Кисломолочные бактерии, способы и их применения
Владельцы патента RU 2767340:
БИОГАЙА АБ (SE)
Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ селекции штаммов кисломолочных бактерий, его применение для ингибирования роста патогенных бактерий у индивида, биологически чистая культура Lactobacillus reuteri DSM-27131, замороженная или лиофилизированная композиция, содержащая чистую культуру Lactobacillus reuteri DSM-27131, биологически чистая культура Lactobacillus reuteri DSM 32465, замороженная или лиофилизированная композиция, содержащая чистую культуру Lactobacillus reuteri DSM 32465 и применение утилизирующих этаноламин бактерий Lactobacillus reuteri для лечения заболевания или расстройства, вызванного или связанного с утилизирующим этаноламином патогеном. Способ селекции штаммов кисломолочных бактерий включает обеспечение бактерий штамма бактерий в культуральной среде для выращивания указанных бактерий, определение способности бактерий утилизировать этаноламин и их селекцию. Группа изобретений позволяет утилизировать этаноламин и может быть использована для лечения заболевания или расстройства, вызванного или связанного с утилизирующим этаноламином патогеном. 7 н. и 13 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 4 пр.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к кисломолочным бактериям, и в частности кисломолочным бактериям с благоприятными эффектами на расстройства или заболевания у людей и животных, и к применению указанных кисломолочных бактерий в качестве пробиотиков. Более конкретно, настоящее изобретение относится к активации определенных биологических активностей кисломолочных бактерий, которые являются полезными для здоровья людей после введения кисломолочных бактерий указанным людям.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Точно установлено, что взаимодействие между хозяином и микробом имеют основополагающее значение для здоровья и болезни. Микробиота генерирует метаболиты, которые обеспечивают хозяина питательными веществами и дополнительно вовлечены в иммунный ответ, и регуляцию и развитие иммунной системы. Тканевое микроокружение определяет состав микробиоты, что, в свою очередь, значит то, что один из способов влияния и изменения состава микробиоты может заключаться в изменении рациона (такого как сахар, жир или волокна, которые функционируют как источники энергии бактерий). Изменение иммунитета хозяина, или как результат генетической изменчивости или сопутствующей инфекции и последующего применения антибиотиков, может также влиять на микробиоту в кишечнике.
Lactobacillus и другие бактерии, продуцирующие молочную кислоту, такие как бифидобактерии, обычно применяют в качестве пробиотиков в различных видах пищи, например, йогурте. Рост и образование колоний вредных микроорганизмов можно предотвратить бактериями, продуцирующими молочную кислоту, за счет образования ими колоний на или внутри млекопитающего, посредством образования биопленок, посредством конкуренции за доступные питательные вещества и также продуцирования специфических веществ, таких как пероксиды водорода, бактериоцины или органические кислоты (включая молочную кислоту и уксусную кислоту), которые снижают pH.
Lactobacillus reuteri представляет собой бактерию, о которой известно, что она продуцирует противомикробное вещество 3-гидроксипропиональдегид (HPA), также называемый реутерином.
Клетки прокариот рассматриваются как примитивные, хотя некоторые из них содержат необычные включения, известные как микрокомпартменты (MCS), которые, по-видимому, служат в качестве примитивных органелл внутри бактериальных клеток. Карбоксисома (которая участвует в фиксации диоксида углерода) представляет собой в течение приблизительно 30 лет единственный микрокомпартмент, распознанный в клетках микробов. В 2005, профессор Todd O. Yeates и его коллеги обнаружили первые структурные детали бактериальных микрокомпартментов. Первые структуры высокого разрешения белков бактериальных микрокомпартментов раскрыли принципы конструкции, весьма схожие с принципами у некоторых вирусов. Шесть идентичных белковых субъединиц объединяются, образуя гексамерное звено, которое составляет строительный элемент оболочки. Данные гексамерные звенья упакованы плотно вместе, образуя молекулярный слой, который содержит только маленькие поры. Данная плотная упаковка, по-видимому, ограничивает перемещение молекул в и из микрокомпартмента, кроме как через поры.
Кластерный анализ гомологий микробных белков, специфических для микрокомпартментов, предполагает, что данные включения могут участвовать в порядке семи различных метаболических процессах в различных бактериальных видах (Thomas A. Bobik. 2007. Bacterial Microcompartments. Microbe. 1:25-31). Строительные элементы бактериальных микрокомпартментов представляют собой исключительно белки и гликопротеины. Электронная микроскопия (необходимая для наблюдения микрокомпартментов) показала отсутствие липидного монослоя или бислоя (как в везикулах эукариот), окружающих данные микрокомпартменты, делая их единственным известным белковым метаболическим компартментом в живых клетках.
Члены бактериального вида, включающего Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Clostridium, Fusobacterium, Shigella, Listeria и Yersinia, содержат компартменты, необходимые для разрушения этаноламина в их микрокомпартментах. Полагают, что другим свойством микрокомпартментов заключаются в их способности действовать в качестве контейнеров для субстратов, токсичных для самих бактерий.
Этаноламин представляет собой продукт деградации мембранного фосфолипида форсфатидилэтаноламина (PE) и преобладает в желудочно-кишечном тракте. Этаноламин может применяться как источник азота (и иногда углерода) бактериями, способными катаболизировать данное соединение. Данная способность связана с важными патогенами желудочно-кишечного тракта, включая, например, энтерогеморрагическую Escherichia coli O157:H7 (EHEC) Этаноламин может также быть сигналом для бактерий для инициации ее вирулентной программы. (Garsin DA. 2012. Ethanolamine: a signal to commence a host-associated lifestyle? mBio 3(4):e00172-12. doi:10.1128/mBio.00172-12.)
Рост резистентности к противомикробным препаратам и сокращение числа открытий новых антибиотиков увеличивает риск глобального кризиса в области здравоохранения, связанного с инфекционными заболеваниями. Национальный план борьбы с бактериями, устойчивыми к антибиотикам (Bacteria TFfCA-R (ed). 2015. National Action Plan for Combating Antibiotic-Resistant Bacteria. The White House, Washington, D.C.) подчеркивает, что необходимы усилия для проведения разработки новых антибиотиков и альтернативных способов лечения для борьбы с резистентностью и заболеваниями, связанными с применением противомикробных препаратов. Как результат, в настоящее время изучается ряд новых способов лечения, включая, но не ограничиваясь, пробиотики, иммунотерапию и агенты, связывающие токсины.
Непростой задачей является поиск новой антибиотикотерапии, поскольку большинство патогенных бактерий развили хитроумные способы оставаться стойкими и для того, чтобы перехитрить микроокружение хозяина в различных ситуациях. Например, патогенные бактерии Salmonella typhimurium показывают уникальное преимущество роста по сравнению с другими бактериями, так как они могут использовать этаноламин, который представляет собой вещество, которое высвобождается клетками тканей хозяина в воспаленный кишечник. Однако вплоть до настоящего времени не предполагают или, по меньшей мере, не показано, что этаноламин может применяться полезными бактериями. Смотри, например, (Thiennimitr P, et.al Intestinal inflammation allows Salmonella to use ethanolamine to compete with the microbiota, Proc Natl Acad Sci USA 2011).
Следовательно, все еще существует необходимость в данной области техники в обнаружении новых путей борьбы с патогенными бактериями, и в частности необходимость в разработке новых терапий, которые не способствуют дальнейшему развитию резистентности к антибиотикам в обществе.
СУЩНОСТЬ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Цели выше в настоящий момент решены или, по меньшей мере, смягчены обеспечением в настоящем изобретении новыми штаммами кисломолочных бактерий, способными утилизировать этаноламин, способами селекции дополнительных утилизирующих этаноламин кисломолочных бактерий, способами получения утилизирующих этаноламин кисломолочных бактерий, стимулированных для утилизации этаноламина, а также различными составами и применениями, включающими указанные утилизирующие этаноламин кисломолочные бактерии.
Соответственно, настоящее изобретение заключается в неожиданном обнаружении того, что некоторые кисломолочные бактерии способны утилизировать этаноламин в качестве субстрата. Не желая быть связанными теорией, данное обнаружение, по-видимому, обеспечивает данные бактерии способами конкуренции с патогенными бактериями, применяющими тот же субстрат. Следовательно, когда данные патогенные бактерии присутствуют в желудочно-кишечном тракте зараженного индивида, где вещество имеется в наличие, введение полезных утилизирующих этаноламин бактерий может сделать возможным для данных бактерий ухудшение выживаемости патогенных бактерий и также снизить их вирулентный эффект. Также предусматривается, что другие механизмы, уже применяемые утилизирующими этаноламин бактериями, могут взаимодейстсовать с механизмом с утилизацией этаноламина и, посредством этого, обеспечивать улучшенный противомикробный эффект, как представлено в настоящем изобретении. Соответственно, это предоставляет пригодную противомикробную альтернативу, направленную на утилизирующие этаноламин патогенные бактерии, находящиеся в желудочно-кишечном тракте индивида. Затем, также предполагается, что данное обнаружение обладает потенциалом снижать избыточное применение антибиотиков в ответ на патогенные инфекции. Кроме того, ацетальдегид, продуцируемый кисломолочными бактериями при применении этаноламина, может обладать своим собственным противомикробным эффектом.
Следовательно, настоящее изобретение относится к способу селекции штамма кисломолочных бактерий, способного утилизировать этаноламин, причем способ включает стадии:
i) обеспечения бактерий штамма кисломолочных бактерий в культуральной среде и выращивания культуры указанных бактерий,
ii) определения, способны ли указанные бактерии утилизировать этаноламин; и
iii) селекции указанного штамма кисломолочных бактерий, если указанные бактерии способны утилизировать этаноламин,
где указанная культуральная среда содержит количество или концентрацию этаноламина, и/или некоторое количество или концентрацию этаноламина добавляют к культуре стадии i) в момент времени перед стадией ii).
В другом аспекте, также обеспечивают способ селекции штамма кисломолочных бактерий, способного утилизировать этаноламин, включающий определение генетического профиля указанных кисломолочных бактерий, причем способ включает стадии:
i) обеспечения бактерий штамма кисломолочных бактерий, который будут скринировать;
ii) проведения первоначального скрининга указанного штамма кисломолочных бактерий, определяя наличие одной или более бактериальных гомологий генов, кодирующих следующие белки;
1. Большая субъединица этаноламин-аммоний-лиазы EutB;
2. Структурный белок EutL микрокомпартмента; и/или
3. Белок, утилизирующий этаноламин EutH; в указанном штамме кисломолочных бактерий,
iii) если один или более из указанных генов присутствуют в указанном штамме кисломолочных бактерий, определения, способны ли указанные бактерии утилизировать этаноламин; и
iv) селекции указанного штамма кисломолочных бактерий, если указанные бактерии способны утилизировать этаноламин.
Необязательно, можно проводить второй или дополнительный скрининг, т.е. генетический скрининг, указанного штамма кисломолочных бактерий, как часть стадии ii), перед или после стадии ii) и перед стадией iii), или подобными, приведенного выше способа, определяя наличие одной или более бактериальных гомологий генов, кодирующих следующие белки:
1. NADPH-зависимая FMN редуктаза, принадлежащая к pfam03358 белковому семейству и/или
2. Протеин-тирозин-фосфатаза, принадлежащая к pfam13350 белковому семейству.
Указанные гены указанного второго скрининга могут присутствовать в том же генном кластере или даже в том же опероне, как приведенные выше гены, скринированные в первоначальном скрининге. Предпочтительно, указанные гены присутствуют в том же генном кластере или даже в том же опероне.
Более того, также обеспечивают способ продуцирования кисломолочных бактерий, стимулированных для утилизации этаноламина, причем способ включает стадии:
i) обеспечения кисломолочных бактерий, способных утилизировать этаноламин в культуральной среде,
ii) добавления к культуральной среде стадии i) первого количества или концентрации этаноламина в первый момент времени и выращивания указанной культуры,
iii) необязательно добавления к культуре стадии ii) второго количества или концентрации этаноламина во второй момент времени и выращивания указанной культуры, и затем;
iv) извлечения кисломолочных бактерий из указанной культуральной среды.
Кисломолочные бактерии, отобранные или полученные способом, описанным в настоящем изобретении, также включены в настоящее описание, а также их различные применения. В другом аспекте, также обеспечивают композицию, содержащую утилизирующие этаноламин кисломолочные бактерии, стимулированные этаноламином в процессе роста культуры, содержащей указанные кисломолочные бактерии.
Как приведено ранее, также обеспечивают новые штаммы Lactobacillus reuteri: биологически чистой культуры Lactobacillus reuteri DSM 27131 и
биологически чистой культуры Lactobacillus reuteri DSM 32465. Данные штаммы выбраны в качестве штаммов кисломолочных бактерий, которые способны утилизировать этаноламин. Данные штаммы можно также применять в способе получения кисломолочных бактерий, стимулированных для утилизации этаноламина, и для различных других применений и способов, включающих утилизирующих этаноламин бактерий, описанных в настоящем изобретении. Также обеспечивают замороженные или лиофилизированные композиции утилизирующих этаноламин кисломолочных бактерий, таких как Lactobacillus reuteri, например, замороженную или лиофилизированную композицию, содержащую биологически чистую культуру Lactobacillus reuteri DSM 27131 и/или биологически чистую культуру Lactobacillus reuteri DSM 32465, причем указанная композиция дополнительно содержит, по меньшей мере, криопротектор или лиопротектор. Различные криопротекторы (например, глицерин, сахароза, лактоза или трегалоза) или лиопротекторы (например, сахароза, лактоза, трегалоза или мальтодекстрин), как известно в данной области техники, или другие добавки, также предусмотрены в настоящем контексте.
Кроме того, обеспечивают новые штаммы, кисломолочные бактерии, отобранные или полученные способами, описанными в настоящем изобретении, или как описано в настоящем изобретении в другом месте, для применения в качестве лекарственных средств, такого как для применения в лечении заболевания или расстройства, вызванного или связанного с утилизирующим этаноламин патогеном. Примеры данных патогенов дополнительно описаны в настоящем изобретении. Также обеспечивают применение указанных кисломолочных бактерий или штаммов в ингибировании роста одной или более патогенных бактерий. Более конкретно, данные композиции предназначены для введения людям или животным, например, с целью более эффективного лечения расстройств, вызванных патогенами в желудочно-кишечном тракте.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1 показывает продуцирование ацетальдегида утилизирующими этаноламин кисломолочными бактериями. Продуцирование ацетальдегида проявляется в виде (красной) жирной линии, сопровождаемой расширенными (красными) зонами, окружающими указанную жирную линию. Жирная линия также включает бактериальную штриховую культуру; A) жирную линию или красные (то есть расширенные) зоны не наблюдали вокруг бактериальной штриховой культуры L. reuteri DSM 17938. B) Красные (то есть расширенные) зоны, простирающиеся приблизительно на 3 мм на каждой стороне бактериальной штриховой культуры, образующей часть жирной линии, наблюдали вокруг колоний L. reuteri DSM 27131 и также красные (увеличенные) зоны вокруг стрика L. reuteri DSM 32465 (C, простирающиеся приблизительно на 1,5 мм с каждой стороны бактериальной штриховой культуры, причем указанная бактериальная штриховая культура образует часть жирной линии).
Фигура 2 показывает анализ на желчеустойчивость и снижение жизнеспособности штамма дикого типа L. reuteri DSM 27131 (серые/полосатые столбики) и улучшенного штамма L. reuteri DSM 32465 (черные столбики).
Фигура 3. Ex vivo анализ подтверждает усиленное ингибирование C. difficile L. reuteri DSM 27131, предварительно инкубированных с 10 мМ этаноламином. Ex vivo рост C. difficile CD2015 измеряли в содержимом фекалий стерильных мышей. Результаты для жизнеспособных колониеобразующих единиц C. difficile и C. difficile вместе с L. reuteri DSM 27131 после инкубирования в течение 24 часов. Данные представляют собой среднее±стандартное отклонение.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения
В настоящем изобретении, термин «лечение» может включать и облегчение симптомов, а также предотвращение симптомов. Соответственно, данный термин включает предотвращение, ослабление и профилактику заболевания или расстройства, или подобных. Термин «расстройство» может также включать заболевание.
Когда бы ни применяли термин «бактерии» в настоящем изобретении, предполагается, что он включает штаммы кисломолочных бактерий (если не предполагается патоген), но он не ограничен любым конкретным штаммом.
Предполагается, что термин «утилизирующие» этаноламин относится к кисломолочным бактериям, которые способны утилизировать и метаболизировать этаноламин до последующих активных метаболитов, согласно способу, известному в данной области техники. Термин «утилизирующие» этаноламин может в некотором контексте также относится к тому, что кисломолочные бактерии способны утилизировать и метаболизировать этаноламин до последующих активных и секретируемых метаболитов, согласно способу, известному в данной области техники.
Штаммы кисломолочных бактерий
Штамм Lactobacillus reuteri DSM 27131 хранится в соответствии с будапештским договором в Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) на 18 апреля 2013.
Lactobacillus reuteri strain DSM 32465 хранится в соответствии с будапештским договором в Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig) на 21 марта 2017.
Введение в подробное описание
Как приведено ранее в настоящем изобретении, изобретатели настоящего изобретения впервые обнаружили новые непатогенные штаммы кисломолочных бактерий, которые способны утилизировать этаноламин. Этаноламин представляет собой продукт деградации мембранного фосфолипида фосфатидилэтаноламина (PE) и преобладает в желудочно-кишечном тракте. Этаноламин можно применяться в качестве источника азота и иногда углерода, бактериями, способными катаболизировать данное соединение. Однако вплоть до настоящего времени считалось, что только патогенные бактерии, такие как энтерогеморрагические Escherichia coli O157:H7 (EHEC), способны утилизировать этаноламин. Данную утилизацию непатогенными бактериями можно, например, детектировать в колониях в чашках с агаром обнаружением получающегося в результате ацетальдегида из этаноламин.
Данные результаты сделают также возможным обнаружение и селекцию дополнительных кисломолочных бактерий, на основе обнаружения наличия утилизирующих этаноламин свойств указанных бактерий. Соответственно, способы селекции утилизирующих этаноламин кисломолочных бактерий, способы продуцирования утилизирующих этаноламин кисломолочных бактерий, вызванного этаноламином, а также другие применения, композиции и способы, включающие указанные новые штаммы и бактерии, также являются результатом данного обнаружения и, следовательно, обеспечены в настоящем изобретении. Данные аспекты дополнительно описаны ниже.
Способ селекции
Соответственно, более подробно, настоящее изобретение относится к способу селекции штамма кисломолочных бактерий, способного утилизировать этаноламин, причем способ включает стадии:
i) обеспечения бактерий штамма кисломолочных бактерий в культуральной среде и выращивания культуры указанных бактерий,
ii) определения, способны ли указанные бактерии утилизировать этаноламин; и
iii) селекции указанного штамма кисломолочных бактерий, если указанные бактерии способны утилизировать этаноламин,
где указанная культуральная среда содержит количество или концентрацию этаноламина, и/или некоторое количество или концентрацию этаноламина добавляют к культуре стадии i) в момент времени перед стадией ii).
Культуральная среда содержит питательные вещества и другие ингредиенты, поддерживающие рост бактериальных клеток, и является хорошо известной специалистам в данной области техники. Примеры культуральной среды в настоящем контексте включают, например, агар (чашки с агаром), но также предполагается жидкая культуральная среда. Культуру можно также называть бактериальной культурой и/или среду бактериальной культуральной средой.
Выращивание указанных кисломолочных бактерий в среде, содержащей этаноламин, можно осуществлять в анаэробных условиях, и при температуре от приблизительно 35°C до приблизительно 45°C, такой как при приблизительно 37°C. Обычно, бактерии выращивают в течение от приблизительно 14 до приблизительно 72 часов, такое как в течение от приблизительно 20 до приблизительно 60 часов, от приблизительно 14 до приблизительно 16 часов или в течение приблизительно 48 часов. Дополнительно предусмотрены аналогичные условия, например, микроаэробные условия с меньшим количеством кислорода, чем в воздухе (например, приблизительно 5% кислорода).
Этаноламин можно добавлять непосредственно к культуральной среде вместе с кисломолочными бактериями, например, когда чашку с агаром применяют в способе определения, способен ли штамм кисломолочных бактерий утилизировать этаноламин, но его можно также добавлять после, например, добавлять в более поздние моменты времени, к имеющейся культуре после того, как культуру выдерживали в течение некоторого времени. Данный более поздний момент времени может быть, например, когда культура достигла определенной концентрации или плотности, такой как приблизительно 0,3-2 единиц, измеренной как оптическая плотность при 600 нм (OD600).
Ссылку на «количество или концентрацию», например, этаноламина в настоящем изобретении, например, применяют для иллюстрации того, что способ можно проводить в небольшом или большом масштабе, и также что подходящие количества и концентрации этаноламина можно применять и предусмотрены в способах настоящего описания. Обычно, этаноламин будут описывать как добавляемый в определенной концентрации к культуральной среде, содержащей штамм кисломолочных бактерий, где концентрация затем представляет собой суммарную концентрацию этаноламина в указанной среде, к которой добавляют этаноламин, но, конечно, это также подразумевает то, что количество этаноламина добавляют к указанной культуральной среде, получая в результате указанную концентрацию. Специалист в данной области техники знает, какое количество или концентрация этаноламина будет требоваться для стимулирования и/или активации бактериальной культуры.
Способ может дополнительно включать добавление к культуре стадии i) дополнительного количества или концентрации этаноламина во второй момент времени после добавления первого количества этаноламина, и выращивания указанной культуры перед проведением стадий ii) и iii) указанного способа. Дополнительное количество или концентрацию этаноламина, как описано ранее в настоящем изобретении, можно добавлять к культуре кисломолочных бактерий, дополнительно способствуя запуску утилизации этаноламина указанными бактериями и/или дополнительно содействуя продуцированию ацетальдегида указанными бактериями. Если применяют агаровую среду, бактерии обычно уже выдерживали в присутствии этаноламина в течение определенного периода времени. Если это так, любое второе количество или концентрацию этаноламина можно добавлять в качестве верхнего слоя на указанную чашку с агаром, содержащую бактерии.
Иллюстрации способа представлены в экспериментальной части.
Способ селекции, обеспечиваемый в настоящем изобретении, может также включать дополнительную стадию, где стадию можно проводить перед воздействием на кисломолочные бактерии этаноламином. Она представляет собой стадию, которая включает определение определенного генетического профиля указанных кисломолочных бактерий, показывающего, имеют ли склонность указанные бактерии утилизировать этаноламин в качестве субстрата. Более конкретно, данный способ включает дополнительную стадию, которая предшествует стадии i) или проводят вместе со стадией i) способа селекции и которая включает проведение первоначального скрининга указанных кисломолочных бактерий на наличие одного или более гена (генов), кодирующих бактериальные гомологи одного или более генов, кодирующих любой из белков, выбранных из группы, состоящей из: большой субъединицы этаноламин-аммоний-лиазы EutB, структурного белка EutL микрокомпартмента и белка, утилизирующего этаноламин EutH, в указанных кисломолочных бактериях.
Гены являются известными и имеются в открытом доступе, и их можно найти, например, по https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/; согласно следующей информации:
1. Большая субъединица этаноламин-аммоний-лиазы EutB
пример: Genbank номер доступа EOJ56712;
2. Структурный белок EutL микрокомпартмента
Пример: Genbank номер доступа EOJ56710;
3. Белок, утилизирующий этаноламин EutH, транспортер этаноламина
Пример: Genbank номер доступа EOJ56702.
Необязательно, наличие бактериальной гомлогии гена, кодирующего NADPH-зависимую FMN редуктазу, принадлежащую к pfam03358 белковому семейству, и/или гена, кодирующего протеин-тирозин-фосфатазу, принадлежащую к pfam13350 белковому семейству, можно также определить в указанном способе, иногда называемом в настоящем изобретении вторым или дополнительным генетическим скринингом. Указанные гены могут присутствовать в том же генном кластере или опероне, как приведенные выше гены, скринированные в первоначальном скрининге. Предпочтительно указанные гены присутствуют в том же генном кластере и иногда даже в том же опероне, как гены первоначального скрининга.
Проведением второго или дополнительного генетического скрининга, описанного в настоящем изобретении, способ селекции штамма кисломолочных бактерий, способного утилизировать этаноламин, включающий определение генетического профиля, можно даже дополнительно улучшить, поскольку данные гены или все гены вместе рассматривают особенно пригодными в контексте утилизации этаноламина.
NADPH-зависимая FMN редуктаза, принадлежащая к pfam 03358 белковому семейству, может быть представлена Genbank номер доступа WP_075913928, но не ограничивается им. Протеин-тирозин-фосфатаза, принадлежащая к pfam13350 белковому семейству, может быть представлена Genbank номер доступа WP_054277074, но не ограничивается им.
Как приведено ранее в настоящем изобретении, приведенные выше гены указанного первого или первоначального и указанного второго или дополнительного скрининга могут присутствовать в том же генном кластере или даже присутствовать в том же опероне. В некоторых аспектах гены выше присутствуют в том же генном кластере или том же опероне.
Наличие одного или более приведенных выше генов в геноме указанного штамма кисломолочных бактерий указывает на то, что указанный штамм способен утилизировать этаноламин, и, если так, можно затем проводить следующую стадию определения или подтверждения, способен ли указанный штамм утилизировать этаноламин, такую как определением продуцирования ацетальдегида.
Скрининг наличия указанного одного или более гена (генов) можно проводить обычно известными способами для анализа генетической информации, например, полным или частичным геномным сиквенсом, полимеразной цепной реакцией (ПЦР), микрочипами или подобными. Все они представляют способы, которые являются хорошо известными специалисту в данной области техники и легко воспроизводимыми.
Способ селекции может дополнительно включать стадии, где стадия ii) включает определение, способны ли указанные кисломолочные бактерии продуцировать ацетальдегид при утилизации этаноламина, измерением количества или концентрации ацетальдегида в образце культуры из указанной бактериальной культуре. Пример того, как определить, способен ли штамм кисломолочных бактерий утилизировать этаноламин, находится в примере 1 экспериментальной части (результаты показаны на фигуре 1). В настоящем изобретении, утилизацию рассматривают как продуцирование ацетальдегида из этаноламина, наблюдаемое в виде красных зон (обозначенный стрелкой и также наблюдаемое как включающее жирную линию) на чашке с агаром. Смотри фигуру 1. Разница в результатах между утилизирующими этаноламин бактериями и бактериями, неутилизирующими этаноламин, является очевидной, и ее легко определит специалист. В качестве контроля, можно применять штамм кисломолочных бактерий, не способный утилизировать этаноламин, такой как штамм, идентифицированный как не обладающий генетическим профилем, приведенным в настоящем изобретении.
Соответственно, в настоящем изобретении можно определить, способен ли штамм кисломолочных бактерий утилизировать этаноламин, анализом экспансии или распространения, но также измерением ширины расширенной (красной) зоны, окружающей жирную линию, содержащую бактериальную штриховую культуру, как показано на фигуре 1. Как приведено ранее в настоящем изобретении, в некоторых аспектах, определяют, что штамм кисломолочных бактерий является утилизирующим этаноламин, если отчетливую красную область или зону наблюдают на и/или в районе бактериальной штриховой культуры, демонстрирующую наличие ацетальдегида. Иногда, более конкретно, «ширину» зоны можно измерить и можно расширить, по меньшей мере, на приблизительно 0,5 мм на каждой стороне жирной линии или бактериальной штриховой культуры, указывающей на наличие ацетальдегид. Это также дополнительно показано в примере 1 и в таблице 1.
В настоящем изобретении, количество или концентрация этаноламина в или добавляемая к указанной культуральной среде стадии i) может составлять от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 50 мМ, такую как от приблизительно 1 мМ до приблизительно 50 мМ, такую как от приблизительно 1 мМ до приблизительно 30 мМ, такую как от приблизительно 0,5 мМ до приблизительно 15 мМ. Его также называют первым количеством или концентрацией этаноламина. Кроме того, дополнительное количество или концентрация этаноламина, добавляемая к указанной культуре, может составлять от приблизительно 1 мМ до приблизительно 1M, такую как от приблизительно 30 мМ до приблизительно 1M, или от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ. Его также называют вторым количеством или концентрацией этаноламина. Добавление первого или второго количества этаноламина может, но не обязательно, служить различным целям в машинерии утилизирующих этаноламин кисломолочных бактерий.
В настоящем изобретении и во всех контекстах кисломолочные бактерии могут представлять собой бактерии рода Lactobacillus. Это действительно применимо ко всем аспектам, применениям и способам, описанным в настоящем изобретении. Указанные кисломолочные бактерии могут также представлять собой бактерии вида Lactobacillus reuteri. Это также, в общем, применимо в настоящем изобретении.
В одном аспекте настоящего изобретения, обеспечивают кисломолочные бактерии штамма кисломолочных бактерий, отобранного способом селекции в настоящем изобретении, причем указанные бактерии способны утилизировать этаноламин.
Способ получения
Также обеспечивают способ получения, включающий кисломолочные бактерии, как определено в настоящем изобретении. Более конкретно, обеспечивают способ продуцирования кисломолочных бактерий, стимулированных для утилизации этаноламина, причем способ включает стадии:
i) обеспечения кисломолочных бактерий, способных утилизировать этаноламин в культуральной среде,
ii) добавления к культуре стадии i) первого эффективного количества или концентрации этаноламина в первый момент времени и выращивания указанной культуры,
iii) необязательно добавления к культуре стадии ii) второго эффективного количества или концентрации этаноламина во второй момент времени и выращивания указанной культуры, и затем;
iv) извлечения кисломолочных бактерий из указанной культуральной среды.
Кисломолочные бактерии, получаемые указанным способом, могут, в добавление, также продуцировать реутурин и также конкурировать с патогенными бактериями за субстрат глицерин или 1,2-пропандиол (1,2-PD), посредством этого ограничивая доступность данного субстрата для патогенов, в добавление к ограничению субстрата этаноламина. Как приведено ранее в настоящем изобретении, также предполагается, что различные механизмы и части машинерии кисломолочных бактерий, включая способность утилизировать этаноламин, могут взаимодействовать и, посредством этого, обеспечивать улучшенный противомикробный эффект.
Также относительно способа продуцирования кисломолочных бактерий, стимулированных для утилизации этаноламин, первое и наобязательно второе количество или концентрацию этаноламина можно добавлять к или обеспечивать указанную культуру. Это также называют первым и вторым добавлением этаноламина к культуре или культуральной среде. Снова, количество или концентрация этаноламина в или добавляемая к указанной культуральной среде стадии i) может составлять от приблизительно 1 до приблизительно 30 мМ, или как показано в другом месте в настоящем изобретении. Это также называют первым количеством или концентрацией этаноламина. Также, дополнительное количество или концентрация этаноламина, добавляемая к указанной культуре, может составлять от приблизительно 30 мМ до приблизительно 1M, или как показано в другом месте в настоящем изобретении. Это также называют вторым количеством или концентрацией этаноламина. Добавление первого или второго количества этаноламина может, но не обязательно, служить различным целям в машинерии утилизирующих этаноламин кисломолочных бактерий.
Как приведено ранее относительно способа селекции, применяемые кисломолочные бактерии могут представлять собой бактерии рода Lactobacillus. Кроме того, как приведено ранее, указанные кисломолочные бактерии могут представлять собой бактерии вида Lactobacillus reuteri. Это равно применимо ко всем аспектам в настоящем изобретении.
Затем, кисломолочные бактерии, полученные способом, описанным в настоящем изобретении, можно получать в форме, пригодной для хранения, и затем в виде продукта, пригодного для введения людям или животным. Продукты должны по существу не содержать влаги, обеспечивая удовлетворительную стабильность при хранении (такую как добавлением влагопоглотителя к указанной композиции). Культуры кисломолочных бактерий можно хранить в замороженной или лиофилизированной/высушенной сублимацией форме.
Конечно, кисломолочные бактерии, применяемые в любой композиции в настоящем изобретении, представляют собой жизнеспособные бактерии, даже если они находятся в высушенной или лиофилизированной/высушенной сублимацией форме, или подобной.
Соответственно, также обеспечивают в настоящем изобретении кисломолочные бактерии, полученные способом, описанным в настоящем изобретении, а также любую композицию, содержащую указанные кисломолочные бактерии. Данная композиция может быть лиофилизированной/высушенной сублимацией и может необязательно содержать дополнительные добавки или ингредиенты, такие как один или более криопротекторов, лиопротекторов и/или влагопоглотителей.
Генетическое профилирование
Как приведено ранее в настоящем изобретении в другом аспекте, но относительно способа селекции, ранее описанного в настоящем изобретении, обеспечивают способ селекции штамма кисломолочных бактерий, способных утилизировать этаноламин, включающий определение генетического профиля указанных кисломолочных бактерий, причем способ включает стадии:
i) обеспечения бактерий штамма кисломолочных бактерий, которые будут скринировать;
ii) проведения первоначального скрининга указанного штамма кисломолочных бактерий, определяя наличие одной или более бактериальных гомологий генов, кодирующих следующие белки;
a) Большая субъединица этаноламин-аммоний-лиазы EutB;
b) Структурный белок EutL микрокомпартмента; и/или
c) Белок, утилизирующий этаноламин EutH; в указанном штамме кисломолочных бактерий
iii) если один или более из указанных генов присутствуют в указанном штамме кисломолочных бактерий, определения, способны ли указанные бактерии утилизировать этаноламин; и
iv) селекции указанного штамма кисломолочных бактерий, если указанные бактерии способны утилизировать этаноламин.
Необязательно, второй или дополнительный скрининг, т.е. генетический скрининг, указанного штамма кисломолочных бактерий можно проводить, как часть стадии ii), перед или после стадии ii) и перед стадией iii), или подобным, приведенного выше способа, определяя наличие одной или более бактериальных гомологий генов, кодирующих следующие белки: NADPH-зависимая FMN редуктаза, принадлежащая к pfam03358 белковому семейству, и/или протеин-тирозин-фосфатаза, принадлежащая к pfam13350 белковому семейству. Указанные гены могут присутствовать в том же генном кластере, как приведенные выше гены, скринированные в первоначальном скрининге, или даже в том же опероне. Предпочтительно, указанные гены присутствуют в том же генном кластере или даже в том же опероне. Проведением второго генетического скрининга, описанного в настоящем изобретении, способ селекции штамма кисломолочных бактерий, способных утилизировать этаноламин, включающий определение генетического профиля, можно дополнительно улучшить, поскольку данные гены или все гены вместе рассматриваются как пригодные в контексте утилизации этаноламина.
Гены и критерии проведения указанного способа представляют собой, как описано ранее в настоящем изобретении в контексте селекции и/или способа получения.
Применения кисломолочных бактерий, отобранных или полученных способом в настоящем изобретении, а также композиции, содержащие утилизирующие этаноламин кисломолочные бактерии
В еще другом аспекте обеспечивают кисломолочные бактерии, отобранные или полученные способами в настоящем изобретении, для применения в ингибировании роста патогенных бактерий в желудочно-кишечном тракте индивида. В равной мере, обеспечивают применение кисломолочных бактерий, отобранных или полученных способами в настоящем изобретении для ингибирования роста патогенных бактерий. Предложенный механизм в основе этой способности отобранных или полученных кисломолочных бактерий описан ранее в настоящем изобретении, и является результатом того, что патогенные бактерии и кисломолочные бактерии конкурируют за один субстрат. Ингибированием роста данных патогенов, любой вредный эффект, который будет вызываться или уже вызван патогеном, опосредованно предотвращается или, по меньшей мере, уменьшается обеспечением нуждающегося индивида кисломолочными бактериями.
Следовательно, посредством этого, также обеспечивают в настоящем изобретении данные кисломолочные бактерии для применения в качестве лекарственного средства. Более того, данные кисломолочные бактерии обеспечивают для применения в лечении заболевания или расстройства, вызванного или связанного с утилизирующими этаноламин патогеном. Как указано, данный эффект можно опосредовать посредством ингибирующего эффекта указанных кисломолочных бактерий на патогенез инвазивных патогенных бактерий. Как показано в настоящем изобретении в примере 3 и на фигуре 3, утилизирующие этаноламин кисломолочные бактерии способны успешно ингибировать рост патогена C.difficile.
В настоящем изобретении, указанный применяющий этаноламин патоген можно выбрать из группы, состоящей из Clostridium difficile, Escherichia coli, энтерогеморрагических Escherichia coli, Salmonella enterica (например, Salmonella enterica serovar typhimurium), Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Klebsiella pneumonia, Citrobacter koseri, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Clostridium tetani, Listeria monocytogenes, Fusobacterium nucleatum Enterococcus faecalis, Acinetobacter baumannii, Burkholderia mallei, и Burkholderia cepacia. Однако могут также быть предусмотрены другие утилизирующие этаноламин патогены.
Примеры заболеваний, которые связаны с утилизирующими этаноламин патогенными бактериями, представляют собой, например, дисбактериоз (микробный дисбаланс или дезадаптация на или внутри организма), листериоз, сальмонеллез, бактериальные инфекции, приводящие к воспалительным заболеваниям кишечника, инфекции патогенными псевдомонадами (инфицированные раны), и туристическую диарею.
Также обеспечивают композицию, содержащую утилизирующие этаноламин кисломолочные бактерии, стимулированные этаноламином в процессе роста клеточной культуры, содержащей указанные кисломолочные бактерии. Как описано ранее в настоящем изобретении, композиция, описанная в настоящем изобретении, может содержать кисломолочные бактерии рода Lactobacillus. Указанный Lactobacillus может также представлять собой бактерии вида Lactobacillus reuteri. Композиции в настоящем изобретении могут быть также применимы в лечении заболевания или расстройства, вызванного или связанного с утилизирующим этаноламин патогеном. Композиции в настоящем изобретении могут быть также пригодны в ингибировании роста одной или более патогенных бактерий в желудочно-кишечном тракте индивида. В равной мере, их можно применять для лечения заболевания или расстройства, вызванного или связанного с утилизирующим этаноламин патогеном и в ингибировании роста одной или более патогенных бактерий в желудочно-кишечном тракте индивида.
Естественно, настоящее изобретение относится к указанным утилизирующим этаноламин кисломолочным бактериям или штаммам кисломолочных бактерий для применения в качестве пробиотика. Также обеспечивают пробиотическую композицию, содержащую указанные кисломолочные бактерии или штаммы кисломолочных бактерий во всех аспектах, представленных в настоящем изобретении.
Новые штаммы кисломолочных бактерий
Также обеспечивают следующие новые штаммы кисломолочных бактерий:
биологически чистая культура Lactobacillus reuteri DSM 27131 и;
биологически чистая культура Lactobacillus reuteri DSM 32465.
В их аспекте, обеспечивают замороженную или лиофилизированную композицию (композиции), содержащую биологически чистую культуру любого из штаммов Lactobacillus reuteri DSM 27131 и Lactobacillus reuteri DSM 32465.
Также обеспечивают в настоящем изобретении новые замороженные или лиофилизированные продукты Lactobacillus reuteri, содержащие, по меньшей мере:
биологически чистую культуру Lactobacillus reuteri DSM 27131; or
биологически чистую культуру Lactobacillus reuteri DSM 32465.
Также обеспечивают в настоящем изобретении, следующие новые замороженные продукты Lactobacillus reuteri, содержащие, по меньшей мере, криопротектор, такой как глицерин, и:
биологически чистую культуру Lactobacillus reuteri DSM 27131; или
биологически чистую культуру Lactobacillus reuteri DSM 32465.
Также обеспечивают в настоящем изобретении, следующие новые лиофилизированные продукты Lactobacillus reuteri, содержащие, по меньшей мере, лиопротектор, такой как дисахарид, и:
биологически чистую культуру Lactobacillus reuteri DSM 27131; или
биологически чистую культуру Lactobacillus reuteri DSM 32465.
В настоящем изобретении, термины продукты и композиции можно применять взаимозаменяемо относительно указанных кисломолочных бактерий.
Как приведено ранее в настоящем изобретении, обеспечивают новые штаммы Lactobacillus reuteri, описанные в настоящем изобретении, или композиций или продукты, содержащие или состоящие из указанных штаммов, для применения в лечении заболевания или расстройства, вызванного или связанного с утилизирующим этаноламин патогенном, и/или для применения в ингибировании роста одной или более патогенных бактерий в желудочно-кишечном тракте индивида, как описано ранее в настоящем изобретении. Утилизирующие этаноламин патогены представлены в другом месте в настоящем изобретении и равно применимы в настоящем контексте.
Также обеспечивают способ лечения заболевания или расстройства, вызванного или связанного с утилизирующим этаноламин патогенном, у индивида, причем указанный способ включает введение указанному индивиду эффективного количества кисломолочных бактерий, нового штамма кисломолочных бактерий или композиции, или продуктов, как описано в другом месте в настоящем изобретении, указанному индивиду. Также обеспечивают способ лечения индивида, страдающего от инфекции патогенными утилизирующими этаноламин бактериями, введением утилизирующих этаноламин кисломолочных бактерий, как определено в настоящем изобретении, ингибируя рост указанных патогенных бактерий. Фармацевтически эффективное количество указанных кисломолочных бактерий, определяемое квалифицированным практиком, вводят указанному индивиду.
Также обеспечивают способ улучшения штамма Lactobacillus, такого как Lactobacillus reuteri к желчи доминантной селекцией-желчеустойчивость, как дополнительно описано в примерах ниже (пример 2). Соответственно, в примере 2 показано, что штамм Lactobacillus reuteri DSM 32465, полученный из штамма дикого типа, Lactobacillus reuteri DSM 27131, является более устойчивым к желчи, чем штамм дикого типа. Это представляет собой дополнительное преимущество L. reuteri штамма DSM 32465 для применения в качестве пробиотика для определенных заболеваний, применений и показаний.
Настоящее изобретение проиллюстрировано далее следующей экспериментальной частью, но не предполагается, что она ограничивает его.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ПРИМЕР 1
Селекция бактериального штамма, который может утилизировать этаноламин
Бактериальные штаммы
Тестировали различные штаммы Lactobacillus reuteri; L. reuteri DSM 27131, L. reuteri DSM 17938 и L. reuteri DSM 32465. Все штаммы получали у BioGaia AB.
Способ
Бактерии выращивали в течение 48 часов на MRS чашках с агаром (с 10 мМ этаноламином) в анаэробной атмосфере при 37°C. Затем, на чашки наносили слой агара с 500 мМ этаноламином (1% агар) и выдерживали при 37°C в течение 1 часа. Ацетальдегид детектировали добавлением 5 мл 2,4-динитрофенилгидразина (0,1% в 2 M HCl). После выдерживания в течение 3 мин, раствор сливали и добавляли 5 мл 5 M KOH. Красные зоны вокруг бактериальных штриховых культур показывали наличие ацетальдегида.
Результаты
Все штаммы L. reuteri тестировали на их возможную утилизацию этаноламина, которую затем можно наблюдать за счет синтеза ацетальдегида. L. reuteri DSM 17938 давал отрицательный результат, но L. reuteri DSM 27131 и L. reuteri DSM 32465 давали положительный результат, смотри фигуру 1. Соответственно, расширенные (красные) зоны наблюдали вокруг L. reuteri DSM 27131 и L. reuteri DSM 32465. Расширенную (красную) зону не наблюдали вокруг L. reuteri DSM 17938. Приблизительная ширина содержащих ацетальдегид зон на фигуре 1 показана в таблице 1 ниже.
| Штамм | Ширина бактериальной штриховой культуры (мм) | Ширина с зонами (мм) | Только зоны, размер (мм) | Размер зоны, на каждой стороне (мм) |
| DSM27131 | 10 | 16 | 6 | 3 |
| DSM32465 | 14 | 17 | 3 | 1,5 |
| Нормализованные величины | ||||
| Штамм | Ширина бактериальной штриховой культуры (мм) | Ширина с зонами (мм) | Только зоны, размер (мм) | Размер зоны, на каждой стороне (мм) |
| DSM27131 | 4 | 6,40 | 2,40 | 1,20 |
| DSM32465 | 4 | 4,86 | 0,86 | 0,43 |
Таблица 1: Ширина красных зон, окружающих бактериальные штриховые культуры, на фигуре 1, B (DSM 27131) и C (DSM 32465), соответственно
Стадия селекции
Выбирали Lactobacillus reuteri DSM 27131 и Lactobacillus reuteri DSM 32465.
ПРИМЕР 2
Улучшение Lactobacillus reuteri доминантной селекцией-желчеустойчивость
Бактериальные штаммы
Применяли Lactobacillus reuteri штамм DSM 27131.
Способ
Бактерии выращивали в течение ночи (ON) в MRS бульоне при 37°C. Затем, пробирки центрифугировали при 3000 x g в течение 10 минут, и надосадочную жидкость выбрасывали. Пеллет повторно суспендировали в равных объемах MRS с добавленной свиной желчью (0,5% вес/об). Получали аликвоты 200 мкл, две пробирки отбирали непосредственно для испытания на жизнеспособность (исходная величина). Последовательные десятикратные разбавления осуществляли для всех пробирок и наносили на MRS чашки с агаром, применяя капельно-чашечный способ. Вкратце, 10 мкл каждого разбавленного раствора прикапывали на MRS чашки, разделенные на шесть зон, оставляли высохнуть перед выдерживанием ON в анаэробных условиях при 37°C. Остаток аликвот выдерживали при 37°C, две пробирки отбирали каждые 30 минут перед испытанием на жизнеспособность в течение вплоть до четырех часов.
После ON выдерживания, определяли количество бактерий, устанавливая жизнеспособность бактерий. Начиная с подходящих моментов времени, в зависимости от жизнеспособности, колонии различных размеров собирали и хранили в качестве новых вариантов того же штамма L. reuteri.
Стадия селекции
Отбирали новый вариант Lactobacillus reuteri DSM 32465.
Результаты
Первоначальные испытания L. reuteri DSM 27131 показали плохую переносимость свиной желчи при концентрациях 1 и 5%. Дополнительный эксперимент осуществляли с 0,5% свиной желчью с теми же результатами как раньше, однако с первых двух моментов времени, колонии отбирали и хранили в качестве новых вариантов. Lactobacillus reuteri DSM 32465 испытывали тем же способом, как L. reuteri DSM 27131, с 0,5% желчью, и они показали значительное улучшение желчеустойчивости (фигура 2). Нижняя начальная величина L. reuteri DSM 27131 показывает, как чувствителен дикий тип к свиной желчи со снижением от приблизительно 5⋅108 КОЕ/мл до ниже 106 за считанные несколько минут.
ПРИМЕР 3
РЕЗУЛЬТАТЫ
Ex vivo эксперименты показывают, что утилизирующий этаноламин штамм L. reuteri strain DSM 27131 полностью ингибирует рост C. difficile, тогда как L. reuteri DSM 17938 (данные не показаны) не ингибирует рост C. difficile при тех же экспериментальных условиях (фигура 3).
МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
Бактериальные штаммы и культуральные условия.
Стандартное выращивание Lactobacillus reuteri штаммов 17938 и DSM 27131 в deMan, Rogosa, Sharpe среде (MRS; Difco, Franklin Lakes, NY) и C. difficile CD2015 в среде с сердечно-мозговым экстрактом с 2% D-глюкозой (вес/об) (BHI; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) осуществляли при 37°C в анаэробной камере (Anaerobe Systems, AS-580, Morgan Hill, CA), дополненной смесью 10% CO2, 5% H2 и 85% N2 в течение 16-18 ч.
Ex vivo исследования разрастания в GI фекальном содержимом.
Чувствительность C. difficile к L. reuteri 17938 или L. reuteri DSM 27131 в фекальном содержимом стерильных мышей определяли следующим способом. Фекалии собирали у 7-10 недельных C57BL/6 мышей, повторно суспендировали 1:2 в PBS и разделяли на 200 мкл образцы. Каждую аликвоту заражали C. difficile CD2015 (104/мл), затем выдерживали с PBS, содержащем 3 мМ глицерин, и обрабатывали L. reuteri 17938 (107/мл) или L. reuteri DSM 27131 (107/мл, предварительно выдержанными в течение ночи с 10 мМ этаноламином). Суспензии выдерживали анаэробно при 37°C в течение 24 ч. Образцы отбирали через 0 и 24 ч, и C. difficile и L. reuteri бактерии определяли количественно по отношению к ночной культуре на предварительно восстановленном селективном циклосерин-цефокситин-фруктозном агаре с таурохолатом натрия (TCCFA) или MRS средой, соответственно. Чашки выдерживали анаэробно в течение 48 часов при 37°C, и считали колониеобразующие единицы.
ПРИМЕР 4
Частичный сиквенс бактериальных гомологов генов способа генетического скрининга, представленного в настоящем изобретении
Черновую геномную последовательность получали, применяя способы, известные в данной области, на бактериальном штамме L. reuteri DSM 27131. Результат данного анализа показывает, что следующие гены, кодирующие белки, участвующие в утилизации этаноламина, обнаружены в бактериальном штамме L. reuteri DSM 27131:
1. Большая субъединица этаноламин-аммоний-лиазы EutB
2. Структурный белок EutL микрокомпартмента
3. Белок, утилизирующий этаноламин EutH
4. NADPH-зависимая FMN редуктаза, принадлежащая к pfam03358 белковому семейству
5. Протеин-тирозин-фосфатаза, принадлежащая к pfam13350 белковому семейству
Все гены выше присутствовали в том же генном кластере, и также, вероятно, в том же опероне.
1. Способ селекции штамма бактерий Lactobacillus reuteri, способного утилизировать этаноламин, причем способ включает стадии:
i) обеспечения бактерий штамма бактерий Lactobacillus reuteri в культуральной среде и выращивания культуры указанных бактерий;
ii) определения, способны ли указанные бактерии утилизировать этаноламин; и
iii) селекции указанного штамма бактерий Lactobacillus reuteri, если указанные бактерии способны утилизировать этаноламин,
где указанная культуральная среда содержит количество или имеет концентрацию этаноламина, и/или количество этаноламина добавляют к культуре стадии i) в момент времени перед стадией ii).
2. Способ по п. 1, где указанный способ дополнительно включает добавление к культуре стадии i) дополнительного количества этаноламина во второй момент времени и выращивания указанной культуры перед проведением стадий ii) и iii) указанного способа.
3. Способ по любому из пп. 1-2, где стадии i) предшествует проведение первоначального скрининга указанных бактерий Lactobacillus reuteri на наличие одного или более гена (генов), кодирующих бактериальные гомологи одного или более генов, кодирующих любой из белков, выбранных из группы, состоящей из: большой субъединицы этаноламин-аммоний-лиазы EutB, структурного белка EutL микрокомпартмента и белка, утилизирующего этаноламин EutH, у указанных бактерий Lactobacillus reuteri, где необязательно указанный способ дополнительно включает проведение скрининга, определяя присутствие бактериального гомолога гена, кодирующего NADPH-зависимую FMN редуктазу, принадлежащую к pfam03358 семейству белков, и/или гена, кодирующего протеинтирозинфосфатазу, принадлежащую к pfam13350 белковому семейству.
4. Способ по любому из пп. 1-3, где количество этаноламина при добавлении к указанной культуральной среде стадии i) приводит к концентрации от 0,1 мМ до 50 мМ или от 1мМ до 30 мМ, и/или где дополнительное количество этаноламина при добавлении к указанной культуре приводит к от 1 мМ до 1 М, или от 30 мМ до 1M.
5. Способ по любому из пп. 1-4, где отобранный штамм бактерий Lactobacillus reuteri, способный утилизировать этаноламин, представляет собой Lactobacillus reuteri DSM 27131 или Lactobacillus reuteri DSM 32465.
6. Применение штамма бактерий Lactobacillus reuteri, отобранного способом любого из предшествующих пунктов, для ингибирования роста патогенных бактерий у индивида, необязательно для ингибирования роста патогенных бактерий в желудочно-кишечном тракте индивида.
7. Применение штамма бактерий Lactobacillus reuteri по п. 6 для лечения заболевания или расстройства, вызванного или связанного с утилизирующим этаноламин патогеном, где необязательно указанный утилизирующий этаноламин патоген выбран из группы, состоящей из Clostridium difficile, Escherichia coli, Enterohemorrhagic Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Salmonella enterica serovar Typhimurium, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Klebsiella pneumonia, Citrobacter koseri, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Clostridium tetani, Listeria monocytogenes, Fusobacterium nucleatum Enterococcus faecalis, Acinetobacter baumannii, Burkholderia mallei и Burkholderia cepacia.
8. Биологически чистая культура бактерий Lactobacillus reuteri DSM 27131, которая способна утилизировать этаноламин.
9. Замороженная или лиофилизированная композиция, содержащая биологически чистую культуру бактерий Lactobacillus reuteri по п. 8, которая способна утилизировать этаноламин, и криопротектор или лиопротектор.
10. Биологически чистая культура бактерий Lactobacillus reuteri по п. 8 для применения в лечении заболевания или расстройства, вызванного или связанного с утилизирующим этаноламин патогеном.
11. Биологически чистая культура бактерий Lactobacillus reuteri по п. 8 для применения в ингибировании роста одной или более патогенных бактерий у индивида, необязательно для ингибирования роста патогенных бактерий в желудочно-кишечном тракте индивида.
12. Композиция по п. 9 для применения в лечении заболевания или расстройства, вызванного или связанного с утилизирующим этаноламин патогеном.
13. Композиция по п. 9 для применения в ингибировании роста одной или более патогенных бактерий у индивида, необязательно для ингибирования роста патогенных бактерий в желудочно-кишечном тракте индивида.
14. Биологически чистая культура бактерий Lactobacillus reuteri DSM 32465, которая способна утилизировать этаноламин.
15. Замороженная или лиофилизированная композиция, содержащая биологически чистую культуру бактерий Lactobacillus reuteri по п. 14, которая способна утилизировать этаноламин, и криопротектор или лиопротектор.
16. Биологически чистая культура бактерий Lactobacillus reuteri по п. 14 для применения в лечении заболевания или расстройства, вызванного или связанного с утилизирующим этаноламин патогеном.
17. Биологически чистая культура бактерий Lactobacillus reuteri по п. 14 для применения в ингибировании роста одной или более патогенных бактерий у индивида, необязательно для ингибирования роста патогенных бактерий в желудочно-кишечном тракте индивида.
18. Композиция по п. 15 для применения в лечении заболевания или расстройства, вызванного или связанного с утилизирующим этаноламин патогеном.
19. Композиция по п. 15 для применения в ингибировании роста одной или более патогенных бактерий у индивида, необязательно для ингибирования роста патогенных бактерий в желудочно-кишечном тракте индивида.
20. Применение утилизирующих этаноламин бактерий Lactobacillus reuteri для лечения заболевания или расстройства, вызванного или связанного с утилизирующим этаноламин патогеном (ухудшением выживаемости патогенных бактерий и/или снижением вирулентного эффекта указанного патогена).
