Аттенуированный штамм "asfv/cv60/2020" вируса африканской чумы свиней семейства asfarviridae, рода asfivirus для изучения иммунологических реакций, молекулярно-генетического анализа, генетической модификации и создания прототипа вакцины против ачс

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм вируса африканской чумы свиней «ASFV/CV60/2020». Охарактеризованный штамм получен путем глубокой адаптации последовательным пассированием вируса в перевиваемой культуре клеток почки африканской зеленой мартышки (CV-1) и депонирован в коллекции штаммом микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером 334-деп/20-122. Представленный штамм обладает умеренной инфекционной активностью, накапливается в культуре клеток костного мозга и CV-1. Вирулентность для свиней всех возрастных групп при внутримышечном введении не превышает 12,5%. Представленный штамм вируса может быть использован для изучения факторов иммунитета у свиней при создании прототипа вакцины против африканской чумы свиней. 3 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности, к штаммам вируса африканской чумы свиней (АЧС) и может быть использовано в научно-исследовательских институтах и лабораториях в качестве штамма для изучения иммунологических реакций, молекулярно-генетического анализа, генетической модификации вируса, а также для изготовления антигенсодержащих биопрепаратов и создания прототипа вакцины против АЧС.

АЧС - вирусная болезнь свиней, характеризующаяся лихорадкой, отказом от корма, лимфаденитами и обширными геморрагиями во внутренних органах инфицированных животных. Для АЧС характерно многообразие форм течения болезни: от сверхострой и острой со 100% летальностью до хронической. В настоящее время с учетом степени интенсивности течения эпизоотического процесса и масштабов географического распространения можно говорить о развитии панзоотии АЧС [1].

В 2014-2020 гг. панзоотия АЧС охватила многие страны Африканского континента, Европы, в том числе, Украина, Беларусь, Россия, а также страны Азии (Китай, Корея, Индия, Вьетнам, Лаос и т.п.) и Океании. Кроме того, прослеживается тенденция к дальнейшему распространению болезни в мире.

Трудности глобальной эрадикации АЧС связаны с отсутствием средств специфической профилактики и лечения, а также сложностью контроля за ее распространением в свиноводческих хозяйствах с низким уровнем биологической безопасности и в популяции дикого кабана.

В настоящее время для научных исследований, проводимых с целью изучения вирулентных свойств, генотиповой и серотиповой принадлежности выделенных изолятов в качестве референс-штаммов II генотипа, VIII серотипа наиболее часто используют два штамма: Georgia 2007/01 и Arm07, положившие начало развитию текущей панзоотии на Евразийском континенте.

Аттенуированные штаммы, как наиболее безопасные, могут быть использованы при получении гипериммунных сывороток и антигенов для постановки ИФА и иммуноблоттинга, для определения сероиммунотипа вновь выделяемых природных вариантов вируса АЧС в реакции задержки гемадсорбции (РЗГАд), а также в качестве источника референс-ДНК при апробации новых тест-систем на основе ПЦР, и для разработки средств специфической профилактики.

Однако, попытки использования разработанных по классическим канонам вариантов вакцин против этой особо опасной болезни свиней в 60-х годах прошлого века не только не способствовали улучшению эпизоотической ситуации с АЧС, но и усугубили ее [2].

В настоящий момент различные мировые научные группы проводят исследования по разработке вакцины против АЧС. За основу для разработки вакцины используют, как высоковирулентные варианты вируса АЧС, так и его природно- или лабораторно-аттенуированные варианты [3, 4, 5].

По мнению Lacasta et al., живые аттенуированные вирусы АЧС -идеальные инструменты для анализа механизмов, участвующих в вирусном патогенезе и иммунной защите [6].

Вследствие формирования эндемичных по АЧС зон на территории Российской Федерации остро стоит вопрос о наличии банка российских изолятов, анализ которых позволит не только выяснить природу вирулентности вируса, но и разработать научно-обоснованную платформу для разработки эффективной вакцины против АЧС.

На данный момент известен ряд отечественных и зарубежных штаммов вируса АЧС, используемых для изготовления антигенсодержащих биопрепаратов [7, 8, 9].

Аттенуированный штамм КК-262/С I генотипа, II серотипа использовался для разработки вакцинных препаратов. Он обладает способностью к репродукции в первичных культурах клеток костного мозга свиней (KMC), а его введение свиньям индуцирует формирование протективного иммунного ответа к заражению гомологичным вирулентным вирусом I генотипа II серотипа [9, 10].

История патентования в нашей стране циркулирующих штаммов вируса АЧС II генотипа VIII серотипа начинается с 2010 года, когда впервые был зарегистрирован патент на российский штамм Ставрополь 01/08 [11]. Это высоковирулентный вирус, способный репродуцироваться только в первичной культуре KMC, альвеолярных макрофагов (АМС) или лейкоцитов свиньи (ЛС).

В дальнейшем вирус штамма Ставрополь 01/08 был адаптирован к росту в перевиваемой культуре клеток А₄С₂ (гибрид СПЭВ и спленоцитов свиньи - Sus scrofa L) и CV - 1 (почка африканской зеленой мартышки - Cercopithecus aethiops) [12]. Однако, полученный аттенуированный штамм Ставрополь 01/08 не защищал животных от заражения вирулентным вирусом, т.к. утратил часть свойств, необходимых для формирования протективного иммунного ответа при АЧС.

Известен штамм Волгоград/14с, применяемый для разработки диагностических препаратов и проведения вирусологических, молекулярно-генетических исследований [13], который получен из вирулентного российского изолята Волгоград/14с, принадлежащего к VIII серотипу. Хотя рекомбинантный вирус Волгоград/14с после удаления гена A238L утратил патогенность исходного вируса, он не обладает протективными свойствами и не защищает от контрольного заражения вирулентным вирусом VIII серотипа [14]. Следовательно, этот штамм не может быть использован для изучения протективных свойств и разработки защитных препаратов.

Наиболее близким аналогом (прототипом) предлагаемого штамма, обладающего протективными свойствами и способностью репродуцироваться в гетерологичной перевиваемой культуре клеток, является адаптированный к росту в Vero (почка африканской зеленой мартышки - Cercopithecus aethiops) аттенуированный штамм BA71V, I генотипа IV серотипа [15], испытания которого доказали возможность достижения защиты от заражения как гомологичным (одного генотипа), так и гетерологичным изолятами (разных генотипов). Кроме того, сравнительный анализ генома вирулентных и аттенуированных штаммов позволил определить группы генов, обуславливающих вирулентность вируса АЧС [16]. Однако он принадлежит к I генотипу и IV серотипу, поэтому применение его в дальнейшем в качестве компонента диагностических систем является нецелесообразным.

Несмотря на предпринимаемые меры борьбы, ареал распространения АЧС в мире продолжает расширяться. В связи с этим необходимость проведения сравнительного геномного анализа вирулентных и авирулентных вариантов и изучения иммуногенеза болезни с дальнейшей целью создания вакцины является приоритетным направлением исследований по защите от панзоотии АЧС.

Аттенуированные штаммы вируса АЧС с отличающимися по вирулентности, контагиозности, реактогенности и выраженности клинических признаков свойствами, необходимы, как для определения причин вирулентности вируса АЧС, так и для разработки средств ее специфической профилактики.

Техническая проблема, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала аттенуированных штаммов вируса африканской чумы свиней, которые необходимы для изучения иммунологии этого заболевания, молекулярно-генетического анализа и генетической модификации возбудителя при создании прототипа вакцины, а также для диагностических исследований, получения антигенсодержащих препаратов.

Все вышеизложенные факты указывают на приоритетность задачи по получению нового аттенуированного штамма вируса АЧС, пригодного для детального изучения структуры его генома, анализа функций генов и механизмов формирования иммунного ответа при АЧС у инфицированных животных, а также диагностических исследований и модификации вируса при получении вакцинных препаратов.

Указанная проблема была решена получением аттенуированного штамма вируса АЧС II генотипа VIII серотипа со сниженной вирулентностью, стабильными культурально-биологическими свойствами, обладающего способностью к эффективной репликации в перевиваемой культуре клеток CV-1, предназначенного для изучения особенностей иммуногенеза при АЧС и для разработки диагностических и защитных препаратов. Кроме того, аттенуированный штамм также может быть использован для получения авирулентных клонов вируса, проведения генетических модификаций, как с целью изучения функций отдельных генов, так и для создания прототипа маркированной вакцины на его основе.

Исходным материалом, послужившим источником для получения штамма вируса «ASFV/CV60/2020», являлся адаптированный к росту в перевиваемой культуре клеток CV-1 вирус штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/СV-1» [17]. В свою очередь, штамм «АЧС/ВНИИЗЖ/СV-1» был получен в процессе адаптации к росту в перевиваемой культуре клеток вируса с летальностью 85,7% штамма «АЧС-8 №2/Одинцово 02/14» вируса африканской чумы свиней, выделенный из селезенки отстрелянного на территории Одинцовского района Московской области в 2014 году дикого кабана. Вирус штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» накапливается в культуре клеток костного мозга свиней и CV-1 в титре 6,0-7,0 lg ГАдЕ₅₀/см³, а его летальность для домашних свиней всех возрастных групп не превышает 37,5%.

По сравнению с известными штаммами II генотипа, вирус АЧС штамма «ASFV/CV60/2020» обладает сниженной остаточной летальностью для свиней (12,5%) и эффективно репродуцируется в культуре клеток почки зеленой мартышки CV-1, а титр вируса достигает значений 7,5-8,0 lg ГАдЕ₅₀/см³. Кроме того, вирус АЧС штамма «ASFV/CV60/2020» обладает выраженной иммуногенностью, поскольку при его введении животным большинство клинических признаков АЧС отсутствуют, а выжившие животные приобретают устойчивость к повторному заражению вирулентным вирусом II генотипа VIII серотипа, что дает возможность использовать его для получения специфической гипериммунной сыворотки.

Полученный путем длительной адаптации (60 пассажей) аттенуированный штамм «ASFV/CV60/2020» вируса африканской чумы свиней депонирован в Коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» под авторским названием «ASFV/CV60/2020» с регистрационным номером №334 - деп / 20-122 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Штамм вируса африканской чумы свиней «ASFV/CV60/2020» характеризуется следующими признаками и свойствами:

Морфологические свойства.

Штамм «ASFV/CV60/2020» вируса африканской чумы свиней относится к семейству Asfarviridae, род Asfivirus. Обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя АЧС: при электронно-микроскопическом исследовании наблюдаются вирионы возбудителя икосаэдрической формы с диаметром -200 нм, имеющие нескольких концентрических слоев. Центральный нуклеоид вириона или кор, представленный двухцепочечной молекулой ДНК с плотным слоем белковой оболочки, покрывает внутренняя липидная оболочка, заключенная в капсид. Капсид состоит из 1892-2172 капсомеров и окружен суперкапсидной (наружной) липопротеидной оболочкой.

Антигенные свойства.

В состав зрелых вирионов вируса АЧС входит более 50 белков. Основные антигенные свойства штамма «ASFV/CV60/2020» соответствуют таковым вируса VIII серотипа: вирусспецифические антигены выявляются специфическими антителами в иммуноферментном анализе и иммуноблоттинге; в реакции задержки гемадсорбции и иммунопробе проявляются свойства, характерные для соответствующего серотипа, а в реакции прямой иммунофлуоресценции его антиген взаимодействует со специфическими антителами к вирусу АЧС.

Генотаксономическая характеристика.

С использованием филогенетического анализа на основе нуклеотидного секвенирования фрагмента гена B646L штамм вируса АЧС «ASFV/CV60/2020» отнесен ко II генотипу вируса АЧС (100% гомология с референс-штаммом II генотипа Georgia 2007/01).

Генетическая принадлежность предлагаемого для патентования варианта вируса проиллюстрирована на дендрограмме, отражающей филогенетическое родство штамма «ASFV/CV60/2020» с эпизоотическими штаммами вируса африканской чумы свиней II генотипа (дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей участка гена B646L, кодирующего основной капсидный белок вируса АЧС) (фиг. 2).

Сущность изобретения пояснена на графических изображениях, на которых отображены:

Фиг. 1 - Динамика изменения уровня антител в сыворотке крови четырех групп свиней, инфицированных вирусом аттенуированного штамма «ASFV/CV60/2020» в твердофазном иммуноферментном анализе (ТФ ИФА);

Фиг. 2 - Положение штамма вируса АЧС «ASFV/CV60/2020» на филогенетическом древе семейства Asfarviridae рода Asfivirus;

Фиг. 3 - Специфичность взаимодействия антител к вирусу штамма «ASFV/CV60/2020» с антигеном вируса АЧС разных серотипов (а - блоттограмма белков препарата очищенного цитоплазматического антигена (a1-I серотип, a2-IV серотип) после электрофореза в 10% разделяющем геле; б - реакция непрямой иммунофлуоресценции с вирусом гетерологичного серотипа (б1 - IV серотип, б2 - контроль незараженной культуры клеток). Сероиммунотиповая принадлежность.

Серотип вируса АЧС определен в РЗГАд (реакции задержки гемадсорбции) и в иммунопробе по разработанной во ВНИИВВиМ методике [18, 19].

Серотиповая принадлежность штамма «ASFV/CV60/2020» вируса АЧС была установлена в РЗГАд с использованием специфических сывороток к VIII и IV серотипам.

Первичную культуру клеток (KMC, АМС) выращивали на 96-луночных планшетах в посадочной концентрации 6-7×10⁶/см³. После сорбции клеток неприкрепленные клетки и избыток эритроцитов удаляли, а в лунки вносили 200 мкл ростовой среды и панели инкубировали 48 часов при 37°С и 3-5% СО₂. Реакцию проводили в объеме 250 мкл поддерживающей среды следующего состава:

- 200 мкл среда DMEM,

- 25 мкл вируссодержащей суспензии,

- 25 мкл специфической или контрольной сыворотки.

Учет реакции проводили через 24-72 часа при выраженной гемадсорбции в контрольных образцах.

Установлено, что специфическая сыворотка, полученная на штамм «Arm07» VIII серотипа вируса АЧС, вызывает задержку (отсутствие ГАд) в разведениях 1:20, в то время, как внесение отрицательной сыворотки свиньи и референс-сыворотки IV серотипа, полученной из Референтной лаборатории Европейского Союза «CISA INIA» (Испания), не вызывало задержки появления специфической гемадсорбции. Результаты типирования штамма приведены в таблице 1.

По результатам постановки реакции задержки ГАд с использованием референс-сывороток разных серотипов вируса АЧС, аттенуированный и адаптированный к росту в перевиваемой культуре клеток CV-1 штамм «ASFV/CV60/2020» отнесен к вирусу африканской чумы свиней VIII серотипа (таблица 1).

Сероиммунотиповая принадлежность определялась посредством постановки иммунопробы на свиньях (7 голов), зараженных вирусом штамма «ASFV/CV60/2020», в дозе 10 ГАдЕ/гол. Через 35 дней после заражения всем свиньям вводили 1000 ГАдЕ/гол вирулентного вируса АЧС штамма «Arm07». Животные приобрели устойчивость к повторному заражению вирулентным вирусом АЧС VIII серотипа. Таким образом, иммунопроба подтвердила принадлежность вируса штамма «ASFV/CV60/2020» к VIII серотипу.

Культуральные свойства.

Вирус штамма «ASFV/CV60/2020» размножается в первичных культурах клеток АМС, ЛС, СС (селезенки свиней) и KMC, причем, его репродукция сопровождается появлением «рыхлой» гемадсорбции, когда к одной инфицированной клетке прикреплено не более 20-30 эритроцитов свиней [23]. Титр накопления вируса на 5 сутки достигает значений 7,0-7,5 lg ГАдЕ₅₀/см³.

В культуре клеток почки зеленой мартышки (CV-1) титры накопления вируса составляют 7,5-8,0 lg ГАдЕ₅₀/см³ при репродукции в течение 7 суток при температуре 36-37°С (таблица 2). Установлено, что вирус штамма «ASFV/CV60/2020» сохраняет данные свойства в течение 15 серийных пассажей (срок наблюдения).

Патогенные свойства.

Вирус штамма «ASFV/CV60/2020» слабопатогенен для свиней при внутримышечном введении, у выживших животных наблюдается лишь кратковременное повышение температуры до 41,0°С, а клинические признаки, характерные для АЧС, у большинства животных отсутствуют.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Штамм не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и гетерологичными вирусами.

Способ получения и условия хранения.

Штамм хранится при минус 70°С в виде лиофилизированной вируссодержащей суспензии, которая получена путем культивирования вируса в монослое клеток CV-1 при 37°С в течение 7 суток, с добавлением 10% фетальной сыворотки КРС. Периодичность освежения штамма один раз в 10 лет.

Дополнительные характеристики.

Вирулентность - низковирулентен (12,5%) для естественно восприимчивых животных при внутримышечном заражении.

Антигенная активность - введение вируса аттенуированного штамма «ASFV/CV60/2020» свиньям индуцирует образование вирусспецифических антител, которые выявляются в иммуноферментном анализе, иммуноблоттинге и реакции непрямой иммунофлуоресценции с тест-антигенами вируса I, IV и VIII серотипа (Фиг. 3). На данном изображении представлено:

М - маркер молекулярной массы белка;

ВА I - вирусный антиген I серотипа, выявленный с помощью антител к вирусу «ASFV/CV60/2020»;

ВА IV - вирусный антиген IV серотипа, выявленный с помощью антител к вирусу «ASFV/CV60/2020»;

- стрелкой отмечено специфическое свечение комплекса антигена вируса АЧС IV серотипа с антителами к вирусу «ASFV/CV60/2020», мечеными ФИТЦ.

Иммуногенная активность - контрольное заражение выживших свиней позволило определить, что 100% животных приобрели стойкий протективный иммунитет.

Стабильность - стабильно активен при репродукции в перевиваемой культуре клеток CV-1, сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 15 последовательных пассажей (срок наблюдения).

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1.

Изучение стабильности и репродукционных свойств вируса АЧС аттенуированного штамма «ASFV7CV60/2020» проводили в культуре клеток CV-1 в течение 15 последовательных пассажей. Наличие гемадсорбирующей активности определяли в культуре клеток KMC. Основные характеристики вируса АЧС аттенуированного штамма «ASFV/CV60/2020» в культурах клеток KMC и CV-1 в процессе пассирования представлены в таблице 2.

Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о том, что в течение 15 (с 61 по 75 пассажи) последовательных пассажей вирус аттенуированного штамма «ASFV/CV60/2020» вируса АЧС эффективно размножался в клетках CV-1 и сохранял способность к репродукции в культуре клеток KMC, причем, репродукция вируса в культуре клеток KMC сопровождалась появлением «рыхлой» гемадсорбции в присутствии в питательной среды 0,01% эритроцитов свиньи.

Через 7 суток культивирования в культуре клеток CV-1 при температуре 37,0°С титр накопления вируса составлял 7,5-8,0 lg ГАдЕ₅₀/см³.

Пример 2.

При исследовании структуры популяции и биологических свойств вируса аттенуированного штамма «ASFV/CV60/2020» проведено внутримышечное заражение 8 голов свиней крупной белой породы массой ~15-18 кг вируссодержащей суспензией в дозе 10 ГАдЕ/гол. Такая минимальная доза инфекционного вируса, вводимая животным, позволяет установить четкое различие в биологических свойствах отдельных компонентов вирусной популяции.

Исходя из анализа клинического проявления и уровня виремии у инфицированных животных выявлена неоднозначность клинических проявлений у зараженных животных, в результате на основе экспериментальных данных всех подопытных животных распределили на 4 группы (таблица 3).

Из 8 зараженных животных только у одного наблюдались характерные для подострой формы АЧС клинические признаки с максимальной температурой тела до 41,7°С, а гибель наступила на 17 день после заражения (д.п.з.) (I группа). Титр вируса в крови достигал значений 7,2 lg ГАдЕ₅₀/см³.

У двух свиней (II группа) наблюдались характерные для хронической формы АЧС клинические признаки с максимальной температурой тела до 41,0°С, выражавшиеся в кратковременных подъемах температуры, некротических поражениях кожи, припухлости суставов, титр вируса в крови не превышал 6,25 lg ГАдЕ₅₀/см.

У двух из 8 зараженных свиней (III группа) отсутствовали клинические признаки заболевания африканской чумы свиней, а значения титра вируса в крови держались в границах 2,0-3,8 lg ГАдЕ50/см.

У IV группы свиней (3 головы) не только не регистрировали клинические признаки заболевания, но и не установили наличия виремии ни в ПЦР, ни в РГАд на всем протяжении эксперимента (35 дней) до контрольного заражения вирулентным штаммом.

Полученные результаты свидетельствуют о неоднородности структуры популяции вируса штамма «ASFV/CV60/2020», которая проявилась в неоднозначности вызываемых отдельными вариантами вируса клиническими проявлениями болезни или отсутствием таковых у зараженных животных.

У выживших подопытных свиней отобрали кровь, в сыворотке которой при постановке твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ ИФА), обнаружили вирусспецифические антитела. В результате анализа с использованием набора ТФ ИФА производства фирмы «Ingenaza» определили наличие выявляемых постинфекционных вирусспецифических антител, титр которых на 27 д.п.з. достигал у свиней III и IV группы значений 4,0 log₂/cм³, а у свиней II группы - 7,0 log₂/cм³.

Пример 3.

Изучение особенностей динамики антителообразования у зараженных аттенуированным штаммом «ASFV/CV60/2020» вируса АЧС свиней проводили путем определения титра антител в сыворотке крови, отобранной на 1-32 сутки после заражения у животных I-IV группы (представленных в примере 2).

Уровень антител в крови определяли титрованием сыворотки двукратными разведениями с дальнейшим анализом проб в ТФ ИФА с помощью коммерческого набора Ingenasa-Ingezim РРА Сотрас К3 (Испания).

В результате установлено, что динамика антителообразования различается у всех 4 групп свиней, особенности которой выявляются, как на раннем этапе их появления в крови (7-9 день после заражения - д.п.з.), так и на этапе с 11 по 25 д.п.з. (Фиг. 1), причем уровень антител достиг своего максимума на 28 д.п.з. и оставался неизменным до 35 суток у трех групп животных (срок наблюдения).

Анализ полученных результатов подтвердил различие вызываемых иммунологических проявлений у животных I - IV групп при введении малых доз аттенуированного штамма «ASFV/CV60/2020» вируса АЧС.

Таким образом, полученный аттенуированный штамм «ASFV/CV60/2020» вируса АЧС обладает инфекционной активностью для культуры клеток и свиней в дозе 10 ГАдЕ/гол, летальностью 12,5% и может быть использован при проведении экспериментальных работ по изучению динамики антителообразования и протективных свойств, а также поисковых научно-исследовательских работ.

Пример 4.

Определение основных клинических признаков течения болезни и сравнительный анализ уровня содержания вируса в крови и назальных смывах являются важными характеристиками патогенности/иммуногенности вируса АЧС. Заражение проводили путем внутримышечной инокуляции вирусной суспензии в дозе 10 ГАдЕ₅₀/гол вируса аттенуированного штамма «ASFV/CV60/2020» группе из 7 свиней, а вторая группа из 7 свиней, была заражена вируссодержащим материалом штамма «АЧС-8 №2/Одинцово 02/14» с использованием той же дозы вируса и метода заражения [20]. 2 головы свиньи использовали в качестве контроля, т.е. оставались не зараженными (контрольная группа).

Далее проводили изучение динамики развития клинических признаков болезни, виремии и вирусовыделения при АЧС путем сравнительного анализа температурных показателей и параметров накопления вируса в крови. С этой целью у подопытных животных проводили измерение ректальной температуры и отбирали пробы крови и назальных смывов с интервалом 2 дня в течение всего эксперимента (32 суток).

Определение наличия вирусного генома в назальных смывах и крови проводили методом ПЦР в реальном времени в соответствии с инструкцией к тест-системе "АЧС" для выявления вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва) [21]. Титр вируса в крови определяли в реакции гемадсорбции согласно Методическим рекомендациям по выделению и титрованию вируса африканской чумы свиней, ФГБУ «ВНИИЗЖ» [22].

Для определения количества инфицированных клеток в крови животных применяли метод окрашивания с использованием ФИТЦ-конъюгата анти-АЧС антител к структурному белку р72 (Ingenaza, Испания). После окрашивания пробы анализировали с помощью проточной цитофлуориметрии.

Сравнительный анализ основных характеристик вируса АЧС штаммов «АЧС-8 №2/Одинцово 02/14» и «ASFV/CV60/2020» при постановке биопробы приведен в таблице 4.

Как видно из результатов, приведенных в таблице 4, максимальная ректальная температура у животных, зараженных вирусом штамма «АЧС-8 №2/Одинцово 02/14» достигала 42°С, а длительность течения болезни составила 7-9 дней, в то время как у свиней, инфицированных вирусом аттенуированного штамма «ASFV/CV60/2020», регистрировали незначительную температурную реакцию при отсутствии других признаков заболевания АЧС у большинства животных.

Сравнительный анализ уровней виремии и вирусовыделения в назальных смывах позволил выявить существенные различия в обоих показателях. Так, титр вируса в крови у свиней, инфицированных вирусом аттенуированного штамма «ASFV/CV60/2020», был ниже в 100 и более раз, а в назальных смывах обнаружен не был, в отличие от животных, зараженных вирусом штамма «АЧС-8 №2/Одинцово 02/14».

Таким образом, использование сравнительного анализа биологических свойств различных изолятов и штаммов вируса АЧС с таковыми аттенуированного штамма «ASFV/CV60/2020» с определением основных клинических признаков течения болезни и уровней содержания вируса в крови и назальных смывах позволяет охарактеризовать патогенность и/или иммуногенность вновь выделенных изолятов вируса АЧС.

Пример 5.

Для изучения протективных свойств и иммунного ответа у свиней, инфицированных внутримышечно в дозе 10 ГАдЕ₅₀/гол аттенуированным штаммом «ASFV/CV60/2020» вируса АЧС, проводили их контрольное заражение вирулентным вирусом «Arm07» в дозе 1000 ГАдЕ₅₀/гол. Все 7 животных, переживших заражение вирусом «ASFV/CV60/2020» приобрели 100% защиту к заражению гомологичным вирулентным вирусом «Arm07», при гибели всех не иммунных контрольных животных (2 свиньи - контрольная группа). Установлено, что приобретенный иммунитет полностью предохранял свиней от развития клинических признаков, характерных для АЧС, таких, как лихорадка, отказ от корма, покраснение кожи. При этом у привитых животных обнаруживали непродолжительную виремию (не более 7 дней). Выделение вируса с носовыми экскретами не отмечено.

При посмертном вскрытии через 28 суток после контрольного заражения у всех выживших животных отсутствовали патологоанатомические изменения, характерные для АЧС.

В это же время у контрольных животных отмечали характерные для АЧС клинические признаки и патологоанатомические изменения, а также высокие значения титра вируса (в крови 7,0-7,5 lg ГАдЕ₅₀/см³ и в носовых смывах 2,0-4,5 lg ГАдЕ₅₀/см³), которые обнаруживали, начиная с 3 д.п.з.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Аттенуированный штамм «ASFV760CV/2020» вируса африканской чумы свиней семейства Asfarviridae рода Asfivirus для изучения иммунологических реакций при АЧС, молекулярно-генетического анализа и генетической модификации при создании прототипа вакцины»:

1. The Federal Service for Veterinary and Phytosanitary Supervision [in Russian], [electronic resource]. - Режим доступа: https://fsvps.gov.ru/fsvps/asf

2. Manso Ribeiro, J. sur la vaccination contre la Peste Porcine Africaine la XXXe Session del'Office International des Epizooties / J. Manso Ribeiro // Bull. Off. Intern. Epiz. - 1962. - Vol.58. - P. 1031-1040.

3. Barasona J.A. et al. First oral vaccination of Eurasian wild boar against African swine fever virus genotype II // Frontiers in veterinary science. - 2019. - T. 6.-C. 137.

4. Gallardo C. et al. Attenuated and non-haemadsorbing (non-HAD) genotype II African swine fever virus (ASFV) isolated in Europe, Latvia 2017 // Transboundary and emerging diseases. - 2019. - Т. 66. - №. 3. - C. 1399-1404.

5. In vivo experimental studies of genotype II African swine fever virus (ASFV) isolates currently circulating in two Estonian counties / C. Gallardo [et al.] // Proc. 10th Annu. Meet. EPIZONE, Madrid, Sept. 2016. - P. 81.

6. Lacasta A. et al. Live attenuated African swine fever viruses as ideal tools to dissect the mechanisms involved in viral pathogenesis and immune protection // Veterinary research. -2015. -T. 46. - №. l. - C. 1-16.

7. Monteagudo P.L., Lacasta A., Lopez E., Bosch L., Collado J. BA71ACD2: a New Recombinant Live Attenuated African Swine Fever Virus with Cross Protective Capabilities. Journal of virology. 2017; 91:101 - 109.

8. Leitao A, Cartaxeiro C, Coelho R, Cruz B, Parkhouse RME, Portugal FC, Vigario JD, Martins CLV (2001) The non-hemadsorbing African swine fever virus isolate ASFV/NH/P68 provides a model for defining the protective anti-virus immune response. J Gen Virol 82:513-523.

9. Патент РФ 2452511. Аттенуированный штамм вируса африканской чумы свиней II серотипа для разработки диагностических и вакцинных препаратов. Калантаенко Ю.Ф., Жестерев В.И., Балышев В.М., Мищанин В.А. Москва, 2010.

10. Крутько С.А., Малоголовкин А.С., Кольцова Г.С.Делеция гена EP402R отменяет протективность штамма КК-262/С вируса африканской чумы свиней / Ветеринария, 2020, №11, Стр.25-28. DOI:10.30896/0042-4846.2020.23.11.25-28.

11. Патент РФ 2439152. Штамм «Ставрополь 01/08» вируса АЧС для вирусологических, молекулярно - генетических и мониторинговых исследований / Балышев В.М., Колбасов Д.В., Куриннов В.В. [и др.]; Москва, 2012.

12. Прудникова Е.Ю. Особенности репродукции вируса африканской чумы свиней в перевиваемой культуре клеток А₄С₂ // Ветеринария и кормление. - 2012.- №. 5. - С.43-45.

13. Патент РФ 2575079. Штамм вируса африканской чумы свиней 8-го серотипа, адаптированный к перевиваемой культуре клеток COS-1. Моргунов Ю.П., Моргунов С.Ю., Бурмакина Г. С, Малоголовкин А. С.и др., Москва, 2016.

14. Нефедьева, М.В. Получение рекомбинантного вируса африканской чумы свиней с делецией гена A238L и изучение его ростовых характеристик / М.В. Нефедьева, И. А. Титов, А.С. Малоголовкин // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и сельскохозяйственной микробиологии. XIX-я Всерос.конф. молодых ученых. Сборник тезисов. Москва, 15-16 апреля 2019 г. - ФГБНУ ВНИИСБ. - М., 2019. - С.99-100.

15. Rodriguez J.M. et al. Genome sequence of African swine fever virus BA71, the virulent parental strain of the nonpathogenic and tissue-culture adapted В A71V //PloS one. - 2015. - T. 10 - https://doi.org/10.1371/journal.pone.0142889

16. Chapman D.A.G. et al. Comparison of the genome sequences of nonpathogenic and pathogenic African swine fever virus isolates // Journal of General Virology. - 2008. - T. 89. - №. 2. - C. 397-408.

17. Патент РФ 2675535. Штамм «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» вируса африканской чумы свиней, со сниженной вирулентностью для свиней, для вирусологических, диагностических, молекулярно-генетических и мониторинговых исследований. Власова Н.Н., Жуков И.Ю., Мазлум А., Шарыпова Д.В., Першин А.С, Иголкин А.С., Москва, 2018.

18. Вишняков И.Ф. и др. Сероиммунологическая классификация природных изолятов вируса африканской чумы свиней // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии. - 1995. - С. 141-143.

19. Диагностика африканской чумы свиней. И.Ф. Вишняков, Н.И. Митин, А.Н. Курносов, В.М. Колосов, Ф.А. Бадаев, И.В. Федорищев, В.А. Бурлаков // Материалы научной конференции ВНИИВВиМ. - Покров, 1992. - С.57-70.

20. Elsukova А.А., Shevchenko I.V., Varentsova А.А. et al., 2017 Biological properties of African swine fever virus Odintsovo 02/14 isolate and its genome analysis. International Journal of Environmental & Agriculture Research (IJOEAR) ISSN: 2454-1850; 2017 - Vol.:3, Issue.: 10 (October), Page 26-37.

21. Инструкция по применению тест-системы «АЧС» для выявления вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции. - ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва. - 2017 г.

22. Методические рекомендации по выделению и титрованию вируса африканской чумы свиней в культуре клеток костного мозга свиней / А.А. Варенцова [и др.]; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир, 2014. - 17 с.

23. Популяционная структура вируса африканской чумы свиней по признаку количественной гемадсорбции / В.В. Макаров [и др.] // Вопросы вирусологии. - 1991. - Т. 4. - С.321-324.

1. Штамм «ASFV/CV60/2020» вируса африканской чумы свиней II генотипа VIII серотипа семейства Asfarviridae рода Asfivirus, депонированный в Коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №334-деп/20-122 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», для изучения факторов иммунитета у свиней при создании прототипа вакцины против африканской чумы свиней.

2. Штамм по п. 1, характеризующийся тем, что он получен в течение 60 серийных пассажей в культуре клеток CV-1, титр накопления вируса составляет 7,5-8,0 lg ГАдЕ₅₀/см³, стабилен при пассировании в культуре клеток CV-1 в течение 15 последовательных пассажей.

3. Штамм по п. 1, характеризующийся тем, что он получен в течение 60 серийных пассажей в культуре клеток CV-1 с остаточной вирулентностью для свиней не более 12,5% при внутримышечном заражении, инфекционная активность составляет 6,5-7,0 lg ГАдЕ₅₀/см³.

4. Штамм по п. 1, характеризующийся тем, что он индуцирует в организме свиней образование выявляемых в ТФ ИФА постинфекционных вирусспецифических антител, титр которых достигал значений в диапазоне 4,0-7,0 log₂/см³.