Пептид, полученный из depdc1, и содержащая его вакцина



Пептид, полученный из depdc1, и содержащая его вакцина
Пептид, полученный из depdc1, и содержащая его вакцина
Пептид, полученный из depdc1, и содержащая его вакцина
Пептид, полученный из depdc1, и содержащая его вакцина
Пептид, полученный из depdc1, и содержащая его вакцина
Пептид, полученный из depdc1, и содержащая его вакцина
Пептид, полученный из depdc1, и содержащая его вакцина
Пептид, полученный из depdc1, и содержащая его вакцина
Пептид, полученный из depdc1, и содержащая его вакцина
Пептид, полученный из depdc1, и содержащая его вакцина
Пептид, полученный из depdc1, и содержащая его вакцина
Пептид, полученный из depdc1, и содержащая его вакцина
Пептид, полученный из depdc1, и содержащая его вакцина
Пептид, полученный из depdc1, и содержащая его вакцина
Пептид, полученный из depdc1, и содержащая его вакцина

Владельцы патента RU 2765574:

ОНКОТЕРАПИ САЙЕНС, ИНК. (JP)

Изобретение относится к области биохимии, в частности к пептиду, содержащему менее чем 15 аминокислот, со способностью индуцировать цитотоксическую T-клетку (ЦТЛ) в присутствии антигенпрезентирующей(-их) клетки(-ок), экспрессирующей(-их) HLA-A*1101. Раскрыты полинуклеотид, кодирующий указанный пептид; композиция, эмульсия, набор, содержащие указанный полипептид; антигенпрезентирующие клетки, содержащие указанный полипептид. Так же раскрыты способы индуцирования иммунного ответа, лечения или профилактики, с помощью указанного пептида, способ скрининга на пептид; применение подходящей дозы указанного пептида. Изобретение позволяет эффективно лечить заболевания, ассоциированные с фактором HLA-A*1101. 13 н. и 8 з.п. ф-лы, 9 ил., 6 табл., 3 пр.

 

[Область техники]

Настоящее изобретение относится к области биологической науки, более конкретно, к области терапии злокачественных опухолей. В частности, настоящее изобретение относится к новым пептидам, которые очень эффективны в качестве противоопухолевых вакцин, к способам для лечения и/или профилактики опухолей с использованием пептида/пептидов, и фармацевтическим композициям, содержащим пептид(-ы).

[Предшествующий уровень техники]

Было показано, что CD8-положительные цитотоксические T-лимфоциты (ЦТЛ) распознают эпитопные пептиды, полученные из опухолеассоциированных антигенов (TAA) и обнаруженные на молекуле главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I, а затем убивают опухолевые клетки. С момента открытия семейства антигенов меланомы (MAGE) с использованием иммунологических подходов было обнаружено много других TAA (NPL1: Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80; NPL2: Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9). Некоторые из этих TAA в настоящее время проходят клиническую разработку в качестве мишеней для иммунотерапии.

В некоторых из этих TAA были выявлены эпитопные пептиды, которые могут распознаваться ЦТЛ, и планируется их применение в иммунотерапии для различных типов злокачественных опухолей (NPL3: Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; NPL4: Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; NPL5: Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; NPL6: van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9) 3308-14; NPL7: Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; NPL8: Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; NPL9: Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 439-66; NPL10: Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94). До настоящего времени, было зарегистрировано несколько клинических испытаний с использованием этих эпитопных пептидов для ЦТЛ, полученных из TAA. К сожалению, многие из этих клинических испытаний показали низкую частоту объективных ответов (NPL11: Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; NPL12: Coulie ПГ et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; NPL13: Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15). Таким образом, все еще существует потребность в выявлении новых эпитопов для ЦТЛ, которые можно использовать в иммунотерапии злокачественных опухолей.

DEPDC1 (белок 1, содержащий DEP-домен); референсная последовательность: GeneBank, номер доступа NM_001114120 (SEQ ID NO: 113) или номер доступа GeneBank NM_017779 (SEQ ID NO: 115)) идентифицируют как ген с повышенным уровнем экспрессии при раке мочевого пузыря при помощи анализа профиля экспрессии генов с использованием полногеномной кДНК (NPL14: Kanehira M et al., Oncogene 2007,26(44):6448-55). Наблюдали, что экспрессия DEPDC1 специфически повышена в опухолевых клетках более чем у 80% пациентов с раком мочевого пузыря, но он не экспрессируется в других здоровых важных органах, за исключением яичка. Дополнительно, показано, что клеточная пролиферация в клеточных линиях рака мочевого пузыря подавляется в результате подавления экспрессии DEPDC1 при помощи миРНК (PTL1: WO2006/085684).

Недавно были идентифицированы эпитопные пептиды для ЦТЛ, полученные из DEPDC1 и рестриктированные по HLA-A24 и HLA-A2 (PTL2: WO2008/047473). Эти пептиды эффективны у пациентов со злокачественными опухолями, имеющих тип HLA-A24 или HLA-A2, но нельзя ожидать, чтобы они оказывали эффект у пациентов со злокачественными опухолями, у которых нет этих типов HLA.

[Список цитирования]

[Патентная литература]

[PTL 1] WO2006/085684

[PTL2] WO2008/047473

[PTL3] WO2011/067920

[Непатентная литература]

[NPL 1] Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80

[NPL 2] Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9

[NPL 3] Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55

[NPL 4] Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42

[NPL 5] Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9

[NPL 6] van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14

[NPL 7] Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8

[NPL 8] Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72

[NPL 9] Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66

[NPL 10] Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94

[NPL 11] Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80

[NPL 12] Coulie ПГ et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42

[NPL 13] Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15

[NPL 14] Kanehira M et al., Oncogene 2007,26(44):6448-55

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к пептидам, которые могут индуцировать ЦТЛ, специфичные к DEPDC1-экспрессирующим клеткам. Когда эти пептиды презентируются на антигенпрезентирующих клетках (АПК) при помощи лейкоцитарного антигена человека (HLA), индуцируются ЦТЛ, которые демонстрируют специфическую цитотоксическую активность против DEPDC1-экспрессирующих клеток. Пептиды, полученные из DEPDC1, которые были идентифицированы к настоящему времени, как имеющие способность индуцировать ЦТЛ (индуцибельность ЦТЛ), являются или HLA-A2-рестриктированными или HLA-A24-рестриктированными пептидами, и не могут индуцировать ЦТЛ против клеток, которые не экспрессируют эти HLA. Таким образом, известные пептиды не подходят для проведения иммунотерапии у индивидуумов, у которых нет этих HLA. HLA-A11 представляет собой аллель, который часто встречается у азиатов (Sette A, Sidney J., Immunogenetics 1999, 50: 201-12), и HLA-A01 представляет собой аллель, которые часто встречается у европеоидов (Cao et al., Hum Immunol 2001; 62(9): 1009-30). Желательно вводить HLA-A11-рестриктированные пептиды HLA-A11-положительным индивидуумам, и HLA-A01-рестриктированные пептиды HLA-A01-положительным индивидуумам. Таким образом, настоящее изобретение относится к пептидам, полученным из DEPDC1 и способным индуцировать ЦТЛ, и которые являются рестриктированными по HLA-A11 или HLA-A01. На основании результатов, описываемых в настоящем документе, было доказано, что пептиды по настоящему изобретению являются эпитопными пептидами, которые могут индуцировать мощный и специфический иммунный ответ против клеток, экспрессирующих DEPDC1 и HLA-A11 или HLA-A01.

Таким образом, одной задач по настоящему изобретению является создание пептидов, полученных из DEPDC1, которые могут индуцировать ЦТЛ ограничительно по HLA-A11 или HLA-A01. Эти пептиды можно использовать для индуцирования ЦТЛ in vitro, ex vivo или in vivo, или можно использовать для введения индивидуумам с целью индуцирования иммунного ответа против DEPDC1-экспрессирующих злокачественных клеток. Предпочтительными пептидами являются пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из числа SEQ ID NO: 1, 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107, и 108; более предпочтительными пептидами являются нонапептиды, декапептиды, или ундекапептиды; и еще более предпочтительными пептидами являются пептиды, состоящие из аминокислотной последовательности, выбранной из числа SEQ ID NO: 1, 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107 и 108.

Пептиды по настоящему изобретению включают пептиды, в которых одна, две или более аминокислот замещены, удалены, вставлены и/или добавлены, при условии, что полученные модифицированные пептиды сохраняют способность исходного пептида индуцировать ЦТЛ.

Настоящее изобретение дополнительно относится к изолированным полинуклеотидам, кодирующим любой один из пептидов по настоящему изобретению. Аналогично пептидам по настоящему изобретению, эти полинуклеотиды можно использовать для индуцирования АПК со способностью индуцировать ЦТЛ, и можно вводить индивидуумам для индуцирования иммунного ответа против DEPDC1-экспрессирующих злокачественных клеток.

Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим один или несколько типов пептидов по настоящему изобретению, один или несколько типов полинуклеотидов, кодирующих один или несколько типов пептидов по настоящему изобретению, АПК по настоящему изобретению, экзосомы, презентирующие пептиды по настоящему изобретению, и/или ЦТЛ по настоящему изобретению. Композиции по настоящему изобретению предпочтительно являются фармацевтическими композициями. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно использовать для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, а также для профилактики послеоперационных рецидивов злокачественной опухоли. Их также можно использовать для индуцирования иммунного ответа против злокачественной опухоли. При введении индивидууму, пептид по настоящему изобретению презентируется на поверхности АПК, и в результате индуцируются ЦТЛ, нацеленные на пептид. Таким образом, другой задачей по настоящему изобретению является создание композиций, которые индуцируют ЦТЛ, где композиции содержат один или несколько типов пептидов по настоящему изобретению, один или несколько типов полинуклеотидов, кодирующих один или несколько типов пептидов по настоящему изобретению, АПК по настоящему изобретению и/или экзосомы, презентирующие пептиды по настоящему изобретению.

Следующей задачей по настоящему изобретению является создание способов индуцирования АПК, имеющих способность индуцировать ЦТЛ, где способы включают этап контакта одного или нескольких типов пептидов по настоящему изобретению с АПК, или этап введения полинуклеотида, кодирующего любой один пептид по настоящему изобретению, в АПК.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу индуцирования ЦТЛ, включающему этап совместного культивирования CD8-положительной T-клетки с АПК, которая презентирует на поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению, этап совместного культивирования CD8-положительной T-клетки с экзосомой, которая презентирует на поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению, или этап введения в CD8-положительную T-клетку вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий каждую субъединицу T-клеточного рецептора (TCR), способного связываться с пептидом по настоящему изобретению, который презентируется посредством антигена HLA на клеточной поверхности. Предпочтительным антигеном HLA в настоящем изобретении является HLA-A11 или HLA-A01.

Следующей задачей по настоящему изобретению является получение изолированных АПК, которые презентируют на поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению. Настоящее изобретение дополнительно относится к изолированным ЦТЛ, нацеленным на пептид по настоящему изобретению. Эти АПК и ЦТЛ можно использовать в иммунотерапии для DEPDC1-экспрессирующих злокачественных опухолей. В настоящем изобретении, злокачественная опухоль, которую лечат иммунотерапией, является, например, злокачественной опухолью у пациентом, гомозиготных или гетерозиготных по HLA-A11 или HLA-A01. Следовательно, АПК также представляют собой клетки с гетерозиготой или гомозиготой по HLA-A11 или HLA-A01. Таким образом, настоящее изобретение относится к иммунотерапии для злокачественных опухолей, экспрессирующих DEPDC1 и антиген HLA, выбранный из HLA-A11 и HLA-A01.

Другой задачей по настоящему изобретению является создание способов индуцирования иммунного ответа против злокачественной опухоли у индивидуума, где способы включают этап введения индивидууму пептида/пептидов по настоящему изобретению, полинуклеотида/полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы), АПК по настоящему изобретению, экзосомы/экзосом, презентирующих пептид(-ы) по настоящему изобретению, и/или ЦТЛ по настоящему изобретению. Другой задачей по настоящему изобретению является создание способов для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, а также для профилактики послеоперационных рецидивов злокачественной опухоли у индивидуума, где способы включают этап введения индивидууму пептида/пептидов по настоящему изобретению, полинуклеотида/полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы), АПК по настоящему изобретению, экзосомы/экзосом, презентирующих пептид(-ы) по настоящему изобретению, и/или ЦТЛ по настоящему изобретению.

В дополнение к вышеизложенному, другие задачи и признаки настоящего изобретения станут более очевидными после прочтения последующего подробного описания в сочетании с сопутствующими фигурами и примерами. Однако следует понимать, что как указанная выше сущность по настоящему изобретению, так и последующее подробное описание являются примерами вариантов осуществления, и не ограничивают настоящее изобретение или другие альтернативные варианты осуществления настоящего изобретения. В частности, хотя настоящее изобретение описано в настоящем документе со ссылкой на ряд конкретных вариантов осуществления, следует понимать, что описание является иллюстративным по отношению к настоящему изобретению и не ограничивает настоящее изобретение. Специалисту в данной области могут прийти на ум различные модификации и применения, в пределах сущности и объема по настоящему изобретению, описанных в прилагаемой формуле изобретения. Кроме того, другие цели, особенности, выгоды и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из сущности и определенных вариантов осуществления, описанных ниже, и будут легко понятны специалистам в данной области. Такие цели, особенности, выгоды и преимущества будут понятны из вышеизложенного в сочетании с сопутствующими примерами, данными, фигурами и всеми разумными выводами, вытекающими из них, по отдельности или с учетом ссылок, включенных в настоящий документ.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 состоит из фотографий от (a) до (b), показывающих результаты анализа способом иммуноферментных пятен (ELISPOT) с интерфероном (IFN)-гамма на ЦТЛ, индуцированных при помощи пептидов, полученных из DEPDC1. По сравнению с контролем, ЦТЛ в лунке #4 с DEPDC1-A11-9-627 (SEQ ID NO: 1) (a) показали активную выработку IFN-гамма. На этих фотографиях, квадрат на лунках показывает, что клетки из соответствующих лунок выращивали для создания линий ЦТЛ. Напротив, DEPDC1-A11-9-258 (SEQ ID NO: 2) (b) показан как пример типичных отрицательных данных, где не было специфической выработки IFN-гамма. На фигуре, «+» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующим пептидом; и «-» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, которые не были активированы ни одним из пептидов.

Фиг. 2 представляет собой линейный график, показывающий результаты твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с IFN-гамма, подтверждающего выработку IFN-гамма в линиях ЦТЛ, стимулированных DEPDC1-A11-9-627 (SEQ ID NO: 1). Эти результаты подтверждают, что линии ЦТЛ, полученные путем стимуляции DEPDC1-A11-9-627 (SEQ ID NO: 1), демонстрируют активную выработку IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигуре, «+» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных DEPDC1-A11-9-627 (SEQ ID NO: 1); и «-» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, которые не были активированы ни одним из пептидов. Соотношение R/S указывает на соотношение числа клеток линий ЦТЛ (клетки-респондеры) и числа клеток-мишеней (клетки-стимуляторы).

Фиг. 3 представляет собой линейный график, показывающий выработку IFN-гамма в клонах ЦТЛ, полученных при серийных разведениях из линий ЦТЛ, стимулированных DEPDC1-A11-9-627 (SEQ ID NO: 1). Этот результат подтверждает, что линии ЦТЛ, полученные путем стимуляции DEPDC1-A11-9-627 (SEQ ID NO: 1), демонстрируют активную выработку IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигуре, «+» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных DEPDC1-A11-9-627 (SEQ ID NO: 1); и «-» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, которые не были активированы ни одним из пептидов. Соотношение R/S указывает на соотношение числа клеток линий ЦТЛ (клетки-респондеры) и числа клеток-мишеней (клетки-стимуляторы).

Фиг. 4 представляет собой линейный график, показывающий специфическую активность ЦТЛ против клеток-мишеней, экспрессирующих и DEPDC1, и HLA-A*1101. Клетки COS7, трансфицированные или HLA-A*1101, или полноразмерным геном DEPDC1, получали в качестве контроля. Клон ЦТЛ, полученный при помощи DEPDC1-A11-9-627 (SEQ ID NO: 1), продемонстрировал специфическую активность ЦТЛ против клеток COS7, трансфицированных и DEPDC1, и HLA-A*1101 (черный ромб). С другой стороны, не было выявлено значительной специфической активности ЦТЛ против клеток-мишеней, трансфицированных либо HLA-A*1101 (белый треугольник), либо DEPDC1 (белый круг).

Фиг. 5-1 состоит из фотографий от (a) до (x), показывающих результаты анализа ELISPOT с IFN-гамма на ЦТЛ, индуцированных при помощи пептидов, полученных из DEPDC1. По сравнению с контролем, ЦТЛ в лунке #6 с DEPDC1-A01-9-239 (SEQ ID NO: 81) (a), лунке #5 с DEPDC1-A01-9-46 (SEQ ID NO: 82) (b), Лунке #3 с DEPDC1-A01-9-516 (SEQ ID NO: 21) (c), Лунке #3 с DEPDC1-A01-9-781 (SEQ ID NO: 83) (d), Лунке #7 с DEPDC1-A01-9-571 (SEQ ID NO: 84) (e), Лунке #2 с DEPDC1-A01-9-96 (SEQ ID NO: 85) (f), Лунке #4 с DEPDC1-A01-9-260 (SEQ ID NO: 86) (г), Лунке #7 с DEPDC1-A01-9-767 (SEQ ID NO: 87) (h), Лунке #8 с DEPDC1-A01-9-291 (SEQ ID NO: 88) (i), Лунке #6 с DEPDC1-A01-9-311 (SEQ ID NO: 89) (j), Лунке #3 с DEPDC1-A01-10-690 (SEQ ID NO: 90) (k), Лунке #6 с DEPDC1-A01-10-2 (SEQ ID NO: 91) (l), Лунке #3 с DEPDC1-A01-10-259 (SEQ ID NO: 58) (m), Лунке #1 с DEPDC1-A01-10-45 (SEQ ID NO: 92) (n), Лунке #6 с DEPDC1-A01-10-712 (SEQ ID NO: 96) (o), Лунке #7 с DEPDC1-A01-10-188 (SEQ ID NO: 99) (p), Лунке #6 с DEPDC1-A01-10-470 (SEQ ID NO: 101) (q), Лунке #6 с DEPDC1-A01-10-456 (SEQ ID NO: 102) (r), Лунке #4 с DEPDC1-A01-10-679 (SEQ ID NO: 103) (s), Лунке #2 с DEPDC1-A01-10-341 (SEQ ID NO: 104) (t), Лунке #3 с DEPDC1-A01-10-183 (SEQ ID NO: 106) (u), Лунке #6 с DEPDC1-A01-10-286 (SEQ ID NO: 107) (v), и Лунке #8 с DEPDC1-A01-11-44 (SEQ ID NO: 108) (w) показали активную выработку IFN-гамма. На этих фотографиях, квадрат на лунках показывает, что клетки из соответствующих лунок выращивали для создания линий ЦТЛ. Напротив, DEPDC1-A01-10-780 (SEQ ID NO: 94) (x показан как пример типичных отрицательных данных, где не было специфической выработки IFN-гамма. На фигуре, «+» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующим пептидом; и «-» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, которые не были активированы ни одним из пептидов.

Фиг. 5-2 показывает продолжение Фиг. 5-1 (фотографии с (m) по (x)).

Фиг. 6 представляет собой линейный график, показывающий результаты ELISA с IFN-гамма, подтверждающие выработку IFN-гамма в линиях ЦТЛ, стимулированных DEPDC1-A01-11-44 (SEQ ID NO: 108). Этот результат подтверждает, что линия ЦТЛ, полученная путем стимуляции DEPDC1-A01-11-44 (SEQ ID NO: 108), демонстрирует активную выработку IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигуре, «+» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующим пептидом; и «-» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, которые не были активированы ни одним из пептидов. Соотношение R/S указывает на соотношение числа клеток линий ЦТЛ (клетки-респондеры) и числа клеток-мишеней (клетки-стимуляторы).

Фиг. 7 представляет собой линейный график, показывающий выработку IFN-гамма в клоне ЦТЛ, полученном при серийных разведениях из линии ЦТЛ, стимулированной DEPDC1-A01-11-44 (SEQ ID NO: 108). Этот результат подтверждает, что клон ЦТЛ, полученный путем стимуляции DEPDC1-A01-11-44 (SEQ ID NO: 108) демонстрирует активную выработку IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигуре, «+» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующим пептидом; и «-» показывает выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, которые не были активированы ни одним из пептидов. Соотношение R/S указывает на соотношение числа клеток линий ЦТЛ (клетки-респондеры) и числа клеток-мишеней (клетки-стимуляторы).

Фиг. 8 представляет собой линейный график, показывающий показывающих специфическую активность ЦТЛ против клеток-мишеней, экспрессирующих и DEPDC1, и HLA-A*0101. Клетки COS7, трансфицированные или HLA-A*0101, или полноразмерным геном DEPDC1 получали в качестве контроля. Клон ЦТЛ, полученный при помощи DEPDC1-A01-11-44 (SEQ ID NO: 108), демонстрировал специфическую активность ЦТЛ против клеток COS7, трансфицированных и DEPDC1, и HLA-A*0101 (черный ромб). С другой стороны, не было выявлено значительной специфической активности ЦТЛ против клеток-мишеней, трансфицированных либо HLA-A*0101 (белый треугольник), либо DEPDC1 (белый круг).

[Способ осуществления изобретения]

Описание вариантов осуществления

Хотя в практическом осуществлении или тестировании вариантов осуществления настоящего изобретения можно использовать любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, что описаны в настоящем документе, предпочтительные способы, устройства и материалы описаны в настоящем документе. Однако перед тем как будут описаны материалы и способы по настоящему изобретению, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными размерами, формами, измерениями, материалами, способами, протоколами, и т.д., описываемыми в настоящем документе, поскольку они могут варьировать в соответствии с рутинной экспериментальной деятельностью и оптимизацией. Также следует понимать, что терминология, применяемая в описании, предназначена только для описания конкретных версий или вариантов осуществления, и не предназначена для ограничения объема по настоящему изобретению, который ограничен только прилагаемой формулой изобретения.

I. Определения

Определители единственного числа, используемые в настоящем документе, означают «по меньшей мере, один», если конкретно не указано иное.

Термины «изолированный» и «очищенный», применяемые по отношению к веществу (например, пептиду, антителу, полинуклеотиду или т.п.), указывают на то, что вещество по существу не содержит, по меньшей мере, ни одно вещество, которое также может входить в натуральный источник. Таким образом, изолированный или очищенный пептид относится к пептиду, который по существу не содержит другой клеточный материал, например, углевод, липид и другие загрязняющие белки из источника клеток или ткани, из которого получают пептид. Если пептид синтезируют химическим путем, изолированный или очищенный пептид относится к пептиду, который по существу не содержит вещество-предшественник или другое химическое вещество. Фраза «по существу не содержит клеточный материал» включает получение пептида, при котором пептид отделяют от клеточных компонентов из клеток, из которых пептид выделен или где он был рекомбинантно произведен. Таким образом, пептид, который по существу не содержит клеточный материал, включает пептидные препараты, которые содержат менее чем приблизительно 30%, 20%, 10%, или 5%, 3%, 2% или 1% (на основании сухой массы) других клеточных материалов.

Если пептид производят рекомбинантным способом, изолированный или очищенный пептид, который по существу не содержит среду для культивирования, и пептид, который по существу не содержит среду для культивирования, включает пептидные препараты, которые содержат среду для культивирования, менее чем приблизительно 20%, 10% или 5%, 3%, 2% или 1% (на основании сухой массы) от объема пептидного препарата.

Альтернативно, если пептид синтезируют химическим путем, изолированный или очищенный пептид по существу не содержит вещество-предшественник или другое химическое вещество, и пептид, который по существу не содержит вещество-предшественник или другое химическое вещество, включает пептидные препараты, которые содержат вещество-предшественник или другие химические вещества, менее чем приблизительно 30%, 20%, 10%, 5%, 3%, 2% или 1% (на основании сухой массы) от объема пептидного препарата. То, что конкретный пептидный препарат является изолированным или очищенным можно подтверждать, например, при появлении одиночной полосы при электрофорезе с додецилсульфатом натрия (SDS) в полиакриламидном геле и окраске Кумасси бриллиантовым голубым или на подобном геле. В предпочтительном варианте осуществления пептиды и полинуклеотиды по настоящему изобретению являются изолированными или очищенными.

Термины «полипептид», «пептид» и «белок» в настоящем документе используются взаимозаменяемо, и относятся к полимерам из аминокислотных остатков. Эти термины также применяют к неприродным аминокислотным полимерам, содержащим один или несколько неприродных аминокислотных остатков, в дополнение к природным аминокислотным полимерам. Неприродные аминокислоты включают аналоги аминокислот, миметики аминокислот, и т.п.

Термин «аминокислота», применяемый в настоящем документе, относится к природным аминокислотам, а также аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют аналогично природным аминокислотам. Природными аминокислотами являются аминокислоты, которые кодируются генетическим кодом, а также аминокислоты, модифицированные после трансляции в клетках (например, гидроксипролин, гамма-карбоксиглутаминат, и O-фосфосерин, и т.д.). Фраза «аналог аминокислоты» относится к соединениям, которые имеют такую же основную химическую структуру (альфа углерод, связанный с водородом, карбоксигруппу, аминогруппу, и группу R), как и природная аминокислота, но имеют модифицированную R-группу или модифицированные остовы (например, гомосерин, норлейцин, метионин сульфоксид, метионин метил сульфоний, и т.п.). Фраза «миметик аминокислоты» относится к соединениям, которые имеют различные структуры, но аналогичные функции с основными аминокислотами. Аминокислоты могут быть или L-аминокислотами или D-аминокислотами, и пептиды по настоящему изобретению предпочтительно являются L-аминокислотными полимерами.

Термины «полинуклеотид», «олигонуклеотид» и «нуклеиновая кислота» используются взаимозаменяемо в настоящем документе, и относятся к полимеру из нуклеотидов.

Термин «композиция», применяемый в настоящем описании, предназначен для включения продуктов, которые содержат конкретно оговоренные ингредиенты в конкретно оговоренных количествах, и любых продуктов, полученных прямо или косвенно из комбинации конкретно оговоренных ингредиентов в конкретно оговоренных количествах. Если композиция представляет собой фармацевтическую композицию, термин «композиция» предназначен для включения продуктов, содержащих активный ингредиент/ингредиенты и инертный ингредиент/ингредиенты, а также любых продуктов, полученных прямо или косвенно из комбинации, комплексообразования или агрегации любых двух или более ингредиентов, из диссоциации одного или нескольких ингредиентов, или из реакций другого типа или взаимодействий одного или нескольких ингредиентов. Таким образом, фармацевтические композиции по настоящему изобретению включают в себя любые композиции, полученные путем смешивания соединений или клеток по настоящему изобретению с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем. Не являясь ограничивающими, термины «фармацевтически приемлемый носитель» или «физиологически приемлемый носитель», применяемые в настоящем описании, включают жидкие или твердые наполнители, разбавители, эксципиенты, растворители, и инкапсулирующие материалы; и означают фармацевтически или физиологически приемлемые материалы, композиции, вещества или среды.

Если не указано иначе, термин «злокачественная опухоль» относится к злокачественной опухоли, которая гиперэкспрессирует ген DEPDC1; и примеры таких опухолей включают рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, хронический миелолейкоз (ХМЛ), рак толстого кишечника, рак желудка, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, мелкоклеточный рак легких (SCLC), опухоль мягких тканей и т.п., не ограничиваясь вышеизложенными. В иллюстративном варианте осуществления «злокачественная опухоль» представляет собой злокачественную опухоль, которая экспрессирует DEPDC1 и HLA-A11 и/или HLA-A01.

Если не указано иначе, термины «цитотоксический T-лимфоцит» и «цитотоксическая T-клетка» и «ЦТЛ» используют взаимозаменяемо в настоящем документе. Если конкретно не указано иное, они относятся к подгруппе T-лимфоцитов, которая может распознавать «чужие» клетки (например, опухолевые/злокачественные клетки, вирус-инфицированные клетки) и индуцировать гибель таких клеток.

Если не указано иначе, термин «HLA-A11» относится к типу HLA-A11, который включает подтипы, такие как HLA-A*1101, HLA-A*1102, HLA-A*1103, и HLA-A*1104.

Если не указано иначе, термин «HLA-A01» относится к типу HLA-A01, который включает подтипы, такие как HLA-A*0101, HLA-A*0102, HLA-A*0103, и HLA-A*0104.

В отношении индивидуума или пациента, фраза «антиген HLA индивидуума (или пациента) представляет собой HLA-A11», применяемая в настоящем документе, указывает, что индивидуум или пациент имеет ген антигена HLA-A11 в гомозиготном или гетерозиготном состоянии как молекулу MHC (Главного комплекса гистосовместимости) класса I, и что антиген HLA-A11 экспрессируется в клетках индивидуума или пациента в виде антигена HLA. Аналогично, фраза «антиген HLA индивидуума (или пациента) представляет собой HLA-A01», применяемая в настоящем документе, указывает, что индивидуум или пациент имеет ген HLA-A01 в гомозиготном или гетерозиготном состоянии как молекулу MHC (Главного комплекса гистосовместимости) класса I, и что антиген HLA-A01 экспрессируется в клетках индивидуума или пациента в виде антигена HLA.

При условии, что способы и композиции по настоящему изобретению пригодны в отношении «лечения» злокачественной опухоли, лечение считается «эффективным», если оно достигает клинических преимуществ, например, уменьшение размера, распространения или метастатических свойств злокачественной опухоли, замедление прогрессирования злокачественной опухоли, ослабление клинических симптомов злокачественной опухоли, продление периода выживания, подавление послеоперационных рецидивов у индивидуума. Если лечение применяется профилактически, «эффективность» означает, что лечение замедляет или предотвращает образование злокачественной опухоли, или предупреждает или ослабляет клинические симптомы злокачественной опухоли. Эффективность определяют по отношению к любым общеизвестным способам для диагностики или лечения конкретного типа опухоли.

При условии, что способы и композиции по настоящему изобретению пригодны в отношении «предупреждения (профилактики)» злокачественной опухоли, термин «предупреждение (профилактика)» в настоящем документе включает любую работу, которая облегчает бремя смертности или заболеваемости, ассоциированных со злокачественными опухолями. Предупреждение (профилактику) можно проводить на «первичном, вторичном и третичном профилактических уровнях». В то время как первичное предупреждение (профилактика) помогает избежать развития заболевания, вторичное и третичное предупреждение (профилактика) включает в себя предупреждение (профилактику) прогрессирования заболевания и появления симптомов, а также деятельность, предназначенную для снижения неблагоприятных воздействий существующего заболевания путем восстановления функций и уменьшения осложнений, ассоциированных с заболеванием. С другой стороны, предупреждение (профилактика) может включать в себя ослабление тяжести конкретного нарушения, например, обширную профилактическую терапию, предназначенную для уменьшения роста опухоли и метастазирования.

В контексте настоящего изобретения, лечение и/или предупреждение (профилактика) злокачественной опухоли и/или предупреждение (профилактика) ее послеоперационного рецидива включают в себя любое из событий, таких как ингибирование пролиферации злокачественных клеток, инволюцию или регрессию опухоли, инициацию ремиссии и подавление развития злокачественной опухоли, регрессию опухоли, а также уменьшение или ингибирование метастазирования, подавление послеоперационных рецидивов злокачественной опухоли, и продление периода выживания. Эффективное лечение и/или предупреждение (профилактика) злокачественной опухоли снижает смертность, улучшает прогноз индивидуума со злокачественной опухолью, снижает уровень опухолевых маркеров в крови, и облегчает выявляемые симптомы, ассоциированные со злокачественной опухолью. Например, облегчение или улучшение симптомов составляет эффективное лечение и/или предупреждение (профилактику), и включает состояние, при котором симптомы стабильны или улучшены на 10%, 20%, 30% или больше.

В контексте настоящего изобретения, термин «антитело» относится к иммуноглобулинам и их фрагментам, которые специфически реакционноспособны по отношению к обозначенному белку или его пептиду. Антитело может включать антитела человека, приматизированные антитела, химерные антитела, биспецифические антитела, гуманизированные антитела, антитела, слитые с другими белками или радиоактивными метками, и фрагменты антител. Кроме того, «антитело» в настоящем документе используется в самом широком смысле и конкретно включает интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образованные из двух или более интактных антител, и фрагменты антител при условии, что они проявляют желательную биологическую активность. «Антитело» может быть антителами всех классов (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM).

Если не указано иначе, все технические термины и научные термины, применяемые в настоящем документе, имеют то же самое значение, в каком их обычно понимает специалист в области, к которой относится настоящее изобретение.

II. Пептиды

HLA-A11 представляет собой аллель, который часто встречается у азиатов (Sette A, Sidney J., Immunogenetics 1999, 50: 201-12), и HLA-A01 представляет собой аллель, который часто встречается у европеоидов (Cao et al., Hum Immunol 2001; 62(9): 1009-30). Таким образом, предлагается эффективный способ лечения DEPDC1-экспрессирующих злокачественных опухолей для большой популяции азиатов или европеоидов путем предоставления пептидов, полученных из DEPDC1, которые способны к индуцированию ЦТЛ и рестриктированы по HLA-A11 или HLA-A01. Таким образом, настоящее изобретение относится к пептидам, полученным из DEPDC1, которые способны индуцировать ЦТЛ ограничительно по HLA-A11 или HLA-A01.

Пептиды по настоящему изобретению представляют собой пептиды, полученные из DEPDC1, которые способны индуцировать ЦТЛ ограничительно по HLA-A11 или HLA-A01. Пептиды, способные индуцировать ЦТЛ ограничительно по HLA-A11, включают пептиды с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 1. Пептиды, способные индуцировать ЦТЛ ограничительно по HLA-A01, включают пептиды с аминокислотной последовательностью, выбранной из числа SEQ ID NO: 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107 и 108.

ЦТЛ с цитотоксической активностью, специфичные по отношению к этим пептидам, можно создавать при стимуляции Т-клеток in vitro дендритными клетками (DC), активированными этими пептидами. Полученные ЦТЛ демонстрируют специфическую цитотоксическую активность против клеток-мишеней, активированных каждым из пептидов.

Ген DEPDC1 сверхэкспрессирован в злокачественных клетках, таких как злокачественные клетки, например, при раке мочевого пузыря, раке молочной железы, раке шейки матки, холангиоцеллюлярном раке, хроническом миелолейкозе (ХМЛ), раке толстого кишечника, раке желудка, немелкоклеточном раке легких (NSCLC), лимфоме, остеосаркоме, раке простаты, мелкоклеточном раке легких (SCLC), опухоли мягких тканей и т.п., но не экспрессируется в большинстве здоровых органов. Таким образом, он представляет собой превосходную мишень для иммунотерапии. Таким образом, пептиды по настоящему изобретению могут быть подходящим образом использованы для иммунотерапии злокачественной опухоли. Предпочтительным пептидом является нонапептид (пептид, состоящий из 9 аминокислотных остатков), декапептид (пептид, состоящий из 10 аминокислотных остатков) или ундекапептид (пептид, состоящий из 10 аминокислотных остатков), и более предпочтительным является пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из числа SEQ ID NO: 1, 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107, и 108. Например, пептид с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 1 подходит для индуцирования ЦТЛ, демонстрирующих цитотоксическую активность против клеток, экспрессирующих HLA-A11 и DEPDC1, и может быть подходящим образом использован для иммунотерапии злокачественной опухоли у HLA-A11-положительных пациентов. В более предпочтительном варианте осуществления пептид по настоящему изобретению представляет собой пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Дополнительно, например, пептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из числа SEQ ID NO: 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107, и 108 подходит для индуцирования ЦТЛ, демонстрирующих цитотоксическую активность против клеток, экспрессирующих HLA-A01 и DEPDC1, и может быть подходящим образом использован для иммунотерапии злокачественной опухоли у HLA-A01-положительных пациентов. В более предпочтительном варианте осуществления пептид по настоящему изобретению представляет собой пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 108.

Для пептидов по настоящему изобретению, дополнительный аминокислотный остаток/остатки могут быть присоединены к аминокислотной последовательности пептида по настоящему изобретению, при условии, что полученные пептиды сохраняют способность исходного пептида индуцировать ЦТЛ. Дополнительный аминокислотный остаток/остатки могут состоять из любых типов аминокислот, при условии, что они не снижают способность исходного пептида индуцировать ЦТЛ. Таким образом, пептиды по настоящему изобретению включают пептиды, способные индуцировать ЦТЛ, состоящие из аминокислотной последовательности, выбранной из числа SEQ ID NO: 1, 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107 и 108. Такие пептиды состоят, например, менее чем из приблизительно 40 аминокислот, во многих случаях менее чем из приблизительно 20 аминокислот, и, как правило, менее чем из приблизительно 15 аминокислот. Таким образом, если исходный пептид представляет собой нонапептид, пептид по настоящему изобретению относится к пептидам, которые имеют 10 аминокислот в длину или 11-40 аминокислот в длину, которые получены добавлением дополнительной аминокислоты/аминокислот к пептиду. Более того, если исходный пептид представляет собой декапептид, пептид по настоящему изобретению относится к пептидам, которые имеют 11-40 аминокислот в длину. Кроме того, если исходный пептид представляет собой ундекапептид, пептид по настоящему изобретению относится к пептидам, которые имеют 12-40 аминокислот в длину. Такой пептид может быть, например, пептидом, который имеет 11-20 аминокислот в длину, или пептидом, который имеет 11-15 аминокислот в длину. Предпочтительным примером дополнительного аминокислотного остатка/остатков является аминокислотный остаток/остатки, примыкающие к аминокислотной последовательности пептида по настоящему изобретению в полноразмерной аминокислотной последовательности DEPDC1 (например, SEQ ID NO: 114 или 116). Таким образом, пептиды по настоящему изобретению включают пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из числа SEQ ID NO: 1, 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107 и 108, и где пептиды представляют собой пептидные фрагменты DEPDC1 и имеют способность индуцировать ЦТЛ.

Как правило, модификации одной, двух или более аминокислот в определенном пептиде не влияют на функции пептида, или в некоторых случаях даже усиливают желаемые функции исходного пептида. Фактически, известно, что модифицированные пептиды (т.е., пептиды, состоящие из аминокислотной последовательности, в которой один, два или несколько аминокислотных остатков являются модифицированными (т.е. замещены, удалены, вставлены, и/или добавлены) по сравнению с исходной референсной последовательностью) сохраняют биологическую активность исходного пептида (Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13). Таким образом, в одном из вариантов осуществления пептиды по настоящему изобретению могут быть пептидами, содержащими аминокислотную последовательность, в которой одна, две или несколько аминокислот замещены, удалены, вставлены, и/или добавлены к аминокислотной последовательности, выбранной из числа SEQ ID NO: 1, 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107 и 108, и имеющими способность индуцировать ЦТЛ.

Специалисту в данной области ясно, что отдельные замены в аминокислотной последовательности, которые изменяют единичную аминокислоту или небольшое процентное содержание аминокислот, как правило, приводят к сохранению свойств исходной боковой цепи/цепей аминокислоты. Таким образом, на них часто ссылаются как на «консервативные замены» или «консервативные модификации»; и модификация белка «консервативной заменой» или «консервативной модификацией» может приводить к модифицированному белку, который имеет функции, аналогичные функциям исходного белка. Таблицы консервативных замен, представляющие функционально сходные аминокислоты, хорошо известны в данной области. Примеры характеристик боковых цепей аминокислот, которые функционально похожи, включают, например, гидрофобные аминокислоты (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), гидрофильные аминокислоты (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), и боковые цепи со следующими общими функциональными группами или характеристиками: алифатические боковые цепи (G, A, V, L, I, P); боковые цепи, содержащие гидроксильную группу (S, T, Y); боковые цепи, содержащие атом серы (C, M); боковые цепи, содержащие карбоновую кислоту и амид (D, N, E, Q); боковые цепи, содержащие основание (R, K, H); и ароматические боковые цепи (H, F, Y, W). Кроме того, следующие восемь групп содержат аминокислоты, которые принимаются в данной области в качестве консервативных замен друг для друга:

1) Аланин (A), Глицин (G);

2) Аспарагиновая кислота (D), Глутаминовая кислота (E);

3) Аспарагин (N), Глутамин (Q);

4) Аргинин (R), Лизин (K);

5) изолейцин (I), Лейцин (L), Метионин (M), Валин (V);

6) Фенилаланин (F), Тирозин (Y), Триптофан (W);

7) Серин (S), Треонин (T); и

8) Цистеин (C), Метионин (M) (см., например, Creighton, Proteins 1984).

Такие консервативно модифицированные пептиды также включены в пептиды по настоящему изобретению. Однако пептиды по настоящему изобретению не ограничены ими и могут включать неконсервативные модификации, при условии, что модифицированный пептид сохраняет способность исходного пептида индуцировать ЦТЛ. Кроме того, модифицированные пептиды не исключают пептиды, способные индуцировать ЦТЛ, которые получены из полиморфных вариантов, межвидовых гомологов, и аллелей DEPDC1.

При условии, что пептид сохраняет способность исходного пептида индуцировать ЦТЛ, можно модифицировать (т.е., замещать, удалять, вставлять и/или добавлять) небольшое число (например, 1, 2 или несколько) или небольшое процентное содержание аминокислот. В настоящем документе, термин «несколько» означает 5 или менее аминокислот, например, 4 или 3, или менее. Процентное содержание аминокислот, которые будут модифицированы, предпочтительно составляет 20% или менее, более предпочтительно, 15% или менее, даже более предпочтительно, 10% или менее, или от 1 до 5%.

При использовании для иммунотерапии, пептиды по настоящему изобретению должны презентироваться на поверхности клетки или экзосомы, предпочтительно в виде комплекса с антигеном HLA. Таким образом, предпочтительно, что пептиды по настоящему изобретению обладают высокой аффинностью связывания с антигеном HLA. С этой целью, пептиды можно модифицировать при помощи замены, делеции, вставки, и/или добавления аминокислотных остатков для получения модифицированного пептида с улучшенной аффинностью связывания. Поскольку закономерность последовательностей пептидов, показанная путем связывания с антигенами HLA, уже известна (Falk, et al., Immunogenetics 1994 40 232-41; Chujoh, et al., Tissue Antigens 1998: 52: 501-9; Takiguchi, et al., Tissue Antigens 2000: 55: 296-302.), модификации на основании такой закономерности можно вводить в пептиды по настоящему изобретению.

Например, в пептидах с аффинностью связывания для HLA класса I, вторая аминокислота с N-конца и C-концевая аминокислота, как правило, представляют собой якорные остатки, участвующие в связывании с HLA класса I (Rammensee HG, et al., Immunogenetics. 1995; 41(4): 178-228.). Например, для HLA-A11, треонин, валин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, и тирозин в качестве второй аминокислоты с N-конца, и лизин и аргинин в качестве C-концевой аминокислоты известны как якорные остатки с высокой аффинностью связывания для HLA-A11 (Falk, et al., Immunogenetics 1994, 40: 232-41; Chujoh, et al., Tissue Antigens 1998: 52: 501-9).

Дополнительно, для HLA-A11, существуют вспомогательные якорные остатки в положениях 3 и 7 от N-конца; и известно, что лейцин, фенилаланин, тирозин, изолейцин, и аланин являются предпочтительными в качестве третьей аминокислоты от N-конца, и что лейцин, изолейцин, тирозин, валин и фенилаланин являются предпочтительными в качестве седьмой аминокислоты с N-конца (Falk, et al., Immunogenetics 1994, 40: 232-41; Chujoh, et al., Tissue Antigens 1998: 52: 501-9). Таким образом, для повышения аффинности связывания с HLA-A11, существует вероятность того, что желательно заменить вторую аминокислоту с N-конца треонином, валином, изолейцином, лейцином, фенилаланином, или тирозином, и/или заменить C-концевую аминокислоту лизином или аргинином.

Дополнительно, существует вероятность того, что также желательно заменить третью аминокислоту с N-конца лейцином, фенилаланином, тирозином, изолейцином, или аланином, и/или заменить седьмую аминокислоту с N-конца лейцином, изолейцином, тирозином, валином или фенилаланином. Таким образом, пептиды со способностью индуцировать ЦТЛ, содержащие аминокислотную последовательность, в которой, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, вторая аминокислота с N-конца замещена треонином, валином, изолейцином, лейцином, фенилаланином, или тирозином; третья аминокислота с N-конца замещена лейцином, фенилаланином, тирозином, изолейцином, или аланином; седьмая аминокислота с N-конца замещена лейцином, изолейцином, тирозином, валином или фенилаланином; и/или C-концевая аминокислота замещена лизином или аргинином, охватываются пептидами по настоящему изобретению. В предпочтительном варианте осуществления пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, вторая аминокислота с N-конца замещена треонином, валином, изолейцином, лейцином, фенилаланином, или тирозином; третья аминокислота с N-конца замещена лейцином, фенилаланином, тирозином, изолейцином, или аланином; седьмая аминокислота с N-конца замещена лейцином, изолейцином, тирозином, валином или фенилаланином; и/или C-концевая аминокислота замещена лизином или аргинином.

То есть пептиды по настоящему изобретению включают в себя пептиды со способностью индуцировать ЦТЛ, которые содержат аминокислотную последовательность с одной или несколькими заменами, которые выбраны из нижеизложенных от (a) до (d), введенных в аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1:

(a) вторая аминокислота с N-конца замещена треонином, валином, изолейцином, лейцином, фенилаланином, или тирозином;

(b) третья аминокислота с N-конца замещена лейцином, фенилаланином, тирозином, изолейцином, или аланином;

(c) седьмая аминокислота с N-конца замещена лейцином, изолейцином, тирозином, валином или фенилаланином; и

(d) C-концевая аминокислота замещена лизином или аргинином.

В предпочтительном варианте осуществления пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который состоит из аминокислотной последовательности с одной или несколькими заменами, которые выбраны из вышеизложенных от (a) до (d), введенных в аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1. В настоящем изобретении, предпочтительное число замен составляет 1, 2, 3 или 4 замены, выбранные из вышеизложенных от (a) до (d).

Пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, вторая аминокислота с N-конца замещена треонином, валином, изолейцином, лейцином, фенилаланином, или тирозином, и/или C-концевая аминокислота замещена лизином или аргинином. Предпочтительно, пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, вторая аминокислота с N-конца замещена треонином, валином, изолейцином, лейцином, фенилаланином, или тирозином, и/или C-концевая аминокислота замещена лизином или аргинином. То есть пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который содержит аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько замен выбраны из нижеизложенных от (a) до (b) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1:

(a) вторая аминокислота с N-конца замещена треонином, валином, изолейцином, лейцином, фенилаланином, или тирозином; и

(b) C-концевая аминокислота замещена лизином или аргинином.

В предпочтительном варианте осуществления пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который состоит из аминокислотной последовательности, включающей одну или несколько замен, выбранных из вышеизложенных от (a) до (b), введенных в аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. В более предпочтительном варианте осуществления вторая аминокислота с N-конца замещена треонином, валином, изолейцином, лейцином.

Для HLA-A01, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота в качестве третьей аминокислоты с N-конца, и тирозин в качестве C-концевой аминокислоты известны как якорные остатки с высокой аффинностью связывания для HLA-A01. Дополнительно, известно, что существуют вспомогательные якорные остатки в положении 2 с N-конца для HLA-A01, и что треонин и серин являются предпочтительными в качестве второй аминокислоты с N-конца (Kubo, R.T Journal of Immunology 1994, 152: 3913; Gambacorti-Passerini, C. Clinical Cancer Research 1997, 3: 675-83; Falk, K. Immunogenetics 1994, 40: 238-41). Таким образом, для сохранения или повышения аффинности связывания с HLA-A01, существует вероятность того, что желательно заменить третью аминокислоту с N-конца аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой, и/или C-концевую аминокислоту тирозином. Дополнительно, существует вероятность того, что также желательно заменить вторую аминокислоту с N-конца треонином или серином. Таким образом, пептиды со способностью индуцировать ЦТЛ, содержащие аминокислотную последовательность, в которой, в аминокислотной последовательности, выбранной из числа SEQ ID NO: 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107 и 108, вторая аминокислота с N-конца замещена треонином или серином, третья аминокислота с N-конца замещена аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой, и/или C-концевая аминокислота замещена тирозином, охватываются пептидами по настоящему изобретению. В предпочтительном варианте осуществления пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой, в аминокислотной последовательности, выбранной из числа SEQ ID NO: 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107 и 108, вторая аминокислота с N-конца замещена треонином или серином, третья аминокислота с N-конца замещена аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой, и/или C-концевая аминокислота замещена тирозином. То есть пептиды по настоящему изобретению включают в себя пептид со способностью индуцировать ЦТЛ, который содержит аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько замен, выбранных из нижеизложенных от (a) до (c), введены в аминокислотную последовательность, выбранную из числа SEQ ID NO: 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107 и 108:

(a) вторая аминокислота с N-конца замещена треонином или серином;

(b) третья аминокислота с N-конца замещена аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой; и

(c) C-концевая аминокислота замещена тирозином (однако, SEQ ID NO: 82, 21, 86, 87, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 103, 107 и 108, которые содержат тирозин на С-конце, исключены из аминокислотных последовательностей, которые подлежат замене (с)).

В предпочтительном варианте осуществления пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который состоит из аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько замен, выбранных из вышеизложенных от (a) до (c), введенных в аминокислотную последовательность, выбранную из числа SEQ ID NO: 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107 и 108. В настоящем изобретении, предпочтительное число замен составляет 1, 2 или 3 замены, выбранные из числа вышеизложенных от (a) до (c).

Кроме того, пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который содержит аминокислотную последовательность, в которой, в аминокислотной последовательности, выбранной из числа SEQ ID NO: 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107 и 108, третья аминокислота с N-конца замещена аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой, и/или C-концевая аминокислота замещена тирозином. Предпочтительно, пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который содержит аминокислотную последовательность, в которой, в аминокислотной последовательности, выбранной из числа SEQ ID NO: 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107 и 108, третья аминокислота с N-конца замещена аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой, и/или C-концевая аминокислота замещена тирозином. То есть пептид по настоящему изобретению может быть пептидом со способностью индуцировать ЦТЛ, который содержит аминокислотную последовательность с одной или несколькими заменами, которые выбраны из нижеизложенных от (a) до (b) в аминокислотной последовательности, выбранной из числа SEQ ID NO: 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107 и 108:

(a) третья аминокислота с N-конца замещена аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой; и

(b) C-концевая аминокислота замещена тирозином (однако, SEQ ID NO: 82, 21, 86, 87, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 103, 107 и 108, которые содержат тирозин на С-конце, исключены из аминокислотных последовательностей, которые подлежат замене (b)).

В предпочтительном варианте осуществления пептид по настоящему изобретению может быть пептидом, имеющим способность индуцировать ЦТЛ, который состоит из аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько замен, которые выбраны из вышеуказанных от (a) до (b), введенных в аминокислотную последовательность, выбранную из числа SEQ ID NO: 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107 и 108.

Замену/замены можно вводить в аминокислоту/аминокислоты пептидов не только в якорном участке/участках, но также в положении/положениях потенциальных участков распознавания T-клеточного рецептора (TCR). Несколько исследовательских работ продемонстрировали, что пептид, который имеет замены аминокислот, такие как CAP1, p53(264-272), Her-2/neu369-377 или gp100209-217, может иметь равную или лучшую активность по сравнению с исходным пептидом (Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-7, 1997; T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1, 168(3): 1338-47.; S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206; и S. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-14).

Настоящее изобретение также предполагает, что одну, две или несколько аминокислот можно добавлять с N-конца и/или C-конца пептидов по настоящему изобретению (например, пептидов, состоящих из аминокислотной последовательности, выбранной из числа SEQ ID NO: 1, 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107, и 108). Более конкретно, настоящее изобретение относится к пептидам, состоящим из аминокислотных последовательностей, в которых одна, две или несколько аминокислот добавлены или к одному, или к обоим из N-конца и C-конца аминокислотных последовательностей, на которые ссылается каждая из SEQ ID NO. Такие модифицированные пептиды, которые сохраняют способность индуцировать ЦТЛ, также включены в настоящее изобретение. Например, если пептид, в котором одна, две или несколько аминокислот добавлены с N-конца и/или C-конца пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или 108, контактирует с АПК, он захватывается в АПК и процессируется до пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или 108. Он может затем индуцировать ЦТЛ путем презентирования на клеточной поверхности АПК с помощью пути презентации антигена. Более конкретно, пептиды по настоящему изобретению могут быть пептидами, в которых одну, две или несколько аминокислот добавляют к любому из N-конца и C-конца, или к обоим.

Дополнительно, в другом варианте осуществления настоящего изобретения, предлагаются пептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, содержащих одну, две или несколько замен аминокислот в аминокислотных последовательностях, на которые ссылается каждая из SEQ ID NO, и в которых одна, две или несколько аминокислоты добавлены или к одному, или к обоим из N-конца и C-конца этих замещенных аминокислотных последовательностей. Если пептиды по настоящему изобретению содержат замена аминокислоты/аминокислот, желаемые положения для замены могут быть, например, одним, двумя, тремя или четырьмя положениями, выбранными из второго положения с N-конца, третьего положения с N-конца, седьмого положения с N-конца, и C-конца в аминокислотных последовательностях, на которые ссылается каждая из SEQ ID NO, содержащаяся в пептидах по настоящему изобретению.

Однако если аминокислотная последовательность пептида идентична части аминокислотной последовательности эндогенного или экзогенного белка с отличающейся функцией, могут быть индуцированы побочные эффекты, такие как аутоиммунные нарушения и/или аллергические симптомы против конкретных веществ. Таким образом, предпочтительно проводить поиски с использованием доступных баз данных, для того чтобы избежать ситуаций, в которых аминокислотная последовательность пептида соответствует аминокислотной последовательности другого белка. Если из поисков гомологии становится ясно, что не существует пептида всего лишь с одной или двумя различающимися аминокислотами по сравнению с указанным пептидом, указанный пептид можно модифицировать для того чтобы повысить его аффинность связывания с антигенами HLA, и/или увеличить его способность индуцировать ЦТЛ без опасности таких побочных эффектов.

Пептиды, в которых модифицированы одна, две или несколько аминокислот из пептида по настоящему изобретению, теоретически спрогнозированы для сохранения способности исходного пептида индуцировать ЦТЛ; однако предпочтительно проверить способность модифицированных пептидов индуцировать ЦТЛ. В настоящем документе, «пептид со способностью индуцировать ЦТЛ (индуцибельность ЦТЛ)» относится к пептиду, который индуцирует ЦТЛ при помощи АПК, стимулированных пептидом. «Индуцирование ЦТЛ» включает индуцирование дифференцировки в ЦТЛ, индуцирование активации ЦТЛ, индуцирование пролиферации ЦТЛ, индуцирование цитотоксической активности ЦТЛ, индуцирование опосредованного ЦТЛ разрушения клеток-мишеней, и индуцирование повышенной выработки IFN-гамма ЦТЛ.

Способность индуцировать ЦТЛ можно подтверждать путем стимулирования АПК, которые экспрессируют интересующий антиген HLA (например, B-лимфоциты, макрофаги или дендритные клетки), с пептидом, и смешивания с CD8-положительными Т-клетками; и затем с помощью измерения IFN-гамма, высвобожденного ЦТЛ против клеток-мишеней. В качестве АПК можно предпочтительно использовать дендритные клетки, полученные из мононуклеарных клеток периферической крови человека. В качестве реакционной системы можно использовать трансгенных животных, созданных для экспрессии антигена HLA. Альтернативно, клетки-мишени могут быть радиоактивно-меченными с помощью 51Cr и так далее, и цитотоксическая активность пептид-индуцированных ЦТЛ может быть рассчитана на основании радиоактивности, испускаемой клетками-мишенями. Альтернативно, способность индуцировать ЦТЛ можно оценивать путем измерения IFN-гамма, выработанного и высвобожденного ЦТЛ в присутствии пептид-стимулированных АПК, и путем визуализации области ингибирования на среде с использованием моноклональных антител к IFN-гамма.

В дополнение к вышеизложенным модификациям, пептиды по настоящему изобретению могут быть связаны с другими пептидами при условии, что полученный связанный пептид сохраняет способность индуцировать ЦТЛ. Пример подходящего пептида для связывания с пептидами по настоящему изобретению включает пептид, индуцирующему ЦТЛ и полученному из других опухоль-ассоциированных антигенов. Дополнительно, пептиды по настоящему изобретению могут также быть связаны друг с другом. Подходящие линкеры для применения для связывания пептидов известны в данной области, и, например, можно использовать линкеры, такие как AAY (P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK (SEQ ID NO: 117) (R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-15), или K (S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-6, K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-15). Пептиды можно связывать в различных расположениях (например, мелкими цепочками, повторами, и т.д.), и можно также связывать три или более пептидов.

Пептиды по настоящему изобретению могут также быть связаны с другими веществами при условии, что полученный связанный пептид сохраняет способность индуцировать ЦТЛ. Примеры подходящего вещества для связывания с пептидом по настоящему изобретению включают, например, пептид, липид, сахар или цепь сахаров, ацетильную группу, и природный или синтетический полимер. Пептиды по настоящему изобретению можно модифицировать путем гликозилирования, окисления боковых цепей, фосфорилирования или т.п., при условии, что их способность индуцировать ЦТЛ не будет нарушена. Можно также проводить такие типы модификаций для придания дополнительных функций (например, нацеливающей функции и функции доставки) или для стабилизации пептида.

Например, для повышения стабильности пептида in vivo в данной области известно введение D-аминокислот, миметиков аминокислот или неприродных аминокислот, и эта концепция также может быть применима к пептидам по настоящему изобретению. Стабильность пептидов можно оценивать несколькими способами. Например, стабильность можно тестировать с использованием пептидазы, а также различных биологических сред, таких как плазма и сыворотка человека (см., например, Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302).

Дополнительно, как указано выше, среди модифицированных пептидов, в которых один, два, или несколько аминокислотных остатков были замещены, удалены, вставлены и/или добавлены, можно проводить скрининг или отбор по тем пептидам, которые имеют такую же или более высокую активность, как и исходные пептиды. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способам скрининга или отбора модифицированных пептидов, которые имеют такую же или более высокую активность, как и исходный пептид. Конкретно, настоящее изобретение относится к способу скрининга на пептид со способностью индуцировать ЦТЛ, где способ включает этапы:

(a) создания кандидатных последовательностей, состоящих из аминокислотной последовательности, в которой один, два, или несколько аминокислотных остатков замещены, удалены, вставлены и/или добавлены по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислотной последовательности, выбранной из числа SEQ ID NO: 1, 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107, и 108;

(b) отбора в кандидатных последовательностях, полученных в (a), кандидатной последовательности, которая не имеет значительной гомологии (идентичности последовательности) с любым известным продуктом гена человека, за исключением DEPDC1;

(c) контакта пептида, состоящего из кандидатной последовательности, выбранной в (b), с АПК;

(d) контакта АПК из (c) с CD8-положительными T-клетками; и

(e) отбора пептида, который имеет равную или более высокую способность индуцировать ЦТЛ, чем пептид, состоящий из исходной аминокислотной последовательности.

В настоящем документе, пептид по настоящему изобретению также описан как «пептид(-ы) DEPDC1».

III. Получение пептидов по настоящему изобретению

Для получения пептидов по настоящему изобретению можно использовать хорошо известные способы. Например, для получения пептидов по настоящему изобретению можно использовать технологию рекомбинантных ДНК или химический синтез. Пептиды по настоящему изобретению можно синтезировать по отдельности, или в виде более длинных полипептидов, включающих два или более пептида. Пептиды по настоящему изобретению можно выделять из клеток-хозяев или продуктов реакции синтеза, после того как они были произведены в клетках-хозяевах при помощи технологии рекомбинантных ДНК или после того как они были синтезированы химическим путем. То есть, пептиды по настоящему изобретению можно очищать или изолировать таким образом, что они по существу не содержат других белков и их фрагментов из клетки-хозяина, или любых других химических веществ.

Пептиды по настоящему изобретению могут содержать модификации, такие как гликозилирование, окисление боковых цепей, фосфорилирование при условии, что такие модификации не разрушают биологическую активность исходного пептида. Другие иллюстративные модификации включают введение D-аминокислот или других миметиков аминокислот, которые можно использовать, например, для увеличения времени полувыведения пептидов из сыворотки.

Пептид по настоящему изобретению можно получать путем химического синтеза на основании выбранной аминокислотной последовательности. Примеры общепринятых способов пептидного синтеза, которые можно адаптировать для синтеза, включают способы, описанные в документах ниже:

(i) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;

(ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;

(iii) ʺPeptide Synthesisʺ (in Japanese), Maruzen Co., 1975;

(iv) ʺBasics and Experiment of Peptide Synthesisʺ (in Japanese), Maruzen Co., 1985;

(v) ʺDevelopment of Pharmaceuticalsʺ (in Japanese), Continued Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991;

(vi) WO99/67288; и

(vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, Solid Phase Peptide Synthesis, Academic Press, New York, 1980, 100-18.

Альтернативно, пептиды по настоящему изобретению можно получать, адаптируя любые известные способы генетической инженерии для выработки пептидов (например, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (Wu et al.) 1983, 101: 347-62). Например, сначала получают подходящий вектор, несущий полинуклеотид, который кодирует пептид по настоящему изобретению, в экспресирующейся форме (например, после регуляторной последовательности, соответствующей промоторной последовательности), и транформируют подходящую клетку-хозяина. Клетку-хозяина затем культивируют для получения пептида по настоящему изобретению. Пептид по настоящему изобретению также можно получать in vitro с использованием системы для трансляции in vitro.

IV. Полинуклеотиды

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, который кодирует любой из пептидов по настоящему изобретению. Он включает полинуклеотиды, полученные из природного гена DEPDC1 (например, номер доступа GeneBank NM_001114120 (SEQ ID NO: 113) или номер доступа GeneBank NM_017779 (SEQ ID NO: 115)), а также полинуклеотиды с консервативно модифицированной нуклеотидной последовательностью. В настоящем документе, фраза «консервативно модифицированная нуклеотидная последовательность» относится к последовательностям, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности. Из-за вырожденности генетического кода, большое количество функционально идентичных нуклеиновых кислот кодирует любой указанный белок. Например, все кодоны GCA, GCC, GCG, и GCU кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, где кодоном определен аланин, кодон можно изменять на любой из соответствующих вышеописанных кодонов без изменения кодируемого полипептида. Такие вариации нуклеиновых кислот представляют собой «молчащие вариации», которые являются одним из видов консервативно модифицированных вариаций. Каждая последовательность нуклеиновой кислоты в настоящем документе, которая кодирует пептид, также описывает любую возможную молчащую вариацию нуклеиновой кислоты. Специалисту в данной области будет понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который, как правило, является единственным кодоном для метионина, и TGG, который, как правило, является единственным кодоном для триптофана) можно модифицировать для получения функционально идентичной молекулы. Таким образом, каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, неявно описана в каждой раскрытой последовательности.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может состоять из ДНК, РНК, и их производных. ДНК соответствующим образом состоит из оснований, таких как A, T, C, и G, и T заменена на U в РНК.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может кодировать несколько пептидов по настоящему изобретению с наличием или отсутствием между ними промежуточных аминокислотных последовательностей. Например, промежуточная аминокислотная последовательность может обеспечивать участок расщепления (например, последовательность распознавания фермента) полинуклеотида или транслированных пептидов. Кроме того, полинуклеотид может включать любые дополнительные последовательности в кодирующую последовательность, которая кодирует пептид по настоящему изобретению. Например, полинуклеотид может быть рекомбинантным полинуклеотидом, который включает регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии пептида или может быть экспрессирующим вектором (например, плазмидой) с маркерными генами и т.п. Как правило, такие рекомбинантные полинуклеотиды можно получать путем манипуляций с полинуклеотидами путем общепринятых рекомбинантных способов при помощи, например, полимераз и эндонуклеаз.

Для получения полинуклеотидов по настоящему изобретению можно использовать и рекомбинантные способы, и способы химического синтеза. Например, полинуклеотид можно получать путем вставки в соответствующий вектор, который можно экпрессировать после трансфекции в компетентных клетках. Альтернативно, полинуклеотид можно амплифицировать при помощи способов ПЦР или экспрессии в подходящих хозяевах (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). Альтернативно, полинуклеотид можно синтезировать с использованием твердофазных способов, как описано в Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5. Продукты связывания из нескольких пептидов, которые можно получать таким образом, можно очищать по мере необходимости и вводить в таком связанном состоянии. В этом случае, из связанных пептидов путем процессинга можно получать антигенпрезентирующие пептиды и выявлять ЦТЛ-индуцирующую активность каждого из пептидов. Таким образом, при связывании пептидов предпочтительно комбинировать пептиды с одинаковым ограничением по HLA. Альтернативно, пептиды можно вводить в виде смеси отдельных пептидов, расщепляя связанную часть.

V. Экзосомы

Настоящее изобретение дополнительно относится к внутриклеточным пузырькам, обозначаемым как экзосомы, которые презентируют на своей поверхности комплексы, образованные между пептидами по настоящему изобретению и антигенами HLA. Экзосомы можно получать, например, при помощи способов, подробно описанных в JPH11-510507 и WO99/03499, и можно получать с использованием АПК, полученных от пациентов, которые являются объектами для лечения и/или предупреждения заболевания (профилактики). Экзосомы по настоящему изобретению можно прививать как вакцины, аналогичным образом, как и пептиды по настоящему изобретению.

Тип антигенов HLA, включенных в описанные выше комплексы, должен совпадать с типом у индивидуума, которому необходимо лечение и/или предупреждение заболевания (профилактика). Например, HLA-A11 (например, HLA-A*1101) представляют собой аллели, широко и повсеместно наблюдаемые в азиатских популяциях, и этот тип антигенов HLA считается подходящим для лечения азиатских пациентов. Дополнительно, HLA-A01 (например, HLA-A*0101) представляет собой аллель, широко и повсеместно наблюдаемый в европеоидных популяциях, и этот тип антигенов HLA считается подходящим для лечения европеоидных пациентов. Как правило, в клинической практике, за счет предварительного исследования типа антигена HLA у пациента, нуждающегося в лечении, возможно выбрать подходящий пептид, который имеет высокий уровень аффинности связывания с конкретным антигеном HLA, или который имеет способность индуцировать ЦТЛ за счет презентации антигена, опосредованной конкретным антигеном HLA.

Экзосомы по настоящему изобретению презентируют на своей поверхности комплекс пептида по настоящему изобретению и HLA-A11. Если HLA, который образует комплекс с пептидом по настоящему изобретению, представляет собой HLA-A11, пептид по настоящему изобретению предпочтительно является пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1, или его модифицированным пептидом, и, более предпочтительно, пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, или его модифицированным пептидом.

Дополнительно, если HLA, который образует комплекс с пептидом по настоящему изобретению, представляет собой HLA-A01, пептид по настоящему изобретению предпочтительно является пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из числа SEQ ID NO: 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107, и 108, или его модифицированным пептидом, и, более предпочтительно, пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, выбранной из числа SEQ ID NO: 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107, и 108, или его модифицированным пептидом.

VI. Антигенпрезентирующие клетки (АПК)

Настоящее изобретение дополнительно относится к АПК, которые презентируют на своей поверхности комплексы, образованные между антигенами HLA и пептидами по настоящему изобретению. Альтернативно, настоящее изобретение относится к АПК, имеющим на своей клеточной поверхности комплексы, образованные между антигенами HLA и пептидами по настоящему изобретению. АПК по настоящему изобретению могут быть изолированными АПК. При применении в отношении клетки (АПК, ЦТЛ, и т.д.), термин «изолированный» означает, что клетки отделены от другого типа клеток. АПК по настоящему изобретению могут быть АПК, индуцированными из АПК, полученных от пациента, которого собираются подвергать лечению и/или предупреждению (профилактике), и их можно вводить в виде вакцины сами по себе или в комбинации с другими лекарственными средствами, включая пептид(-ы), экзосому/экзосомы или ЦТЛ по настоящему изобретению.

АПК по настоящему изобретению не ограничиваются конкретным типом клеток, и могут быть клетками, о которых известно, что они презентируют белковые антигены на своей клеточной поверхности таким образом, что они распознаются лимфоцитами, например, дендритные клетки (DC), клетки Лангерганса, макрофаги, B-клетки, и активированные T-клетки. Поскольку DC является типичной АПК, которая имеет самую сильную способность индуцировать ЦТЛ среди АПК, DC могут быть предпочтительно использованы в качестве АПК по настоящему изобретению. В настоящем изобретении, предпочтительная DC является изолированной DC, полученной от человека. Дополнительно, АПК по настоящему изобретению могут представлять собой смеси нескольких типов клеток с антиген-презентирующей функцией и могут быть смесями АПК, каждая из которых презентирует различные типы пептидов по настоящему изобретению.

Например, АПК по настоящему изобретению можно получать, индуцируя DC из мононуклеарных клеток периферической крови, а затем стимулируя их in vitro, ex vivo или in vivo пептидами по настоящему изобретению. Когда пептид по настоящему изобретению вводят индивидууму, АПК, презентирующие пептид по настоящему изобретению, индуцируются в организме индивидуума. Таким образом, после того как пептиды по настоящему изобретению вводят индивидууму, можно получать АПК по настоящему изобретению путем забора АПК от индивидуума. Альтернативно, АПК по настоящему изобретению можно получать путем контакта АПК, собранных у индивидуума, с пептидом по настоящему изобретению.

Для того чтобы индуцировать иммунный ответ против DEPDC1-экспрессирующих злокачественных клеток у индивидуума, АПК по настоящему изобретению можно вводить индивидууму сами по себе или в комбинации с другими лекарственными средствами, включая пептид(-ы), экзосому/экзосомы или ЦТЛ по настоящему изобретению. Например, введение ex vivo может включать следующие этапы:

(a) забор АПК у первого индивидуума;

(b) контакт АПК из этапа (a) с пептидом; и

(c) введение АПК из этапа (b) второму индивидууму.

Первый индивидуум и второй индивидуум могут быть одним и тем же индивидуумом, или могут быть разными индивидуумами. Когда первый индивидуум и второй индивидуум являются разными индивидуумами, предпочтительно, что HLA первого индивидуума и второго индивидуума представляют собой HLA одного типа. АПК, полученные на вышеописанном этапе (b), могут быть вакциной для лечения злокачественной опухоли и/или предупреждения заболевания (профилактики).

АПК по настоящему изобретению, полученные вышеописанным способом, имеют способность индуцировать ЦТЛ. Термин «способность индуцировать ЦТЛ (индуцибельность ЦТЛ)», применяемый в отношении АПК, относится к способности АПК индуцировать ЦТЛ при контакте с CD8-положительной T-клеткой/клетками. Дополнительно, «способность индуцировать ЦТЛ (индуцибельность ЦТЛ)» включает способность АПК индуцировать активацию ЦТЛ, способность АПК индуцировать пролиферацию ЦТЛ, способность АПК способствовать опосредованному ЦТЛ разрушению клеток-мишеней, и способность АПК повышать опосредованную ЦТЛ выработку IFN-гамма. ЦТЛ, индуцированная АПК по настоящему изобретению, представляет собой ЦТЛ, специфичную к DEPDC1, и демонстрирует специфическую цитотоксическую активность против DEPDC1-экспрессирующих клеток.

В дополнение к вышеописанным способам, АПК по настоящему изобретению можно получать путем введения полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в АПК in vitro. Вводимый полинуклеотид может быть в форме ДНК или РНК. Способ введения конкретно не ограничен, и его примеры включают различные способы, применяемые обычно в данной области, такие как липофекция, электропорация и способ с фосфатом кальция. Более конкретно, можно использовать способы, описанн в Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72, и JP2000-509281. За счет введения полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в АПК, полинуклеотид транскрибируется и транслируется в клетке, а затем произведенный пептид процессируется MHC класса I и проходит через путь презентации пептида по настоящему изобретению на клеточной поверхности АПК.

В предпочтительном варианте осуществления АПК по настоящему изобретению презентирует на своей клеточной поверхности комплекс, образованный между пептидом по настоящему изобретению и HLA-A11 (более предпочтительно HLA-A*1101) или HLA-A01 (более предпочтительно HLA-A*0101). Если HLA, который образует комплекс с пептидом по настоящему изобретению, представляет собой HLA-A11, пептид по настоящему изобретению предпочтительно является пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1 или его модифицированным пептидом, и, более предпочтительно, пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1. Если HLA, который образует комплекс с пептидом по настоящему изобретению, представляет собой HLA-A01, пептид по настоящему изобретению предпочтительно является пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из числа SEQ ID NO: 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107, и 108, или его модифицированным пептидом, и, более предпочтительно, пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, выбранной из числа SEQ ID NO: 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107, и 108, или его модифицированным пептидом.

АПК по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой АПК, индуцированную способом, включающим этап, описанный (a) или (b) ниже:

(a) контакт АПК, экспрессирующей, по меньшей мере, один HLA, выбранный из HLA-A11 (более предпочтительно HLA-A*1101 и HLA-A01 (более предпочтительно HLA-A*0101), с пептидом по настоящему изобретению; или

(b) введение полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в АПК, экспрессирующую, по меньшей мере, один HLA, выбранный из HLA-A11 (более предпочтительно HLA-A*1101) и HLA-A01 (более предпочтительно HLA-A*0101).

Пептид по настоящему изобретению, который контактирует с HLA-A11-экспрессирующей АПК, предпочтительно представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 1 или его модифицированный пептид, и более предпочтительно пептид с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 1.

Пептид по настоящему изобретению, который контактирует с HLA-A01-экспрессирующей АПК, предпочтительно представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из числа SEQ ID NO: 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107, и 108 или его модифицированный пептид, и более предпочтительно пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из числа SEQ ID NO: 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107, и 108.

Настоящее изобретение относится к применению пептида по настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции, которая индуцирует АПК со способностью индуцировать ЦТЛ. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу или процессу производства фармацевтической композиции, которая индуцирует АПК со способностью индуцировать ЦТЛ. Дополнительно, настоящее изобретение относится к пептиду по настоящему изобретению для индуцирования АПК со способностью индуцировать ЦТЛ.

VII. Цитотоксические T-лимфоциты (ЦТЛ)

ЦТЛ, индуцированные пептидом по настоящему изобретению можно использовать в качестве вакцины аналогичным образом, как и пептид по настоящему изобретению, для усиления иммунного ответа, нацеленного на DEPDC1-экспрессирующую раковую клетку. Таким образом, настоящее изобретение относится к ЦТЛ, которые индуцируются или активируются пептидом по настоящему изобретению. ЦТЛ по настоящему изобретению представляют собой ЦТЛ, который нацелен на пептид по настоящему изобретению, и способен к связыванию с комплексом пептида по настоящему изобретению и антигена HLA. Связывание ЦТЛ с комплексом опосредуется через T-клеточный рецептор (TCR), присутствующий на клеточной поверхности ЦТЛ. ЦТЛ по настоящему изобретению может быть изолированным ЦТЛ. Предпочтительные ЦТЛ представляют собой изолированные ЦТЛ человеческого происхождения. ЦТЛ по настоящему изобретению могут представлять собой смеси ЦТЛ, каждая из которых нацелена на различные типы пептидов по настоящему изобретению.

ЦТЛ по настоящему изобретению можно получать путем (1) введения пептидов по настоящему изобретению индивидууму, (2) стимулирования АПК и CD8-положительных T-клеток, или мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC),полученных от индивидуума, пептидом по настоящему изобретению in vitro, (3) контакта CD8-положительных T-клеток или PBMC с АПК или экзосомами, которые презентируют на своей поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению, in vitro, или (4) введения в CD8-положительные T-клетки вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий каждую субъединицу T-клеточного рецептора (TCR), способного связываться с пептидом по настоящему изобретению, презентированным на клеточной поверхности посредством антигена HLA. Экзосомы и АПК, применяемые в способе (2) или (3) выше, можно получать путем способов, описанных в разделах «V. Экзосомы» и «VI. Антигенпрезентирующие клетки (АПК)», соответственно, а подробности способа (4) выше будут описаны в разделе «VIII. T-клеточный рецептор (TCR)».

ЦТЛ по настоящему изобретению можно вводить сами по себе пациентам, которые подвергаются лечению и/или предупреждению (профилактике), или в комбинации с другими лекарственными средствами, включая пептид(-ы), АПК или экзосому/экзосомы по настоящему изобретению с целью регулирования воздействий. Дополнительно, ЦТЛ по настоящему изобретению могут быть ЦТЛ, индуцированными из CD8-положительных T-клеток, полученных от пациентов, которым предполагается вводить ЦТЛ. ЦТЛ по настоящему изобретению действуют специфически на клетки-мишени, которые презентируют пептиды по настоящему изобретению, например, те же самые пептиды, которые использовали для индуцирования ЦТЛ по настоящему изобретению. Клетки-мишени могут быть клетками, которые эндогенно экспрессируют DEPDC1, такими как злокачественные клетки, или клетки, трансфицированные геном DEPDC1. Клетки, которые презентируют пептид по настоящему изобретению на своей клеточной поверхности из-за стимулирования пептидом, могут становиться мишенью для атаки ЦТЛ по настоящему изобретению. Клетки, являющиеся мишенями для ЦТЛ по настоящему изобретению, предпочтительно являются клетками, которые положительны, по меньшей мере, по одному из HLA-A11 (более предпочтительно HLA-A*1101) и HLA-A01 (более предпочтительно HLA-A*0101).

В предпочтительном варианте осуществления ЦТЛ по настоящему изобретению специфически нацелены на клетки, которые экспрессируют и DEPDC1, и, по меньшей мере, один HLA, выбранный из HLA-A11 (более предпочтительно HLA-A*1101) и HLA-A01 (более предпочтительно HLA-A*0101). В настоящем изобретении, клетки, являющиеся мишенями для ЦТЛ, могут быть клетками, которые имеют любые из аллелей HLA-A11 и HLA-A01 в гомозиготном или гетерозиготном состоянии.

В настоящем документе, то, что ЦТЛ «нацелен на» клетки, относится к распознаванию ЦТЛ клеток, которые презентируют на своей клеточной поверхности комплекс HLA и пептида по настоящему изобретению, и демонстрации цитотоксической активности против клеток. Дополнительно, «специфически нацелен на» относится к тому, что ЦТЛ демонстрирует цитотоксическую активность против таких клеток, но не демонстрирует повреждающей активности по отношению к другим клеткам. Выражение «распознавать клетки», применяемое в отношении ЦТЛ, относится к связыванию с комплексом HLA и пептида по настоящему изобретению, презентированным на клеточной поверхности, через TCR, и к демонстрации цитотоксической активности против клеток. Таким образом, ЦТЛ по настоящему изобретению предпочтительно является ЦТЛ, который может связываться через TCR с комплексом, образованным между пептидом по настоящему изобретению и HLA-A11 (более предпочтительно HLA-A*1101) или HLA-A01 (более предпочтительно HLA-A*0101), презентированным на клеточной поверхности.

Кроме того, ЦТЛ по настоящему изобретению предпочтительно являются ЦТЛ, индуцированными способом, включающим этап, описанный в (a) или (b) ниже:

(a) контакт in vitro CD8-положительных T-клеток с АПК или экзосомами, которые презентируют на своей поверхности комплекс пептида по настоящему изобретению и HLA-A11 (более предпочтительно HLA-A*1101) или HLA-A01 (более предпочтительно HLA-A*0101); или

(b) введение в CD8-положительные T-клетки полинуклеотида, кодирующего каждую субъединицу TCR, способного связываться с пептидом по настоящему изобретению, презентированным на клеточной поверхности посредством HLA-A11 (более предпочтительно HLA-A*1101) или HLA-A01 (более предпочтительно HLA-A*0101). ЦТЛ, индуцированные таким способом, представляют собой клетки с TCR, которые специфически распознают комплекс пептида и антигена HLA, использованный для индукции. Таким образом, они представляют собой клетки со структурным отличием от других ЦТЛ, которые имеют отличающуюся специфичность реакции из-за различий в структуре TCR.

VIII. T-клеточные рецепторы (TCR)

Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим полинуклеотид, кодирующий каждую субъединицу TCR, способного связываться с пептидом по настоящему изобретению, который презентирован на клеточной поверхности при помощи антигена HLA, и к способам применения таких композиций. Полинуклеотид наделяет CD8-положительные T-клетки специфичностью против DEPDC1-экспрессирующих злокачественных клеток за счет экспрессии TCR, способного связываться с пептидом по настоящему изобретению, который презентирован на клеточной поверхности при помощи антигена HLA. Полинуклеотиды, кодирующие альфа цепь/цепи и бета цепь/цепи, можно идентифицировать как субъединицу TCR ЦТЛ, индуцированных пептидом по настоящему изобретению, с применением способов, известных в данной области (WO2007/032255 и Morgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)). Например, для анализа TCR предпочтительными являются способы ПЦР. Не ограничиваясь нижеописанными, праймеры для ПЦР для анализа могут быть, например, набором/наборами праймеров для амплификации путем комбинирования 5'-концевого праймера и 3'-концевого праймера/праймеров ниже:

5'-концевой праймер:

5'-R праймер (5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3') (SEQ ID NO: 109)

3'-концевой праймер:

Специфичный к области С альфа-цепи TCR

3-TRa-C праймер (5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3') (SEQ ID NO: 110)

Специфичный к области С1 бета-цепи TCR

3-TRb-C1 праймер (5'-tcagaaatcctttctcttgac-3') (SEQ ID NO: 111) или

Специфичный к области С2 бета-цепи TCR

3-TR-бета-C2 праймер (5'-ctagcctctggaatcctttctctt-3') (SEQ ID NO: 112)

TCR, образованные за счет введения идентифицированных полинуклеотидов в CD8-положительные T-клетки, могут связываться с высокой аффинностью связывания с клетками-мишенями, которые презентируют пептид по настоящему изобретению, и опосредовать эффективный лизис клеток-мишеней, презентирующих пептид по настоящему изобретению, in vivo и in vitro.

Полинуклеотид, кодирующий каждую субъединицу TCR, можно вставлять в подходящий вектор, например, ретровирусный вектор. Эти векторы хорошо известны в данной области. Полинуклеотид или вектор, содержащий его в экспрессируемой форме, можно вводить в CD8-положительную T-клетку, например, CD8-положительную T-клетку, полученную от пациента. Настоящее изобретение относится к готовым композициям, которые позволяют легко и быстро получить модифицированные T-клетки, имеющие превосходные свойства лизиса злокачественных клеток, за счет быстрой модификации собственных Т-клеток пациента (или T-клеток, полученных от другого индивидуума).

В настоящем документе, специфический TCR представляет собой TCR, который может придавать специфическую цитотоксическую активность против клеток-мишеней за счет специфического распознавания комплекса пептида по настоящему изобретению и антигена HLA, презентированного на поверхности клеток-мишеней, при этом TCR присутствует на поверхности CD8-положительной T-клетки. Специфическое распознавание вышеописанного комплекса можно подтверждать любым известным способом, и предпочтительные примеры способов включают анализ окрашивания мультимеров HLA с использованием молекул HLA и пептидов по настоящему изобретению, и способы анализа иммуноферментных пятен (ELISPOT). Специфическое, опосредованное TCR, распознавание клетки-мишени Т-клеткой, в которую был введен вышеописанный полинуклеотид, и передачу сигнала в клетке можно подтверждать, проводя анализ ELISPOT. Когда вышеописанный TCR присутствует на поверхности CD8-положительной T-клетки, может ли он наделять CD8-положительную T-клетку специфической цитотоксической активностью против клетки-мишени можно также подтверждать известными способами. Предпочтительные способы включают, например, измерение цитотоксической активности против клеток-мишеней при помощи анализа высвобождения хрома или т.п.

Настоящее изобретение в отношении HLA-A11 относится к ЦТЛ, полученным путем трансформации CD8-положительных T-клеток полинуклеотидом, кодирующим каждую субъединицу TCR, которая связывается, например, с комплексом, образованным пептидом с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 и антигеном HLA-A11.

Настоящее изобретение в отношении HLA-A01 относится к ЦТЛ, полученным путем трансформации CD8-положительных T-клеток полинуклеотидом, кодирующим каждую субъединицу TCR, которая связывается, например, с комплексом, образованным пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из числа SEQ ID NO: 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107, и 108, и антигеном HLA-A01.

Трансформированные ЦТЛ способны к хоумингу (перемещению лимфоцитов из крови в лимфатические ткани) in vivo и могут быть выращены при помощи хорошо известного способа культивирования in vitro (например, Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-61 (1989)). ЦТЛ по настоящему изобретению можно использовать для получения иммуногенной композиции, подходящей для лечения заболевания или предупреждения заболевания (профилактики) у пациента, нуждающегося в лечении или предупреждении заболевания (профилактике) (содержание включено в настоящий документ в виде ссылки WO2006/031221).

IX. Фармацевтические композиции

Настоящее изобретение дополнительно относится к композициям или фармацевтическим композициям, содержащим, по меньшей мере, один активный ингредиент, выбранный из нижеизложенных:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК по настоящему изобретению;

(d) экзосома по настоящему изобретению; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать по мере необходимости носитель/носители, эксципиент(-ы) или т.п., широко используемые в фармацевтических препаратах без конкретных ограничений, в дополнение к вышеописанному активному ингредиенту/ингредиентам. Примеры носителя, который можно использовать в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, относятся к стерилизованной воде, физиологическому раствору, фосфатному буферу, культуральной жидкости и т.п. Таким образом, настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим, по меньшей мере, один активный ингредиент, выбранный из нижеизложенных от (a) до (e), и фармацевтически приемлемый носитель:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК по настоящему изобретению;

(d) экзосома по настоящему изобретению; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

Дополнительно, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать, по мере необходимости, стабилизаторы, суспензии, консерванты, поверхностно-активные вещества, солюбилизаторы, регуляторы pH, ингибиторы агрегации и т.п.

Экспрессия DEPDC1 значительно повышена в злокачественных клетках по сравнению с нормальными тканями. Таким образом, пептид по настоящему изобретению или полинуклеотид, кодирующий пептид, можно использовать для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, и/или профилактики ее послеоперационного рецидива. Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, и/или профилактики ее послеоперационного рецидива, содержащим один или несколько типов пептидов или полинуклеотидов по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента. Альтернативно, пептиды по настоящему изобретению можно производить для презентирования на поверхности экзосом или АПК для применения в качестве фармацевтических композиций. Кроме того, ЦТЛ по настоящему изобретению, нацеленный на любой один из пептидов по настоящему изобретению, также можно использовать в качестве активного ингредиента фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать терапевтически эффективное количество или фармацевтически эффективное количество вышеописанного активного ингредиента.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению также можно использовать в качестве вакцины. В контексте настоящего изобретения, термин «вакцина» (также называемая «иммуногенная композиция») относится к композициям, которые имеют функцию индуцирования иммунного ответа, приводящего к противоопухолевому действию при введении животному. Таким образом, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать для индуцирования иммунного ответа, приводящего к противоопухолевому действию у индивидуума. Иммунный ответ, индуцируемый пептидом, полипептидом, АПК, ЦТЛ и фармацевтической композицией по настоящему изобретению, конкретно не ограничен при условии, что он является иммунным ответом, который приводит к противоопухолевому действию, и примеры включают индуцирование ЦТЛ, специфичных к злокачественным клеткам, и индуцирование специфической цитотоксической активности против злокачественных клеток.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно использовать для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, и/или профилактики ее послеоперационного рецидива у человеческих индивидуумов или пациентов. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно использовать предпочтительно индивидууму, положительному, по меньшей мере, по одному HLA, выбранному из HLA-A11 и HLA-A01. Дополнительно, фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно использовать предпочтительно для лечения и/или профилактики злокачественных опухолей, экспрессирующих DEPDC1 и, по меньшей мере, один HLA, выбранный из HLA-A11 и HLA-A01, и/или для профилактики их послеоперационного рецидива.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению активного ингредиента, выбранного из нижеуказанных, в производстве фармацевтической композиции для лечения или профилактики злокачественной опухоли:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к активному ингредиенту, выбранному из нижеуказанных, для применения в лечении или профилактике злокачественной опухоли:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к способу или процессу для производства фармацевтической композиции для лечения или профилактики злокачественной опухоли, где способ или процесс включает этап формулирования, по меньшей мере, одного активного ингредиента, выбранного из нижеуказанных, с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение дополнительно относится к способу или процессу для производства фармацевтической композиции для лечения или профилактики злокачественной опухоли, где способ или процесс включает этап смешивания активного ингредиента, выбранного из нижеуказанных, с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение дополнительно относится к способу лечения или профилактики злокачественной опухоли, который включает этап введения индивидууму, по меньшей мере, одного активного ингредиента, выбранного из нижеуказанных:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

В настоящем изобретении, пептид с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 1, идентифицирован как эпитопные пептиды, рестриктированные по HLA-A11, которые могут индуцировать мощный и специфический иммунный ответ. Таким образом, фармацевтические композиции по настоящему изобретению, содержащие, по меньшей мере, один пептид с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 1, являются подходящими, в частности для введения индивидууму с HLA-A11 (например, HLA-A*1101) в качестве антигена HLA. То же самое относится и к фармацевтическим композициям, содержащим полинуклеотид, кодирующий любые из этих пептидов (т.е. полинуклеотиды по настоящему изобретению), АПК или экзосому, которые презентируют эти пептиды (т.е., АПК или экзосомы по настоящему изобретению), или ЦТЛ, нацеленный на эти пептиды (т.е. ЦТЛ по настоящему изобретению). То есть фармацевтические композиции, содержащие активный ингредиент в контексте с пептидом с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 1, являются подходящими для введения индивидуумам с HLA-A11 (т.е. HLA-A11-положительным индивидуумам). В более предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой фармацевтическую композицию, которая содержит пептид с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 1.

Аналогично, в настоящем изобретении, пептиды с аминокислотной последовательностью, выбранной из числа SEQ ID NO: 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107, и 108, идентифицированы как эпитопные пептиды, рестриктированные по HLA-A01, которые могут индуцировать мощный и специфический иммунный ответ. Таким образом, фармацевтические композиции по настоящему изобретению, содержащие, по меньшей мере, один из этих пептидов с аминокислотной последовательностью, выбранной из числа SEQ ID NO: 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107, и 108 являются подходящими, в частности для введения индивидууму с HLA-A01 (например, HLA-A*0101) в качестве антигена HLA. То же самое относится и к фармацевтическим композициям, содержащим полинуклеотид, кодирующий любые из этих пептидов (т.е. полинуклеотиды по настоящему изобретению), АПК или экзосому, которые презентируют эти пептиды (т.е. АПК или экзосомы по настоящему изобретению), или a ЦТЛ, нацеленный на эти пептиды (т.е. ЦТЛ по настоящему изобретению). То есть фармацевтические композиции, содержащие активный ингредиент в контексте с пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из числа SEQ ID NO: 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107, и 108, являются подходящими для введения индивидуумам с HLA-A01 (т.е. HLA-A01-положительным индивидуумам). В более предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой фармацевтическую композицию, которая содержит пептид с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 108.

Злокачественные опухоли для лечения и/или профилактики при помощи фармацевтических композиций по настоящему изобретению конкретно не ограничены при условии, что они являются злокачественными опухолями, экспрессирующими DEPDC1, и включают рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, хронический миелолейкоз (ХМЛ), рак толстого кишечника, рак желудка, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, мелкоклеточный рак легких (SCLC), опухоль мягких тканей и т.п. Предпочтительные злокачественные опухоли в настоящем изобретении представляют собой злокачественные опухоли, которые имеют аллель HLA, выбранный из числа HLA-A11 и HLA-A01 в гомозиготном или гетерозиготном состоянии.

В дополнение к активным ингредиентам, описанным выше, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать другие пептиды, которые имеют способность индуцировать ЦТЛ против злокачественных клеток (например, другие пептиды, полученные из TAA и индуцирующие ЦТЛ), другие полинуклеотиды, кодирующие другие пептиды, другие клетки, которые презентируют другие пептиды, или т.п.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут также необязательно содержать другие терапевтические вещества в качестве активного ингредиента, при условии, что они не ингибируют противоопухолевые воздействия вышеписанных активных ингредиентов, таких как пептиды по настоящему изобретению. Например, фармацевтические композиции по настоящему изобретению необязательно могут содержать противовоспалительные композиции, анальгетики, химиотерапевтические препараты и т.п. В дополнение к включению других терапевтических веществ в фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, можно также вводить фармацевтическую композицию по настоящему изобретению последовательно или одновременно с одной или несколькими другими фармацевтическими композициями. Доза фармацевтической композиции по настоящему изобретению и других фармацевтических композиций зависит, например, от типа применяемой фармацевтической композиции и заболевания, которое лечат, а также от режима и путей введения.

Следует понимать, что с учетом типа состава, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может включать другие компоненты, общепринятые в данной области, в дополнение к ингредиентам, конкретно упомянутым в настоящем документе.

Настоящее изобретение также относится к промышленным изделиям или наборам, которые содержат фармацевтическую композицию по настоящему изобретению. Промышленные изделия или наборы по настоящему изобретению могут включать контейнер, который содержит фармацевтическую композицию по настоящему изобретению. Пример подходящего контейнера включает бутылку, флакон или пробирку, но не ограничивается ими. Контейнер может быть сделан из различных материалов, таких как стекло или пластик. К контейнеру может быть присоединена этикетка, и на этикетке может быть описано заболевание или состояние болезни, для которого должна быть использована фармацевтическая композиция по настоящему изобретению. Этикетка может также содержать указания для введения и т.п.

Промышленные изделия или наборы по настоящему изобретению могут дополнительно включать второй контейнер, который содержит фармацевтически приемлемые разбавители, необязательно, в дополнение к контейнеру, который содержит фармацевтическую композицию по настоящему изобретению. Промышленные изделия или наборы по настоящему изобретению могут дополнительно содержать другие материалы, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения пользователя, такие как другие буферы, разбавители, фильтры, иглы для инъекций, шприцы и вкладыши в упаковку с инструкциями по применению.

По мере необходимости, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно предоставлять в упаковке или в дозаторном устройстве, которые могут содержать одну или несколько единиц лекарственных форм, содержащих активные ингредиенты. Упаковка может включать, например, металлическую пленку или полимерную пленку, такую как блистерная упаковка. Инструкции для введения могут быть прикреплены к упаковке или к дозаторному устройству.

(1) Фармацевтические композиции, содержащие пептид(-ы) в качестве активного ингредиента

Фармацевтическую композицию, содержащую пептид по настоящему изобретению можно формулировать путем общепринятых способов рецептуры по мере необходимости. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут включать по мере необходимости в дополнение к пептиду по настоящему изобретению, носители, эксципиенты и т.п., широко используемые в фармацевтических препаратах без конкретных ограничений. Примеры носителей, которые можно использовать в фармацевтических композициях по настоящему изобретению включают стерилизованную воду (например, воду для инъекций), физиологический раствор, фосфатный буфер, фосфатно-солевой буфер, физиологический раствор, забуференный Трисом, 0,3% глицин, культуральную жижкость, и т.п. Дополнительно, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать по мере необходимости стабилизаторы, суспензии, консерванты, поверхностно-активные вещества, солюбилизаторы, регуляторы pH, ингибиторы агрегации, и т.п. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут индуцировать специфический иммунитет против DEPDC1-экспрессирующих злокачественных клеток, и, таким образом, их можно применять с целью лечения злокачественных опухолей или предупреждения (профилактики) злокачественных опухолей.

Например, фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно получать путем растворения в фармацевтически или физиологически приемлемых водорастворимых носителях, таких как стерилизованная вода (например, вода для инъекций), физиологический раствор, фосфатный буфер, фосфатно-солевой буфер, физиологический раствор, забуференный Трисом, и добавления, по мере необходимости, стабилизаторов, суспензий, консервантов, поверхностно-активных веществ, солюбилизаторов, регуляторов pH, ингибиторов агрегации, и т.п., а затем стерилизации раствора пептида. Способ стерилизации раствора пептида конкретно не ограничен, и предпочтительно проводится путем стерилизации фильтрацией. Стерилизацию фильтрацией можно проводить при помощи, например, фильтра для стерилизации фильтрацией 0,22 мкм или менее по диаметру пор. Раствор пептида, стерилизованный фильтрацией, можно вводить индивидууму, например, в виде инъекции, не ограничиваясь ею.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно получать в виде лиофилизированного состава путем лиофильного высушивания вышеописанного раствора пептида. Лиофилизированный состав можно получать путем заполнения раствором пептида, приготовленным, как описано выше, подходящего контейнера, такого как ампула, флакон или пластиковый контейнер, с последующей лиофильной сушкой и инкапсуляцией в контейнер с промытой стерилизованной резиновой пробкой или т.п. после восстановления давления. Лиофилизированный состав можно вводить индивидууму после повторного растворения в фармацевтически или физиологически приемлемых водорастворимых носителях, таких как стерилизованная вода (например, вода для инъекций), физиологический раствор, фосфатный буфер, фосфатно-солевой буфер, физиологический раствор, забуференный Трисом, и т.п., перед введением. Предпочтительные примеры фармацевтических композиций по настоящему изобретению включают инъекции такого стерилизованного фильтрацией раствора пептида, и лиофилизированные составы, которые получают из лиофилизированного раствора пептида. Настоящее изобретение дополнительно включает наборы, содержащие такой лиофилизированный состав и раствор для повторного растворения. Настоящее изобретение также включает наборы, содержащие контейнер, который содержит лиофилизированный состав, который представляет собой фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, и контейнер, который содержит раствор для его повторного растворения.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут включать комбинацию двух или более типов пептидов по настоящему изобретению. Комбинация пептидов может быть в форме коктейля из смешанных пептидов, или они могут быть конъюгированы друг с другом стандартными способами. Например, пептиды могут быть химически связаны или могут экспрессироваться в виде последовательностей одиночного слитого полипептида. За счет введения пептида по настоящему изобретению, пептид с высокой плотностью презентируется на АПК при помощи антигена HLA, а затем ЦТЛ, которые специфически реагируют с комплексом, образованным между презентируемым пептидом и антигеном HLA, индуцируются. Альтернативно, АПК (например, DC) забирают у индивидуума, и затем стимулируют пептидами по настоящему изобретению для получения АПК, которые презентируют любой из пептидов по настоящему изобретению на своей клеточной поверхности. Эти АПК повторно вводят индивидууму для индуцирования ЦТЛ у индивидуума, и в результате, повышается их агрессивность по отношению к DEPDC1-экспрессирующим злокачественным клеткам.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут также содержать адъювант, известный эффективным формированием клеточного иммунитета. Адъювант относится к соединению, которое усиливает иммунный ответ против антигена и которое имеет иммунологическую активность при введении вместе (или последовательно) с антигеном. Можно использовать известные адъюванты, описанные в литературе, например, Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89. Примеры подходящего адъюванта включают соли алюминия (фосфат алюминия, гидроксид алюминия, алюминий оксигидроксид и т.п.), квасцы, холерный токсин, токсин сальмонеллы, неполный адъювант Фрейнда (IFA), полный адъювант Фрейнда (CFA), ISCOMatrix, GM-CSF и другие иммуностимулирующие цитокины, олигодезоксинуклеотид, содержащий мотив CpG (CpG7909 и т.п.), эмульсии «масло-в-воде», сапонин или его производные (QS21 и т.п.), липополисахарид, такой как липид A или его производные (MPL, RC529, GLA, E6020 и т.п.), липопептиды, лактоферрин, флагеллин, двухцепочечную РНК или ее производные (poly I:C и т.п.), бактериальную ДНК, имидазохинолины (имиквимод, R848 и т.п.), лиганд лектина С-типа (трегалоза-6,6'-дибегенат (TDB) и т.п.), лиганд CD1d (альфа-галактозилцерамид и т.п.), скваленовые эмульсии (MF59, AS03, AF03 и т.п.), PLGA, и т.п., не ограничиваясь указанными.

Адъювант может находиться в другом контейнере отдельно от фармацевтической композиции, содержащей пептид по настоящему изобретению, в наборах, содержащих фармацевтическую композицию по настоящему изобретению. В этом случае, адъювант и фармацевтическую композицию можно вводить индивидууму последовательно, или смешивать друг с другом непосредственно перед введением индивидууму. Такие наборы, содержащие фармацевтическую композицию, включающую пептид по настоящему изобретению и адъювант, также предусмотрены настоящим изобретением. Когда фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой лиофилизированный состав, набор может дополнительно содержать раствор для повторного растворения. Дополнительно, настоящее изобретение относится к наборам, содержащим контейнер, который содержит фармацевтическую композицию по настоящему изобретению и контейнер, который содержит адъювант. Набор может дополнительно содержать по мере необходимости контейнер, который содержит раствор для повторного растворения.

Когда в качестве адъюванта используют масляный адъювант, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно получать в виде эмульсии. Эмульсии можно получать, например, путем смешивания и перемешивания раствора пептида, приготовленного, как описано выше, и масляного адъюванта. Раствор пептида может быть раствором, который был восстановлен после лиофилизации. Эмульсия может быть или типа «вода в масле», или типа «масло в воде», и эмульсия типа «вода в масле» является предпочтительной для получения высокоэффективного усиленного иммунного ответа. В качестве масляного адъюванта может быть предпочтительно использован IFA, без ограничений упомянутым. Получение эмульсии можно проводить непосредственно перед введением индивидууму, и в этом случае, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть предоставлена в виде набора, содержащего раствор пептида по настоящему изобретению и масляный адъювант. Когда фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой лиофилизированный состав, набор может дополнительно содержать раствор для повторного растворения.

Дополнительно, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть составом с липосомами, в которые инкапсулирован пептид по настоящему изобретению, гранулярным составом, в котором пептид связан с гранулами несколько микрометров в диаметре, или составом, в котором липид связан с пептидом.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения пептид по настоящему изобретению также можно вводить в форме фармацевтически приемлемой соли. Предпочтительные примеры солей включают соли со щелочными металлами (литием, калием, натрием и т.п.), соли со щелочноземельными металлами (кальцием, магнием и т.п.), соли с другими металлами (медью, железом, цинком, марганцем и т.п.), соли с органическими основаниями, соли с аминами, соли с органическими кислотами (уксусной кислотой, муравьиной кислотой, пропионовой кислотой, фумаровой кислотой, малеиновой кислотой, янтарной кислотой, винной кислотой, лимонной кислотой, яблочной кислотой, щавелевой кислотой, бензойной кислотой, метансульфоновой кислотой и т.п.), и соли с неорганическими кислотами (соляной кислотой, фосфорной кислотой, бромистоводородной кислотой, серной кислотой, азотной кислотой и т.п.). Фраза «фармацевтически приемлемая соль», применяемая в настоящем документе, относится к соли, которая сохраняет фармакологическую и фармацевтическую эффективность и свойства соединений. Таким образом, фармацевтические композиции, содержащие фармацевтически приемлемую соль пептида по настоящему изобретению, также охватываются настоящим изобретением. Дополнительно, «пептид по настоящему изобретению» также включает, в дополнение к свободному пептиду, его фармацевтически приемлемые соли.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут дополнительно включать компонент, который примирует ЦТЛ. Липиды были идентифицированы как вещества, способные примировать ЦТЛ in vivo против вирусных антигенов. Например, остатки пальмитиновой кислоты можно присоединять к эпсилон- и альфа-аминогруппам остатка лизина, а затем связывать с пептидом по настоящему изобретению. Липидированный пептид затем можно вводить или напрямую в мицеллу или частицу, включенную в липосому, или эмульгировать в адъюванте. В качестве другого примера липида, примирующего ответы ЦТЛ, можно использовать липопротеины E. coli, такие как трипальмитоил-S-глицерилцистенил-серил-серин (P3CSS), для примирования ЦТЛ при ковалентном присоединении к соответствующему пептиду (см., например, Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4).

Примеры подходящих способов для введения пептидов или фармацевтических композиций по настоящему изобретению включают пероральные, эпидермальные, подкожные, внутримышечные, внутрикостные, внтурибрюшинные, и внутривенные инъекции, а также системное введение или местное введение в непосредственной близости от участков-мишеней, но не ограничиваются перечисленными. Предпочтительный способ введения включает подкожную инъекцию в непосредственной близости от лимфоузлов, таких как подмышечный или паховый. Более конкретно, например, подкожное введение является предпочтительным, если фармацевтическая композиция по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента содержит пептид или экзосому. Альтернативно, композиции с APC или ЦТЛ в качестве активного ингредиента можно вводить путем внутривенной инъекции или т.п. Введение можно проводить путем одиночного введения или разделенным на несколько введений. Пептиды по настоящему изобретению можно вводить индивидууму в терапевтически или фармацевтически эффективном количестве для лечения злокачественной опухоли или в терапевтически или фармацевтически эффективном количестве для индуцирования иммунитета (более конкретно, ЦТЛ) против DEPDC1-экспрессирующих злокачественных клеток. Доза пептидов по настоящему изобретению может быть соответствующим образом скорректирована в соответствии с заболеванием, подлежащим лечению, возрастом и массой пациента, способом введения и т.п. Для каждого из пептидов по настоящему изобретению, доза составляет, как правило, 0,001 мг - 1000 мг, например, 0,01 мг - 100 мг, например, 0,1 мг - 30 мг, например, 0,1 мг - 10 мг, например, 0,5 мг - 5 мг. Интервал между дозами может составлять от одного раза каждые несколько суток до нескольких месяцев, и например, дозировку можно производить с интервалом раз в неделю. Специалист в данной области может соответствующим образом выбрать подходящую дозу (дозирование).

В предпочтительном варианте осуществления фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат терапевтически эффективное количество пептида по настоящему изобретению и фармацевтически или физиологически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат терапевтически эффективное количество пептида по настоящему изобретению, фармацевтически или физиологически приемлемый носитель и адъювант. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать 0,001 мг - 1000 мг, предпочтительно 0,01 мг - 100 мг, более предпочтительно 0,1 мг - 30 мг, даже более предпочтительно 0,1 мг - 10 мг, например, 0,5 мг - 5 мг пептида по настоящему изобретению. Когда фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой инъекцию, она может содержать пептид по настоящему изобретению в концентрации 0,001 мг/мл - 1000 мг/мл, предпочтительно 0,01 мг/мл - 100 мг/мл, более предпочтительно 0,1 мг/мл - 30 мг/мл, даже более предпочтительно 0,1 мг/мл - 10 мг/мл, например, 0,5 мг/мл - 5 мг/мл. В этом случае, например, можно вводить индивидууму путем инъекции от 0,1 до 5 мл, предпочтительно, от 0,5 мл до 2 мл фармацевтической композиции по настоящему изобретению.

Дополнительно, настоящее изобретение относится к способам лечения и/или профилактики злокачественной опухоли и/или профилактики ее послеоперационного рецидива, которые включают введение индивидууму терапевтически эффективного количества пептида по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Как описано выше, пептиды по настоящему изобретению можно вводить индивидууму в однократной дозе, как правило, 0,001 мг - 1000 мг, например, 0,01 мг - 100 мг, например, 0,1 мг - 30 мг, например, 0,1 мг - 10 мг, или например, 0,5 мг - 5 мг. В предпочтительном варианте осуществления пептиды по настоящему изобретению вводят индивидууму вместе с адъювантом. Дополнительно, интервал между дозами может составлять от одного раза каждые несколько суток до нескольких месяцев, предпочтительно от одного раза каждые несколько суток до раза в месяц, например, от одного раза в неделю или одного раза в две недели.

(2) Фармацевтические композиции, содержащие полинуклеотиды в качестве активного ингредиента

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут также содержать полинуклеотиды, кодирующие пептиды по настоящему изобретению, в экспрессируемой форме. В настоящем документе, фраза «в экспрессируемой форме» означает, что полинуклеотид, при введении в клетку, будет экспрессироваться как пептид по настоящему изобретению. В примере варианта осуществления, последовательность полинуклеотида по настоящему изобретению относится к регуляторным элементам, необходимым для экспрессии пептида по настоящему изобретению. Полинуклеотид(-ы) по настоящему изобретению могут быть дополнены последовательностью, необходимой для достижения стабильной вставки в геном клеток-мишеней (см., например, Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 для описания кассетных векторов для гомологичной рекомбинации). См., например, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; патенты США №№ 5580859, 5589466, 5804566, 5739118, 5736524, 5679647; и WO98/04720. Примеры технологий доставки на основе ДНК включают «голую ДНК», облегченную доставку (бупивакаин, полимеры, опосредованную пептидами), комплексы катионных липидов, и доставку, опосредованную частицами («генная пушка») или давлением (см., например, патент США № 5922687).

Пептиды по настоящему изобретению можно также экспрессировать при помощи вирусных или бактериальных векторов. Примеры экспрессирующих векторов включают аттенуированные вирусы-хозяева, такие как вирус осповакцины или вирус оспы кур. Например, можно использовать вирус осповакцины в качестве вектора для экспрессии пептида по настоящему изобретению. После введения в хозяина, рекомбинантный вирус осповакцины экспрессирует иммуногенный пептид, и, таким образом, вызывает иммунный ответ. Векторы на основе вируса осповакцины и способы, подходящие для протоколов иммунизации, описаны, например, в патенте США № 4722848. Другим вектором является БЦЖ (бацилла Кальмета-Герена). Векторы на основе БЦЖ описаны у Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60. Будет очевиден широкий спектр других векторов, подходящих для терапевтического введения или иммунизации, например, аденовирусные и аденоассоциированные вирусные векторы, ретровирусные векторы, векторы на основе Salmonella typhi, векторы на основе обезвреженного токсина сибирской язвы и т.п. См., например, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85.

Доставка полинуклеотида по настоящему изобретению пациенту может быть или прямой, при этом пациент может напрямую получать вектор, несущий полинуклеотид по настоящему изобретению, или опосредованной, при этом, сначала клетки трансформируются вектором, несущим полинуклеотид по настоящему изобретению in vitro, затем клетки пересаживают пациенту. Эти два подхода известны, соответственно, как генная терапия in vivo и ex vivo.

Для общих обзоров способов генотерапии, см. Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu и Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215. Способы, общеизвестные в области технологии рекомбинантных ДНК, которые также можно использовать для настоящего изобретения, описаны в Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993; и Krieger, Gene Transfer и Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990.

Аналогично введению пептидов, введение полинуклеотидов можно проводить путем пероральной, интрадермальной, подкожной, внутривенной, внутримышечной, внутрикостной и/или внутрибрюшинной инъекции, и т.п. Это может быть системным введением или местным введением в непосредственной близости от участков-мишеней. Введение можно проводить путем одиночного введения или разделенным на несколько введений. Полинуклеотиды по настоящему изобретению можно вводить индивидууму в терапевтически или фармацевтически эффективном количестве для лечения злокачественной опухоли или в терапевтически или фармацевтически эффективном количестве для индуцирования иммунитета (более конкретно, ЦТЛ) против DEPDC1-экспрессирующих злокачественных клеток. Доза полинуклеотида в подходящем носителе или доза полинуклеотида в клетках, трансформированных полинуклеотидом, кодирующим пептид по настоящему изобретению, может быть соответствующим образом скорректирована в соответствии с заболеванием, подлежащим лечению, возрастом и массой пациента, способом введения и т.п., и она может составлять, как правило, 0,001 мг - 1000 мг, например, 0,01 мг - 100 мг, например, 0,1 мг - 30 мг, например, 0,1 мг - 10 мг, или например, 0,5 мг - 5 мг. Интервал между дозами может составлять от одного раза каждые несколько суток до нескольких месяцев, и например, дозировку можно производить с интервалом раз в неделю. Специалист в данной области может соответствующим образом выбрать подходящую дозу (дозирование).

X. Способы применения пептидов, экзосом, АПК и ЦТЛ

Пептиды и полинуклеотиды по настоящему изобретению можно использовать для индуцирования АПК и ЦТЛ. ЦТЛ можно также индуцировать при помощи экзосом и АПК по настоящему изобретению. Пептиды, полинуклеотиды, экзосомы и АПК по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с любым другим соединением/соединениями при условии, что не будет ингибирована их способность индуцировать ЦТЛ. Таким образом, ЦТЛ по настоящему изобретению можно индуцировать при помощи фармацевтической композиции, содержащей любой из пептидов, полинуклеотиды, АПК и экзосомы по настоящему изобретению. Дополнительно, АПК по настоящему изобретению можно индуцировать при помощи фармацевтической композиции, содержащей пептид или полинуклеотид по настоящему изобретению.

(1) Способы индуцирования АПК

Настоящее изобретение относится к способам индуцирования АПК со способностью индуцировать ЦТЛ, при помощи пептида/пептидов или полинуклеотида/полинуклеотидов по настоящему изобретению.

Способы по настоящему изобретению включают этап контакта АПК с пептидом по настоящему изобретению in vitro, ex vivo, или in vivo. Например, способ контакта АПК с пептидом ex vivo может включать нижеизложенные этапы:

(a) забор АПК у индивидуума; и

(b) контакт АПК из этапа (a) с пептидом по настоящему изобретению.

Вышеописанные АПК не ограничиваются конкретным типом клеток, и включают клетки, о которых известно, что они презентируют белковые антигены на своей клеточной поверхности, таким образом, что они распознаются лимфоцитами, например, можно использовать DC, клетки Лангерганса, макрофаги, B-клетки, и активированные T-клетки. Среди АПК, DC имеют наиболее мощную способность индуцировать ЦТЛ, и, таким образом, предпочтительно использовать DC. Любые пептиды по настоящему изобретению можно использовать сами по себе или в комбинации с другими пептидами по настоящему изобретению. Дополнительно, пептиды по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с другими пептидами, индуцирующими ЦТЛ (например, другими пептидами, полученными из TAA и индуцирующими ЦТЛ).

Помимо этого, когда пептид по настоящему изобретению вводят индивидууму, АПК контактируют с пептидом in vivo, и в результате АПК, имеющие высокую способность индуцировать ЦТЛ, индуцируются в организме индивидуума. Таким образом, способы по настоящему изобретению могут включать этап введения пептида по настоящему изобретению индивидууму. Аналогично, когда полинуклеотид по настоящему изобретению вводят индивидууму в экспрессируемой форме, пептид по настоящему изобретению экспрессируется in vivo, экспрессировавшийся пептид контактирует с АПК in vivo, и в результате АПК, имеющие высокую способность индуцировать ЦТЛ, индуцируются в организме индивидуума. Таким образом, настоящее изобретение может также включать этап введения полинуклеотида по настоящему изобретению индивидууму.

Для того чтобы индуцировать АПК со способностью индуцировать ЦТЛ, настоящее изобретение может включать этап введения полинуклеотида по настоящему изобретению в АПК. Например, способ может включать нижеизложенные этапы:

(a) забор АПК у индивидуума; и

(b) введение полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в АПК из этапа (a).

Этап (b) можно проводить, как описано выше в разделе «VI. Антигенпрезентирующие клетки (АПК)».

Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу индуцирования АПК со способностью индуцировать ЦТЛ, включающему нижеизложенные этапы (a) или (b):

(a) контакт АПК с пептидом по настоящему изобретению; или

(b) введение полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в АПК.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения АПК со способностью индуцировать ЦТЛ, включающему нижеизложенные этапы (a) или (b):

(a) контакт АПК с пептидом по настоящему изобретению; или

(b) введение полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в АПК.

Вышеописанные способы можно проводить in vitro, ex vivo, или in vivo, и предпочтительно проводить их in vitro или ex vivo. АПК, применяемые в вышеописанных способах, можно получать от индивидуума, которому планируется вводить индуцированные АПК, или их можно получать от другого индивидуума. Когда используют АПК, полученные от индивидуума (донора), отличного от индивидуума, для которого запланировано введение, индивидуум для введения и донор должны иметь идентичный тип HLA.

В способах по настоящему изобретению, когда пептид с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 1, или его модифицированный пептид используют в качестве пептида по настоящему изобретению, тип HLA предпочтительно представляет собой HLA-A11 (более предпочтительно HLA-A*1101), как у индивидуума для введения, так и у донора. Альтернативно, АПК, применяемые в вышеописанных способах, предпочтительно представляют собой АПК, которые экспрессируют HLA-A11 (более предпочтительно HLA-A*1101).

Аналогично, когда пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из числа SEQ ID NO: 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107, и 108 или его модифицированный пептид используют в качестве пептида по настоящему изобретению в методах по настоящему изобретению, тип HLA предпочтительно представляет собой HLA-A01 (более предпочтительно HLA-A*0101), как у индивидуума для введения, так и у донора. Альтернативно, АПК, применяемые в вышеописанных способах, предпочтительно представляют собой АПК, которые экспрессируют HLA-A01 (более предпочтительно HLA-A*0101). АПК можно получать с применением известных способов из PBMC, после того как PBMC выделены из крови, полученной от донора, путем способа центрифугирования с удельной плотностью или т.п.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат пептид по настоящему изобретению или полинуклеотид, кодирующий пептид, для индуцирования АПК со способностью индуцировать ЦТЛ.

Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к применению пептида по настоящему изобретению или полинуклеотида, кодирующего пептид, в производстве фармацевтической композиции для индуцирования АПК со способностью индуцировать ЦТЛ.

Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к пептидам по настоящему изобретению или полинуклеотидам, кодирующим пептиды, для применения для индуцирования АПК со способностью индуцировать ЦТЛ.

Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к способам или процессам производства фармацевтической композиции для индуцирования АПК, где способ или процесс включают этап формулирования пептида по настоящему изобретению или полинуклеотида, кодирующего пептид, с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение дополнительно относится к способам или процессам производства фармацевтической композиции для индуцирования АПК со способностью индуцировать ЦТЛ, где способ или процесс включают этап смешивания пептида по настоящему изобретению или полинуклеотида, кодирующего пептид, с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем.

АПК, индуцированные способами по настоящему изобретению, могут индуцировать ЦТЛ, специфичные к DEPDC1 (т.е., ЦТЛ по настоящему изобретению).

(2) Способы индуцирования ЦТЛ

Настоящее изобретение также относится к способам индуцирования ЦТЛ с использованием пептидов, полинуклеотидов, экзосом или АПК по настоящему изобретению. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам индуцирования ЦТЛ с использованием одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих полипептид(-ы), которые могут формировать T-клеточный рецептор (TCR) (т.е., субъединицу TCR), способный распознавать комплекс пептида по настоящему изобретению и антигена HLA. Предпочтительно, способы индуцирования ЦТЛ включают, по меньшей мере, один этап, выбранный из нижеизложенных:

(a) контакт CD8-положительных T-клеток с антигенпрезентирующими клетками, которые презентируют на своей поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению;

(b) контакт CD8-положительных T-клеток с экзосомами, которые презентируют на своей поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению; и

(c) введение в CD8-положительные T-клетки одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих полипептид(-ы), которые могут формировать TCR, способный распознавать комплекс пептида по настоящему изобретению и антигена HLA.

Когда пептид(-ы), полинуклеотид(-ы), экзосому/экзосомы или АПК по настоящему изобретению вводят индивидууму, ЦТЛ индуцируются в организме индивидуума, и сила иммунного ответа, нацеленного на DEPDC1-экспрессирующие злокачественные клетки, возрастает. Таким образом, способы по настоящему изобретению могут включать этап введения индивидууму пептида/пептидов, полинуклеотида/полинуклеотидов, АПК или экзосомы/экзосом по настоящему изобретению.

Альтернативно, ЦТЛ можно индуцировать при использовании их in vitro или ex vivo. Например, способы по настоящему изобретению могут включать следующие этапы:

(a) забор АПК у индивидуума;

(b) контакт АПК из этапа (а) с пептидом по настоящему изобретению; и

(c) совместное культивирование АПК из этапа (b) с CD8-положительными T-клетками.

Индуцированные ЦТЛ впоследствии можно возвращать индивидууму.

АПК для совместного культивирования с CD8-положительными T-клетками из этапа (c) выше также можно получать путем введения в АПК полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, как описано выше в разделе «VI. Антигенпрезентирующие клетки (АПК)». Однако АПК для применения в способах по настоящему изобретению не ограничиваются вышеуказанными, и можно использовать любые АПК, которые презентируют на своей поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению.

В способах по настоящему изобретению, вместо таких АПК, также можно использовать экзосомы, которые презентируют на своей поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению. То есть, способы по настоящему изобретению могут включать этап совместного культивирования с экзосомами, которые презентируют на своей поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению. Такие экзосомы можно получать способами, описанными выше в разделе «V. Экзосомы».

Дополнительно, ЦТЛ также можно индуцировать путем введения в CD8-положительную T-клетку вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий каждую субъединицу TCR, способного связываться с пептидом по настоящему изобретению, презентированным при помощи антигена HLA на клеточной поверхности. Такую трансформацию можно проводить, как описано выше в разделе «VIII. T-клеточные рецепторы (TCR)».

Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам индуцирования ЦТЛ, включающим этап, выбранный из нижеизложенных:

(a) совместное культивирование CD8-положительных T-клеток с АПК, которые презентируют на своей поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению;

(b) совместное культивирование CD8-положительных T-клеток с экзосомами, которые презентируют на своей поверхности комплекс антигена HLA и пептида по настоящему изобретению; и

(c) введение в CD8-положительные T-клетки вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий каждую субъединицу TCR, способного связываться с пептидом по настоящему изобретению, презентированным при помощи антигена HLA на клеточной поверхности.

Вышеописанные способы можно проводить in vitro, ex vivo, или in vivo, и предпочтительно проводить их in vitro или ex vivo. АПК, или экзосомы, и CD8-положительные T-клетки, применяемые в вышеописанных способах, можно получать от индивидуума, которому планируется вводить индуцированные АПК, или их можно получать от другого индивидуума. Когда используют АПК, или экзосомы, и CD8-положительные T-клетки, полученные от индивидуума (донора), отличного от индивидуума, для которого запланировано введение, индивидуум для введения и донор должны иметь идентичный тип HLA. Например, когда пептид с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO1, или его модифицированный пептид используют в качестве пептидов по настоящему изобретению, тип HLA предпочтительно представляет собой HLA-A11 (более предпочтительно HLA-A*1101), как у индивидуума для введения, так и у донора. Альтернативно, АПК или экзосомы, применяемые в вышеописанных способах, предпочтительно представляют собой АПК или экзосомы, которые презентируют на своей поверхности комплекс из HLA-A11 (более предпочтительно HLA-A*1101) и пептида по настоящему изобретению (пептида с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, или его модифицированного пептида). В этом случае, индуцированные ЦТЛ демонстрируют специфическую цитотоксическую активность против клеток, которые презентируют комплекс из HLA-A11 и пептида по настоящему изобретению (например, DEPDC1-экспрессирующие HLA-A11-положительные клетки).

Альтернативно, например, когда пептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из числа SEQ ID NO: 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107, и 108, или его модифицированный пептид используют в качестве пептидов по настоящему изобретению, тип HLA предпочтительно представляет собой HLA-A01 (более предпочтительно HLA-A*0101), как у индивидуума для введения, так и у донора.

Альтернативно, АПК или экзосомы, применяемые в вышеописанных способах, предпочтительно представляют собой АПК или экзосомы, которые презентируют на своей поверхности комплекс из HLA-A01 (более предпочтительно HLA-A*0101) и пептида по настоящему изобретению (пептида с аминокислотной последовательностью, выбранной из числа SEQ ID NO: 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107, и 108, или его модифицированного пептида). В этом случае, индуцированные ЦТЛ демонстрируют специфическую цитотоксическую активность против клеток, которые презентируют комплекс из HLA-A01 и пептида по настоящему изобретению (например, DEPDC1-экспрессирующие HLA-A01-положительные клетки).

В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к композициям или фармацевтическим композициям для индуцирования ЦТЛ, содержащим по меньшей мере один активный ингредиент, выбранный из нижеизложенных:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к применению активного ингредиента, выбранного из нижеизложенных, в производстве композиций или фармацевтических композиций для индуцирования ЦТЛ:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности.

Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к активному ингредиенту, выбранному из нижеизложенных, для применения в индуцировании ЦТЛ:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности.

Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к способу или процессу для производства композиции или фармацевтической композиции для индуцирования ЦТЛ, где способ или процесс включает этап формулирования активного ингредиента, выбранного из нижеизложенных, с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение дополнительно относится к способу или процессу для производства композиции или фармацевтической композиции для индуцирования ЦТЛ, где способ или процесс включает этап смешивания активного ингредиента, выбранного из нижеизложенных, с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности.

XI. Способы индуцирования иммунного ответа

Настоящее изобретение дополнительно относится к способам индуцирования иммунного ответа против DEPDC1-экспрессирующих злокачественных опухолей. Подходящие злокачественные опухоли включают рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, хронический миелолейкоз (ХМЛ), рак толстого кишечника, рак желудка, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, мелкоклеточный рак легких (SCLC), опухоль мягких тканей и т.п., не ограничиваясь вышеизложенными. Предпочтительно, чтобы злокачественная опухоль экспрессировала, по меньшей мере, один HLA, выбранный из HLA-A11 и HLA-A01.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способам индуцирования иммунного ответа против DEPDC1-экспрессирующих злокачественных клеток. Признано, что DEPDC1 сверхэкспрессирован в различных типах злокачественных опухолей, описанных выше. Таким образом, когда индуцируется иммунный ответ против DEPDC1-экспрессирующих злокачественных клеток, в результате ингибируется пролиферация злокачественных клеток. Таким образом, настоящее изобретение дополнительно относится к способам ингибирования пролиферации DEPDC1-экспрессирующих злокачественных клеток. Способы по настоящему изобретению подходят, в частности, для ингибирования пролиферации злокачественных клеток, экспрессирующих DEPDC1 и, по меньшей мере, один HLA, выбранный из HLA-A11, HLA-A33, HLA-A03 и HLA-A01.

Способы по настоящему изобретению могут включать этап введения композиции, содержащей любой из пептидов по настоящему изобретению или полинуклеотида/полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы). Способы по настоящему изобретению также включают введение АПК или экзосом, презентирующих любой из пептидов по настоящему изобретению. За деталями можно обращаться в раздел «IX. Фармацевтические композиции», в частности, к частям, описывающим применение фармацевтических композиций по настоящему изобретению в качестве вакцин. Кроме того, экзосомы и АПК, которые можно использовать в способах по настоящему изобретению для индуцирования иммунного ответа, описаны подробно в «V. Экзосомы», «VI. Антигенпрезентирующие клетки (АПК)» и в пунктах (1) и (2) из «X. Способы применения пептидов, экзосом, АПК и ЦТЛ», описанных выше.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям или вакцинам для индуцирования иммунного ответа против DEPDC1-экспрессирующих злокачественных опухолей, где фармацевтическая композиция или вакцина содержит активный ингредиент, выбранный из нижеизложенных:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

Альтернативно, настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям или вакцинам для индуцирования иммунного ответа против DEPDC1-экспрессирующих злокачественных клеток, где фармацевтическая композиция или вакцина содержит активный ингредиент, выбранный из нижеизложенных:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к фармацевтическим композициям или вакцинам для ингибирования пролиферации DEPDC1-экспрессирующих злокачественных клеток, где фармацевтическая композиция или вакцина содержит активный ингредиент, выбранный из нижеизложенных:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению активного ингредиента, выбранного из нижеизложенных, в производстве фармацевтических композиций или вакцин для индуцирования иммунного ответа против DEPDC1-экспрессирующих злокачественных опухолей:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

Альтернативно, настоящее изобретение относится к применению активного ингредиента, выбранного из нижеизложенных, в производстве фармацевтических композиций или вакцин для индуцирования иммунного ответа против DEPDC1-экспрессирующих злокачественных клеток:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

Альтернативно, настоящее изобретение относится к применению активного ингредиента, выбранного из нижеизложенных, в производстве фармацевтических композиций или вакцин для ингибирования пролиферации DEPDC1-экспрессирующих злокачественных клеток:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способам или процессам для производства фармацевтических композиций, которые индуцируют иммунный ответ против DEPDC1-экспрессирующих злокачественных опухолей, при этом способ может включать этап смешивания или формулирования пептида или полинуклеотида по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым носителем.

Альтернативно, настоящее изобретение относится к способам для ингибирования пролиферации DEPDC1-экспрессирующих злокачественных клеток или к способам индуцирования иммунного ответа против DEPDC1-экспрессирующих злокачественных опухолей, которые включают этап введения индивидууму вакцин или фармацевтических композиций, содержащих активный ингредиент, выбранный из нижеизложенных:

(a) пептид по настоящему изобретению;

(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;

(c) АПК, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;

(d) экзосома, которая презентирует пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и

(e) ЦТЛ по настоящему изобретению.

В контексте настоящего изобретения, DEPDC1-экспрессирующие злокачественные опухоли можно лечить путем введения пептида, полипептида, АПК, экзосомы и/или ЦТЛ по настоящему изобретению. Альтернативно, иммунный ответ против DEPDC1-экспрессирующих злокачественных опухолей можно индуцировать путем введения пептида, полипептида, АПК, экзосомы и/или ЦТЛ по настоящему изобретению. Примеры таких злокачественных опухолей включают рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, хронический миелолейкоз (ХМЛ), рак толстого кишечника, рак желудка, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, мелкоклеточный рак легких (SCLC), опухоль мягких тканей и т.п., не ограничиваясь перечисленными. Дополнительно, иммунный ответ против DEPDC1-экспрессирующих злокачественных клеток можно индуцировать путем введения пептида, полипептида, АПК, экзосомы и/или ЦТЛ по настоящему изобретению. Таким образом, перед введением вакцины или фармацевтической композиции, содержащей вышеописанный активный ингредиент, предпочтительно подтвердить, увеличен ли уровень экспрессии DEPDC1 в больном участке у индивидуума, подлежащего лечению, или нет.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к лечению DEPDC1-экспрессирующей злокачественной опухоли у пациента, нуждающегося в лечении злокачественных опухолей, где способ включает нижеизложенные этапы:

(i) измерение уровня экспрессии DEPDC1 в биологическом образце, полученном из больного участка индивидуума со злокачественной опухолью;

(ii) выявление индивидуума с DEPDC1-экспрессирующей злокачественной опухолью на основании уровня экспрессии DEPDC1, измеренного в (i); и

(iii) введение индивидууму с DEPDC1-экспрессирующей злокачественной опухолью, по меньшей мере, одного ингредиента, выбранного из группы, состоящей из вышеописанных от (a) до (e).

Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к вакцинам и фармацевтическим композициям, содержащим, по меньшей мере, один активный ингредиент, выбранный из группы, состоящей из вышеописанных от (a) до (e), для введения индивидууму с DEPDC1-экспрессирующей злокачественной опухолью. Настоящее изобретение дополнительно относится к способу выявления или отбора индивидуума, подлежащего лечению, по меньшей мере, одним активным ингредиентом, выбранным из группы, состоящей из вышеописанных от (a) до (e), где способ включает нижеизложенные этапы:

(i) измерение уровня экспрессии DEPDC1 в биологическом образце, полученном из больного участка индивидуума со злокачественной опухолью;

(ii) выявление индивидуума с DEPDC1-экспрессирующей злокачественной опухолью на основании уровня экспрессии DEPDC1, измеренного в (i); и

(iii) идентификация или отбор индивидуума, выявленного в (ii) как индивидуума, которого можно лечить, по меньшей мере, одним активным ингредиентом, выбранным из группы, состоящей из вышеописанных от (a) до (e).

Биологические образцы, собранные у индивидуума для измерения уровня экспрессии DEPDC1 в вышеописанных способах, конкретно не ограничены, и например, можно предпочтительно использовать образцы ткани, полученные путем биопсии и т.п. и содержащие злокачественные клетки. Уровень экспрессии DEPDC1 в биологическом образце можно измерять известными способами, и например, можно использовать способы, которые детектируют продукты транскрипции гена DEPDC1 при помощи зондов, или способы ПЦР (например, способ микропанелей с кДНК, способ Нозерн-блоттинга, способ ОТ-ПЦР или т.п.), способы, которые детектируют продукты трансляции гена DEPDC1 при помощи антител или т.п. (например, способ Вестерн-блоттинга, способ иммуноокрашивания или т.п.), и т.п. Дополнительно, биологические образцы могут быть образцами крови, и в этом случае, измеряют уровень антител против DEPDC1 в крови, и можно оценивать уровень экспрессии DEPDC1 в месте заболевания на основании уровня в крови. Уровень антитела против DEPDC1 в крови можно измерять с применением известных способов, и, например, можно использовать иммуноферментный анализ (EIA), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунологический анализ (РИА) и т.п., с использованием белка DEPDC1 или пептида по настоящему изобретению в качестве антигена.

Как правило, в тканях и клетках, которые не экспрессируют DEPDC1, практически не выявляются продукты транскрипции и трансляции DEPDC1. Таким образом, когда продукт транскрипции или трансляции DEPDC1 детектируется в полученных от индивидуума злокачественных клетках или образце ткани, содержащем злокачественные клетки, можно определить, что злокачественная опухоль индивидуума экспрессирует DEPDC1. В образцах крови индивидуума, у которого нет DEPDC1-экспрессирующей злокачественной опухоли, практически не выявляются антитела против DEPDC1 или их фрагменты. Таким образом, когда антитела против DEPDC1 или их фрагменты детектируются в образце крови, полученном от индивидуума, можно определить, что злокачественная опухоль индивидуума экспрессирует DEPDC1. Экспрессирует ли злокачественная опухоль индивидуума DEPDC1 или нет, также можно определить при сравнении результатов измерений в биологическом материале того же типа, полученном из неопухолевого участка индивидуума или в биологическом материале того же типа, полученном от индивидуума без злокачественной опухоли (образец здорового контроля). То есть при сравнении с уровнем мишени измерения в образце здорового контроля (уровень у здорового контроля), если уровень в биологическом образце исследуемого индивидуума повышен, злокачественную опухоль индивидуума оценивают как экспрессирующую DEPDC1. Например, когда количество выявленной мишени измерения повышено, по меньшей мере, на 10% или более по сравнению уровнем у здорового контроля, злокачественную опухоль индивидуума можно оценивать как экспрессирующую DEPDC1. Желательно, чтобы количество выявленной мишени измерения было повышено предпочтительно на 25% или более, и более предпочтительно, на 50% или более, чем уровень у здорового контроля. Дополнительно, количество выявленного продукта транскрипции или трансляции DEPDC1 можно оценивать при нормализации его против выявленного количества известного гена «домашнего хозяйства», такого как бета-актин, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа, или рибосомальный белок P1.

В предпочтительном варианте осуществления, предпочтительно подтверждать тип HLA у индивидуума перед введением, по меньшей мере, одного активного ингредиента, выбранного из группы, состоящей из вышеизложенных от (a) до (e). Например, для индивидуумов, которым вводят активный ингредиент, связанный с пептидом с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 1, предпочтительно выбирать HLA-A11-положительных индивидуумов. Для индивидуумов, которым вводят активный ингредиент, связанный с пептидом с аминокислотной последовательностью, выбранной из числа SEQ ID NO: 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107, и 108, предпочтительно выбирать HLA-A01-положительных индивидуумов.

Настоящее изобретение дополнительно относится к комплексам пептида по настоящему изобретению и HLA. Вышеописанные комплексы по настоящему изобретению могут быть мономерами или мультимерами. Когда комплекс по настоящему изобретению является мультимером, число полимеров конкретно не ограничено, и он может быть мультимером с любым числом полимеров. Примеры включают тетрамер, пентамер, гексамер и т.п., но не ограничиваются перечисленными. Мультимеры по настоящему изобретению также включают декстрамеры (WO2002/072631) и стрептамеры (Knabel M et al., Nat Med. 2002 Jun; 8(6): 631-7.). Комплексы пептида по настоящему изобретению и HLA можно получать в соответствии с известными способами (например, Altman JD et al., Science.1996, 274(5284): 94-6; WO2002/072631; WO2009/003492; Knabel M et al., Nat Med. 2002 Jun; 8(6): 631-7, и т.д.). Комплексы по настоящему изобретению, например, можно использовать в количественной оценке ЦТЛ, специфичных к пептиду по настоящему изобретению. Например, образец крови получают у индивидуума, которому вводили фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, и после отделения PBMC получают CD4-негативные клетки и приводят их в контакт с комплексом по настоящему изобретению, который конъюгирован с флуоресцентным красителем. Затем, можно измерять процентное содержание ЦТЛ, специфичных к пептиду по настоящему изобретению, путем анализа проточной цитометрией. Например, воздействия фармацевтической композиции по настоящему изобретению на индуцирование иммунного ответа можно контролировать, измеряя специфические ЦТЛ против пептида по настоящему изобретению до, во время и/или после введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению.

XII. Антитела

Настоящее изобретение дополнительно относится к антителам, которые связываются с пептидом по настоящему изобретению. Предпочтительные антитела специфически связываются с пептидом по настоящему изобретению, но не связываются (или слабо связываются) с пептидом, который не является пептидом по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления такое антитело может включать антитело, которое распознает пептид относительно молекул HLA, т.е. антитело, которое связывается с комплексом пептид-MHC. Специфичность связывания антитела можно подтверждать анализом ингибирования. То есть если связывание между анализируемым антителом и полноразмерным полипептидом DEPDC1 ингибируется в присутствии пептида по настоящему изобретению, такое антитело демонстрирует специфическое связывание с пептидом по настоящему изобретению. Антитела против пептидов по настоящему изобретению можно использовать в анализах для диагностики и прогнозирования заболевания, а также отбора индивидуума для введения фармацевтических композиций по настоящему изобретению и мониторинга фармацевтических композиций по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к различным иммунологическим анализам для детекции и/или количественного определения пептидов по настоящему изобретению или их фрагментов. Такие иммунологические анализы включают радиоиммунологический анализ, имунохроматографию, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), иммуноферментный флуоресцентный анализ (ELIFA) и т.п., не ограничиваясь перечисленными, и их проводят в рамках различных форматов иммунологических анализов, хорошо известных в данной области.

Антитела по настоящему изобретению можно использовать в способах иммунологической визуализации, которые могут выявлять DEPDC1-экспрессирующие злокачественные опухоли, и их примеры включают радиоактивную сцинтиграфию с использованием меченого антитела по настоящему изобретению, не ограничиваясь указанным. Такие способы анализа используют в клинике для детекции, мониторинга, и прогнозирования DEPDC1-экспрессирующих злокачественных опухолей; и примеры таких злокачественных опухолей включают рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, хронический миелолейкоз (ХМЛ), рак толстого кишечника, рак желудка, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, мелкоклеточный рак легких (SCLC), опухоль мягких тканей и т.п., не ограничиваясь перечисленными.

Антитела по настоящему изобретению можно использовать в любой произвольной форме, такой как моноклональные антитела или поликлональные антитела, и они могут дополнительно включать антитела, полученные при иммунизации животного, такого как кролик, пептидом по настоящему изобретению, все классы поликлональных антител и моноклональных антител, антитела человека, а также химерные антитела и гуманизированные антитела, полученные путем генетической рекомбинации.

Пептид по настоящему изобретению или его фрагмент, применяемый в качестве антигена для получения антител, можно получать путем химического синтеза или способов генетической инженерии, на основании аминокислотных последовательностей, описываемых в настоящем документе.

Пептид, применяемый в качестве иммунизирующего антигена, может быть пептидом по настоящему изобретению или фрагментом пептида по настоящему изобретению. Дополнительно, пептид может быть связан или конъюгирован с носителем для повышения иммуногенности. Гемоцианин морского блюдца (KLH) является хорошо известным носителем. Способы для связывания KLH с пептидом также хорошо известны в данной области.

Любое млекопитающее можно иммунизировать вышеописанным антигеном, и предпочтительно рассматривать совместимость сродительской клеткой, применяемой в слиянии клеток, при получении моноклонального антитела. Как правило, можно использовать животных отряда Грызуны (Rodentia), Зайцеобразные (Lagomorpha) или Приматы (Primate). Животные отряда Грызунов включают, например, мышей, крыс и хомяков. Животные отряда Зайцеобразных включают, например, кроликов. Животные отряда Приматов включают, например, обезьян катарринов (обезьян старого света), таких как яванский макак (Macaca fascicularis), макаки-резусы, гамадрилы, и шимпанзе.

Способы иммунизации животных антигеном известны в данной области. Интраперитонеальная и подкожная инъекции антигена являются стандартными способами для иммунизации млекопитающих. Более конкретно, антиген разбавляют и суспендируют в соответствующем количестве фосфатно-солевого буфера (PBS), физиологического раствора, или т.п. По мере необходимости, раствор суспензии антигена можно вводить млекопитающим после смешивания с соответствующим количеством стандартного адъюванта, такого как полный адъювант Фрейнда, и эмульсификации. Затем предпочтительно вводить антиген, смешанный с соответствующим количеством неполного адъюванта Фрейнда несколько раз в интервале от 4 до 21 суток. Для иимунизации можно использовать подходящий носитель. После вышеуказанной иммунизации, сыворотку можно тестировать стандартным способом на увеличение количества желаемого антитела.

Поликлональные антитела против пептида по настоящему изобретению можно получать, забирая кровь у млекопитающих, у которых было подтверждено увеличение уровня желаемого антитела в сыворотке после иммунизации, и отделяя сыворотку от крови любым общепринятым способом. Поликлональное антитело может быть сывороткой, содержащей поликлональное антитело, или из сывороткии можно выделять фракцию, содержащую поликлональное антитело. Иммуноглобулин G или M можно получать из фракций, которые распознают только пептид по настоящему изобретению, например, с использованием аффинной колонки, конъюгированной с пептидом по настоящему изобретению, а затем дополнительной очистки фракций с использованием колонки с белком A или белком G.

Для того чтобы приготовить моноклональные антитела, после подтверждения увеличения уровня желаемого антитела в сыворотке после иммунизации, у млекопитающих забирают иммунные клетки и проводят клеточное слияние. Иммунные клетки, используемые для слияния клеток, предпочтительно можно получать из селезенки. Для других родительских клеток, которые сливают с вышеуказанными иммунными клетками, можно использовать, например, миеломную клетку млекопитающих, и более предпочтительно, миеломную клетку, которая приобрела свойство селекции по лекарственному средству клеток для слияния.

Вышеуказанные иммунные клетки можно сливать с миеломными клетками следующими известными способами, например, способом из Milstein et al. (Galfre и Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)).

Гибридомы, полученные путем слияния клеток, можно отбирать, культивируя их в стандартной селективной среде, такой как среда HAT (среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Культивирование клеток обычно продолжают в среде HAT в течение достаточного периода времени (например, от нескольких суток до нескольких недель), чтобы погибли все остальные клетки (не слитые клетки), кроме желаемых гибридом. Затем, гибридомные клетки, вырабатывающие желаемое антитело можно отбирать и клонировать, проводя стандартные лимитирующие разведения.

В дополнение к вышеописанным способам иммунизации не являющегося человеком животного при помощи антигена для получения гибридомы, можно иммунизировать лимфоциты человека, такие как лимфоциты, инфицированные вирусом Эпштейна-Барр, in vitro пептидом, клетками, экспрессирующими пептид, или их лизатами. Затем иммунизированные лимфоциты можно сливать с иммортализованными миеломными клетками, полученными от человека, такими как U266, для получения гибридом, производящих желаемое антитело человека, способное связываться с пептидом (JPS63-17688).

Затем, полученную гибридому пересаживают в брюшную полость мыши, и забирают асцитную жидкость. Полученное моноклональное антитело можно очищать, например, путем осаждения сульфатом аммония, на колонках с белком A или белком G, ионообменной хроматографией с DEAE, или на аффинной колонке, конъюгированной с пептидом по настоящему изобретению.

Альтернативно, антителопродуцирующие иммунные клетки, такие как иммунизированные лимфоциты, можно иммортализовать при помощи гена злокачественной опухоли ген и использовать для получения моноклональных антител.

Моноклональные антитела, полученные таким образом, также можно получать путем рекомбинации с использованием способов генетической инженерии (см., например, Borrebaeck и Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, опубликованную в Великобритании у MacMillan Publishers LTD (1990)). Например, ДНК, кодирующую антитело, можно клонировать в иммунные клетки, такие как клетки антителопродуцирующей гибридомы или иммунизированные лимфоциты, и вставить в подходящий вектор, а затем ввести в клетки-хозяева для получения рекомбинантного антитела. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным антителам, полученным, как описано выше.

Дополнительно, антитела по настоящему изобретению могут быть фрагментами антител или модифицированными антителами, при условии, что они связываются с пептидами по настоящему изобретению. Например, желательно, чтобы фрагмент антитела содержал антигенсвязывающий участок/участки антител. Конкретно, фрагменты антител могут быть Fab, F(ab')2, Fv, или одноцепочечным Fv(scFv), в котором фрагменты Fv, полученные из тяжелой и легкой цепей связаны подходящим линкером (Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)). Более конкретно, фрагменты антител можно получать при обработке антитела ферментом, таким как папаин или пепсин. Альтернативно, можно сконструировать ген, кодирующий фрагмент антитела, вставить в экспрессирующий вектор, и экспрессировать в подходящей клетке-хозяине (см., например, Co et al., J Immunol 152: 2968-76 (1994); Better и Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989); Pluckthun и Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989); Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986); Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986); Bird и Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)).

Антитела можно модифицировать путем конъюгации с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Настоящее изобретение относится к таким модифицированным антителам. Модифицированные антитела можно получать путем химической модификации антител. Эти способы модификации являются общепринятыми в данной области.

Альтернативно, антитела по настоящему изобретению можно получать в виде химерных антител из вариабельной области антитела, не принадлежащего человеку, и константной области антитела человека, или в виде гуманизированных антител, которые содержат определяющую комплементарность область (CDR) из антитела, не принадлежащего человеку, и каркасную область, и константную область (FR) из антитела человека. Такие антитела можно получать в соответствии с известными способами. Гуманизацию можно проводить, замещая последовательность/последовательности антитела человека соответствующей последовательностью/последовательностями CDR из антитела, не принадлежащего человеку (см., например, Verhoeyen et al., Science 239: 1534-6 (1988)). Таким образом, такие гуманизированные антитела представляют собой химерные антитела, в которых по существу менее чем интактный вариабельный домен человека замещен соответствующей последовательностью от видов, не являющихся человеком.

Также можно использовать интактные антитела человека, содержащие вариабельную область человека в дополнение к каркасу и константным областям человека. Такие антитела можно получать при помощи различных способов, известных в данной области. Например, способы in vitro включают использование рекомбинантных библиотек из фрагментов антител человека, презентированных на бактериофагах (например, Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991)). Аналогично, антитела человека можно также получать, вводя локусы гена иммуноглобулина человека трансгенным животным, например, мышам, у которых гены эндогенных иммуноглобулинов были частично или полностью инактивированы. Этот подход описан, например, в патентах США №№ 6150584, 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425 и 5661016.

Антитела, полученные, как описано выше, можно очищать для гомогенности. Например, выделение и очистку антител можно проводить в соответствии со способами выделения и способами очистки, применяемыми для распространенных белков. Например, антитело можно отделять и изолировать при помощи соответствующим образом выбранного и скомбинированного применения хроматографии на колонках, такой как аффинная хроматография, фильтрации, ультрафильтрации, высаливания, диализа, SDS-электрофореза в полиакриламидном геле и электрофореза с изоэлектрофокусированием (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow и David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), но не ограничиваясь перечисленными. Колонку с белком A и колонку с белком G можно использовать в качестве аффинной колонки. Примеры колонок с белком A, которые можно использовать, включают, например, Hyper D, POROS и Sepharose F.F. (Pharmacia).

Кроме аффинной хроматографии, примеры хроматографии включают, например, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию, хроматографию с обратной фазой, адсорбционную хроматографию и т.п. (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Хроматографию можно проводить путем хроматографии в жидкой фазе, такой как ВЭЖХ и FPLC.

Активность связывания антигена для антитела по настоящему изобретению можно измерять, например, при помощи измерения оптической плотности, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), иммуноферментного анализа (EIA), радиоиммунологического анализа (РИА), и/или иммунофлуоресценции (IF). В случае ELISA, антитело по настоящему изобретению иммобилизуют на планшете, пептид по настоящему изобретению наносят на планшет, а затем наносят образец, содержащий желаемое антитело, такой как культуральный супернатант антителопродуцирующих клеток или очищенные антитела. Затем наносят вторичное антитело, которое распознает первичное антитело и помечено ферментом, таким как щелочная фосфатаза, и инкубируют планшет. Затем после отмывания на планшет наносят субстрат для фермента, такой как п-нитрофенилфосфат, и оценивают активность связывания антигена для образца по измерению оптической плотности. Для оценки активности связывания антитела, в качестве антигена можно использовать пептидные фрагменты, такие как C-концевые или N-концевые фрагменты. Для оценки активности антитела по настоящему изобретению можно использовать BIAcore (Pharmacia).

Возможно выявлять или измерять пептид по настоящему изобретению при помощи вышеописанных способов, добавляя антитело по настоящему изобретению к образцу, предположительно содержащему пептид по настоящему изобретению, и выявляя или измеряя иммунный комплекс, образовавшийся между антителом и пептидом.

Например, антитело по настоящему изобретению можно использовать для выявления пептида по настоящему изобретению, присутствующего в образце крови (например, образце сыворотки) индивидуума. Альтернативно, антитело по настоящему изобретению, присутствующее в образце крови (например, образце сыворотки) индивидуума, также можно выявлять при помощи пептида по настоящему изобретению. Результат измерения пептида по настоящему изобретению или антитела по настоящему изобретению в образце крови индивидуума можно использовать для отбора индивидуума для введения фармацевтических композиций по настоящему изобретению или мониторинга эффективности фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Кроме того, опубликовано, что пациенты, у которых есть антитело против пептида, вводимого в качестве вакцины, могут иметь высокую восприимчивость к вакцине. Таким образом, пептид по настоящему изобретению можно использовать в качестве антигена для иммунологического анализа с использованием антитела к пептиду как индикатора для отбора из числа раковых пациентов пациента с ожидаемой высокой восприимчивостью к вакцине, содержащей пептид.

XIII. Векторы и клетки-хозяева

Настоящее изобретение относится к векторам, содержащим полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению, и клетки-хозяева, в которые введены векторы. Вектор по настоящему изобретению можно использовать для хранения полинуклеотида по настоящему изобретению в клетке-хозяине, для экспрессии пептида по настоящему изобретению в клетке-хозяине, или для введения полинуклеотида по настоящему изобретению для генотерапии.

Когда E. coli является клеткой-хозяином и вектор амплифицируют в большом количестве в E. coli (например, JM109, DH5-альфа, HB101 или XL1-Blue), вектор должен иметь «точку начала репликации» для амплификации в E. coli и маркерный ген для селекции трансформированных E. coli (например, ген резистентности к лекарственному средству, отбирающий по лекарственному средству, такому как ампициллин, тетрациклин, канамицин, хлорамфеникол). Например, можно использовать векторы серии M13, векторы серии pUC, pBR322, pBluescript, pCR-Script и т.п. Кроме того, для клонирования можно использовать pGEM-T, pDIRECT и pT7, а также вышеуказанные векторы. Когда вектор используют для продукции пептида по настоящему изобретению, можно использовать экспрессирующий вектор. Например, экспрессирующий вектор для экспрессии в E. coli должен иметь вышеуказанные характеристики для амплификации в E. coli. Когда E. coli, такие как JM109, DH5-альфа, HB101 или XL1-Blue используют в качестве клетки-хозяина, вектор должен иметь промотор, например, промотор lacZ (Ward et al., Nature 341: 544-6 (1989); FASEB J 6: 2422-7 (1989)), промотор araB (Better et al., Science 240: 1041-3 (1988)), промотор T7 или т.п., который может эффективно экспрессировать желаемый ген в E. coli. В этом отношении вместо вышеуказанных векторов можно использовать, например, pGEX-5X-1 (Pharmacia), "QIAexpress system" (Qiagen), pEGFP и pET (в этом случае, хозяином предпочтительно являются BL21, которые экспрессируют РНК-полимеразу T7). Дополнительно, вектор может содержать сигнальную последовательность для секреции пептида. Иллюстративной сигнальной последовательностью, которая направляет пептид для секреции в периплазматическое пространство E. Coli, является сигнальная последовательность pelB (Lei et al., J Bacteriol 169: 4379 (1987)). Способы для введения векторов в целевые клетки-хозяева включают, например, способ с хлоридом кальция и способ электропорации.

В дополнение к E. coli, для получения полипептида по настоящему изобретению можно использовать, например, экспрессирующие векторы, полученные от млекопитающих (например, pcDNA3 (Invitrogen) и pEGF-BOS (Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990)), pEF, pCDM8), экспрессирующие векторы, полученные из клеток насекомых (например, "экспрессирующая бакуловирусная система Bac-to-BAC" (GIBCO BRL), pBacPAK8), экспрессирующие векторы, полученные из растений (например, pMH1, pMH2), экспрессирующие векторы, полученные из вирусов животных (например, pHSV, pMV, pAdexLcw), экспрессирующие векторы, полученные из ретровирусов (например, pZIpneo), экспрессирующие векторы, полученные из дрожжей (например, "Pichia Expression Kit" (Invitrogen), pNV11, SP-Q01) и экспрессирующие векторы, полученные из Bacillus subtilis (например, pPL608, pKTH50).

Для того чтобы экспрессировать вектор в клетках животных, таких как клетки CHO, COS или NIH3T3, вектор должен нести промотор, необходимый для экспрессии в таких клетках, например, промотор SV40 (Mulligan et al., Nature 277: 108 (1979)), промотор MMLV-LTR, промотор EF1-альфа (Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)), промотор CMV и т.п., и предпочтительно маркерный ген для селекции трансформантов (например, ген резистентности к лекарственному средству, отбирающий по лекарственному средству (например, неомицину, G418)). Примеры известных векторов с этими характеристиками включают, например, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV и pOP13.

Варианты осуществления настоящего изобретения проиллюстрированы ниже на основании вышеизложенного объяснения, однако настоящее изобретение не ограничено этими вариантами осуществления.

[1] Пептид менее чем из 15 аминокислот со способностью индуцировать цитотоксическую T-клетку (ЦТЛ), который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(a) аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107, и 108; и

(b) аминокислотной последовательности, в которой одна, две или несколько аминокислот замещены, удалены, вставлены и/или добавлены к аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107, и 108.

[2] Пептид из [1], который выбран из группы, состоящей из нижеизложенных от (i) до (ii):

(i) пептид, содержащий аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из нижеизложенных от (a) до (d), введены в аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1:

(a) вторая аминокислота с N-конца замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из треонина, валина, изолейцина, лейцина, фенилаланина и тирозина;

(b) третья аминокислота с N-конца замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лейцина, фенилаланина, тирозина, изолейцина и аланина;

(c) седьмая аминокислота с N-конца замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лейцина, изолейцина, тирозина, валина и фенилаланина; и

(d) C-концевая аминокислота замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лизина и аргинина; и

(ii) пептид, содержащий аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из нижеизложенных от (a) до (c), введены в аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107, и 108:

(a) первая аминокислота с N-конца замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты;

(b) вторая аминокислота с N-конца замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из фенилаланина, тирозина, аланина, изолейцина, лейцина и валина; и

(c) C-концевая аминокислота замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из аргинина и лизина;

(iii) пептид, содержащий аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из нижеизложенных от (a) до (b), введены в аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107, и 108:

(a) вторая аминокислота с N-конца замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лейцина, метионина, валина, аланина, изолейцина, серина и треонина; и

(b) C-концевая аминокислота замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из аргинина, лизина, тирозина и фенилаланина; и

(iv) пептид, содержащий аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из нижеизложенных от (a) до (c), введены в аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41:

(a) вторая аминокислота с N-конца замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из треонина и серина;

(b) третья аминокислота с N-конца замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты; и

(c) C-концевая аминокислота замещена тирозином.

[3] Пептид из [1], который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 28, 30, 32, 61, 62, 63, 64, 67, 74, 77, 52, 79, 80, 85, 27, 86, 87, 90, 92, 46, 95 и 41.

[4] Полинуклеотид, который кодирует пептид по любому из пп. с [1] до [3].

[5] Композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и, по меньшей мере, один ингредиент, выбранный из группы, состоящей из нижеизложенных от (a) до (e):

(a) один или несколько типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3];

(b) один или несколько типов полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы) по любому из пп. с [1] до [3] в экспрессируемой форме;

(c) антигенпрезентирующая клетка (АПК), которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA;

(d) экзосома, которая презентирует на своей поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA; и

(e) ЦТЛ, который нацелен на пептид по любому из пп. с [1] до [3].

[6] Композиция по п. [5], которая является композицией для индуцирования ЦТЛ, где ингредиент представляет собой, по меньшей мере, один ингредиент, выбранный из группы, состоящей из из нижеизложенных от (a) до (d):

(a) один или несколько типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3];

(b) один или несколько типов полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы) по любому из пп. с [1] до [3] в экспрессируемой форме;

(c) антигенпрезентирующая клетка (АПК), которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA;

(d) экзосома, которая презентирует на своей поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA.

[7] Композиция по п. [5], которая является фармацевтической композицией.

[8] Композиция по п. [7], которая является фармацевтической композицией для одного или нескольких применений, выбранных из группы, состоящей из (i) лечения злокачественных опухолей, (ii) предупреждения (профилактики) злокачественной опухоли и (iii) предупреждения (профилактики) послеоперационного рецидива злокачественной опухоли.

[9] Композиция по п. [7], которая предназначена для индуцирования иммунного ответа против злокачественной опухоли.

[10] Композиция по п. [8] или [9], где злокачественная опухоль выбрана из группы, включающей рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, хронический миелолейкоз (ХМЛ), рак толстого кишечника, рак желудка, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, мелкоклеточный рак легких (SCLC) и опухоль мягких тканей.

[11] Композиция по любому из пп. с [5] до [10], которую формулируют для введения индивидууму, положительному, по меньшей мере, по одному HLA, выбранному из группы, состоящей из HLA-A11 и HLA-A01.

[12] Способ индуцирования АПК со способностью индуцировать ЦТЛ, который включает этап, выбранный из группы, состоящей из нижеизложенных (a) и (b):

(a) контакт АПК с пептидом по любому из пп. с [1] до [3] in vitro, ex vivo или in vivo; и

(b) введение полинуклеотида, кодирующего пептид по любому из пп. с [1] до [3], в АПК.

[13] Способ индуцирования ЦТЛ, который включает этап, выбранный из группы, состоящей из нижеизложенных от (a) до (c):

(a) совместное культивирование CD8-положительной T-клетки/клеток с АПК, которые презентируют на своей поверхности комплекс из антигена HLA и пептида по любому из пп. с [1] до [3];

(b) совместное культивирование CD8-положительной T-клетки/клеток с экзосомой/экзосомами, которые презентируют на своей поверхности комплекс из антигена HLA и пептида по любому из пп. с [1] до [3]; и

(c) введение в CD8-положительную T-клетку/клетки полинуклеотида, кодирующего каждую субъединицу T-клеточного рецептора (TCR), способного связываться с пептидом по любому из пп. с [1] до [3], презентированным при помощи антигена HLA на клеточной поверхности.

[14] АПК, которая презентирует на своей поверхности комплекс из антигена HLA и пептида по любому из пп. с [1] до [3].

[15] АПК по п. [14], которая индуцирована при помощи способа из п. [12].

[16] ЦТЛ, которая нацелена на пептид по любому из пп. с [1] до [3].

[17] ЦТЛ из п. [16], которая индуцирована при помощи способа из п. [13].

[18] Способ индуцирования иммунного ответа против злокачественной опухоли, который включает введение индивидуумукомпозиции, содержащей, по меньшей мере, один ингредиент, выбранный из группы, состоящей из нижеизложенных с (a) по (e):

(a) один или несколько типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3];

(b) один или несколько типов полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы) по любому из пп. с [1] до [3] в экспрессируемой форме;

(c) антигенпрезентирующая клетка (АПК), которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA;

(d) экзосома, которая презентирует на своей поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA; и

(e) ЦТЛ, который нацелен на пептид по любому из пп. с [1] до [3].

[19] Способ лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, и/или профилактики ее послеоперационного рецидива, который включает введение индивидууму, по меньшей мере, одного ингредиента, выбранного из группы, состоящей из нижеизложенных пп. с (a) по (e):

(a) один или несколько типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3];

(b) один или несколько типов полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы) по любому из пп. с [1] до [3] в экспрессируемой форме;

(c) антигенпрезентирующая клетка (АПК), которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA;

(d) экзосома, которая презентирует на своей поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA; и

(e) ЦТЛ, который нацелен на пептид по любому из пп. с [1] до [3].

[20] Антитело, которое связывается с пептидом по любому из пп. с [1] до [3].

[21] Способ скрининга на пептид со способностью индуцировать ЦТЛ, который включает этапы:

(a) создания кандидатных последовательностей, состоящих из аминокислотной последовательности, в которой один, два, или несколько аминокислотных остатков замещены, удалены, вставлены и/или добавлены по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 81, 82, 21, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 58, 92, 96, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 107, и 108;

(b) отбора в кандидатных последовательностях, полученных в (a), кандидатной последовательности, которая не имеет значительной гомологии (идентичности последовательности) с любым известным продуктом гена человека, за исключением DEPDC1;

(c) контакта пептида, состоящего из кандидатной последовательности, выбранной в (b), с АПК;

(d) контакта АПК из (c) с CD8-положительной T-клеткой/клетками; и

(e) отбора пептида, который имеет равную или более высокую способность индуцировать ЦТЛ, по сравнению с пептидом, состоящим из исходной аминокислотной последовательности.

[22] Применение, по меньшей мере, одного ингредиента выбранного из группы, состоящей из нижеизложенных пп. с (a) по (e), в производстве композиции для индуцирования иммунного ответа против злокачественной опухоли:

(a) один или несколько типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3];

(b) один или несколько типов полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы) по любому из пп. с [1] до [3] в экспрессируемой форме;

(c) антигенпрезентирующая клетка (АПК), которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA;

(d) экзосома, которая презентирует на своей поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA; и

(e) ЦТЛ, который нацелен на пептид по любому из пп. с [1] до [3].

[23] Применение, по меньшей мере, одного активного ингредиента выбранного из группы, состоящей из нижеизложенных пп. с (a) по (e), в производстве фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, и/или профилактики ее послеоперационного рецидива:

(a) один или несколько типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3];

(b) один или несколько типов полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы) по любому из пп. с [1] до [3] в экспрессируемой форме;

(c) антигенпрезентирующая клетка (АПК), которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA;

(d) экзосома, которая презентирует на своей поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA; и

(e) ЦТЛ, который нацелен на пептид по любому из пп. с [1] до [3].

[24] Применение, по меньшей мере, одного активного ингредиента выбранного из группы, состоящей из нижеизложенных пп. с (a) по (e), для индуцирования иммунного ответа против злокачественной опухоли:

(a) один или несколько типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3];

(b) один или несколько типов полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы) по любому из пп. с [1] до [3] в экспрессируемой форме;

(c) антигенпрезентирующая клетка (АПК), которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA;

(d) экзосома, которая презентирует на своей поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA; и

(e) ЦТЛ, который нацелен на пептид по любому из пп. с [1] до [3].

[25] Применение, по меньшей мере, одного ингредиента выбранного из группы, состоящей из нижеизложенных пп. с (a) по (e), для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, и/или профилактики ее послеоперационного рецидива:

(a) один или несколько типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3];

(b) один или несколько типов полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы) по любому из пп. с [1] до [3] в экспрессируемой форме;

(c) антигенпрезентирующая клетка (АПК), которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA;

(d) экзосома, которая презентирует на своей поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA; и

(e) ЦТЛ, который нацелен на пептид по любому из пп. с [1] до [3].

[26] Способ индуцирования цитотоксической активности против DEPDC1-экспрессирующей клетки/клеток, который включает этап введения индивидууму, по меньшей мере, одного ингредиента, выбранного из группы, состоящей из нижеизложенных пп. с (a) по (e):

(a) один или несколько типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3];

(b) один или несколько типов полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы) по любому из пп. с [1] до [3] в экспрессируемой форме;

(c) антигенпрезентирующая клетка (АПК), которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA;

(d) экзосома, которая презентирует на своей поверхности комплекс из пептида по любому из пп. с [1] до [3] и антигена HLA; и

(e) ЦТЛ, который нацелен на пептид по любому из пп. с [1] до [3].

[27] Лиофилизированный состав, содержащий один или несколько типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3].

[28] Фармацевтическая композиция, которую получают способом, включающим растворение одного или нескольких типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3] в водорастворимом носителе, и проведение стерилизации фильтрованием.

[29] Водный раствор, стерилизованный фильтрованием, который представляет собой водный раствор, содержащий один или несколько типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3] и водорастворимый носитель.

[30] Эмульсия, содержащая один или несколько типов пептидов по любому из пп. с [1] до [3], водорастворимый носитель и масляный адъювант.

[31] Набор, включающий контейнер, который содержит фармацевтическую композицию по любому из пп. с [5] по [11], и контейнер, который содержит адъювант.

[32] Набор, включающий контейнер, в котором находится лиофилизированный состав, содержащий пептид по любому из пп. с [1] до [3], контейнер, в котором находится адъювант, и контейнер, в котором находится раствор для повторного растворения лиофилизированного состава.

Настоящее изобретение поясняется в настоящем документе подробно со ссылкой на его конкретные варианты осуществления. Однако следует понимать, что вышеизложенное объяснение по факту является иллюстративным и пояснительным, и предназначено для объяснения настоящего изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления. Путем общепринятого экспериментирования, специалист в данной области легко поймет, что можно производить различные изменения и модификации в пределах сущности и объема настоящего изобретения. Таким образом, настоящее изобретение не ограничивается вышеизложенным разъяснением, а определяется прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

Здесь и далее, настоящее изобретение более подробно описано со ссылкой на примеры. Однако, хотя последующие материалы, способ и примеры могу помочь специалисту в производстве и использовании определенных вариантов настоящего изобретения, они существуют только для иллюстрации аспектов настоящего изобретения, и, таким образом, нкоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения. Специалист в данной области может использовать способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, что описаны в настоящем документе, в практическом осуществлении или испытаниях по настоящему изобретению.

Все документы по известному уровню техники, процитированные в настоящем документе, включены посредством ссылки в настоящее описание.

Примеры

[Пример 1]

Материалы и способы

Линии клеток

C1R, HLA-A- и HLA-B-негативную В-лимфобластную линию клеток человека, и COS7, линию клеток почки африканской зеленой мартышки, приобретали у ATCC.

Создание клеток-стимуляторов со стабильной экспрессией HLA-A*1101

C1R (C1R-A11), которые стабильно экспрессируют HLA-A*1101, использовали в качестве клеток-стимуляторов. Амплифицировали путем ПЦР кДНК, кодирующую открытую рамку считывания HLA-A*1101, и клонировали в экспрессирующий вектор. Клетки C1R трансфицировали экспрессирующим вектором, а затем проводили селекцию при помощи G418 (Invitrogen) через две недели. Селектированные по G418 клетки высевали в лунки, содержащие среду для культивирования с G418, в 96-луночный планшет, и дополнительно культивировали в течение 30 суток. Экзогенную экспрессию HLA-A*1101 в клетках C1R подтверждали анализом проточной цитометрии.

Селекция кандидатных пептидов, полученных из DEPDC1

Девяти- и десятимерные пептиды, полученные из DEPDC1, которые связываются с молекулой HLA-A*1101 были теоретически рассчитаны при помощи программного обеспечения для предсказания связывания «NetMHC 3.2» (www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC-3.2/) (Buus et al., Tissue Antigens. 2003 Nov, 62(5): 378-84; Nielsen et al., Protein Sci. 2003 May, 12(5): 1007-17; Bioinformatics. 2004 Jun 12: 20(9): 1388-97).

Пептидный синтез

Эти пептиды синтезировали в American Пептид Company (Sunnyvale, CA) в соответствии со стандартным способом синтеза на твердой фазе, и очищали при помощи обратно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Пептиды анализировали по чистоте (>90%) и идентичности путем аналитической ВЭЖХ и масс-спектрометрии, соответственно. Пептиды растворяли в диметилсульфоксиде из расчета 20 мг/мл и хранили при -80°C.

Индукция ЦТЛ in vitro

Дендритные клетки (DC) моноцитарного происхождения использовали в качестве антигенпрезентирующей клетки для того чтобы индуцировать ответ цитотоксического T-лимфоцита (ЦТЛ) против пептидов, презентированных на лейкоцитарных антигенах человека (HLA). Как описано в других разделах, DC получали in vitro (Nakahara S et al., Cancer Res 2003, 63(14): 4112-8). Конкретно, мононуклеарные клетки периферической крови, выделенные у здоровых добровольцев (HLA-A*1101-положительных) при помощи раствора Фиколл-Пак плюс (Pharmacia) разделяли путем прикрепления к пластиковым чашкам для тканевой культуры (Becton Dickinson) и концентрировали в виде фракции моноцитов. Популяцию концентрированных моноцитов культивировали в присутствии 1000 МЕ/мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (R&D System) и 1000 МЕ/мл интерлейкина(IL)-4 (R&D System) в среде AIM-V (Invitrogen), содержащей 2% инактивированной нагреванием аутологичной сыворотки (AS). Через семь суток культивирования, цитокин-индуцированные DC были активированы 20 мкг/мл каждого из синтезированных пептидов в среде AIM-V при 37°C в течение трех часов в присутствии 3 мкг/мл бета 2-микроглобулина.

Затем, эти активированные пептидами DC были инактивированы рентгеновским облучением (20 Гр), и смешаны в соотношении 1:20 с аутологичными CD8+ T-клетками, полученными путем положительной селекции при помощи CD8 Positive Isolation Kit (Dynal). Эти культуральные продукты высевали в 48-луночный планшет (Corning). Каждая лунка содержала 1,5×104 активированных пептидами DC, 3×105 CD8+ T-клеток и 10 нг/мл IL-7 (R&D System) в 0,5 мл среды AIM-V с 2% AS.. Через три дня, к этим культуральным продуктам добавляли IL-2 (CHIRON) с конечной концентрацией 20 МЕ/мл. На сутки 7 и сутки 14, T-клетки дополнительно стимулировали аутологичными DC, активированными пептидами. DC получали каждый раз тем же способом, что и вышеописанный. На сутки 21, после третьей стимуляции пептидом, активность ЦТЛ тестировали против активированных пептидами C1R-A11 (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).

Способ наращивания ЦТЛ

ЦТЛ выращивали в культуре при помощи способов, аналогичных, описанным у Riddell et al. (Walter EA et al., N Engl J Med 1995, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996, 2(2): 216-23). ЦТЛ совместно культивировали в 25 мл среды AIM-V, содержащей 5% AS (AIM-V/5%AS) и 40 нг/мл антитела к CD3, с двумя типами В-лимфобластных клеточных линий человека, обработанных митомицином C (5×106 клеток). Через сутки после начала культивирования к культуре добавляли 120 МЕ/мл IL-2. На сутки 5, 8 и 11 к культуре добавляли свежую среду AIM-V с 5% AS, содержащую 30 МЕ/мл IL-2 (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).

Создание клонов ЦТЛ

ЦТЛ высаживали для получения 1 или 10 клеток/лунку в 96-луночных круглодонных планшетах для микротитрования (Nalge Nunc International). ЦТЛ совместно культивировали с двумя типами В-лимфобластных клеточных линий человека, обработанных митомицином C, в концентрации 1×104 клеток в общем объеме 150 мкл/лунку среды AIM-V/5%AS с 30 нг/мл антитела к CD3 и 125 МЕ/мл IL-2. Через десять суток к среде добавляли IL-2 в количестве 500 МЕ/мл в 50 мкл среды AIM-V/5%AS. На сутки 14, тестировали активность ЦТЛ, и наращивали клоны ЦТЛ с использованием способа, аналогичного описанному выше (Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).

Специфическая активность ЦТЛ

Для исследования специфической активности ЦТЛ проводили анализ ELISPOT с IFN-гамма и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) с IFN-гамма. Конкретно, активированные пептидами C1R-A11 (1×104 клетки/лунку) получали в качестве клеток-стимуляторов. Индуцированные ЦТЛ, т.е. линии и клоны ЦТЛ, использовали в качестве клеток-респондеров. Анализ ELISPOT с IFN-гамма и ELISA с IFN-гамма проводили согласно протоколам производителя.

Создание клеток, принудительно экспрессирующих ген-мишень и HLA-A*1101

кДНК, кодирующую открытую рамку считывания гена-мишени или HLA-A*1101 амплифицировали при помощи ПЦР. Амплифицированный продукт клонировали в экспрессирующий вектор. Вектор, экспрессирующий ген-мишень и вектор, экспрессирующий HLA-A*1101, вместе или по отдельности были трансфицированы в клетки COS7, которые представляют собой линию клеток, негативную по гену-мишени и HLA, с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) согласно протоколу, рекомендованному производителем. Через 2 дня после трансфекции, трансфицированные клетки собирали с использованием версена (Invitrogen) и использовали в качестве клеток-мишеней для анализа активности ЦТЛ (5×104 клетки/лунку).

Результаты

Предсказание пептидов, полученных из DEPDC1 и связывающихся с HLA-A*1101

Таблицы 1a и 1b показывают девятимерные и десятимерные пептиды, полученные из DEPDC1, которые были теоретически рассчитаны как связывающиеся с HLA-A*1101, в порядке уменьшения аффинности связывания. Всего выбрали 80 пептидов, которые потенциально обладают свойством связываться с HLA-A*1101 и исследовали для выявления эпитопных пептидов.

[Таблица 1a]

[Таблица 1b-1]

[Таблица 1b-2]

Индуцирование ЦТЛ теоретически рассчитанными пептидами, полученными из DEPDC1 и рестриктированными по HLA-A*1101

ЦТЛ индуцировали в соответствии с протоколом, описанным в «Материалах и способах». Пептид-специфическую активность ЦТЛ измеряли путем анализа ELISPOT с IFN-гамма (фиг. 1). В сравнении с контролем, ЦТЛ в лунке #4 с DEPDC1-A11-9-627 (SEQ ID NO: 1) показал мощную выработку IFN-гамма. В то же время, несмотря на то, что остальные пептиды, показанные в таблицах 1a и 1b, потенциально имели активность связывания с HLA-A*1101, не было выявлено специфической активности ЦТЛ в результате стимуляции этими пептидами. Примером типичных отрицательных данных является отсутствие специфической выработки IFN-гамма у ЦТЛ, стимулированных DEPDC1-A11-9-558 (SEQ ID NO: 2) (b). В результате, DEPDC1-A11-9-627 (SEQ ID NO: 1), полученный из DEPDC1, выбрали в качестве пептида, способного индуцировать высокоактивные ЦТЛ.

Получение линий и клонов ЦТЛ против пептидов, полученных из DEPDC1

Линию ЦТЛ получали путем наращивания клеток в лунке #4 с DEPDC1-A11-9-627 (SEQ ID NO: 1), который показал пептид-специфическую активность ЦТЛ в анализе ELISPOT с IFN-гамма. Активность ЦТЛ из этих линий ЦТЛ измеряли при помощи ELISA с IFN-гамма (фиг. 2). Линия ЦТЛ показала мощную выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных DEPDC1-A11-9-627 (SEQ ID NO: 1), по сравнению с клетками-мишенями, которые не были активированы пептидом. Дополнительно, клоны ЦТЛ были получены из линии ЦТЛ путем лимитирующих разведений, как описано в разделе «Материалы и способы» выше, и выработку IFN-гамма из клонов ЦТЛ против C1R-A11, активированных DEPDC1-A11-9-627 (SEQ ID NO: 1), измеряли при помощи ELISA с IFN-гамма. Мощную выработку IFN-гамма наблюдали в клонах ЦТЛ, стимулированных DEPDC1-A11-9-627 (SEQ ID NO: 1) (фиг. 3).

Специфическая активность ЦТЛ против клеток-мишеней, экспрессирующих DEPDC1 и HLA-A*1101

Линию ЦТЛ, индуцированную DEPDC1-A11-10-14 (SEQ ID NO: 32) исследовали на способность распознавать клетки-мишени, экспрессирующие DEPDC1 и молекулу HLA-A*1101. Клетки COS7, трансфицированные и полноразмерным DEPDC1, и геном HLA-A*1101, получали в качестве клеток-мишеней. Клетки COS7, трансфицированные или полноразмерным DEPDC1, или HLA-A*1101, получали в качестве контроля. Линия ЦТЛ, индуцированная DEPDC1-A11-9-627 (SEQ ID NO: 1), показала мощную активность ЦТЛ против клеток COS7, экспрессирующих и DEPDC1, и HLA-A*1101 (фиг. 4). С другой стороны, не было выявлено значительной активности ЦТЛ против контрольных клеток. Эти данные ясно доказывают, что пептид DEPDC1-A11-9-627 (SEQ ID NO: 1) представляет собой пептид, полученный в результате эндогенного процессинга DEPDC1, презентированный на клетках-мишенях при помощи молекулы HLA-A*1101 и распознающийся ЦТЛ. Эти результаты демонстрируют возможность того, что полученный из DEPDC1 DEPDC1-A11-9-627 (SEQ ID NO: 1) может подходить в качестве противораковой вакцины для пациентов с DEPDC1-экспрессирующей злокачественной опухолью.

Анализ гомологии антигенных пептидов

ЦТЛ, стимулированные DEPDC1-A11-9-627 (SEQ ID NO: 1), показали значительную специфическую активность ЦТЛ. Эти результаты могут быть связаны с тем, что последовательность DEPDC1-A11-9-627 (SEQ ID NO: 1) гомологична пептидам, полученным из других молекул, известных тем, что они сенсибилизируют иммунную систему человека. Для того чтобы исключить эту возможность, проводили анализ гомологии, запрашивая эти пептидные последовательности при помощи алгоритма BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Этот результат показывает, что не существует последовательности, имеющей значительную гомологию с последовательностью DEPDC1-A11-9-627 (SEQ ID NO: 1). Таким образом, как известно авторам настоящего изобретения, практически не существует возможности того, что этот пептид мог бы вызвать непреднамеренный иммунный ответ против других неродственных молекул. Подводя итоги, были выявлен новый эпитопный пептид, полученный из DEPDC1 и рестриктированный по HLA-A11. Продемонстрировано, что эпитопный пептидй, полученный из DEPDC1, применим для иммунотерапии злокачественных опухолей.

[Пример 2]

Материалы и способы

Линии клеток

C1R, HLA-A- и HLA-B-негативную В-лимфобластную линию клеток человека, и COS7, линию клеток почки африканской зеленой мартышки, приобретали у ATCC.

Создание клеток-стимуляторов со стабильной экспрессией HLA-A*0101

C1R (C1R-A01), которые стабильно экспрессируют HLA-A*0101, использовали в качестве клеток-стимуляторов. Амплифицировали путем ПЦР кДНК, кодирующую открытую рамку считывания HLA-A*0101, и клонировали в экспрессирующий вектор. Клетки C1R трансфицировали экспрессирующим вектором, а затем проводили селекцию при помощи G418 (Invitrogen) через две недели. Селектированные по G418 клетки высевали в лунки, содержащие среду для культивирования с G418, в 96-луночный планшет, и дополнительно культивировали в течение 30 суток. Экзогенную экспрессию HLA-A*0101 в клетках C1R подтверждали анализом проточной цитометрии.

Селекция кандидатных пептидов, полученных из DEPDC1

Девяти-, десяти- и одиннадцатимерные пептиды, полученные из DEPDC1, которые связываются с молекулой HLA-A*0101, были теоретически рассчитаны при помощи программного обеспечения для предсказания связывания «NetMHC 3.2» (www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC-3.2/) (Buus et al., Tissue Antigens. 2003 Nov, 62(5): 378-84; Nielsen et al., Protein Sci. 2003 May, 12(5): 1007-17; Bioinformatics. 2004 Jun 12: 20(9): 1388-97).

Пептидный синтез

Эти пептиды синтезировали в American Пептид Company (Sunnyvale, CA) в соответствии со стандартным способом синтеза на твердой фазе, и очищали при помощи обратно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Пептиды анализировали по чистоте (>90%) и идентичности путем аналитической ВЭЖХ и масс-спектрометрии, соответственно. Пептиды растворяли в диметилсульфоксиде из расчета 20 мг/мл и хранили при -80°C.

Индукция ЦТЛ in vitro

Дендритные клетки (DC) моноцитарного происхождения использовали в качестве антигенпрезентирующей клетки для того чтобы индуцировать ответ цитотоксического T-лимфоцита (ЦТЛ) против пептидов, презентированных на лейкоцитарных антигенах человека (HLA). Как описано в других разделах, DC получали in vitro (Nakahara S et al., Cancer Res 2003, 63(14): 4112-8). Конкретно, мононуклеарные клетки периферической крови, выделенные у здоровых добровольцев (HLA-A*0101-положительных) при помощи раствора Фиколл-Пак плюс (Pharmacia) разделяли путем прикрепления к пластиковым чашкам для тканевой культуры (Becton Dickinson) и концентрировали в виде фракции моноцитов. Популяцию концентрированных моноцитов культивировали в присутствии 1000 МЕ/мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (R&D System) и 1000 МЕ/мл интерлейкина(IL)-4 (R&D System) в среде AIM-V (Invitrogen), содержащей 2% инактивированной нагреванием аутологичной сыворотки (AS). Через семь суток культивирования, цитокин-индуцированные DC были активирован 20 мкг/мл каждого из синтезированных пептидов в среде AIM-V при 37°C в течение трех часов в присутствии 3 мкг/мл бета 2-микроглобулина. Полученные клетки по наблюдениям экспрессировали на своей клеточной поверхности DC-ассоциированные молекулы, такие как CD80, CD83, CD86 и HLA класса II (данные не показаны). Затем, эти активированные пептидами DC были инактивированы рентгеновским облучением (20 Гр), и смешаны в соотношении 1:20 с аутологичными CD8+ T-клетками, полученными путем положительной селекции при помощи CD8 Positive Isolation Kit (Dynal). Эти культуральные продукты высевали в 48-луночный планшет (Corning). Каждая лунка содержала 1,5×104 активированных пептидами DC, 3×105 CD8+ T-клеток и 10 нг/мл IL-7 (R&D System) в 0,5 мл среды AIM-V с 2% AS. Через три дня, к этим культуральным продуктам добавляли IL-2 (CHIRON) с конечной концентрацией 20 МЕ/мл. На сутки 7 и сутки 14, T-клетки дополнительно стимулировали аутологичными DC, активированными пептидами. DC получали каждый раз тем же способом, что и вышеописанный. На сутки 21, после третьей стимуляции пептидом, ЦТЛ тестировали против активированных пептидами клеток C1R-A01 (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).

Способ наращивания ЦТЛ

ЦТЛ выращивали в культуре при помощи способов, аналогичных, описанным у Riddell et al. (Walter EA et al., N Engl J Med 1995, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996, 2(2): 216-23). ЦТЛ совместно культивировали в 25 мл среды AIM-V, содержащей 5% AS (AIM-V/5%AS) и 40 нг/мл антитела к CD3, с двумя типами В-лимфобластных клеточных линий человека, обработанных митомицином C, в количестве 5×106 клеток/колбу. Через сутки после начала культивирования к культуре добавляли 120 МЕ/мл IL-2. На сутки 5, 8 и 11 к культуре добавляли свежую среду AIM-V с 5% AS, содержащую 30 МЕ/мл IL-2 (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).

Создание клонов ЦТЛ

ЦТЛ высаживали для получения 1 или 10 клеток/лунку в 96-луночных круглодонных планшетах для микротитрования (Nalge Nunc International). ЦТЛ совместно культивировали с двумя типами В-лимфобластных клеточных линий человека, обработанных митомицином C, в концентрации 1×104 клеток в общем объеме 150 мкл/лунку среды AIM-V/5%AS с 30 нг/мл антитела к CD3 и 125 МЕ/мл IL-2. Через десять суток к среде добавляли IL-2 в количестве 500 МЕ/мл в 50 мкл среды AIM-V/5%AS. На сутки 14, тестировали активность ЦТЛ, и наращивали клоны ЦТЛ с использованием способа, аналогичного описанному выше (Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).

Специфическая активность ЦТЛ

Для исследования специфической активности ЦТЛ проводили анализ ELISPOT с IFN-гамма и ELISA с IFN-гамма. Конкретно, активированные пептидами C1R-A01 клетки (1×104 клетки/лунку) получали в качестве клеток-стимуляторов. Индуцированные ЦТЛ, т.е. линии и клоны ЦТЛ, использовали в качестве клеток-респондеров. Анализ ELISPOT с IFN-гамма и ELISA с IFN-гамма проводили согласно протоколам производителя.

Создание клеток-мишеней, принудительно экспрессирующих ген-мишень и HLA-A*0101

кДНК, кодирующую открытую рамку считывания гена-мишени или HLA-A*0101, амплифицировали при помощи ПЦР. Амплифицированный продукт клонировали в экспрессирующий вектор. Экспрессирующие векторы трансфицировали при помощи Липофектамина 2000 (Invitrogen) согласно протоколу, рекомендованному производителем. Через 2 дня после трансфекции, трансфицированные клетки собирали с использованием версена (Invitrogen) и использовали в качестве клеток-мишеней для анализа активности ЦТЛ (5×104 клетки/лунку).

Результаты

Предсказание пептидов, полученных из DEPDC1 и связывающихся с HLA-A*0101

Таблицы от 2a до 2с показывают девятимерные, десятимерные и одиннадцатимерные пептиды, полученные из DEPDC1, которые были теоретически рассчитаны как связывающиеся с HLA-A*0101 в порядке уменьшения аффинности связывания. Всего выбрали 30 пептидов, которые потенциально обладают свойством связываться с HLA-A*1101 и исследовали для выявления эпитопных пептидов.

[Таблица 2a]

[Таблица 2b]

[Таблица 2c]

Индуцирование ЦТЛ теоретически рассчитанными пептидами, полученными из DEPDC1 и рестриктированными по HLA-A*0101

ЦТЛ против пептидов, полученных из DEPDC1, получали в соответствии с протоколом, описанным в «Материалах и способах». Пептид-специфическую активность ЦТЛ измеряли путем анализа ELISPOT с IFN-гамма (фиг. 5). В сравнении с контролем ЦТЛ в

Лунке #6 c DEPDC1-A01-9-239 (SEQ ID NO: 81) (a),

Лунке #5 c DEPDC1-A01-9-46 (SEQ ID NO: 82) (b),

Лунке #3 c DEPDC1-A01-9-516 (SEQ ID NO: 21) (c),

Лунке #3 c DEPDC1-A01-9-781 (SEQ ID NO: 83) (d),

Лунке #7 c DEPDC1-A01-9-571 (SEQ ID NO: 84) (e),

Лунке #2 c DEPDC1-A01-9-96 (SEQ ID NO: 85) (f),

Лунке #4 c DEPDC1-A01-9-260 (SEQ ID NO: 86) (г),

Лунке #7 c DEPDC1-A01-9-767 (SEQ ID NO: 87) (h),

Лунке #8 c DEPDC1-A01-9-291 (SEQ ID NO: 88) (i),

Лунке #6 c DEPDC1-A01-9-311 (SEQ ID NO: 89) (j),

Лунке #3 c DEPDC1-A01-10-690 (SEQ ID NO: 90) (k),

Лунке #6 c DEPDC1-A01-10-2 (SEQ ID NO: 91) (l),

Лунке #3 c DEPDC1-A01-10-259 (SEQ ID NO: 58) (m),

Лунке #1 c DEPDC1-A01-10-45 (SEQ ID NO: 92) (n),

Лунке #6 c DEPDC1-A01-10-712 (SEQ ID NO: 96) (o),

Лунке #7 c DEPDC1-A01-10-188 (SEQ ID NO: 99) (p),

Лунке #6 c DEPDC1-A01-10-470 (SEQ ID NO: 101) (q),

Лунке #6 c DEPDC1-A01-10-456 (SEQ ID NO: 102) (r),

Лунке #4 c DEPDC1-A01-10-679 (SEQ ID NO: 103) (s),

Лунке #2 c DEPDC1-A01-10-341 (SEQ ID NO: 104) (t),

Лунке #3 c DEPDC1-A01-10-183 (SEQ ID NO: 106) (u),

Лунке #6 c DEPDC1-A01-10-286 (SEQ ID NO: 107) (v), и

Лунке #8 c DEPDC1-A01-11-44 (SEQ ID NO: 108) (w), демонстрировали мощную выработку IFN-гамма. В то же время, несмотря на то, что остальные пептиды, показанные в таблицах 2a, 2b, и 2c потенциально имели активность связывания с HLA-A*0101, не было выявлено специфической активности ЦТЛ в результате стимуляции этими пептидами. Примером типичных отрицательных данных является отсутствие специфической выработки IFN-гамма у ЦТЛ, стимулированных DEPDC1-A01-10-780 (SEQ ID NO: 94) (x). В результате, выбрали 23 пептидов, полученных из DEPDC1 в качестве пептидов, способных индуцировать высокоактивные ЦТЛ.

Получение линий и клонов ЦТЛ против пептидов, полученных из DEPDC1

Линию ЦТЛ получали путем наращивания клеток в лунке #8 с DEPDC1-A01-11-44 (SEQ ID NO: 108), которая показала пептид-специфическую активность ЦТЛ. Активность ЦТЛ из линии ЦТЛ измеряли при помощи ELISA с IFN-гамма (фиг. 6). Линия ЦТЛ показала мощную выработку IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных DEPDC1-A01-11-44 (SEQ ID NO: 108), по сравнению с клетками-мишенями, которые не были активированы пептидами. После индукции ЦТЛ in vitro клоны ЦТЛ были получены из линий ЦТЛ путем лимитирующих разведений, как описано в разделе «Материалы и способы» выше, и выработку IFN-гамма из клонов ЦТЛ против клеток C1R-A01, активированных DEPDC1-A01-11-44 (SEQ ID NO: 108), измеряли при помощи ELISA с IFN-гамма. Мощную выработку IFN-гамма наблюдали в клоне ЦТЛ, стимулированном DEPDC1-A01-11-44 (SEQ ID NO: 108) (фиг. 7).

Специфическая активность ЦТЛ против клеток-мишеней, экспрессирующих DEPDC1 и HLA-A*0101

Клон ЦТЛ, индуцированный DEPDC1-A01-11-44 (SEQ ID NO: 108) исследовали на его способность распознавать клетки-мишени, экспрессирующие DEPDC1 и молекулу HLA-A*0101 Клетки COS7, трансфицированные и полноразмерным DEPDC1, и геном HLA-A*0101 получали в качестве клеток-мишеней. Клетки COS7, трансфицированные или полноразмерным DEPDC1, или HLA-A*0101, получали в качестве контроля. Клон ЦТЛ, индуцированный пептидом DEPDC1-A01-11-44 (SEQ ID NO: 108) продемонстрировал мощную активность ЦТЛ против клеток COS7, экспрессирующих и DEPDC1, и HLA-A*0101 (фиг. 8). С другой стороны, не было выявлено значительной активности ЦТЛ против контрольных клеток. Эти данные ясно доказывают, что DEPDC1-A01-11-44 (SEQ ID NO: 108) представляет собой пептид, полученный в результате эндогенного процессинга DEPDC1, презентированный на клетках-мишенях при помощи молекулы HLA-A*0101 и распознающийся ЦТЛ. Эти результаты демонстрируют возможность того, что DEPDC1-A01-11-44 (SEQ ID NO: 108) может подходить в качестве противораковой вакцины для пациентов с DEPDC1-экспрессирующей злокачественной опухолью.

Анализ гомологии антигенных пептидов

ЦТЛ, индуцированные последовательностью DEPDC1-A01-9-239 (SEQ ID NO: 81), DEPDC1-A01-9-46 (SEQ ID NO: 82), DEPDC1-A01-9-516 (SEQ ID NO: 21), DEPDC1-A01-9-781 (SEQ ID NO: 83), DEPDC1-A01-9-571 (SEQ ID NO: 84), DEPDC1-A01-9-96 (SEQ ID NO: 85), DEPDC1-A01-9-260 (SEQ ID NO: 86), DEPDC1-A01-9-767 (SEQ ID NO: 87), DEPDC1-A01-9-291 (SEQ ID NO: 88), DEPDC1-A01-9-311 (SEQ ID NO: 89), DEPDC1-A01-10-690 (SEQ ID NO: 90), DEPDC1-A01-10-2 (SEQ ID NO: 91), DEPDC1-A01-10-259 (SEQ ID NO: 58), DEPDC1-A01-10-45 (SEQ ID NO: 92), DEPDC1-A01-10-712 (SEQ ID NO: 96), DEPDC1-A01-10-188 (SEQ ID NO: 99), DEPDC1-A01-10-470 (SEQ ID NO: 101), DEPDC1-A01-10-456 (SEQ ID NO: 102), DEPDC1-A01-10-679 (SEQ ID NO: 103), DEPDC1-A01-10-341 (SEQ ID NO: 104), DEPDC1-A01-10-183 (SEQ ID NO: 106), DEPDC1-A01-10-286 (SEQ ID NO: 107) или DEPDC1-A01-11-44 (SEQ ID NO: 108) демонстрировали значительную специфическую активность ЦТЛ. Эти результаты могут быть связаны с тем, что последовательности DEPDC1-A01-9-239 (SEQ ID NO: 81), DEPDC1-A01-9-46 (SEQ ID NO: 82), DEPDC1-A01-9-516 (SEQ ID NO: 21), DEPDC1-A01-9-781 (SEQ ID NO: 83), DEPDC1-A01-9-571 (SEQ ID NO: 84), DEPDC1-A01-9-96 (SEQ ID NO: 85), DEPDC1-A01-9-260 (SEQ ID NO: 86), DEPDC1-A01-9-767 (SEQ ID NO: 87), DEPDC1-A01-9-291 (SEQ ID NO: 88), DEPDC1-A01-9-311 (SEQ ID NO: 89), DEPDC1-A01-10-690 (SEQ ID NO: 90), DEPDC1-A01-10-2 (SEQ ID NO: 91), DEPDC1-A01-10-259 (SEQ ID NO: 58), DEPDC1-A01-10-45 (SEQ ID NO: 92), DEPDC1-A01-10-712 (SEQ ID NO: 96), DEPDC1-A01-10-188 (SEQ ID NO: 99), DEPDC1-A01-10-470 (SEQ ID NO: 101), DEPDC1-A01-10-456 (SEQ ID NO: 102), DEPDC1-A01-10-679 (SEQ ID NO: 103), DEPDC1-A01-10-341 (SEQ ID NO: 104), DEPDC1-A01-10-183 (SEQ ID NO: 106), DEPDC1-A01-10-286 (SEQ ID NO: 107) и DEPDC1-A01-11-44 (SEQ ID NO: 108) гомологичны пептидам, полученным из других молекул, известных тем, что они сенсибилизируют иммунную систему человека. Для того чтобы исключить эту возможность, проводили анализ гомологии, запрашивая эти пептидные последовательности при помощи алгоритма BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Этот результат показывает, что не существует последовательности, имеющей значительную гомологию с последовательностями DEPDC1-A01-9-239 (SEQ ID NO: 81), DEPDC1-A01-9-46 (SEQ ID NO: 82), DEPDC1-A01-9-516 (SEQ ID NO: 21), DEPDC1-A01-9-781 (SEQ ID NO: 83), DEPDC1-A01-9-571 (SEQ ID NO: 84), DEPDC1-A01-9-96 (SEQ ID NO: 85), DEPDC1-A01-9-260 (SEQ ID NO: 86), DEPDC1-A01-9-767 (SEQ ID NO: 87), DEPDC1-A01-9-291 (SEQ ID NO: 88), DEPDC1-A01-9-311 (SEQ ID NO: 89), DEPDC1-A01-10-690 (SEQ ID NO: 90), DEPDC1-A01-10-2 (SEQ ID NO: 91), DEPDC1-A01-10-259 (SEQ ID NO: 58), DEPDC1-A01-10-45 (SEQ ID NO: 92), DEPDC1-A01-10-712 (SEQ ID NO: 96), DEPDC1-A01-10-188 (SEQ ID NO: 99), DEPDC1-A01-10-470 (SEQ ID NO: 101), DEPDC1-A01-10-456 (SEQ ID NO: 102), DEPDC1-A01-10-679 (SEQ ID NO: 103), DEPDC1-A01-10-341 (SEQ ID NO: 104), DEPDC1-A01-10-183 (SEQ ID NO: 106), DEPDC1-A01-10-286 (SEQ ID NO: 107) и DEPDC1-A01-11-44 (SEQ ID NO: 108). Таким образом, как известно авторам настоящего изобретения, практически не существует возможности того, что эти пептиды могли бы вызвать непреднамеренный иммунный ответ против других неродственных молекул. Подводя итоги, были выявлены новые эпитопные пептиды, полученные из DEPDC1 и рестриктированные по HLA-A01. Продемонстрировано, что эпитопные пептиды, полученные из DEPDC1, применимы для иммунотерапии злокачественных опухолей.

[Пример 3]

Получение составов эмульсий

Пептид растворяли в растворителе для инъекций или стерильном физиологическом растворе до получения концентрации от 1,0 мг/мл до 10,0 мг/мл, и набирали в шприц. Его соединяли через коннектор со шприцем, наполненным неполным адъювантом Фрейнда (IFA), в количестве, эквивалентном количеству растворителя для инъекций или стерильного физиологического раствора, и перемешивали, поочередно нажимая на поршни двух соединенных шприцев. После нескольких минут перемешивания, готовность эмульсии оценивали путем капельной пробы. Капельную пробу можно проводить, капая одну каплю смешанного образца на воду. Эмульсию оценивают как готовую, когда образец, капнутый на воду, не сразу диффундирует в воде; и эмульсию оценивают, как не готовую, когда образец, капнутый на воду, сразу растворяется в воде. Когда эмульсию оценивают как не готовую, дополнительно проводят перемешивание до готовности эмульсии. Готовую эмульсию можно вводить пациенту со злокачественной опухолью путем подкожной инъекции. Пациента со злокачественной опухолью, подходящего для введения, можно выбирать из пациентов, страдающих от рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака шейки матки, холангиоцеллюлярного рака, хронического миелолейкоза (ХМЛ), рака толстого кишечника, рака желудка, немелкоклеточного рака легких (NSCLC), лимфомы, остеосаркомы, рака простаты, мелкоклеточного рака легких (SCLC), опухоли мягких тканей и т.п.

Получение лиофилизированных составов

Пептид растворяли в растворителе для инъекций растворе до получения концентрации от 1,0 мг/мл до 10,0 мг/мл, и стерилизовали фильтрованием. Раствором заполняли стерилизованный флакон, и наполовину закрывали стерилизованной резиновой пробкой. После лиофилизации флакона, его полностью закрывали и запаивали алюминиевой крышкой для получения лиофилизированного состава. При использовании, растворитель для инъекций или стерильный физиологический раствор инъецировали во флакон для повторного растворения лиофилизированного порошка. Повторно растворенный раствор во флаконе собирали в шприц, и шприц соединяли через коннектор со шприцем, наполненным IFA, в количестве, эквивалентном собранному повторно растворенному раствору. Повторно растворенный раствор и IFA смешивали, поочередно нажимая на поршни двух соединенных шприцев. После нескольких минут перемешивания, готовность эмульсии оценивали путем капельной пробы. Готовую эмульсию можно вводить пациенту со злокачественной опухолью путем подкожной инъекции. Пациента со злокачественной опухолью, подходящего для введения, можно выбирать из пациентов, страдающих от рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака шейки матки, холангиоцеллюлярного рака, хронического миелолейкоза (ХМЛ), рака толстого кишечника, рака желудка, немелкоклеточного рака легких (NSCLC), лимфомы, остеосаркомы, рака простаты, мелкоклеточного рака легких (SCLC), опухоли мягких тканей и т.п.

Применимость в промышленности

Настоящее изобретение относится к новым эпитопным пептидам, полученным из DEPDC1 и рестриктированным по HLA-A11 и HLA-A01, которые могут индуцировать мощный и специфический противоопухолевый иммунный ответ, и, таким образом, иметь применимость для широкого спектра типов злокачественных опухолей. Пептиды, композиции, АПК, и ЦТЛ по настоящему изобретению можно использовать в качестве пептидной вакцины для злокачественной опухоли, экспрессирующей DEPDC1, например, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака шейки матки, холангиоцеллюлярного рака, хронического миелолейкоза (ХМЛ), рака толстого кишечника, рака желудка, немелкоклеточного рака легких (NSCLC), лимфомы, остеосаркомы, рака простаты, мелкоклеточного рака легких (SCLC) и опухоли мягких тканей.

Хотя настоящее изобретение в настоящем документе описано подробно и относительно его конкретных вариантов осуществления, следует понимать, что вышеуказанное описание является по своему характеру иллюстративным и пояснительным и предназначено для иллюстрации настоящего изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления. Путем рутинных экспериментов, специалист в данной области легко поймет, что в изобретении можно производить различные изменения и модификации в пределах существа и объема настоящего изобретения, пределы которых определены прилагаемой формулой изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC.

<120> ПЕПТИДЫ DEPDC1 И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ ВАКЦИНЫ

<130> ONC-A1602P

<150> JP 2015-159291

<151> 2015-08-12

<150> JP 2015-165779

<151> 2015-08-25

<160> 117

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 1

Met Ser Gln Asn Val Asp Met Pro Lys

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 2

Ala Thr Ile Asn Lys Arg Leu Cys Lys

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 3

Ser Leu Met Ile His Thr Phe Ser Arg

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 4

Ile Gln Leu Leu Arg Lys Phe Leu Lys

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 5

His Leu Asn Asn Leu Asn Ser Phe Lys

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 6

Ser Leu Glu Glu Val Ile Asn Pro Lys

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 7

Lys Leu Phe Leu Glu Ser Lys Pro Lys

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 8

Ser Ala Gln Glu Phe Asp Glu Gln Lys

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 9

Lys Gln Pro Met Leu Ile Leu Arg Lys

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 10

Arg Gln Gln Thr Ile Gln Leu Leu Arg

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 11

Gln Val Ile Pro Gln Tyr Ile Met Tyr

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 12

Lys Glu Tyr Pro Leu Ile Tyr Gln Lys

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 13

Ser Leu Leu Gln Pro His Leu Glu Arg

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 14

Gln Gln Thr Ile Gln Leu Leu Arg Lys

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 15

Met Tyr Asn Met Ala Asn Thr Ser Lys

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 16

Ile Gln Asp Asp Pro Gln Ser Ser Lys

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 17

Ser Tyr Leu Gln Thr Ala Val Glu Lys

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 18

Ser Leu Leu His Arg Glu Lys Asn Lys

1 5

<210> 19

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 19

Thr Ser Pro Leu Lys Thr Leu Pro Arg

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 20

Ser Val Phe His Gln Ser Phe Pro Asn

1 5

<210> 21

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 21

Arg Ser Ser Thr Arg Arg Asn Ser Tyr

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 22

Ile Ser Asn Pro Gly Phe Gln Glu Arg

1 5

<210> 23

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 23

Lys Asn Asn Ile Glu Asn Phe Ser Lys

1 5

<210> 24

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 24

Gly Leu Phe Ala Pro Leu Pro Thr Tyr

1 5

<210> 25

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 25

Arg Asn Leu Ser Arg Arg Thr Pro Lys

1 5

<210> 26

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 26

Arg Phe Pro Ala Thr Ser Pro Leu Lys

1 5

<210> 27

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 27

Leu Leu Ser Leu Leu His Arg Glu Lys

1 5

<210> 28

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 28

Gln Leu Leu Met Arg Met Ile Ser Arg

1 5

<210> 29

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 29

Ser Leu Leu Leu Arg Ser Ser Thr Arg

1 5

<210> 30

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 30

Arg Ser Leu Pro Leu Lys Glu Lys Arg

1 5

<210> 31

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 31

Arg Met Ser Gln Asn Val Asp Met Pro Lys

1 5 10

<210> 32

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 32

Ala Thr Ser Pro Leu Lys Thr Leu Pro Arg

1 5 10

<210> 33

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 33

Ile Met Tyr Asn Met Ala Asn Thr Ser Lys

1 5 10

<210> 34

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 34

Thr Ile Gln Leu Leu Arg Lys Phe Leu Lys

1 5 10

<210> 35

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 35

Ala Val Glu Lys His Leu Asp Tyr Leu Lys

1 5 10

<210> 36

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 36

Arg Ser Leu Met Ile His Thr Phe Ser Arg

1 5 10

<210> 37

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 37

Phe Ser Lys Asp Lys Asp Ser Ile Phe Lys

1 5 10

<210> 38

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 38

Asn Thr Pro Val Ala Glu Ile Ile Met Lys

1 5 10

<210> 39

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 39

Ala Leu Phe Gly Asp Lys Pro Thr Ile Lys

1 5 10

<210> 40

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 40

Ile Ile Lys Asn Arg Ser Leu Pro Leu Lys

1 5 10

<210> 41

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 41

Ser Ala Thr Ile Asn Lys Arg Leu Cys Lys

1 5 10

<210> 42

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 42

Val Ser Asp Arg Ser Ser Gly Ile His Lys

1 5 10

<210> 43

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 43

Ser Ile Phe Lys Leu Arg Asn Leu Ser Arg

1 5 10

<210> 44

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 44

Arg Gln Gln Thr Ile Gln Leu Leu Arg Lys

1 5 10

<210> 45

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 45

Pro Ser Tyr Leu Gln Thr Ala Val Glu Lys

1 5 10

<210> 46

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 46

Thr Ser Phe Arg Ala Gly Met Pro Leu Arg

1 5 10

<210> 47

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 47

Ala Val Asp Trp Leu Tyr Asp Leu Leu Arg

1 5 10

<210> 48

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 48

Gln Ser Leu Leu Gln Pro His Leu Glu Arg

1 5 10

<210> 49

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 49

Leu Leu Leu Ser Leu Leu His Arg Glu Lys

1 5 10

<210> 50

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 50

Lys Ile Gln Asp Asp Pro Gln Ser Ser Lys

1 5 10

<210> 51

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 51

Ser Phe Arg Ala Gly Met Pro Leu Arg Lys

1 5 10

<210> 52

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 52

Ser Leu Leu Leu Arg Ser Ser Thr Arg Arg

1 5 10

<210> 53

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 53

Ile Ser Ala Gln Glu Phe Asp Glu Gln Lys

1 5 10

<210> 54

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 54

Ile Val Asp Val Pro Gly Asn Ser Ser Lys

1 5 10

<210> 55

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 55

Leu Ser Leu Leu His Arg Glu Lys Asn Lys

1 5 10

<210> 56

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 56

Ala Pro Leu Pro Thr Tyr Ser Tyr Cys Lys

1 5 10

<210> 57

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 57

Gln Ser Leu Leu Leu Arg Ser Ser Thr Arg

1 5 10

<210> 58

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 58

Arg Ser Asn Asp Met Asn Asn Pro Thr Tyr

1 5 10

<210> 59

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 59

Asn Met His Asp Leu Ser Ser Asn Ser Lys

1 5 10

<210> 60

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 60

Asn Val Asp Asp Asn Asn Gln Leu Phe Arg

1 5 10

<210> 61

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 61

Thr Ile Lys Gln Pro Met Leu Ile Leu Arg

1 5 10

<210> 62

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 62

Arg Ser Leu Pro Leu Lys Glu Lys Arg Lys

1 5 10

<210> 63

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 63

Ile Gln Lys Pro Phe Ser Ala Gly Phe Lys

1 5 10

<210> 64

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 64

Ala Met Lys Cys Leu Ala Asn Trp Pro Arg

1 5 10

<210> 65

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 65

Ile Ala Glu Leu Leu Glu Asn Ile Ile Lys

1 5 10

<210> 66

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 66

Leu Leu Leu Pro Pro Pro Asn Arg Arg Lys

1 5 10

<210> 67

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 67

Gln Ile Ser Asn Pro Gly Phe Gln Glu Arg

1 5 10

<210> 68

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 68

Thr Ser Pro Leu Lys Thr Leu Pro Arg Arg

1 5 10

<210> 69

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 69

Leu Gln Leu Leu Met Arg Met Ile Ser Arg

1 5 10

<210> 70

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 70

Met Leu Ile Leu Arg Lys Pro Lys Phe Arg

1 5 10

<210> 71

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 71

Ser Leu Pro Leu Lys Glu Lys Arg Lys Lys

1 5 10

<210> 72

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 72

Asn Ser Asn Phe Gly Pro Glu Val Thr Arg

1 5 10

<210> 73

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 73

Pro Ser Leu Glu Glu Val Ile Asn Pro Lys

1 5 10

<210> 74

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 74

Asn Leu His Ser Glu Glu Asn Ile Gln Lys

1 5 10

<210> 75

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 75

Ser Gln Gly Val Pro Pro Gly Pro Tyr Arg

1 5 10

<210> 76

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 76

Phe Arg Phe Pro Ala Thr Ser Pro Leu Lys

1 5 10

<210> 77

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 77

Tyr Val Gly Phe Glu Arg Asp Val Phe Arg

1 5 10

<210> 78

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 78

Lys Gln Val Ile Pro Gln Tyr Ile Met Tyr

1 5 10

<210> 79

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 79

Glu Leu Cys Asn Gly Lys Cys Lys Ser Lys

1 5 10

<210> 80

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 80

Glu Ser Glu Ala Ala Leu Phe Gly Asp Lys

1 5 10

<210> 81

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 81

Lys Ser Asp Asp Leu Pro His Trp Val

1 5

<210> 82

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 82

Ala Gly Glu Ala Val Asp Trp Leu Tyr

1 5

<210> 83

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 83

Thr Thr Glu Ser Glu Ala Ala Leu Phe

1 5

<210> 84

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 84

Leu Ser Glu Asn Ser Leu Leu Pro Ala

1 5

<210> 85

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 85

Asn Val Asp Asp Asn Asn Gln Leu Phe

1 5

<210> 86

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 86

Ser Asn Asp Met Asn Asn Pro Thr Tyr

1 5

<210> 87

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 87

Phe Gln Lys Glu Tyr Pro Leu Ile Tyr

1 5

<210> 88

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 88

Leu Thr Phe Glu Tyr Tyr Glu Leu Phe

1 5

<210> 89

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 89

Val Ser Asp Arg Ser Ser Gly Ile His

1 5

<210> 90

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 90

Gln Thr Ala Val Glu Lys His Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 91

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 91

Glu Ser Gln Gly Val Pro Pro Gly Pro Tyr

1 5 10

<210> 92

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 92

Thr Ala Gly Glu Ala Val Asp Trp Leu Tyr

1 5 10

<210> 93

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 93

Gln Phe Gln Lys Glu Tyr Pro Leu Ile Tyr

1 5 10

<210> 94

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 94

Pro Thr Thr Glu Ser Glu Ala Ala Leu Phe

1 5 10

<210> 95

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 95

Phe Thr Ala Gly Glu Ala Val Asp Trp Leu

1 5 10

<210> 96

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 96

Leu Phe Ala Pro Leu Pro Thr Tyr Ser Tyr

1 5 10

<210> 97

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 97

Phe Val Asn Ile Leu Val Val Cys Gly Tyr

1 5 10

<210> 98

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 98

Ser Thr Ser Gln Ala Ala Ile Ala Glu Leu

1 5 10

<210> 99

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 99

Glu Val Trp Arg Tyr Val Ile Leu Ile Tyr

1 5 10

<210> 100

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 100

Leu Leu Thr Phe Glu Tyr Tyr Glu Leu Phe

1 5 10

<210> 101

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 101

His Ser Glu Glu Asn Ile Gln Lys Pro Phe

1 5 10

<210> 102

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 102

Phe Leu Glu Ser Lys Pro Lys Gln Glu Phe

1 5 10

<210> 103

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 103

His Gln Glu Ile Leu Gln Val Pro Ser Tyr

1 5 10

<210> 104

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 104

Ser Thr Glu Cys Leu Leu Leu Ser Leu Leu

1 5 10

<210> 105

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 105

Leu Ser Ala Met Lys Cys Leu Ala Asn Trp

1 5 10

<210> 106

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 106

Gln Glu Asp Val Glu Glu Val Trp Arg Tyr

1 5 10

<210> 107

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 107

Leu Pro Glu Pro Leu Leu Thr Phe Glu Tyr

1 5 10

<210> 108

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид, полученный из DEPDC1

<400> 108

Phe Thr Ala Gly Glu Ala Val Asp Trp Leu Tyr

1 5 10

<210> 109

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ПЦР-праймер для анализа TCR

<400> 109

gtctaccagg cattcgcttc at 22

<210> 110

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ПЦР-праймер для анализа TCR

<400> 110

tcagctggac cacagccgca gcgt 24

<210> 111

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ПЦР-праймер для анализа TCR

<400> 111

tcagaaatcc tttctcttga c 21

<210> 112

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ПЦР-праймер для анализа TCR

<400> 112

ctagcctctg gaatcctttc tctt 24

<210> 113

<211> 5459

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> кодирующая последовательность

<222> (223)..(2658)

<400> 113

agctactgga gccccaggac gcagccgagc ggccctcgcc gactccttcc cgagcctggc 60

tgtggcgtca cgtgacccgc ggcgcggcca atccgcgcag ccctctatgc tattcaaatc 120

ggcggcgggg ccaacggttg tgccgagact cgccactgcc gcggccgctg ggcctgagtg 180

tcgccttcgc cgccatggac gccaccgggc gctgacagac ct atg gag agt cag 234

Met Glu Ser Gln

1

ggt gtg cct ccc ggg cct tat cgg gcc acc aag ctg tgg aat gaa gtt 282

Gly Val Pro Pro Gly Pro Tyr Arg Ala Thr Lys Leu Trp Asn Glu Val

5 10 15 20

acc aca tct ttt cga gca gga atg cct cta aga aaa cac aga caa cac 330

Thr Thr Ser Phe Arg Ala Gly Met Pro Leu Arg Lys His Arg Gln His

25 30 35

ttt aaa aaa tat ggc aat tgt ttc aca gca gga gaa gca gtg gat tgg 378

Phe Lys Lys Tyr Gly Asn Cys Phe Thr Ala Gly Glu Ala Val Asp Trp

40 45 50

ctt tat gac cta tta aga aat aat agc aat ttt ggt cct gaa gtt aca 426

Leu Tyr Asp Leu Leu Arg Asn Asn Ser Asn Phe Gly Pro Glu Val Thr

55 60 65

agg caa cag act atc caa ctg ttg agg aaa ttt ctt aag aat cat gta 474

Arg Gln Gln Thr Ile Gln Leu Leu Arg Lys Phe Leu Lys Asn His Val

70 75 80

att gaa gat atc aaa ggg agg tgg gga tca gaa aat gtt gat gat aac 522

Ile Glu Asp Ile Lys Gly Arg Trp Gly Ser Glu Asn Val Asp Asp Asn

85 90 95 100

aac cag ctc ttc aga ttt cct gca act tcg cca ctt aaa act cta cca 570

Asn Gln Leu Phe Arg Phe Pro Ala Thr Ser Pro Leu Lys Thr Leu Pro

105 110 115

cga agg tat cca gaa ttg aga aaa aac aac ata gag aac ttt tcc aaa 618

Arg Arg Tyr Pro Glu Leu Arg Lys Asn Asn Ile Glu Asn Phe Ser Lys

120 125 130

gat aaa gat agc att ttt aaa tta cga aac tta tct cgt aga act cct 666

Asp Lys Asp Ser Ile Phe Lys Leu Arg Asn Leu Ser Arg Arg Thr Pro

135 140 145

aaa agg cat gga tta cat tta tct cag gaa aat ggc gag aaa ata aag 714

Lys Arg His Gly Leu His Leu Ser Gln Glu Asn Gly Glu Lys Ile Lys

150 155 160

cat gaa ata atc aat gaa gat caa gaa aat gca att gat aat aga gaa 762

His Glu Ile Ile Asn Glu Asp Gln Glu Asn Ala Ile Asp Asn Arg Glu

165 170 175 180

cta agc cag gaa gat gtt gaa gaa gtt tgg aga tat gtt att ctg atc 810

Leu Ser Gln Glu Asp Val Glu Glu Val Trp Arg Tyr Val Ile Leu Ile

185 190 195

tac ctg caa acc att tta ggt gtg cca tcc cta gaa gaa gtc ata aat 858

Tyr Leu Gln Thr Ile Leu Gly Val Pro Ser Leu Glu Glu Val Ile Asn

200 205 210

cca aaa caa gta att ccc caa tat ata atg tac aac atg gcc aat aca 906

Pro Lys Gln Val Ile Pro Gln Tyr Ile Met Tyr Asn Met Ala Asn Thr

215 220 225

agt aaa cgt gga gta gtt ata cta caa aac aaa tca gat gac ctc cct 954

Ser Lys Arg Gly Val Val Ile Leu Gln Asn Lys Ser Asp Asp Leu Pro

230 235 240

cac tgg gta tta tct gcc atg aag tgc cta gca aat tgg cca aga agc 1002

His Trp Val Leu Ser Ala Met Lys Cys Leu Ala Asn Trp Pro Arg Ser

245 250 255 260

aat gat atg aat aat cca act tat gtt gga ttt gaa cga gat gta ttc 1050

Asn Asp Met Asn Asn Pro Thr Tyr Val Gly Phe Glu Arg Asp Val Phe

265 270 275

aga aca atc gca gat tat ttt cta gat ctc cct gaa cct cta ctt act 1098

Arg Thr Ile Ala Asp Tyr Phe Leu Asp Leu Pro Glu Pro Leu Leu Thr

280 285 290

ttt gaa tat tac gaa tta ttt gta aac att ttg gtt gtt tgt ggc tac 1146

Phe Glu Tyr Tyr Glu Leu Phe Val Asn Ile Leu Val Val Cys Gly Tyr

295 300 305

atc aca gtt tca gat aga tcc agt ggg ata cat aaa att caa gat gat 1194

Ile Thr Val Ser Asp Arg Ser Ser Gly Ile His Lys Ile Gln Asp Asp

310 315 320

cca cag tct tca aaa ttc ctt cac tta aac aat ttg aat tcc ttc aaa 1242

Pro Gln Ser Ser Lys Phe Leu His Leu Asn Asn Leu Asn Ser Phe Lys

325 330 335 340

tca act gag tgc ctt ctt ctc agt ctg ctt cat aga gaa aaa aac aaa 1290

Ser Thr Glu Cys Leu Leu Leu Ser Leu Leu His Arg Glu Lys Asn Lys

345 350 355

gaa gaa tca gat tct act gag aga cta cag ata agc aat cca gga ttt 1338

Glu Glu Ser Asp Ser Thr Glu Arg Leu Gln Ile Ser Asn Pro Gly Phe

360 365 370

caa gaa aga tgt gct aag aaa atg cag cta gtt aat tta aga aac aga 1386

Gln Glu Arg Cys Ala Lys Lys Met Gln Leu Val Asn Leu Arg Asn Arg

375 380 385

aga gtg agt gct aat gac ata atg gga gga agt tgt cat aat tta ata 1434

Arg Val Ser Ala Asn Asp Ile Met Gly Gly Ser Cys His Asn Leu Ile

390 395 400

ggg tta agt aat atg cat gat cta tcc tct aac agc aaa cca agg tgc 1482

Gly Leu Ser Asn Met His Asp Leu Ser Ser Asn Ser Lys Pro Arg Cys

405 410 415 420

tgt tct ttg gaa gga att gta gat gtg cca ggg aat tca agt aaa gag 1530

Cys Ser Leu Glu Gly Ile Val Asp Val Pro Gly Asn Ser Ser Lys Glu

425 430 435

gca tcc agt gtc ttt cat caa tct ttt ccg aac ata gaa gga caa aat 1578

Ala Ser Ser Val Phe His Gln Ser Phe Pro Asn Ile Glu Gly Gln Asn

440 445 450

aat aaa ctg ttt tta gag tct aag ccc aaa cag gaa ttc ctg ttg aat 1626

Asn Lys Leu Phe Leu Glu Ser Lys Pro Lys Gln Glu Phe Leu Leu Asn

455 460 465

ctt cat tca gag gaa aat att caa aag cca ttc agt gct ggt ttt aag 1674

Leu His Ser Glu Glu Asn Ile Gln Lys Pro Phe Ser Ala Gly Phe Lys

470 475 480

aga acc tct act ttg act gtt caa gac caa gag gag ttg tgt aat ggg 1722

Arg Thr Ser Thr Leu Thr Val Gln Asp Gln Glu Glu Leu Cys Asn Gly

485 490 495 500

aaa tgc aag tca aaa cag ctt tgt agg tct cag agt ttg ctt tta aga 1770

Lys Cys Lys Ser Lys Gln Leu Cys Arg Ser Gln Ser Leu Leu Leu Arg

505 510 515

agt agt aca aga agg aat agt tat atc aat aca cca gtg gct gaa att 1818

Ser Ser Thr Arg Arg Asn Ser Tyr Ile Asn Thr Pro Val Ala Glu Ile

520 525 530

atc atg aaa cca aat gtt gga caa ggc agc aca agt gtg caa aca gct 1866

Ile Met Lys Pro Asn Val Gly Gln Gly Ser Thr Ser Val Gln Thr Ala

535 540 545

atg gaa agt gaa ctc gga gag tct agt gcc aca atc aat aaa aga ctc 1914

Met Glu Ser Glu Leu Gly Glu Ser Ser Ala Thr Ile Asn Lys Arg Leu

550 555 560

tgc aaa agt aca ata gaa ctt tca gaa aat tct tta ctt cca gct tct 1962

Cys Lys Ser Thr Ile Glu Leu Ser Glu Asn Ser Leu Leu Pro Ala Ser

565 570 575 580

tct atg ttg act ggc aca caa agc ttg ctg caa cct cat tta gag agg 2010

Ser Met Leu Thr Gly Thr Gln Ser Leu Leu Gln Pro His Leu Glu Arg

585 590 595

gtt gcc atc gat gct cta cag tta tgt tgt ttg tta ctt ccc cca cca 2058

Val Ala Ile Asp Ala Leu Gln Leu Cys Cys Leu Leu Leu Pro Pro Pro

600 605 610

aat cgt aga aag ctt caa ctt tta atg cgt atg att tcc cga atg agt 2106

Asn Arg Arg Lys Leu Gln Leu Leu Met Arg Met Ile Ser Arg Met Ser

615 620 625

caa aat gtt gat atg ccc aaa ctt cat gat gca atg ggt acg agg tca 2154

Gln Asn Val Asp Met Pro Lys Leu His Asp Ala Met Gly Thr Arg Ser

630 635 640

ctg atg ata cat acc ttt tct cga tgt gtg tta tgc tgt gct gaa gaa 2202

Leu Met Ile His Thr Phe Ser Arg Cys Val Leu Cys Cys Ala Glu Glu

645 650 655 660

gtg gat ctt gat gag ctt ctt gct gga aga tta gtt tct ttc tta atg 2250

Val Asp Leu Asp Glu Leu Leu Ala Gly Arg Leu Val Ser Phe Leu Met

665 670 675

gat cat cat cag gaa att ctt caa gta ccc tct tac tta cag act gca 2298

Asp His His Gln Glu Ile Leu Gln Val Pro Ser Tyr Leu Gln Thr Ala

680 685 690

gtg gaa aaa cat ctt gac tac tta aaa aag gga cat att gaa aat cct 2346

Val Glu Lys His Leu Asp Tyr Leu Lys Lys Gly His Ile Glu Asn Pro

695 700 705

gga gat gga cta ttt gct cct ttg cca act tac tca tac tgt aag cag 2394

Gly Asp Gly Leu Phe Ala Pro Leu Pro Thr Tyr Ser Tyr Cys Lys Gln

710 715 720

att agt gct cag gag ttt gat gag caa aaa gtt tct acc tct caa gct 2442

Ile Ser Ala Gln Glu Phe Asp Glu Gln Lys Val Ser Thr Ser Gln Ala

725 730 735 740

gca att gca gaa ctt tta gaa aat att att aaa aac agg agt tta cct 2490

Ala Ile Ala Glu Leu Leu Glu Asn Ile Ile Lys Asn Arg Ser Leu Pro

745 750 755

cta aag gag aaa aga aaa aaa cta aaa cag ttt cag aag gaa tat cct 2538

Leu Lys Glu Lys Arg Lys Lys Leu Lys Gln Phe Gln Lys Glu Tyr Pro

760 765 770

ttg ata tat cag aaa aga ttt cca acc acg gag agt gaa gca gca ctt 2586

Leu Ile Tyr Gln Lys Arg Phe Pro Thr Thr Glu Ser Glu Ala Ala Leu

775 780 785

ttt ggt gac aaa cct aca atc aag caa cca atg ctg att tta aga aaa 2634

Phe Gly Asp Lys Pro Thr Ile Lys Gln Pro Met Leu Ile Leu Arg Lys

790 795 800

cca aag ttc cgt agt cta aga taa ctaactgaat taaaaattat gtaatacttg 2688

Pro Lys Phe Arg Ser Leu Arg

805 810

tggaactttg ataaatgaag ccatatctga gaatgtagct actcaaaagg aagtctgtca 2748

ttaataaggt atttctaaat aaacacatta tgtaaggaag tgccaaaata gttatcaatg 2808

tgagactctt aggaaactaa ctagatctca attgagagca cataacaata gatgatacca 2868

aatacttttt gtttttaaca cagctatcca gtaaggctat catgatgtgt gctaaaattt 2928

tatttacttg aattttgaaa actgagctgt gttagggatt aaactataat tctgttctta 2988

aaagaaaatt tatctgcaaa tgtgcaagtt ctgagatatt agctaatgaa ttagttgttt 3048

ggggttactt ctttgtttct aagtataaga atgtgaagaa tatttgaaaa ctcaatgaaa 3108

taattctcag ctgccaaatg ttgcactctt ttatatattc tttttccact tttgatctat 3168

ttatatatat gtatgtgttt ttaaaatatg tgtatatttt atcagatttg gttttgcctt 3228

aaatattatc cccaattgct tcagtcattc atttgttcag tatatatatt ttgaattcta 3288

gttttcataa tctattagaa gatggggata taaaagaagt ataaggcaat catatattca 3348

ttcaaaagat atttatttag caactgctat gtgcctttcg ttgttccaga tatgcagaga 3408

caatgataaa taaaacatat aatctcttcc ataaggtatt tattttttaa tcaagggaga 3468

tacacctatc agatgtttaa aataacaaca ctacccactg aaatcagggc atatagaatc 3528

attcagctaa agagtgactt ctatgatgat ggaacaggtc tctaagctag tggttttcaa 3588

actggtacac attagactca cccgaggaat tttaaaacag cctatatgcc cagggcctaa 3648

cttacactaa ttaaatctga attttgggga tgttgtatag ggattagtat tttttttaat 3708

ctaggtgatt ccaatattca gccaactgtg agaatcaatg gcctaaatgc tttttataaa 3768

catttttata agtgtcaaga taatggcaca ttgactttat tttttcattg gaagaaaatg 3828

cctgccaagt ataaatgact ctcatcttaa aacaaggttc ttcaggtttc tgcttgattg 3888

acttggtaca aacttgaagc aagttgcctt ctaattttta ctccaagatt gtttcatatc 3948

tattccttaa gtgtaaagaa atatataatg catggtttgt aataaaatct taatgtttaa 4008

tgactgttct catttctcaa tgtaatttca tactgtttct ctataaaatg atagtattcc 4068

atttaacatt actgattttt attaaaaacc tggacagaaa attataaatt ataaatatga 4128

ctttatcctg gctataaaat tattgaacca aaatgaattc tttctaaggc atttgaatac 4188

taaaacgttt attgtttata gatatgtaaa atgtggatta tgttgcaaat tgagattaaa 4248

attatttggg gttttgtaac aatataattt tgcttttgta ttatagacaa atatataaat 4308

aataaaggca ggcaactttc atttgcacta atgtacatgc aattgagatt acaaaataca 4368

tggtacaatg ctttaataac aaactctgcc agtcaggttt gaatcctact gtgctattaa 4428

ctagctagta aactcagaca agttacttaa cttctctaag ccccagtttt gttatctata 4488

aaatgaatat tataatagta cctcttttta ggattgcgag gattaagcag gataatgcat 4548

gtaaagtgtt agcacagtgt ctcacataga ataagcactc tataaatatt ttactagaat 4608

cacctaggat tatagcacta gaagagatct tagcaaaaat gtggtccttt ctgttgcttt 4668

ggacagacat gaaccaaaac aaaattacgg acaattgatg agccttatta actatctttt 4728

cattatgaga caaaggttct gattatgcct actggttgaa attttttaat ctagtcaaga 4788

aggaaaattt gatgaggaag gaaggaatgg atatcttcag aagggcttcg cctaagctgg 4848

aacatggata gattccattc taacataaag atctttaagt tcaaatatag atgagttgac 4908

tggtagattt ggtggtagtt gctttctcgg gatataagaa gcaaaatcaa ctgctacaag 4968

taaagagggg atggggaagg tgttgcacat ttaaagagag aaagtgtgaa aaagcctaat 5028

tgtgggaatg cacaggtttc accagatcag atgatgtctg gttattctgt aaattatagt 5088

tcttatccca gaaattactg cctccaccat ccctaatatc ttctaattgg tatcatataa 5148

tgacccactc ttcttatgtt atccaaacag ttatgtggca tttagtaatg gaatgtacat 5208

ggaatttccc actgacttac ctttctgtcc ttgggaagct taaactctga atcttctcat 5268

ctgtaaaatg tgaattaaag tatctaccta actgagttgt gattgtagtg aaagaaaggc 5328

aatatattta aatcttgaat ttagcaagcc cacgcttgat ttttatgtcc tttcctcttg 5388

ccttgtattg agtttaagat ctctactgat taaaactctt ttgctatcaa aaaaaaaaaa 5448

aaaaaaaaaa a 5459

<210> 114

<211> 811

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 114

Met Glu Ser Gln Gly Val Pro Pro Gly Pro Tyr Arg Ala Thr Lys Leu

1 5 10 15

Trp Asn Glu Val Thr Thr Ser Phe Arg Ala Gly Met Pro Leu Arg Lys

20 25 30

His Arg Gln His Phe Lys Lys Tyr Gly Asn Cys Phe Thr Ala Gly Glu

35 40 45

Ala Val Asp Trp Leu Tyr Asp Leu Leu Arg Asn Asn Ser Asn Phe Gly

50 55 60

Pro Glu Val Thr Arg Gln Gln Thr Ile Gln Leu Leu Arg Lys Phe Leu

65 70 75 80

Lys Asn His Val Ile Glu Asp Ile Lys Gly Arg Trp Gly Ser Glu Asn

85 90 95

Val Asp Asp Asn Asn Gln Leu Phe Arg Phe Pro Ala Thr Ser Pro Leu

100 105 110

Lys Thr Leu Pro Arg Arg Tyr Pro Glu Leu Arg Lys Asn Asn Ile Glu

115 120 125

Asn Phe Ser Lys Asp Lys Asp Ser Ile Phe Lys Leu Arg Asn Leu Ser

130 135 140

Arg Arg Thr Pro Lys Arg His Gly Leu His Leu Ser Gln Glu Asn Gly

145 150 155 160

Glu Lys Ile Lys His Glu Ile Ile Asn Glu Asp Gln Glu Asn Ala Ile

165 170 175

Asp Asn Arg Glu Leu Ser Gln Glu Asp Val Glu Glu Val Trp Arg Tyr

180 185 190

Val Ile Leu Ile Tyr Leu Gln Thr Ile Leu Gly Val Pro Ser Leu Glu

195 200 205

Glu Val Ile Asn Pro Lys Gln Val Ile Pro Gln Tyr Ile Met Tyr Asn

210 215 220

Met Ala Asn Thr Ser Lys Arg Gly Val Val Ile Leu Gln Asn Lys Ser

225 230 235 240

Asp Asp Leu Pro His Trp Val Leu Ser Ala Met Lys Cys Leu Ala Asn

245 250 255

Trp Pro Arg Ser Asn Asp Met Asn Asn Pro Thr Tyr Val Gly Phe Glu

260 265 270

Arg Asp Val Phe Arg Thr Ile Ala Asp Tyr Phe Leu Asp Leu Pro Glu

275 280 285

Pro Leu Leu Thr Phe Glu Tyr Tyr Glu Leu Phe Val Asn Ile Leu Val

290 295 300

Val Cys Gly Tyr Ile Thr Val Ser Asp Arg Ser Ser Gly Ile His Lys

305 310 315 320

Ile Gln Asp Asp Pro Gln Ser Ser Lys Phe Leu His Leu Asn Asn Leu

325 330 335

Asn Ser Phe Lys Ser Thr Glu Cys Leu Leu Leu Ser Leu Leu His Arg

340 345 350

Glu Lys Asn Lys Glu Glu Ser Asp Ser Thr Glu Arg Leu Gln Ile Ser

355 360 365

Asn Pro Gly Phe Gln Glu Arg Cys Ala Lys Lys Met Gln Leu Val Asn

370 375 380

Leu Arg Asn Arg Arg Val Ser Ala Asn Asp Ile Met Gly Gly Ser Cys

385 390 395 400

His Asn Leu Ile Gly Leu Ser Asn Met His Asp Leu Ser Ser Asn Ser

405 410 415

Lys Pro Arg Cys Cys Ser Leu Glu Gly Ile Val Asp Val Pro Gly Asn

420 425 430

Ser Ser Lys Glu Ala Ser Ser Val Phe His Gln Ser Phe Pro Asn Ile

435 440 445

Glu Gly Gln Asn Asn Lys Leu Phe Leu Glu Ser Lys Pro Lys Gln Glu

450 455 460

Phe Leu Leu Asn Leu His Ser Glu Glu Asn Ile Gln Lys Pro Phe Ser

465 470 475 480

Ala Gly Phe Lys Arg Thr Ser Thr Leu Thr Val Gln Asp Gln Glu Glu

485 490 495

Leu Cys Asn Gly Lys Cys Lys Ser Lys Gln Leu Cys Arg Ser Gln Ser

500 505 510

Leu Leu Leu Arg Ser Ser Thr Arg Arg Asn Ser Tyr Ile Asn Thr Pro

515 520 525

Val Ala Glu Ile Ile Met Lys Pro Asn Val Gly Gln Gly Ser Thr Ser

530 535 540

Val Gln Thr Ala Met Glu Ser Glu Leu Gly Glu Ser Ser Ala Thr Ile

545 550 555 560

Asn Lys Arg Leu Cys Lys Ser Thr Ile Glu Leu Ser Glu Asn Ser Leu

565 570 575

Leu Pro Ala Ser Ser Met Leu Thr Gly Thr Gln Ser Leu Leu Gln Pro

580 585 590

His Leu Glu Arg Val Ala Ile Asp Ala Leu Gln Leu Cys Cys Leu Leu

595 600 605

Leu Pro Pro Pro Asn Arg Arg Lys Leu Gln Leu Leu Met Arg Met Ile

610 615 620

Ser Arg Met Ser Gln Asn Val Asp Met Pro Lys Leu His Asp Ala Met

625 630 635 640

Gly Thr Arg Ser Leu Met Ile His Thr Phe Ser Arg Cys Val Leu Cys

645 650 655

Cys Ala Glu Glu Val Asp Leu Asp Glu Leu Leu Ala Gly Arg Leu Val

660 665 670

Ser Phe Leu Met Asp His His Gln Glu Ile Leu Gln Val Pro Ser Tyr

675 680 685

Leu Gln Thr Ala Val Glu Lys His Leu Asp Tyr Leu Lys Lys Gly His

690 695 700

Ile Glu Asn Pro Gly Asp Gly Leu Phe Ala Pro Leu Pro Thr Tyr Ser

705 710 715 720

Tyr Cys Lys Gln Ile Ser Ala Gln Glu Phe Asp Glu Gln Lys Val Ser

725 730 735

Thr Ser Gln Ala Ala Ile Ala Glu Leu Leu Glu Asn Ile Ile Lys Asn

740 745 750

Arg Ser Leu Pro Leu Lys Glu Lys Arg Lys Lys Leu Lys Gln Phe Gln

755 760 765

Lys Glu Tyr Pro Leu Ile Tyr Gln Lys Arg Phe Pro Thr Thr Glu Ser

770 775 780

Glu Ala Ala Leu Phe Gly Asp Lys Pro Thr Ile Lys Gln Pro Met Leu

785 790 795 800

Ile Leu Arg Lys Pro Lys Phe Arg Ser Leu Arg

805 810

<210> 115

<211> 4607

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> кодирующая последовательность

<222> (223)..(1806)

<400> 115

agctactgga gccccaggac gcagccgagc ggccctcgcc gactccttcc cgagcctggc 60

tgtggcgtca cgtgacccgc ggcgcggcca atccgcgcag ccctctatgc tattcaaatc 120

ggcggcgggg ccaacggttg tgccgagact cgccactgcc gcggccgctg ggcctgagtg 180

tcgccttcgc cgccatggac gccaccgggc gctgacagac ct atg gag agt cag 234

Met Glu Ser Gln

1

ggt gtg cct ccc ggg cct tat cgg gcc acc aag ctg tgg aat gaa gtt 282

Gly Val Pro Pro Gly Pro Tyr Arg Ala Thr Lys Leu Trp Asn Glu Val

5 10 15 20

acc aca tct ttt cga gca gga atg cct cta aga aaa cac aga caa cac 330

Thr Thr Ser Phe Arg Ala Gly Met Pro Leu Arg Lys His Arg Gln His

25 30 35

ttt aaa aaa tat ggc aat tgt ttc aca gca gga gaa gca gtg gat tgg 378

Phe Lys Lys Tyr Gly Asn Cys Phe Thr Ala Gly Glu Ala Val Asp Trp

40 45 50

ctt tat gac cta tta aga aat aat agc aat ttt ggt cct gaa gtt aca 426

Leu Tyr Asp Leu Leu Arg Asn Asn Ser Asn Phe Gly Pro Glu Val Thr

55 60 65

agg caa cag act atc caa ctg ttg agg aaa ttt ctt aag aat cat gta 474

Arg Gln Gln Thr Ile Gln Leu Leu Arg Lys Phe Leu Lys Asn His Val

70 75 80

att gaa gat atc aaa ggg agg tgg gga tca gaa aat gtt gat gat aac 522

Ile Glu Asp Ile Lys Gly Arg Trp Gly Ser Glu Asn Val Asp Asp Asn

85 90 95 100

aac cag ctc ttc aga ttt cct gca act tcg cca ctt aaa act cta cca 570

Asn Gln Leu Phe Arg Phe Pro Ala Thr Ser Pro Leu Lys Thr Leu Pro

105 110 115

cga agg tat cca gaa ttg aga aaa aac aac ata gag aac ttt tcc aaa 618

Arg Arg Tyr Pro Glu Leu Arg Lys Asn Asn Ile Glu Asn Phe Ser Lys

120 125 130

gat aaa gat agc att ttt aaa tta cga aac tta tct cgt aga act cct 666

Asp Lys Asp Ser Ile Phe Lys Leu Arg Asn Leu Ser Arg Arg Thr Pro

135 140 145

aaa agg cat gga tta cat tta tct cag gaa aat ggc gag aaa ata aag 714

Lys Arg His Gly Leu His Leu Ser Gln Glu Asn Gly Glu Lys Ile Lys

150 155 160

cat gaa ata atc aat gaa gat caa gaa aat gca att gat aat aga gaa 762

His Glu Ile Ile Asn Glu Asp Gln Glu Asn Ala Ile Asp Asn Arg Glu

165 170 175 180

cta agc cag gaa gat gtt gaa gaa gtt tgg aga tat gtt att ctg atc 810

Leu Ser Gln Glu Asp Val Glu Glu Val Trp Arg Tyr Val Ile Leu Ile

185 190 195

tac ctg caa acc att tta ggt gtg cca tcc cta gaa gaa gtc ata aat 858

Tyr Leu Gln Thr Ile Leu Gly Val Pro Ser Leu Glu Glu Val Ile Asn

200 205 210

cca aaa caa gta att ccc caa tat ata atg tac aac atg gcc aat aca 906

Pro Lys Gln Val Ile Pro Gln Tyr Ile Met Tyr Asn Met Ala Asn Thr

215 220 225

agt aaa cgt gga gta gtt ata cta caa aac aaa tca gat gac ctc cct 954

Ser Lys Arg Gly Val Val Ile Leu Gln Asn Lys Ser Asp Asp Leu Pro

230 235 240

cac tgg gta tta tct gcc atg aag tgc cta gca aat tgg cca aga agc 1002

His Trp Val Leu Ser Ala Met Lys Cys Leu Ala Asn Trp Pro Arg Ser

245 250 255 260

aat gat atg aat aat cca act tat gtt gga ttt gaa cga gat gta ttc 1050

Asn Asp Met Asn Asn Pro Thr Tyr Val Gly Phe Glu Arg Asp Val Phe

265 270 275

aga aca atc gca gat tat ttt cta gat ctc cct gaa cct cta ctt act 1098

Arg Thr Ile Ala Asp Tyr Phe Leu Asp Leu Pro Glu Pro Leu Leu Thr

280 285 290

ttt gaa tat tac gaa tta ttt gta aac att ttg ggc ttg ctg caa cct 1146

Phe Glu Tyr Tyr Glu Leu Phe Val Asn Ile Leu Gly Leu Leu Gln Pro

295 300 305

cat tta gag agg gtt gcc atc gat gct cta cag tta tgt tgt ttg tta 1194

His Leu Glu Arg Val Ala Ile Asp Ala Leu Gln Leu Cys Cys Leu Leu

310 315 320

ctt ccc cca cca aat cgt aga aag ctt caa ctt tta atg cgt atg att 1242

Leu Pro Pro Pro Asn Arg Arg Lys Leu Gln Leu Leu Met Arg Met Ile

325 330 335 340

tcc cga atg agt caa aat gtt gat atg ccc aaa ctt cat gat gca atg 1290

Ser Arg Met Ser Gln Asn Val Asp Met Pro Lys Leu His Asp Ala Met

345 350 355

ggt acg agg tca ctg atg ata cat acc ttt tct cga tgt gtg tta tgc 1338

Gly Thr Arg Ser Leu Met Ile His Thr Phe Ser Arg Cys Val Leu Cys

360 365 370

tgt gct gaa gaa gtg gat ctt gat gag ctt ctt gct gga aga tta gtt 1386

Cys Ala Glu Glu Val Asp Leu Asp Glu Leu Leu Ala Gly Arg Leu Val

375 380 385

tct ttc tta atg gat cat cat cag gaa att ctt caa gta ccc tct tac 1434

Ser Phe Leu Met Asp His His Gln Glu Ile Leu Gln Val Pro Ser Tyr

390 395 400

tta cag act gca gtg gaa aaa cat ctt gac tac tta aaa aag gga cat 1482

Leu Gln Thr Ala Val Glu Lys His Leu Asp Tyr Leu Lys Lys Gly His

405 410 415 420

att gaa aat cct gga gat gga cta ttt gct cct ttg cca act tac tca 1530

Ile Glu Asn Pro Gly Asp Gly Leu Phe Ala Pro Leu Pro Thr Tyr Ser

425 430 435

tac tgt aag cag att agt gct cag gag ttt gat gag caa aaa gtt tct 1578

Tyr Cys Lys Gln Ile Ser Ala Gln Glu Phe Asp Glu Gln Lys Val Ser

440 445 450

acc tct caa gct gca att gca gaa ctt tta gaa aat att att aaa aac 1626

Thr Ser Gln Ala Ala Ile Ala Glu Leu Leu Glu Asn Ile Ile Lys Asn

455 460 465

agg agt tta cct cta aag gag aaa aga aaa aaa cta aaa cag ttt cag 1674

Arg Ser Leu Pro Leu Lys Glu Lys Arg Lys Lys Leu Lys Gln Phe Gln

470 475 480

aag gaa tat cct ttg ata tat cag aaa aga ttt cca acc acg gag agt 1722

Lys Glu Tyr Pro Leu Ile Tyr Gln Lys Arg Phe Pro Thr Thr Glu Ser

485 490 495 500

gaa gca gca ctt ttt ggt gac aaa cct aca atc aag caa cca atg ctg 1770

Glu Ala Ala Leu Phe Gly Asp Lys Pro Thr Ile Lys Gln Pro Met Leu

505 510 515

att tta aga aaa cca aag ttc cgt agt cta aga taa ctaactgaat 1816

Ile Leu Arg Lys Pro Lys Phe Arg Ser Leu Arg

520 525

taaaaattat gtaatacttg tggaactttg ataaatgaag ccatatctga gaatgtagct 1876

actcaaaagg aagtctgtca ttaataaggt atttctaaat aaacacatta tgtaaggaag 1936

tgccaaaata gttatcaatg tgagactctt aggaaactaa ctagatctca attgagagca 1996

cataacaata gatgatacca aatacttttt gtttttaaca cagctatcca gtaaggctat 2056

catgatgtgt gctaaaattt tatttacttg aattttgaaa actgagctgt gttagggatt 2116

aaactataat tctgttctta aaagaaaatt tatctgcaaa tgtgcaagtt ctgagatatt 2176

agctaatgaa ttagttgttt ggggttactt ctttgtttct aagtataaga atgtgaagaa 2236

tatttgaaaa ctcaatgaaa taattctcag ctgccaaatg ttgcactctt ttatatattc 2296

tttttccact tttgatctat ttatatatat gtatgtgttt ttaaaatatg tgtatatttt 2356

atcagatttg gttttgcctt aaatattatc cccaattgct tcagtcattc atttgttcag 2416

tatatatatt ttgaattcta gttttcataa tctattagaa gatggggata taaaagaagt 2476

ataaggcaat catatattca ttcaaaagat atttatttag caactgctat gtgcctttcg 2536

ttgttccaga tatgcagaga caatgataaa taaaacatat aatctcttcc ataaggtatt 2596

tattttttaa tcaagggaga tacacctatc agatgtttaa aataacaaca ctacccactg 2656

aaatcagggc atatagaatc attcagctaa agagtgactt ctatgatgat ggaacaggtc 2716

tctaagctag tggttttcaa actggtacac attagactca cccgaggaat tttaaaacag 2776

cctatatgcc cagggcctaa cttacactaa ttaaatctga attttgggga tgttgtatag 2836

ggattagtat tttttttaat ctaggtgatt ccaatattca gccaactgtg agaatcaatg 2896

gcctaaatgc tttttataaa catttttata agtgtcaaga taatggcaca ttgactttat 2956

tttttcattg gaagaaaatg cctgccaagt ataaatgact ctcatcttaa aacaaggttc 3016

ttcaggtttc tgcttgattg acttggtaca aacttgaagc aagttgcctt ctaattttta 3076

ctccaagatt gtttcatatc tattccttaa gtgtaaagaa atatataatg catggtttgt 3136

aataaaatct taatgtttaa tgactgttct catttctcaa tgtaatttca tactgtttct 3196

ctataaaatg atagtattcc atttaacatt actgattttt attaaaaacc tggacagaaa 3256

attataaatt ataaatatga ctttatcctg gctataaaat tattgaacca aaatgaattc 3316

tttctaaggc atttgaatac taaaacgttt attgtttata gatatgtaaa atgtggatta 3376

tgttgcaaat tgagattaaa attatttggg gttttgtaac aatataattt tgcttttgta 3436

ttatagacaa atatataaat aataaaggca ggcaactttc atttgcacta atgtacatgc 3496

aattgagatt acaaaataca tggtacaatg ctttaataac aaactctgcc agtcaggttt 3556

gaatcctact gtgctattaa ctagctagta aactcagaca agttacttaa cttctctaag 3616

ccccagtttt gttatctata aaatgaatat tataatagta cctcttttta ggattgcgag 3676

gattaagcag gataatgcat gtaaagtgtt agcacagtgt ctcacataga ataagcactc 3736

tataaatatt ttactagaat cacctaggat tatagcacta gaagagatct tagcaaaaat 3796

gtggtccttt ctgttgcttt ggacagacat gaaccaaaac aaaattacgg acaattgatg 3856

agccttatta actatctttt cattatgaga caaaggttct gattatgcct actggttgaa 3916

attttttaat ctagtcaaga aggaaaattt gatgaggaag gaaggaatgg atatcttcag 3976

aagggcttcg cctaagctgg aacatggata gattccattc taacataaag atctttaagt 4036

tcaaatatag atgagttgac tggtagattt ggtggtagtt gctttctcgg gatataagaa 4096

gcaaaatcaa ctgctacaag taaagagggg atggggaagg tgttgcacat ttaaagagag 4156

aaagtgtgaa aaagcctaat tgtgggaatg cacaggtttc accagatcag atgatgtctg 4216

gttattctgt aaattatagt tcttatccca gaaattactg cctccaccat ccctaatatc 4276

ttctaattgg tatcatataa tgacccactc ttcttatgtt atccaaacag ttatgtggca 4336

tttagtaatg gaatgtacat ggaatttccc actgacttac ctttctgtcc ttgggaagct 4396

taaactctga atcttctcat ctgtaaaatg tgaattaaag tatctaccta actgagttgt 4456

gattgtagtg aaagaaaggc aatatattta aatcttgaat ttagcaagcc cacgcttgat 4516

ttttatgtcc tttcctcttg ccttgtattg agtttaagat ctctactgat taaaactctt 4576

ttgctatcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 4607

<210> 116

<211> 527

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 116

Met Glu Ser Gln Gly Val Pro Pro Gly Pro Tyr Arg Ala Thr Lys Leu

1 5 10 15

Trp Asn Glu Val Thr Thr Ser Phe Arg Ala Gly Met Pro Leu Arg Lys

20 25 30

His Arg Gln His Phe Lys Lys Tyr Gly Asn Cys Phe Thr Ala Gly Glu

35 40 45

Ala Val Asp Trp Leu Tyr Asp Leu Leu Arg Asn Asn Ser Asn Phe Gly

50 55 60

Pro Glu Val Thr Arg Gln Gln Thr Ile Gln Leu Leu Arg Lys Phe Leu

65 70 75 80

Lys Asn His Val Ile Glu Asp Ile Lys Gly Arg Trp Gly Ser Glu Asn

85 90 95

Val Asp Asp Asn Asn Gln Leu Phe Arg Phe Pro Ala Thr Ser Pro Leu

100 105 110

Lys Thr Leu Pro Arg Arg Tyr Pro Glu Leu Arg Lys Asn Asn Ile Glu

115 120 125

Asn Phe Ser Lys Asp Lys Asp Ser Ile Phe Lys Leu Arg Asn Leu Ser

130 135 140

Arg Arg Thr Pro Lys Arg His Gly Leu His Leu Ser Gln Glu Asn Gly

145 150 155 160

Glu Lys Ile Lys His Glu Ile Ile Asn Glu Asp Gln Glu Asn Ala Ile

165 170 175

Asp Asn Arg Glu Leu Ser Gln Glu Asp Val Glu Glu Val Trp Arg Tyr

180 185 190

Val Ile Leu Ile Tyr Leu Gln Thr Ile Leu Gly Val Pro Ser Leu Glu

195 200 205

Glu Val Ile Asn Pro Lys Gln Val Ile Pro Gln Tyr Ile Met Tyr Asn

210 215 220

Met Ala Asn Thr Ser Lys Arg Gly Val Val Ile Leu Gln Asn Lys Ser

225 230 235 240

Asp Asp Leu Pro His Trp Val Leu Ser Ala Met Lys Cys Leu Ala Asn

245 250 255

Trp Pro Arg Ser Asn Asp Met Asn Asn Pro Thr Tyr Val Gly Phe Glu

260 265 270

Arg Asp Val Phe Arg Thr Ile Ala Asp Tyr Phe Leu Asp Leu Pro Glu

275 280 285

Pro Leu Leu Thr Phe Glu Tyr Tyr Glu Leu Phe Val Asn Ile Leu Gly

290 295 300

Leu Leu Gln Pro His Leu Glu Arg Val Ala Ile Asp Ala Leu Gln Leu

305 310 315 320

Cys Cys Leu Leu Leu Pro Pro Pro Asn Arg Arg Lys Leu Gln Leu Leu

325 330 335

Met Arg Met Ile Ser Arg Met Ser Gln Asn Val Asp Met Pro Lys Leu

340 345 350

His Asp Ala Met Gly Thr Arg Ser Leu Met Ile His Thr Phe Ser Arg

355 360 365

Cys Val Leu Cys Cys Ala Glu Glu Val Asp Leu Asp Glu Leu Leu Ala

370 375 380

Gly Arg Leu Val Ser Phe Leu Met Asp His His Gln Glu Ile Leu Gln

385 390 395 400

Val Pro Ser Tyr Leu Gln Thr Ala Val Glu Lys His Leu Asp Tyr Leu

405 410 415

Lys Lys Gly His Ile Glu Asn Pro Gly Asp Gly Leu Phe Ala Pro Leu

420 425 430

Pro Thr Tyr Ser Tyr Cys Lys Gln Ile Ser Ala Gln Glu Phe Asp Glu

435 440 445

Gln Lys Val Ser Thr Ser Gln Ala Ala Ile Ala Glu Leu Leu Glu Asn

450 455 460

Ile Ile Lys Asn Arg Ser Leu Pro Leu Lys Glu Lys Arg Lys Lys Leu

465 470 475 480

Lys Gln Phe Gln Lys Glu Tyr Pro Leu Ile Tyr Gln Lys Arg Phe Pro

485 490 495

Thr Thr Glu Ser Glu Ala Ala Leu Phe Gly Asp Lys Pro Thr Ile Lys

500 505 510

Gln Pro Met Leu Ile Leu Arg Lys Pro Lys Phe Arg Ser Leu Arg

515 520 525

<210> 117

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> линкерный пептид

<400> 117

Asn Lys Arg Lys

1

<---

1. Пептид, содержащий менее чем 15 аминокислот, со способностью индуцировать цитотоксическую T-клетку (ЦТЛ) в присутствии антигенпрезентирующей(-их) клетки(-ок), экспрессирующей(-их) HLA-A*1101, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из нижеследующей группы, состоящей из:

(a) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1; и

(b) аминокислотной последовательности, имеющей одну или более замен, выбранных из нижеследующих (1)-(4), введенных в аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1:

(1) вторая аминокислота с N-конца замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из треонина, валина, изолейцина, лейцина, фенилаланина и тирозина;

(2) третья аминокислота с N-конца замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лейцина, фенилаланина, тирозина, изолейцина и аланина; и

(3) седьмая аминокислота с N-конца замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лейцина, изолейцина, тирозина, валина и фенилаланина; и

(4) C-концевая аминокислота замещена аргинином.

2. Пептид по п. 1, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

3. Полинуклеотид, который кодирует пептид по любому из пп. 1, 2.

4. Композиция для индуцирования иммунного ответа против клеток, экспрессирующих DEPDC1 и HLA-A*1101, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и подходящую дозу, по меньшей мере, одного ингредиента, выбранного из группы, состоящей из нижеизложенных пунктов (a)–(d):

(a) один или несколько пептидов по любому из пп. 1, 2;

(b) один или несколько полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы) по любому из пп. 1, 2 в экспрессируемой форме;

(c) антигенпрезентирующая клетка (АПК), которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. 1, 2 и HLA -A*1101; и

(d) экзосома, которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. 1, 2 и HLA -A*1101.

5. Композиция по п. 4, где индуцирование иммунного ответа против клеток, экспрессирующих DEPDC1 и HLA-A*1101, является индуцированием ЦТЛ(-ов) против клеток, экспрессирующих DEPDC1 и HLA-A*1101.

6. Композиция по п. 4, которая является фармацевтической композицией.

7. Композиция по п. 6, которая предназначена для одного или нескольких применений, выбранных из группы, состоящей из (i) лечения злокачественных опухолей, (ii) предупреждения (профилактики) злокачественной опухоли и (iii) предупреждения (профилактики) послеоперационного рецидива злокачественной опухоли.

8. Композиция по п. 6, которая предназначена для индуцирования иммунного ответа против злокачественной опухоли.

9. Композиция по п. 7 или 8, где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака шейки матки, холангиоцеллюлярного рака, хронического миелолейкоза (ХМЛ), рака толстого кишечника, рака желудка, немелкоклеточного рака легких (NSCLC), лимфомы, остеосаркомы, рака простаты, мелкоклеточного рака легких (SCLC) и опухоли мягких тканей.

10. Композиция по любому из пп. 4-9, которую формулируют для введения индивидууму, положительному, по меньшей мере, по одному HLA, выбранному из группы, состоящей из HLA-A *1101.

11. Способ индуцирования АПК со способностью индуцировать ЦТЛ, который включает этап, выбранный из группы, состоящей из:

(a) контакта АПК, экспрессирующей HLA-A*1101, с пептидом по любому из пп. 1, 2 in vitro, ex vivo или in vivo; и

(b) введения полинуклеотида, кодирующего пептид по любому из пп. 1, 2, в АПК, экспрессирующей HLA-A*1101.

12. Способ индуцирования ЦТЛ, который включает этап, выбранный из группы, состоящей из:

(a) совместного культивирования CD8-положительной T-клетки/клеток с АПК, которые презентируют на своей поверхности комплекс из HLA-A*1101 и пептида по любому из пп. 1, 2; и

(b) совместного культивирования CD8-положительной T-клетки/клеток с экзосомой/экзосомами, которые презентируют на своей поверхности комплекс из HLA-A*1101 и пептида по любому из пп. 1, 2.

13. АПК, которая презентирует на своей поверхности комплекс из HLA-A*1101 и пептида по любому из пп. 1, 2.

14. АПК по п. 13, которая индуцирована при помощи способа по п. 11.

15. Способ индуцирования иммунного ответа против злокачественной опухоли, экспрессирующей DEPDC1 и HLA-A*1101, который включает введение индивидууму, подходящей дозы по меньшей мере, одного ингредиента, выбранного из группы, состоящей из нижеизложенных пунктов (a)–(d):

(a) один или несколько пептидов по любому из пп. 1, 2;

(b) один или несколько полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы) по любому из пп. 1, 2 в экспрессируемой форме;

(c) антигенпрезентирующая клетка (АПК), которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. 1, 2 и HLA-A*1101; и

(d) экзосома, которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. 1, 2 и HLA-A*1101.

16. Способ лечения или профилактики злокачественной опухоли, экспрессирующей DEPDC1 и HLA-A*1101, или профилактики ее послеоперационного рецидива, который включает введение индивидууму композиции, содержащей подходящую дозу, по меньшей мере, одного активного ингредиента, выбранного из группы, состоящей из нижеизложенных пунктов (a)-(d):

(a) один или несколько пептидов по любому из пп. 1, 2;

(b) один или несколько полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы) по любому из пп. 1, 2 в экспрессируемой форме;

(c) антигенпрезентирующая клетка (АПК), которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. 1, 2 и HLA -A*1101; и

(d) экзосома, которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. 1, 2 и HLA -A*1101.

17. Способ скрининга на пептид со способностью индуцировать ЦТЛ, который включает этапы:

(a) создания кандидатных последовательностей, состоящих из аминокислотной последовательности, в которой один, два или несколько аминокислотных остатков замещены, удалены, вставлены и/или добавлены по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1;

(b) отбор в кандидатных последовательностях, полученных в (a), кандидатной последовательности, которая не имеет значительной гомологии (идентичности последовательности) с любым известным продуктом гена человека, за исключением DEPDC1;

(c) контакт АПК, экспрессирующей HLA-A*1101, с пептидом, состоящим из кандидатной последовательности, выбранной в (b);

(d) контакт АПК из (c) с CD8-положительной T-клеткой; и

(e) отбор пептида, который имеет равную или более высокую способность индуцировать ЦТЛ, по сравнению со способностью пептида, состоящего из исходной аминокислотной последовательности.

18. Эмульсия для индуцирования иммунного ответа против клеток, экспрессирующих DEPDC1 и HLA-A*1101, содержащая подходящую дозу одного или несколько пептидов по любому из пп. 1, 2, водорастворимый носитель и масляный адъювант.

19. Набор для одного или более применений, выбранных из группы, состоящей из (i) лечения злокачественной опухоли, экспрессирующей DEPDC1 и HLA-A*1101, (ii) предупреждения (профилактики) злокачественной опухоли, экспрессирующей DEPDC1 и HLA-A*1101, и (iii) предупреждения (профилактики) послеоперационного рецидива злокачественной опухоли, экспрессирующей DEPDC1 и HLA-A*1101, включающий контейнер, который содержит композицию по любому из пп. 4-10, и контейнер, который содержит адъювант.

20. Применение подходящей дозы по меньшей мере одного ингредиента, выбранного из группы, состоящей из нижеизложенных пунктов с (a) по (d):

(a) один или несколько пептидов по любому из пп. 1, 2;

(b) один или несколько полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы) по любому из пп. 1, 2 в экспрессируемой форме;

(c) антигенпрезентирующая клетка (АПК), которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. 1, 2 и HLA-A*1101; и

(d) экзосома, которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. 1, 2 и HLA-A*1101,

при получении фармацевтической композиции для индуцирования иммунного ответа против злокачественной опухоли, экспрессирующей DEPDC1 и HLA-A*1101.

21. Применение подходящей дозы по меньшей мере одного активного ингредиента, выбранного из группы, состоящей из нижеизложенных пунктов (a)–(d):

(a) один или несколько пептидов по любому из пп. 1, 2;

(b) один или несколько полинуклеотидов, кодирующих пептид(-ы) по любому из пп. 1, 2 в экспрессируемой форме;

(c) антигенпрезентирующая клетка (АПК), которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. 1, 2 и HLA-A*1101; и

(d) экзосома, которая презентирует на своей клеточной поверхности комплекс из пептида по любому из пп. 1, 2 и HLA-A*1101,

при получении фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, экспрессирующей DEPDC1 и HLA-A*1101, и/или профилактики послеоперационного рецидива злокачественной опухоли.



 

Похожие патенты:

Настоящее изобретение относится к клеточной биологии и медицине, в частности к дерматологии, и раскрывает способ оценки противопсориатического действия наружного препарата на лабораторной модели имиквимод-индуцированного псориаза. Для осуществления указанного способа проводят иммуногистохимическое исследование биоптата пораженного участка кожи.

Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии и медицины, в частности к способам получения чувствительных к глюкозе в крови бета-клеток, секретирующих инсулин. Для осуществления указанных способов используют эндокринные клетки, секретирующие гормоны, которые одновременно экспрессируют INS и NKX6.1.
Изобретение относится к клеточной биологии и медицине, в частности к способу выделения фибробластов из стромы роговицы. Для осуществления способа используют стромальные лентикулы, полученные при лазерной коррекции зрения.

Изобретение относится к медицине, а именно к сосудистой хирургии. Способ изготовления in vitro персонифицированного клеточнозаселенного сосудистого протеза заключается в формировании каркаса протеза из смеси полигидроксибутирата/валерата в концентрации от 3 до 7% (m/v) и с-поликапролактона в концентрации от 9 до 14% (m/v) методом электроспиннинга, покрытии каркаса аутологичным фибрином с дальнейшим заселением внутренней поверхности аутологичными колониеформирующими эндотелиальными клетками, выделенными из периферической крови, в количестве не менее 700000 клеток на 1 см2 и подготовке эндотелиального слоя в условиях пульсирующего проточного биореактора к дальнейшей имплантации в сосудистое русло.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к искусственной антигенпрезентирующей клетке (aAPC), а также к способу ее получения. Также раскрыто применение вышеуказанной клетки в способе активации антигенспецифической T-клетки, способе индуцирования пролиферации T-клетки, способе экспансии субпопуляции из популяции T-клеток, а также в способе индуцирования T-клеточного ответа на антиген HPV-E7.

Настоящая группа изобретений относится к клеточной биологии. Предложен способ обогащения CD4+- и CD8+-T-клеток, который предусматривает проведение в замкнутой системе отбора CD4+-клеток и отбора CD8+-клеток из образца, содержащего первичные T-клетки человека, и комбинирование этих клеток в необходимом соотношении, составляющем приблизительно от 10:1 до 1:10.

Настоящее изобретение относится к генетической инженерии и медицине, в частности к генно-клеточному везикулярному терапевтическому препарату для терапии рассеянного склероза и способу терапии рассеянного склероза путём трансплантации указанного препарата посредством однократного внутривенного введения.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу повышения количества прегнан Х рецептора. Способ включает культивирование линии клеток аденокарциномы ободочной кишки человека и предусматривает добавление в среду пероксида водорода до достижения его концентрации в среде 10, 50, 100 мкМ с инкубацией в течение 24 часов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ повышения аутологичной противоопухолевой активности нейтрофилов in vitro у больных с онкологическими заболеваниями включает выделение клеток из венозной крови, их культивирование в условиях CO2-инкубатора при 37°С в питательной среде при концентрации клеток 1⋅106 кл/мл, новым является то, что инкубацию осуществляют в течение 4-х часов в среде, дополнительно содержащей 0,5 М глутаминовой кислоты и 48,5 мМ глицеральдегид-3-фосфата, при этом через 2 часа после начала инкубации в среду вносят раствор аргинина в конечной концентрации 2М.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены химерные антигенные рецепторы (CAR) против представителя D группы 5 семейства С рецепторов, связанных с G-белками (GPRC5D), иммунореактивная клетка, Т-клетка, молекула нуклеиновой кислоты, клетка-хозяин.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному вектору, содержащему промотор, функционально связанный с последовательностью, которая кодирует тирозинкиназный рецептор В (TrkB), и последовательностью, которая кодирует агонист рецептора TrkB, и может быть использовано в медицине.
© Патентный поиск, поиск патентов на изобретения - FindPatent.RU 2012-2024
Политика конфиденциальности 2015-08-12 2022-02-23T14:59:55
Наверх