Способ повышения количества прегнан х рецептора
Владельцы патента RU 2762853:
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения Российской Федераци (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу повышения количества прегнан Х рецептора. Способ включает культивирование линии клеток аденокарциномы ободочной кишки человека и предусматривает добавление в среду пероксида водорода до достижения его концентрации в среде 10, 50, 100 мкМ с инкубацией в течение 24 часов. Изобретение эффективно в качестве доступного способа повышения количества прегнан Х рецептора в эксперименте in vitro. 1 ил.
Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии и клинической фармакологии, и предназначено для индуцирования прегнан Х рецептора (PXR).
Прегнан Х рецептор (PXR, steroid and xenobiotic receptor – SXR, NR1I2 - Nuclear Receptor Subfamily 1, Group I, Member 2) является членом суперсемейства ядерных рецепторов и регулирует экспрессию ферментов I фазы биотрансформации (изоферментов цитохрома P450 CYP3A и CYP2B), экспрессию ферментов II фазы биотрансформации (UDP-глюкуронозилтрансферазы 1A1 и сульфотрансферазы), а также переносчиков лекарственных веществ MDR1 и MRP2. Изменение количества PXR в эксперименте in vitro может применяться для изучения роли данного рецептора в фармакокинетике лекарственных веществ.
Известно, что индукторами PXR являются рифампицин, рифаксимин, ампренавир, литохолевая кислота, соломстерол A и B, дексаметазон, никардипин [Chai S.C., Lin W., Li Y., Chen T. 2019. Drug discovery technologies to identify and characterize modulators of the pregnane X receptor and the constitutive androstane receptor. Drug Discov Today. 24 (3), 906–915].
Техническим результатом настоящего изобретения является разработка доступного и экономичного способа повышения количества прегнан Х рецептора в эксперименте in vitro.
С данной целью было выполнено исследование на линии клеток аденокарциномы ободочной кишки человека (Caco-2) (ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных», Санкт-Петербург, Россия). Клетки культивировали при 37ºС и 5% содержании СО2 в инкубаторе WS-189C («World Science», Корея) в Дульбекко модифицированной среде Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4500 мг/л) (Sigma-Aldrich, CША), с добавлением L-глутамина (4 мМ) (Sigma-Aldrich), 15% эмбриональной бычьей сыворотки (Sigma-Aldrich), 100 ЕД/мл и 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина (Sigma-Aldrich) соответственно.
Клетки культивировали в течение 21 сут, поскольку при данном сроке происходит их спонтанная дифференцировка в энтероцитоподобные клетки, экспрессирующие PXR [Garg A., Zhao A., Erickson S.L., Mukherjee S., Lau A.J., Alston L., Chang T.K., Mani S., Hirota S.A. 2016. Pregnane X Receptor Activation Attenuates Inflammation-Associated Intestinal Epithelial Barrier Dysfunction by Inhibiting Cytokine-Induced Myosin Light-Chain Kinase Expression and c-Jun N-Terminal Kinase 1/2 Activation. J Pharmacol Exp Ther. 359 (1), 91-101. http://doi.org/: 10.1124/jpet.116.234096].
После чего для активации PXR в культуральную среду добавляли пероксид водорода Н2О2 («Sigma-Aldrich», Германия) до достижения его концентрации 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50, 100 мкМ и инкубировали 3 и 24 ч. На каждый эксперимент было выполнено по 3 повторения. Контрольным клеткам в эквивалентном объеме в культуральную среду добавляли воду для инъекций.
После окончания экспозиции клетки снимали с лунок раствором трипсин-ЭДТА (Sigma-Aldrich), трижды промывали раствором фосфатного буфера (BioRad, США) и лизировали в NP40 Cell Lysis Buffer Thermo (Thermo Fisher Scientific, США) c добавлением смеси ингибиторов протеиназ (Sigma-Aldrich) в течение 30 минут при +40С и постоянном перемешивании из расчета 107 клеток на 100 мкл буфера. Полученный лизат центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 минут (AvantiJXN-3, Beckmancoulter, США). В супернатанте определяли относительного количество PXR с помощью метода вестерн-блот.
Полученные результаты анализировали с помощью программ «StatSoft Statistica 13.0» (США, номер лицензии JPZ811I521319AR25ACD-W) и Microsoft Excel for MAC ver. 16.24 (ID02984-001-000001). Результаты представлены в виде M±SD. Для оценки статистической значимости различий использовали дисперсионный анализ (ANOVA), попарные сравнения выполняли с помощью критерия Ньюмена-Кейлса. Статистически значимыми считали различия при p<0.05.
Воздействие пероксида водорода на клетки линии Caco-2 в течение 3 ч не влияло на количество PXR, данный показатель достоверно не отличался от значений контроля.
Увеличение длительности экспозиции с пероксидом водорода до 24 ч вызывало повышение количества PXR при концентрации H2O2 10 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ на 67.1% (р = 0.03), 25.9% (р = 0.0003) и 35.9% (р = 0.0003) соответственно. Экспозиция с пероксидом водорода в концентрациях 0,1, 0,5, 1, 5 мкМ не вызывала дострверного изменения количества PXR.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Относительное количество PXR в клетках линии Сасо-2 при индукции окислительного стресса пероксидом водорода в концентрациях 0.1-100 мкМ в течение 3 и 24 ч (M ± SD, n = 3). Примечание: к -контроль; * - p < 0,05 по сравнению с контролем
Таким образом, для повышения количества PXR в клетках аденокарциномы ободочной кишки человека необходимо добавление в Дульбекко модифицированную среду Игла пероксида водорода до достижения его концентрации в среде 10 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ с последующей инкубацией в течение 24 часов.
Способ был использован при изучении фармакокинетики лекарственных веществ – субстратов MDR1 в трех экспериментах.
Способ повышения количества прегнан Х рецептора, включающий культивирование линии клеток аденокарциномы ободочной кишки человека в Дульбекко модифицированной среде Игла с содержанием глюкозы 4500 мг/л, содержащей L-глутамин 4 мМ, 15% бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в течение 21 суток, отличающийся последующим добавлением в среду пероксида водорода до достижения его концентрации в среде 10, 50, 100 мкМ с инкубацией в течение 24 часов.
