Способ прогнозирования предрасположенности к посттравматическому гонартрозу

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к диагностике генетической предрасположенности к развитию остеоартроза коленного сустава (гонартроза) после травматического повреждения, и может быть использовано в спортивной, предиктивной и персонализированной медицине, а также в целях коррекции образа жизни пациентов в валеологической практике. При генотипировании определяют полиморфизм rs5743708, G2258A (Arg753Gln) гена TLR 2 (Toll-подобного рецептора) и в полиморфных локусах выявляют аллель A и генотипы АА и AG и при их наличии диагностируют высокую генетическую предрасположенность к развитию посттравматического гонартроза. 5 з.п. ф-лы, 1 табл., 5 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к медицине, в частности к молекулярно-генетическим исследованиям, а именно к области диагностики генетической предрасположенности к развитию остеоартроза коленного сустава (гонартроза) после травматического повреждения, и может быть использовано в спортивной, предиктивной и персонализированной медицине, а также в целях коррекции образа жизни пациентов в валеологической практике.

Термины и определения

Электрофорез - это метод разделения макромолекул (ДНК, РНК, белков) под действием электрического поля на гелевом носителе в соответствии с их физико-химическими свойствами. Электрофорез  ДНК  в агарозном  геле применяется для разделения фрагментов  ДНК различной длины.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это метод молекулярной биологии, позволяющий создать копии определенного фрагмента ДНК из исходного образца, повысив его содержание в пробе на несколько порядков. Цель ПЦР - получить множество одинаковых двухцепочечных фрагментов ДНК строго определенной длины (обычно не более 2–3 тысяч пар нуклеотидов, т.п.н.). Для этого проводят 20–30 циклов реакции. Каждый цикл состоит из трех этапов: денатурация, отжиг, элонгация.

Денатурация ДНК-матрицы - разъединение исходной двухцепочечной ДНК на две параллельные цепи путем нагревания и разрушения водородных связей между азотистыми основаниями комплементарных цепей.

Отжиг праймеров - специфическое присоединение праймеров к освободившимся цепям ДНК-матрицы с разных сторон копируемого участка.

Элонгация - удлинение, или синтез новой цепи ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы, которая присоединяется к комплексам праймер-матрица и строит комплементарную цепь, которая становится матрицей для синтеза в следующем цикле.

Уровень техники

Остеоартроз (ОА) – дегенеративное заболевание суставов, ведущее к потере физической активности, ранней инвалидизации и резкому снижению качества жизни (Каратеев А.Е., Лила А.М., 2018) [1], (Peat G., Thomas M.J., 2021) [2].

Остеоартроз диагностируется у 10–12% населения планеты, распространенность ОА в разных регионах мира колеблется от 13,6% до 41,7% и значительно увеличивается по мере старения (Ковалерский Г.М., Середа А.П., Лычагин А.В. и др., 2014) [3]. Остеоартроз (ОА) является многофакторным заболеванием, при котором наряду со старением, важная роль отводится травматическому повреждению суставов и генетической предрасположенности. Среди ОА крупных суставов одну из самых актуальных проблем представляет собой гонартроз (артроз коленного сустава), который регистрируется в 55% случаев среди больных, страдающих дистрофическими заболеваниями крупных суставов нижних конечностей (Хитров Н.А., 2008) [4]. Гонартроз (ГА) – деформирующий остеоартроз коленного сустава, встречается у каждого пятого человека на Земле. При сплошном обследовании популяций признаки ОА коленного сустава обнаруживаются у 50% людей обоего пола после 60 лет, а у 90% - после 75 лет (Головач И.Ю., Егудина Е.Д., 2019) [5]. Более 12% всех случаев ОА связано с травмой сустава (Riegger J., Brenner R.E., 2020) [6]. Согласно современным данным, у лиц трудоспособного возраста остеоартроз коленного сустава в 80% является посттравматическим (Novakofski K.D., Berg L.C., Bronzini I.  et al., 2015) [7]. Причем, доля вторичного - посттравматического ОА неуклонно возрастает, что связано с ростом числа лиц травмоопасных профессий (военнослужащие, шахтеры, спасатели МЧС и пожарные, строители, водители и др.), а также с популяризацией спорта и активного образа жизни (Rhon D.I., Perez K.G., Eskridge S.L., 2019) [8]. Это приводит к увеличению встречаемости посттравматического артроза у лиц молодого и среднего возраста, что может быть связано, в том числе, с генетической предрасположенностью (Valdes A.M., Spector T.D.) [9], (Valdes A.M., Doherty S.A.) [10].

В отличие от возраст-ассоциированного и/или метаболического ОА, развивающегося у людей пожилого и среднего возраста, посттравматический гонартроз (ПТГА) поражает более молодых пациентов и характеризуется довольно быстрой прогрессией. Показано, что наибольшая частота всех травм колена наблюдается у мужчин в возрасте до 30 лет (Gianotti S.M. et al., 2009) [11]. При этом риск развития посттравматического ОА после травмы сустава увеличивается с возрастом (Stevens D.G. et al., 2001) [12]. Предполагается, что развитие ПТГА начинается вскоре после микротравмы в тканях суставов и прогрессирует через последовательность острых и хронических изменений в метаболизме и составе хряща и синовия (Van Spil W.E., Kubassova O., Boesen M. et al., 2019) [13]. После травмы сустава в синовии значительно возрастает содержание провоспалительных маркеров (интерлейкина-1-бета IL-1β, интерлейкина-6 IL-6, фактора некроза опухоли TNFα), катаболических ферментов деградации хрящевого матрикса (матриксных металлопротеиназ, аггреканаз) (Riegger J., Brenner R.E., 2020) [6]. Резкое усиление катаболической активности в суставе, вызванное травмой, приводит к накоплению в синовиальной жидкости фрагментов коллагена и олигомерных белков хряща, которые относятся к семейству DAMP (damage associated molecular patterns, молекулярные паттерны, ассоциированные с повреждениями) (Struglics A., Hansson M., Lohmander L.S., 2011) [14]. Причем эти фрагменты остаются в среде сустава в течение нескольких лет после травмы, что способствует развитию посттравматического гонартроза (ПТГА).

Одним из механизмов, связанных с развитием ПТГА, является активация рецепторов врожденного иммунитета - Toll-подобных рецепторов (TLR), что в конечном итоге приводит к усилению патологических изменений в тканях сустава (Punzi L., Galozzi P., Luisetto R. et al., 2016) [15]. Показано, что ПТГА, как и ОА, характеризуется наличием генетических факторов риска, и исследования ассоциаций кандидатных генов уже обнаружили несколько локусов восприимчивости к ПТГА (Valdes A.M. et al., 2010) [9], (Valdes A.M. et al., 2013) [10].

Поиск надежных и значимых молекулярных и, в особенности, молекулярно-генетических маркеров предрасположенности к посттравматическому гонартрозу в популяциях русского населения РФ является актуальной проблемой ранней диагностики и предиктивной медицины.

Известен биохимический способ оценки интенсивности деструктивных процессов при травматическом повреждении коленного сустава и прогнозирования развития посттравматического артроза (RU №2463000, МПК A61B 10/00, G09B 23/28, G01N 33/48, опубл. 10.10.2012) [16]. Для осуществления способа моделируют травму коленного сустава у экспериментальных животных и проводят количественное определение фракционного состава оксипролина в плазме крови, на основании чего оценивают степень деструкции коллагеновых структур с последующим прогнозом развития посттравматического артроза. Недостатком способа является использование модели травмы сустава у экспериментальных животных, а не обследование пациентов с посттравматическим гонартрозом, что запрещает использование способа для тестирования больных без дополнительных исследований на человеке. Кроме того, определение фракционного состава оксипролина как биомаркера метаболизма коллагена позволяет оценить только степень деструкции хрящевой ткани при травме, но исключает возможность прогнозирования предрасположенности к развитию.

Известен молекулярно-генетический способ прогнозирования предрасположенности к развитию тяжелой формы деформирующего OA коленного сустава у взрослых с помощью выявления генотипа, гомозиготного по функционально неполноценному аллелю t гена рецептора 1,25-дигидроксивитамина D3, VDR (RU №2249210, МПК G01N 33/48, C12Q 1/68, опубл. 27.03.2005) [17]. Данный способ осуществляется путем смешивания компонентов реакционной смеси и добавления олигопраймеров, путем полимеразной цепной реакции с последующей рестрикцией полученного продукта и визуализацией электрофореграммы в вертикальном полиакриламидном геле. В данном способе генетическую предрасположенность определяют путем анализа полиморфизма Taq I гена VDR методом полимеразной цепной реакции с использованием праймеров:

5′-GATGATCCAGAAGCTAGCCGACCT-3′ и

5′-GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCT-3′.

На основании результата анализа электрофореграммы составляют клиническую интерпретацию, при этом наличие функционально неполноценного генотипа tt по полиморфизму Taq I гена VDR интерпретируют как предрасположенность к высокому риску развития тяжелой формы деформирующего остеоартроза коленного сустава (в популяции Северо-Западного региона Российской Федерации).

Однако обширный мета-анализ, касающийся роли различных полиморфизмов гена VDR, в том числе и полиморфизма Taq I, учитывающий данные 3372 пациентов, не обнаружил статистически значимой ассоциации с предрасположенностью к OA, даже после стратификации по европейским и азиатским когортам (Lee Y.H., Woo J.H. et al., 2009) [18]. В вышеупомянутом способе пациенты с предшествовавшими травмами коленного сустава (внутрисуставные и околосуставные переломы, вывихи, повреждения менисков и связок коленного сустава) не были включены в исследование, поскольку это могло быть причиной вторичного OA. Более того, как показано в работе (Valdes A.M., Doherty S.A., Muir K.R., 2013) [10] посттравматические тяжелые формы OA, ведущие к необходимости полной замены сустава, характеризуются, по крайней мере, такой же генетической предрасположенностью, как и в случае первичного OA.

Установление предрасположенности к развитию OA именно после травматического воздействия на коленный сустав достигается в способе диагностики предрасположенности к посттравматическому остеоартрозу коленного сустава, согласно которому у исследуемых пациентов проводят генотипирование полиморфизма rs2276109 (A-82G) гена матриксной металлопротеиназы-12 (ММР-12), при выявлении генотипа GG диагностируют генетическую предрасположенность к развитию посттравматического остеоартроза коленного сустава и генотипирование проводят с помощью полимеразной цепной реакции (RU2600860, МПК G01N 33/48, опубл.20.07.2016) [19], принимаемый за прототип настоящего изобретения.

Известный способ осуществляется путем выделения геномной ДНК из периферической крови с помощью коммерческого набора реагентов «ДНК-Экспресс-кровь» (Литех, Россия). Идентификацию полиморфных локусов гена ММП-12 проводят методом полимеразной цепной реакции с использованием коммерческого диагностикума SNP-экспресс (Литех, Россия). После проведения амплификации в амплификаторе TerCyc (Россия) ампликоны разделяют путем электрофореза в 3% агарозном геле, окрашивают этидиум бромидом и визуализируют в трансиллюминаторе GelDoc (BioRad, США). При выявлении генотипа GG диагностируют генетическую предрасположенность к развитию посттравматического остеоартроза коленного сустава.

Известный способ прогноза развития ПТОА требует выявления гомозиготного генотипа гена ММП-12.Частота встречаемости полиморфного генотипа GG у больных посттравматическим гонартрозом достоверно выше, чем в контрольной группе с 5%-ным уровнем значимости и вероятностью ошибочной оценки - р<0,03. Кроме того, для прогноза предрасположенности необходимо выявление именно гомозиготного генотипа - GG, наличие гетерозиготного генотипа - AG не дает достоверного прогноза ассоциации данного полиморфизма с ПТГА (р>0,05).

Раскрытие изобретения

Техническим результатом заявляемого изобретения является:

- повышение в 10 раз достоверности  прогнозирования предрасположенности к ПТГА с помощью полиморфного маркера А гена TLR2 (в предлагаемой заявке 0,5%-ный уровень значимости при р<0,004, в прототипе - 5%-ный уровень значимости при р<0,03);

- повышение чувствительности заявляемого способа, т.к. ассоциация с ПТГА полиморфизма гена TLR2  определяется при наличии как гомозиготного АА, так и гетерозиготного генотипа GA (c 1%-ным уровнем значимости при вероятности ошибочной оценки р<0,006). В прототипе - достоверно ассоциирован с предрасположенностью к ПТГА только гомозиготный генотип (GG) гена ММП12, гетерозиготный генотип (AG) не ассоциирован с ПТГА. В соответствии с этим применение предлагаемого нами способа существенно расширяет группу риска.

Указанный технический результат достигается тем, что способ прогнозирования предрасположенности к посттравматическому гонартрозу характеризуется тем, что проводят генотипирование полиморфизма гена путем выделения геномной ДНК из периферической крови и проведения повторяющихся циклов полимеразной цепной реакции (ПЦР), каждый из которых включает денатурацию двухцепочечной ДНК-матрицы, отжиг праймеров и элонгацию, или синтез ДНК при заданных температурах с разделением продуктов ПЦР (ампликонов) посредством электрофореза в агарозном геле.

Согласно изобретению при генотипировании полиморфизма гена определяют полиморфизм rs5743708, G2258A (Arg753Gln) гена TLR 2 (Toll-подобного рецептора) и в полиморфных локусах выявляют аллель A и генотипы АА и AG и при их наличии диагностируют высокую генетическую предрасположенность к развитию посттравматического гонартроза.

В предпочтительных вариантах выполнения способа:

- ПЦР цикл повторяют 35 раз;

- денатурацию двухцепочечной ДНК-матрицы проводят в течение 70 с при температуре 93°С;

- отжиг праймеров (связывание праймеров с одноцепочечной ДНК-матрицей) проводят в течение 10 с при температуре 64°С;

- время элонгации ДНК составляет 80 с при 72°С;

- для выявления полиморфных аллелей гена толл-подобного рецептора TLR2, G2258A проводят одновременно две реакции амплификации с двумя парами аллель-специфических праймеров, комплементарных нормальному и полиморфному аллелю.

Исследования, проведенные авторами настоящего изобретения доказывают, что для реализации способа прогноза предрасположенности к ПТГА по полиморфизму гена TLR2 достаточно выявить только мутантный аллель А в полиморфных локусах гена, т.е. наличие как гомозиготного (АА), так и гетерозиготного (AG) генотипа по гену TLR2 позволяет прогнозировать высокую генетическую предрасположенность к ПТГА. Повышение чувствительности обеспечивается тем, что прогнозирование предрасположенности к ПТГА обеспечивается не только наличием гомозиготного АА, но и присутствием гетерозиготного генотипа AG, что существенно расширяет группу риска предрасположенности к артрозу.

Следует подчеркнуть, что отсутствуют работы, в которых достоверно показана ассоциация изученного нами полиморфизма rs5743708, G2258A гена TLR2 с посттравматическим гонартрозом. Активация Toll-подобных рецепторов, как правило, приводит к запуску воспалительной реакции и только в случае наличия изученного нами полиморфизма гена TLR2 активация провоспалительного пути сменяется на активацию программированной клеточной гибели или апоптоза, который является ключевым механизмом патогенеза дегенеративных заболеваний суставов (Barreto G., Manninen M., Eklund K.K., 2020) [20].

Ген TLR2 локализован на длинном плече 4-й хромосомы (4q32), на которой найдено 89 однонуклеотидных полиморфизмов (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs), 29 из них локализованы в интронной части гена и 17 – в третьем экзоне TLR2 (Du X. et al., 2000) [21]. Установлено, что 6 смысловых SNPs гена TLR2 связаны с заменой аминокислоты в цитозольном TIR-домене рецептора. Эти полиморфные варианты TLR2 приводят к снижению сигнальной функции рецептора, что сопровождается снижением активности провоспалительного NF-kB-зависимого сигнального пути, и, как следствие, повышают восприимчивость к инфекции (Ioana M.et al., 2012) [22]. При аллельном варианте G2258A(Arg753Gln) (rs5743708) гена TLR2 происходит замена аргинина (Arg) глутамином (Gln) в позиции 753, что приводит к конформационным изменениям в цитозольном TIR-домене рецептора. Аллельный вариант гена TLR2 2258A нарушает работу TLR2–зависимого сигнального пути.

Толл-подобные рецепторы (Тoll-like receptors, TLR) относятся к большому семейству рецепторов, распознающих патогены (pattern recognition receptors, PRRs) и являются критическими элементами врожденного звена иммунной системы позвоночных. Они составляют мультигенное семейство рецепторов, которые в совокупности связывают множество разнообразных - как экзогенных, так и эндогенных - лигандов (Ioana M. et al., 2012) [22]. К настоящему времени у человека идентифицировано 13 TLR (Понасенко А.В. и др., 2015) [23].

TLRs представляют собой трансмембранные интегральные белки, содержащие три домена: внеклеточный, трансмембранный и внутриклеточный (цитозольный). Внеклеточный домен содержит варьирующее число богатых лейцином повторяющихся мотивов (LRRs), которые обеспечивают прямое взаимодействие рецептора с лигандами - РАМР или DAMP. Внутриклеточный домен TLR сходен с цитоплазматическим доменом рецептора интерлейкина 1 (IL-1), в связи с чем его называют TIR-домен (Toll/interleukin-1 receptor domain), который участвует в передаче сигнала от активированного TLR внутрь клетки.

TLRs относятся к рецепторам врожденного иммунитета, которые распознают консервативные структуры микроорганизмов, называемые патоген-ассоциированными молекулярными структурами (PAMP) (Akira S., Takeda K., 2005) [24]. Но TLRs распознают также и эндогенные молекулы, вырабатываемые при повреждениях ткани и воспалении (сигналы опасности) - молекулярные структуры, ассоциированные с повреждением (DAMP) (Sillat T. et al., 2013) [25]. К эндогенным сигналам опасности или DAMP в условиях развития ОА относят хондроцит-ассоциированный белок HMGB1, белки теплового шока и различные компоненты экстраклеточного хрящевого матрикса (низкомолекулярный гиалуронан, гепарансульфат, бигликан и фрагменты фибронектина и других белков матрикса). При дегенерации хряща молекулы матрикса высвобождаются в частично деградированном и денатурированном виде и могут действовать как сигналы опасности (DAMP), которые связываются с TLR (Riegger J.,Brenner R.E., 2020) [6]. Среди различных TLR наибольшая экспрессия в хондроцитах отмечена для TLR2, который активируется IL-1β и фрагментами белков хрящевого матрикса (Barreto G. et al., 2020) [20].

В TLR2-зависимом сигнальном пути на уровне адаптерного белка MyD88 (белковый миелоидный фактор дифференцировки 88) может произойти разветвление сигнального пути. При отсутствии изученного нами полиморфизма гена ТLR2 стимуляция рецептора приводит к активации ядерного фактора-kB (NF-kB) и запуску воспалительной реакции, если присутствует полиморфный маркер G2258A (Arg753Gln) гена TLR2 реализуется путь программированной клеточной гибели - апоптоз (Aliprantis A.O. et al., 2000) [26], (Salaun B., Romero P. Lebecque S., 2007) [27]. Это указывает на то, что TLR2 в случае присутствия мутантного аллеля А становится новым «рецептором смерти», через который реализуется апоптоз.

Таким образом, полиморфизм G2258A гена TLR2 при посттравматическом гонартрозе приводит к изменению конформации цитоплазматического домена (TIR) рецептора TLR2 и нарушению взаимодействия с адаптерным белком MyD88 при передаче сигнала от рецептора к нижестоящим звеньям сигнального пути. С одной стороны, это препятствует сборке сигналосомы и передаче провоспалительного сигнала через NF-kB-зависимый путь в ядро. С другой стороны, что особенно важно для данного полиморфизма, это способствует переключению сигнала на апоптотический путь через взаимодействие доменов смерти DD адаптерных молекул MyD88 и FADD и активацию сигнального пути TLR2 → MyD88 → FADD → каспаза-8 → каспаза-3, что в итоге усиливает апоптоз хондроцитов при ПТГА и дегенерацию суставов. Учитывая, что апоптоз или программированная гибель хондроцитов относится к ведущим механизмам патогенеза ПТГА, полиморфизм гена TLR2 может вносить существенный вклад в развитие патологического процесса.

Осуществление изобретения

Способ прогнозирования предрасположенности к посттравматическому гонартрозу состоит из следующих этапов.

Выделение ДНК из периферической крови.

Для выделения ДНК из периферической крови используют коммерческий набор реагентов «ДНК-экспресс-кровь» (Литех, Москва).

Основные этапы выделения ДНК:

1. В пробирку типа «Эппендорф» с замком внести 800 мкл цельной крови. Перед внесением кровь необходимо перемешать до однородности. В качестве антикоагулянта при заборе венозной крови используется ЭДТА.

2. Закрыть пробирку и центрифугировать со скоростью 3000 оборотов в минуту при комнатной температуре в течение 5 минут, после центрифугирования кровь разделится на плазму и форменные элементы. На поверхности осадка форменных элементов расположен тонкий слой лейкоцитов.

3. Аккуратно удалить пипеткой плазму, не захватив при этом лейкоциты.

4. Закрыть пробирку и выдержать ее при -20°C (в морозильной камере) до полного замораживания форменных элементов (в течение 1 часа).

5. Полностью разморозить содержимое пробирки при комнатной температуре.

6. Внести в пробирку реактив «ДНК-экспресс-кровь». Его объем должен быть равен объему оставшихся в пробирке форменных элементов и плазмы (в опыте в пробирке находилось 500 мкл форменных элементов, соответственно прибавляли 500 мкл реагента «ДНК-экспресс-кровь»). Закрыть пробирку.

7. Содержимое пробирки в течение 10 секунд тщательно перемешать на вортексе.

8. Установить пробирку в предварительно прогретый до 98°C термостат, выдержать 15 минут, затем центрифугировать со скоростью 12000 оборотов в минуту при комнатной температуре в течение 60 секунд.

Полученный таким образом супернатант используют в качестве исследуемого образца ДНК.

Проведение ПЦР (амплификации). Анализ полиморфизма гена.

Ход работы:

1. Приготовить и пронумеровать пробирки для проведения амплификации. Для каждой пробы необходимы две пробирки - N (норма) и P (патология).

2. Приготовить рабочие смеси реагентов для амплификации из расчета на 1 пробу: 17 мкл разбавителя; 2.5 мкл реакционной смеси; 0.2 мкл Taq-полимеразы. Готовятся две рабочие смеси: с реакционной смесью «норма» и с реакционной смесью «патология».

3. После добавления Taq-полимеразы, которое производится в последнюю очередь, необходимо тщательно перемешать смесь пипетированием.

4. Добавить по 20 мкл соответствующей рабочей амплификационной смеси во все соответствующие пробирки для амплификации.

5. Добавить во все пробирки по 1 капле минерального масла.

6. Внести по 5 мкл образца ДНК в пробирку с рабочей амплификационной смесью «норма» и в пробирку с рабочей амплификационной смесью «патология». В пробирке отрицательного контроля содержится равное количество рабочей амплификационной смеси, минерального масла, а также 5 мкл разбавителя.

7. Пробирки закрыть и центрифугировать в течение 3-5 секунд при 3000 оборотах в минуту.

8. Перенести пробирки в амплификатор для проведения реакции амплификации. Используется «горячий старт», то есть пробирки вносятся в прогретый до 94°C амплификатор.

Режим амплификации:

1 цикл

а) денатурация двухцепочечной ДНК-матрицы в течение 70 с при 93°C;

б) отжиг праймеров в течение 10 с при 64°C;

в) элонгация ДНК (с помощью Taq-полимеразы) в течение 80 с при 72°C.

Цикл в амплификаторе TerCyc (Россия) повторялся 35 раз

10°C - хранение

Для выявления полиморфных аллелей гена толл-подобного рецептора 2 (TLR2, G2258A) используют наборы реагентов SNP-экспресс (Литех, Москва). Анализ основан на одновременном проведении двух реакций амплификации с двумя парами аллель-специфичных праймеров. Одна пара праймеров комплементарна нормальному (более распространенному) аллелю, вторая комплементарна полиморфному аллелю. Данный анализ позволяет выявлять как гетерозиготное носительство полиморфных аллелей, так и гомозиготное состояние.

Детекция продуктов ПЦР (ампликонов)

Разделение продуктов амплификации проводят методом горизонтального электрофореза в агарозном геле.

Ход работы:

1. Залить в аппарат для электрофореза TAE - буфер, приготовленный на дистиллированной воде разбавлением 50хТАЕ: в 50 раз (pH=8.3).

2. Приготовить 3% агарозный гель. Добавить к 100 мл расплавленной агарозы 10 мкл 1% раствора бромистого этидия.

3. Охладить расплавленную агарозу до температуры 50-60°C и залить в планшет для заливки геля. Для получения карманов в агарозном геле установить гребенку. Объем карманов должен быть не менее 20-25 мкл. После застывания агарозы перенести планшет с гелем в камеру для проведения электрофореза.

4. Нанести в карманы геля по 10-15 мкл амплификата.

5. Подключить камеру для электрофореза к источнику питания и задать напряжение 10-15 В/см геля. Оптимальное время проведения электрофореза 15-20 минут.

Анализ электрофореграмм осуществляют под ультрафиолетом (УФ) на трансиллюминаторе BioRad (длина волны УФ света 310 нм).

Далее приводятся конкретные примеры осуществления заявленного способа.

Пример 1

Пациент Д., мужчина, 56 лет, находился в отделении ортопедии с 02.12.2014 по 10.12.2014. Считает себя больным в течение 5 лет, когда появились боли в коленных суставах, несколько падений на коленные суставы 6-7 лет назад. Был поставлен следующий диагноз: Двусторонний посттравматический гонартроз 3 стадии по Kellgren-Lawrence, дегенеративный разрыв тела медиального мениска правого коленного сустава, болевой синдром справа. Был госпитализирован для артроскопии правого коленного сустава.

Проведено молекулярно-генетическое типирование и выявлен гомозиготный генотип АА(rs5743708) и, следовательно, предрасположенность к развитию посттравматического гонартроза.

Пример 2

Пациент К., мужчина, 61 год, находился в отделении ортопедии с 10.01.2015 по 18.01.2015. Считает себя больным в течение длительного времени, когда появились боли, ограничение движений в левом коленном суставе, после падения на левую ногу с высоты 2,5 метров. Был поставлен диагноз: Левосторонний посттравматический гонартроз 3 стадии по Kellgren-Lawrence, дегенеративный разрыв заднего рога медиального мениска левого коленного сустава, сгибательная контрактура левого коленного сустава. Был госпитализирован для артроскопии левого коленного сустава.

Проведено молекулярно-генетическое типирование и выявлен гомозиготный генотип АА(rs5743708), данный генотип предрасполагает к развитию ОА коленного сустава после травмы.

Пример 3

Пациент Л., мужчина, 38 лет, находился в отделении ортопедии с 10.12.2014 по 18.12.2014. После спортивной травмы правого коленного сустава (07.12.2013 г.) появились боли, ограничение функции сустава, ощущение нестабильности. Был поставлен следующий диагноз: Правосторонний посттравматический гонартроз 2 стадии по Kellgren-Lawrence, травматический разрыв медиального мениска, передней крестообразной связки (ПКС) правого коленного сустава. Был госпитализирован для артроскопии правого коленного сустава.

Проведено молекулярно-генетическое типирование и выявлен гетерозиготный генотип GA (rs5743708), данный генотип предрасполагает к развитию ОА коленного сустава после травмы.

Пример 4

Пациентка С., женщина, 59 лет, находилась в отделении ортопедии с 04.11.2014 по 12.11.2014. После падения на правый бок 6 мес. назад, появились боли в правом коленном суставе. Был поставлен следующий диагноз: Правосторонний посттравматический гонартроз 3 стадии по Kellgren-Lawrence, дегенеративный разрыв медиального мениска правого коленного сустава. Была госпитализирована для артроскопии правого коленного сустава.

Проведено молекулярно-генетическое типирование и выявлен гетерозиготный генотип GA(rs5743708), данный генотип предрасполагает к развитию ОА коленного сустава после травмы.

Пример 5

В качестве объекта исследования были использованы образцы периферической крови 137 неродственных пациентов с диагнозом посттравматический гонартроз в возрасте 46,33±1,44 лет, 56 мужчин и 81 женщина, русской национальности, проживающие на территории Ростовской области, проходившие лечение в Центральной городской больнице №1 им. Н.А. Семашко. Контрольную группу составили 96 пациентов отделения травматологии и ортопедии ЦГБ, без признаков сужения суставной щели, наличия остеофитов, жалоб на боли или ограниченность функций, в возрасте 44,12±1,47 лет, 39 мужчины и 57 женщины, из Ростовской области (таблица).

Таблица

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфных локусов гена толл-подобного рецептора-2 (TLR2) у пациентов с посттравматическим гонартрозом и здоровых лиц.

Общая группа, %	Прогноз развития ПТГА
	Контроль (n = 96)	ПТГА (n = 137)
TLR2 G2258A (rs 5743708)
GG	67,2	38,6	Нет предрасположенности
GA	31,3	56,1	Есть предрасположенность
AA	1,6	5,3	Есть предрасположенность
G	82,8	66,7	Нет предрасположенности
A	17,2	33,3	Есть предрасположенность
OR (95%CI) GG GA AA	0,31 (0,15 – 0,65) 2,82 (1,33 – 6,01) 3,50(0,35 –34,64)
G A	0,42 (0,23 – 0,76) 2,41(1,32 – 4,4)
χ21 (р)	8,30 (0,004)
χ22 (р)	10,18 (0,006)
χ23 (р)	9,92 (0,007)

Примечание. χ2₁ – критерий χ2 при сравнении частот встречаемости генотипов в группах контроля и ПТГА, χ2₂ – критерий χ2 при сравнении частот встречаемости аллелей в группах контроля и ПТГА, χ2₃ - критерий χ2 при сравнении частот встречаемости гетерозиготных генотипов полиморфных локусов гена TLR2.

Частоты генотипов и аллелей в группе пациентов с ПТГА составили: GG- 38,6% (р > 0,05), GA - 56,1% (p < 0,01), AA - 5,3% (p < 0,01), частота аллеля G- 66,7% (p > 0,05), A - 33,3% (p <0,01); в контрольной группе: GG- 67,2%, GA - 31,3%, AA - 1,6%, частота аллеля G - 82,8%, A - 17,2%.

Причем, в общей группе больных ПТГА частота встречаемости гомозиготного генотипа AA и гетерозиготного генотипа GA достоверно выше, чем в контроле, что в 3,5 и 2,82 раза, соответственно, повышает риск развития заболевания.

Таким образом, обнаружены достоверные различия в частотах генотипов - гомозиготы AA (χ2=8,30, p=0,004), гетерозиготы GA (χ2=9,92, p=0,007) и аллеля A (χ2=10,18, p=0,006) по полиморфизму G2258A между группой пациентов с ПТГА и контрольной группой. Следовательно, полученные результаты позволяют утверждать наличие достоверных ассоциаций полиморфного маркера G2258A гена TLR2 с предрасположенностью к развитию посттравматического гонартроза (остеоартроза коленного сустава).

При оценке соответствия данных исследуемых выборок применяли критерий χ2:

χ2=Σ(П-Е)²/Е,

где П - показатель в исследуемой группе;

Е - данные контрольной группы.

Если вычисленный критерий не превышает табличного для уровня значимости 0.05, то данные о частоте генотипов, полученные нами, соответствуют контрольным.

Вышеприведенные примеры свидетельствуют о возможности использования заявленного способа для выявления генетической предрасположенности человека к развитию осложнений после травматического повреждения, а именно к развитию посттравматического остеоартроза коленного сустава (посттравматического гонартроза, ПТГА). Способ можно использовать при отборе для разных сфер деятельности человека с повышенной двигательной активностью (травмоопасные профессии, спорт).

Источники информации

1. Каратеев А.Е., Лила А.М. Остеоартрит: современная клиническая концепция и некоторые перспективные терапевтические подходы // Науч.-практич. ревматол. - 2018. - Т. 56. - С.70-81.

2. Peat G., Thomas M.J. Osteoarthritis year in review 2020: epidemiology &therapy // Osteoarthritis Cartilage. - 2021. - Vol. 29. -P. 180-189.

3. Кавалерский Г.М., Середа А.П., Лычагин А.В., Сметанин С.М. Эндопротезирование суставной поверхности надколенника при тотальной артропластике коленного сустава: аналитический обзор литературы // Травматология и ортопедия России. - 2014. - №3. - С. 128-141.

4. Хитров Н.А. Современные пути лечения остеоартроза // Русск. мед. ж. - 2008. -Т.16, № 26. - С. 1778-1783.

5. Головач И.Ю., Егудина Е.Д. Посттравматический остеоартрит: современные представления о развитии, прогрессировании и терапевтических подходах // Политравма/Polytrauma - 2019. - №1. - С. 82-89.

6. Riegger J., Brenner R.E. Pathomechanisms of Posttraumatic Osteoarthritis: Chondrocyte Behavior and Fate in a Precarious Environment // Int. J. Mol. Sci. - 2020. - Vol. 21, 1560. - P. 1-23.

7. Novakofski K.D., Berg L.C., Bronzini I.  et al. Joint-dependent response to impact and implications for post-traumatic osteoarthritis // Osteoarthritis Cartilage. - 2015. - Vol. 23. - P. 1130-1137.

8. Rhon D.I., Perez K.G., Eskridge S.L. Risk of post‐traumatic knee osteoarthritis after knee injury in military service members //Musculoskeletal Care. - 2019. - P. 1–7.

9. Valdes A.M., Spector T.D. The clinical relevance of genetic susceptibility to osteoarthritis // Best Pract. Res. Clin. Rheumatol. - 2010. - Vol. 24. - P. 3–14.

10. Valdes A.M., Doherty S.A., Muir K.R., Wheeler M., Maciewicz R.A., Zhang W. et al. The genetic contribution to severe post-traumatic osteoarthritis // Ann. Rheum. Dis. - 2013. - Vol. 72. - P. 1687-90.

11. Gianotti S.M., Marshall S.W., Hume P.A., Bunt L. Incidence of anterior cruciate ligament injury and other knee ligament injuries: a national population-based study // J. Sci. Med. Sport. - 2009. - Vol. 12. - P.622–627.

12. Stevens D.G., Beharry R., McKee M.D., Waddell J.P., Schemitsch E.H. The long-term functional outcome of operatively treated tibial plateau fractures // J. Orthop. Trauma. - 2001. - Vol.15. - P.312–320.

13. Van Spil W.E., Kubassova O., Boesen M. et al. Osteoarthritis phenotypes and novel therapeutic targets // Biochemical Pharmacology. - 2019. - Vol. 165. - P. 41–48.

14. Struglics A, Hansson M, Lohmander LS. Human aggrecanase generated synovial fluid fragment levels are elevated directly after knee injuries due to proteolysis both in the inter globular and chondroitin sulfate domains. Osteoarthr. Cartil. -2011. - Vol.19. - P.1047–57.

15. Punzi L., Galozzi P., Luisetto R., Favero M., Ramonda R., Oliviero F., Scanu A. Post-traumatic arthritis: overview on pathogenic mechanisms and role of inflammation // RMD Open. - 2016. - №2. - Р.1-9.

16. RU 2463000 C1; МПК A61B 10/00, G09B 23/28, G01N 33/48, опубл. 10.10.2012.

17. RU 2249210 C2; МПК G01N 33/48, C12Q 1/68, опyбл. 27.03.2005.

18. Lee Y.H., Woo J.H., Choi S.J., Ji J.D., Song G.G. Vitamin D receptor Taql, Bsml and Apal polymorphisms and osteoarthritis susceptibility: A meta-analysis // Joint Bone Spine. – 2009. - Vol. 76. - P. 156-161.

19. RU 2600 860 C2; МПК G01N 33/48, опyбл. 27.10.2016 – прототип.

20. Barreto G., Manninen M., Eklund K.K. Osteoarthritis and Toll-Like Receptors: When Innate Immunity Meets Chondrocyte Apoptosis // Biology. – 2020. - Vol. 9. - P. 1-15.

21. Du X., Poltorak A., Wei Y., Beutler B. Three novel mammalian toll-like receptors: gene structure, expression, and evolution // Eur. Cytokine Netw. – 2000. - Vol. 11. - P. 362-371.

22. Ioana M., Ferwerda B., Plantinga T.S. et al. Different Patterns of Toll-Like Receptor 2 Polymorphisms in Populations of Various Ethnic and Geographic Origins //Infection and Immunity. - 2012. - P. 1917–1922.

23. Понасенко А.В., Хуторная М.В., Кутихин А.Г., Жидкова И.И., Головкин А.С., Барбараш О.Л. Роль полиморфизмов генов семейства Toll-подобных рецепторов в атеросклеротическом поражении сосудов сердца // Атеросклероз. - 2015. - Т. 11. - С. 22-28.

24. Akira S., Takeda K.Toll-like receptors in innate immunity // Immunology. – 2005. – N17. – P. 1-14.

25. Sillat T., Barreto G., Clarijs P., Soininen A., Ainola M., Pajarinen J., Korhonen M., Konttinen Y.T., Sakalyte R., Hukkanen M., Ylinen P., Nordstrom D.C.E. Toll-like receptors in human chondrocytes and osteoarthritic cartilage // Acta Orthopaed. - 2013. - Vol. 84. - P. 585–592.

26. Aliprantis A.O., Yang R.B., Weiss D.S., Godowski P., Zychlinsky A. The apoptotic signaling pathway activated by Toll-like receptor-2 // EMBO J.- 2000. - Vol. 19. - P. 3325-3336.

27. Salaun B., Romero P. Lebecque S. Toll-like receptors' two-edged sword: when immunity meets apoptosis // Eur. J. Immunol. - 2007. - Vol. 37. - P. 3311–3318.

1. Способ диагностики предрасположенности к посттравматическому гонартрозу, характеризующийся тем, что проводят генотипирование полиморфизма гена путем выделения геномной ДНК из периферической крови и проведения повторяющихся циклов полимеразной цепной реакции (ПЦР), каждый из которых включает денатурацию ДНК-матрицы, отжиг праймеров и элонгацию ДНК при заданных температурах с последующим разделением продуктов ПЦР (ампликонов) посредством электрофореза в агарозном геле, отличающийся тем, что при генотипировании полиморфизма гена определяют полиморфизм rs5743708, G2258A (Arg753Gln) гена TLR 2 (Toll-подобного рецептора) и в полиморфных локусах выявляют аллель A и генотипы АА и AG и при их наличии диагностируют высокую генетическую предрасположенность к развитию посттравматического гонартроза.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ПЦР цикл повторяют 35 раз.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что денатурацию двухцепочечной ДНК-матрицы проводят в течение 70 с при температуре 93°С.

4. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что отжиг праймеров проводят в течение 10 с при температуре 64°С.

5. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что время элонгации ДНК составляет 80 с при 72°С.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для выявления полиморфных аллелей гена толл-подобного рецептора TLR2, G2258A проводят одновременно две реакции амплификации с двумя парами аллель-специфических праймеров, комплементарных нормальному и полиморфному аллелю.