными с помощью EcoRI и SfiI, затем лигировали в pUC19 rc_MCS_Left_end_PLX Rightend_V1, обработанный с помощью EcoRI и SfiI, таким образом создавая pUC19 L-ITR GAd-GAG.

b. Правый конец GAd затем амплифицировали с помощью ПЦР с олигонуклеотидами FW 5'- Cataatcgacccgagtcgcactctcacagcaccagca -3' (SEQ ID NO: 60) и RV 5'- GAACTCCggatccgtttaaacCATCATCAATAATATACCTTATTTTG -3' (SEQ ID NO: 61), обработанными с помощью PshA1 и BamHI, затем лигировали в pUC19 L-ITR GAd-GAG, обработанный с помощью PshAl и BamHI, таким образом создавая pUC19 L/R-ITR GAd-GAG.

c. Фрагмент ДНК, содержащий кодирующую область рГХ, амплифицировали с помощью ПЦР с олигонуклеотидами FW 5'-Cataatcgcgatcgcgcttaggcctgaccatctgg-3' (SEQ ID NO: 62) и RV 5'- GAACTCCggcgcgccTTAGGGGGAGGCAAGGCTG-3' (SEQ ID NO: 63), обработанными с помощью AsisI-AscI, затем клонировали в плазмиду pUC19 L/R-ITR GAd-GAG, обработанную с помощью AsisI-AscI, создавая pUC19 L/R-ITR pIX GAd-GAG.

d. Кассету HCMV-GAG-BGHpolyA получали из плазмиды phCMV-GAG, обработанной с помощью MscI-SfiI. Кассету клонировали в pUC19 L/R-ITR pIX GAd-GAG, обработанный с помощью MscI-SfiI и затем «затупляли концы», создавая челнок pGAd-GAG.

e. Конструирование челночной ВАС путем замены плазмидной области с помощью области ВАС: область ВАС получали из плазмиды pBELO ВАС RDL, обработанной с помощью PmeI, затем клонировали в плазмидный челночный вектор pGAd-GAG, обработанный с помощью PmeI, и, таким образом, создавая ВАС-челнок GAd-GAG.

f. Вставка селекционной кассеты Amp-LacZ-SacB между правым концом и областью pIX: селекционную кассету Amp-LacZ-SacB получали из челночной плазмиды pChAd с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидов FW (5'-GAACTCCGGCGCGCCTAGG GATAACAGGGTAAT ACCCCTATTTGTTTATTTTTCT -3', SEQ ID NO: 64) и RV (5'-CATAATCGGCGCGCCATTACCCTGTTATCCCTATTATTTGTTAACTGTTAA TTGTC-3', SEQ ID NO: 65), обработанных с помощью AscI. Селекционную кассету клонировали в ВАС-челночный вектор GAd-GAG, обработанный с помощью AscI, создавая ВАС-челнок GAd-GAG A/L/S (фигура 1).

Челночную плазмиду разработали так, чтобы она содержала сайты рестрикционных ферментов (PmeI), которые присутствуют только на конце обеих ITR, чтобы позволить высвобождение вирусной ДНК из плазмидной ДНК.

Пример 3: Конструирование векторов ΔЕ1

Геномную ДНК GADNOU wt выделяли с помощью обработки протеиназой K с последующей экстракцией фенолом/хлороформом. Векторы pGADNOU19 и pGADNOU20 получали гомологичной рекомбинацией в штамме Е. coli BJ5183. Клонирование вирусной ДНК получали путем котрансформации клеток штамма Е. coli BJ5183 с помощью очищенной вирусной ДНК WT и челнока ВАС GAd-GAG A/L/S. Гомологичная рекомбинация между генами pIX, правыми последовательностями ДНК ITR, присутствующими на концах челночной ВАС (обработанной с помощью AscI), и вирусной геномной ДНК позволила ее вставку в вектор ВАС путем одновременной делеции области Е1, которую замещали кассетой экспрессии, создавая векторы ΔE1/GAG (ВАС) GADNOU 19 GAG ВАС и GADNOU20 GAG ВАС. Скрининг проводили с помощью рестрикционного анализа и ПЦР-секвенирования на гексоновой области.

Пример 4: Конструирование векторов ΔЕ3

Стратегия конструирования основана на двух последовательных стадиях, как описано ниже:

a) Замещение области Е3 селекционной кассетой Amp-LacZ-SacB:

Селекционную кассету Amp-LacZ-SacB получали из челнока ВАС GAd-GAG A/L/S с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидов FW (5'-GGATTACACCAAGATCTTTGCTGTC ATTTGTGTGCTGAGTATAATAAAGGCTGAGATCAGAATCTACTCGACCCCTATTTGT ТТАТТТТТСТ-3', SEQ ID NO: 66) и RV (5'-CTTGCTATCAGA TTTCAAGTAAGTGATTTTTTATTGATTACAGTTATGATCAATTGAAAGGGATAAGGT CTTATTTGTTAACTGTTAATTGTC-3', SEQ ID NO: 67). Фрагмент ДНК, полученный с помощью ПЦР, затем клонировали в GAdNoul9 GAG ВАС и GAdNou20 GAG ВАС с помощью рекомбинационной техники с получением GAdNoul9 GAG (DE1E3) A/L/S ВАС и GAdNou20 GAG (DE1E3) A/L/S ВАС.

b) Делеция селекционной кассеты Amp-lacZ-SacB для делеций области Е3:

Селекционную кассету Amp-LacZ-SacB подвергали делеций с использованием одноцепочечного олигонуклеотида (5' ctgtcatttgtgtgctgagtataataaaggctgagatcagaatctactcggaccttatccctttcaattgatcataactgtaatcaataaaaaatca ctt-3', SEQ ID NO: 68) с получением замещения селекционной кассеты Amp-LacZ-SacB одноцепочечным олигонуклеотидом и последующей делецией области Е3. Одноцепочечный олигонуклеотид использовали для замещения селекционной кассеты в GADNOU 19 GAG (DE1E3) A/L/S ВАС и GADNOU20 GAG (DE1E3) A/L/S ВАС с помощью рекомбинационных техник для создания конечной плазмиды GADNOU 19 GAG (DE1E3) ВАС (фигура 2) и GADNOU20 GAG (DE1E3) ВАС (фигура 3).

Пример 5: Улучшенная продуктивность новых аденовирусных векторов

Продуктивность двух аденовирусных векторов, полученных от человекообразных обезьян, отличных от человека, GADNOU19 и GADNOU 20, несущих делецию Е1 и экспрессирующих антиген GAG, оценивали в адгезивных клетках Нек293. Продуктивность оценивали путем инфицирования адгезивных клеток Т25 очищенными вирусами при MOI 100 и MOI 300 вирусных частиц на клетки по сравнению с эталонным вектором Ad5, несущим ту же экспрессионную кассету. Инфицированные клетки собирали через три дня после заражения, когда полный цитопатический эффект становился очевидным; вирус выделяли из инфицированных клеток с помощью трех циклов замораживания/оттаивания (-70°/37°С), и лизаты затем осветляли центрифугированием. Осветленные лизаты количественно определяли с помощью количественной ПЦР с праймерами и зондами, комплементарными области промотора CMV. Олигонуклеотидные последовательности являются следующими: CMVfw для 5'-CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA-3' (SEQ ID NO: 69), CMVrv 5'-GACTTGGAAATCCCCGTGAGT-3' (SEQ ID NO: 70), зонд CMVFAM-TAMRA 5'-ACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTT-3' (SEQ ID NO: 71). QPCR выполняли на детекторе последовательности ABI Prism 7900 - Applied Biosystem. Результирующая удельная продуктивность, выраженная в вирусных частицах на клетку (vp/клетка) GAGNOU19 и GADNOU, экспрессирующих GAG, оказалась значительно выше, чем у эталонного вектора Ad5, несущего ту же экспрессионную кассету (фигура 1).

Обоснование повышения продуктивности. Аденовирусные геномы согласно настоящему изобретению относятся к группе С аденовирусов, которые, как известно, обладают высокой иммунологической активностью. В то же время вирусы группы С характеризуются относительно низкой продуктивностью. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что аденовирусные геномы согласно настоящему изобретению содержат определенный геномный признак, который отличается от многих других аденовирусов группы С. Признак представлен парой некодирующих РНК, присутствующих в геноме (так называемые вирус-ассоциированные (VA) РНК I и II), каждая длиной около 170 нуклеотидов и разделенных приблизительно 60 нуклеотидами. Как правило, присутствуют обе РНК I и II VA, но в некоторых случаях (вирусы группы А и некоторые вирусы группы В) присутствует только VA РНК I. Известно, что эти РНК связаны с вмешательством вируса в механизм клеточной защиты. Кроме того, обе VA РНК I и II дополнительно обрабатываются клеточными ферментами в микроРНК. Точная функция этих микроРНК, однако, неизвестна.

Анализируя последовательности известных аденовирусов, авторы настоящего изобретения обнаружили, что VA РНК I и II геномов согласно настоящему изобретению не похожи на последовательности VA РНК I и II других аденовирусов группы С (например, Ad5 и Ad2 человека, но также многие изоляты шимпанзе, принадлежащие к группе С), но вместо этого они более похожи на VA РНК I и VA РНК II из групп В и Е. Средние идентичности последовательностей VA РНК I и II в пределах и между группами были рассчитаны и показаны в таблице 3 ниже.

Таблица 3: Среднее процентное отношение идентичности последовательности VA РНК I в группах С*, В, Е, D, А, С и VA РНК II в пределах групп С*, В, Е, D, С и среднее процентное отношение идентичности последовательности между группой С* по отношению к другим группам. Группа С* представляет вирусы GADNOU согласно настоящему изобретению.

Следовательно, считается, что эти РНК приводят к более высокой репликации вирусов. Согласно имеющимся у авторов настоящего изобретения сведениям, VA РНК еще никогда не коррелировали с улучшенной продуктивностью аденовирусов.

Пример 6: Иммуногенность вектора Gad

Иммуногенность двух векторов GADNOU (GADNOU 19 GAG (DE1E3), SEQ ID NO: 72 и GADNOU20 GAG (DE1E3), SEQ ID NO: 73), кодирующих gag ВИЧ-1 (SEQ ID NO: 74), оценивали у мышей BALB/c. Шесть животных в группе иммунизировали внутримышечно возрастающими дозами каждого вектора GADNOU. ELISpot проводили на спленоцитах, собранных через 3 недели, с использованием в качестве антигена 9-мерного пептида, кодирующего главный эпитоп gag ВИЧ CD8+ Hd 2 Kd (AMQMLKETI). Данные показывают сильную иммуногенность, индуцированную обоими векторами при самой высокой протестированной дозе, составляющей 3×10⁷ vp (вирусные частицы). Также при более низкой дозе, составляющей 3×10⁶ vp оба вектора все еще были способны индуцировать специфический для gag ВИЧ-1 ответ Т-клеток у 50% вакцинированных мышей (фигура 5).

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> НОУСКОМ АГ

<120> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И АМИНОКИСЛОТНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

АДЕНОВИРУСОВ НЕ ОТНОСЯЩИХСЯ К ЧЕЛОВЕКУ ЧЕЛОВЕКООБРАЗНЫХ ОБЕЗЬЯН, СОДЕРЖАЩИЕ ИХ

ВЕКТОРЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> 854-10 PCT

<150> EP17179825.9

<151> 2017-07-05

<160> 74

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 37184

<212> ДНК

<213> Аденовирус человекообразных обезьян

<400> 1

catcatcaat aatatacctt attttggatt gaggccaata tgataatgag gtgggcgggg 60

cgaggcgggg cgggtgacgt aggacgcgcg agtagggttg ggaggtgtgg cggaagtgtg 120

gcatttgcaa gtgggaggag ctgacatgca atcttccgtc gcggaaaatg tgacgttttt 180

gatgagcgcc gcctacctcc ggaagtgcca attttcgcgc gcttttcacc ggatatcgta 240

gtaattttgg gcgggaccat gtaagatttg gccattttcg cgcgaaaagt gaaacgggga 300

agtgaaaact gaataatagg gcgttagtca tagcgcgtaa tatttaccga gggccgaggg 360

actttgaccg attacgtgga ggactcgccc aggtgttttt tacgtgaatt tccgcgttcc 420

gggtcaaagt ctccgttttt attgtcgccg tcatctgacg cggagggtat ttaaacccgc 480

tgcgctccta aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc tccgctccgt 540

ttcggcgatc gaaaaatgag acatttagcc tgcactccgg gtcttttgtc cggccgggcg 600

gcgtccgagc ttttggacgc tttgctcaat gaggttctga gcgatgattt tccgtctact 660

acccacttta gcccacctac tcttcacgaa ctgtacgatc tggatgtact ggtggatgtg 720

aacgatccca acgaggaggc ggtttctacg ttttttcccg agtctgcgct tttggctgcc 780

caggagggat ttgacctaca cactccgccg ctgcctattt tagagtctcc gctgccggag 840

cccagtggta taccttatat gcctgaactg cttcccgaag tggtagacct gacctgccac 900

gagccgggct ttccgcccag cgacgatgag ggtgagcctt ttgctttaga ctatgctgag 960

atacctgggc tcggttgcag gtcttgtgca tatcatcaga gggttaccgg agaccccgag 1020

gttaagtgtt cgctgtgcta tatgaggctg acctcttcct ttatctacag taagtttttt 1080

tgtgtaggtg ggctttttgg gtaggtgggt tttgtggcag gacaggtgta aatgttgctt 1140

gtgttttttg tacctgcagg tccggtgtcc gagccagacc cggagcccga ccgcgatccc 1200

gagccggatc ccgagcctcc tcgcaggcca aggaaattac cttccatttt gtgcaagcct 1260

aagacacctg tgaggaccag cgaggcggac agcactgact ctggcacttc tacctctcct 1320

cctgaaattc acccagtggt tcctctgggt atacatagac ctgttgctgt tagagtttgc 1380

gggcgacgcc ctgcagtaga gtgcattgag gacttgctta acgatcccga gggacctttg 1440

gacttgagca ttaaacgccc taggcaataa accccaccta agtaataaac cccacctaag 1500

taataaactt taccgccctt ggttattgag atgacgccca atgtttgctt ttgaatgact 1560

tcatgtgtat aataaaagtg agtgtggtca taggtctctt gtttgtctgg gcggggttta 1620

agggtatata agtttctcgg ggctaaactt ggttacactt gaccccaatg gaggcgtggg 1680

ggtgcttgga ggagtttgcg gacgtgcgcc gtttgctgga cgagagctct agcaatacct 1740

atagtatttg gaggtatctg tggggctcta ctcaggccaa gttggtcttc agaattaagc 1800

aggattacaa gtgcgatttt gaagagcttt ttagttcctg tggtgagctt ttgcaatcct 1860

tgaatctggg ccaccaggct atcttccagg aaaaggttct ctcgactttg gatttttcca 1920

ctcccgggcg caccgccgct tgtgtggctt ttgtgtcttt tgtgcaagat aaatggagcg 1980

gggagaccca cctgagtcac ggctacgtgc tggatttcat ggcgatggct ctttggaggg 2040

cttacaacaa atggaagatt cagaaggaac tgtacggttc cgccctacgt cgtccacttc 2100

tgcagcggca ggggctgatg tttcccgacc atcgccagca tcagaatctg gaagacgagc 2160

gagcggagaa gatcagcttg agagccggcc tggaccctcc tcaggaggaa tgaatctccc 2220

gcaggtggtt gagctgtttc ccgaactgag acgggtcctg actatcaggg aggatggtca 2280

gtttgtgaag aagctgaaga gggatcgggg tgagggagat gatgaggcgg ctagcaattt 2340

agcttttagt ctgataactc gccaccgacc ggaatgtatt acctatcagc agattaagga 2400

gagttgtgcc aacgagctgg atcttttggg tcagaagtat agcatagaac agcttaccac 2460

ttactggctt cagcccgggg atgattggga agaggcgatt agggtgtatg caaaggtggc 2520

cctgcggccc gattgcaagt ataagattac taagttggtt aatattagaa actgctgcta 2580

tatttctgga aacggggccg aagtggagat agatactgag gacagggtgg ctattaggtg 2640

ttgcatgata aacatgtggc ccgggatact ggggatggat ggggtgatat ttatgaatgt 2700

gaggttcacg ggccccaact ttaatggtac ggtgttcatg ggcaacacca acttgctcct 2760

gcatggtgcg agtttctatg ggtttaacaa cacctgtata gaggcctgga ccgatgtaaa 2820

ggttcgaggt tgttcctttt atagctgttg gaaggcggtg gtgtgtcgcc ctaaaagcag 2880

gggttctgtg aagaaatgct tgtttgaaag gtgcacccta ggtatccttt ctgagggcaa 2940

ctccagggtg cgccataatg tggcttcgaa ctgcggttgc ttcatgcaag tgaagggggt 3000

gagcgttatc aagcataact cggtctgtgg aaactgcgag gatcgcgcct ctcagatgct 3060

gacctgcttt gatggcaact gtcacctgtt gaagaccatt catataagca gtcaccccag 3120

aaaggcctgg cccgtgtttg agcataacat tctgacccgc tgttccttgc atctgggggt 3180

caggaggggt atgttcctgc cttaccagtg taactttagc cacactaaaa tcctgctgga 3240

acccgagtgc atgactaagg tcagcctgaa tggtgtgttt gatgtgagtc tgaagatttg 3300

gaaggtgctg aggtatgatg agaccaggac caggtgccga ccctgcgagt gcggcggcaa 3360

gcacatgaga aatcagcctg tgatgttgga tgtgaccgag gagcttaggc ctgaccatct 3420

ggtgctggcc tgcaccaggg ccgagtttgg gtctagcgat gaggataccg attgaggtgg 3480

gtaaggtggg cgtggctagc agggtgggcg tgtataaatt gggggtctaa ggggtctctc 3540

tgtttgtctt gcaacagccg ccgccatgag cgacaccggc aacagctttg atggaagcat 3600

ctttagtccc tatctgacag tgcgcatgcc tcactgggcc ggagtgcgtc agaatgtgat 3660

gggttccaac gtggatggac gtcccgttct gccttcaaat tcgtctacta tggcctacgc 3720

gaccgtggga ggaactccgc tggacgccgc gacctccgcc gccgcctccg ccgccgccgc 3780

gaccgcgcgc agcatggcta cggaccttta cagctctttg gtggcgagca gcgcggcctc 3840

tcgcgcgtct gctcgggatg agaaactgac tgctctgctg cttaaactgg aagacttgac 3900

ccgggagctg ggtcaactga cccagcaggt ttccagcttg cgtgagagca gccttgcctc 3960

cccctaatgg cccataatat aaataaaagc cagtctgttt ggattaagca agtgtatgtt 4020

ctttatttaa ctctccgcgc gcggtaagcc cgggaccagc ggtctcggtc gtttagggtg 4080

cggtggattt tttccaacac gtggtacagg tggctctgga tgtttagata catgggcatg 4140

agtccatccc tggggtggag gtagcaccac tgcagagctt cgtgctcggg ggtggtgttg 4200

tatatgatcc agtcgtagca ggagcgctgg gcgtggtgct gaaaaatgtc cttaagcaag 4260

aggcttatag ctagggggag gcccttggtg taagtgttta caaatctgct tagctgggag 4320

gggtgcatcc ggggggatat gatgtgcatc ttggactgga tttttaggtt ggctatgttc 4380

ccgcccagat cccttctggg attcatgttg tgcaggacca ccagcacggt atatccagtg 4440

cacttgggaa atttatcgtg gagcttagac gggaatgcat ggaagaactt ggagacgccc 4500

ttgtggcctc ccagattttc catacattcg tccatgatga tggcaatggg cccgtgggaa 4560

gctgcctgag caaaaacgtt tctggcatcg ctcacatcgt agttatgttc cagggtgagg 4620

tcatcatagg acatctttac gaatcggggg cgaagggtcc cggactgggg gatgatggta 4680

ccctcgggcc ccggggcgta gttcccctca cagatctgca tctcccaggc tttcatttca 4740

gagggaggga tcatatccac ctgcggggcg atgaaaaaga cagtttctgg cgcaggggag 4800

attaactggg atgagagcag gtttctgagc agctgtgact ttccacagcc ggtgggccca 4860

tatatcacgc ctatcaccgg ctgcagctgg tagttaagag agctgcagct gccgtcctcc 4920

cggagcaggg gggccacctc gttgagcata tccctgacgt ggatgttctc cctgaccagt 4980

tccgccagaa ggcgctcgcc gcccagcgaa agcagctctt gcaaggaagc aaaatttttc 5040

agcggtttca ggccatcggc cgtgggcatg tttttcagcg tctgggtcag cagctccagc 5100

ctgtcccaga gctcggtgat gtgctctacg gcatctcgat ccagcagatc tcctcgtttc 5160

gcgggttggg gcggctttcg ctgtagggca ccagccgatg ggcgtccagc ggggccagag 5220

tcatgtcctt ccatgggcgc agggtcctcg tcagggtggt ctgggtcacg gtgaaggggt 5280

gcgctccggg ttgggcactg gccagggtgc gcttgaggct ggttctgctg gtgctgaatc 5340

gctgccgctc ttcgccctgc gcgtcggcca ggtagcattt gaccatggtc tcgtagtcga 5400

gaccctcggc ggcgtgcccc ttggcgcgga gctttccctt ggaggtggcg ccgcacgagg 5460

ggcactgcag gctcttcagg gcgtagagct tgggagcgag aaacacggac tctggggagt 5520

aggcgtccgc gccgcaggcc gagcagaccg tctcgcattc caccagccaa gtgagttccg 5580

ggcggtcagg gtcaaaaacc aggttgcccc catgcttttt gatgcgtttc ttaccttggc 5640

tctccatgag gcggtgtccc ttctcggtga cgaagaggct gtccgtgtcc ccgtagaccg 5700

acttcagggg cctgtcttcc agcggagtgc ctctgtcctc ctcgtagaga aactctgacc 5760

actctgagac gaaggcccgc gtccaggcca ggacgaagga ggccacgtgg gaggggtagc 5820

ggtcgttgtc cactagcggg tccaccttct ccagggtgtg caggcacatg tccccctcct 5880

ccgcgtccag aaaagtgatt ggcttgtagg tgtaggacac gtgaccgggg gttcccaacg 5940

ggggggtata aaagggggtg ggtgcccttt catcttcact ctcttccgca tcgctgtctg 6000

cgagagccag ctgctggggt aagtattccc tctcgaaggc gggcatgacc tcagcgctca 6060

ggttgtcagt ttctaaaaat gaggaggatt tgatgttcac ctgtccggag gtgatacctt 6120

tgagggtacc tgggtccatc tggtcagaaa acactatttt tttgttatca agcttggtgg 6180

cgaatgaccc gtagagggcg ttggagagca gcttggcgat ggagcgcagg gtctggtttt 6240

tgtcgcggtc ggctcgctcc ttggccgcga tgttgagttg cacgtactcg cgggccacgc 6300

acttccactc ggggaacacg gtggtgcgct cgtctgggat caggcgcacc ctccagccgc 6360

ggttgtgcag ggtgaccatg tcgacgctgg tggcgacctc accgcgcaga cgctcgttgg 6420

tccagcagag gcggccgccc ttgcgcgagc agaagggggg tagggggtcc agctggtcct 6480

cgtttggggg gtccgcgtcg atggtaaaga ccccggggag caggcgcggg tcaaagtagt 6540

cgatcttgca agcttgcatg tccagagccc gctgccattc gcgggcggcg agcgcgcgct 6600

cgtaggggtt gaggggcggg ccccagggca tggggtgggt gagcgcggag gcgtacatgc 6660

cgcagatgtc atacacgtac aggggttccc tgaggatacc gaggtaggtg gggtagcagc 6720

gccccccgcg gatgctggcg cgcacgtagt catagagctc gtgggagggg gccagcatgt 6780

tgggcccgag gttggtgcgc tgggggcgct cggcgcggaa gacgatctgc ctgaagatgg 6840

cgtgggagtt ggaggagatg gtgggccgct ggaagacgtt gaagcttgct tcttgcaagc 6900

ccacggagtc cctgacgaag gaggcgtagg actcgcgcag cttgtgcacc agctcggcgg 6960

tgacctggac gtcgagcgca cagtagtcga gggtctcgcg gatgatgtca tacctatcct 7020

cccccttctt tttccacagc tcgcggttga ggacgaactc ttcgcggtct ttccagtact 7080

cttggagggg aaacccgtcc gtgtccgaac ggtaagagcc tagcatgtag aactggttga 7140

cggcctggta ggggcagcag cccttctcca cgggcagcgc gtaggcctgc gccgccttgc 7200

ggagggaggt gtgggtgagg gcgaaagtgt ccctgaccat gactttgagg tattgatgtc 7260

tgaagtctgt gtcatcgcag ccgccctgtt cccacagggt gtagtccgtg cgctttttgg 7320

agcgcgggtt gggcagggag aaggtgaggt cattgaagag gatcttcccc gctcgaggca 7380

tgaagtttct ggtgatgcga aagggccctg ggaccgagga gcggttgttg atgacctggg 7440

cggccaggac gatctcgtca aagccgttta tgttgtgtcc cacgatgtag agctccagga 7500

agcggggctg gcccttgatg gaggggagct ttttaagttc ctcgtaggta agctcctcgg 7560

gcgattccag gccgtgctcc tccagggccc agtcttgcaa gtgagggttg gccgccagga 7620

aggatcgcca gaggtcgcgg gccatgaggg tctgcaggcg gtcgcggaag gttctgaact 7680

gccgccccac ggccattttt tcgggggtga tgcagtagaa ggtgaggggg tctttctccc 7740

aggggtccca tctgagctct cgggcgaggt cgcgcgcggc agcgaccaga gcctcgtcgc 7800

cccccagttt catgaccagc atgaagggca cgagttgctt gccaaaggct cccatccaag 7860

tgtaggtttc tacatcgtag gtgacaaaga ggcgctccgt gcgaggatga gagccgattg 7920

ggaagaactg gatctcccgc caccagttgg aggattggct gttgatgtgg tgaaagtaga 7980

agtcccgtct gcgggccgag cactcgtgct ggcttttgta aaagcgaccg cagtactggc 8040

agcgctgcac gggttgtata tcttgcacga ggtgaacctg gcgacctctg acgaggaagc 8100

gcagcgggaa tctaagtccc ccgcctgggg tcccgtgtgg ctggtggtct tttactttgg 8160

ttgtctggcc gccagcatct gtctcctgga gggcgatggt ggaacagacc accacgccgc 8220

gagagccgca ggtccagatc tcggcgctcg gcgggcggag tttgatgacg acatcgcgca 8280

cattggagct gtccatggtc tccagctccc gcggcggcag gtcagccggg agttcctgga 8340

ggttcacctc gcagagacgg gtcaaggcgc ggacagtgtt gagatggtat ctgatttcaa 8400

ggggcatgtt ggaggcggag tcgatggctt gcaggaggcc gcagccccgg ggggccacga 8460

tggttccccg cggggcgcga ggggaggcgg aagctggggg tgtgttcaga agcggtgacg 8520

cgggcgggcc cccggaggta gggggggttc cggccccaca ggcatgggcg gcaggggcac 8580

gtcttcgccg cgcgcgggca ggggctggtg ctggctccga agagcgcttg cgtgcgcgac 8640

gacgcgacgg ttggtgtcct gtatctggcg cctctgagtg aagaccacgg gtcccgtgac 8700

cttgaacctg aaagagagtt cgacagaatc aatctcggca tcgttgacag cggcctggcg 8760

caggatctcc tgcacgtcgc ccgagttgtc ctggtaggcg atttctgcca tgaactgctc 8820

gatctcttcc tcctggagat ctcctcgtcc ggcgcgctcc acggtggccg ccaggtcgtt 8880

ggagatgcga cccatgagct gcgagaaggc gttgagtccg ccctcgttcc agacccggct 8940

gtagaccacg cccccctcgg cgtcgcgggc gcgcatgacc acctgggcca ggttgagctc 9000

cacgtgtcgc gtgaagacgg cgtagttgcg caggcgctgg aaaaggtagt tcagggtggt 9060

ggcggtgtgc tcggcgacga agaagtacat gacccagcgc cgcaacgtgg attcattgat 9120

gtcccccaag gcctccaggc gctccatggc ctcgtagaag tccacggcga agttgaaaaa 9180

ctgggagttg cgagcggaca cggtcaactc ctcctccaga agacggatga gctcggcgac 9240

agtgtcgcgc acctcgcgct cgaaggccac ggggggcgct tcttcctctt ccacctcttc 9300

ttccatgatt gcttcttctt cttcctcagc cgggacggga gggggcggcg gcgggggagg 9360

ggcgcggcgg cggcggcggc gcaccgggag gcggtcgatg aagcgctcga tcatctcccc 9420

ccgcatgcgg cgcatggtct cggtgacggc gcggccgttc tcccgggggc gcagctcgaa 9480

gacgccgcct ctcatttcgc cgcggggcgg gcggccgtga ggtagcgaga cggcgctgac 9540

tatgcatctt aacaattgct gtgtaggtac gccgccaagg gacctgattg agtccagatc 9600

caccggatcc gaaaaccttt ggaggaaagc gtctatccag tcgcagtcgc aaggtaggct 9660

gagcaccgtg gcgggcgggg gcgggtcggg agagttcctg gcggagatgc tgctgatgat 9720

gtaattaaag taggcggtct tgagaaggcg gatggtggac aggagcacca tgtctttggg 9780

tccggcctgt tggatgcgga ggcggtcggc catgccccag gcctcgttct gacaccggcg 9840

caggtctttg tagtaatctt gcatgagtct ttccaccggc acttcttctc cttcctcttc 9900

ttcatctcgc cggtggtttc tcgcgccgcc catgcgcgtg accccaaagc ccctgagcgg 9960

ctgcagcagg gccaggtcgg cgaccacgcg ctcggccaag atggcctgct gtacctgagt 10020

gagggtcctc tcgaagtcat ccatgtccac gaagcggtgg taggcacccg tgttgatggt 10080

gtaggtgcag ttggccatga cggaccagtt gacggtctgg tgtcccggct gcgagagctc 10140

cgtgtaccgc aggcgcgaga aggcgcggga atcgaacacg tagtcgttgc aagtccgcac 10200

cagatactgg tagcccacca ggaagtgcgg cggaggttgg cgatagaggg gccagcgctg 10260

ggtggcgggg gcgccgggcg ccaggtcttc cagcatgagg cggtggtatc cgtagatgta 10320

cctggacatc caggtgatgc ctgcggcggt ggtggtggcg cgcgcgtagt cgcggacccg 10380

gttccagatg tttcgcaggg gcgagaagtg ttccatggtc ggcacgctct ggccggtgag 10440

gcgcgcgcag tcgttgacgc tctatacaca cacaaaaacg aaagcgttta cagggctttc 10500

gttctgtagc ctggaggaaa gtaaatgggt tgggttgcgg tgtgccccgg ttcgagacca 10560

agctgagctc agccggctga agccgcagct aacgtggtat tggcagtccc gtctcgaccc 10620

aggccctgta tcctccagga tacggtcgag agcccttttg ctttcttggc caagcgcccg 10680

tggcgcgatc tgggatagat ggtcgcgatg agaggacaaa agcggctcgc ttccgtagtc 10740

tggagaaaca atcgccaggg ttgcgttgcg gcgtaccccg gttcgagccc ctatggcggc 10800

ttggatcggc cggaaccgcg gctaacgtgg gctgtggcag ccccgtcctc aggaccccgc 10860

cagccgactt ctccagttac gggagcgagc cccttttgtt tttttatttt ttagatgcat 10920

cccgtgctgc ggcagatgcg cccctcgccc cggcccgatc agcagcagca acagcaggca 10980

tgcagacccc cctctcctct ccccgccccg gtcaccacgg ccgcggcggc cgtgtccggt 11040

gcggggggcg cgctggagtc agatgagcca ccgcggcggc gacctaggca gtatctggac 11100

ttggaagagg gcgagggact ggcgcggctg ggggcgagct ctccagagcg ccacccgcgg 11160

gtgcagttga aaagggacgc gcgtgaggcg tacctgccgc ggcaaaacct gtttcgcgac 11220

cgcgggggcg aggagcccga ggagatgcgg gactgcaggt tccaagcggg gcgcgagctg 11280

cgccgcggct tggacagaca gcgcctgctg cgcgaggagg actttgagcc cgacacgcag 11340

acgggcatca gccccgcgcg cgcgcacgtg gccgcggccg acctggtgac cgcctacgag 11400

cagacggtga accaggagcg caacttccaa aaaagcttca acaaccacgt gcgcacgctg 11460

gtggcgcgcg aggaggtgac cctgggtctc atgcatctgt gggacctggt ggaggcgatc 11520

gtgcagaacc ccagcagcaa gcccctgacc gcgcagctgt tcctggtggt gcagcacagc 11580

agggacaacg aggccttcag ggaggcgctg ctgaacatca ccgagccgga ggggcgctgg 11640

ctcctggacc tgataaacat cctgcagagc atagtggtgc aggagcgcag cctgagcctg 11700

gccgagaagg tggcggccat taactattct atgctgagcc tgggcaagtt ctacgctcgc 11760

aagatctaca agacccccta cgtgcccata gacaaggagg tgaagataga cagcttctac 11820

atgcgcatgg cgctgaaggt gctaaccctg agcgacgacc tgggagtgta ccgcaacgag 11880

cgcatccaca aggccgtgag cgccagccgg cggcgcgagc tgagcgaccg cgaactgatg 11940

cacagtctgc agcgcgcgct gaccggcgcg ggcgagggcg acagggaggt cgagtcctac 12000

tttgacatgg gggccgacct gcactggcag ccgagccgcc gcgccctgga agcggcgggg 12060

gcgtacggcg gccccctggc ggccgatgac gaggaagagg aggactatga gctagaggag 12120

ggcgagtacc tggaggactg acctggctgg tggtgttttg gtatagatgc aagatccgaa 12180

cgtggcggac ccggcggtcc gggcggcgct gcagagccag ccgtccggca ttaactcctc 12240

tgacgactgg gccgcggcca tgggtcgcat catggccctg accgcgcgca accccgaggc 12300

cttcaggcag cagcctcagg ctaaccggct ggcggccatc ttggaagcgg tagtgcccgc 12360

gcgctccaac cccacccacg agaaggtgct ggccatagtc aacgcgctgg cggagagcag 12420

ggccatccgg gcagacgagg ccggactggt gtacgatgcg ctgctgcagc gggtggcgcg 12480

gtacaacagc ggcaacgtgc agaccaacct ggaccgcctg gtgacggacg tgcgcgaggc 12540

cgtggcgcag cgcgagcgct tgcatcagga cggcaacctg ggctcgctgg tggcgctaaa 12600

cgccttcctt agcacccagc cggccaacgt accgcggggg caggaggact acaccaactt 12660

cttgagcgcg ctgcggctga tggtgaccga ggtccctcag agcgaggtgt accagtcggg 12720

gcccgactac ttcttccaga ccagcagaca gggcttgcaa accgtgaacc tgagccaggc 12780

tttcaagaac ctgcgggggc tgtggggagt gaaggcgccc accggcgacc gggctacggt 12840

gtccagcctg ctaaccccca actcgcgcct gctgctgctg ctgatcgcgc ccttcacgga 12900

cagcgggagc gtctcgcggg agacctatct gggccacctg ctgacgctgt accgcgaggc 12960

catcgggcag gcgcaggtgg acgagcacac cttccaggag atcaccagcg tgagccacgc 13020

gctggggcag gaggacacgg gcagcctgca ggcgaccctg aactacctgc tgaccaacag 13080

gcggcagaag attcccacgc tgcacagcct gacccaggag gaggagcgca tcttgcgcta 13140

cgtgcagcag agcgtgagcc tgaacctgat gcgcgacggc gtgacgccca gcgtggcgct 13200

ggacatgacc gcgcgcaaca tggaaccggg catgtacgct tcccagcggc cgttcatcaa 13260

ccgcctgatg gactacttgc atcgggcggc ggccgtgaac cccgagtact tcaccaatgc 13320

cattctgaat ccccactgga tgccccctcc gggtttctac aacggggact tcgaggtgcc 13380

tgaggtcaac gatgggttcc tctgggatga catggatgac agtgtgttct cccccaaccc 13440

gctgcgcgcc gcgtctctgc gattgaagga gggctctgac agggaaggac caaggagtct 13500

ggcctcctcc ctggctctgg gggcggtggg cgccacgggc gcggcggcgc ggggcagcag 13560

ccccttcccc agcctggcgg actctctgaa tagcgggcgg gtgagcaggc cccgcttgct 13620

aggcgaggag gagtatctga acaactccct gctgcagccc gtgagggaca aaaacgctca 13680

gcggcagcag tttcccaaca atgggataga gagcctggtg gacaagatgt ccagatggaa 13740

gacgtatgcg caggagtaca aggagtggga ggaccgccag ccgcggcccc tgccgccccc 13800

tagacagcgc tggcagcggc gcgcgtccaa ccgccgctgg aggcaggggc ccgaggacga 13860

tgatgactct gcagatgaca gcagcgtgtt ggacctgggc gggagcggga accccttttc 13920

gcacctgcgc ccacgcctgg gcaagatgtt ttaaaagaga aaaataaaaa ctcaccaagg 13980

ccatggcgac gagcgttggt tttttgttcc cttccttagt atgcggcgcg cggcgatgtt 14040

cgaggagggg cctcccccct cttacgagag cgcgatggga atttctcctg cggcgcccct 14100

gcagcctccc tacgtgcctc ctcggtacct gcaacctaca ggggggagaa atagcatctg 14160

ttactctgag ctgcagcccc tgtacgatac caccagactg tacctggtgg acaacaagtc 14220

cgcggacgtg gcctccctga actaccagaa cgaccacagc gattttttga ccacggtgat 14280

ccaaaacaac gacttcaccc caaccgaggc cagtacccag accataaacc tggacaacag 14340

gtcgaactgg ggcggcgacc tgaagactat cctgcacacc aatatgccca acgtgaacga 14400

gttcatgttc accaactctt ttaaggcgcg ggtgatggtg gcgcgcgagc agggggaggc 14460

gaagtacgag tgggtggact tcacgctgcc cgagggcaac tactcagaga ccatgactct 14520

cgacctgatg aacaatgcga tcgtggaaca ctatctgaaa gtgggcaggc agaacggggt 14580

gaaggagagc gatatcgggg tcaagtttga caccagaaac ttccgtctgg gctgggaccc 14640

tgtgaccggg ctggtcatgc cgggggtcta caccaacgag gcctttcatc ccgatatagt 14700

gctcctgccc ggctgtgggg tggacttcac ccagagccgg ctgagcaacc tgctgggcgt 14760

tcgcaagcgg caacctttcc aggagggttt caagatcacc tatgaggatc tggagggggg 14820

caacattccc gcgctccttg atctggacgc ctacgaggag agcttgaaac ccgaggagag 14880

cgctggcgac agcggcgaga gtggcgagga gcaagccggc ggcggcggca gcgcgtcggt 14940

agaaaacgaa agtactcccg cagtggcggc ggacgctgcg gaggtcgagc cggaggccat 15000

gcagcaggac gcagaggagg gcgcgcagga ggacatgaac aatggggaga tcaggggcga 15060

cactttcgcc acccggggcg aagaaaaaga ggcagaggcg gcggcggcga cggcggaagc 15120

cgaaaccgag gcagaggcag agcccgagac cgaagttatg gaagacatga atgatggaga 15180

acgtaggggt gacacgtttg ccacccgggg cgaagagaag gcggcggagg cagaagccgc 15240

ggctgaggag gcggctgcgg ctgcggccaa ggctgaggct gcggctgagg ctaaggtcga 15300

agccgatgtt gcggttgagg ctcaggctga ggaggaggcg gcggctgaag cagttaagga 15360

aaaggcccag gcagagcagg aagagaaaaa acctgtcatt caacctctaa aagaagatag 15420

caaaaagcgc agttacaacg tcattgaggg cagcaccttt acccaatacc gcagctggta 15480

cctggcttac aactacggcg acccggtcaa gggggtgcgc tcgtggaccc tgctctgcac 15540

gccggacgtc acctgcggct ccgagcagat gtactggtcg ctgccaaaca tgatgcaaga 15600

cccggtgacc ttccgttcca cgcggcaggt tagcaacttt ccggtggtgg gcgccgaact 15660

gctgccagta cactccaaga gtttttacaa cgagcaggcc gtctactccc agctgatccg 15720

ccaggccacc tctctgaccc acgtgttcaa tcgctttccc gagaaccaga ttttggcgcg 15780

cccgccggcc cccaccatca ccaccgtcag tgaaaacgtt cctgccctca cagatcacgg 15840

gacgctaccg ctgcgcaaca gcatctcagg agtccagcga gtgaccatta ctgacgccag 15900

acgccggacc tgcccctacg tttacaaggc cttgggcata gtctcgccgc gcgtcctctc 15960

cagtcgcact ttttaaaaca catccaccca cacgctccaa aatcatgtcc gtactcatct 16020

cgcccagcaa caacaccggc tgggggctgc gcgcacccag caagatgttt ggaggggcaa 16080

ggaagcgctc cgaccagcac cccgtgcgcg tgcgcggcca ctaccgcgcg ccctggggtg 16140

cgcacaagcg cgggcgcaca gggcgcacca ctgtggatga tgtcattgac tccgtagtgg 16200

agcaggcgcg ccactacaca cccggcgcgc cgaccgcctc cgccgtgtcc accgtggacc 16260

aggcgatcga aagcgtggta cagggggcgc ggcactatgc caaccttaaa agtcgccgcc 16320

gccgcgtggc gcgccgccat cgccggagac cccgggctac tgccgccgcg cgccttacca 16380

aggctctgct caagcgcgcc aggcgaactg gccaccgggc cgccatgagg gccgcacggc 16440

gggctgccgc tgccgcgagc gccgtggccc cgcgggcacg aaggcgcgcg gccgctgccg 16500

ccgccgccgc catttccagc ttggcctcga cgcggcgcgg taacatatac tgggtgcgcg 16560

actcggtgag cggcacacgt gtgcccgtgc gctttcgccc cccacggaat tagcacaaga 16620

caacatacac actgagtctc ctgctgttgt gtatcccagc ggcgaccgtc agcagcggcg 16680

acatgtccaa gcgcaaaatt aaagaagaga tgctccaggt catcgcgccg gagatctatg 16740

ggcccccgaa gaaggaggag gaggattaca agccccgcaa gctaaagcgg gtcaaaaaga 16800

aaaagaaaga tgatgacgtt gacgaggcgg tggagtttgt ccgccgcatg gcgcccaggc 16860

gccctgtgca gtggaagggt cggcgcgtgc agcgagtcct gcgccccggc accgcggtgg 16920

tctttacgcc cggcgagcgt tccacgcgca ctttcaagcg ggtgtacgat gaggtgtacg 16980

gcgacgagga tctgttggag caggccaacc atcgatttgg ggagtttgca tatgggaaac 17040

ggcctcgcga gagtctaaaa gaggacctgc tggcgctacc gctggacgag ggcaatccca 17100

ccccgagtct gaagccggtg accctgcaac aggtgctgcc tttgagcgcg cccagcgagc 17160

agaagcgagg gttaaagcgc gagggcgggg acctggcacc caccgtgcag ttgatggtgc 17220

ccaagcggca gaagctggag gacgtgctgg agaaaatgaa agtagagccc gggatccagc 17280

ccgagatcaa ggtccgccct atcaagcagg tggcgcccgg cgtgggagtc cagaccgtgg 17340

acgttaggat tcccacggag gagatggaaa cccaaaccgc cactccctct tcggcagcaa 17400

gcgccaccac cggcgccgct tcggtagagg tgcagacgga cccctggcta cccgccgcca 17460

ctatcgccgt cgccgccgcc ccccgttcgc gcggacgcaa gagaaattat ccagcggcca 17520

gcgcgcttat gccccagtat gcgctgcatc catccatcgc gcccaccccc ggctaccgcg 17580

ggtactcgta ccgcccgcgc agatcagccg gcactcgcgg ccgccgccgc cgtgcgacca 17640

caaccagccg ccgccgtcgc cgccgccgcc agccagtgct gacccccgtg tctgtaagga 17700

aggtggctcg ctcggggagc acgctggtgg tgcccagagc gcgctaccac cccagcatcg 17760

tttaaagccg gtctctgtat ggttcttgca gatatggccc tcacttgtcg ccttcgcttc 17820

ccggtgccgg gataccgagg aagaactcac cgccgcaggg gcatggcggg cagcggtctc 17880

cgcggcggcc gtcgccatcg ccggcgcgca aagagcaggc gcatgcgcgg cggtgtgttg 17940

cccctgctgg tcccgctact cgccgcggcg atcggcgccg tgcccgggat cgcctccgtg 18000

gccctgcagg cgtcccagaa acattgactc ttgcaacctt gcaagcttgc atttttggag 18060

gaaaaaataa aaaagtctag actctcacgc tcgcttggtc ctgtgactat tttgtagaaa 18120

aaagatggaa gacatcaact ttgcgtcgct ggccccgcgt cacggctcgc gcccgttcat 18180

gggagactgg acagatatcg gcaccagcaa tatgagcggt ggcgccttca gctggggcag 18240

tctgtggagc ggccttaaaa attttggttc caccattaag aactatggca acaaagcgtg 18300

gaacagcagc acgggtcaga tgctgagaga caagttgaaa gagcagaact tccaggagaa 18360

ggtggcgcag ggcctggcct ctggcatcag cggggtggtg gacatagcta accaggccgt 18420

gcagaaaaag ataaacagtc atctggaccc ccgccctcag gtggaggaaa cgcctccagc 18480

catggagacg gtgtctcccg agggcaaagg cgaaaagcgc ccgcggcccg acagggaaga 18540

gaccctggtg tcacacaccg aggagccgcc ctcttacgag gaggcagtca aggccggcct 18600

gcccaccact cgccccatag ctcccatggc caccggtgtg gtgggtcaca ggcaacacac 18660

ccccgcaaca ctagatctgc ccccgccgtc cgagccgact cgccagccaa aggcggtgac 18720

ggtgtccgct ccctccactt ccgccgccaa cagagtgcct ctgcgccgcg ctgcgagcgg 18780

cccccgggcc tcgcgagtca gcggcaactg gcagagcaca ctgaacagca tcgtgggcct 18840

gggagtgagg agtgtgaagc gccgccgttg ctactgaatg agcaagctag ctaacgtgtt 18900

gtatgtgtgt atgcgtccta tgtcgccgcc agaggagctg ttgagccgcc ggcgccgtct 18960

gcactccagc gaatttcaag atggcgaccc catcgatgat gcctcagtgg tcgtacatgc 19020

acatctcggg ccaggacgct tcggagtacc tgagccccgg gctggtgcag ttcgcccgcg 19080

ccacagacac ctacttcaac atgagtaaca agttcaggaa ccccactgtg gcgcccaccc 19140

acgatgtgac cacggaccgg tcgcagcgcc tgacgctgcg gttcatcccc gtggatcggg 19200

aggacaccgc ttactcttac aaggcgcggt tcacgctggc cgtgggcgac aaccgcgtgc 19260

tggacatggc ctccacttac tttgacatcc ggggggtgct ggacaggggc cccactttta 19320

agccctactc gggcactgcc tacaaccccc tggcccccaa gggcgccccc aattcttgtg 19380

agtgggaaca agaggaaaat caggtggtcg ctgcagatga tgaacttgaa gatgaagaag 19440

cgcaagcaca agaggaagcc cctgtgaaaa aaattcatgt atatgctcag gcgcctcttt 19500

ctggcgaaaa gatttccaag gatggtatcc aaataggtac tgaagtcgta ggagatacat 19560

ctaaggacac ttttgcagat aaaacattcc aacccgaacc tcagataggc gagtctcagt 19620

ggaacgaggc tgatgccaca gcagcaggag gtagagtttt gaaaaagact acccctatga 19680

gaccttgcta tggatcctat gccaggccta ccaatgccaa cgggggtcaa ggaattatgg 19740

ttgccaatga acaaggagtg ttggagtcta aagtagaaat gcaatttttc tctaacacca 19800

caacccttaa tgcgcgggat ggaaccggca atcccgaacc aaaggtggtg ttgtacagcg 19860

aagatgtcca cttggaatct cccgatactc atctgtctta caagcccaaa aaggatgatg 19920

ttaatgccaa aatcatgttg ggtcagcaag ccatgcccaa cagacccaac ctcattggat 19980

ttagagataa tttcattggg cttatgtttt acaacagcac cggtaacatg ggagtgctgg 20040

cgggtcaggc ctctcagttg aatgctgtgg tggacttgca ggatagaaac acagaactgt 20100

catatcagct tctgcttgat tcaattgggg atagaaccag atacttctcc atgtggaacc 20160

aggcagtgga tagctatgat ccagatgtca gaattattga aaaccatggg actgaggatg 20220

aactgcccaa ctactgcttc cctttgggcg gcataggagt tactgatact tatcaaggga 20280

taaaaaatac caatggcaat ggtcagtgga ccaaagatga tcagttcgcg gaccgcaacg 20340

aaataggggt gggaaacaac ttcgccatgg agatcaacat ccaggccaac ctttggagaa 20400

acttcctcta tgcaaacgtg gggctctacc tgccagacaa gctcaagtac aaccccacca 20460

acgtggacat ctctgacaac cccaacacct atgactacat gaacaagcgg gtggtggccc 20520

ctggcctggt ggactgcttt gtcaatgtgg gagccaggtg gtccctggac tacatggaca 20580

acgtcaaccc cttcaaccac caccgcaatg cgggtctgcg ctaccgctcc atgatcctgg 20640

gcaacgggcg ctatgtgccc tttcacatcc aggtacccca gaagttcttt gccatcaaga 20700

acctcctgct cctgcccggc tcctacacct acgagtggaa cttcaggaag gatgtgaaca 20760

tggtcctaca gagctctctg ggcaatgacc ttagggtgga tggggccagc atcaagtttg 20820

acagcatcac cctctatgct acatttttcc ccatggccca caacaccgcc tccacgcttg 20880

aggccatgct gagaaacgac accaacgacc agtcctttaa tgactacctc tctggggcca 20940

acatgctcta cccaatccca gccaaggcca ccaacgtgcc catctccatc ccctctcgca 21000

actgggccgc ctttagaggc tgggccttta cccgccttaa gaccaaggag accccctccc 21060

tgggctcggg ttttgatccc tactttgttt actcgggatc catcccctac ctggatggca 21120

ccttctacct caaccacact ttcaagaaga tatccatcat gtatgactcc tccgtcagct 21180

ggccgggcaa cgaccgcttg ctcaccccca atgagttcga ggtcaagcgc gccgtggacg 21240

gcgagggcta caacgtggcc cagtgcaaca tgaccaagga ctggttcctg gtgcagatgc 21300

tggccaacta caacataggc taccagggct tttacatccc agagagctac aaggacagga 21360

tgtactcctt cttcagaaat ttccaaccca tgagccgaca ggtggtggac gagaccaatt 21420

acaaggacta tcaagccatt ggcatcaccc accagcacaa caactcgggt ttcgtgggct 21480

acctggcgcc caccatgcgc gagggtcagg cctaccccgc caacttcccc taccccttga 21540

taggcaagac cgcggtcgac agcgtcaccc agaaaaagtt cctctgcgac cgcaccctct 21600

ggcgcatccc cttctctagc aacttcatgt ccatgggtgc gctcacggac ctgggccaaa 21660

acctgcttta tgccaactct gcccatgcgc tggacatgac ttttgaggtg gaccccatgg 21720

acgagcccac ccttctctat attgtgtttg aagtgttcga cgtggtcaga gtgcaccagc 21780

cgcaccgcgg tgtcatcgag accgtgtacc tgcgtacgcc cttctcagcc ggcaacgcca 21840

ccacctaagg agacagcgcc gccgccgcct gcatgacggg ttccaccgag caagagctca 21900

gggccattgc cagagacctg ggatgcggac cctatttttt gggcacctat gacaaacgct 21960

tcccgggctt tatctcccga gacaagctcg cctgcgccat tgtcaacacg gccgcgcgcg 22020

agaccggggg cgtgcactgg ctggcctttg gctgggaccc gcgctccaaa acttgctacc 22080

tctttgaccc ctttggcttc tccgatcagc gcctcaggca gatttatgag tttgagtacg 22140

aggggctgct gcgccgcagc gcgctcgcct cctcgcccga ccgctgcatc acccttgaga 22200

agtccaccga aaccgtgcag gggccccact cggccgcctg cggtctcttc tgttgcatgt 22260

ttttgcacgc ctttgtgcac tggcctcaga gtcccatgga ttgcaacccc accatgaact 22320

tgctaaaggg agtgcccaac gccatgctcc agagccccca ggtccagccc accctgcgcc 22380

gcaaccagga acagctttac cgcttcctgg agcgccactc cccctacttc cgcagccaca 22440

gcgcgcgcat ccggggggcc acctcttttt gccacttgca agaaaacatg caagacggaa 22500

aatgatgtac agcatgcttt taataaatgt aaagactgtg cactttaatt atacacgggc 22560

tctttctggt tatttattca acaccgccgt cgccatttag aaatcgaaag ggttctgccg 22620

tgcgtcgccg tgcgccacgg gcagagacac gttgcgatac tggaagcggc tcgcccactt 22680

gaactcgggc accaccatgc ggggcagtgg ttcctcgggg aagttctcgc tccacagggt 22740

gcgggtcagc tgcagcgcgc tcaggaggtc gggagccgag atcttgaagt cgcagttggg 22800

gccggaaccc tgcgcgcgcg agttgcggta cacggggttg cagcactgga acaccagcag 22860

ggccggatta ttcacgctgg ccagcaggct ctcgtcgctg atcatgtcgc tgtccagatc 22920

ctccgcgttg ctcagggcga atggggtcat cttgcagacc tgcctgccca ggaaaggcgg 22980

gagcccaggc ttgccgttgc agtcgcagcg caggggcatt agcaggtgcc cacggcccga 23040

ctgcgcctgc gggtacaacg cgcgcatgaa ggcttcgatc tgcctaaaag ccacctgggt 23100

cttggctccc tccgaaaaga acatcccaca ggacttgctg gagaactggt tcgcgggaca 23160

gctggcatcg tgcaggcagc agcgcgcgtc agtgttggca atctgcacca cgttgcgacc 23220

ccaccggttt ttcactatct tggccttgga agcctgctcc tttagcgcgc gctggccgtt 23280

ctcgctggtc acatccatct ctatcacctg ttccttgttg atcatgtttg tcccgtgcag 23340

acactttagg tcgccctccg tctgggtgca gcggtgctcc cacagcgcgc aaccggtggg 23400

ctcccaattc ttgtgggtca cccccgcgta ggcctgcagg taggcctgca ggaagcgccc 23460

catcatggtc ataaaggtct tctggctcgt aaaggtcagc tgcaggccgc gatgctcttc 23520

gttcagccag gtcttgcaga tggcggccag cgcctcggtc tgctcgggca gcatcttaaa 23580

atttgtcttc aggtcgttat ccacgtggta cttgtccatc atggcacgcg ccgcctccat 23640

gcccttctcc caggcggaca ccatgggcag gcttaggggg tttatcactt ccagcggcga 23700

ggacaccgta ctttcgattt cttcttcctc cccctcttcc cggcgcgcgc ccccgctgtt 23760

gcgcgctctt accgcctgca ccaaggggtc gtcttcaggc aagcgccgca ccgagcgctt 23820

gccgcccttg acctgcttga tcagtaccgg cgggttgctg aagcccacca tggtcagcgc 23880

cgcctgctct tcttcgtctt cgctgtctac cactatttct ggggaggggc ttctccgctc 23940

tgcggcaaag gcggcggatc gcttcttttt tttcttggga gccgccgcga tggagtccgc 24000

cacggcgacc gaggtcgagg gcgtggggct gggggtgcgc ggtaccaggg cctcgtcgcc 24060

ctcggactct tcctctgact ccaggcggcg gcggagtcgc ttctttgggg gcgcgcgcgt 24120

cagcggcggc ggagacgggg acggggacgg ggacgggacg ccctccacag ggggtggtct 24180

tcgcgcagac ccgcggccgc gctcgggggt cttctcgcgc tggtcttggt cccgactggc 24240

cattgtatcc tcctcctcct aggcagagag acataaggag tctatcatgc aagtcgagaa 24300

ggaggagagc ttaaccaccc cctcagagac cgccgatgcg cccgccgtcg ccgtcgcccc 24360

cgctaccgcc gacgcgcccg ccacaccgag cgacaccccc acggaccccc ccgccgacgc 24420

acccctgttc gaggaagcgg ccgtggagca ggacccgggc tttgtctcgg cagaggagga 24480

tttgcaagag gaggagaata aggaggagaa gccctcagtg ccaaaagatc ataaagagca 24540

agacgagcac gacgcagacg cacaccaggg tgaagtcggg cggggggacg gagggcatgg 24600

cggcgccgac tacctagacg aaggaaacga cgtgctcttg aagcacctgc atcgtcagtg 24660

cgccatcgtc tgcgacgctc tgcaggagcg cagcgaggtg cccctcagcg tggcggaggt 24720

cagccgcgcc tacgagctca gcctcttttc cccccgggtg cccccccgcc gccgcgaaaa 24780

cggcacatgc gagcccaacc cgcgcctcaa cttctacccc gcctttgtgg tgcccgaggt 24840

cctggccacc tatcacatct tctttcaaaa ttgcaagatc cccatctcgt gccgcgccaa 24900

ccgtagccgc gccgataaga tgctggccct gcgccagggc gaccacatac ctgatatcgc 24960

cgctttggaa gatgtgccaa agatcttcga gggtctgggg cgcaacgaga agcgggcagc 25020

aaactctctg caacaggaaa acagcgaaaa tgagagtcac actggagcgc tggtggagct 25080

ggagggcgac aacgcccgcc tggcggtgct caagcgcagc atcgaggtca cccactttgc 25140

ctaccccgcg ctcaacctgc cccccaaagt catgaacgcg gtcatggacg ggctgatcat 25200

gcgccgcggc cggcccctcg ctccagatgc aaacttgcat gaggagaccg aggacggtca 25260

gcccgtggtc agcgacgagc agctgacgcg ctggctggag agcgcggacc ccgccgaact 25320

ggaggagcgg cgcaagatga tgatggccgc ggtgctggtc accgtagagc tggagtgtct 25380

gcagcgcttc ttcggtgacc ccgagatgca gagaaaggtc gaggagaccc tacactacac 25440

cttccgccag ggctacgtgc gccaggcttg caagatctcc aacgtggagc tcagcaacct 25500

ggtgtcctac ctgggcatct tgcatgaaaa ccgccttggg cagagcgtgc tacactccac 25560

cctgcgcggg gaggcgcgcc gcgactacgt gcgcgactgc gtttacctct tcctctgcta 25620

cacctggcag acggccatgg gggtctggca gcagtgcctg gaggagcgca acctcaagga 25680

gctggagaag cttctgcagc gcgcgctcaa agacctctgg acgggcttca acgagcgctc 25740

ggtggccgcc gcgctagccg acctcatctt ccccgagcgc ctgctcaaaa ccctccagca 25800

ggggctgccc gacttcacca gccaaagcat gttgcaaaat tttaggaact ttatcctgga 25860

gcgttctggc atcctacccg ccacctgctg cgccctgccc agcgactttg tccccctcgt 25920

gtaccgcgag tgccccccgc cgctgtgggg ccactgctac ctgttccaac tggccaacta 25980

cctgtcctac cacgcggacc tcatggagga ctccagcggc gaggggctca tggagtgcca 26040

ctgccgctgc aacctctgca cgccccaccg ctccctggtc tgcaacaccc aactgctcag 26100

cgagagtcag attatcggta ccttcgagct acagggtccg tcctcctcag acgagaagtc 26160

cgcggctccg gggctaaaac tcactccggg gctgtggact tccgcctacc tgcgcaaatt 26220

tgtacctgaa gactaccacg cccacgaaat caggttttac gaggaccaat cccgcccgcc 26280

caaggcggag ctgaccgcct gcgtcatcac ccagggcgag atcctaggcc aattgcaagc 26340

catccaaaaa gcccgccaag agtttttgct gaagaggggt cggggggtgt atctggaccc 26400

ccagtcgggt gaggagctca acccggttcc cccgctgcca ccgccgcggg accttgcttc 26460

ccaggataag catcgccatg gctcccagaa agaagcagca gcggccgccg ctgccgccgc 26520

cccacatgct ggaggaagag gaggaatact gggacagtca ggcagaggag gtttcggacg 26580

aggaggagcc ggagacggag atggaagagt gggaggagga cagcttagac gaggaggctt 26640

ccgaagccga agaggcaggc gcaacaccgt caccctcggc cgcagccccc tcgcaggcgc 26700

ccccgaagtc cgctcccagc atcagcagca acagcagcgc tataacctcc gctcctccac 26760

cgccgcgacc cacggccgac cgcagaccca accgtagatg ggacaccacc ggaaccgggg 26820

ccggtaagtc ctccgggaga ggcaagcaag cgcagcgcca aggctaccgc tcgtggcgcg 26880

ctcacaagaa cgccatagtc gcttgcttgc aagactgcgg ggggaacatc tccttcgccc 26940

gccgcttcct gctcttccac cacggtgtgg ccttcccccg taacgtcctg cattactacc 27000

gtcatctcta cagcccctac tgcggcggca gtgagccaga ggcggccagc ggcggcggcg 27060

cccgtttcgg tgcctaggaa gacccagggc aagacttcag ccaagaaact cgcggcgacc 27120

gcggcgaacg cggtcgcggg ggccctgcgc ctgacggtga acgaacccct gtcgacccgc 27180

gaactgagga accgaatctt ccccactctc tatgccatct tccagcagag cagagggcag 27240

gatcaggaac tgaaagtaaa aaacaggtct ctgcgctccc tcacccgcag ctgtctgtat 27300

cacaagagcg aagaccagct tcggcgcacg ctggaggacg ctgaggcact cttcagcaaa 27360

tactgcgcgc tcactcttaa ggactagctc cgcgcccttc tcgaatttag gcgggaacgc 27420

ctacgtcatc gcagcgccgc cgtcatgagc aaggacattc ccacgccata catgtggagc 27480

tatcagccgc agatgggact cgcggcgggc gcctcccaag actactccac ccgcatgaac 27540

tggctcagtg ccggcccaca catgatctca caggttaatg acatccgcac ccatcgaaac 27600

caaatattgg tgaagcaggc ggcaattacc accacgcccc gcaataatcc caaccccagg 27660

gagtggcccg cgtccctggt gtatcaggaa attcccggcc ccaccaccgt actacttccg 27720

cgtgattccc aggccgaagt ccaaatgact aactcagggg cacagctcgc gggcggctgt 27780

cgtcacaggg tgcggcctcc tcgccagggt ataactcacc tggagatccg aggcagaggt 27840

attcagctca acgacgagtc ggtgagctcc tcgctcggtc tcagacctga cgggaccttc 27900

cagatagccg gagccggccg atcttccttc acgccccgcc aggcgtacct gactctgcag 27960

agctcgtcct cggcgccgcg ctcgggcggc atcgggactc tccagttcgt gcaggagttt 28020

gtgccctcgg tctacttcaa ccccttctcg ggctctcccg gtcgctaccc ggaccagttt 28080

atcccgaact ttgacgccgc gagggactcg gtggacggct acgactgaat gtcgggtgga 28140

cccggtgcag agcaacttcg cctgaagcac cttgaccact gccgccgccc tcagtgcttt 28200

gcccgctgtc agaccggtga gttccagtac ttttccctgc ccgactcgca cccggacggc 28260

ccggcgcacg gggtgcgctt tttcatcccg agtcaggtcc gctctaccct aatcagggag 28320

ttcaccgccc gtcccctact ggcggagttg gaaaaggggc cttctatcct aaccattgcc 28380

tgcatttgct ctaaccctgg attacaccaa gatctttgct gtcatttgtg tgctgagtat 28440

aataaaggct gagatcagaa tctactcggg ctcctgtcgc catcctgtca acgccaccgt 28500

ccaagcccgg cccgatcagc ccgaggtgaa cctcacctgt ggtctgcacc ggcgcctgag 28560

gaaataccta gcttggtact acaacagcac tccctttgtg gtttacaaca gctttgacca 28620

ggacggggtc tcactgaggg ataacctctc gaacctgagc tactccatca ggaagaacaa 28680

caccctcgag ctacttcctc cttacctgcc cgggacttac cagtgtgtca ccggcccctg 28740

cacccacacc cacctgttga tcgtaaacga ctctcttccg agaacagacc tcaataactc 28800

ctctccgcag ttccccagaa caggaggtga gctcaggaaa ccccgggtaa agaagggtgg 28860

acaagagtta acacttgtgg ggtttctggt atatgtgacg ctggtggtgg ctcttttgat 28920

taaggctttt ccttccatgt ctgaactatc cctcttcttt tatgaacaac tcgactagtg 28980

ctaacgggac cctacccaac gaatcgggat tgaatatcgg taaccaggtt gcagtttcac 29040

ttttgattac cttcatagtc ctcttcctgc tagtgctgtc gcttctgtgc ctgcggatcg 29100

ggggctgctg catccacgtt tatatctggt gctggctgtt tagaaggttc ggagaccacc 29160

gcaggtagaa taatgctgct taccctcttt gtcctggcgc tggctgccag ctgccaagcc 29220

ttttccgagg ctgacttcat agagccccag tgcaatatca cttataaatc tgaacgtgcc 29280

atctgtacta ttctaatcaa atgtgttact caacacgata aggtgactgt taaatacaaa 29340

gatcaattaa aaaaagacgc actttacagc agctggcaac caggagatga tcaaaaatac 29400

aatgtaaccg tcttccaggg caaactctcc aaaacttaca attacaattt cccatttgag 29460

cagatgtgtg actttgtcat gtacatggaa aagcagtaca agctgtggcc tccaactccc 29520

cagggctgtg tggaaaatcc aggctctttc tgtatgatct ctctctgtgt aactgtgctg 29580

gcactaatac tcacgcttct gtatctcaga tttaaatcaa ggcaaagctt cattgatgaa 29640

aagaaaatgc cataatcgct caacgcttga ttgctaacac cgggttttta tccgcagaat 29700

gattggaatc accctactaa tcacctccct ccttgcgatt gcccatgggt tggaacgaat 29760

cgaagtccct gtgggggcca atgttaccct ggtggggcct gtcggcaatg ctacattaat 29820

gtgggaaaaa tatactaaaa atcaatgggt ttcttactgc actaacaaaa acagccacaa 29880

gcccagagcc atctgcgatg ggcaaaatct aaccttgatt gatgttcaat tgctggatgc 29940

gggctactat tatgggcagc tgggtacaat gattaattac tggagacccc acagagatta 30000

catgcttcac gtagtaaagg gtcccattag cagcccaacc accacctcta ccacacccac 30060

taccaccact actcccacca ccagcactgc cgcccagcct cctcatagca gaacaaccac 30120

ttttatcaat tccaagtccc actcccccca cattgccggc gggccctccg cctcagactc 30180

cgagaccacc gagatctgct tctgcaaatg ctctgacgcc attgcccagg atttggaaga 30240

tcacgaggaa gatgagcatg actacgcaga tgcatgccag gcatcagagg cagaagcgct 30300

accggtggcc ctaaaacagt atgcagactc ccacaccacc cccaaccttc ctccaccttc 30360

ccagaagcca agtttcctgg gggaaaatga aactctgcct ctttccatac tagctctgac 30420

atctgttgct attttggccg ctctgctggt gcttctatgc tctatatgct acctgatctg 30480

ctgcagaaag aaaaaatctc acggccatgc tcaccagccc ctcatgcact tcccttaccc 30540

tccagagctg ggcgaccaca aactttaagt ctgcagtagc tatctgccca tcccttgtca 30600

gtcgacagcg atgagcccca ctaatctaac agcctctgga cttacaacat tgtctcttaa 30660

tgagaccacc gctcctcaag acctgtacga tggtgtctcc gcgctggtta accagtggga 30720

tcacctgggc atatggtggc tcctcatagg agcagtgacc ctgtgcctaa tcctggtctg 30780

gatcatctgc tgcatcaaaa gcagaagacc caggcggcgg cccatctaca ggcccttcgt 30840

catcacacct gaagataatg atgatgatga caccacctcc aggctgcaga gcctaaagca 30900

gctactcttc tcttttacag catggtaaat tgaatcatgc cccgcatttt catctacttg 30960

cttctccttc cactttttct gggctcctct acattggcca ctgtgtccca catcgaggta 31020

gactgcctca cgcccttcac agtctacctg cttttcggct ttgtcatctg cacctttgtc 31080

tgcagcgtta tcactgtagt gatctgcttc atacagtgca tcgactacat ctgtgtgcgg 31140

gtggcctact ttagacacca cccccagtat cgcaacaggg acatagcggc tctcctaaga 31200

cttgtttaaa tcatggccaa attacctgtg attggtcttc tgattatctg ctgcgtccta 31260

gccgcgattg ggactcaacc taataccacc accagcgctc ccagaaagag acatgtatcc 31320

tgcagcttca agcgtccctg gaatataccc caatgcttta ctgatgaacc tgaaatctct 31380

ttggcttggt acttcagcgt caccgccctt ctcatcttct gcagtacggt tattgctctt 31440

gccatctacc cttcccttaa cctgggctgg aatgctgtca actctatgga atatcccacc 31500

ttcccagaac cagacctgcc agacctggtt gttctaaacg cgtttcctcc tcctccagtt 31560

caaaatcagt ttcgccctcc gtcccctacg cccactgagg tcagctactt taatctaaca 31620

ggcggagatg actgaaaacc tagacctaga aatggacggt ctctgcagcg agcaacgcac 31680

actagagagg cgccggcaaa aagcagagct cgagcgtctt aaacaagagc tccaagacgc 31740

cgtggccata caccagtgca aaaaagggct cttctgtctg gtaaaacagg ccacgctcac 31800

ctatgaaaaa acaggtgaca cccaccgcct aggatacaag ctgcccacac agcgccaaaa 31860

gtttgccctt atgataggtg aacaacccat caccgtcacc cagcactccg tggagacaga 31920

aggctgcatt catgctccct gcaggggcgc tgactgcctc tacaccttga tcaaaaccct 31980

ctgcggtctc agagacctta tccctttcaa ttgatcataa ctgtaatcaa taaaaaatca 32040

cttacttgaa atctgatagc aagactctgt ccaatttttt cagcaacact tccttcccct 32100

cctcccaact ctggtactct aggcgcctcc tagctgcaaa cttcctccac agtctgaagg 32160

gaatgtcaga ttcctcctcc tgtccctccg cacccacgat cttcatgttg ttacagatga 32220

aacgcgcgag atcgtctgac gagaccttca accccgtgta cccctacgat accgagatcg 32280

ctccgacttc tgtccctttc cttacccctc cctttgtatc atccgcagga atgcaagaaa 32340

atccagctgg ggtgctgtcc ctgcacctgt cagagcccct taccacccac aatggggccc 32400

tgactctaaa aatggggggc ggcctgaccc tggacaagga agggaatctc acttcccaaa 32460

acatcaccag tgtcgatccc cctctcaaaa aaagcaagaa caacatcagc cttcagaccg 32520

ccgcacccct cgccgtcagc tccggggccc taaccctttt tgccactccc cccctagcgg 32580

tcagtggcga caaccttact gtgcagtctc aggcccctct tactttggaa gactcaaaac 32640

taactctggc caccaaagga cccctaactg tgtccgaagg caaacttgtc ctagaaacag 32700

agcctcccct gcatgcaagt gacagcagta gcctgggcct tagcgtcacg gccccactta 32760

gcattaacaa tgacagccta ggactagaca tgcaagcgcc catcagctct cgagatggaa 32820

aactggctct aacagtggcg gcccccctaa ctgtggccga gggtatcaat gctttggcag 32880

tagccacagg taatggtatt ggactaaatg aaaccaacac acacctgcag gcaaaactgg 32940

tcgcgcccct aggctttgat accaacggca acattaagct aagcgtcgca ggaggcatga 33000

ggctaaacaa taacacactg atactagatg taaactaccc atttgaggct caaggccaac 33060

tgagcctaag agtgggctcg ggcccactat atgtagattc tagtagtcat aacctaacca 33120

ttagatgcct taggggattg tatgtaacat cttctaacaa ccaaaacggt ctagaggcca 33180

acattaaact aacaaaaggc cttgtgtatg acggaaatgc catagcagtt aatgttggca 33240

aagggctgga atacagccct actggcacaa cagaaaaacc tatacagact aaaataggtc 33300

taggcatgga gtatgacact gagggagcca tgatgacaaa actaggctct ggactaagct 33360

ttgacaattc aggagccatt gtggtgggaa acaaaaatga tgacaggctt actttgtgga 33420

ccacaccgga cccatcgccc aactgtcaga tttactctga aaaagatgct aaactaacct 33480

tggtactgac taaatgtggc agtcaggttg taggcacagt atctattgcc gctcttaaag 33540

gtagccttgt gccaatcact agtgcaatca gtgtggttca gatataccta aggtttgatg 33600

aaaatggggt gctgatgagt aactcttcac ttaatggcga atactggaat tttagaaacg 33660

gagactcaac taatggcaca ccatatacaa acgcagtggg ttttatgcct aatctactgg 33720

cctatcctaa aggtcaaact acaactgcaa aaagtaacat tgtcagccag gtctacatga 33780

acggggacga tactaaaccc atgacattta caatcaactt caatggcctt agtgaaacag 33840

gggatacccc tgtcagtaaa tattccatga cattctcatg gaggtggcca aatggaagct 33900

acatagggca caattttgta acaaactcct ttactttctc ctacatcgcc caagaataaa 33960

gaaagcacag agatgcttgt ttttgatttc aaaattgtgt gcttttattt attttcaagc 34020

ttacagtatt tccagtagtc attagaatag agcttaatta aactgcatga gaacccttcc 34080

acatagctta aattatcacc agtgcaaatg gaaaaaaatc aacatacctt tttatccaga 34140

tatcaaagaa ctctagtggt cagttttccc ccaccctccc agctcacaga atacacagtc 34200

ctttcccccc ggctggcttt aaacaacact atctcattgg taacagacat atttttaggt 34260

gtaataatcc acacggtctc ttggcgggcc aaacgctggt ctgtgatgtt aataaactcc 34320

ccaggcagct ctttcaagtt cacgtcgctg tccaactgct gaagcgctcg cggctccgac 34380

tgcgcctcta gcggaggcaa cggcagcacc cgatccttga tctataaagg agtagagtca 34440

taatccccca taagaatagg gcggtgatgc agcaacaagg cgcgcagcaa ctcctgccgc 34500

cgcctctccg tacgacagga atgcaacggg gtggtggtct cctccgcgat aatccgcacc 34560

gctcgcagca tcagcatcct cgtcctccgg gcacagcagc gcatcctgat ctcactgaga 34620

tcggcgcagt aagtgcagca caacaccaag atgttattta agatcccaca gtgcaaagca 34680

ctgtacccaa agctcatggc gggaaggaca gcccccacgt gaccatcgta ccagatcctc 34740

aggtaaatca aatgacgacc tctcataaac acgctggaca tatacatcac ctccttgggc 34800

atgagctgat tcaccacctc tcgataccac aggcatcgct gattaattaa agacccctcg 34860

agcaccatcc tgaaccagga agccagcacc tgaccccccg ccaggcactg cagggacccc 34920

ggtgaatcgc agtggcagtg aagactccag cgctcgtagc cgtgaaccat agagctggtc 34980

attatatcca cattggcaca acacagacac actttcatac actttttcat gattagcagc 35040

tcctctctag tcaagaccat atcccaagga atcacccact cttgaatcaa ggtaaatccc 35100

acacagcagg gcaggcctct cacataactc acgttatgca tagtgagcgt gtcgcaatct 35160

ggaaataccg gatgatcttc catcaccgaa gcccgggtct ccgtctcaaa gggaggtaaa 35220

cggtccctcg tgtagggaca gtggcgggat aatcgagatc gtgttgaacg tagagtcatg 35280

ccaaagggaa cagcggacgt actcatattt cctccagcag aaccaagtgc gcgcgtggca 35340

gctatccctg cgtcttctgt ctcgccgcct gccccgctcg gtgtagtagt tgtaatacag 35400

ccactccctc agaccgtcaa ggcgctccct ggcgtccgga tctataacaa caccgtcctg 35460

cagcgccgcc ctgatgacat ccaccaccgt agagtatgcc aagcccagcc acgaaatgca 35520

ctcactttga cagcgagaga taggaggagc gggaagagat ggaagaacca tgatagtaaa 35580

agaactttta ttccaatcga tcctctacaa tgtcaaagtg tagatctatc agatggcact 35640

ggtctcctcc gctgagtcga tcaaaaataa cagctaaacc acaaacaaca cgattggtca 35700

aatgctgcac aagggcttgc agcataaaat cgcctcgaaa gtccaccgca agcataacat 35760

caaagccacc gcccctatca tgatctatga taaaaacccc acagctatcc accagaccca 35820

tatagttttc atctctccat cgtgaaaaaa tatttacaag ctcctccttt aaatcacctc 35880

caaccaattc aaaaagttga gccagaccgc cctccacctt cattttcagc atgcgcatca 35940

tgattgcaaa aattcaggct cctcagacac ctgtataaga ttgagaagcg gaacgttaac 36000

atcaatgttt cgctcgcgaa gatcgcgcct cagtgcaagc atgatataat cccacaggtc 36060

ggagcggatc agcgaggaca tctccccgcc aggaaccaac tcaacggagc ctatgctgat 36120

tataatacgc atattcgggg ctatgctaac cagcacggcc cccaaatagg cgtactgcat 36180

aggcggcgac aaaaagtgaa cagtttgggt taaaaaatca ggcaaacact cgcgcaaaaa 36240

agcaagaaca tcataaccat gctcatgcaa atagatgcaa gtaagctcag gaacgaccac 36300

agaaaaatgc acaatttttc tctcaaacat gactgcgagc cctgcaaaaa ataaaaaaga 36360

aacattacac aagagtagcc tgtcttacaa tgggatagac tactctaacc aacataagac 36420

gggccacgac atcgcccgcg tggccataaa aaaaattatc cgtgtgatta aaaagaagca 36480

cagatagctg gccagtcata tccggagtca tcacgtgcga acccgtgtag acccccgggt 36540

tggacacatc ggccaaacaa agaaagcggc caatgtatcc cggaggaatg ataacactaa 36600

gacgaagata caacagaata accccatggg ggggaataac aaagttagta ggtgaataaa 36660

aacgataaac acccgaaact ccctcctgcg taggcaaaat agcgccctcc ccttccaaaa 36720

caacatacag cgcttccaca gcagccatga caaaagactc aaaacactca aaagactcag 36780

tcttaccagg aaaataaaag cactctcaca gcaccagcac taatcagagt gtgaagaggg 36840

ccaagtgccg aacgagtata tataggaatt aaaaatgacg taaatgtgta aaggtcaaaa 36900

aacgcccaga aaaatacaca gaccaacgcc cgaaacgaaa acccgcgaaa aaatacccag 36960

aagttcctca acaaccgcca cttccgcttt cccacgatac gtcacttcct caaaaatagc 37020

aaactacatt tcccacatgt acaaaaccaa aacccctccc cttgtcaccg cccacaactt 37080

acataatcac aaacgtcaaa gcctacgtca cccgccccgc ctcgccccgc ccacctcatt 37140

atcatattgg cctcaatcca aaataaggta tattattgat gatg 37184

<210> 2

<211> 37184

<212> ДНК

<213> Аденовирус человекообразных обезьян

<400> 2