Моноклональные антитела против клаудина 1 для профилактики и лечения гепатоцеллюлярной карциномы

Изобретение относится к области биохимии, в частности к применению моноклонального антитела против клаудина 1. Раскрыта фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество указанного моноклонального антитела. Изобретение позволяет эффективно лечить болезни печени, не связанной с HCV. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 16 ил., 3 табл., 3 пр.

 

Связанная патентная заявка

В настоящей заявке заявляется приоритет Европейской патентной заявки EP 15 159 872,9, которая была подана 19 марта 2015 года. Европейская патентная заявка полностью включена в настоящее описание ссылкой.

Предшествующий уровень изобретения

Гепатоцеллюлярная карцинома (HCC) является второй ведущей и быстро приобретающей вес причиной смерти от злокачественных новообразований во всем мире (Международное агентство онкологических исследований, GLOBOCAN 2012: Оценочная частота возникновения онкологических заболеваний, смертность и распространенность во всем мире в 2012 году - веб-страница: globocan.iarc.fr). HCC насчитывает более 500 000 новых случаев в год и почти столько же смертей из-за плохого прогноза заболевания. Хроническая инфекция вируса гепатита С (HCV) является наиболее важным фактором риска развития цирроза печени и HCC (El-Serag, N Engl J Med., 2011, 365 (12): 1118-1127). По оценкам, приблизительно 3% населения мира хронически инфицировано HCV (Всемирная организация здравоохранения). Другими важными факторами риска для HCC являются инфекция вирусом гепатита B (HBV), алкогольная болезнь печени и неалкогольная жировая дистрофия печени. Менее распространенные причины включают наследственный гемохроматоз, дефицит альфа-1-антитрипсина, аутоиммунный гепатит, некоторые порфирии, болезнь Вильсона, афлатоксин. Распределение этих факторов риска среди пациентов с HCC сильно варьирует в зависимости от географического региона, а также от расы или этнической группы. Большинство из этих факторов риска приводят к образованию и прогрессированию цирроза, который присутствует у 80-90% пациентов с HCC. Пятилетний кумулятивный риск развития HCC у пациентов с циррозом колеблется от 5% до 30% в зависимости от причины, региона или этнической группы и стадии цирроза. В 2011 году на конечной стадии заболевания печени и HCC было произведено 6 342 трансплантаций печени, связанных с затратами в размере более 1 миллиарда долларов США только на эту процедуру (см. веб-страницу NIH: optn.transplant.hrsa.gov/latestData/step2.asp).

Хотя HCC можно избежать, устраняя основную причину на ранней стадии заболевания, отсутствуют стратегии профилактики HCC у пациентов с прогрессирующим циррозом и развитым фиброзом, при которых риск HCC сохраняется, несмотря на лечение основной причины. Действительно, даже лечение инфекции HCV не устраняет риск развития HCC, когда уже имеет место настоящий фиброз (van der Meer et al., JAMA, 2012, 308 (24): 2584-2593). В настоящее время варианты радикального лечения пациентов с цирротической HCC в основном ограничиваются трансплантацией печени, непрактичным, инвазивным и ресурсоемким решением. Учитывая чрезвычайно частые рецидивы опухоли после хирургического лечения и отсутствие эффективных стратегий лечения, профилактика развития HCC у пациентов с развитым фиброзом печени считается наиболее эффективной стратегией для существенного воздействия на выживаемость пациентов (Hoshida et al., J Hepatol., 2014, 61 (1S): S79-S90; Hoshida et al., Curr Cancer Drug Targets, 2012, 12 (9): 1129-1159).

В свете растущего экономического бремени, связанного с пациентами с циррозом и связанного с ним HCC, настоятельно необходимы новые стратегии профилактики и лечения HCC у пациентов с прогрессирующим заболеванием печени.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к системам и стратегиям профилактики и/или лечения гепатоцеллюлярной карциномы (HCC), независимо от этиологии. В частности, настоящее изобретение относится к применению антител против клаудина-1 для профилактики и/или лечения гепатоцеллюлярной карциномы, включая гепатоцеллюлярную карциному, которая не связана с инфекцией HCV и гепатоцеллюлярную карциному, которая развилась или которая подвержена развитию, после излечивания инфекции HCV. Анализируя индуцированную вирусом систему клеточных сигналов и 186-генную сигнатуру печени, которая предсказывает риск HCC у пациентов с циррозом различной этиологии, авторы показали, что моноклональное антитело против клаудина 1, которое они ранее разработали и показали для лечения хронической инфекции HCV без обнаруженных побочных эффектов (EP 08 305 597 и WO 2010/034812), препятствует передаче сигналов клеток печени и полностью обращает сигнатуру риска HCC у пациента в модельной системе на основе клеток печени. Было обнаружено, что модуляция передачи сигналов и перепрограммирования транскрипции не зависит от антивирусной активности антитела, указывая, что моноклональное антитело против клаудина 1 действует непосредственно на онкогенные пути. Действительно, выполняя механистические исследования, авторы продемонстрировали, что антитело ухудшает сигнальный путь EGFR-MAPK и экспрессию генов воспалительного ответа, которые были предложены в качестве драйверов гепатокарциногенеза. По сравнению с противовирусными агентами и другими соединениями-кандидатами для хемопротекции от HCC моноклональное антитело против клаудина 1 было наиболее эффективным для обращения сигнатуры высокого риска HCC.

Следовательно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу против клаудина-1 или его биологически активному фрагменту для применения в профилактике или лечении гепатоцеллюлярной карциномы, не связанной с HCV, у объекта, то есть у объекта, который никогда не был инфицирован HCV или у объекта, который был излечен от инфекции HCV.

В некоторых воплощениях гепатоцеллюлярная карцинома, не связанная с HCV, связана с инфекцией вируса гепатита B (HBV), алкоголизмом, неалкогольной жировой дистрофией печени (NAFLD), наследственным гемохроматозом, дефицитом антитрипсина α 1, пёстрой порфирией, болезнью Вильсона, тирозинемией, болезнью накопления гликогена, аутоиммунным гепатитом, первичным билиарным циррозом или воздействием афлатоксинов. В других воплощениях гепатоцеллюлярная карцинома, не связанная с HCV, представляет собой гепатоцеллюлярную карциному неизвестного происхождения.

В некоторых воплощениях антитело против клаудина 1 представляет собой поликлональное антитело. В других воплощениях антитело против клаудина 1 представляет собой моноклональное антитело.

В некоторых воплощениях антитело против клаудина 1 представляет собой моноклональное антитело, секретируемое гибридомной клеточной линией, совместно депонированной INSERM и GENOVAC в DSMZ 29 июля 2008 года под учетным номером, выбранным из группы, состоящей из DSM ACC2931, DSM ACC2932, DSM ACC2933, DSM ACC2934, DSM ACC2935, DSM ACC2936, DSM ACC2937 и DSM ACC2938. В других воплощениях антитело против клаудина 1 содержит шесть гипервариабельных областей (CDR) моноклонального антитела, секретируемого гибридомной клеточной линией, совместно депонированной INSERM и GENOVAC в DSMZ 29 июля 2008 года под учетным номером, выбранным из группы, состоящая из DSM ACC2931, DSM ACC2932, DSM ACC2933, DSM ACC2934, DSM ACC2935, DSM ACC2936, DSM ACC2937 и DSM ACC2938.

В некоторых воплощениях антитело против клаудина 1 является гуманизированным, деиммунизированным или химерным.

Биологически активный фрагмент антитела против клаудина 1 представляет собой фрагмент, который сохраняет биологическое свойство антитела, которое заключается в нарушении передачи сигналов клеток печени, и полном обращении сигнатуры риска HCC у пациента.

В более общем плане настоящее изобретение охватывает использование любой молекулы, которая содержит антитело против клаудина-1 или его биологически активный фрагмент, включая химерные антитела, гуманизированные антитела, деиммунизированные антитела и молекулы, полученные из антитела, содержащие, по меньшей мере, одну гипервариабельную область (CDR) из вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи моноклонального антитела против клаудина-1, секретируемого гибридомной клеточной линией, включая молекулы, такие как Fab-фрагменты, фрагменты F (ab ') 2, фрагменты Fd, Sc-антитела (одноцепочечные антитела), диатела, отдельные легкие цепи антитела, отдельные тяжелые цепи антитела, химерные слитые белки из цепей антитела и других молекул, и конъюгаты антител, такие как антитела, конъюгированные с диагностическим агентом (детектируемым фрагментом) или терапевтическим агентом, при условии, что эти молекулы, относящиеся к антителу, сохраняют биологическое свойство, которое заключается в нарушении передачи сигналов клеток печени и/или полном обращении сигнатуры риска HCC у пациента и/или в предотвращении или лечении гепатоцеллюлярной карциномы, не связанной с HCV.

В связанном аспекте настоящее изобретение относится к способу предотвращения гепатоцеллюлярной карциномы у объекта, страдающего не связанным с HCV заболеванием печени, причем указанный способ включает стадию введения объекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела против клаудина 1 или его биологически активного фрагмента. Как указано выше, объект, страдающий от заболевания печени, никогда не был инфицирован HCV или был излечен от инфекции HCV.

В некоторых воплощениях основная причина заболевания печени, не связанного с HCV, выбрана из группы, состоящей из инфекции вируса гепатита B (HBV), алкоголизма, неалкогольной жировой дистрофии печени (NAFLD), наследственного гемохроматоза, дефицита антитрипсина α 1, пёстрой порфирии, болезни Вильсона, тирозинемии, болезни накопления гликогена, аутоиммунного гепатита, первичного билиарного цирроза и воздействия афлатоксинов. В других воплощениях болезнь, не связанная с HCV, имеет неизвестное происхождение.

В другом связанном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения не ассоциированной с HCV гепатоцеллюлярной карциномы у объекта, причем указанный способ включает стадию введения объекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела против клаудина 1 или его биологически активного фрагмента. Как указано выше, объект, страдающий гепатоцеллюлярной карциномой, никогда не был инфицирован HCV или был излечен от инфекции HCV.

В некоторых воплощениях гепатоцеллюлярная карцинома, не ассоциированная с HCV, связана с инфекцией вируса гепатита B (HVB), алкоголизмом, неалкогольной жировой болезнью печени (NAFLD), наследственным гемохроматозом, дефицитом антитрипсина альфа 1, пёстрой порфирией, болезнью Вильсона, тирозинемия, болезнью накопления гликогена, аутоиммунным гепатитом, первичным билиарным циррозом или воздействием афлатоксинов. В других воплощениях гепатоцеллюлярная карцинома, не связанная с HCV, представляет собой гепатоцеллюлярную карциному неизвестного происхождения.

Антитела против клаудина 1 и их биологически активные фрагменты, которые могут быть использованы при практическом осуществлении способа профилактики настоящего изобретения и в способе лечения по настоящему изобретению, описаны выше.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество антитела против клаудина 1 или его биологически активный фрагмент и, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент для применения в профилактике или лечении гепатоцеллюлярной карциномы, не ассоциированной с HCV, у объекта, то есть объекта, который никогда не был инфицирован HCV или объекта, который был излечен от инфекции HCV.

В некоторых воплощениях гепатоцеллюлярная карцинома, не связанная с HCV, связана с инфекцией вируса гепатита B, алкоголизмом, неалкогольной жировой болезнью печени (NAFLD), наследственным гемохроматозом, дефицитом антитрипсина α 1, пёстрой порфирией, болезнью Вильсона, тирозинемией, болезнью накопления гликогена, аутоиммунного гепатита, первичным билиарным циррозом или воздействием афлатоксинов. В других воплощениях гепатоцеллюлярная карцинома, не связанная с HCV, представляет собой гепатоцеллюлярную карциному неизвестного происхождения.

Антитела против клаудина 1 и их биологически активные фрагменты, которые могут присутствовать в фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением, являются такими, как описано выше.

В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержит дополнительный терапевтический агент. Дополнительный терапевтический агент может быть выбран из группы, состоящей из антивирусных агентов, противовоспалительных агентов, иммуномодулирующих агентов, анальгетиков, противомикробных агентов, антибактериальных агентов, антибиотиков, антиоксидантов, антисептиков, противораковых агентов и их комбинаций.

В связанном аспекте настоящее изобретение относится к антителу против клаудина 1 или его биологически активному фрагменту для изготовления лекарственного средства для профилактики и/или лечения не ассоциированной с HCV гепатоцеллюлярной карциномы у объекта.

Эти и другие цели, преимущества и признаки настоящего изобретения станут очевидными для специалистов в данной области техники, которые прочитали следующее подробное описание предпочтительных воплощений.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. 186-генная сигнатура для HCC, индуцированной стойкой инфекцией HCV, полностью обращена после обработки CLDN1-специфичным mAb клеток Huh7.5.1dif. A. Клетки Huh7.5.1 дифференцировали в гепатоцит-подобные клетки Huh7.5.1dif, устойчиво инфицировали HCV, и подвергали обработке эрлотинибом или CLDN1-специфичным mAb или не подвергали обработке на 7-й день после заражения, а затем анализировали транскриптом. B. Иммунодетектирование белка Е2 HCV (7-й день инфекции). Окраска ядер синим цветом с помощью DAPI. Масштабная шкала 50 мкм. C. GSEA демонстрирует обращение генов высокого и низкого риска HCC после обработки эрлотинибом и CLDN1-специфичным mAb. По сравнению с эрлотинибом, CLDN1 mAb показало лучшую эффективность обращения профиля высокого риска HCC.

Фигура 2. CLDN1-специфичное mAb реверсирует гены высокого риска HCC более эффективно, чем антивирусные препараты прямого действия или другие соединения-кандидаты хемопревенции HCC независимо от вирусной нагрузки. A. Клетки Huh7.5.1dif инфицировали HCV Jc1. На 7-й день после инфицирования клетки обрабатывали различными соединениями. Общую клеточную РНК выделяли и подвергали анализу NanoString. Обработка HCV Jc1-инфицированных клеток Huh7.5.1dif с DAA (1 нМ DCV + 1 мкМ SOF), интерфероном альфа-2а (10 МЕ/мл), эрлотинибом (0,1 мкМ) и пиоглитазоном (1 мкМ), частично обращает гены высокого риска HCC, как показано GSEA. Контрольная терапия метформином (Met, 3 мкМ) не оказывала влияния. Обработка CLDN1-специфичным mAb (1, 10 и 100 мкг/мл) сильно обращает гены высокого риска HCC. Карты интенсивности показывают значимость индукции или подавления сигнатуры генов высокого/низкого риска HCC. B. Обращение генной сигнатуры с помощью CLDN1-специфического mAb не зависит от вирусной нагрузки. Были проанализированы относительные экспрессии РНК HCV (нормированные по GAPDH). Нагрузка HCV в клеточной модели, среднее ± SD, n = 3. FC - кратное изменение, DCV - Даклатасвир, SOF - Софосбувир.

Фигура 3. CLDN1-специфичное mAb нарушает сигнальную систему и экспрессию EGFR/MAPK в клетках печени человека. A, B. Клетки Huh7.5.1 инфицировали HCV Jc1 и собирали для анализа протеома. Инфекция HCV Jc1-E2 FLAG приводит к увеличению фосфорилирования EGFR. A. Фосфорилирование рецепторной тирозинкиназы (RTK) оценивали в клеточных лизатах с использованием набора Phospho-RTK Array Kit для человека (R & D Systems). B. Количественная оценка интенсивности дот-блоттинга фосфорилированных белков с использованием программного обеспечения Image J. Среднее ± SEM интегрированных плотностей дот-блота, n = 3. C-E. Экспрессия мРНК EGFR и EGF (по отношению к мРНК GAPDH) в неинфицированных (Ctrl) и HCV Jc1-инфицированных клетках Huh7.5.1dif (С; n = 9); неинфицированных (Ctrl) и HBV-инфицированных клетках HepG2-NTCP (D ; n = 12); клетки Huh7.5.1dif инкубировали в отсутствие (Ctrl) или в присутствии 40 мМ этанола (E, N = 6). Показан средний процент ± SEM. *U-критерий Манна-Уитни (p-значение <0,01). F. CLDN1-специфичное mAb нарушает сигнализацию клеток-хозяев HCV. Обнаружение киназного фосфорилирования в хронически инфицированных HCV Jc1 клетках Huh7.5.1, обработанных контрольным или CLDN1-специфичным mAb (100 мкг/мл, 24 часа) с использованием эррея человеческих фосфокиназ. p-Erk1/2, выделенная черными квадратами в F, была количественно определена с использованием программного обеспечения Image J (NIH). Результаты показаны как среднее ± SEM интегральных плотностей дот-блота из двух независимых экспериментов, выполненных в двух повторах. G. Обращение экспрессии сигнала EGFR-MAPK при обработке CLDN1-специфичным mAb. Клетки Huh7.5.1dif инфицировали HCV Jc1. Общую РНК выделяли и подвергали анализу NanoString. Графики представляют оценки перепредставленности сигналов EGFR в злокачественной опухоли, полученные из базы данных онкогенных сигнатур (EGFR_UP.V1_UP) в результате анализа представленности групп генов (GSEA).

Фигура 4. Сигнальные пути EGFR и MAPK подавляются после обработки CLDN1-специфичными mAb HCV Jc1-инфицированных клеток Huh7.5.1dif. В двух независимых экспериментах клетки Huh7.5.1dif инфицировали HCV Jc1 и обрабатывали mAb, как описано выше. Общую клеточную РНК выделяли и подвергали анализу NanoString. Выбирали дифференциально экспрессируемые гены. Значения интенсивности экспрессии были нормированы и логарифмически преобразованы; дифференциально экспрессируемые гены имели р-значения FDR <0,05 и кратное изменение ± 1,9. Ingenuity Pathway Analysis (IPA ®, веб-страница: qiagen.com/ingenuity) использовали для генерации анализа сетей. Дифференциально экспрессируемые гены, принадлежащие A. EGFR- и B. MAPK-сигнальным путям, подавляются после обработки CLDN1-специфичным mAb. Заполненные узлы с генами, выделенными жирным шрифтом, представляют собой дифференциально экспрессируемые гены, принадлежащие сигнальному пути EGFR или MAPK, округленные прямоугольники, означают положительную регуляцию, а кружки, означают отрицательную регуляцию после обработки CLDN1-специфичным mAb. Квадраты представляют собой предсказанные мишени; гены, выделенные жирным шрифтом и черным контуром, относятся к сигнальному пути EGFR или MAPK. Непрерывные и пунктирные линии указывают на прямое и косвенное взаимодействие, соответственно.

Фигура 5. Обработка CLDN1-специфичным mAb модулирует воспалительный сигнальный путь NF-кВ в HCV Jc1-инфицированных Huh7.5.1dif клетках. В двух независимых экспериментах, клетки Huh7.5.1dif инфицировали HCV Jc1 и обрабатывали mAb, как описано выше. Общая клеточная РНК была выделена и подвергнута анализу NanoString. Выбирали дифференциально экспрессируемые гены. Сети были сгенерированы с помощью Ingenuity Pathway Analysis (IPA®, веб-страница: qiagen.com/ingenuity). Сигнальный путь NF-κB модулируется после обработки CLDN1-специфичным mAb. Заполненные узлы с генами, выделенными жирным шрифтом, представляют собой дифференциально экспрессируемые гены, принадлежащие сигнальному пути NF-κB, округленный прямоугольник означает положительную регуляцию, и кружки означают отрицательную регуляцию после обработки CLDN1-специфичным mAb. Квадраты представляют собой предсказанные мишени; гены, выделенные жирным шрифтом и черным контуром, относятся к сигнальному пути NF-κB. Сплошные и пунктирные линии указывают на прямое и косвенное взаимодействие, соответственно.

Фигура 6. Обработка HCV Jc1-инфицированных клеток Huh7.5.1dif CLDN1-специфичным mAb подавляет гены, индуцируемые заболеванием печени. В двух независимых экспериментах, клетки Huh7.5.1dif инфицировали HCV Jc1 и обрабатывали mAb, как описано выше. Общую клеточную РНК выделяли и подвергали анализу NanoString. Выбирали дифференциально экспрессируемые гены. Ingenuity Pathway Analysis (IPA ®, веб-страница: qiagen.com/ingenuity) использовали для проведения анализа сетей. Показано, что гены, индуцированные болезнью печени, экстрагированные программным обеспечением IPA на основе базы знаний Ingenuity Knowledge Base, подавляются после обработки CLDN1-специфичным mAb. Узлы представляют собой дифференциально экспрессируемые гены, округленный прямоугольник означает положительную регуляцию, а кружки, означают отрицательную регуляцию после обработки CLDN1-специфичным mAb. Квадраты представляют собой прогнозируемые мишени. Сплошные и пунктирные линии указывают на прямое и косвенное взаимодействие, соответственно. Гены с черным контуром участвуют в заболеваниях печени, согласно базе знаний IPA Knowledge Base.

Фигура 7. Полученная из пациента пан-этиологическая 32-генная сигнатура риска HCC обращается после обработки CLDN1-специфичным mAb HBV-инфицированных клеток HepG2-NTCP. A. Клетки HepG2-NTCP инфицировали HBV, полученным из сыворотки, и обрабатывали mAb, специфичным к CLDN1 человека, или контрольным Ab в течение 7 дней. B. Инфекция HBV была подтверждена путем количественного определения относительной HGV-прегеномной (pg) РНК-экспрессии с помощью qRT-PCR (среднее ± SD; n = 3). C. Карта интенсивности, показывающая подавление/индукцию экспрессии генов высокого и низкого риска HCC, соответственно, после обработки mAb, специфичным к CLDN1 человека. Экспрессию сигнатуры риска HCC оценивали с использованием Biomark HD, технологии высокопроизводительной RT-PCR. В масштабной линейке белый указывает на увеличение подавления, черный указывает на увеличение индукции.

Фигура 8. Полученная из пациента пан-этиологическая 32-генная сигнатура обращается после обработки CL-1-специфичным mAb в обработанных этанолом клетках печени. А. Клетки Huh7.5.1 дифференцировали в гепатоцит-подобные клетки Huh7.5.1dif, подвергали длительной обработке этанолом (40 мМ) и обрабатывали mAb, специфическим к CLDN1 человека, или контрольным Ab за 10 дней экспонирования. B. Карта интенсивности, показывающая подавление/индукцию экспрессии генов высокого и низкого риска HCC, соответственно, после обработки mAb, специфичного к CLDN1 человека. Сигнатуру риска HCC оценивали с использованием технологии Biomark HD, высокопроизводительной RT-PCR. В масштабной шкале белый указывает на увеличение подавления, черный указывает на увеличение индукции.

Фигура 9. Варбург-поднобный метаболический сдвиг, связанный с повышенным риском рака, обращается после обработки mAb, специфичным к CLDN1 человека, HCV-инфицированных клеток Huh7.5.1dif. А. Анализ полярных метаболитов проводили в клетках Huh7.5.1dif, устойчиво инфицированных HCV. Через десять дней после инфицирования HCV метаболиты экстрагировали и дополнительно анализировали с помощью масс-спектрометрии. B. Поток лактата в клетках печени. Отрицательные значения: накопление вне клеток. C. Карта интенсивности и иерархическая кластеризация, показывающая 15 обнаруженных метаболитов.

Фигура 10. Обработка mAb, специфичным к CLDN1 человека, подавляет регуляторы эпителиально-мезенхимального (ЕМТ) перехода в инфицированных вирусом клетках печени. А. Клетки Huh7.5.1dif устойчиво инфицировали HCV Jc1 и обрабатывали CLDN1-специфичным mAb или контрольным Ab в течение 3 дней через 7 дней после заражения. B. Относительная экспрессия Snail1 (SNAI1), Snail2 (SNAI2) и ZEB1 (ZEB1) при обработке CLDN1-специфичным mAb или контрольным mAb. C. Карта интенсивности, показывающая экспрессию генов, участвующих в ЕМТ. Обработка CLDN1-специфичным mAb изменяла паттерн экспрессии генов, обычно наблюдаемый при ЕМТ. Представленные гены относятся к 186-генной сигнатуре риска HCC. В масштабной шкале белый указывает на увеличение подавления, черный указывает на увеличение индукции. Результаты представляют собой один эксперимент, выполненный в трех повторах. ES: Шкала оценки увеличения.

Фигура 11. Профилактика и лечение заболеваний печени с помощью CLDN1-специфичного mAb в модели мыши DEN для заболевания печени и HCC. A. Используемый подход. Мыши C3H/He (n = 10) получали одну инъекцию DEN (D на графике). Восемнадцать недель после инъекции DEN и до обработки антителом двух мышей умерщвляли для базового анализа . С 18-й недели до 23-й недели оставшиеся 8 мышей подвергали обработке мышиным CLDN1-специфическим Ab mIgG3 (Y) (n = 4, группа лечения) или не обрабатывали (n = 4, контрольная группа). Через неделю после последнего лечения антителом печень собирали для анализа после лечения . Ткань печени фиксировали и окрашивали либо гематоксилином/эозином (B, C, E), либо трихромом Массона (D). B. Заболевание печени на исходном уровне до обработки антителом. Восемнадцать недель после инъекции DEN и до обработки антителом, двух мышей умерщвляли. Печень мышей собирали, фиксировали и окрашивали гематоксилином/эозином. Стрелки показывают очаговые области стеатоза в печени всех мышей. Увеличение x200. C, D и E. Заболевание печени после обработки CLDN1-специфичным mAb. C. Печень собирали после обработки на 23-й неделе и окрашивали гематоксилином/эозином. Стрелки показывают области стеатоза исключительно у контрольных мышей, но не у мышей, обработанных анти-CLDN1 mAb. Увеличение x200. D. Трихромовое окрашивание по Массону печени двух из четырех мышей на группу, подтверждает наличие стеатоза (стрелки) у контрольных мышей, в то время как стеатоз не обнаруживается или едва обнаруживается у мышей, получавших CLDN1-специфичное mAb. Показаны два увеличения (x50 и x200). E. Гематоксилин/эозиновое окрашивание опухоли печени у мыши контрольной группы при двух разных увеличениях (x50 и x200). Никаких опухолей не было обнаружено у мышей, обработанных CLDN1-специфичными антителами. Изображения являются репрезентативными для всей печени. Идентификационные номера мышей указаны на каждом слайде (D-E). Масштабные полоски: 200 мкм для увеличения x50 и 50 мкм для увеличения x200.

Определения

Во всем описании используются несколько терминов, которые определены в следующих абзацах.

Используемый в данном документе термин «объект» относится к человеку или другому млекопитающему (например, примату, собаке, кошке, козе, лошади, свинье, мыши, крысе, кролику и т.п.), у которых может развиться гепатоцеллюлярная карцинома, но которые могут страдать или не страдать от этой болезни. Не являющиеся человеком объекты могут быть трансгенными или иначе модифицированными животными. Во многих воплощениях настоящего изобретения объект является человеком. В таких воплощениях объект часто упоминается как «индивидуум» или «пациент». Термин «индивидуум» не обозначает конкретный возраст и, таким образом, охватывает новорожденных, детей, подростков и взрослых. Термин «пациент» более конкретно относится к человеку, страдающему от заболевания. В практике настоящего изобретения пациенту обычно диагностируют заболевания печени.

Термин «лечение» используется здесь для характеристики способа или процесса, который направлен на (1) задерживание или предотвращение возникновения заболевания или состояния (например, гепатоцеллюлярной карциномы); (2) замедления или остановки прогрессии, осложнения или ухудшения симптомов заболевания или состояния (например, заболевания печени); (3) достижения улучшения симптомов заболевания или состояния; или (4) лечения заболевания или состояния. Лечение можно назначать до начала заболевания или состояния для профилактического или превентивного действия. Альтернативно или дополнительно, лечение может быть назначено после начала заболевания или состояния для терапевтического действия.

Термины «гепатоцеллюлярная карцинома» и «HCC» используются в данном документе взаимозаменяемо. Они относятся к наиболее распространенному типу рака печени, также называемому злокачественной гепатомой. Используемые в данном документе термины «HCV-ассоциированная гепатоцеллюлярная карцинома» и «связанное с HCV заболевание печени» относятся к гепатоцеллюлярной карциноме и заболеванию печени соответственно, которые являются вторичными по отношению к инфекции вирусом гепатита C (HCV). Используемый в данном документе термин «не ассоциированная с HCV гепатоцеллюлярная карцинома» относится к гепатоцеллюлярной карциноме, которая развивается, или которая склонна к развитию у пациента, который никогда не был инфицирован HCV. «Гепатоцеллюлярная карцинома, не связанная с HCV» также включает гепатоцеллюлярную карциному, которая развивается, или которая склонна к развитию, у пациента, который был излечен от инфекции HCV. Аналогично, термин «не связанное с HCV заболевание печени» относится к заболеванию печени, которое развилось у пациента, который никогда не был инфицирован HCV или у пациента, который был излечен от инфекции HCV. Примерами не ассоциированной с HCV гепатоцеллюлярной карциномы/заболевания печени являются гепатоцеллюлярная карцинома/заболевание печени, вторичные по отношению к инфекции вируса гепатита B (HBV), алкогольной болезни печени, неалкогольной жировой дистрофии печени, наследственному гемохроматозу, дефициту альфа 1-антитрипсина, аутоиммунному гепатиту, некоторым порфириям, болезни Вильсона, афлатоксину, диабету 2 типа, ожирению и т.д., а также гепатоцеллюлярной карциноме/заболеванию печени неизвестного происхождения.

«Фармацевтическая композиция» в данном документе определена как содержащая эффективное количество, по меньшей мере, одного антитела против клаудина 1 (или его биологически активного фрагмента) и, по меньшей мере, одного фармацевтически приемлемого носителя или эксципиента.

Используемый в данном документе термин «эффективное количество» относится к любому количеству соединения, агента, антитела или композиции, которое является достаточным для достижения его целевого назначения (назначений), например, искомого биологического или лекарственного ответа в клетке, ткани, системе или объекте. Например, в некоторых воплощениях настоящего изобретения целью (целями) может быть: предотвращение возникновения гепатоцеллюлярной карциномы, замедления, облегчения или остановки прогрессии, обострения или ухудшения симптомов заболевания печени или гепатоцеллюлярной карциномы; для облегчения симптомов заболевания или для лечения гепатоцеллюлярной карциномы.

Термин «фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент» относится к среде-носителю, которая не влияет на эффективность биологической активности активного ингредиента(ов) и которая не является чрезмерно токсичной для хозяина при концентрации, при которой она вводится. Термин включает растворители, дисперсию, среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты и агенты, замедляющие адсорбцию, и т.п. Использование таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области (см., например, «Remington's Pharmaceutical Sciences», EW Martin, 18th Ed., 1990, Mack Publishing Co.: Easton, PA, который включен в данный документ ссылкой во всей полноте).

Термин «клаудин-1 человека или CLDN1 человека» относится к белку, имеющему последовательность, показанную под учетным номером е NCBI NP_066924, или к любому встречающемуся в природе варианту, обычно обнаруживаемому в популяциях людей-переносчиков HCV. Термин «внеклеточный домен» или «эктодомен» клаудина-1 относится к области последовательности клаудина-1, которая распространяется во внеклеточное пространство (т.е. пространство вне клетки).

Используемый в данном документе термин «антитело» относится к любому иммуноглобулину (т.е. к интактной молекуле иммуноглобулина, активной части молекулы иммуноглобулина и т.д.), которая связывается с определенным эпитопом. Этот термин охватывает моноклональные антитела и поликлональные антитела. Все производные и их фрагменты, которые поддерживают специфическую связывающую способность, также включены в термин. Термин также охватывает любой белок, имеющий связывающий домен, который является гомологичным или в значительной степени гомологичным связывающему домену иммуноглобулина. Эти белки могут быть получены из природных источников или частично или получены полностью синтетически.

Термин «специфическое связывание», когда он используется в отношении антитела, относится к связыванию антитела с заданным антигеном. Как правило, антитело связывается с аффинностью, по меньшей мере, 1 × 107 М -1 и связывается с заданным антигеном с аффинностью, которая, по меньшей мере, в два раза больше, чем аффинность связывания с неспецифическим антигеном (например, BSA, казеин).

Термин «выделенный», используемый в данном документе в отношении белка или полипептида, означает белок или полипептид, который в силу своего происхождения или манипуляции отделен, по меньшей мере, от некоторых компонентов, с которыми он связан естественным образом или с которым он ассоциируется при первоначальном получении. Под «выделенным» альтернативно или дополнительно подразумевается, что представляющий интерес белок или полипептид получают или синтезируются руками человека.

Термины «белок», «полипептид» и «пептид» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к аминокислотным последовательностям разной длины либо в их нейтральных (незаряженных) формах, либо в виде солей и либо немодифицированных, либо модифицированных гликозилированием, окислением боковой цепи или фосфорилированием. В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность представляет собой полноразмерный нативный белок. В других воплощениях аминокислотная последовательность представляет собой меньший фрагмент полноразмерного белка. В других воплощениях аминокислотная последовательность модифицируется дополнительными заместителями, присоединенными к боковым цепям аминокислоты, таким как гликозильные остатки, липиды или неорганические ионы, такие как фосфаты, а также модификациями, связанными с химическими превращениями цепей, такими как окисление сульфгидрильных групп. Таким образом, термин «белок» (или его эквивалентные термины) предназначен для включения аминокислотной последовательности полноразмерного нативного белка или его фрагмента с учетом тех модификаций, которые существенно не изменяют его специфические свойства. В частности, термин «белок» охватывает белковые изоформы, то есть варианты, которые кодируются одним и тем же геном, но которые различаются по их pI или MW, или и по тому, и по другому. Такие изоформы могут различаться по их аминокислотной последовательности (например, в результате аллельной вариации, альтернативного сплайсинга или ограниченного протеолиза) или, альтернативно, могут возникать из дифференциальной посттрансляционной модификации (например, гликозилирования, ацилирования, фосфорилирования).

Термин «аналог», используемый в данном документе в отношении белка, относится к полипептиду, который обладает сходной или идентичной функцией белка, но необязательно должен содержать аминокислотную последовательность, которая аналогична или идентична аминокислотной последовательности белка или структуры, которая аналогична или идентична структуре белка. Предпочтительно, в контексте настоящего изобретения белковый аналог имеет аминокислотную последовательность, которая идентична, по меньшей мере, на 30%, более предпочтительно, по меньшей мере, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% аминокислотной последовательности белка.

Термин «фрагмент» или термин «часть», используемый в данном документе в отношении белка, относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, по меньшей мере, из 5 последовательных аминокислотных остатков (предпочтительно, по меньшей мере, около 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250 или более аминокислотных остатков) аминокислотной последовательности белка. Фрагмент белка может обладать или не обладать функциональной активностью белка.

Термин «биологически активный», используемый в данном документе для характеристики белкового варианта, аналога или фрагмента, относится к молекуле, которая обладает достаточной идентичностью аминокислотной последовательности или гомологией с белком для проявления сходных или идентичных свойств белка. Например, во многих воплощениях настоящего изобретения биологически активный фрагмент антитела против клаудина 1 представляет собой фрагмент, который сохраняет способность антитела вмешиваться в сигнализацию клеток печени и обращать сигнатуру риска HCC пациента.

Термин «гомологичный» (или «гомология»), используемый в данном документе, является синонимом термина «идентичность» и относится к сходству последовательностей между двумя полипептидными молекулами или между двумя молекулами нуклеиновой кислоты. Когда положение в обеих сравниваемых последовательностях занято одним и тем же основанием или одним и тем же аминокислотным остатком, то соответствующие молекулы гомологичны в этом положении. Процент гомологии между двумя последовательностями соответствует количеству совпадающих или гомологичных положений между двумя последовательностями, разделенному на количество сравниваемых положений и умноженному на 100. Как правило, сравнение проводится, когда две последовательности выровнены, чтобы обеспечить максимальную гомологию. Гомологичные аминокислотные последовательности имеют идентичные или сходные аминокислотные последовательности. Сходными остатками являются консервативные замены для «допустимых точечных мутаций» соответствующих аминокислотным остаткам в контрольной последовательности. «Консервативные замены» остатка в контрольной последовательности представляют собой замены, которые физически или функционально подобны соответствующему эталонному остатку, например, имеющие аналогичный размер, форму, электрический заряд, химические свойства, включая способность образовывать ковалентные или водородные связи, или т.п. Особенно предпочтительными консервативными заменами являются те, которые соответствуют критериям, определенным для «приемлемой точечной мутации», как описано Dayhoff et al. (“Atlas of Protein Sequence and Structure”, 1978, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, DC, Suppl. 3, 22: 354-352).

Термины «меченный», «меченный детектируемым агентом» и «меченный детектируемой группой» используются в данном документе взаимозаменяемо. Эти термины используются для указания того, что объект (например, антитело) может быть визуализировано, например, после связывания с другим объектом (например, антигеном). Предпочтительно детектируемый агент или объект выбирают таким образом, чтобы он генерировал сигнал, который можно измерить, и интенсивность которого связана с количеством связанного объекта. Способы для мечения белков и полипептидов, включая антитела, хорошо известны в данной области. Маркированные полипептиды могут быть получены путем введения или конъюгации с меткой, которая прямо или косвенно обнаруживается спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими средствами или любыми другими подходящими средствами. Подходящие обнаруживаемые агенты включают, без ограничения указанным, различные лиганды, радионуклиды, флуоресцентные красители, хемилюминесцентные агенты, микрочастицы, ферменты, колориметрические метки, магнитные метки и гаптены.

Термины «приблизительно» и «около», используемые в данном документе в отношении числа, обычно включают числа, которые попадают в диапазон 10% в любом направлении числа (больше или меньше числа), если не указано иное или иным образом очевидно из контекста (за исключением случаев, когда такое число будет превышать 100% возможного значения).

Подробное описание некоторых предпочтительных воплощений

Как упоминалось выше, настоящее изобретение относится к применению антител против клаудина 1 для профилактики и/или лечения гепатоцеллюлярной карциномы, в частности, для профилактики и/или лечения гепатоцеллюлярной карциномы, которая не связана с HCV.

I - Антитела против клаудина-1

Авторы ранее разработали моноклональные антитела, направленные против клаудина-1 человека, и продемонстрировали, что эти моноклональные антитела вылечивают инфекцию HCV in vivo без обнаруживаемых неблагоприятных эффектов (EP 08 305 597 и WO 2010/034812). В настоящее время они продемонстрировали, что эти моноклональные антитела препятствуют передаче сигналов клеток печени и обращают сигнатуру риска HCC пациента в модельной системе на основе клеток печени, и что модуляция передачи сигналов и транскрипции не зависит от антивирусной активности антитела.

Человеческий клаудин 1 (CLDN1) представляет собой белок плотных контактов, экспрессируемый в различных тканях. В гепатоцитах он играет важную роль в формировании барьера, разделяющего кровь и желчь (Zona et al., Viruses, 2014, 6 (2): 875-892). Было показано, что CLDN1 играет двойную роль в заболевании печени, которое ассоциируется с HCV: это важный фактор хозяина для Инфекции HCV, служащий фактором входа вируса в клетку, необходимым для инициации, распространения и поддержания инфекции (Evans et al., Nature, 2007, 446(7137): 801-805; Mailly et al., “Clearance of persistent hepatitis C virus infection using a claudin-1-targeting monoclonal antibody”, Nat Biotech, 2015, в печати). Кроме того, сообщается, что CLDN1 участвует в канцерогенезе посредством модуляции клеточной передачи сигналов (Suh et al., Oncogene, 2013, 32 (41): 4873-4882) или путем индукции экспрессии матричных металлопротеиназ (Oku et al., Cancer Res, 2006, 66 (10): 5251-5257). Кроме того, было показано, что экспрессия CLDN1 повышается при HCC по сравнению с непораженной заболеванием тканью печени (Stebbing et al., Oncogene, 2013, 32 (41): 4871-4872).

Антитела против клаудина 1, которые могут быть использованы при практическом осуществлении настоящего изобретения, включают любое антитело, которое было получено против клаудина 1, и которое может быть показано, что оно мешает передаче сигналов клеток печени и обращает сигнатуру риска HCC пациента, например, в модельной системе на основе клеток печени.

Примеры антител против клаудина 1, которые могут быть использованы при практическом осуществлении настоящего изобретения, включают, в частности, поликлональные и моноклональные антитела против CLDN1, которые были разработаны заявителями (см. ЕР 08 305 597 и WO 2010/034812, Fofana et al., Gastroenterology, 2010, 139 (3): 953-64, 964.e1-4). Как описано в этих документах, восемь моноклональных антител были получены путем генетической иммунизации, и было показано, что они эффективно ингибируют инфекцию HCV путем нацеливания на внеклеточный домен клаудина-1. С помощью модельной системы инфекции HCV и первичных человеческих гепатоцитов было продемонстрировано, что эти моноклональные антитела против CLDN1 эффективно ингибируют инфекцию HCV всех основных генотипов, а также сильно вариабельных квазивирусов HCV у отдельных пациентов. Кроме того, эти антитела эффективно блокировали проникновение высокоинфекционных вариантов HCV, которые были устойчивы к нейтрализующим антителам у шести пациентов с повторной инфекцией HCV при трансплантации печени. Моноклональные антитела против клаудина 1 называются OM-4A4-D4, OM-7C8-A8, OM-6D9-A6, OM-7D4-C1, OM-6E1-B5, OM-3E5-B6, OM-8A9-A3 и OM-7D3-B3. Таким образом, подходящие антитела против клаудина 1 представляют собой моноклональные антитела, секретируемые любой из линий клеток гибридомы, депонированных INSERM (один из заявителей) и GENOVAC в DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikro -organen und und Zellkuturen GmbH, Inhoffenstraße 7 B, 38124 Брауншвейг, Германия) 29 июля 2008 года под учетными номерами DSM ACC2931, DSM ACC2932, DSM ACC2933, DSM ACC2934, DSM ACC2935, DSM ACC2936, DSM ACC2937 и DSM ACC2938 (описано в ЕР 08 305 597 и WO 2010/034812).

Другие примеры подходящих антител против клаудина 1 включают те, которые описаны в Европейском патенте № EP 1 167 389, патенте США № 6,627,439, в международной патентной заявке, опубликованной под номером WO 201/132307 и в международных патентных заявках, опубликованных под номерами WO 2015/014659 и WO 2015/014357, а также в Yamashita et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 2015, 353(1): 112-118 .

Антитела против клаудина 1, подходящие для применения в настоящем изобретении, могут быть поликлональными антителами или моноклональными антителами.

Вместо использования описанных выше гибридом в качестве источника антител, антитела против клаудина 1 могут быть получены любым другим подходящим способом, известным в данной области. Например, моноклональное антитело против клаудина 1 может быть получено методами рекомбинантной ДНК. Эти способы обычно включают выделение генов, кодирующих искомое антитело, перенос генов в подходящий вектор и массовую экспрессию в системе клеточной культуры. Гены или ДНК, кодирующие искомое моноклональное антитело, могут быть легко выделены и секвенированы с использованием обычных процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). Гибридомные клеточные линии могут служить в качестве предпочтительного источника такой ДНК. Подходящие клетки-хозяева для рекомбинантного продуцирования антител включают, без ограничения указанным, подходящие клетки-хозяева млекопитающих, такие как CHO, HeLa или CV1. Подходящие экспрессирующие плазмиды включают, без ограничения указанным, pcDNA3.1 Zeo, pIND (SP1), pREP8 (все коммерчески доступные у Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) и т.п. Гены антител могут быть экспрессированы с помощью вирусных или ретровирусных векторов, включая векторы на основе MLV, векторы на основе вируса коровьей оспы и т.п. Клетки можно выращивать стандартными способами в подходящих средах для культивирования, таких как, например, среда DMEM и RPMI-1640. Антитела против клаудина 1 могут быть экспрессированы как одноцепочечные антитела. Выделение и очистку рекомбинантно продуцируемых антител можно проводить стандартными способами. Например, моноклональное антитело против клаудина 1 может быть выделено и очищено из клеточных культур очисткой на протеине A, сульфатом аммония или осаждением этанолом, экстракцией кислотой, анионной или катионообменной хроматографией, хроматографией на фосфоцеллюлозе, хроматографией на гидрофобном взаимодействии, аффинной хроматографией, такой как колонка с протеином А, гидроксилапатитной хроматографией, лектиновой хроматографией или любой подходящей комбинацией этих способов. Для очистки также можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ).

В ином случае антитело против клаудина 1 для применения в соответствии с настоящим изобретением может быть получено из коммерческих источников.

В некоторых воплощениях антитело против клаудина 1 используется в его нативной форме. В других воплощениях оно укорачивается, (например, посредством ферментативного расщепления или другого подходящего способа) для получения фрагментов или частей иммуноглобулина, в частности фрагментов или частей, которые являются биологически активными. Биологически активные фрагменты или части антитела против клаудина 1 включают фрагменты или части, которые сохраняют способность антитела вмешиваться в сигнализацию клеток печени и обращают сигнатуру риска HCC, пациента, например, в модельной системе на основе клеток печени, такой как система сигнатур 186 генов печени, используемая авторами (см. Примеры ниже) и/или способность предотвращать гепатоцеллюлярную карциному и/или лечить гепатоцеллюлярную карциному.

Биологически активным фрагментом или частью антитела против клаудина 1 может быть фрагмент или часть Fab, фрагмент или часть F (ab')2, вариабельный домен или один или несколько CDR (гипервариабельные области) из антитела (например, антитело, которое включает все 6 CDR моноклонального антитела против клаудина 1). В ином случае, биологически активный фрагмент или часть антитела против клаудина 1 может быть получена из карбоксильной части или конца белка антитела и может содержать фрагмент Fc, фрагмент Fd или фрагмент Fv.

Фрагменты антитела против клаудина 1 по настоящему изобретению могут быть получены любым подходящим способом, известным в данной области, включая, без ограничения указанным, ферментативное расщепление (например, протеолитическое расщепление интактных антител) или синтетические или рекомбинантные методы. Антительные фрагменты F (ab')2, Fab, Fv и ScFv (одноцепочечные Fv) могут быть, например, экспрессированы и секретированы из клеток-хозяев млекопитающих или из E. coli. Антитела также могут быть получены в разнообразных укороченных формах с использованием генов антитела, в которых один или несколько стоп-кодонов были введены выше естественного стоп-сайта. Различные части антител могут быть объединены вместе химически обычными способами или могут быть получены в виде смежного белка с использованием методов генной инженерии.

Антитела против клаудина 1 (или их биологически активные фрагменты), пригодные для применения в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены в модифицированной форме, такой как слитый белок (т.е. молекула иммуноглобулина или часть, связанная с полипептидной сущностью). Предпочтительно слитый белок сохраняет биологическое свойство антитела. Полипептидный объект, который должен быть слит с антителом против клаудина 1 или его биологически активным фрагментом, может быть выбран для придания любого из нескольких выгодных свойств полученному слитому белку. Например, полипептидный объект может быть выбран для обеспечения повышенной экспрессии рекомбинантного слитого белка. Альтернативно или дополнительно, полипептидный объект может облегчать очистку слитого белка, например, действуя как лиганд при аффинной очистке. Протеолитический сайт расщепления может быть добавлен к рекомбинантному белку, так что искомая последовательность может быть окончательно отделена от полипептидного объекта после очистки. Полипептидный объект также может быть выбран для обеспечения улучшенной стабильности слитого белка, когда стабильность является целью. Примеры подходящих полипептидных объектов, включают, например, полигистидиновые метки, которые позволяют легко очищать полученный слитый белок на никелевой хелатной колонке. Глутатион-S-трансфераза (GST), мальтозный B-связывающий белок или протеин A являются другими примерами подходящих полипептидных объектов.

Антитело против клаудина 1 для применения в соответствии с настоящим изобретением может быть повторно сконструировано таким образом, чтобы оптимизировать стабильность, растворимость, период полужизни in vivo или способность связывать дополнительные мишени. Генно-инженерные подходы, а также химические модификации для выполнения любых или всех этих изменений свойств хорошо известны в данной области. Например, известно, что добавление, удаление и/или модификация константных областей антитела играют особенно важную роль для биодоступности, распределения и полужизни терапевтически вводимых антител. Класс и подкласс антител, определяемый Fc или константной областью антитела (которая опосредует эффекторные функции), при наличии, придает важные дополнительные свойства.

Дополнительные слитые белки по изобретению могут быть получены с помощью технологий перетасовки ДНК, хорошо известных в данной области (см., например, патенты США № 5,605,793; 5,811,238; 5,830,721; 5,834,252 и 5,837,458).

Антитела против клаудина 1, подходящие для применения в соответствии с настоящим изобретением, также могут быть «гуманизированы»: различия в последовательности между антителами грызунов и последовательностями человека могут быть сведены к минимуму путем замены остатков, которые отличаются от остатков в человеческих последовательностях путем сайт-направленного мутагенеза отдельных остатков или путем прививки целых областей или путем химического синтеза. Гуманизированные антитела также могут быть получены с использованием рекомбинантных способов. В гуманизированной форме антитела некоторые, большинство или все аминокислоты вне областей CDR заменяются аминокислотами из молекул иммуноглобулина человека, тогда как некоторые, большинство или все аминокислоты в пределах одной или нескольких областей CDR не изменяются. Допускаются небольшие добавления, делеции, вставки, замены или модификации аминокислот, если они не вносят существенного изменения в биологическую активность полученного антитела. Подходящие «замещающие» молекулы иммуноглобулина человека включают молекулы IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgD или IgE и их фрагменты. В ином случае, Т-клеточные эпитопы, присутствующие в антителах грызунов, могут быть модифицированы путем мутации (деиммунизации) с целью получения неиммуногенных антител грызунов, которые могут применяться для терапевтических целей у людей (см. веб-страницу: accurobio.com).

Антитела против клаудина 1 (или биологически активные варианты или их фрагменты), пригодные для применения в соответствии с настоящим изобретением, могут быть функционально связаны (например, путем химической связи, генетической химеризации, нековалентной ассоциации или иным образом) с одной или несколькими другими молекулярными объектами. Способы получения таких модифицированных антител (или конъюгированных антител) известны в данной области (см., например, “Affinity Techniques. Enzyme Purification: Part B”, Methods in Enzymol., 1974, Vol. 34, Jakoby and Wilneck (Eds.), Academic Press: New York, NY; и Wilchek and Bayer, Anal. Biochem., 1988, 171: 1-32). Предпочтительно, молекулярные объекты присоединены в положениях молекулы антитела, которые не влияют на связывающие свойства полученного конъюгата, например, в положениях, которые не участвуют в специфическом связывании антитела с его мишенью.

Молекула антитела и молекулярный объект могут быть ковалентно, непосредственно связаны друг с другом. Или, в ином случае, молекула антитела и молекулярный объект могут быть ковалентно связаны друг с другом через линкерную группу. Это может быть достигнуто с использованием любого из широкого спектра стабильных бифункциональных агентов, хорошо известных в данной области, включая гомофункциональные и гетерофункциональные линкеры.

В некоторых воплощениях антитело против клаудина 1 (или его биологически активный фрагмент) для применения в соответствии с настоящим изобретением конъюгируют с терапевтическим фрагментом. Любой из множества терапевтических объектов может быть пригодным для применения на практике настоящего изобретения, включая, без ограничения перечисленным, цитотоксины (например, цитостатические или цитоцидные агенты), терапевтические агенты и ионы радиоактивных металлов (например, альфа-излучатели и альфа-излучатели, прикрепленные к макроциклическим хелаторам, таким как DOTA). Цитотоксины или цитотоксические агенты включают любой агент, который вреден для клеток. Примеры включают, без ограничения перечисленным, паклитаксол, цитохалазин В, грамицидин D, этидиумбромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол, тимидинкиназу, эндонуклеазу, РНКазу и пуромицин и их фрагменты, варианты или гомологи. Терапевтические агенты включают, без ограничения указанным, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацилдекарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, тиоэпа хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнитол, стрептозотоцин, митомицин C и цисплатин цисдилордиаминовой платины (II) (DDP), антрациклины (например, даунорубицин и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин, блеомицин, митрамицин и антрамицин) и антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин).

Другие терапевтические фрагменты включают белки или полипептиды, обладающие требуемой биологической активностью. Такие белки включают, без ограничения указанным, токсины (например, абрин, рицин А, альфа-токсин, экзотоксин синегнойной палочки, дифтерийный токсин, сапорин, момордин, гелонин, противовирусный белок лаконоса американского, альфа-сарцин и холерный токсин); белки, такие как фактор некроза опухоли, альфа-интерферон, бета-интерферон, фактор роста нервов, фактор роста тромбоцитов, активатор тканевого плазминогена; апоптотические агенты (например, TNF-α, TNF-β) или модификаторы биологического ответа (например, лимфокины, интерлейкин-1 (IL-1), интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-6 (IL-6) гранулоцитарный макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) или другие факторы роста).

В ином случае или дополнительно антитело по настоящему изобретению (или его биологически активный фрагмент) можно конъюгировать с детектируемым агентом. Любой из множества детектируемых агентов может быть использован в практике настоящего изобретения, включая, без ограничения перечисленным, различные лиганды, радионуклиды (например, 3H, 125I, 131I и т.п.), флуоресцентные красители (например, флуоресцеиновый изотиоцианат, родамин, фикоэриэрин, фикоцианин, аллоцикоцианин, о-фтальдегид и флуорескамин), хемилюминесцентные агенты (например, люциферин, люцифераза и акурин), микрочастицы (такие как, например, квантовые точки, нанокристаллы, люминофоры и т.п.), ферменты (такие как, например, те, которые используются в ELISA, то есть пероксидаза хрена, бета-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), колориметрические метки, магнитные метки и биотин, диоксигенин или другие гаптены и белки, для которых антисыворотки или моноклональные антитела являются доступными.

Другие молекулярные объекты, которые могут быть конъюгированы с антителом по настоящему изобретению (или его биологически активным фрагментом), включают, без ограничения указанным, линейные или разветвленные гидрофильные полимерные группы, группы жирных кислот или жирные сложноэфирные группы.

Таким образом, при практическом осуществлении настоящего изобретения антитела против клаудина 1 могут быть использованы в форме полноразмерных антител, биологически активных вариантов или их фрагментов, химерных антител, гуманизированных антител и молекул, полученных из антитела, содержащих, по меньшей мере, один гипервариабельный участок (CDR) из вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи антитела против клаудина 1, включая молекулы, такие как фрагменты Fab, фрагменты F(ab')2, фрагменты Fd, фрагменты Fabc, Sc-антитела (одноцепочечные антитела), диатела, индивидуальные одиночные легкие цепи антитела, индивидуальные одиночные тяжелые цепи антитела, химерные слитые белки из антительных цепей и других молекул и конъюгаты антител, такие как антитела, конъюгированные с терапевтическим агентом или детектируемым агентом. Как показано, предпочтительно, чтобы молекулы, связанные с антителом против клаудина 1 в соответствии с настоящим изобретением, мешали передаче сигналов клеток печени и обращали сигнатуру риска HCC у пациента (такую как система сигнатур из 186 генов печени, используемую настоящими авторами - см. Примеры).

Специалист в данной области поймет, что другие соединения, нацеленные на клаудин-1, могут быть использованы при практическом осуществлении настоящего изобретения, включая, без ограничения указанным, небольшие молекулы и siRNA.

II - Лечение или профилактика гепатоцеллюлярной карциномы

A. Показания

Авторы показали, что антитела против клаудина 1 более эффективны, чем противовирусные агенты и другие соединения-кандидаты для хемопротекции HCC при обращении сигнатуры высокого риска HCC. Следовательно, антитела против клаудина 1 или их биологически активные фрагменты могут быть использованы в профилактических и терапевтических способах для профилактики и/или лечения гепатоцеллюлярной карциномы.

Способы лечения по настоящему изобретению могут быть осуществлены с использованием антитела против клаудина 1 или его биологически активного фрагмента или фармацевтической композиции, содержащей такое антитело или фрагмент (см. ниже). Эти способы обычно включают введение эффективного количества антитела против клаудина-1 или его биологически активного фрагмента или его фармацевтической композиции объекту, нуждающемуся в этом. Введение может быть выполнено с использованием любого из способов введения, известных специалисту в данной области (см. ниже).

В частности, настоящее изобретение относится к способу предотвращения развития гепатоцеллюлярной карциномы у пациента, страдающего от заболевания печени. Болезнь печени или патология могут быть воспалением печени, фиброзом печени и/или циррозом.

При практическом осуществлении настоящего изобретения основной причиной заболевания печени не является инфекция HCV. Таким образом, изобретение обеспечивает способ профилактики и/или лечения не ассоциированной с HCV гепатоцеллюлярной карциномы, то есть для профилактики и/или лечения гепатоцеллюлярной карциномы, которая развивается или которая восприимчива к развитию у пациента, который никогда не был инфицирован HCV, или у пациента, который был излечен от инфекции HCV.

В некоторых воплощениях изобретения основной причиной заболевания печени является инфекция HBV. Хроническая инфекция HBV приводит к циррозу печени и является совместно с хронической инфекцией HCV ответственной за то, что рак печени стал наиболее распространенным раком во многих частях мира. Во всем мире около 2 миллиардов человек инфицированы HBV. Риск HCC примерно в 20 раз выше у людей с HBV- и/или HCV-инфекцией в западных промышленно развитых странах, где распространенность инфекции низкая.

В ином случае, заболевание печени может быть алкогольным заболеванием печени, где основной причиной заболевания печени является алкоголизм. Потребление алкоголя определенно признано причиной хронических заболеваний печени, включая гепатоцеллюлярную карциному. Алкоголь может быть вовлечен в развитие HCC через прямые (генотоксические) и непрямые механизмы. Косвенный механизм включает развитие цирроза, который, вероятно, является наиболее распространенным путем канцерогенеза печени в развитых странах.

В других воплощениях данного изобретения основной причиной заболевания печени является неалкогольная жировая дистрофия печени (NAFLD). NAFLD является наиболее распространенным заболеванием печени в западных промышленно развитых странах. Она считается проявлением в печени метаболического синдрома. Таким образом, NAFLD имеет тенденцию развиваться у людей с избыточной массой или ожирением и/или у которых имеется диабет, высокий уровень холестерина или высокий уровень триглицеридов. У большинства людей NAFLD не имеет признаков и симптомов, и не имеет каких-либо осложнений. Но у некоторых людей с NAFLD жир, который накапливается в печени, может вызвать воспаление и рубцевание в печени, что, как считается, приводит к фиброзу и циррозу. Эта более серьезная форма NAFLD иногда называется безалкогольным стеатогепатитом. Следует отметить, что метаболический синдром и диабет типа 2 были продемонстрированы как независимые факторы риска HCC.

В других воплощениях основной причиной заболевания печени является наследственное заболевание, связанное с метаболизмом, такое как наследственный гемохроматоз. Люди с наследственным гемохроматозом усваивают слишком много железа из пищи. Железо располагается в тканях по всему телу, включая печень. Если железо накопится в достаточном количестве в печени, то это может привести к циррозу. Другие наследуемые метаболические заболевания, которые являются факторами риска гепатоцеллюлярной карциномы, включают дефицит альфа-1 антитрипсина, пеструю порфирию, болезнь Вильсона, тирозинемию и гемогенные болезни.

В других воплощениях основной причиной заболевания печени является аутоиммунный гепатит (также называемый люпоидный гепатит). Аутоиммунный гепатит - хроническое заболевание печени, которое возникает, когда иммунная система организма поражает клетки печени, вызывая воспаление печени. Еще одним аутоиммунным заболеванием, которое поражает печень и может вызвать цирроз, является первичный билиарный цирроз или PBC. PBC - это аутоиммунное состояние, при котором иммунная система медленно атакует желчные протоки в печени. Когда желчные протоки повреждаются, желчь накапливается в печени и со временем повреждает ткань. Это может привести к рубцеванию, фиброзу и циррозу.

В других воплощениях основной причиной заболевания печени является воздействие афлатоксинов. Афлатоксины представляют собой яды, вырабатываемые грибом, который растет на сельскохозяйственных культурах (таких как арахис, пшеница, соя, кукуруза и рис), которые плохо хранятся. Длительное воздействие этих веществ является основным риском развития рака печени. Риск увеличивается еще больше у людей с HCV- или HBV-инфекцией. В развитых странах содержание афлатоксина в пищевых продуктах регулируется путем тестирования. Загрязнение афлатоксином чаще встречается в некоторых частях Африки и Азии.

В других воплощениях основная причина заболевания печени неизвестна или болезнь печени вызвана еще не обнаруженными агентами, включая агенты генетического происхождения, инфекционные агенты или химические и/или физические токсические вещества печени.

Введение антитела против клаудина 1 или его фармацевтической композиции пациентам, страдающим не связанными с HCV заболеваниями печени в соответствии с настоящим изобретением, может замедлять, уменьшать, останавливать или облегчать прогрессирование заболевания печени, в частности прогрессирование к циррозу и/или к гепатоцеллюлярной карциноме, или реверсировать прогрессирование до момента лечения болезни печени.

Альтернативно или дополнительно введение антитела против клаудина 1 или его фармацевтической композиции пациенту, страдающему от заболевания печени, не связанного с HCV в соответствии с настоящим изобретением, может привести к улучшению, по меньшей мере, одного из симптомов, испытываемых индивидуумом, включает, без ограничения указанным, снижение аппетита, потерю массы, усталость, боль в животе, желтуху, зуд, симптомы гриппа, боль в мышцах, боль в суставах, прерывистую низкосортную лихорадку, зуд, нарушения сна, тошноту, диарею, диспепсия, когнитивные изменения, депрессию, головные боли и перепады настроения; симптомы цирроза, такие как асцит, кровоподтеки и склонность к кровотечениям, боль в костях, варикоз (особенно в желудке и пищеводе), стеаторею, желтуху и печеночную энцефалопатию.

Альтернативно или дополнительно, введение антитела против клаудина 1 или его фармацевтической композиции пациенту, страдающему от заболевания печени, не связанного с HCV в соответствии с настоящим изобретением, может привести к предотвращению трансплантации печени.

Эффекты лечения в соответствии с изобретением могут контролироваться с использованием любого из анализов, известных в данной области, для диагностики болезни печени, затронувшей пациента. Такие анализы включают, без ограничения указанным, серологические анализы крови и тесты функции печени для измерения одного или нескольких альбумина, аланиновой трансаминазы (ALT), щелочной фосфатазы (ALP), аспартат-трансаминазы (AST) и гамма-глутамилтранспептидазы (GGT), а также способы визуализации печени, такие как магнитно-резонансная эластография (MRE), магнитно-резонансная томография (МРТ), компьютерная томография (КТ) и ультразвук. Также может быть проведена биопсия.

Такие анализы могут также включать анализ сигналов печени, транскрипционных или протеомических изменений, как описано в примерах ниже, в биологическом образце, полученном из объекта, получающего лечение в соответствии с настоящим изобретением. Клетки печени, которые могут быть проанализированы, включают гепатоциты, клетки Купфера, звездчатые клетки, эндотелиальные клетки, фибробласты, макрофаги и иммунные клетки, включая, без ограничения указанным, Т-, В- и NK-клетки.

В некоторых воплощениях антитело против клаудина 1 (или его биологически активный фрагмент) или его фармацевтическая композиция вводят отдельно в соответствии со способом профилактики или лечения настоящего изобретения. В других воплощениях антитело против клаудина 1 (или его биологически активный фрагмент) или его фармацевтическая композиция вводят в комбинации, по меньшей мере, с одним дополнительным терапевтическим агентом. Антитело против клаудина 1 (или его биологически активный фрагмент) или его фармацевтическую композицию можно вводить перед введением терапевтического агента одновременно с терапевтическим агентом и/или после введения терапевтического агента.

Терапевтические агенты, которые могут вводиться в комбинации с антителом против клаудина 1 (или его биологически активным фрагментом) или его фармацевтической композицией, могут быть выбраны из большого количества биологически активных соединений, которые известны в данной области, чтобы иметь полезный эффект при лечении заболеваний печени и/или при лечении основной причины заболевания печени. Как будет понятно специалисту в данной области, терапевтический агент(ы) будет отличаться в зависимости от характера заболевания печени, которым поражен пациент.

Например, когда пациент страдает от заболевания печени, связанного с инфекцией HBV, терапевтическим агентом (агентами) могут быть ПЭГилированный интерферон (PEG-IFN) или нуклеозидные или нуклеотидные аналоги, которые используются для профилактики HCC у пациентов с HBV-инфекцией. В случае алкогольного заболевания печени терапевтическим агентом (агентами) могут быть кортикостероиды и/или антиоксиданты, такие как S-аденозилметионин. Когда у пациента есть неалкогольная жировая дистрофия печени, терапевтическим агентом (агентами) могут быть сенсибилизаторы инсулина (такие как метформин и тиазолидиндионы, например, пиоглитазон), урсодезоксихолевая кислота и препараты, снижающие уровень липидов, витамин Е и статины. В случае наследственного гемохроматоза терапевтическим агентом (агентами) могут быть препараты для хелатирования железа (такие как хлорохин и гидроксихлорохин). При заболеваниях печени с дефицитом альфа 1 антитрипсина терапевтическим агентом (агентами) могут быть вдыхаемые формы альфа-1 антитрипсина. Для пёстрой порфирии терапевтическим агентом (агентами) могут быть хелатные препараты железа (такие как хлорохин и гидроксихлорохин). В случае болезни Вильсона терапевтический агент (агенты) может представлять собой медь-хелатирующее лекарственное средство (такое как пеницилламин и триентин гидрохлорид) и ацетат цинка, которые препятствуют поглощению меди из пищи. В случае аутоиммунного гепатита терапевтическим агентом (агентами) могут быть кортикостероиды и/или ингибиторы иммунной системы. Для первичного билиарного цирроза терапевтическим агентом (агентами) могут быть урсодезоксихолевая кислота (которая является основным лекарственным средством показанным для прогрессирования заболевания), иммунодепрессанты, метотрексат, кортикостероиды, циклоспорин и противозудные средства.

B. Введение

Антитело против клаудина 1 или его биологически активный фрагмент (необязательно после композиции с одним или несколькими подходящими фармацевтически приемлемыми носителями или эксципиентами) в искомой дозировке можно вводить объекту, нуждающемуся в этом, любым подходящим путем. Различные системы доставки известны и могут быть использованы для введения антител, включая таблетки, капсулы, инъекционные растворы, инкапсулирование в липосомах, микрочастицы, микрокапсулы и т.д. Способы введения включают, без ограничения указанным, кожный, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, внутривенный, подкожный, интраназальный, легочный, эпидуральный, глазной и пероральный пути. Антитело против клаудина 1 или его биологически активный фрагмент или его фармацевтическую композицию можно вводить любым удобным или другим подходящим путем, например, путем инфузии или болюсной инъекции путем абсорбции через эпителиальные или слизистые оболочки (например, перорально, через слизистую, через слизистую прямой кишки и кишечника, и т.д.). Введение может быть системным или местным. Парентеральное введение может быть предпочтительно направлено на печень пациента, например, путем катетеризации в печеночные артерии или в желчный проток или в портальную вену. Как будет понятно специалистам в данной области техники, в воплощениях, в которых изобретенное антитело вводят в комбинации с дополнительным терапевтическим агентом, антитело и терапевтический агент могут вводиться одним и тем же путем (например, внутривенно) или разными путями (например, внутривенно и перорально).

C. Дозировка

Антитело против клаудина 1 или его биологически активный фрагмент (необязательно после композиции с одним или несколькими подходящими фармацевтически приемлемыми носителями или эксципиентами) будет вводиться в дозе, так что доставляемое количество является эффективными для целевого применения. Способ введения, рецептура и вводимая дозировка будут зависеть от искомого терапевтического эффекта, тяжести состояния, подлежащего лечению, если оно уже присутствует, наличия любой инфекции, возраста, пола, массы и общего состояния здоровья пациента, а также от эффективности, биодоступности и периода полужизни in vivo, используемого антитела или композиции, использования (или отсутствия) сопутствующих терапий и других клинических факторов. Эти факторы легко определяемы лечащим врачом в ходе лечения. Альтернативно или дополнительно, дозировка, которую следует вводить, может быть определена из исследований с использованием животных моделей (например, шимпанзе или мышей). Корректировка дозы для достижения максимальной эффективности на основе этих или других способов хорошо известна в данной области и находится в пределах возможностей квалифицированных врачей. Поскольку исследования проводятся с использованием антител против клаудина 1, будет представлена дополнительная информация о соответствующих уровнях дозировки и продолжительности лечения.

Лечение в соответствии с настоящим изобретением может состоять из разовой дозы или нескольких доз. Таким образом, введение антитела против клаудина 1 или его биологически активного фрагмента (или его фармацевтической композиции) может быть постоянным в течение определенного периода времени или периодическим и с определенными интервалами, например, ежечасно, ежедневно, еженедельно (или в течение какого-либо другого многодневного интервала), ежемесячно, ежегодно (например, в форме с замедленным высвобождением). В качестве альтернативы доставка может происходить несколько раз в течение заданного периода времени, например, два или более раз в неделю; два или более раз в месяц и т.п. Доставка может быть непрерывной доставкой в течение определенного периода времени, например, внутривенно.

Как правило, количество антитела против клаудина 1 или его биологически активный фрагмент (или его фармацевтическая композиция) предпочтительно находится в диапазоне от около 1 нг/кг до около 100 мг/кг массы тела объекта, например, от около 100 нг/кг до около 50 мг/кг массы тела объекта; или от около 1 мкг/кг до около 10 мг/кг массы тела объекта, или от около 100 мкг/кг до около 1 мг/кг массы тела объекта.

В некоторых воплощениях количество антитела против клаудина 1 или его биологически активного фрагмента (или его фармацевтической композиции) будет таким, чтобы количество не оказывало влияния на вирусную нагрузку HCV, если оно было введено пациенту, инфицированному HCV.

III - Фармацевтические композиции

Как упоминалось выше, антитела против клаудина 1 (и родственные молекулы) могут вводиться сами по себе или в виде фармацевтической композиции. Соответственно, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим эффективное количество антитела против клаудина 1 или его биологически активного фрагмента, описанного в данном документе, и, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент для применения в профилактике или лечении гепатоцеллюлярной карциномы. В некоторых воплощениях композиция дополнительно содержит один или несколько дополнительных биологически активных агентов.

Антитела или фармацевтические композиции могут вводиться в любом количестве и с использованием любого способа введения, эффективного для достижения искомого профилактического и/или терапевтического эффекта. Оптимальная фармацевтическая композиция может варьировать в зависимости от пути введения и искомой дозировки. Такие составы могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость клиренса in vivo вводимого активного ингредиента.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть составлены в виде единичной дозы для облегчения введения и единообразия дозировки. Выражение «стандартная лекарственная форма», при использовании в данном документе, относится к физически дискретной единице антитела против клаудина-1 или к его биологически активному фрагменту для пациента, подлежащего лечению. Однако следует понимать, что общая суточная доза композиций будет определяться лечащим врачом в рамках обоснованного медицинского заключения.

A. Подбор состава

Инъекционные препараты, например, стерильные инъекционные водные или масляные суспензии, могут быть приготовлены в соответствии с известным уровнем техники с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов. Стерильный инъекционный препарат может также представлять собой стерильный раствор для инъекций, суспензию или эмульсию в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, в виде раствора в 2,3-бутандиоле. Среди приемлемых носителей и растворителей, которые могут быть использованы, являются вода, раствор Рингера, USP и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, стерильные, жирные масла обычно используют в качестве раствора или суспендирующей среды. Для этой цели можно использовать любое мягкое жирное масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, также могут быть использованы для приготовления инъекционных препаратов. Стерильные жидкие носители полезны в композициях стерильной жидкой формы для парентерального введения.

Инъецируемые препараты можно стерилизовать, например, путем фильтрации через удерживающий бактерии фильтр или путем введения стерилизующих агентов в форме стерильных твердых композиций, которые можно растворить или диспергировать в стерильной воде или другой стерильной инъекционной среде перед применением. Жидкие фармацевтические композиции, которые представляют собой стерильные растворы или суспензии, можно вводить, например, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно или подкожно. Инъекция может осуществляться посредством однократного нажатия или путем постепенной инфузии. Когда это необходимо или желательно, композиция может включать местный анестетик для облегчения боли в месте инъекции.

Чтобы продлить действие активного ингредиента (в данном документе антитела против клаудина-1 или его биологически активный фрагмента), часто желательно замедлить абсорбцию ингредиента подкожной или внутримышечной инъекцией. Задержка абсорбции парентерально вводимого активного ингредиента может быть достигнута путем растворения или суспендирования ингредиента в масляном носителе. Формы для инъекцируемых депо получают путем формирования микроинкапсулированных матриц активного ингредиента в биоразлагаемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения активного ингредиента и полимера и природы конкретного используемого полимера можно контролировать скорость высвобождения ингредиентов. Примеры других биодеградируемых полимеров включают поли (ортоэфиры) и поли (ангидриды). Составы инъецируемых депо также могут быть получены путем захвата активного ингредиента в липосомах или микроэмульсиях, которые совместимы с тканями организма.

Жидкие лекарственные формы для перорального введения включают, без ограничения указанным, фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы, эликсиры и композиции под давлением. В дополнение к антителу против клаудина 1 или его биологически активному фрагменту жидкая лекарственная форма может содержать инертные разбавители, обычно используемые в данной области, такие как, например, вода или другой растворитель, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла (в частности, хлопкового, арахисового, кукурузного масла, масла зародышей, оливкового, касторового и кунжутного масла), глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот сорбитана и их смеси. Помимо инертных разбавителей пероральные композиции могут также включать адъюванты, такие как смачивающие агенты, суспендирующие агенты, консерванты, подсластители, ароматизаторы и ароматизаторы, загустители, красители, регуляторы вязкости, стабилизирующие или осморегуляторы. Примеры подходящих жидких носителей для перорального введения включают воду (потенциально содержащую добавки, как указано выше, например, производные целлюлозы, такие как раствор карбоксиметилцеллюлозы натрия), спирты (включая одноатомные спирты и многоатомные спирты, такие как гликоли) и их производные и масла (например, фракционированное кокосовое масло и арахисовое масло). Для композиций под давлением жидкий носитель может представлять собой галогенированный углеводород или другой фармацевтически приемлемый пропеллент.

Твердые лекарственные формы для перорального введения включают, например, капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых дозированных формах антитело против клаудина-1 или его биологически активный фрагмент могут быть смешаны, по меньшей мере, с одним инертным физиологически приемлемым эксципиентом или носителем, таким как цитрат натрия или фосфат дикальция, и одним или несколькими из числа: (a) филлеров или наполнителей, таких как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннитал и кремниевая кислота; (b) связующих, таких как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и аравийская камедь; (c) увлажнителей, таких как глицерин; (d) разрыхляющих агентов, такие как агар-агар, карбонат кальция, картофельный или тапиоковый крахмал, альгиновая кислота, некоторые силикаты и карбонат натрия; (e) замедлителей, замедляющие раствор, таких как парафин; ускорителей поглощения, таких как соединения четвертичного аммония; (g) смачивающих агентов, таких как, например, цетиловый спирт и моностеарат глицерина; (h) абсорбентов, таких как каолин и бентонитовая глина; и (i) смазывающих веществ, таких как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия и их смеси. Другие вспомогательные вещества, подходящие для твердых композиций, включают поверхностно-модифицирующие агенты, такие как неионные и анионные поверхностно-модифицирующие агенты. Типичные примеры поверхностно-модифицирующих агентов включают, без ограничения указанным, полоксамер 188, хлорид бензалкония, стеарат кальция, цетостеариловый спирт, эмульгирующий воск из цетомакрогола, сложные эфиры сорбитана, коллоидный диоксид кремния, фосфаты, додецилсульфат натрия, силикат магния и триэтаноламин. В случае капсул, таблеток и пилюль лекарственная форма может также содержать буферные агенты.

Твердые композиции аналогичного типа также могут быть использованы в качестве наполнителей в мягких и твердых желатиновых капсулах с использованием таких эксципиентов, как лактоза или молочный сахар, а также полиэтиленгликоли высокой молекулярной массы и т.п. Твердые лекарственные формы из числа таблеток, драже, капсул, пилюль и гранул могут быть получены с покрытиями и оболочками, такими как энтеросолюбильные покрытия, контролирующие высвобождение покрытия и другие покрытия, хорошо известные в уровне технике, относящегося к получению фармацевтических композиций. Они могут необязательно содержать непрозрачные агенты и могут также иметь такую композицию, что они высвобождают активный ингредиент(ы) только или предпочтительно в определенной части кишечного тракта, необязательно, с временной задержкой. Примеры встраиваемых композиций, которые могут быть использованы, включают полимерные вещества и воски.

В некоторых воплощениях может быть желательным вводить композицию по изобретению локально в область, нуждающуюся в лечении (например, в печень). Это может быть достигнуто, например, без ограничения указанным, местной инфузией во время операции (например, трансплантации печени), местного применения путем инъекции с помощью катетера, с помощью суппозитория или с помощью кожного пластыря или стента или другого имплантата.

Для местного введения композицию предпочтительно готовят в виде геля, мази, лосьона или крема, который может включать носители, такие как вода, глицерин, спирт, пропиленгликоль, жирные спирты, триглицериды, эфиры жирных кислот или минеральное масло. Другие актуальные носители включают жидкую нефть, изопропилпальмитат, полиэтиленгликоль, этанол (95%), полиоксиэтиленмонолаурат (5%) в воде или лаурилсульфат натрия (5%) в воде. При необходимости можно добавлять другие материалы, такие как антиоксиданты, увлажнители, стабилизаторы вязкости и аналогичные агенты.

Кроме того, в некоторых случаях ожидается, что фармацевтические композиции могут быть расположены в чрескожных устройствах, расположенных на коже или под кожей. Такие устройства включают пластыри, имплантаты и инъекции, которые высвобождают активный ингредиент с помощью пассивных или активных механизмов высвобождения. Трансдермальное введение включают все виды введения через поверхность тела и поверхности внутренних оболочек организма, включая эпителиальные и слизистые ткани. Такие введения могут быть осуществлены с использованием настоящих композиций в лосьонах, кремах, пенах, пластырях, суспензиях, растворах и суппозиториях (ректальном и вагинальном).

Трансдермальное введение может быть осуществлено с использованием трансдермального пластыря, содержащего активный ингредиент (то есть антитело против клаудина-1 или его биологически активный фрагмент) и носитель, который не токсичен для кожи, и обеспечивает доставку ингредиента для системного всасывания в кровоток через кожу. Носитель может принимать любое количество форм, таких как кремы и мази, пасты, гели и окклюзирующего устройства. Кремами и мазями могут быть вязкие жидкие или полутвердые эмульсии типа масло-в-воде или вода-в-масле. Также могут подходить пасты, состоящие из абсорбирующих порошков, диспергированных в нефтяной или гидрофильной нефти, содержащей активный ингредиент. Для высвобождения активного ингредиента в кровоток можно использовать множество окклюзирующих устройств, таких как полупроницаемая мембрана, покрывающая резервуар, содержащий активный ингредиент с носителем или без него, или матрицу, содержащую активный ингредиент.

Композиции суппозиториев могут быть изготовлены из традиционных материалов, включая масло какао, с добавлением или без добавления восков для изменения температуры плавления суппозитория и глицерина. Могут также использоваться водорастворимые основания для суппозиториев, такие как полиэтиленгликоли с различными молекулярными массами.

Материалы и способы получения различных составов известны в данной области и могут быть адаптированы для осуществления настоящего изобретения. Подходящие составы для доставки антител можно найти, например, в «Remington's Pharmaceutical Sciences», EW Martin, 18th Ed., 1990, Mack Publishing Co .: Easton, PA.

B. Дополнительные биологически активные агенты

В некоторых воплощениях антитело против клаудина-1 или его биологически активный фрагмент является единственным активным ингредиентом в фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В других воплощениях фармацевтическая композиция дополнительно содержит один или несколько биологически активных агентов. Примеры подходящих биологически активных агентов включают, без ограничения указанным, терапевтические агенты, такие как антивирусные агенты, противовоспалительные агенты, иммуномодулирующие агенты, анальгетики, противомикробные агенты, ингибиторы киназы, ингибиторы передачи, антибактериальные средства, антибиотики, антиоксиданты, антисептики агенты и их комбинации.

В таких фармацевтических композициях антитело против клаудина-1 и дополнительный терапевтический агент (агенты) можно комбинировать в одном или нескольких препаратах для одновременного, раздельного или последовательного введения антитела против клаудина-1 и терапевтического агента (ов). Более конкретно, композиция согласно изобретению может быть сформулирована таким образом, что антитело и терапевтический агент(ы) могли вводиться вместе или независимо друг от друга. Например, антитело против клаудина-1 и терапевтический агент могут быть составлены вместе в одной композиции. В ином случае, они могут содержаться (например, в разных составах и/или контейнерах) и вводиться отдельно.

C. Фармацевтические упаковки наборов

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической упаковке или набору, содержащему один или несколько контейнеров (например, флаконов, ампул, пробирок, колб или бутылок), содержащих один или несколько ингредиентов фармацевтической композиции по изобретению, что позволяет вводить антитело против клаудина 1 или его биологически активный фрагмент.

Различные ингредиенты фармацевтической упаковки или набора могут поставляться в твердой (например, лиофилизированной) или жидкой форме. Каждый ингредиент, как правило, представлен в виде аликвоты в соответствующем контейнере или в концентрированной форме. Фармацевтические упаковки или наборы могут включать средства для восстановления лиофилизированных ингредиентов. Отдельные контейнеры наборов предпочтительно тесно расположены для коммерческой продажи.

В некоторых воплощениях фармацевтическая упаковка или набор включает один или несколько дополнительных терапевтических агентов, как описано выше. Необязательно связанным с контейнером (контейнерами) может быть информационное сообщение или листок-вкладыш в форме, предписанной правительственным учреждением, регулирующим производство, использование или продажу фармацевтических или биологических продуктов, которая отражает разрешение агентства по производству, использованию или продаже на введение людям. Уведомление листка-вкладыша может содержать инструкции для применения фармацевтической композиции в соответствии с описанными в данном документе способами лечения.

В наборе или на наборе может присутствовать идентификатор, например, штрих-код, радиочастота, идентификационные метки и т.д. Идентификатор может использоваться, например, для уникальной идентификации набора для целей контроля качества, инвентаризации, отслеживания движения между рабочими станциями и т.д.

Примеры

Следующие примеры описывают некоторые из предпочтительных способов изготовления и осуществления настоящего изобретения. Однако следует понимать, что примеры приведены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема изобретения. Кроме того, за исключением случаев, когда описание в примере представлено в прошедшем времени, текст, как и все остальное описание, не предполагает, что эксперименты действительно выполнялись или данные фактически были получены.

Некоторые из приведенных ниже результатов представлены в рукописи: T. Baumert et al., “A Claudin-1-specific Monoclonal Antibody for Prevention and Treatment of Hepatocellular Carcinoma”, которая была представлена для публикации.

Пример 1

Материалы и методы

Реагенты и антитела. Моноклональные антитела против клаудина-1 (mAb против CLDN1 были получены, как описано ранее (Fofana et al., Gastroenterology, 2010, 139: 953-964, e1-4). Эрлотиниб был приобретен у IC Laboratories; а интерферон-альфа 2а у Roche. Даклатасвир и софосбувир были синтезированы Acme Biosciences. Пиоглитазон, метформин и DMSO были приобретены у Sigma-Aldrich. Набор Phospho-RTK Array был получен от R & D Systems. Реагенты ECL и Hyperfilms были приобретены у GE Healthcare. IgG Alexa -Fluor ® 647 против мышиного (коза) и IgG Alexa-Fluor ® 647 против человеческого (коза) были приобретены у Jackson ImmunoResearch. DAPI был получен у Life Technologies.

Клеточные линии. Клетки Huh7.5.1 были описаны ранее (Zhong et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102 (26): 9294-9299). Для задержки пролиферации и дифференцировки (клеток Huh7.5.1dif), от 2.5.104 до 3.104 клеток Huh7.5.1 культивировали в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 1% диметилсульфоксида (DMSO).

Заражение HCV клеток Huh7.5.1.dif. HCVcc Jc1 из клеточной культуры (генотип 2a/2a) (Pietschmann et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103 (19): 7408-7413) получали в клетках Huh7.5.1, как описано ранее (Wakita et al. ., Nat Med., 2005, 11 (7): 791-796). Инфекционность HCVcc определяли путем вычисления дозы заражения 50% культуры ткани (TCID50) в экспериментах по инфекции, как описано ранее (Lindenbach et al., Science, 2005, 309 (5734): 623-626). Инфекцию HCV оценивали с помощью qRT-PCR внутриклеточной РНК HCV (Xiao et al., Gut, 2015, 64 (3): 483-494), а также путем иммуноокрашивания с использованием специфического к HCV E2-специфического антитела AP33, как описано ранее (Krieger et al., Hepatology. 2010, 51(4): 1144-1157).

Транскрипционный анализ. Клетки печени лизировали в TRI-реагенте (Molecular Research Center), а РНК очищали с помощью набора Direct-zol RNA MiniPrep (Zymo Research) в соответствии с инструкциями производителя. Количество и качество РНК оценивали с использованием NanoDrop (ThermoScientific) и Bioanalyzer 2100 (Illumina). Профиль экспрессии генов определяли с использованием 250-500 нг общей РНК с помощью системы nCounter Digital Analyzer (NanoString).

Анализ фосфорилирования. Анализ фосфорилирования проводили с использованием Proteome Prolifer Human Phospho-kinase Array (R & D Systems), как описано ранее изготовителем. Для визуализации блоты инкубировали с ECL (GE Healthcare) и подвергали воздействию ECL Hyperfilm (GE Heathcare). Результаты анализа фосфокиназной активности определяли количественно путем интегрирования плотности дот-блоттинга с использованием программного обеспечения Image J (NIH).

Влияние антивирусов и малых молекул на сигнатуру риска HCC. Через семь (7) дней после инфекции HCV Jc1, клетки Huh7.5.1dif инкубировали либо с комбинацией 1 нМ даклатасвира и 1 мкM софосбувира; 10 МЕ/мл интерферона-альфа 2а; 1, 10 или 100 мкг/мл CLDN1-специфического mAb; или 0,1 мМ эрлотиниба в присутствии 1% DMSO. Клетки, инкубированные с 1% DMSO, служили отрицательным контролем. Через три (3) дня после обработки клетки лизировали, общую РНК очищали, как описано выше, и анализировали экспрессию гена и внутриклеточную вирусную нагрузку, как описано выше.

Биоинформационный и статистический анализ. Прогнозирование клинического исхода, основанного на сигнатуре 186 генов, было выполнено, как сообщалось ранее, с использованием алгоритма предсказания ближайшего шаблона, который был реализован в GenePattern (King et al., Gut, 2014, 20. pii: gutjnl-2014-307862. Doi : 10.1136/gutjnl-2014-307862; Hoshida et al., PLoS ONE, 2010, 5 (11), e15543). Прогноз генной сигнатуры выского или низкого риска HCC определяли с использованием p <0,05 и FDR <0,25. Индукцию/супрессию каждого гена, в зависимости от времени, в соответствии с инфекцией HCV Jc1 и неинфицированным контролем, оценивали с помощью модулей GSEA и GSEA одиночного образца (ssGSEA), реализованных в GenePattern, как описано ранее (Subramanian et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102 (43): 15545-15550, Barbie et al., Nature, 2009, 462 (7269): 108-112). Анализ обогащения пути проводили с использованием ToppGene Suite (вэб-страница: toppgene.cchmc.org), как описано ранее (Chen et al., Nucleic Acids Res., 2009, 37 (Web Server issue): W305-311). Анализы генов nCounter рассматривались как значимо экспрессированные с помощью t-теста FDR <0,05 и кратных изменений ± 1,8. Используя дифференциально экспрессируемые гены, проводили анализ сетей с использованием канонических путей из репозитория Ingenuity Knowledge Base (Ingenuity Systems Inc.).

Результаты

186-генная сигнатура HCC. В настоящем исследовании используется 186-генная сигнатура риска HCC в незлокачественной ткани печени, которая, как было показано, сильно ассоциирована с предиктивным риском HCC у пациентов с циррозом, вызванным вирусом гепатита C (HCV), вирусом гепатита B (HBV) и алкоголизмом (Hoshida et al., N Engl J Med., 2008, 359 (19): 1995-2004; Hoshida et al., Gastroenterology. 2013, 144(5): 1024-1030; King et al., Gut, 2014, 20. pii: gutjnl-2014-307862. doi: 10.1136/gutjnl-2014-307862; King et al., PLoS ONE, 2014, 9(12): e114747) во многих независимых группах азиатских, европейских и американских пациентов с циррозом и HCC, вызванных разнообразными этиологиями, на основании вплоть наблюдения до 23 лет. Эта генная сигнатура включала 73 гена высокого риска HCC в печени, которые были положительно регулированы, и 103 гена низкого риска HCC, которые были отрицательно регулированы в тканях печени (Hoshida et al., Gastroenterology. 2013, 144(5): 1024-1030).

Анализ молекулярных путей показал, что хроническая инфекция HCV в печени человека усиливает активацию NF-κB, интерлейкина-6, а также путей эпидермального фактора роста (EGF) и генов, связанных с репарацией ДНК (Hernandez-Gea et al., Gastroenterology, 2013, 144 (3): 512-527). Сигнатура продемонстрировала существенную превосходную прогностическую способность (Hoshida et al., J Hepatol., 2014, 61 (1S): S79-S90) по сравнению с прогностическими вариантами ДНК, выявленными в крупномасштабных исследованиях «случай-контроль» или групповых исследованиях (Kumar et al., Nat Genet., 2011, 43 (5): 455-458, Miki et al., Nat Genet., 2011, 43 (8): 797-800; Abu Dayyeh et al., Gastroenterology, 2011, 141 (1): 141-149). В моделях грызунов с обусловленной циррозом HCC, сигнатура была индуцирована на очень ранней стадии фиброза печени и обращалась под воздействием одобренного FDA ингибитора EGF-пути эрлотиниба, сопровождаясь снижением фиброза печени и узлов HCC (Fuchs et al., Hepatology, 2014, 59 (4): 1577-1590).

Таким образом, 186-генная сигнатура риска HCC представляет собой ценный инструмент для мониторинга прогресса HCC и для понимания того, какие пути играют роль в развитии HCC. Воспользовавшись этим наблюдением, авторы недавно разработали простую и надежную систему на основе клеток печени с индуцируемой 186 генной сигнатурой риска HCC. Сигнатура высокого риска HCC была индуцирована устойчивой инфекцией HBV, инфекцией HCV или воздействием этанола. Используя эту модель, авторы определили драйверы сигнатуры высокого риска HCC, включая сигнальный путь EGFR, и показали обращение сигнатуры высокого риска HCC эрлотинибом (S. Bandiera et al., (S. Bandiera et al., “A cell-based model unravels drivers for hepatocarcinogenesis and targets for clinical chemoprevention”, которая была представлена для публикации в Nature Medicine 12 марта 2015 года. Эта модель на основе клеток позволяет разгадать клеточные схемы прогрессирования заболевания печени у пациентов и идентифицировать целевые показатели хемопротективных мишеней HCC для клинической оценки.

Было обнаружено, что CLDN1-специфичное mAb обращает сигнатуру экспрессии генов высокого риска HCC в модели на основе клеток печени для прогрессии заболевания печени и гепатокарциногенеза. Для того чтобы оценить роль анти-CLDN1 mAb при химиопрофилактике HCC, авторы использовали ранее разработанные модели, основанные на плохо пролиферирующих клетках Huh7.5.1 (Huh7.5.1dif), в которых HCC-связанная 186-генная сигнатура может быть легко индуцирована при экспонировании рекомбинантному HCV (штамм Jc1 - Bauhofer et al., Gastroenterology, 2012, 143 (2): 429-438 e8) (см. Фигуру 1A). CLDN1 специфичные mAb добавляли к клеткам Huh7.5.1dif через 7 дней после инокуляции вируса, во временной точке, при которой подавляющее большинстве клеток устойчиво инфицировалось HCV, что оценивалось с помощью иммуногистохимического анализа (см Фигуру 1В). Эртолиниб использовался в качестве положительного контроля для обращения генной сигнатуры. Эффект обработки CLDN1-специфичным mAb на экспрессию HCV-индуцированной HCC-связанной 186-генной сигнатуры затем оценивали с использованием технологии цифрового подсчета транскриптов (nCounter assay) (Hoshida et al., N Engl J Med., 2008, 359 (19): 1995-2004; King et al., Gut, 2014, 20. pii: gutjnl-2014-307862. Doi: 10.1136/gutjnl-2014-307862). Анализ представленности групп генов (GSEA) показал, что гены высокого риска HCC были сильно подавлены (NES: -2,29, FDR <0,001), а гены низкого риска HCC были значительно индуцированы (NES: 1,73, FDR <0,001) в образцах, обработанных CLDN1-специфичным mAb. Кроме того, с помощью вычислительного анализа с использованием модели прогнозирования HCC, которая применяет алгоритм ближайшего шаблона (Hoshida et al., PLoS ONE, 2010, 5 (11): e15543), заявители продемонстрировали статистически значимое обращение 186-генной сигнатуры во всех устойчиво инфицированных HCV образцах после обработки CLDN1-специфичным mAb (см. Таблицу 1 ниже).

Таблица 1. Модель прогноза HCC показывает обращение генов высокого риска HCC после CLDN1-специфичного mAb. Клетки Huh7.5.1dif были инфицированы HCV Jc1. Общую клеточную РНК выделяли и подвергали анализу NanoString. Данные экспрессии генов были подвергнуты прогнозу ближайшего шаблона (NTP) 186-генной сигнатуры риска HCC в HCV-инфицированных клетках Huh7.5.1dif, обработанных 10 и 100 мкг/мл CLDN1-специфичного mAb, при этом анализ проводили с использованием GenePattern. Были получены карты интенсивностей (данные не показаны). Был дан прогноз для HCV-инфицированных (Ctrl) и обработанных (CLDN1_10 или CLDN1_100) клеток как имеющих высокий риск и низкий риск HCC. Ниже приводятся статистические показатели NTP. Значения FDR p <0,05 считались значимыми.

10 мкг/мл	10 мкг/мл
Образец	р-значение	Образец	р-значение
CTRL_10_3	0,0005	CTRL_100_3	0,0005
CTRL_10_2	0,0005	CTRL_100_2	0,0005
CTRL_10_1	0,008	CTRL_100_1	0,0075
CLDN1_10_2	0,0005	CLDN1_100_2	0,004
CLDN1_10_3	0,0005	CLDN1_100_1	0,0055
CLDN1_10_1	0,0005	CLDN1_100_3	0,001

Было обнаружено, что CLDN1-специфичное mAb обращает 186-генную сигнатуру риска HCC в клетках более эффективно, чем антивирусные препараты прямого действия, и соединения-кандидаты, хемопревентивные в отношении HCC. Поразительно, что эффект CLDN1-специфичного mAb был более сильным, чем в случае эрлотиниба, который приводил к частичной супрессии генов высокого риска HCC (NES: -1,28, FDR = 0,08) и индукции генов низкого риска HCC (NES: 1,26, FDR = 0,09) (см. Фигуру 1С).

Чтобы дополнительно оценить эффективность CLDN1-специфичного mAb при реверсии генной сигнатуры риска HCC, авторы сравнили его эффекты с эффектами антивирусных препаратов прямого действия (DAA), интерферона альфа и пиоглитазона, соединений, которые ранее были показаны заявителями с помощью GSEA как частично подавляющие гены высокого риска HCC. Метформин, соединение, которое ранее было показано, как не демонстрирующее какого-либо влияния на сигнатуру риска HCC, использовалось в качестве отрицательного контроля. Настоящие заявители обнаружили, что CLDN1-специфичное mAb обращает гены высокого риска HCC более эффективно, чем другие тестируемые соединения (см. Фигуру 2A). Следует отметить, что в отличие от DAA, подавление генов высокого риска НСС, индуцированное CLDN1-специфичным mAb, оказалась независимой от его влияния на вирусную нагрузку, поскольку очень низкая концентрация этого моноклонального антитела, которая не модулирует вирусную нагрузку в клетках Huh7.5.1dif, была эффективной в обращении 186-генной сигнатуры (см. Фигуру 2В).

В совокупности эти данные указывают на то, что CLDN1-специфичное mAb эффективно обращает сигнатуру риска HCC, вызванной HCV, независимо от его антивирусного эффекта.

Было установлено, что CLDN1-специфичное mAb нарушает сигнальный путь EGF-MAPK как драйвера гепатокарциногенеза. Авторы ранее показали, что HCV использует EGFR и клаудин-1 в качестве факторов зависимости хозяина, для входа в гепатоцит в культуре клеток и in vivo (Mailly et al., Clearance of persistent hepatitis C virus infection using a claudin-1-targeting monoclonal antibody, Nat Biotech, 2015, 33(5): 549-554; Lupberger et al., Hepatology, 2013, 58(4): 1225-1235; Lupberger et al., Nat Med., 2011, 17(5): 589-559; Zona et al., Cell Host Microbe, 2013, 13(3): 302-313). Чтобы оценить, использует ли HCV не только эксплоиты EGFR и CLDN1 для входа, но также инициирует ли внутриклеточные сигнальные каскады, авторы исследовали вирус-индуцированные сигнальные пути в инфицированных вирусом клетках печени. Воспользовавшись новой модельной системой для изучения биологии болезни HCV (см. Фигуру 1), они провели скрининг состояния активации канонических сигнальных путей гепатоцитов, как описано ранее (Lupberger et al., Hepatology, 2013, 58 (4): 1225-1235, Lupberger et al., Nat Med., 2011, 17 (5): 589-59; Zona et al., Cell Host Microbe, 2013, 13 (3): 302-313). Они отметили, что инфекция HCV вызывает активацию специфических сетей передачи сигналов в хозяине, включая EGFR-путь, как показано фосфорилированием EGFR, вызванным вирусом (см. Фигуры 3A-B), повышенной экспрессией EGF и EGFR и значительной индукцией экспериментально определенных сигнатур генов-мишеней EGF (см. Фигуру 3C). Интересно отметить, что индукция пути EGF/EGFR наблюдалась также в инфицированных HBV клетках, а также в клетках, обработанных этанолом, хотя и на более низком уровне (см. Фигуру 3D-E).

Анализ нижележащих сигнальных путей выявил вызванное HCV фосфорилирование киназы, регулируемой внеклеточными сигналами (ERK) (см. Фигуру 3F). Поскольку путь EGFR был идентифицирован как сильно связанный с гепатокарциногенезом у пациентов (Hoshida et al., N Engl J Med., 2008, 359 (19): 1995-2004; Hoshida et al., Gastroenterology, 2013, 144 (5 ): 1024-1030, King et al., Gut, 2014, 20. pii: gutjnl-2014-307862. doi: 10.1136/gutjnl-2014-307862; King et al., PLoS ONE, 2014, 9 (12): e114747, Abu Dayyeh et al., Gastroenterology, 2011, 141 (1): 141-149), и является драйвером HCC на животных моделях (Fuchs et al., Hepatology, 2014, 59 (4): 1577-1590; Lanaya et al, Nat Cell Biol., 2014, 16 (10): 972-981, 1-7), вполне вероятно, что индуцированная вирусом активация путей EGFR-ERK1/2 способствует гепатокарциногенезу. Важно отметить, что смешанные данные показывают, что mAb против клаудина-1 ингибирует передачу сигналов ERK1/2 (см. Фигуру 3F). Значительное подавление экспрессии генов EGFR-пути наблюдалось также при анализе онкогенных сигнатур EGFR при раке (см. Фигуру 3G). GSEA одиночного образца (ssGSEA) показал подавление сигналов EGFR и связанных с EGFR генов даже при низких дозах CLDN1-специфичного антитела (данные не показаны). Причастность EGFR-пути была дополнительно подтверждена анализом сети дифференциально экспрессируемых генов, который показал супрессию EGFR- (см. Фигуру 4A) и MAPK-сигнальных путей (см. Фигуру 4B).

Было обнаружено, что CLDN1-специфичное mAb нарушает экспрессию генов, связанных с заболеванием печени, а также генов воспалительного ответа, которые являются драйверами гепатокарциногенеза. Кроме того, анализ функционального обогащения дифференциально экспрессированных генов показал, что гены воспалительной реакции, включая сигнальные пути NF-κB, EBV, LMP1, MyD88 и TLR, были снижены, как показано в части A таблицы 2 ниже) и на Фигуре 5, тогда как экспрессия генов, участвующих в метастатических путях, была повышена (см. часть В таблицы 2 ниже).

Таблица 2. Обработка CLDN1-специфичным mAb подавляет связанные с воспалением гены и индуцирует гены, связанные с метаболизмом. Клетки Huh7.5.1dif инфицировали HCV Jc1. После выделения общая РНК была подвергнута анализу NanoString. Значения интенсивности экспрессии были нормированы и логарифмически преобразованы. Дифференциально экспрессируемые гены имеют р-значения FDR <0,05 и кратное изменение ± 1,9. Анализ путей проводили с использованием ToppGene Suite A. Отрицательно регулируемые гены были связаны с сигнальными путями MAPK, NF-κB и Toll-подобных рецепторов, тогда как B. положительно регулируемые гены относятся к метаболическим путям.

	р-значение	FDR q-значение
A. Пути отрицательно регулируемых генов
Индукция киназ NFkB и MAP	8,75E-05	2,02E-02
Каскад, зависимый от MyD88	9,81E-05	2,02E-02
Каскад толл-подобного рецептора 7/8 (TLR7/8)	9,81E-05	2,02E-02
Каскад толл-подобного рецептора 9 (TLR9)	1,22E-04	2,02E-02
Каскад толл-подобного рецептора 3 (TLR3)	1,83E-04	2,02E-02
Сигнальный путь EBV LMP1	2,24E-04	2,16E-02
Фосфорилирование CREB	6,11E-04	4,28E-02
B. Пути положительно регулируемых генов
Дыхательный электронный транспорт	5,77E-09	2,06E-06
Цикл лимонной кислоты (TCA)	7,50E-09	2,06E-06
Метаболизм белков	1,11E-05	5,57E-04
Регулирование каскада комплемента	3,01E-04	1,10E-02
протеасомный комплекс	6,23E-04	2,14E-02
Реутилизация пуринового нуклеотида	1,66E-03	4,14E-02
Биосинтез пуриновых нуклеотидов de novo	1,66E-03	4,14E-02

Интересно отметить, что восемь (8) из девяти (9) генов, которые, как было показано ранее, были индуцированы различными драйверами HCC, включая обработку HCV, HBV или этанолом (см. Bandiera et al., “A cell-based model unravels drivers for hepatocarcinogenesis and target for clinical chemoprevention”, который был подан авторами для публикации в Nature Medicine 12 марта 2015 г.), были подавлены после обработки CLDN1-специфичным mAb (см. Таблицу 3 ниже). Наконец, авторы показали, что антитело, специфичное к клаудину-1, подавляет экспрессию генов, участвующих в заболеваниях печени (см. Фигуру 6).

Таблица 3. Терапия с CLDN1-специфичным mAb снижает регуляцию генов, обычно индуцируемых различными HCC-драйверами, включая HCV и HBV-инфекцию и обработкой этанолом. Статистические показатели, FDR p-значения <0,05 считались значимыми.

Обозначение гена	Название гена	FDR р-значение	Кратное изменение
ANXA3	Аннексин А3	0,001	-1,92
FILIP1L	подобный белку 1, взаимодействующему с Филамином А	0,0014	-1,92
DUSP5	Фосфатаза 5 с двойной специфичностью	0,002	-1,94
ANXA1	Аннексин А1	0,005	-1,93
EGF	Эпидермальный фактор роста	0,005	-1,94
SLC12A2	представитель 2 семейства 12 траспортеров растворенных веществ (натрий/калий/хлоридный транспортер)	0,006	-1,95
PODXL	подокаликсин-подобный	0,022	-1,95
LOXL2	подобный лизил-оксидазе, 2	0,036	-1,93

В совокупности эти данные указывают на то, что CLDN1-специфичное mAb обращает риск гепатокарциногенеза, вероятно, нарушая сигнализацию EGF-MAPK и экспрессию генов воспалительного ответа.

Обсуждение

В настоящем исследовании авторы показали, что CLDN1, хорошо охарактеризованный фактор входа HCV и противовирусная мишень для профилактики и лечения инфекции HCV, является ранее необнаруженной целью профилактики и лечения HCC. Они продемонстрировали, что CLDN1-специфичное mAb реверсирует гены высокого риска HCC в модельной системе на основе клеток печени, где сигнатура риска HCC, общая для разных этиологий, была вызвана персистирующей HCV-инфекцией. Примечательно, что специфическое для CLDN1 моноклональное антитело более эффективно меняло эту сигнатуру риска HCC, чем любые другие противовирусные препараты (антивирусные препараты прямого действия, интерферон альфа) или потенциальные HCC-химиопревентивные агенты (эрлотиниб, пиоглитазон), которые протестировали авторы. Было обнаружено, что специфическое для CLDN1 mAb способно реверсировать сигнатуру риска HCC при концентрациях, которые не влияют на нагрузку HCV, демонстрируя, что CLDN1-специфичное mAb может предотвращать прогрессирование HCC независимо от его эффекта в качестве противовирусного агента и, таким образом, проявляет широкую HCC-хемопротекторную активность независимо от лежащей в основе этиологии. Действительно, настоящие авторы показали, что CLDN1-специфичное mAb меняет экспрессию 8 из 9 генов, обычно индуцированных различными этиологиями HCC, за исключением GPX2. В совокупности эти данные подчеркивают перспективность CLDN1 в качестве мишени для химиопрофилактики HCC.

Экспрессия CLDN1 возрастает в ходе HCC, в частности, у пациентов с цирротической печенью (Stebbing et al., Oncogene, 2013, 32 (41): 4871-4872), и было показано, что она способствует эпителиально-мезенхимному переходу (EMT), на ранней стадии прогрессирования опухоли. Основной молекулярный механизм может включать внутриклеточные сигнальные каскады ниже CLDN1 главным образом посредством активации оси c-Abl-PKC-ERK1/2, которая способствует эпителиально-мезенхимному переходу (EMT) посредством активации MMP-2 (Suh et al., Oncogene, 2013, 32 (41): 4873-4882; Yoon et al., J Biol Chem., 2010, 285 (1): 226-233). Действительно, в настоящем исследовании заявители показали, что CLDN1-специфичное mAb нарушает сигнализацию EGFR/MAPK (см. Фигуру 3F, G), драйвера гепатокарциногенеза (Fuchs et al., Hepatology, 2014, 59 (4): 1577- 1590; Lanaya et al., Nat Cell Biol., 2014, 16 (10): 972-981, 1-7). В дополнение к этим наблюдениям анализ функционального обогащения показал, что CLDN1-специфичное mAb подавляет экспрессию путей, связанных с EGF (см. Фигуру 4A) и сигнализацию MAPK (см. Фигуру 4B). Кроме того, показано, что подавляется воспалительный путь NF-KB (см. Фигуру 5). Этот путь играет важную роль в усугублении поражения печени путем стимулирования воспалительных реакций в фиброзной печени и способствует прогрессированию HCC и метастазированию на более поздней стадии (Ning et al., Hepatology, 2014, 60 (5): 1607-1619; Shen et al., Hepatology, 2014, 60 (6): 2065-2076; Song et al., Hepatology, 2014, 60 (5): 1659-1673). Кроме того, несколько путей, принадлежащих к сигнальному пути MyD88, основного игрока в передаче сигнала толл-подобного рецептора, а также пути TLR7 и 9 отрицательно регулировались после обработки CLDN1-специфичным mAb (см. Часть A таблицы 1 выше). Ранее предполагалось, что эти пути были потенциальными терапевтическими мишенями HCC, поскольку они играют роль в индуцировании воспалительных реакций во время HCC (Leake et al., Nat Rev Gastroenterol Hepatol., 2014, 11 (9): 518; Mohamed et al., Liver Int., 2015, 64 (3): 483-494).

Принимая во внимание способность CLDN1-специфичного mAb к обращению сигнальных путей (см. Фигуры 1-3) и воспалительных реакций, приводящих к гепатокарциногенезу (см. Фигуры 3-5) (Fuchs et al., Hepatology, 2014, 59 (4): 1577-1590 Suh et al., Oncogene, 2013, 32 (41): 4873-4882, Stebbing et al., Oncogene, 2013; 32 (41): 4871-4872; Song et al., Hepatology, 2014, 60 (5): 1659-1673, Fortier et al., J Biol Chem., 2013, 288 (16): 11555-11571), а также подавлению хорошо охарактеризованной сигнатуры генов риска HCC (см. Фигуру 2), связанной с прогрессированием заболевания печени (Hoshida et al., N Engl J Med., 2008, 359 (19): 1995-2004; Hoshida et al., Gastroenterology, 2013, 144 (5): 1024-1030; King et al., Gut, 2014, 20. pii: gutjnl-2014-307862. doi: 10.1136/gutjnl-2014-307862; King et al., PLoS ONE, 2014, 9 (12): e114747; Abu Dayyeh et al., Gastroenterology, 2011, 141 (1): 141-149, Fuchs et al., Hepatology, 2014, 59 (4): 1577-1590), CLDN1-специфичное mAb подходит для профилактики и лечения HCC. Учитывая его способность обращать сигнатуру генов риска HCC независимо от этиологии и независимо от его антивирусного эффекта, открывает возможности использовать CLDN1-специфичные mAb для предотвращения и лечения HCC независимо от этиологической причины, включая пациентов с вылеченной HCV-инфекцией, и пациентов с HCC из-за хронической инфекции вирусом гепатита B, алкоголя, неалкогольной жировой дистрофии печени (NAFLD) или аутоиммунной или наследственной болезни печени.

Пример 2

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные линии. Клетки из клеточной линии Huh7.5.1 (Zhong et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102 (26): 9294-9299) культивировали в среде Игла, модифицированного Дульбекко (DMEM), содержащей 1% диметилсульфоксида (DMSO) для дифференцировки (Huh7.5.1dif). NTCP-сверхэкспрессирующие клетки HepG2 (HepG2-NTCP) отбирали с использованием пуромицина и культивировали в DMEM (Ni et al., Gastroenterology, 2014, 146: 1070-1083, Yan et al., ELife, 2012; 1: e00049).

Инфицирование HCV и обработка CLDN1-специфичным mAb. Клетки Huh7.5.1dif высевали в 6-луночные планшеты и инфицировали HCVcc Jc1 (генотип 2а/2а) (Pietschmann et al., PNAS USA, 2006, 103: 7408-7413; Wakita et al., Nature medicine. 2005, 11(7): 791-796). CLDN1-специфичное mAb или контрольное Ab (10 мкг/мл) добавляли на 7-й день после инфицирования. Инфекцию HCV оценивали на 10-й день с помощью qRT-PCR внутриклеточной РНК, как описано ранее (Xiaa et al., PLoS pathogens. 2014, 10(5): e1004128).

Инфицирование HBV и обработка CLDN1-специфичным mAb. Клетки HepG2-NTCP высевали в 12-луночные планшеты и заражали либо рекомбинантным HBV (штамм ayw, генотип D) (Ladner et al., Antimicrobial agents and chemotherapy, 1997, 41 (8): 1715-20), либо очищенным из сыворотки HBV (Habersetzer et al., Liver international: Official Journal of the International Association for the Study of the Liver, 2015, 35(1): 130-139). Человеческое CLDN1-специфичное mAb или контрольное Ab (10 мкг/мл) добавляли на 7 день после инфекции. Через 7 дней после инфекции в течение 3 дней добавляли крысиное mAb против CLDN1 или контрольное Ab (10 мкг/мл). HBV-инфекцию оценивали на 7-й или 10-й день после инфицирования с помощью qRT-PCR-количественной оценки предгеномной РНК HBV (pgRNA), как описано ранее (Verrier et al., Hepatology, 2016, 63 (1): 35-48).

Обработка этанолом. клетки Huh7.5.1dif высевали в 6-луночные планшеты и подвергали воздействию этанола (40 мМ) и обрабатывали CLDN1-специфичным или контрольным Ab (10 мкг/мл) в течение 10 дней. Свежую среду, содержащую этанол и антитела, ежедневно заменяли (Ye et al., Drug and alcohol depend, 2010, 112 (1-2): 107-116).

Транскрипционный анализ. См. Пример 1 на предмет подробностей. Экспрессию генной сигнатуры риска HCC анализировали с использованием Biomark HD, высокопроизводительной RT-PCR-технологии (Baker et al., Nature Med., 2012, 9 (6): 541-544). Экспрессию генов, регулируемых ЕМТ, оценивали с помощью тестов qRT-PCR Taqman Gene Expression (Life Technologies, США). Уровни экспрессии были нормализованы по GAPDG. Относительную экспрессию рассчитывали с использованием метода ΔΔCt.

Биоинформационный и статистический анализ. Контроль индукции/подавления генной сигнатуры высокого риска или низкого риска оценивали с помощью GSEA с FDR <0,25 или с использованием показателей обогащения (ES) для отдельных генов и нормированных показателей обогащения (NES) для наборов генов (Subramanian et al., PNAS USA, 20005, 102 (43): 15545-15550).

Метаболомика. HCV-инфицированные клетки Huh7.5.1dif обрабатывали CLDN1-специфичным mAb на 7 -й день после заражения. На 10-й день после инфицирования метаболиты экстрагировали и анализировали с помощью масс-спектрометрии. Данные анализировали с использованием MetaboAnalyst 3.0 (Xia et al., Nucleic acid Research, 2015, 43 (W1): W251-W257).

Результаты

CLMA1-специфичные mAb обращают пан-этиологичную 32-генную сигнатуру риска HCC пациента в модели на основе HBV-инфицированных клеток печени. Чтобы оценить эффективность mAb против CLDN1 при предотвращении HCC, вызванной этиологиями, отличными от инфекции HCV, заявители далее оценили их способность обращать гены риска HCC, модулированные инфекцией HBV. Недавно было показано, что 32-генная сигнатура, полученная из ранее описанной 186-генной сигнатуры риска HCC, имеет наибольшую значимость при прогнозировании прогресса заболевания печени и развития HCC во всех основных этиологиях HCC (HCV, HBV, алкоголь и NASH) (King et al., Gut, 2014, 64 (8): 1296-1302). Печеночные клетки HepG2, сверхэкспрессирующие NTCP, основные клетки для проникновения HBV, инфицировали HBV и обрабатывали человеческими CLDN1-специфичными или контрольными mAb в течение 7 дней (Фигура 7A). Обработка CLCl1-специфичным mAb человека приводила к индукции экспрессии генов низкого риска HCC и подавлению генов высокого риска HCC (Фигура 7C). Эти результаты показывают, что специфичные к CLDN1 mAb реверсируют экспрессию генов риска HCC, индуцированных инфекцией HBV, и предполагают, что специфичные к CLDN1 mAb могут проявлять хемопревентивную активность против HCC, индуцированной HBV.

CLDN1-специфичные mAb реверсируют пан-этиологичную 32-генную сигнатуру высокого риска HCC пациента в модели на основе клеток печени, обработанных этанолом. Далее, чтобы определить потенциал анти-CLDN1 mAb для профилактики HCC, вызванной потреблением алкоголя, заявители оценивали способность антитела реверсировать гены риска HCC, модулированные путем 10-дневной экспозиции этанолу клеток Huh7.5.1dif (Фигура 8A). Таким образом, они исследовали, может ли 32-генная сигнатура риска HCC (King et al., Gut, 2014, 64(8): 1296-1302) обращаться в клетках Huh7.5.1dif после обработки с помощью CLDN1- специфичных mAb обработанных этанолом клеток. Обработка mAb, специфичным к CLDN1 человека, приводила к индукции экспрессии генов низкого риска HCC и подавлению экспрессии генов высокого риска HCC в клетках, обработанных этанолом (Фигура 8B). Эти результаты указывают на то, что специфичные к CLDN1 mAb обращают генную экспрессию генов риска HCC, индуцированную воздействием этанола, и предполагают, что специфичные к CLDN1 mAb могут проявлять хемопревентивную активность против HCC, вызванной потреблением алкоголя.

CLDN1-специфичное mAb обращает Варбург-подобный метаболический сдвиг, связанный с повышенным риском рака и раком в модели на основе клеток печени. Масс - спектрометрическое профилирование метаболитов в HCV Jc1-инфицированных клетках Huh7.5.1dif выявило изменение стационарных пулов метаболитов в гепатоцитах, в том числе выраженное влияние на лактат. Кроме того, анализ метаболического мечения продемонстрировал повышение притока лактата в гепатоциты, инфицированные HCV Jc1 - известный Варбург-подобный метаболический сдвиг, связанный со злокачественной трансформацией и раком (Cantor et al., Cancer discovery, 2012, 2 (10): 881- 898). Для того, чтобы оценить, способно ли mAb, специфичное к CLDN1 человека реверсировать этот метаболический сдвиг, связанный с повышенным риском рака и раком, клетки Huh7.5.1dif, устойчиво инфицировали вирусом гепатита С, затем обрабатывали гуманизированным CLDN1-специфичным mAb перед анализом метаболитов с помощью по масс-спектрометрии (Фигура 9А). Метаболический профиль кластеров клеток, обработанных CLDN1-специфичным mAb, с мок-инфицированными клетками, показал, что гуманизированное CLDN1-специфичное Ab отменяет индуцированный HCV метаболический сдвиг в клетках, полученных из печени (данные не показаны). Анализ метаболического мечения показал, что индуцированный HCV поток лактата восстанавливается до уровня неинфицированных клеток при обработке CLDN1-специфичным mAb (Фигура 9B). Кроме того, экспрессия нескольких метаболитов, принадлежащих циклу Кребса, была восстановлена до уровня их экспрессии в неинфицированных клетках после обработки CLDN1-специфичным mAb клеток, инфицированных HCV (Фигура 9C). В совокупности эти данные указывают на то, что CLDN1-специфичное mAb обращает связанные с метаболическим сдвигом злокачественную трансформацию и рак. Это говорит о том, что CLDN1-специфичное mAb может предотвращать злокачественную трансформацию гепатоцитов, а также лечить HCC.

Обработка CLDN1-специфичным mAb обращает регуляторы эпителиально- мезенхимального (ЕМТ) перехода. ЕМТ является ранней стадией метастазирования, в ходе которой злокачественные клетки теряют полярность и подвергаются перестройке белков цитоскелета и клеточных контактов (Lamouille et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2014, 15 (3): 178-196). Он индуцируется транскрипционными факторами Snail, Slug и Zeb1, которые связаны с инвазивностью опухоли (Nie et al., Oncogene, 2015, doi: 10.1038/onc.2015.428). Для дальнейшего изучения потенциала специфичного к CLDN1 mAb для предотвращения развития рака или лечения HCC заявители оценили способность гуманизированного CLDN1-специфичного mAb модулировать экспрессию генов, участвующих в ЕМТ. Клетки Huh7.5.1dif, устойчиво инфицировали HCV Jc1, а затем обрабатывали с помощью гуманизированного CLDN1-специфичного mAb (Фигура 10А) до оценки экспрессии генов, индуцируемых в ходе ЕМТ. Экспрессия SNAI1, SNAI2 и ZEB1 была снижена с помощью гуманизированного CLDN1-специфического mAb (Фигура 10B). Кроме того, гены, принадлежащие к 186-генной сигнатуре HCC и дисрегулированные в ходе ЕМТ (Anastassiou et al., BMC cancer. 2011; 11: 529; Medici et al., Molecular Biology of Cell, 2008, 19 (11): 4875-4887) были обращены при обработке CLDN1-специфичным mAb (Фигура 10C). Эти результаты показывают, что CLDN1-специфичное mAb обращает экспрессию генов, участвующих в ЕМТ, что позволяет предположить, что опосредованное CLDN1-специфичным mAb ограничение прогрессирования ЕМТ может способствовать предотвращению прогрессии развития HCC, а также лечению прогрессирующей HCC.

Заключение

В совокупности представленные в данном документе данные демонстрируют, что человеческие, крысиные и мышиные CLDN1-специфичные mAb обращают экспрессию генов сигнатуры риска HCC, которая надежно прогнозирует развитие заболевания печени и HCC у пациентов с различными этиологиями HCC. Было продемонстрировано функциональное влияние mAb на профилактику и лечение прогрессии заболевания печени и развитие HCC, тем, что обработка mAb привела к уменьшению экспрессии генов, участвующих в прогрессии ЕМТ, а также к обращении Варбург-подобного метаболического сдвига в клетках печени, связанных со злокачественной трансформацией и раком. Поскольку специфичные для CLDN1 mAb обращают экспрессию генов риска HCC, вызванную основными причинами HCC (инфекция HCV, инфекция HBV и этанол), mAb подходят для предотвращения и/или лечения HCC независимо от его этиологии, включая вирусные, метаболические и другие причины.

Пример 3

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

5-недельные самцы мышей C3H/He (Janvier Labs, Сен-Бертевен, Франция) получали одну внутрибрюшинную инъекцию диэтилнитрозамина (DEN, Sigma Aldrich, Сен-Кантен-Фаллавьё, Франция), хорошо зарекомендовавшей себя модели прогрессии болезни печени и HCC (Frey et al., Carcinogenesis, 2000, 21: 161-166). На 18-й неделе после инъекции две мыши были умерщвлены для того, чтобы оценить индукцию заболевания печени (Фигура 11А). Между неделями 18 и 23 оставшиеся мыши получали недельные внутрибрюшинные инъекции PBS или мышиного mAb против CLDN1 человека (20 мг/кг) в течение 5 недель (Фигура 11A). Через неделю после пятой инъекции mAb против CLDN1, то есть на 23 неделе после инъекции DEN, всех мышей умерщвляли, а печень собирали и часть фиксировали в формалине для гистологического анализа FFPE (окрашивание гематоксилином/эозином), а также трихромного окрашивания.

Результаты

Для оценки влияния mAb, специфичного к клаудину-1 для профилактики и лечения прогрессирующего заболевания печени и HCC in vivo, заявители использовали мышиную модель с диэтилнитрозамином (DEN) для заболевания печени и HCC. DEN является канцерогенным химическим веществом, которое, как было показано, устойчиво индуцирует стеатоз печени, фиброз, цирроз и HCC на животных моделях. Модели DEN успешно использовались для исследований доказательной медицины по лечению прогрессии заболевания печени и хемопревентивных по отношению к HCC лекарственных средств (Fuchs et al., Hepatology, 2014, 59: 1577-1590; Ip et al., Cancer Prev. Res . (Phila), 2013, 6: 1304-1306; Haider et al., Mol. Cancer Ther., 2013, 12(10): 1947-1957; Park et al., J. Cell Physiol., 2012, 227(3): 899-908).

У мышей C3H/Ha однократное введение DEN приводило к микровакуолярному стеатозу, влияющему на около 10% печени, как показано гистопатологическими анализами, выполненными на 18-й неделе после DEN (Фигура 11В, стрелки). Стеатоз печени наблюдался в фокальном паттерне и был локализован преимущественно в перипорте (Фигура 11B, левая панель). Кроме того, DEN приводила к канцерогенезу печени, как показано при развитии опухоли печени после DEN (Фигура 11Е).

Влияние CLDN1-специфичного антитела на болезнь печени и канцерогенез затем изучали после того, как животные получали лечение антителом в течение пяти недель. В то время как у всех контрольных животных продолжал развиваться стеатоз печени на 23-й неделе после введения DEN, у мышей, получавших лечение CLDN1-специфическим антителом (Фигура 11С, D), стеатоз не наблюдался. Аналогично, в то время как узел опухоли наблюдался на поверхности печени контрольной мыши (мышь # 8841 на Фигуре 11Е), опухоль не была обнаружена у всех мышей, получавших CLDN1-специфичное антитело (данные не показаны).

В совокупности эти результаты показывают, что mAb против CLDN1 реверсирует стеатоз печени, облегчает заболевание печени и обеспечивает хемопревентивный эффект относительно HCC в относящейся к уровню техники мышиной модели прогрессирующей болезни печени и HCC.

Другие воплощения

Другие воплощения изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники из рассмотрения описания или практического осуществления изобретения, раскрытого в данном документе. Предполагается, что описание и примеры следует рассматривать только как типичные, при этом истинный объем изобретения указывается в представленной ниже формуле изобретения.

1. Применение моноклонального антитела против клаудина 1 для лечения болезни печени, не связанной с вирусом гепатита С (HCV) у субъекта, где заболевание печени, не связанное с HCV, представляет собой воспаление печени, рубцевание печени, стеатоз печени, цирроз или неалкогольный стеатогепатит (NAFLD), причем это антитело против клаудина 1 является антителом, выбранным из группы, состоящей из OM-4A4-D4, OM-7C8-A8, OM-6D9-A6, OM-7D4-C1, OM-6E1-B5, OM-3E5-B6, OM-8A9-A3 или OM-7D3-B3, секретированных линией клеток гибридомы, депонированной 29 июля 2008 года под регистрационным номером, выбранным из DSM ACC2931, DSM ACC2932, DSM ACC2933, DSM ACC2934, DSM ACC2935, DSM ACC2936, DSM ACC2937 и DSM ACC2938, соответственно.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что антитело против клаудина 1 представляет собой антитело OM-7D3-B3, секретированное линией клеток гибридомы, депонированной 29 июля 2008 года под регистрационным номером DSM ACC2938.

3. Применение по п. 1 или 2, где прогрессия болезни печени, не связанной с HCV, замедлена, уменьшена, остановлена, облегчена или реверсирована.

4. Применение по любому из пп. 1-3, где NAFLD является неалкогольным стеатогепатитом (NASH).

5. Применение по любому из пп. 1-4, где антитело является гуманизированным, деиммунизированным или химерным.

6. Применение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество моноклонального антитела против клаудина 1 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель, для лечения болезни печени, не связанной с HCV, у субъекта, где болезнь печени, не связанная с HCV, является воспалением печени, рубцеванием печени, стеатозом печени, циррозом или неалкогольным стеатогепатитом (NAFLD), причем это антитело против клаудина 1 является антителом, выбранным из группы, состоящей из OM-4A4-D4, OM-7C8-A8, OM-6D9-A6, OM-7D4-C1, OM-6E1-B5, OM-3E5-B6, OM-8A9-A3 или OM-7D3-B3, секретированным линией клеток гибридомы, депонированной 29 июля 2008 года под регистрационным номером, выбранным из группы, состоящей из DSM ACC2931, DSM ACC2932, DSM ACC2933, DSM ACC2934, DSM ACC2935, DSM ACC2936, DSM ACC2937 и DSM ACC2938, соответственно.

7. Применение по п. 6, отличающееся тем, что антитело к клаудину 1 представляет собой антитело OM-7D3-B3, секретированное линией клеток гибридомы, депонированной 29 июля 2008 года под регистрационным номером DSM ACC2938.

8. Применение по п. 6 или 7, где прогрессия болезни печени, не связанной с HCV, замедлена, уменьшена, остановлена, облегчена или реверсирована.

9. Применение по любому из пп. 6-8, где NAFLD является неалкогольным стеатогепатитом (NASH).

10. Применение по любому из пп. 6-9, где моноклональное антитело против клаудина 1 является гуманизированным, деиммунизированным или химерным.

11. Применение по любому из пп. 6-10, в котором указанная фармацевтическая композиция также содержит дополнительный терапевтический агент.

12. Применение по п. 11, где дополнительный терапевтический агент выбран из группы, состоящей из антивирусных агентов, противовоспалительных агентов, иммуномодулирующих агентов, анальгетиков, противомикробных агентов, ингибиторов киназ, молекул, мешающих передаче сигналов, антибактериальных агентов, антибиотиков, антиоксидантов, антисептиков, противораковых средств и их комбинаций.