Однодоменное антитело и его модификации, специфически связывающиеся с rbd s белка вируса sars-cov-2, и способ их применения для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом sars-cov-2
Владельцы патента RU 2763001:
федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)
Группа изобретений относится к области биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Описано однодоменное антитело, специфически связывающееся с RBDS белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3. Также предложено олигомеризованное однодоменное антитело, специфически связывающееся с RBDS белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью, содержащее в качестве мономерного блока любой вариант созданного однодоменного антитела. Кроме того, создано антитело, представляющее собой однодоменное антитело, слитое с Fc-фрагментом иммуноглобулина G1 человека, специфически связывающееся с RBDS белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью, имеющее конечную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:9. Также создано олигомеризованное антитело, представляющее собой олигомеризованное однодоменное антитело, слитое с Fc-фрагментом иммуноглобулина G1 человека, специфически связывающееся с RBDS белка вируса SARS-CoV-2 и обладающее вируснейтрализующей активностью. Разработан способ терапии или экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, заключающийся во введении в организм млекопитающих в эффективном количестве любого созданного антитела. Изобретение расширяет арсенал средств для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2. 5 н.п. ф-лы, 8 ил., 5 табл., 15 пр.
Область техники
Группа изобретений относится к области биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Созданы однодоменные антитела, а также их модификации, специфически связывающиеся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2 и обладающие вируснейтрализующей активностью, предложено применение таких антител для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2.
Предшествующий уровень техники.
31 декабря 2019 года во Всемирную организацию здравоохранения (ВОЗ) поступила информация о вспышке пневмонии неизвестной этиологии в городе Ухань (Китайская Народная Республика). Возбудителем заболевания оказался одноцепочечный РНК-содержащий вирус SARS-CoV-2, относящийся к семейству Coronaviridae, к линии Beta-CoV B.
Коронавирус SARS-CoV-2 может передаваться воздушно-капельным, воздушно-пылевым, контактным, фекально-оральным способами, а также через контаминированные предметы и поверхности (фомиты), через кровь, от матери ребенку и от животных к человеку (Механизмы передачи вируса SARS-CoV-2 и их значение для выбора мер профилактики, Резюме научных исследований, 9 июля 2020 г. ВОЗ). За несколько месяцев вирус распространился по всему миру, и в январе 2020 года ВОЗ объявила эпидемию, связанную с SARS-CoV-2, чрезвычайной ситуацией в области здравоохранения международного значения, а в марте 2020 года охарактеризовала распространение болезни как пандемию.
Заболевание, которое вызывает SARS-CoV-2 получило собственное название COVID-19. Это потенциально тяжёлая острая респираторная инфекция, которая может протекать как в легкой, так и в тяжелой форме, и сопровождаться такими осложнениями, как пневмония, острый респираторный дистресс-синдром, острая дыхательная недостаточность, острая сердечная недостаточность, острая почечная недостаточность, септический шок, кардиомиопатии, и др. В настоящее время число заболевших COVID-19 более 185 млн человек, а погибших- более 4 млн человек и эти числа продолжают расти. Очевидно, что во всем мире в настоящее время есть острая необходимость в разработке безопасных и эффективных средств профилактики и лечения.
Одним из перспективных подходов к терапии коронавирусной инфекции является применение антител против определенных антигенных детерминант вируса. Это обусловлено двумя основными причинами: высокой специфичностью антител и технологичностью их промышленного производства. (В.С. Смирнов, Арег А. Тотолян. Некоторые возможности иммунотерапии при коронавирусной инфекции. Инфекция и иммунитет 2020, Т. 10, № 3, с. 446–458).
В настоящее время в мире проводится более 50 клинических исследований, связанных с моноклональными антителами (Deb P, Molla MMA, Saif-Ur-Rahman KM. An update to monoclonal antibody as therapeutic option against COVID-19. Biosaf Health. 2021 Apr; 3(2):87-91. doi: 10.1016/j.bsheal.2021.02.001. Epub 2021 Feb 10. PMID: 33585808; PMCID: PMC7872849). (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2590053621000197#s0005).
В настоящий момент разрешено к экстренному использованию два препарата на основе моноклональных антител. 21 ноября 2020 года Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) выдало разрешение на экстренное использование(EUA) препарата REGEN-COV (RegeneronPharmaceuticals), для лечения COVID-19 от легкой до умеренной степени у людей в возрасте от двенадцати лет и старше с массой тела не менее 40 кг (88 фунтов) с положительными результатами прямого тестирования на вирус SARS-CoV-2 и которые имеют высокий риск развития тяжелой формы COVID-19.Сюда входят лица в возрасте 65 лет и старше или лица, страдающие определенными хроническими заболеваниями. REGEN-COV состоит из двух моноклональных антител: казиривимаба (REGN10933) и имдевимаба (REGN10987), которые связываются с неперекрывающимися эпитопами S белка SARS-CoV-2. Результаты клинических исследований данного препарата показали, что он способен снижать вирусную нагрузку, с большим эффектом у пациентов, у которых иммунный ответ еще не был инициирован или у которых исходно была высокая вирусная нагрузка (Weinreich DM, Sivapalasingam S,NortonT, AliS, GaoH, BhoreR, MusserBJ, SooY, RofailD, ImJ, PerryC, PanC, HosainR,MahmoodA, DavisJD, TurnerKC, HooperAT, HamiltonJD, BaumA, KyratsousCA, KimY,CookA, KampmanW, KohliA, SachdevaY, GraberX, KowalB, DiCioccioT, StahlN, LipsichL, BraunsteinN, HermanG, YancopoulosGD; TrialInvestigators. REGN-COV2, a NeutralizingAntibody Cocktail, in Outpatients with Covid-19. N Engl J Med. 2021 Jan 21;384(3):238-251.doi: 10.1056/NEJMoa2035002. Epub 2020 Dec 17. PMID: 33332778; PMCID: PMC7781102).
Другой препарат на основе моноклонального антитела - бамланивимаб (LY-CoV555, разработчик: EliLilly) получил разрешение FDA на экстренное применение для лечения COVID-19 от легкой до умеренной степени тяжести у не госпитализированных взрослых и детей. Однако результаты клинических исследований неоднозначны. Среди госпитализированных пациентов с COVID-19 одновременное применение бамланивимабас ремдесивиром не было эффективно. (ACTIV-3/TICO LY-CoV555 Study Group, LundgrenJD, Grund B, Barkauskas CE, Holland TL, Gottlieb RL, Sandkovsky U, Brown SM, KnowltonKU, Self WH, Files DC, Jain MK, Benfield T, Bowdish ME, Leshnower BG, Baker JV, JensenJU, Gardner EM, Ginde AA, Harris ES, Johansen IS, Markowitz N, Matthay MA, Østergaard L, Chang CC, Davey VJ, Goodman A, Higgs ES, Murray DD, Murray TA, Paredes R, Parmar MKB, Phillips AN, Reilly C, Sharma S, Dewar RL, Teitelbaum M, Wentworth D, Cao H, Klekotka P, Babiker AG, Gelijns AC, Kan VL, Polizzotto MN, Thompson BT, Lane HC, NeatonJD. A Neutralizing Monoclonal Antibody for Hospitalized Patients with Covid-19. N Engl JMed. 2021 Mar 11;384(10):905-914. doi: 10.1056/NEJMoa2033130. Epub 2020 Dec 22. PMID:33356051; PMCID: PMC7781100). Клинические исследования на амбулаторных пациентах показали, что только одна из трех доз исследуемого препарата (2800 мг LY-CoV555)достоверно ускоряла естественное снижение вирусной нагрузки. (ChenP, NirulaA, HellerB, GottliebRL, BosciaJ, MorrisJ, HuhnG, CardonaJ, MocherlaB, StosorV, ShawaI, AdamsAC, VanNaardenJ, CusterKL, ShenL, DuranteM, OakleyG, SchadeAE, SaboJ, PatelDR,KlekotkaP, SkovronskyDM; BLAZE-1 Investigators. SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody LY-CoV555 in Outpatients with Covid-19. N Engl J Med. 2021 Jan 21;384(3):229-237. doi:10.1056/NEJMoa2029849. Epub 2020 Oct 28. PMID: 33113295; PMCID: PMC7646625).
Наилучший эффект наблюдался при комбинированной терапии двумя моноклональнымиантителами: бамланивимаб и этесевимаб. (GottliebRL, NirulaA, ChenP, BosciaJ, HellerB,MorrisJ, HuhnG, CardonaJ, MocherlaB, StosorV, ShawaI, KumarP, AdamsAC, VanNaardenJ, CusterKL, DuranteM, OakleyG, SchadeAE,HolzerTR, EbertPJ, HiggsRE, KallewaardNL, SaboJ, PatelDR, KlekotkaP, ShenL, SkovronskyDM. Effect of Bamlanivimab as Monotherapy or in Combination With Etesevimab on Viral Load in PatientsWith Mild to Moderate COVID-19: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 2021 Feb16;325(7):632-644. doi: 10.1001/jama.2021.0202. PMID: 33475701; PMCID: PMC7821080).
В целом, препараты на основе классических антител имеют ряд недостатков, к которым относятся:
- трудоемкость генно-инженерных манипуляций;
- трудности, связанные с узнаванием некоторых «скрытых» эпитопов;
- необходимость внутривенного введения, что влечет за собой дополнительную нагрузку на систему здравоохранения;
- дорогостоящее производство антител.
Решением проблемы может стать использование однодоменных антител (наноантител), которые в природе можно найти у представителей семейства верблюдовые. Благодаря относительно небольшому размеру однодоменные антитела обладают благоприятными биофизическими свойствами и дешевле в производстве, чем стандартные моноклональные антитела. Они могут быть получены с использованием прокариотических или эукариотических систем экспрессии. Их небольшой размер, а также длинные, определяющие комплементарность участки тяжелой цепи позволяют им нацеливаться на вогнутые эпитопы. Кроме того, наноантитела можно распылять и доставлять прямо в легкие пациента с Covid-19 с помощью ингалятора, что представляет собой лучшую альтернативу внутривенно вводимым классическим антителам (RamSasisekharan. Preparing for the Future — Nanobodies for Covid-19, April 22, 2021 N Engl JMed 2021; 384:1568-1571 DOI: 10.1056/NEJMcibr2101205)
В настоящее время нет препаратов на основе однодоменных антител, разрешенных к применению для лечения COVID-19.
Известно решение (CN112500480A), в котором разработаны варианты однодоменного антитела против вируса SARS-CoV-2, соответствующий вектор экспрессии, а также линия клеток, способная экспрессировать вышеуказанные варианты однодоменного антитела, и способ получения вариантов данного антитела.
Известно решение CN111825762A, в котором разработано несколько вариантов наноантитела к домену RBD S белка вируса SARS-COV-2, а также способ применения вариантов наноантитела для приготовления лекарственных средств для ингибирования вирусной инфекции SARS-COV-2 и приготовлении реагентов или наборов для тестирования вируса SARS-COV-2.
В патенте CN112094342A представлено биэпитопное специфическое антитело, происходящее из альпака, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с доменом RBD SARS-CoV-2 с высоким сродством, что может использоваться для профилактики, лечения и / или диагностики инфекции SARS-CoV-2.
Известно решение CN112062839A, в котором описано создание наноантитела к S белку SARS-CoV-2, а также способ его использования для приготовления реагента для лечения и / или диагностики инфекции, вызванной коронавирусом SARS-CoV-2.
Также известно решение CN112062840A, предусматривающее разработку наноантитела к S белку SARS-CoV-2 , а также способ его использования для приготовления реагента для лечения и / или диагностики инфекции, вызванной коронарирусом SARS-CoV-2.
В патенте CN111303279A описано создание гуманизированного однодоменного антитела против коронавируса SARS-CoV-2, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей однодоменное антитело, а также создание кассеты экспрессии, рекомбинантного вектора, рекомбинантной бактерии или линии трансгенных клеток, содержащей выше описанную молекулу нуклеиновой кислоты. Кроме того, разработан способ применения однодоменного антитела или созданной молекулы нуклеиновой кислоты или созданной экспрессионной кассеты, рекомбинантного вектора, рекомбинантной бактерии или линии трансгенных клеток при производстве продукта, который может применяться для предотвращения и / или лечение заболеваний, вызванных инфицированием новым коронавирусом SARS-CoV-2; а также для подавления заражения новым коронавирусомSARS-CoV-2. При этом продукт может: связываться с новым коронавирусом SARS-CoV-2; обнаруживать связывание нового коронавируса SARS-CoV-2; связываться с белком S нового коронавируса SARS-CoV-2; обнаруживать белок S нового коронавируса SARS-CoV-2. Также разработана фармацевтическая композиция, содержащая созданное однодоменное антитело и фармацевтически приемлемый наполнитель, разбавитель или носитель.
Данное решение, как наиболее близкое к заявляемому, было выбрано авторами патента за прототип. Однако, недостатком прототипа является то, что однодоменные антитела быстро выводятся из организма в следствии низкой молекулярной массы и, таким образом, требуют многократного введения.
Таким образом, в уровне техники существует потребность в создании нового антитела, специфически связывающегося с S белком вируса SARS-CoV-2,для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2,лишенного указанного недостатка.
Раскрытие сущности изобретения
Технической задачей заявленной группы изобретений является расширение арсенала антител для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2.
Технический результат заключается в создании однодоменного антитела и его модификаций, которые эффективно связывают рецептор-связывающий домен (RBD)Sбелка вируса SARS-CoV-2, нейтрализуют вирус SARS-CoV-2 и могут быть использованы для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2. Кроме того, технический результат заключается в том, что разработано антитело, которое обладает улучшенной фармакокинетикой, по сравнению с однодоменными антителами.
Указанный технический результат достигается тем, что создано однодоменное антитело, специфически связывающееся с RBDS белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3.
Также технический результат достигается тем, что создано олигомеризованное однодоменное антитело, специфически связывающееся с RBDS белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью, содержащее в качестве мономерного блока любой вариант созданного однодоменного антитела.
Кроме того, создано фьюжн антитело, представляющее собой однодоменное антитело, слитое сFc-фрагментом иммуноглобулинаG1 человека, специфически связывающееся с RBDS белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью, имеющее конечную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:9.
Также создано олигомеризованное фьюжн антитело, представляющее собой олигомеризованное однодоменное антитело, слитое сFc-фрагментом иммуноглобулинаG1 человека, специфически связывающееся с RBDS белка вируса SARS-CoV-2 и обладающее вируснейтрализующей активностью.
Кроме того, создана нуклеиновая кислота, имеющая нуклеотидную последовательность, кодирующую однодоменное антитело. Создана нуклеиновая кислота, имеющая нуклеотидную последовательность, кодирующую олигомеризованное однодоменное антитело. Также создана нуклеиновая кислота, имеющая нуклеотидную последовательность, кодирующую фьюжн антитело. Создана нуклеиновая кислота, имеющая нуклеотидную последовательность, кодирующую олигомеризованное фьюжн антитело.
Кроме того, создана клетка-продуцент, содержащая нуклеиновую кислоту, имеющую нуклеотидную последовательность любого из созданных антител, и экспрессирующая данное антитело.
А также разработан способ терапии или экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, заключающийся во введении в организм млекопитающих в эффективном количестве любого созданного антитела.
Краткое описание чертежей.
На фиг.1 представлены данные по определению титра специфических антител к RBD в сыворотке крови альпака после иммунизации рекомбинантным RBD.
Ось ординат – оптическая плотность раствора при длине волны 450 нм
Ось абсцисс – разведения сыворотки крови альпака
- Уровень сигнала сыворотки альпака на BSA (отрицательный контроль)
- Уровень специфического сигнала сыворотки альпака на рекомбинантный RBD
На фиг. 2 представлена электрофореграмма анализа результатов очистки однодоменных антител аффинной хроматографией,
где
1- препарат однодоменных антител р2h5;
2- препарат однодоменных антител p2h2;
3- препарат однодоменных антител p2g1;
4- препарат однодоменных антител p3d3;
5- препарат однодоменных антител p1d3;
6- препарат однодоменных антител p1d5;
7- препарат однодоменных антител p2c5;
8- препарат однодоменных антител p5f8.
На фиг. 3 представлено схематическое изображение аминокислотной последовательности однодоменных антител,
где
1 – N-конец;
2 – последовательность однодоменного антитела;
3 – His-tag (гистидиновая метка);
4 – C-конец.
На фиг. 4 представлено схематическое изображение аминокислотной последовательности олигомеризованных однодоменных антител,
где
1 – N-конец;
2 – последовательность однодоменного антитела;
3 – глицин-сериновый линкер;
4 – последовательность однодоменного антитела;
5 – His-tag (гистидиновая метка);
6 – C-конец.
На фиг. 5 представлено схематическое изображение аминокислотной последовательности однодоменных антител, модифицированных Fc-фрагментом IgG1 человека,
1 – глицин-сериновый линкер;
2 –последовательность однодоменного антитела;
2 - шарнирный регион;
3 - Fc-фрагмент IgG1 человека.
На фиг. 6 представлено схематическое изображение аминокислотной последовательности олигомеризованных однодоменных антител, модифицированных Fc-фрагментом IgG1 человека,
где
1 – глицин-сериновый линкер;
2 - димеризованное через серин-глициновый линкер однодоменное антитело;
2 - шарнирный регион;
3 - Fc-фрагмент IgG1 человека.
На фиг. 7 представлены результаты анализа изменения веса животных, которым вводили созданные антитела, и животных из группы плацебо в течение 14 суток после зараженияSARS-CoV-2. В каждой временной точке для каждой группы животных вес представлен в виде арифметического среднего и 95% доверительного интервала. Также на рисунке пунктирной линией отмечена область 95% веса.
Ось ординат – изменение веса животных от начального, %
Ось абсцисс – время после заражения животных вирусом SARS-CoV-2, дни
- животные, которым вводили препарат антител;
- группа плацебо.
На фиг. 8 представлены результаты анализа изменения веса животных, которым вводили созданные антитела, и животных из группы плацебо в течение 30 суток после заражения SARS-CoV-2. В каждой временной точке для каждой группы животных вес представлен в виде арифметического среднего. Также на рисунке пунктирной линией отмечена область 95% веса.
Ось ординат – изменение веса животных от начального, %
Ось абсцисс – время после заражения животных вирусом SARS-CoV-2, дни
- животные, которым внутрибрюшинно вводили p2c5-fc (10 мг/кг), через 1 час после заражения SARS-CoV-2;
- животные, которым внутрибрюшинно вводили p2c5-fc (5 мг/кг), через 1 час после заражения SARS-CoV-2;
- животные, которым интраназально вводили p2c5-fc (200нг), одновременно с заражениемSARS-CoV-2;
- животные, которым интраназально вводили p2c5-fc (1000нг), через 1 час после заражения SARS-CoV-2;
- группа плацебо.
Осуществление изобретения.
Вариантом данного изобретения является однодоменное антитело, специфически связывающееся с RBD доменом S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3.
Для получения данного антитела осуществляли иммунизацию альпаки рекомбинантным RBD вируса SARS-CoV-2, полученным в клеточной линии СНО и очищенным металл-аффинной и эксклюзионной хроматографией. Эффективность иммунизации подтверждали оценкой титра специфических к RBDантител в сыворотке крови животного. Далее у животных выделяли мононуклеарные клетки периферической крови, из которых получали РНК. На основе РНК синтезировали кДНК. На матрице полученной кДНК ставили гнездовую ПЦР, позволяющую амплифицировать последовательности однодоменных антител. Таким образом была получена библиотека ампликонов последовательностей однодоменных антител.
Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, возможно использование не только мононуклеарных клеток, а также цельной крови, лимфатических узлов, селезенки, тимуса или других клеток и органов иммунизированного животного, экспрессирующих однодоменные антитела. Также специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения возможно использование синтетических библиотек последовательностей однодоменных антител.
Селекцию антител проводили методом фагового дисплея с использованием паннинга на антигене (RBD). Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, возможно использование других подходов селекции, таких как паннинг на вирусных частицах, паннинг в растворе биотинилированного антигена, паннинг с использованием конкурентного связывания и элюции. Также специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения возможно использование других методов селекции, таких как рибосомный дисплей, дрожжевой дисплей. В результате селекции были отобраны однодоменные антитела, специфически связывающиеся с RBD доменом S белка вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3). В последующих экспериментах было показано, что данные антитела обладают вируснейтрализующей активностью.
Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения последовательности однодоменных антител, специфических к RBD вируса SARS-CoV-2, могут содержать в себе аминокислотные замены, которые не сказываются на вторичной и третичной структуре однодоменных антител и не влияют на их способность связывать и нейтрализовать RBD вируса SARS-CoV-2. Более того, поскольку в связывании с антигеном участвуют только антигенсвязывающие петли (CDR домены) однодоменных антител, то, как известно специалистам в данной области, любой иммуноглобулин или его аналог, содержащий такие же аминокислотные последовательности CDR доменов, попадает под объем настоящего изобретения. Более того, последовательности CDR доменов могут содержать замены/делеции/вставки аминокислот, которые при парном выравнивании аминокислотных последовательностей обеспечивают гомологичность не менее 70% и не оказывают качественного влияния на способность связываться с антигеном. Таким образом, под объем настоящего изобретения попадают все иммуноглобулины или их аналоги, содержащие последовательности CDR доменов, гомология которых составляет не менее 70% с предлагаемыми последовательностями.
Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения последовательности однодоменных антител, специфических к RBD вируса SARS-CoV-2, могут быть модифицированы путем присоединения различных белков, белковых доменов и тэгов, таких, например, как НА-тэг, Flag-тэг, GST-тэг, GFP белок, RFP белок, биотин и другие.
Нуклеотидную последовательность однодоменных антител определяли методом секвенирования. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения нуклеотидные последовательности, кодирующие однодоменные антитела, могут отличаться, основываясь на принципе вырожденности генетического кода. Таким образом, под объем настоящего изобретения попадают все последовательности нуклеотидов, кодирующие аминокислотные последовательности однодоменных антител SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3. Например, нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15.
С помощью методов генной инженерии была получена клетка-продуцент, содержащая нуклеотидную последовательность однодоменного антитела и экспрессирующая однодоменное антитело SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3. Таким образом, например, были получены: клетка-продуцент на основе Escherichiacoli (E.coli), экспрессирующая однодоменное антитело SEQ ID NO:1; клетка-продуцент на основе Escherichiacoli (E.coli), экспрессирующая однодоменное антитело SEQ ID NO:2, клетка-продуцент на основе Escherichiacoli (E.coli), экспрессирующая однодоменное антитело SEQ ID NO:3.Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения в качестве продуцента можно использовать другие про- и эукариотические системы экспрессии, такие как лактобактерии, бациллы, растения, дрожжи, культуры клеток и другие. При необходимости способ получения дополнительно включает в себя выделение и очистку любым способом, известным в данной области.
Другим вариантом данного изобретения является олигомеризованное однодоменное антитело специфически связывающееся с RBD доменом S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью, содержащее в качестве мономерного блока любой вариант однодоменного антитела, выбранный из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3. Частными случаями данного варианта изобретения являются: димеризованное однодоменное антитело, в котором мономеры соединены глицин-сериновым линкером SEQ ID NO 4, димеризованное однодоменное антитело, в котором мономеры соединены глицин-сериновым линкером SEQ ID NO 5, димеризованное однодоменное антитело, в котором мономеры соединены глицин-сериновым линкером SEQ ID NO 6. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, олигомеризацию однодоменных антител можно осуществлять при помощи других линкеров. Олигомеризованное однодоменное антитело было получено путем экспрессии соответствующей нуклеотидной последовательности в клетках-продуцентах. В последующих экспериментах было показано, что данные антитела обладают вируснейтрализующей активностью.
Нуклеотидная последовательность олигомеризованного однодоменного антитела была получена генно-инженерным методом. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения нуклеотидные последовательности, кодирующие однодоменные антитела, могут отличаться, основываясь на принципе вырожденности генетического кода. Таким образом, под объем настоящего изобретения попадают все последовательности нуклеотидов, кодирующие аминокислотные последовательности олигомеризованных однодоменных антител, в которых мономерами являются однодоменные антитела (SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3). Например, нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18.
С помощью методов генной инженерии была получена клетка-продуцент, содержащая нуклеотидную последовательность олигомеризованного однодоменного антитела, в котором мономерами являются однодоменные антитела (SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3) и экспрессирующая олигомеризованное однодоменное антитело, в котором мономерами являются однодоменные антитела (SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3). Таким образом, например, были получены: клетка-продуцент на основе Escherichiacoli (E.coli), экспрессирующая олигомеризованное однодоменное антитело, в котором мономерами являются однодоменные антитела SEQ ID NO:1; клетка-продуцент на основе Escherichiacoli (E.coli), экспрессирующая олигомеризованное однодоменное антитело, в котором мономерами являются однодоменные антитела SEQ ID NO:2, клетка-продуцент на основе Escherichiacoli (E.coli), экспрессирующая олигомеризованное однодоменное антитело, в котором мономерами являются однодоменные антитела SEQ ID NO:3. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения в качестве продуцента можно использовать другие про- и эукариотические системы экспрессии, такие как лактобактерии, бациллы, растения, дрожжи, культуры клеток и другие. При необходимости способ получения дополнительно включает в себя выделение и очистку любым способом, известным в данной области.
Кроме того, вариантом изобретения является фьюжн антитело, представляющее собой однодоменное антитело, модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобуллинаG1 человека, специфически связывающееся с RBD доменом S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью, имеющее конечную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:9. Данное антитело было получено путем экспрессии нуклеотидной последовательности фьюжн антитела в клетках-продуцентах.
Нуклеотидные последовательности фьюжн антител были созданы генно-инженерным путем на основе нуклеотидной последовательности однодоменных антител и нуклеотидной последовательности Fc-фрагмента иммуноглобуллинаG1 человека. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения нуклеотидные последовательности, кодирующие фьюжн антитела, могут отличаться, основываясь на принципе вырожденности генетического кода. Таким образом, под объем настоящего изобретения попадают все последовательности нуклеотидов, кодирующие аминокислотные последовательности фьюжн антител (SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9). Например, нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21.
С помощью методов генной инженерии была получена клетка-продуцент, содержащая нуклеотидную последовательность фьюжн антитела и экспрессирующая фьюжн антитело SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:9. Таким образом, например, были получены: клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующая фьюжн антитело SEQ ID NO:7; клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующая фьюжн антитело SEQ ID NO:8, клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующая фьюжн антитело SEQ ID NO:9. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения в качестве продуцента можно использовать другие эукариотические системы экспрессии. При необходимости способ получения дополнительно включает в себя выделение и очистку любым способом, известным в данной области.
Также вариантом изобретения является олигомеризованное фьюжн антитело, представляющее собой олигомеризованное однодоменное антитело, содержащее в качестве мономерного блока любой вариант однодоменного антитела, выбранный из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобулинаG1 человека, специфически связывающееся с RBDS белка вируса SARS-CoV-2 и обладающее вируснейтрализующей активностью. Частными случаями данного варианта изобретения являются: димеризованное фьюжн антитело SEQ ID NO 10, в котором мономеры соединены глицин-сериновым линкером; димеризованное однодоменное антитело SEQ ID NO 11, в котором мономеры соединены глицин-сериновым линкером; димеризованное однодоменное антитело SEQ ID NO 12, в котором мономеры соединены глицин-сериновым линкером. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, олигомеризацию однодоменных антител можно осуществлять при помощи других линкеров.
Нуклеотидная последовательность олигомеризованного фьюжн антитела была получена генно-инженерным методом. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела, могут отличаться, основываясь на принципе вырожденности генетического кода. Таким образом, под объем настоящего изобретения попадают все последовательности нуклеотидов, кодирующие аминокислотные последовательности олигомеризованных фьюжн антител SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9. Например, нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24.
С помощью методов генной инженерии была получена клетка-продуцент, содержащая нуклеотидную последовательность олигомеризованного фьюжн антитела, в котором мономерами являются фьюжн антитела (SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQIDNO:9) и экспрессирующая олигомеризованное фьюжн антитело, в котором мономерами являются фьюжн антитела (SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:9). Таким образом, например, были получены: клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующая олигомеризованное фьюжн антитело, в котором мономерами являются фьюжн антитела SEQ ID NO:7; клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующая олигомеризованное фьюжн антитело, в котором мономерами являются фьюжн антитела SEQ ID NO:8, клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующая олигомеризованное фьюжн антитело, в котором мономерами являются фьюжн антитела SEQ ID NO:9. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения в качестве продуцента можно использовать другие эукариотические системы экспрессии. При необходимости способ получения дополнительно включает в себя выделение и очистку любым способом, известным в данной области.
Изучена фармакокинетика однодоменных антител и их модификаций. Продемонстрировано что модификация однодоменных антител и их олигомеров Fc-фрагментом IgG1 человека, позволяет увеличить время их циркуляции в организме с нескольких часов до нескольких недель.
Таким образом, авторами патента были получены варианты антител, специфически связывающееся с RBDS белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью и обладающие улучшенной фармакокинетикой по сравнению с однодоменными антителами.
Кроме того, авторами патента разработан способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, заключающийся во введении в организм млекопитающих в эффективном количестве любого из разработанных вариантов антител.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Получение иммунной библиотеки кДНК однодоменных антител альпака.
На первом этапе работы был получен иммуноген- рецептор-связывающий домен (RBD) S белка вируса SARS-CoV-2. Для этого аминокислотную последовательность рецептор-связывающего домена (RBD) поверхностного Spike-белка вируса SARS-CoV-2 (а.о. 319 - 541, UniProtKB: locus SPIKE_SARS2, accessionP0DTC2) модифицировали c N-конца сигнальным пептидом щелочной фосфатазы SEAP (MLLLLLLLGLRLQLSLGI) и с С-конца последовательностью глицин-серинового линкера и гистидиновой метки (GSHHHHHHHHH). На основе аминокислотной последовательности получили нуклеотидную последовательность, которая была синтезирована ЗАО «Евроген». После этого нуклеотидную последовательность полученного полипептида клонировали в плазмиду для транзиентной экспрессии в клетках млекопитающих. Далее, культуру клеток CHO тарифицировали полученной плазмидой с помощью набора CHO Gro (MirusBio, США) в соответствии с протоколом производителя. Затем клетки культивировали в колбах Эрленмейера в течение 10 дней. По истечении этого срока культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 5000g. Рецептор-связывающий домен (RBD) очищали металл-аффинной хроматографией на системе AKTA start («GE HealthcareLife Sciences», США), используя колонки HisTrap FF 5 мл («GE HealthcareLifeSciences», США) в соответствии с протоколом производителя. Дополнительную очистку и замену буфера на 20 мМ фосфат натрия, 500 мМ натрия хлорид (рН=7,2) проводили на колонке ХК 26/100 («GE HealthcareLifeSciences», США), упакованной сорбентом Superdex 200 pg («GE HealthcareLifeSciences», США). Таким образом, в результате проведенной работы был получен очищенный рекомбинантный RBDS белка вируса SARS-CoV-2.
На следующем этапе работы альпака (Lamapacos - представитель семейства Cameliedae) иммунизировали полученным RBD (100мкг на иммунизацию) 5 раз с промежутками в 10-14 дней. Через неделю после последней иммунизации определили титр антител в сыворотке крови альпака, который составил 1/1638400 (фигура 1).
Через 7 дней после последней иммунизации у альпака отбирали 50,0 мл периферической крови и выделяли мононуклеарные клетки на градиенте фиколла 1,077 (Панэко, Россия). Изолированные мононуклеарные клетки использовали для выделения тотальной РНК реагентом Trizol (Invitrogene, США) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенную РНК использовали в качестве матрицы для синтеза кДНК со случайными праймерами и ревертазой SuperScriptIII (Invitrogene, США). На матрице, полученной кДНК, ставили гнездовую ПЦР, позволяющую амплифицировать последовательности однодоменных антител. Для этой процедуры использовали высокоточную полимеразу Q5 (NEB, Великобритания) и специфические праймеры, содержащие на концах сайты рестрикции.
Таким образом, в результате проведенной работы были получены ампликоны, которые являются иммунной библиотекой кДНК однодоменных антител альпака.
Пример 2. Получение библиотеки рекомбинантных бактерифагов.
Ампликоны, полученные в примере 1гидролизовалирестриктазами и клонировали в фагмидный вектор, гидролизованный по тем же сайтам. Затем трансформировали клетки E.coli (штамм TG1) фагмидными векторами, полученными в результате клонирования.
Суспензию бактериальных клонов-трансформантов клеток E.coli (штамм TG1) использовали для продукции рекомбинантных бактериофагов с использованием бактериофага-помощника M13KO7 (NEB, Великобритания) согласно протоколу фирмы-производителя. Рекомбинантные бактериофаги осаждали путем преципитации полиэтиленгликолем (PEG/NaCl). Таким образом, получена библиотека рекомбинантных бактерифагов с титром 1012 трансдуцирующих единиц/мл суспензии.
Пример 3. Селекция и определение последовательности специфических однодоменных антител
Селекцию специфических рекомбинантных бактериофагов осуществляли путем паннинга на антигене исходной библиотеки бактериофагов. Для этого рекомбинантный RBD (пример 1) иммобилизовали в лунке иммунологического планшета в 50,0 мМ карбонатно-бикарбонатном буфере в течение ночи. Не связавшийся белок удаляли, а лунку блокировали 5% раствором сухого молока в фосфатном буфере в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем добавляли суспензию 1011 рекомбинантных бактерифагов и инкубировали 1 час при комнатной температуре. Не связавшиеся бактерифаги отмывали коллоидным 0,1% раствором детергента Твин-20 в фосфатном буфере. Связавшиеся бактериофаги элюировали при помощи раствора трипсина (0,1 мг/мл). Элюированные бактериофаги использовали для трансдукции клеток E.coli TG1, которые затем высевали на агаризованные чашки в разведении, позволяющем изолировать индивидуальные колонии. Полученные колонии использовали для наращивания бактериальной массы и выделения плазмидной ДНК. Плазмиды секвенировали для определения нуклеотидных последовательностей, кодирующих однодоменные антитела. Было определено 8 индивидуальных последовательностей.
Пример 4. Продукция и очистка однодоменных антител
Для продукции однодоменных антител к интенсивно делящимся клеткам E.coli TG1, полученных из колоний на предыдущем этапе, добавляли 1,0 мкМ изопропил тиогалактопиранозид (IPTG) (Хеликон, Россия), спустя 4 часа бактериальную массу использовали для выделения рекомбинантных белков на колонке HisTrap FF 5 мл («GE HealthcareLifeSciences», США) с использованием хроматографической системы AKTA start («GE HealthcareLifeSciences», США), согласно протоколу фирмы-производителя. Результаты хроматографической очистки однодоменных антител представлены на фигуре 2. Данный пример демонстрирует простоту и эффективность продукции и очистки однодоменных антител в бактериальной системе экспрессии. Таким образом, были получены очищенные препараты однодоменных антител. Одинаковые результаты были получены для всех 8 однодоменных антител. Схематичное изображение аминокислотных последовательностей однодоменных антител представлено на фигуре 3.
Пример 5. Определение вируснейтрализующей активности однодоменных антител.
Целью данной работы являлась оценка способности полученных однодоменных антител нейтрализовать вирус SARS-CoV-2. Реакцию нейтрализации вируса SARS-CoV-2 ставили в варианте постоянная доза вируса – разведения образца однодоменных антител. Готовили образцы однодоменных антител в культуральной среде ДМЕМ с 2% инактивированной фетальной бычьей сывороткой, далее смешивали со 100 БОЕ вируса SARS-CoV-2, инкубировали 1 час при 37ºС и добавляли к клеткам Vero E6. Исходные концентрации препаратов однодоменных антител составляла 0,5-1 мг/мл. Конечные разведения однодоменных антител составили 1/20-1/1280. Клетки инкубировали при 37°С в 5% СО2. Через 96 часов производили учет развития цитопатического действия вируса на культуру клеток визуально по оценке нарушения монослоя клеток. За вируснейтрализующий титр однодоменных антител принимали высшее их разведение, при котором происходит подавление цитопатического действия в 2-х лунках из 3-х.
Данные по вируснейтрализующей активности выбранных антител представлены в таблице 1.
Таблица 1. Вируснейтрализующая активность полученных однодоменных антител.
| Название образца антитела | Вируснейтрализующая активность, нг/мл |
| Однодоменное антитело SEQ ID NO:1 (p2g1) | 332 |
| Однодоменное антитело SEQ ID NO:2 (p2c5) | 664 |
| Однодоменное антитело SEQ ID NO:3 (p5f8) | 295 |
| Однодоменное антитело (p2h1) | 8300 |
| Однодоменное антитело (p2h2) | 12500 |
| Однодоменное антитело (p3d3) | 4300 |
| Однодоменное антитело (p2d1) | 9310 |
| Однодоменное антитело (p2d5) | 1900 |
Как видно из представленных данных все 8 образцов обладали выраженной вируснейтрализующей активностью (рабочая концентрация от 1 до 12,5 мкг/мл), из которых 3 образца обладали наиболее выраженной вируснейтрализующей активностью (рабочая концентрация от менее 1 мкг/мл). Три образца однодоменных антител, обладающих наиболее выраженной вируснейтрализующей активностью, были выбраны для дальнейших исследований.
Таким образом, в результате проведенной работы было получено три однодоменных антитела (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3), обладающих высокой вируснейтрализующей активностью.
Пример 6. Определение констант взаимодействия однодоменных антител
Константы взаимодействия (KD) однодоменных антител p2c5, p5f8 и p2g1 определяли путем детекции изменения показателей поверхностного плазмонного резонанса на приборе Biacore3000 (General Electric, Швеция). Для этого рекомбинантный RBD ковалентно иммобилизировали на поверхности декстранового матрикса чипа СМ5 (General Electric, Швеция), а затем пропускали над поверхностью чипа различные концентрации полученных однодоменных антител. Обработку данных и вычисление констант проводили в автоматическом режиме при помощи программы Bioevaluation (GeneralElectric, Швеция). Полученные данные представлены в таблице 2
Таблица 2. Константа равновесной диссоциации полученных однодоменных антител с рекомбинантным RBD.
| Название образца антитела | Константа равновесной диссоциации |
| Однодоменное антитело SEQ ID NO:1 (p2g1) | 8,2*10е-9 М |
| Однодоменное антитело SEQ ID NO:2 (p2c5) | 2,8*10е-9 М |
| Однодоменное антитело SEQ ID NO:3 (p5f8) | 3,5*10е-9 М |
Полученные данные демонстрируют высокие значения констант равновесных диссоциаций отобранных однодоменных антител с рекомбинантным RBD,что свидетельствует о высокой аффинности связывания однодоменных антител с RBD вируса SARS-CoV-2.
Пример 7. Получение, продукция и очистка олигомеризованных однодоменных антител
Данный пример иллюстрирует получение олигомеризованных однодоменных антител, в частности димеризованных однодоменных антител p2g1-dimer (SEQ ID NO:4), p2c5-dimer (SEQ ID NO:5), p5f8-dimer (SEQ ID NO:6). На первом этапе разработали дизайн нуклеотидной последовательности димеризованных антител, которые представляют собой две аминокислотные последовательности однодоменного антитела ((SEQ ID NO:1 или (SEQ ID NO:2 или (SEQ ID NO:3), соединенные через глицин-сериновый линкер (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS). Нуклеотидные последовательности димеризованных антител были синтезированы компанией ЗАО «Евроген». Полученные нуклеотидные последовательности клонировали в экспрессионный вектор pET30a, получая таким образом плазмидные векторы pET30a-p2c5-dimer, pET30a-p5f8-dimer и pET30a-p2g1-dimer. Полученными экспрессионными векторами были трансформированы клетки E.coli штамма BL21, экспрессия была индуцирована путем добавления 1,0 мкМ IPTG (Хеликон, Россия). Спустя 4 часа из бактериальной массы выделяли димеризованные однодоменные антитела на колонке HisTrap FF 5 мл («GE HealthcareLifeSciences», США) с использованием хроматографической системы AKTA start («GE HealthcareLifeSciences», США), согласно протоколу фирмы-производителя. Так были получены препараты димеризованных однодоменных антител p2g1-dimer (SEQ ID NO:4), p2c5-dimer (SEQ ID NO:5), p5f8-dimer (SEQ ID NO:6). Схематичное изображение аминокислотных последовательностей димеризованных однодоменных антител представлено на фигуре 4.
Таким образом, в результате проведенной работы были получены олигомеризованные однодоменные антитела, мономерами которых являются разработанные однодоменные антитела (SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3).
Пример 8. Определение вируснейтрализующей активности димеризованных однодоменных антител.
Целью данного эксперимента являлась оценка способности разработанных димеризованных однодоменных антител нейтрализовать вирус SARS-CoV-2.
На первом этапе работы подготовили образцы димеризованных однодоменных антител (SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:6) в культуральной среде ДМЕМ с 2% инактивированной фетальной бычьей сывороткой. Затем полученные образцы антител смешивали со 100 БОЕ вируса SARS-CoV-2, инкубировали 1 час при 37°С и добавляли к клеткам Vero E6. Клетки инкубировали при 37°С в 5% СО2. Через 96 часов производили учет развития цитопатического действия вируса на культуру клеток визуально по оценке нарушения монослоя клеток. За вируснейтрализующий титр однодоменных антител принимали высшее их разведение, при котором происходит подавление цитопатического действия в 2-х лунках из 3-х. В результате были определены следующие рабочие вируснейтрализующие концентрации антител: p2g1-dimer (SEQ ID NO:4) = 238 нг/мл, p2c5-dimer(SEQ ID NO:5) = 17 нг/мл, p5f8-dimer (SEQ ID NO:6) = 59 нг/мл.
Как видно из представленных данных все полученные димеризованные однодоменные антитела способны нейтрализовать вирус SARS-CoV-2. При этом, вируснейтрализующая активность димеризованных однодоменных антител (SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6) выше, чем однодоменных антител (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3).
Пример 9. Получение, продукция и очистка фьюжн антител.
Фьюжн антитело представляет собой однодоменное антитело, модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобуллина человека.
Данная модификация однодоменных антител позволит улучшить их фармакокинетические свойства за счет добавления Fc-фрагмента IgG1 человека и его правильного гликозилирования в эукариотических клетках-продуцентах. Кроме того, модификация Fc-фрагментом позволит антителам активировать систему комплимента и связываться с Fc-рецепторами на поверхности иммунокомпитентных клеток.
На первом этапе работы разработали дизайн аминокислотной последовательности фьюжн антитела (SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:9), которое представляет собой однодоменное антитело (SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3), модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобулина G1 человека. На основе аминокислотной последовательности были получены нуклеотидные последовательности фьюжн антител, которые были синтезированы в компании ЗАО «Евроген». Полученные нуклеотидные последовательности клонировали в вектор для экспрессии в эукариотических клетках. Далее проводили трансфекцию клеток линии СНО полученными экспрессионными векторами с использованием системы CHOGro (MirusBio, США) в соответствии с протоколом производителя. Клетки культивировали в колбах Эрленмейера в течение 10 дней. После чего культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 5000g. Антитело очищали аффинной хроматографией на системе AKTA start (Cytiva, Швеция), используя колонки MAbSelectSuRe 1 мл (Cytiva, Швеция) в соответствии с протоколом производителя. Дополнительную очистку и замену буфера проводили на колонке ХК 26/100 (Cytiva, Швеция), упакованной сорбентом Superdex 200 pg (Cytiva, Швеция). Чистоту полученных препаратов фьюжн антител p2g1-fc (SEQ ID NO:7), p2c5-fc (SEQ ID NO:8), p5f8-fc (SEQ ID NO:9), определяли методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях и денатурирующих условиях. Схематичное изображение аминокислотной последовательности фьюжн антител представлено на фигуре. 5.
Таким образом, в результате проведенной работы было получено фьюжн антитело, представляющее собой разработанное однодоменное антитело, модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобулина G1 человека, имеющее конечную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:9.
Пример 10. Определение вируснейтрализующей активности фьюжн антител.
Целью данного эксперимента являлась оценка способности разработанных фьюжн антител нейтрализовать вирус SARS-CoV-2. На первом этапе работы подготовили образцы фьюжн антител (SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:9) в культуральной среде ДМЕМ с 2% инактивированной фетальной бычьей сывороткой. Затем полученные образцы антител смешивали со 100 БОЕ вируса SARS-CoV-2, инкубировали 1 час при 37ºС и добавляли к клеткам Vero E6. Клетки инкубировали при 37°С в 5% СО2. Через 96 часов производили учет развития цитопатического действия вируса на культуру клеток визуально по оценке нарушения монослоя клеток. За вируснейтрализующий титр однодоменных антител принимали высшее их разведение, при котором происходит подавление цитопатического действия в 2-х лунках из 3-х. В результате были определены следующие рабочие вируснейтрализующие концентрации фьюжн антител: p2g1-fc (SEQ ID NO:7) – 1750 нг/мл, p2c5-fc (SEQ ID NO:8) – 5 нг/мл, p5f8-fc (SEQ ID NO:9) – 860 нг/мл,
Как видно из представленных данных все полученные фьюжн антитела обладают вируснейтрализующей активностью против коронавируса SARS-CoV-2.
Пример 11. Получение, продукция и очистка олигомеризованного фьюжн антитела.
Олигомеризованное фьюжн антитело представляет собой олигомеризованное однодоменное антитело, модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобулина человека.
Данная модификация содержит два антиген связывающих сайта антитела, что может потенциально увеличить вируснейтрализующую активность антител за счет увеличения авидности.
В данном примере проиллюстрировано создание димеризованного фьюжн антитела. Специалисту среднего уровня понятно, что аналогичным образом может быть сделано и тримеризованное фьюжн антитело.
На первом этапе работы разработали дизайн аминокислотной последовательности димеризованного фьюжн антитела (SEQ ID NO:10, или SEQ ID NO:11, или SEQ ID NO:12), которое представляет собой димеризованное однодоменное антитело (SEQ ID NO:4, или SEQ ID NO:5, или SEQ ID NO:6, соответственно), модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобулина G1 человека. На основе аминокислотной последовательности были получены нуклеотидные последовательности димеризованного фьюжн антител, которые были синтезированы в компании ЗАО «Евроген». Полученные нуклеотидные последовательности клонировали в вектор для экспрессии в эукариотических клетках. Далее проводили трансфекцию клеток линии СНО полученными экспрессионными векторами с использованием системы CHOGro (MirusBio, США) в соответствии с протоколом производителя. Клетки культивировали в колбах Эрленмейера в течение 10 дней. После чего культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 5000g. Антитело очищали аффинной хроматографией на системе AKTA start (Cytiva, Швеция), используя колонки MAbSelectSuRe 1 мл (Cytiva, Швеция) в соответствии с протоколом производителя. Дополнительную очистку и замену буфера проводили на колонке ХК 26/100 (Cytiva, Швеция), упакованной сорбентом Superdex 200 pg (Cytiva, Швеция). Чистоту полученных препаратов антител p2g1- dimer-fc (SEQ ID NO:10), p2c5-dimer-fc (SEQ ID NO:11), p5f8-dimer-fc (SEQ ID NO:12), определяли методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих и неденатурирующих условиях. Схематичное изображение аминокислотной последовательности олигомеризованных фьюжн антител представлено на фигуре. 6.
Таким образом, в результате проведенной работы было получено олигомеризованное фьюжн антитело, представляющее собой разработанное олигомеризованное однодоменное антитело, модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобуллина G1 человека, имеющее конечную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, или SEQ ID NO:11, или SEQ ID NO:12.
Пример 12. Определение вируснейтрализующей активности олигомеризованных фьюжн антител.
Целью данного эксперимента являлась оценка способности полученных олигомеризованных фьюжн антител нейтрализовать вирус SARS-CoV-2.
На первом этапе работы подготовили образцы димеризованные фьюжн антител (SEQ ID NO:10, или SEQ ID NO:11, или SEQ ID NO:12) в культуральной среде ДМЕМ с 2% инактивированной фетальной бычьей сывороткой. Затем полученные образцы антител смешивали со 100 БОЕ вируса SARS-CoV-2, инкубировали 1 час при 37ºС и добавляли к клеткам Vero E6. Клетки инкубировали при 37°С в 5% СО2. Через 96 часов производили учет развития цитопатического действия вируса на культуру клеток визуально по оценке нарушения монослоя клеток. За вируснейтрализующий титр однодоменных антител принимали высшее их разведение, при котором происходит подавление цитопатического действия в 2-х лунках из 3-х. В результате были определены следующие рабочие вируснейтрализующие концентрации фьюжн антител: p2g1-dimer-fc (SEQ ID NO:10) - 4125 нг/мл, p2c5-dimer-fc (SEQ ID NO:11) – 60 нг/мл, p5f8-dimer-fc (SEQ ID NO:12) – 390 нг/мл.
Как видно из представленных данных все полученные олигомеризованные фьюжн антитела обладают вируснейтрализующей активностью против коронавируса SARS-CoV-2. Таким образом, продемонстрировано, что, как и мономеры, димеризованные формы фьюжн антител обладают вируснейтрализующей активностью. Следовательно, любые олигомеризованные фьюжн антитела (мономеры, димеры, тримеры и т.д.) могут обладать вируснейтрализующей активностью.
Пример 13. Изучение фармакокинетических свойств однодоменных антител и их модификаций.
Целью данной работы являлось изучение фармакокинетических свойств полученных однодоменных антител и их модификаций.
Для этого самкам мышей линии Balb/c весом 20 г. (6 животных/группе) вводили внутривенно препараты полученных однодоменных антител и их модификаций в дозе 10 мг/кг однократно. Таким образом были получены следующие группы животных:
1) p2g1 (SEQ ID NO:1);
2) p2c5 (SEQ ID NO:2);
3) p5f8 (SEQ ID NO:3);
4) p2g1-dimer (SEQ ID NO:4);
5) p2c5-dimer (SEQ ID NO:5);
6) p5f8-dimer (SEQ ID NO:6);
7) p2g1-fc (SEQ ID NO:7);
8) p2c5-fc (SEQ ID NO:8);
9) p5f8-fc (SEQ ID NO:9);
10) p2g1-dimer-fc (SEQ ID NO:10);
11) p2c5-dimer-fc (SEQ ID NO:11);
12) p5f8-dimer-fc (SEQ ID NO:12).
Далее у мышей отбирали сыворотку крови спустя 30 мин, 1, 2, 4, 6, 24, 48, 72, 168, 240, 336 часов после введения препарата. В образцах сыворотки крови животных определяли концентрацию вводимого препарата антител в непрямом ИФА. Для этого в лунки 96-луночного планшета сорбировали рекомбинантный RBD(100 нг/лунку). Концентрацию антител в различные временные интервалы рассчитывали исходя из оптической плотности специфического сигнала испытуемых образцов относительно стандартов (образцы препарата в заданных концентрациях). Параметры фармакокинетики вычисляли использую программу PKsolver 2.0. Результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3. Фармакокинетические свойства разработанных однодоменных антител и их модификаций
| Фармакокинетические параметры | ||||
| Название препарата | t1/2 (ч) | Tmax (ч) | Cmax (мг/мл) | T выведения (ч) |
| p2c5 | 1,01 | 0,5 | 6,22 | 5 |
| p5f8, | 1,05 | 0,5 | 6,03 | 5 |
| p2g1 | 1,03 | 0,5 | 6,01 | 5 |
| p2c5-dimer | 1,08 | 0,5 | 6,68 | 6 |
| p5f8-dimer | 1,1 | 0,5 | 7,01 | 6 |
| p2g1-dimer | 1,09 | 0,5 | 7,03 | 6 |
| p2c5-fc | 55 | 24 | 20,3 | 336 |
| p5f8-fc | 57 | 24 | 22 | 336 |
| p2g1-fc | 54 | 24 | 24 | 336 |
| p2c5-dimer-fc | 60,4 | 24 | 26,8, | 336 |
| p5f8-dimer-fc | 61 | 24 | 26 | 336 |
| p2g1-dimer-fc | 60,5 | 24 | 27 | 336 |
t1/2 – период полувыведения, час
Tmax – период до достижения максимальной концентрации, час
Cmax - максимальная концентрация, мг/мл
T выведения – время выведения, час
Как видно из представленных данных, модификация однодоменных антител Fc-фрагментом IgG1 человека приводит к увеличению циркуляции антител в организме с нескольких часов до 14 дней.
Таким образом в результате проведенной работы было получено модифицированное однодоменное антитело, которое обладает улучшенной фармакокинетикой (по сравнению с однодоменными антителами).
Пример 13. Способ терапии заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2.
Известно, что переливание плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 с высоким титром вируснейтрализующих антител пациентам COVID-19 на ранних стадиях приводит к значительному снижению их смертности (Salazar E, Christensen PA, Graviss EA, Nguyen DT, Castillo B, Chen J, Lopez BV, Eagar TN, Yi X, Zhao P, Rogers J, Shehabeldin A, Joseph D, Masud F, Leveque C, Olsen RJ, Bernard DW, Gollihar J, Musser JM. Significantly Decreased Mortality in a Large Cohort of Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) Patients Transfused Early with Convalescent Plasma Containing High-Titer Anti-Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) Spike Protein IgG. Am J Pathol. 2021 Jan; 191(1):90-107. doi: 10.1016/j.ajpath.2020.10.008. Epub 2020 Nov 4. PMID: 33157066; PMCID: PMC7609241).
Было показано, что все созданные однодоменные антитела и их модификации обладают вируснейтрализующей активностью против SARS-CoV-2. Специалисту среднего уровня очевидно, что данные антитела могут быть использованы для терапии заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2. При этом антитела могут вводиться подкожно, внутримышечно, внутривенно, внутрибрюшинно. Однодоменные антитела и олигомеризованные однодоменные антитела также могут вводиться интраназально, внутривенно и внутримышечно.
Экспериментальные данные показывают, антитела могут вводиться человеку в концентрации от 1 до 100 мг/мл.
Пример 14. Разработка способа экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2.
Целью данной работы являлась разработка способа экстренной профилактики заболеваний, вызываемый вирусом SARS-CoV-2.
В экспериментах использовали модель летальной инфекции сирийских хомячков по схеме представленной в таблице 4. Сирийские хомячки, выбраны в качестве модели, так как их рецепторы ACE2 обладают высоким сродством к SARS-CoV-2.
Таблица 4. Дизайн эксперимента по исследованию протективности фьюжн антитела 2 в профилактическом режиме применения на сирийских хомячках (летальная модель)
| Вид животных | Исследование | Путь введения препарата | Доза препарата | Ожидаемый эффект |
| Сирийские хомячки | Протективная эффективность | Внутрибрюшинно | 10 мг/кг | Отсутствие клинических признаков инфекции у животных, получающих препарат, в сравнении с группой животных, получающих плацебо |
Для изучения протективной активности было выбрано фьюжн антитело p2c5-fc (SEQ ID NO:8). Для исследования был выбран внутрибрюшинный путь введения препарата, однако препарат также может вводиться внутривенно, внутримышечно или подкожно. Однодоменные антитела могут вводиться интраназально.
В исследовании было использовано 20 сирийских хомячков, массой 35-45 г, по 10 животных в опытной (препарат антител) и контрольной (плацебо) группах. В исследовании использовали вирус SARS-CoV-2 (hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-1/2020), изолированный в 2020 году в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, хранящийся в Государственной коллекции вирусов. Инфекционный титр вируса 107 TCID50/мл и 3,5×107 БОЕ/мл. В экспериментах использовали постоянную культуру клеток почки африканской зеленой мартышки - Vero E6. В качестве ростовой и поддерживающей использовали среду DMEM, содержащую соответственно 10% и 2% фетальной телячьей сыворотки.
Животным вводили фьюжн антитело p2c5-fc (SEQ ID NO:8) однократно за 24 часа до заражения в дозе 10 мг/кг, контрольные животные получали инъекцию фосфатно-солевого буфера (плацебо). Через 24 часа после введения препарата или плацебо животных заражали вирусом SARS-CoV-2 интраназально в дозе 5×105 TCID50 на животное (таблица 2). Наблюдение за животными осуществляли в течение 14 дней. Наиболее выраженным клиническим проявлением инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, у золотистых хомяков является снижение веса в первые дни после заражения. Оценку веса у зараженных животных проводили ежедневно на протяжении всего исследования.
На фигуре 7 представлены данные динамики веса животных после заражения. По результатам исследования было показано, что однократное введение препарата антителp2c5-fc (SEQ ID NO:8) в дозе 10 мг/кг животным за сутки до заражения позволяет защитить животных от инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2. В контрольной группе животных после заражения наблюдается снижение массы тела, которое достигает максимума к 4 суткам после заражения. В то же время у животных, получавших созданное антитело p2c5-fc (SEQ ID NO:8), масса тела после заражения не снижается, а постепенно возрастает, что свидетельствует об отсутствии проявления клинических признаков инфекции.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что введение препарата фьюжн антитела p2c5-fc (SEQ ID NO:8) позволяет защитить млекопитающих от клинических проявлений инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2 (5×105 TCID50). Специалисту среднего уровня очевидно, что другие созданные антитела, обладающие вируснейтрализующей активностью, также могут защищать млекопитающих от клинических проявлений инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2.
Таким образом, в результате проведенных экспериментов был разработан способ экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, заключающийся во введении в организм млекопитающих в эффективном количестве любого созданного однодоменного антитела или его модификаций.
Пример 15. Разработка способа терапии заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2.
Терапевтическую эффективность препарата фьюжн антитела p2c5-fc (SEQ ID NO:8) оценивали на модели инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, у АСЕ2-трансгенных мышей. Данные животные были выбраны, так как они высокочувствительны к инфекции SARS-CoV-2. Летальность животных после заражения вирусом SARS-CoV-2 составляет 100%.
В работе использовали вирус SARS-CoV-2 (hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-1/2020), изолированный в 2020 году в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, хранящийся в Государственной коллекции вирусов. Инфекционный титр вируса 107 TCID50/мл и 3,5×107 БОЕ/мл. Животных заражали вирусом SARS-CoV-2 интраназально в дозе 105TCID50 на животное, далее вводили препарат моноклональных антител или плацебо, согласно таблице 5.
Таблица 5. Дизайн экспериментального изучения эффективности фьюжн антитела p2c5-fc
| Препарат | Доза препарата | Путь введения | Время введения | Инфицирование интраназально в дозе TCID50 | Оценка эффективности | |
| фьюжн антитело p2c5-fc | 10 мг/кг | в/б | Через 1 час после заражения | 105 | 3 шт. | Анализ динамики веса. Анализ выживаемости |
| фьюжн антитело p2c5-fc | 5 мг/кг | в/б | Через 1 час после заражения | 105 | 3 шт. | |
| фьюжн антитело p2c5-fc | 25 мкг/кг | и/н | Через 1 час после заражения | 105 | 3 шт. | |
| фьюжн антитело p2c5-fc | 5 мкг/кг | и/н | Одновременно с заражением | 105 | 3 шт. | |
| Плацебо | - | в/б | Через 1 час после заражения | 105 | 3 шт. |
В течение 30 суток после заражения оценивали вес и выживаемость животных.
На фиг. 8 представлены данные динамики веса животных после заражения. По результатам исследования было показано, что однократное системное (внутрибрюшинное) введение препарата фьюжн антитела 2 в дозе 10 и 5 мг/кг животным через час после заражения позволяет защитить животных от инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2. Также было показано, что введение препарата в дозе 5 мкг/кг интраназально одновременно с заражением и введение препарата в дозе 25 мкг/кг интраназально через час после заражения позволяет защитить животных от инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2. Специалисту среднего уровня очевидно, что препарат антитела также может вводиться внутримышечно, внутривенного или подкожно.
У всех животных, получивших препарат, не было зафиксировано снижения веса более 5%. Гибель зараженных животных, получивших препарат, отсутствовала. Тогда как в контрольной группе животных после заражения наблюдается снижение массы тела, к 8 суткам все животные из группы контроля погибли.
Таким образом, можно сделать вывод, что разработанные однодоменные антитела и их производные могут быть использованы для терапии заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры подтверждают эффективность созданных однодоменных антител и их модификаций, обладающих вируснейтрализующей активностью, и обладающих терапевтическими и протективными свойствами против вируса SARS-CoV-2 и их промышленную применимость.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
SEQ ID NO:1.
<110> Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение «Национальный
исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного
академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации
<120>Однодоменное антитело и его модификации, специфически связывающиеся
с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, и способ их применения для терапии и
экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом
SARS-CoV-2 (варианты.
<160>1
<170> BiSSAP 1.3.6
<210>1
<211>142
<212>PRT
<213>Vicugnapacos
<220>
<223> аминокислотная последовательность однодоменного антитела P2G1
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Gly Arg Asp Gly Met Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ala Gly Gly Asn Trp Tyr Gly Tyr Ser Leu Met Glu Tyr Asp Phe
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
115 120 125
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala
130 135 140
SEQ ID NO:2.
<210> 2
<211> 138
<212>PRT
<213>Vicugna pacos
<220>
<223> аминокислотная последовательность однодоменного антитела P2C5
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Cys Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Ile Ile Arg Arg Asp Gly Ser Thr Ala Tyr Thr Asp Ala Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Lys
85 90 95
Ser Trp Ala Cys Ser Ser Gly Glu Tyr Leu Tyr Gln Gly Asp Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu
115 120 125
Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala
130 135 140
SEQ ID NO:3.
<210>3
<211> 138
<212>PRT
<213>Vicugna pacos
<220>
<223> аминокислотная последовательность однодоменного антитела P5F8
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Asp Thr Asp Met Thr Asn
20 25 30
Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asn Ser Glu Arg Val
35 40 45
Ala Cys Ile Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Lys Tyr Ile Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Thr Trp Asp Thr Tyr Gly Tyr Asp Tyr Asn Tyr Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu
115 120 125
Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala
130 135 140
SEQ ID NO:4.
<210>4
<211> 287
<212>PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> аминокислотная последовательность олигомеризованного
однодоменного антитела P2G1
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Gly Arg Asp Gly Met Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ala Gly Gly Asn Trp Tyr Gly Tyr Ser Leu Met Glu Tyr Asp Phe
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Val Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser
165 170 175
Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly
180 185 190
Val Ala Ala Ile Gly Arg Asp Gly Met Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
195 200 205
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
210 215 220
Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ala Ala Ala Gly Gly Asn Trp Tyr Gly Tyr Ser Leu Met Glu Tyr Asp
245 250 255
Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala
260 265 270
Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala
275 280 285
SEQ ID NO:5.
<210>5
<211> 279
<212>PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> аминокислотная последовательность олигомеризованного
однодоменного антитела P2С5
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Cys Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Ile Ile Arg Arg Asp Gly Ser Thr Ala Tyr Thr Asp Ala Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Lys
85 90 95
Ser Trp Ala Cys Ser Ser Gly Glu Tyr Leu Tyr Gln Gly Asp Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
130 135 140
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg
145 150 155 160
Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Cys Ser Tyr Asp Met Ser
165 170 175
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser Ile Ile
180 185 190
Arg Arg Asp Gly Ser Thr Ala Tyr Thr Asp Ala Val Lys Gly Arg Phe
195 200 205
Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
210 215 220
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Lys Ser Trp Ala
225 230 235 240
Cys Ser Ser Gly Glu Tyr Leu Tyr Gln Gly Asp Trp Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
260 265 270
Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala
275 280 285
SEQ ID NO:6.
<210>6
<211> 279
<212>PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> аминокислотная последовательность олигомеризованного
однодоменного антитела P5F8
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Asp Thr Asp Met Thr Asn
20 25 30
Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asn Ser Glu Arg Val
35 40 45
Ala Cys Ile Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Lys Tyr Ile Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Thr Trp Asp Thr Tyr Gly Tyr Asp Tyr Asn Tyr Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
130 135 140
Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg
145 150 155 160
Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Asp Thr Asp Met Thr Asn Ser Met Gly
165 170 175
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asn Ser Glu Arg Val Ala Cys Ile
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
195 200 205
Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met
210 215 220
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Lys Tyr Ile Cys Ala Ala Gly
225 230 235 240
Thr Trp Asp Thr Tyr Gly Tyr Asp Tyr Asn Tyr Trp Gly Pro Gly Thr
245 250 255
Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
260 265 270
Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala
275 280 285
SEQ ID NO:7.
<210>7
<211>357
<212>PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>аминокислотная последовательность фьюжн антитела 2, представляющего
собой однодоменное антитело 2, модифицированное Fc-фрагментом
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Gly Arg Asp Gly Met Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ala Gly Gly Asn Trp Tyr Gly Tyr Ser Leu Met Glu Tyr Asp Phe
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys
115 120 125
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
130 135 140
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
145 150 155 160
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
165 170 175
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
180 185 190
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
195 200 205
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
210 215 220
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
225 230 235 240
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
245 250 255
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
260 265 270
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
275 280 285
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
290 295 300
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
305 310 315 320
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
325 330 335
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
340 345 350
Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
SEQ ID NO:8.
<210>8
<211>352
<212>PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>аминокислотная последовательность фьюжн антитела 2, представляющего
собой однодоменное антитело 2, модифицированное Fc-фрагментом
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Cys Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Ile Ile Arg Arg Asp Gly Ser Thr Ala Tyr Thr Asp Ala Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Lys
85 90 95
Ser Trp Ala Cys Ser Ser Gly Glu Tyr Leu Tyr Gln Gly Asp Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
115 120 125
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
145 150 155 160
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
165 170 175
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
180 185 190
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
195 200 205
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
210 215 220
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
225 230 235 240
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
245 250 255
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
260 265 270
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
275 280 285
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
290 295 300
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
305 310 315 320
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
325 330 335
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
340 345 350
SEQ ID NO:9.
<210>9
<211>352
<212>PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>аминокислотная последовательность фьюжн антитела 3, представляющего
собой однодоменное антитело 3, модифицированное Fc-фрагментом
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Asp Thr Asp Met Thr Asn
20 25 30
Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asn Ser Glu Arg Val
35 40 45
Ala Cys Ile Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Lys Tyr Ile Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Thr Trp Asp Thr Tyr Gly Tyr Asp Tyr Asn Tyr Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
115 120 125
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
145 150 155 160
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
165 170 175
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
180 185 190
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
195 200 205
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
210 215 220
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
225 230 235 240
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
245 250 255
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
260 265 270
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
275 280 285
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
290 295 300
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
305 310 315 320
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
325 330 335
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
340 345 350
SEQ ID NO:10.
<210>10
<211>502
<212>PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>аминокислотная последовательность димеризованного фьюжн антитела 1,
в котором мономеры соединены глицин-сериновым линкером
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Gly Arg Asp Gly Met Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ala Gly Gly Asn Trp Tyr Gly Tyr Ser Leu Met Glu Tyr Asp Phe
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Val Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser
165 170 175
Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly
180 185 190
Val Ala Ala Ile Gly Arg Asp Gly Met Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
195 200 205
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
210 215 220
Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ala Ala Ala Gly Gly Asn Trp Tyr Gly Tyr Ser Leu Met Glu Tyr Asp
245 250 255
Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro
260 265 270
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
275 280 285
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
290 295 300
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
305 310 315 320
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
325 330 335
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
340 345 350
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
355 360 365
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
370 375 380
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
385 390 395 400
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
405 410 415
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
420 425 430
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
435 440 445
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
450 455 460
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
465 470 475 480
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
485 490 495
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
500 505 510
SEQ ID NO:11.
<210>11
<211>494
<212>PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>аминокислотная последовательность димеризованного фьюжн антитела 2,
в котором мономеры соединены глицин-сериновым линкером
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Cys Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Ile Ile Arg Arg Asp Gly Ser Thr Ala Tyr Thr Asp Ala Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Lys
85 90 95
Ser Trp Ala Cys Ser Ser Gly Glu Tyr Leu Tyr Gln Gly Asp Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
130 135 140
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg
145 150 155 160
Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Cys Ser Tyr Asp Met Ser
165 170 175
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser Ile Ile
180 185 190
Arg Arg Asp Gly Ser Thr Ala Tyr Thr Asp Ala Val Lys Gly Arg Phe
195 200 205
Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
210 215 220
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Lys Ser Trp Ala
225 230 235 240
Cys Ser Ser Gly Glu Tyr Leu Tyr Gln Gly Asp Trp Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
260 265 270
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
275 280 285
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
290 295 300
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
305 310 315 320
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
325 330 335
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
340 345 350
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
355 360 365
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
370 375 380
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
385 390 395 400
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
405 410 415
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
420 425 430
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
435 440 445
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
450 455 460
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
465 470 475 480
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485 490 495
SEQ ID NO:12.
<210>12
<211>494
<212>PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>аминокислотная последовательность димеризованного фьюжн антитела 3,
в котором мономеры соединены глицин-сериновым линкером
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Cys Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Ile Ile Arg Arg Asp Gly Ser Thr Ala Tyr Thr Asp Ala Val Lys
50 55 60
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Asp Thr Asp Met Thr Asn
20 25 30
Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asn Ser Glu Arg Val
35 40 45
Ala Cys Ile Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Lys Tyr Ile Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Thr Trp Asp Thr Tyr Gly Tyr Asp Tyr Asn Tyr Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
130 135 140
Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg
145 150 155 160
Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Asp Thr Asp Met Thr Asn Ser Met Gly
165 170 175
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asn Ser Glu Arg Val Ala Cys Ile
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
195 200 205
Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met
210 215 220
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Lys Tyr Ile Cys Ala Ala Gly
225 230 235 240
Thr Trp Asp Thr Tyr Gly Tyr Asp Tyr Asn Tyr Trp Gly Pro Gly Thr
245 250 255
Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
260 265 270
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
275 280 285
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
290 295 300
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
305 310 315 320
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
325 330 335
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
340 345 350
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
355 360 365
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
370 375 380
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
385 390 395 400
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
405 410 415
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
420 425 430
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
435 440 445
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
450 455 460
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
465 470 475 480
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485 490 495
<210>13
<211>444
<212>DNA
<213>Vicugnapacos
<220>
<223>нуклеотиднаяпоследовательность однодоменного антитела P2G1
<400> 1
GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTGCAGC CTGGGGGGTC TGTGAGACTC 60
TCCTGTGCAG CCTCTGGATA CACCTACAGT AGCTACTGCA TGGGCTGGTT CCGCCAGGCT 120
CCAGGGAAGG AGCGCGAGGG GGTCGCAGCT ATCGGCAGGG ATGGTATGAC AAGCTACGCA 180
GACTCCGTGA AGGGCCGATT CACCATCTCC CGAGACAACG CCAAGAACAC GCTGTATCTC 240
GAAATGAACA GCCTGAAACC TGAGGACACG GCCATGTATT ACTGTGCGGC CGCCGGCGGT 300
AACTGGTACG GGTACAGCCT AATGGAGTAT GACTTTGGTT ACTGGGGCCA GGGGACCCAG 360
GTCACCGTCT CCTCAGCGGC CGCAGAACAA AAACTCATCT CAGAAGAGGA TCTGAATGGG 420
GCCGCACATC ACCACCATCA CCAT 444
SEQ ID NO:14.
<210>14
<211> 432
<212>DNA
<213>Vicugnapacos
<220>
<223>нуклеотиднаяпоследовательность однодоменного антитела P2C5
GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC TCGGTGCAGG CTGGAGGGTC TCTGAGACTC 60
TCCTGTGTAG CGTCTGGATA CACCTACTGC AGTTACGACA TGAGTTGGTA CCGCCAGGCT 120
CCAGGGAAGG AGCGCGAGTT CGTTTCAATT ATTCGCCGTG ATGGTTCTAC GGCGTACACA 180
GACGCCGTGA AGGGCCGATT CGCCATCTCC CGAGACAACG CCAAGAACAC ACTGTATCTG 240
CAAATGAACA GCCTGGAACC TGAGGACACG GCCATGTATT ACTGTAAATC TTGGGCTTGC 300
AGCAGCGGTG AATACTTGTA TCAGGGCGAC TGGGGCCAGG GGACCCAGGT CACTGTCTCC 360
TCAGCGGCCG CAGAACAAAA ACTCATCTCA GAAGAGGATC TGAATGGGGC CGCACATCAC 420
CACCATCACC AT 432
SEQ ID NO:15.
<210>15
<211>432
<212>DNA
<213>Vicugnapacos
<220>
<223>нуклеотиднаяпоследовательностьоднодоменногоантителаP5F8
CAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGGAGGC TCGGTGCAGG CTGGAGGGTC TCTGAGACTC 60
TCCTGTACAG CCTCTGGAGA CACCGACATG ACGAACTCCA TGGGCTGGTT CCGCCAGGCT 120
CCAGGGAAGA ACAGCGAGCG GGTCGCATGT ATTGGCGGTG GTGGTAGTAC CACATACTAT 180
GCCGACTCCG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCCAAGACA ACGCCAAGAA CACGGTGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGTCTGAA ACCTGAGGAC ACTGCCAAAT ACATCTGTGC GGCCGGGACC 300
TGGGACACTT ATGGATATGA CTATAACTAC TGGGGCCCGG GGACCCAGGT CACTGTCTCC 360
TCAGCGGCCG CAGAACAAAA ACTCATCTCA GAAGAGGATC TGAATGGGGC CGCACATCAC 420
CACCATCACC AT 432
SEQ ID NO:16.
<210>16
<211> 879
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>нуклеотиднаяпоследовательность олигомеризованного однодоменного антитела
P2G1
<400>
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTGTGAGACTC 60
TCCTGTGCAGCCTCTGGATACACCTACAGTAGCTACTGCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCT 120
CCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCTATCGGCAGGGATGGTATGACAAGCTACGCA 180
GACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTC 240
GAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCGGCCGCCGGCGGT 300
AACTGGTACGGGTACAGCCTAATGGAGTATGACTTTGGTTACTGGGGCCAGGGGACCCAG 360
GTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGCGGATCAGGTGGAGGTGGATCTGGCGGCGGCGGCTCA 420
GGCGGAGGAGGTTCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGG 480
GGGTCTGTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATACACCTACAGTAGCTACTGCATGGGC 540
TGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCTATCGGCAGGGATGGT 600
ATGACAAGCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCGAGACAACGCCAAG 660
AACACGCTGTATCTCGAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGT 720
GCGGCCGCCGGCGGTAACTGGTACGGGTACAGCCTAATGGAGTATGACTTTGGTTACTGG 780
GGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAA 840
GAGGATCTGA ATGGGGCCGC ACATCACCAC CATCACCAT 879
SEQ ID NO:17.
<210> 17
<211> 855
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>нуклеотиднаяпоследовательность олигомеризованного однодоменного антитела
P2C5
<400>
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTC 60
TCCTGTGTAGCGTCTGGATACACCTACTGCAGTTACGACATGAGTTGGTACCGCCAGGCT 120
CCAGGGAAGGAGCGCGAGTTCGTTTCAATTATTCGCCGTGATGGTTCTACGGCGTACACA 180
GACGCCGTGAAGGGCCGATTCGCCATCTCCCGAGACAACGCCAAGAACACACTGTATCTG 240
CAAATGAACAGCCTGGAACCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTAAATCTTGGGCTTGC 300
AGCAGCGGTGAATACTTGTATCAGGGCGACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCC 360
TCAGGTGGTGGCGGATCAGGTGGAGGTGGATCTGGCGGCGGCGGCTCAGGCGGAGGAGGT 420
TCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGA 480
CTCTCCTGTGTAGCGTCTGGATACACCTACTGCAGTTACGACATGAGTTGGTACCGCCAG 540
GCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGTTCGTTTCAATTATTCGCCGTGATGGTTCTACGGCGTAC 600
ACAGACGCCGTGAAGGGCCGATTCGCCATCTCCCGAGACAACGCCAAGAACACACTGTAT 660
CTGCAAATGAACAGCCTGGAACCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTAAATCTTGGGCT 720
TGCAGCAGCGGTGAATACTTGTATCAGGGCGACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACTGTC 780
TCCTCAGCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGCCGCACAT 840
CACCACCATC ACCAT 855
SEQ ID NO:18.
<210> 18
<211> 855
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>нуклеотиднаяпоследовательность олигомеризованного однодоменного антитела
P5F8
<400>
CAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGGAGGC TCGGTGCAGG CTGGAGGGTC TCTGAGACTC 60
TCCTGTACAG CCTCTGGAGA CACCGACATG ACGAACTCCA TGGGCTGGTT CCGCCAGGCT 120
CCAGGGAAGA ACAGCGAGCG GGTCGCATGT ATTGGCGGTG GTGGTAGTAC CACATACTAT 180
GCCGACTCCG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCCAAGACA ACGCCAAGAA CACGGTGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGTCTGAA ACCTGAGGAC ACTGCCAAAT ACATCTGTGC GGCCGGGACC 300
TGGGACACTT ATGGATATGA CTATAACTAC TGGGGCCCGG GGACCCAGGT CACCGTCTCC 360
TCAGGTGGTG GCGGATCAGG TGGAGGTGGA TCTGGCGGCG GCGGCTCAGG CGGAGGAGGT 420
TCCCAGGTGC AGCTGGTGCA GTCTGGGGGA GGCTCGGTGC AGGCTGGAGG GTCTCTGAGA 480
CTCTCCTGTA CAGCCTCTGG AGACACCGAC ATGACGAACT CCATGGGCTG GTTCCGCCAG 540
GCTCCAGGGA AGAACAGCGA GCGGGTCGCA TGTATTGGCG GTGGTGGTAG TACCACATAC 600
TATGCCGACT CCGTGAAGGG CCGATTCACC ATCTCCCAAG ACAACGCCAA GAACACGGTG 660
TATCTGCAAA TGAACAGTCT GAAACCTGAG GACACTGCCA AATACATCTG TGCGGCCGGG 720
ACCTGGGACA CTTATGGATA TGACTATAAC TACTGGGGCC CGGGGACCCA GGTCACTGTC 780
TCCTCAGCGG CCGCAGAACA AAAACTCATC TCAGAAGAGG ATCTGAATGG GGCCGCACAT 840
CACCACCATC ACCAT 855
SEQ ID NO:19.
<210> 19
<211>1071
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>нуклеотидная последовательность фьюжн антитела 1, представляющего собой
однодоменное антитело 1, модифицированное Fc-фрагментом
<400>
GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTGCAGC CTGGGGGGTC TGTGAGACTC 60
TCCTGTGCAG CCTCTGGATA CACCTACAGT AGCTACTGCA TGGGCTGGTT CCGCCAGGCT 120
CCAGGGAAGG AGCGCGAGGG GGTCGCAGCT ATCGGCAGGG ATGGTATGAC AAGCTACGCA 180
GACTCCGTGA AGGGCCGATT CACCATCTCC CGAGACAACG CCAAGAACAC GCTGTATCTC 240
GAAATGAACA GCCTGAAACC TGAGGACACG GCCATGTATT ACTGTGCGGC CGCCGGCGGT 300
AACTGGTACG GGTACAGCCT AATGGAGTAT GACTTTGGTT ACTGGGGCCA GGGGACCCAG 360
GTCACCGTCT CCTCAGAACC TAAGTCCTGT GACAAGACCC ACACCTGTCC ACCTTGTCCT 420
GCTCCAGAGC TGCTTGGAGG TCCAAGCGTG TTCCTGTTTC CTCCCAAACC TAAGGACACC 480
CTGATGATCT CCAGGACACC AGAAGTGACC TGTGTCGTTG TGGACGTCTC TCACGAGGAT 540
CCTGAGGTGA AGTTCAACTG GTATGTGGAT GGTGTGGAGG TCCACAATGC CAAGACCAAA 600
CCCAGAGAGG AACAGTACAA CAGCACCTAC AGAGTCGTGA GTGTGTTGAC CGTGCTGCAT 660
CAAGACTGGC TGAATGGCAA GGAATATAAG TGCAAAGTGA GCAACAAAGC ACTTCCTGCT 720
CCCATCGAGA AGACCATCTC CAAAGCCAAA GGACAACCTA GAGAACCTCA AGTCTACACC 780
CTGCCACCCT CCAGAGAAGA GATGACCAAA AACCAAGTGT CTCTGACCTG TCTTGTCAAA 840
GGCTTCTATC CCTCTGACAT TGCTGTGGAG TGGGAGAGCA ATGGACAACC TGAGAACAAC 900
TATAAGACCA CACCACCTGT CCTGGACAGT GATGGCTCCT TCTTTCTGTA TAGTAAGCTG 960
ACAGTGGACA AGAGCAGGTG GCAGCAAGGC AATGTCTTCT CCTGCAGTGT GATGCATGAA 1020
GCCTTGCACA ACCACTACAC CCAGAAGAGC CTGTCTTTGT CTCCTGGCAA G 1071
SEQ ID NO:20.
<210>20
<211>1059
<212>DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>нуклеотидная последовательность фьюжн антитела 2, представляющего собой
однодоменное антитело 2, модифицированное Fc-фрагментом
<400>
GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC TCGGTGCAGG CTGGAGGGTC TCTGAGACTC 60
TCCTGTGTAG CGTCTGGATA CACCTACTGC AGTTACGACA TGAGTTGGTA CCGCCAGGCT 120
CCAGGGAAGG AGCGCGAGTT CGTTTCAATT ATTCGCCGTG ATGGTTCTAC GGCGTACACA 180
GACGCCGTGA AGGGCCGATT CGCCATCTCC CGAGACAACG CCAAGAACAC ACTGTATCTG 240
CAAATGAACA GCCTGGAACC TGAGGACACG GCCATGTATT ACTGTAAATC TTGGGCTTGC 300
AGCAGCGGTG AATACTTGTA TCAGGGCGAC TGGGGCCAGG GGACCCAGGT CACCGTCTCC 360
TCAGAACCTA AGTCCTGTGA CAAGACCCAC ACCTGTCCAC CTTGTCCTGC TCCAGAGCTG 420
CTTGGAGGTC CAAGCGTGTT CCTGTTTCCT CCCAAACCTA AGGACACCCT GATGATCTCC 480
AGGACACCAG AAGTGACCTG TGTCGTTGTG GACGTCTCTC ACGAGGATCC TGAGGTGAAG 540
TTCAACTGGT ATGTGGATGG TGTGGAGGTC CACAATGCCA AGACCAAACC CAGAGAGGAA 600
CAGTACAACA GCACCTACAG AGTCGTGAGT GTGTTGACCG TGCTGCATCA AGACTGGCTG 660
AATGGCAAGG AATATAAGTG CAAAGTGAGC AACAAAGCAC TTCCTGCTCC CATCGAGAAG 720
ACCATCTCCA AAGCCAAAGG ACAACCTAGA GAACCTCAAG TCTACACCCT GCCACCCTCC 780
AGAGAAGAGA TGACCAAAAA CCAAGTGTCT CTGACCTGTC TTGTCAAAGG CTTCTATCCC 840
TCTGACATTG CTGTGGAGTG GGAGAGCAAT GGACAACCTG AGAACAACTA TAAGACCACA 900
CCACCTGTCC TGGACAGTGA TGGCTCCTTC TTTCTGTATA GTAAGCTGAC AGTGGACAAG 960
AGCAGGTGGC AGCAAGGCAA TGTCTTCTCC TGCAGTGTGA TGCATGAAGC CTTGCACAAC 1020
CACTACACCC AGAAGAGCCT GTCTTTGTCT CCTGGCAAG 1059
SEQ ID NO:21.
<210> 21
<211> 1059
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>нуклеотидная последовательность фьюжн антитела 3, представляющего собой
однодоменное антитело 3, модифицированное Fc-фрагментом
<400>
CAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGGAGGC TCGGTGCAGG CTGGAGGGTC TCTGAGACTC 60
TCCTGTACAG CCTCTGGAGA CACCGACATG ACGAACTCCA TGGGCTGGTT CCGCCAGGCT 120
CCAGGGAAGA ACAGCGAGCG GGTCGCATGT ATTGGCGGTG GTGGTAGTAC CACATACTAT 180
GCCGACTCCG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCCAAGACA ACGCCAAGAA CACGGTGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGTCTGAA ACCTGAGGAC ACTGCCAAAT ACATCTGTGC GGCCGGGACC 300
TGGGACACTT ATGGATATGA CTATAACTAC TGGGGCCCGG GGACCCAGGT CACCGTCTCC 360
TCAGAACCTA AGTCCTGTGA CAAGACCCAC ACCTGTCCAC CTTGTCCTGC TCCAGAGCTG 420
CTTGGAGGTC CAAGCGTGTT CCTGTTTCCT CCCAAACCTA AGGACACCCT GATGATCTCC 480
AGGACACCAG AAGTGACCTG TGTCGTTGTG GACGTCTCTC ACGAGGATCC TGAGGTGAAG 540
TTCAACTGGT ATGTGGATGG TGTGGAGGTC CACAATGCCA AGACCAAACC CAGAGAGGAA 600
CAGTACAACA GCACCTACAG AGTCGTGAGT GTGTTGACCG TGCTGCATCA AGACTGGCTG 660
AATGGCAAGG AATATAAGTG CAAAGTGAGC AACAAAGCAC TTCCTGCTCC CATCGAGAAG 720
ACCATCTCCA AAGCCAAAGG ACAACCTAGA GAACCTCAAG TCTACACCCT GCCACCCTCC 780
AGAGAAGAGA TGACCAAAAA CCAAGTGTCT CTGACCTGTC TTGTCAAAGG CTTCTATCCC 840
TCTGACATTG CTGTGGAGTG GGAGAGCAAT GGACAACCTG AGAACAACTA TAAGACCACA 900
CCACCTGTCC TGGACAGTGA TGGCTCCTTC TTTCTGTATA GTAAGCTGAC AGTGGACAAG 960
AGCAGGTGGC AGCAAGGCAA TGTCTTCTCC TGCAGTGTGA TGCATGAAGC CTTGCACAAC 1020
CACTACACCC AGAAGAGCCT GTCTTTGTCT CCTGGCAAG 1059
SEQ ID NO:22.
<210> 22
<211> 1506
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>нуклеотидная последовательность фьюжн антитела 1, представляющего собой
однодоменное антитело 1, модифицированное Fc-фрагментом
<400>
GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTGCAGC CTGGGGGGTC TGTGAGACTC 60
TCCTGTGCAG CCTCTGGATA CACCTACAGT AGCTACTGCA TGGGCTGGTT CCGCCAGGCT 120
CCAGGGAAGG AGCGCGAGGG GGTCGCAGCT ATCGGCAGGG ATGGTATGAC AAGCTACGCA 180
GACTCCGTGA AGGGCCGATT CACCATCTCC CGAGACAACG CCAAGAACAC GCTGTATCTC 240
GAAATGAACA GCCTGAAACC TGAGGACACG GCCATGTATT ACTGTGCGGC CGCCGGCGGT 300
AACTGGTACG GGTACAGCCT AATGGAGTAT GACTTTGGTT ACTGGGGCCA GGGGACCCAG 360
GTCACCGTCT CCTCAGGTGG TGGCGGATCA GGTGGAGGTG GATCTGGCGG CGGCGGCTCA 420
GGCGGAGGAG GTTCCGAGGT GCAGCTGGTG GAGTCTGGGG GAGGCTTGGT GCAGCCTGGG 480
GGGTCTGTGA GACTCTCCTG TGCAGCCTCT GGATACACCT ACAGTAGCTA CTGCATGGGC 540
TGGTTCCGCC AGGCTCCAGG GAAGGAGCGC GAGGGGGTCG CAGCTATCGG CAGGGATGGT 600
ATGACAAGCT ACGCAGACTC CGTGAAGGGC CGATTCACCA TCTCCCGAGA CAACGCCAAG 660
AACACGCTGT ATCTCGAAAT GAACAGCCTG AAACCTGAGG ACACGGCCAT GTATTACTGT 720
GCGGCCGCCG GCGGTAACTG GTACGGGTAC AGCCTAATGG AGTATGACTT TGGTTACTGG 780
GGCCAGGGGA CCCAGGTCAC CGTCTCCTCA GAACCTAAGT CCTGTGACAA GACCCACACC 840
TGTCCACCTT GTCCTGCTCC AGAGCTGCTT GGAGGTCCAA GCGTGTTCCT GTTTCCTCCC 900
AAACCTAAGG ACACCCTGAT GATCTCCAGG ACACCAGAAG TGACCTGTGT CGTTGTGGAC 960
GTCTCTCACG AGGATCCTGA GGTGAAGTTC AACTGGTATG TGGATGGTGT GGAGGTCCAC 1020
AATGCCAAGA CCAAACCCAG AGAGGAACAG TACAACAGCA CCTACAGAGT CGTGAGTGTG 1080
TTGACCGTGC TGCATCAAGA CTGGCTGAAT GGCAAGGAAT ATAAGTGCAA AGTGAGCAAC 1140
AAAGCACTTC CTGCTCCCAT CGAGAAGACC ATCTCCAAAG CCAAAGGACA ACCTAGAGAA 1200
CCTCAAGTCT ACACCCTGCC ACCCTCCAGA GAAGAGATGA CCAAAAACCA AGTGTCTCTG 1260
ACCTGTCTTG TCAAAGGCTT CTATCCCTCT GACATTGCTG TGGAGTGGGA GAGCAATGGA 1320
CAACCTGAGA ACAACTATAA GACCACACCA CCTGTCCTGG ACAGTGATGG CTCCTTCTTT 1380
CTGTATAGTA AGCTGACAGT GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AAGGCAATGT CTTCTCCTGC 1440
AGTGTGATGC ATGAAGCCTT GCACAACCAC TACACCCAGA AGAGCCTGTC TTTGTCTCCT 1500
GGCAAG 1506
SEQ ID NO:23.
<210>23
<211>1482
<212>DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>нуклеотидная последовательность фьюжн антитела 2, представляющего собой
однодоменное антитело 2, модифицированное Fc-фрагментом
<400>
GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC TCGGTGCAGG CTGGAGGGTC TCTGAGACTC 60
TCCTGTGTAG CGTCTGGATA CACCTACTGC AGTTACGACA TGAGTTGGTA CCGCCAGGCT 120
CCAGGGAAGG AGCGCGAGTT CGTTTCAATT ATTCGCCGTG ATGGTTCTAC GGCGTACACA 180
GACGCCGTGA AGGGCCGATT CGCCATCTCC CGAGACAACG CCAAGAACAC ACTGTATCTG 240
CAAATGAACA GCCTGGAACC TGAGGACACG GCCATGTATT ACTGTAAATC TTGGGCTTGC 300
AGCAGCGGTG AATACTTGTA TCAGGGCGAC TGGGGCCAGG GGACCCAGGT CACCGTCTCC 360
TCAGGTGGTG GCGGATCAGG TGGAGGTGGA TCTGGCGGCG GCGGCTCAGG CGGAGGAGGT 420
TCCGAGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTCGGTGC AGGCTGGAGG GTCTCTGAGA 480
CTCTCCTGTG TAGCGTCTGG ATACACCTAC TGCAGTTACG ACATGAGTTG GTACCGCCAG 540
GCTCCAGGGA AGGAGCGCGA GTTCGTTTCA ATTATTCGCC GTGATGGTTC TACGGCGTAC 600
ACAGACGCCG TGAAGGGCCG ATTCGCCATC TCCCGAGACA ACGCCAAGAA CACACTGTAT 660
CTGCAAATGA ACAGCCTGGA ACCTGAGGAC ACGGCCATGT ATTACTGTAA ATCTTGGGCT 720
TGCAGCAGCG GTGAATACTT GTATCAGGGC GACTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC 780
TCCTCAGAAC CTAAGTCCTG TGACAAGACC CACACCTGTC CACCTTGTCC TGCTCCAGAG 840
CTGCTTGGAG GTCCAAGCGT GTTCCTGTTT CCTCCCAAAC CTAAGGACAC CCTGATGATC 900
TCCAGGACAC CAGAAGTGAC CTGTGTCGTT GTGGACGTCT CTCACGAGGA TCCTGAGGTG 960
AAGTTCAACT GGTATGTGGA TGGTGTGGAG GTCCACAATG CCAAGACCAA ACCCAGAGAG 1020
GAACAGTACA ACAGCACCTA CAGAGTCGTG AGTGTGTTGA CCGTGCTGCA TCAAGACTGG 1080
CTGAATGGCA AGGAATATAA GTGCAAAGTG AGCAACAAAG CACTTCCTGC TCCCATCGAG 1140
AAGACCATCT CCAAAGCCAA AGGACAACCT AGAGAACCTC AAGTCTACAC CCTGCCACCC 1200
TCCAGAGAAG AGATGACCAA AAACCAAGTG TCTCTGACCT GTCTTGTCAA AGGCTTCTAT 1260
CCCTCTGACA TTGCTGTGGA GTGGGAGAGC AATGGACAAC CTGAGAACAA CTATAAGACC 1320
ACACCACCTG TCCTGGACAG TGATGGCTCC TTCTTTCTGT ATAGTAAGCT GACAGTGGAC 1380
AAGAGCAGGT GGCAGCAAGG CAATGTCTTC TCCTGCAGTG TGATGCATGA AGCCTTGCAC 1440
AACCACTACA CCCAGAAGAG CCTGTCTTTG TCTCCTGGCA AG 1482
SEQ ID NO:24.
<210>24
<211>1482
<212>DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>нуклеотидная последовательность фьюжн антитела 3, представляющего собой
однодоменное антитело 3, модифицированное Fc-фрагментом
<400>
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTC 60
TCCTGTACAG CCTCTGGAGA CACCGACATG ACGAACTCCA TGGGCTGGTT CCGCCAGGCT 120
CCAGGGAAGA ACAGCGAGCG GGTCGCATGT ATTGGCGGTG GTGGTAGTAC CACATACTAT 180
GCCGACTCCG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCCAAGACA ACGCCAAGAA CACGGTGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGTCTGAA ACCTGAGGAC ACTGCCAAAT ACATCTGTGC GGCCGGGACC 300
TGGGACACTT ATGGATATGA CTATAACTAC TGGGGCCCGG GGACCCAGGT CACCGTCTCC 360
TCAGGTGGTG GCGGATCAGG TGGAGGTGGA TCTGGCGGCG GCGGCTCAGG CGGAGGAGGT 420
TCCCAGGTGC AGCTGGTGCA GTCTGGGGGA GGCTCGGTGC AGGCTGGAGG GTCTCTGAGA 480
CTCTCCTGTA CAGCCTCTGG AGACACCGAC ATGACGAACT CCATGGGCTG GTTCCGCCAG 540
GCTCCAGGGA AGAACAGCGA GCGGGTCGCA TGTATTGGCG GTGGTGGTAG TACCACATAC 600
TATGCCGACT CCGTGAAGGG CCGATTCACC ATCTCCCAAG ACAACGCCAA GAACACGGTG 660
TATCTGCAAA TGAACAGTCT GAAACCTGAG GACACTGCCA AATACATCTG TGCGGCCGGG 720
ACCTGGGACA CTTATGGATA TGACTATAAC TACTGGGGCC CGGGGACCCA GGTCACCGTC 780
TCCTCAGAAC CTAAGTCCTG TGACAAGACC CACACCTGTC CACCTTGTCC TGCTCCAGAG 840
CTGCTTGGAG GTCCAAGCGT GTTCCTGTTT CCTCCCAAAC CTAAGGACAC CCTGATGATC 900
TCCAGGACAC CAGAAGTGAC CTGTGTCGTT GTGGACGTCT CTCACGAGGA TCCTGAGGTG 960
AAGTTCAACT GGTATGTGGA TGGTGTGGAG GTCCACAATG CCAAGACCAA ACCCAGAGAG 1020
GAACAGTACA ACAGCACCTA CAGAGTCGTG AGTGTGTTGA CCGTGCTGCA TCAAGACTGG 1080
CTGAATGGCA AGGAATATAA GTGCAAAGTG AGCAACAAAG CACTTCCTGC TCCCATCGAG 1140
AAGACCATCT CCAAAGCCAA AGGACAACCT AGAGAACCTC AAGTCTACAC CCTGCCACCC 1200
TCCAGAGAAG AGATGACCAA AAACCAAGTG TCTCTGACCT GTCTTGTCAA AGGCTTCTAT 1260
CCCTCTGACA TTGCTGTGGA GTGGGAGAGC AATGGACAAC CTGAGAACAA CTATAAGACC 1320
ACACCACCTG TCCTGGACAG TGATGGCTCC TTCTTTCTGT ATAGTAAGCT GACAGTGGAC 1380
AAGAGCAGGT GGCAGCAAGG CAATGTCTTC TCCTGCAGTG TGATGCATGA AGCCTTGCAC 1440
AACCACTACA CCCAGAAGAG CCTGTCTTTG TCTCCTGGCA AG 1482
<---
1. Однодоменное антитело, специфически связывающееся с RBDS белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 3.
2. Олигомеризованное однодоменное антитело, специфически связывающееся с RBDS белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью, содержащее в качестве мономерного блока однодоменное антитело по п.1 и имеющее конечную аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, или SEQ ID NO: 5, или SEQ ID NO: 6.
3. Антитело, представляющее собой однодоменное антитело по п.1, слитое с Fc-фрагментом иммуноглобулина G1 человека, специфически связывающееся с RBDS белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью, имеющее конечную аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, или SEQ ID NO: 8, или SEQ ID NO: 9.
4. Олигомеризованное антитело, представляющее собой олигомеризованное однодоменное антитело по п.2, слитое с Fc-фрагментом иммуноглобулина G1 человека, специфически связывающееся с RBDS белка вируса SARS-CoV-2 и обладающее вируснейтрализующей активностью и имеющее конечную аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, или SEQ ID NO: 11, или SEQ ID NO: 12.
5. Способ терапии или экстренной профилактики заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2, заключающийся во введении в организм млекопитающих в эффективном количестве антитела по любому из пп.1-4.
