Синтез лираглутида

Изобретение относится к эффективному твердофазному синтезу лираглутида, представленного Формулой-I. Способ включает следующие стадии: а) загрузки С-концевого глицина на твердофазную подложку на основе смолы в присутствии связующего агента; b) кэппирования непрореагировавших функциональных сайтов; c) последовательного связывания N^α-защищенных аминокислот и аминокислот с защищенными боковыми цепями с получением остова лираглутида в присутствии связующего агента и неорганической соли; d) снятия защитной группы боковой цепи лизина; e) связывания глутаминовой кислоты и пальмитиновой кислоты с боковой цепью лизина в присутствии связующего агента и неорганической соли; и f) получения неочищенного лираглутида посредством удаления защитных групп и отщепления пептида от смолы; где способ включает связывание аминокислот 9-13 при повышенной температуре в диапазоне от 30 до 45°C, где указанная неорганическая соль присутствует в качестве катализатора и выбрана из группы, состоящей из хлорида магния, хлорида цинка и хлорида меди, где стадия (с) включает снятие Fmoc-защиты каждой загруженной аминокислоты с использованием пиперидина в DMF (N,N'-диметилформамид) или смеси пиперидин/DBU (1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен)/DMF, где после каждой стадии снятия Fmoc-защиты осуществляют стадию промывки с использованием HOBt (N-гидроксибензотриазол) в DMF и снятие метилтритильной защитной группы лизина. Способ обеспечивает избегание делеции последовательностей и приводит к увеличению выхода. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 2 ил., 7 пр.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к эффективному твердофазному синтезу лираглутида, представленного Формулой-I.

Лираглутид (VICTOZA®) представляет собой агонист рецептора глюкагоноподобного пептида-1 (ГПП-1), рекомендуемый в качестве дополнения к рациону и физическим упражнениям для улучшения гликемического контроля у взрослых с сахарным диабетом 2 типа.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Лираглутид представляет собой длительно действующий аналог встречающегося в природе человеческого глюкагоноподобного пептида-1 (ГПП-1(7-37)), у которого лизин в положении 34 замещен аргинином и пальмитоиловая группа присоединена посредством глутамоил-спейсера к лизину в положении 26.

Лираглутид (VICTOZA®), разработанный Novo Nordisk, получил первоначальное одобрение в США в 2010 году в виде подкожной инъекции.

В патенте США №6268343 раскрыт лираглутид и способ его получения. Где в получении Arg³⁴-ГПП-1(7-37)-ОН используют технологии генной инженерии с последующей реакцией с N^α-гексадеканоил-Glu(ONSu)-O^tBu.

В США 7273921 В2 и США 6451974 В1 раскрыт способ ацилирования Arg³⁴-ГПП-1(7-37)-ОН с получением лираглутида.

В США 9260474 В2 раскрыт твердофазный синтез лираглутида, отличающийся тем, что включает а) последовательное связывание аминокислот с N-концевой защитой и защитой боковых цепей на основе последовательности пептидного остова лираглутида, где для лизина используется Fmoc-Lys(Alloc)-OH;

b) снятие Alloc-защиты на боковой цепи лизина;

c) связывание пальмитоил-Glu-O^tBu или последовательное связывание глутаминовой кислоты и пальмитоил-хлорида с боковой цепью лизина;

d) удаление защитных групп и расщепление смолы с получением неочищенного лираглутида.

В WO 2014/199397 А2 раскрыт твердофазный синтез лираглутида с использованием подхода на основе последовательного связывания и фрагментного подхода, где для лизина используется Fmoc-Lys(dde)-OH.

В WO 2016/059609 А1 раскрыт способ ацилирования Arg³⁴-ГПП-1(7-37)-ОН с использованием агента на основе меди с получением лираглутида.

Предыдущие способы получения лираглутида имеют недостатки. Данные способы не подходят для крупномасштабного производства лираглутида вследствие сложных методик и высоких затрат; в способах, где Alloc используется в качестве защитной группы боковой цепи лизина, снятие Alloc-защиты требует катализаторов на основе металлов, таких как Pd(PPh₃₎₄, которые являются довольно дорогими. Кроме того, катализатор является влагочувствительным, реакцию нужно проводить в контролируемых условиях и должно рассматриваться содержание тяжелых металлов в конечном продукте. Следовательно, данные способы не являются коммерчески целесообразными или продолжают существовать проблемы осуществления.

Во время твердофазного синтеза наблюдается устойчивая тенденция к агрегации пептидов в используемых условиях. Это происходит по следующим причинам:

a) растущая пептидная последовательность чувствительна к образованию β-листового типа структур, что приводит к разрушению пептидильной смолы, и

b) присутствие гидрофобных аминокислот, которые приводят к появлению свернутой пептидной цепи.

В таких условиях дисперсия реагентов в пептидильную смолу ограничена, реакции связывания и снятия защиты будут медленными и неполными, приводя, таким образом, к образованию примесей пептидов, приводя к сложностям в очистки и приводя в результате к низкому выходу. Следовательно, остается потребность в обеспечении эффективного способа получения лираглутида, который имел бы высокий выход, был масштабируемым, экономически эффективным, экологически безвредным и коммерчески целесообразным в результате избегания повторных трудоемких и продолжительных стадий очистки.

ЦЕЛЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Цель настоящего изобретения заключается в разработке простого, надежного и коммерчески целесообразного последовательного способа получения лираглутида Формулы I с помощью неорганических солей, новых и эффективных условия связывания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1: Схема последовательности операций способа твердофазного синтеза лираглутида (Формула-I) согласно настоящему изобретению.

На Фиг. 2: проиллюстрирована ВЭЖХ (высоко-эффективная жидкостная хроматография)-хроматограмма лираглутида

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Воплощение настоящего изобретения включает способ синтеза для получения лираглутида, включающий следующие стадии:

a) Загрузка С-концевого глицина на твердофазную подложку на основе смолы в присутствии связующего агента.

b) Последовательное связывание Nα-защищенных аминокислот и аминокислот с защищенными боковыми цепями с получением остова лираглутида в присутствии связующего агента и неорганической соли.

c) Снятие защитной группы боковой цепи лизина.

d) Связывание γ-глутаминовой кислоты и пальмитиновой кислоты последовательным образом с боковой цепью лизина в присутствии связующего агента и неорганической соли.

e) Неочищенный лираглутид получают посредством удаления защитных групп и отщепления пептида от смолы.

f) Очистка неочищенного лираглутида.

Схематическое описание способа представляет собой такое, как показано на Фиг. 1.

Используемый подход представляет собой твердофазный синтез лираглутида посредством последовательного подхода и предусматривает неорганические соли во время связывания совместно с обычными связующими агентами и добавками. Согласно способу предложено завершение реакций связывания и снятия защиты и уменьшение рацемизации и, вследствие этого, контроль изомерных примесей, которые очень близки к целевой молекуле, и, в свою очередь, облегчение способа очистки данного пептида.

Для дополнительного улучшения настоящего изобретения на указанной стадии-А) смолу Ванга используют в качестве твердофазной подложки на основе смолы и связывают с Fmoc-Gly-OH с использованием DIC (N,N'-диизопропилкарбодиимид) в качестве связующего агента и MDC (дихлорметан) в качестве растворителя.

Применение 2-хлортритильной смолы (СТС) в качестве твердофазной подложки было ограничено, поскольку реакции связывания были медленными и не протекали до завершения после последовательности 15 аминокислот, и при этом пептид, присоединенный к СТС смоле, являлся лабильным и имеет тенденцию к экстрагированию в мягких кислотных условиях, используемых во время циклов связывания/промывки. Так как синтез лираглутида является многостадийным, на каждой стадии происходит частичное экстрагирование, приводящее к уменьшению общего выхода.

Для дополнительного улучшения настоящего изобретения, на указанной стадии-В), способ включает следующие стадии:

B1) снятие защитной группы Fmoc с Fmoc-Gly-смолы с использованием смеси Пиперидин/DMF (N,N'-Диметилформамид) или Пиперидин, DBU (1,8-Диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен), DMF с получением H-Gly-смолы.

B2) промывка загруженной смолы.

B3) связывание Fmoc-Arg(Pbf)-OH с H-Gly-смолой в присутствии связующего агента, связующей добавки, неорганической соли и основания.

B4) посредством повторения стадий В1, В2 и В3З синтезируют остов лираглутида, где на стадии-В3 защищенные аминокислоты последовательно связываются с получением остова лираглутида.

Для дополнительного улучшения настоящего изобретения, на указанной стадии-В) и D), связующий агент был выбран из группы, состоящей из HBTU (О-Бензотриазол-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат), COMU (1-Циано-2-этокси-2-оксоэтилиденаминоокси)диметиламино-морфолино-карбения гексафторфосфат), DEPBT (3-(Диэтоксифосфорилокси)-1,2,3-бензотриазин-4(3H)-он) или DIC.

Связующие добавки были выбраны их группы, состоящей из чистого оксима или HOBt (N-Гидроксибензотриазол), основание было выбрано из DIPEA (Диизопропилэтиламин), NMM (N-метилморфолин) или ТМР (2,4,6-Триметилпиридин), и неорганическая соль, была выбрана из группы, состоящей из хлорида магния, хлорида цинка или хлорида меди.

Как сказано на стадии-В2), загруженную смолу промывали 0,01-0,1 М HOBt в DMF или изопропаноле.

Для дополнительного улучшения настоящего изобретения, как сказано на стадии-В), Mtt использовали в качестве защитной группы для лизина, и, как сказано на стадии-С), защитную группу Mtt с боковой цепи лизина удаляли посредством использования TFA (трифторуксусная кислота)/MDC или HFIP (1,1,1,3,3,3-Гексафтор-2-пропанол)/TES (Триэтилсилан)/TFE (Трифторэтанол)/MDC.

Для дополнительного улучшения настоящего изобретения, на указанной стадии-D), боковую цепь пальмитоил-глутаминовой кислоты (Pal-Glu) связывали в присутствии связующего агента, выбранного из группы, состоящей из HBTU, COMU, DEPBT или DIC; связующей добавки, выбранной из группы, состоящей из чистого оксима или HOBt; основания, выбранного из DIPEA, NMM или ТМР, и неорганической соли, выбранной из группы, состоящей из хлорида магния, хлорида цинка или хлорида меди.

Другое воплощение настоящего изобретения включает способ синтеза для получения лираглутида, включающий следующие стадии:

A) Связывание Na-Fmoc-защищенного глицина (Fmoc-Gly-OH) с твердофазной подложкой на основе смолы в присутствии связующего агента.

B) Последовательное связывание Nα-защищенных аминокислот и аминокислот с защищенными боковыми цепями с получением остова лираглутида, в присутствии связующего агента и неорганической соли.

C) Снятие защитной группы боковой цепи лизина.

D) Связывание боковой цепи пальмитоил-глутаминовой кислотой (Pal-Glu) с боковой цепью лизина в присутствии связующего агента и неорганической соли.

E) Неочищенный лираглутид получают посредством удаления защитных групп и отщепления пептида от смолы.

F) Очистка неочищенного лираглутида.

Для дополнительного улучшения настоящего изобретения, на указанной стадии-D), боковую цепь пальмитоил-глутаминовой кислоты (Pal-Glu) связывали в присутствии связующего агента, выбранного из группы, состоящей из HBTU, COMU, DEPBT или DIC; связующей добавки, выбранной из группы, состоящей из чистого оксима или HOBt; основания, выбранного из DIPEA, NMM или ТМР, и неорганической соли, выбранной из группы, состоящей из хлорида магния, хлорида цинка или хлорида меди.

Еще одно воплощение настоящего изобретения включает способ синтеза для получения лираглутида, включающий следующие стадии:

i) Связывание Na-Fmoc-защищенного глицина (Fmoc-Gly-OH) с твердофазной подложкой на основе смолы в присутствии связующего агента.

ii) Последовательное связывание Nα-защищенных аминокислот и аминокислот с защищенными боковыми цепями с получением остова лираглутида в присутствии связующего агента и неорганической соли.

iii) Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты с использованием пиперидина в DMF или смеси Пиперидин/DBU/DMF.

iv) После каждой стадии снятия Fmoc-защиты стадия промывки с использованием HOBt в DMF.

v) Снятие защитной группы боковой цепи лизина.

vi) Связывание боковой цепи пальмитоил-глутаминовой кислоты (Pal-Glu) с боковой цепью лизина в присутствии связующего агента и неорганической соли.

vii) Неочищенный лираглутид получают посредством удаления защитных групп и отщепления пептида от смолы. Очистка неочищенного лираглутида.

Дополнительно в качестве улучшений к указанным выше воплощениям аминокислоты под номером 9-13 [то есть Fmoc-Glu(OtBu)⁹, Fmoc-Gly¹⁰, Fmoc-Thr(tBu)¹¹, Fmoc-Phe¹², Fmoc-Thr(tBu)¹³] связывают при повышенной температуре примерно 30-45°С с образованием остова лираглутида.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к эффективному способу получения лираглутида посредством последовательного связывания с использованием твердофазного подхода. Он включает последовательное связывание защищенных аминокислот с получением остова лираглутида, и при завершении линейной последовательности синтез продолжали с боковой цепи лизина посредством добавления γ-глутаминовой кислоты и пальмитиновой кислоты с последующим удалением защитных групп, отщеплением пептида с твердой подложки и очисткой полученного неочищенного лираглутида. Настоящее изобретение также включает применение неорганических солей во время связывания, промывку HOBt в растворе DMF после стадии снятия Fmoc-защиты для подавления агрегации пептидов и обеспечения того, чтобы реакции протекали с завершением, и таким образом избегания делеции последовательностей и улучшения выхода способа.

Сокращения:

ACN: Ацетонитрил

Boc: трет-Бутилоксикарбонил

COMU: 1-Циано-2-этокси-2-оксоэтилиденаминоокси)диметиламино-морфолино-карбения гексафторфосфат

CuCl₂: хлорид меди

DBU: 1,8-Диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен

DEPBT: 3-(Диэтоксифосфорилокси)-1,2,3-бензотриазин-4(3H)-он

DIC: N,N'-диизопропилкарбодиимид

DMAP: Диметиламинопиридин

DMF: N,N'-Диметилформамид

DIPEA: Диизопропилэтиламин

Fmoc: 9-флуоренилметоксикарбонил

HBTU: O-Бензотриазол-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат

HOBt: N-Гидроксибензотриазол

HFIP: 1,1,1,3,3,3-Гексафтор-2-пропанол

Mtt: Метилтритил

МеОН: Метанол

MgCl₂: Хлорид магния

NMM: N-метилморфолин

NMP: N-Метил-2-пирролидон

TES: Триэтилсилан

TFE: Трифторэтанол

TFA: Трифторуксусная кислота

Pbf: 2,2,4,6,7-Пентаметилдигидробензофуран

Pd(PPh₃)₄: Тетракис(трифенилфосфин)палладий (0)

КТ: Комнатная температура

^tBu: трет-Бутил

TIS: Триизопропилсилан

Trt: Тритил

ТМР: 2,4,6-Триметилпиридин

ZnCl₂: Хлорид цинка

Изобретение представлено следующими примерами. Данные примеры предназначены только для иллюстрации и, следовательно, их не следует истолковывать как ограничение объема изобретения.

Пример 1: Синтез лираглутида с использованием MgCl₂

Смолу Ванга (0,3-0,6 ммоль/г, емкость загрузки) загружали в сосуд для синтеза пептида, дважды промывали 10 об. MDC, декантировали промывные воды, добавляли 10 об. MDC и выдерживали для набухания в течение 1 ч. Fmoc-Gly-OH (3,0-5,0 экв.) растворяли в MDC, добавляли минимальное количество DMF для получения прозрачного раствора и смесь переносили в реакционный сосуд. Добавляли DIPC (3,0-6,0 экв.) с последующим добавлением в реакционный сосуд DMAP (0,01-0,1 экв.) и перемешивали в течение 1,0-3,0 ч, при кт. Реакционную массу сушили и смолу, загруженную аминокислотами, дважды промывали MDC с последующей промывкой DMF. Кэппирование непрореагировавших функциональных сайтов проводили с использованием уксусного ангидрида и DIPEA.

Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Arg(Pbf)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв.), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного Тестом Кайзера, избыточное количество реагентов высушивали и промывали пептидил-смолу 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF.

Осуществляли связывание Fmoc-Gly-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв.) и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Arg(Pbf)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв.), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

v) Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Val-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Leu-OH (2,0-4,0 экв.), используя связующие агенты, такие как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистый оксим, HOBt, предпочтительно чистый оксим (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв.), и смесь DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Trp(Boc)-OH (2,0-4,0 экв.) используя связующие агенты, такие как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистый оксим, HOBt, предпочтительно чистый оксим (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смесь DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Ala-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загружаемой аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Ile-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Phe-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

xi) Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Glu(O^tBu)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Lys(Mtt)-OH (2,0-4,0 экв.), используя связующие агенты, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистый оксим, HOBt, предпочтительно чистый оксим (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смесь DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Ala-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загружаемой аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Ala-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Gln(Trt)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Gly-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загружаемой аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Glu(O^tBu)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т.При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Leu-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Tyr(^tBu)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Ser(^tBu)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Ser(^tBu)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т.При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Val-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Asp(O^tBu)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Ser(^tBu)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загружаемой аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Thr(^tBu)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и при повышенной температуре примерно 30-45°С. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Phe-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и при повышенной температуре примерно 30-45°С. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Thr(^tBu)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя.

Реакцию проводили в атмосфере азота и при повышенной температуре примерно 30-45°С. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Gly-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и при повышенной температуре примерно 30-45°С. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Glu(O^tBu)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и при повышенной температуре примерно 30-45°С. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Ala-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загружаемой аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Boc-His(Trt)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Разветвление пептида проводили посредством удаления защитной группы Mtt боковой цепи Lys²⁶ посредством обработки 0,5-2,0% TFA в MDC, 15-20 циклов х 10 об. Пептидил-смолу промывали MDC 2 х 10 об., 2 х 10 об., 2 x 10 об. DMF, и 5-10,0% DIPEA в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Glu-O^tBu (2,0-5,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-5,0 экв.) и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-5,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-10,0 экв.) и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т.При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание гексадекановой кислоты (2,0-5,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DIC (2,0-5,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и MDC в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Загруженную пептидил-смолу промывали DMF 2 х 10 об., MDC 2 х 10 об., МеОН 2 х 10 об. и МТВЕ (метил-трет-бутиловый эфир) 3 х 10 об. Общее отщепление пептида проводили с использованием коктейльной смеси TFA, фенола, TIS, H₂O, тиоанизола. Коктейль пептид-TFA концентрировали и добавляли к охлажденному МТВЕ 5-15 об. Осажденное соединение выделяли посредством центрифугирования и/или фильтрования и сушили в VTD и направляли на очистку (выход способа 18,25%, чистота 51,3%).

Пример 2: Синтез лираглутида с использованием CuCl₂

Способ является таким же, как описано в примере 1, и единственным изменением является то, что в качестве катализатора во время последовательного связывания всех отдельных аминокислот вместо MgCl₂ используют CuCl₂ (выход способа 17,84%, чистота 51,16%).

Пример 3: Синтез лираглутида с использованием коктейля HFIP-TES-TFE для снятия защитной группы Mtt

Способ является таким же, как описано в примере 1, и единственное изменение заключается в удалении Lys(Mtt)²⁶, при котором использовали 5,0-40,0% HFIP, TES 2,0-10,0%, TFE 5,0-10% в MDC 10-30 об., и смесь перемешивали в течение 2-6 ч (фактический выход способа 21,23%, чистота 51,7%).

Пример 4: Синтез лираглутида

Способ является таким же, как описано в примере 1, и единственное изменение заключается в том, что во время связывания не используют неорганические соли (выход способа 6,79%, чистота 34,4%).

Пример 5: Синтез лираглутида без использования неорганической соли

Способ является таким же, как описано в примере 1, и единственное изменение заключается в том, что неорганические соли не используют во время связывания и промывки IPA (изопропиловый спирт), проводимой вместо 0,1 М HOBt в DMF (выход способа 8,62%, чистота 39,1%).

Пример 6: Синтез лираглутида с использованием связывания боковой цепи Pal-Glu-OtBu

Разветвление пептида проводили посредством удаления защитной группы Mtt боковой цепи Lys²⁶ посредством обработки 0,5-2,0% TFA в MDC, 15-20 циклов х 10 об. Пептидил-смолу промывали MDC 2 х 10 об., 2 х 10 об., 2 х 10 об. DMF, и 5-10,0% DIPEA в DMF. Осуществляли связывание боковой цепи Pal-Glu-OtBu (2,0-5,0 экв., представлено на Фиг. II) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-5,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-5,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-10,0 экв.), и MgCl₂, ZnCl₂, предпочтительно MgCl₂ (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.

Пример 7: Синтез лираглутида

Способ является таким же, как описано в примере 1, и удаление Mtt проводили, как описано в примере 3. Дополнительную промывку 0,01-0,1 М HOBt/DMF проводили после каждой стадии снятия Fmoc-защиты для обеспечения полного удаления пиперидина, а также избегания агрегации линейного пептида во время синтеза (фактический выход способа 27,0%, чистота выше 60,0%).

Пример 8: Очистка лираглутида

Неочищенный лираглутид растворяли в разбавленном растворе карбоната аммония, содержащем 5-40% ACN в концентрации 5-75 мг/мл и загружали на предварительно уравновешенную колонку 100-10-С8 (10 мм × 250 мм). За этим следовало 0,2 CV (объем колонки) разбавителя. Связанный лираглутид элюировали с использованием ступенчатого градиента подвижной фазы (А: 0,1% TFA в воде; Б: 0,1% TFA в ACN: IPA). Фракции, имеющие чистоту выше 92%, концентрировали под вакуумом с последующим осаждением в изоэлектрической точке. Осадок выделяли посредством центрифугирования. Выделенный осадок еще раз подвергали действию другой стадии ОФ-ВЭЖХ (обращенно-фазовая высоко-эффективная жидкостная хроматография) на колонке 100-10-С8 (10 мм × 250 мм). Связанный лираглутид элюировали с использованием градиентного элюирования подвижной фазы, а именно состоящей из следующих компонентов: А: разбавленный ацетат аммония; В: ACN. Фракции больше 98,5% объединяли, концентрировали под вакуумом, осаждали в изоэлектрической точке и, наконец, лиофилизировали.

Пример 9: Очистка лираглутида

Неочищенный лираглутид растворяли в разбавленном растворе аммония в концентрации 10-75 мг/мл и подвергали стадии ОФ-ВЭЖХ-1 на колонке 100-10-С8 (10 мм × 250 мм). За этим следовало 0,2 CV разбавителя. Связанный лираглутид элюировали с использованием ступенчатого градиента подвижной фазы (А: 0,1% TFA в воде; Б: 0,1% TFA в ACN: IPA). Фракции, имеющие чистоту выше 90%, концентрировали под вакуумом с последующим осаждением в изоэлектрической точке. Осадок выделяли посредством центрифугирования. Выделенный осадок еще раз подвергали стадии ОФ-ВЭЖХ-2 на колонке 100-10-С8 (10 мм × 250 мм). Связанный лираглутид элюировали с использованием градиентного элюирования подвижной фазы, а именно состоящей из: A: TFA в воде; В: TFA в метаноле. Данная стадия помогала уменьшить специфическую примесь. Фракции выше 93% объединяли, разбавляли ацетатом аммония и загружали на стадии ОФ-ВЭЖХ-3 на колонку 100-10-С8 (10 мм × 250 мм). Связанный лираглутид элюировали с использованием градиентного элюирования подвижной фазы, а именно состоящей из следующих компонентов: А: ацетат аммония; В: ACN. Фракции больше 98,5% объединяли, концентрировали под вакуумом, осаждали при изоэлектрической точке и, наконец, лиофилизировали.

1. Способ получения лираглутида, включающий следующие стадии:

а) загрузки С-концевого глицина на твердофазную подложку на основе смолы в присутствии связующего агента;

b) кэппирования непрореагировавших функциональных сайтов;

c) последовательного связывания N^α-защищенных аминокислот и аминокислот с защищенными боковыми цепями с получением остова лираглутида в присутствии связующего агента и неорганической соли;

d) снятия защитной группы боковой цепи лизина;

e) связывания глутаминовой кислоты и пальмитиновой кислоты с боковой цепью лизина в присутствии связующего агента и неорганической соли; и

f) получения неочищенного лираглутида посредством удаления защитных групп и отщепления пептида от смолы;

где способ включает связывание аминокислот 9-13 при повышенной температуре в диапазоне от 30 до 45°C,

где указанная неорганическая соль присутствует в качестве катализатора и выбрана из группы, состоящей из хлорида магния, хлорида цинка и хлорида меди,

где стадия (с) включает снятие Fmoc-защиты каждой загруженной аминокислоты с использованием пиперидина в DMF (N,N'-диметилформамид) или смеси пиперидин/DBU (1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен)/DMF, где после каждой стадии снятия Fmoc-защиты осуществляют стадию промывки с использованием HOBt (N-гидроксибензотриазол) в DMF и снятие метилтритильной защитной группы лизина.

2. Способ получения лираглутида, включающий следующие стадии:

а) связывания N^α-Fmoc-защищенного глицина (Fmoc-Gly-OH) с твердофазной подложкой на основе смолы в присутствии связующего агента;

b) последовательного связывания N^α-защищенных аминокислот и аминокислот с защищенными боковыми цепями с получением остова лираглутида в присутствии связующего агента и неорганической соли;

c) снятия защитной группы боковой цепи лизина;

d) связывания боковой цепи пальмитоил-глутаминовой кислоты (Pal-Glu- O^tBu) с боковой цепью лизина в присутствии связующего агента и неорганической соли; и

e) получения неочищенного лираглутида посредством удаления защитных групп и отщепления пептида от смолы;

где способ включает связывание аминокислот 9-13 при повышенной температуре в диапазоне от 30 до 45°C,

где указанная неорганическая соль присутствует в качестве катализатора и выбрана из группы, состоящей из хлорида магния, хлорида цинка и хлорида меди,

где стадия (с) включает снятие Fmoc-защиты каждой загруженной аминокислоты с использованием пиперидина в DMF или смеси пиперидин/DBU/DMF, где после каждой стадии снятия Fmoc-защиты осуществляют стадию промывки с использованием HOBt в DMF и снятие метилтритильной защитной группы лизина.

3. Способ по п. 1, включающий связующие агенты, выбранные из HBTU (O-бензотриазол-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат), COMU (1-циано-2-этокси-2-оксоэтилиденаминоокси)диметиламино-морфолино-карбения гексафторфосфат), DEPBT (3-(диэтоксифосфорилокси) 1,2,3-бензотриазин-4(3H)-он), DIC (1,3-диизопропилкарбодиимид) или любой их комбинации.

4. Способ по п. 1, включающий связующие добавки, выбранные из группы, состоящей из чистого оксима, HOBt или их любой комбинации.

5. Способ по п. 1, где связывание Boc-гистидина включает использование смеси связующих агентов, выбранных из группы, состоящей из HBTU-чистый оксим, COMU-чистый оксим, DEPBT-чистый оксим или DIC-чистый оксим.

6. Способ по п. 5, включающий связывание Boc-гистидина с использованием DEPBT-чистый оксим.

7. Способ по п. 1, включающий снятие метилтритильной защитной группы лизина с использованием HFIP (1,1,1,3,3,3-Гексафтор-2-пропанол)/TES (Триэтилсилан)/TFE (Трифторэтанол)/MDC (дихлорметан).

8. Способ по п. 1, дополнительно включающий очистку неочищенного лираглутида.

9. Способ по п. 1, где кэппирование непрореагировавших функциональных сайтов проводят с использованием уксусного ангидрида и органического основания, а связывание глутаминовой кислоты и пальмитиновой кислоты с боковой цепью лизина проводят последовательно.

10. Способ по п. 2, дополнительно включающий очистку неочищенного лираглутида.

11. Способ по п. 2, где снятие защитной группы боковой цепи лизина включает снятие метилтритильной защитной группы боковой цепи лизина с использованием TFA (трифторуксусная кислота) в дихлорметане, а последовательное связывание боковой цепи пальмитоил-глутаминовой кислоты (Pal-Glu- O^tBu) с боковой цепью лизина со снятой защитой проводят в присутствии связующего агента, выбранного из HBTU, COMU, DEPBT, DIC и добавок, выбранных из чистого оксима и HOBt, или комбинации связующих агентов/добавок, и неорганической соли.

12. Способ по п. 2, где снятие метилтритильной защитной группы лизина включает использование HFIP/TES/TFE/MDC, и/или где связывание защищенных глутаминовой кислоты и пальмитиновой кислоты осуществляют последовательно с боковой цепью лизина в присутствии связующего агента и неорганической соли.