Радиотерапевтические частицы и суспензии

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к частице для лечения внутриполостного рака, содержащей: CaCO₃, излучающий альфа-частицы радиоактивный изотоп ²²⁴Ra и продукты распада радиоактивного изотопа ²²⁴Ra, выбранные из группы, состоящей из ²²⁰Rn, ²¹⁶Po и ²¹²Pb, также относится к композиции для лечения внутриполостного рака, содержащей одну или более частиц и разбавитель, носитель, сурфактант и/или эксципиент, также относится к способу получения частицы, включающему приведение излучающего альфа-частицы радиоактивного изотопа ²²⁴Ra и CaCO₃ в контакт друг с другом с использованием или без использования носителя для радиоактивного изотопа, и также относится к набору для получения частицы для лечения внутриполостного рака, включающему: композицию, содержащую CaCO₃, композицию, содержащую излучающий альфа-частицы радиоактивный изотоп ²²⁴Ra и продукты распада радиоактивного изотопа ²²⁴Ra, выбранные из группы, состоящей из ²²⁰Rn, ²¹⁶Po и ²¹²Pb. Группа изобретений обеспечивает получение частиц, эффективных для лечения рака, которые лишены недостатков других аналогичных известных средств, в частности системной токсичности. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 12 ил., 11 табл., 17 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к частице или фармацевтической композиции, содержащей одну или более частиц, либо суспензию одинаковых или разных частиц, содержащих распадающееся соединение и излучающий альфа-частицы радиоактивный изотоп и/или радиоактивный изотоп, генерирующий излучающий альфа-частицы дочерний изотоп. Данные частицы полезны для лечения рака.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Излучающие бета-частицы радиоактивные коллоиды и микрочастицы в течение нескольких лет были использованы с некоторым успехом для лечения асцитов брюшной полости и микроскопических метастазов. Однако отдаленные последствия и заболеваемость вследствие кишечной токсичности сделали эти методы лечения устаревшими, и химиотерапия стала стандартной вспомогательной терапией, например, при раке яичника. По-прежнему существует значительная медицинская потребность в новых методах лечения внутриполостных форм рака.

Излучатели альфа-частиц ранее были предложены в качестве терапевтических средств для лечения рака в брюшной полости. Было предложено два вида химических соединений (1) радиоиммуноконъюгаты и (2) суспензии микро- или наночастиц. Преимуществом радиоиммуноконъюгатов является потенциальная нацеленность на конкретные клетки, а недостатком является существенная утечка препарата в кровоток, потенциально приводящая к системной токсичности.

Преимуществом микро/наночастиц и коллоидов является потенциально лучшее локальное удержание, что уменьшает токсичность в отдаленных участках тела. К недостаткам можно отнести неоднородное отложение введенных доз и возникновение «горячих точек» излучения, а также возможность того, что частицы сами по себе могут вызывать раздражение вследствие медленного распада, и так далее. При использовании микрочастиц и/или наночастиц приходится выбирать между полностью стабильными или медленно распадающимися частицами.

При использовании полностью стабильных частиц преимущества включают низкий риск системной токсичности. Недостатками являются потенциально более гетерогенное распределение дозы излучения и некоторый риск локальной токсичности от «горячих точек». Стабильные радиотерапевтические частицы были использованы для радиоэмболизации с помощью высокоэнергетического излучателя бета-частиц ⁹⁰Y, прочно связанного с не распадающимися стеклянными сферами (TheraSphere™) или сферами на основе смолы (SIR-Spheres™), при лечении первичных опухолей и метастазов в печени. В этом случае ткань печени будет служить экраном против токсичного облучения кишечника, и так далее. Вторым подходом было бы использование распадающихся частиц, медленно высвобождающих некоторое количество радиоактивных изотопов: возможные преимущества включают более однородное распределение дозы излучения за счет улучшенной диффузии исходных изотопов и/или короткоживущих дочерних изотопов и меньшую тенденцию к образованию «горячих точек», вызывающих локальную токсичность. Возможные недостатки включают возможность системной токсичности из-за возможного поступления высвобожденных радиоактивных изотопов в кровь и последующее перераспределение. В настоящее время распадающиеся частицы в основном используют для других цитотоксических соединений, таких как химиотерапевтические средства, но не для радиоактивных изотопов.

Таким образом, существует потребность в улучшенной системе доставки для излучателей альфа-частиц, используемых против внутриполостных форм рака.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к частице, содержащей распадающееся соединение и излучающий альфа-частицы радиоактивный изотоп и/или радиоактивный изотоп, генерирующий излучающий альфа-частицы дочерний изотоп.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения радиоактивный изотоп выбирают из группы, состоящей из ²²⁴Ra, ²¹²Bi, ²¹²Pb, ²²³Ra, ²²⁵Ra, ²²⁵Ac, ²¹³Bi, ²¹¹At, ²²⁷Th.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения распадающееся соединение выбирают из группы, состоящей из CaCO₃, ПЭГ-модифицированного CaCO₃, модифицированного белком CaCO₃, модифицированного углеводом CaCO₃, модифицированного липидом CaCO₃, модифицированного витамином CaCO₃, модифицированного органическим соединением CaCO₃, модифицированного полимером CaCO₃ и/или модифицированного неорганическим кристаллическим соединением CaCO_3.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения размер частицы составляет от 1 нм до 500 мкм.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения частица содержит одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из моноклонального антитела, поликлонального антитела, радиоиммуноконъюгата, иммуноконъюгата, хелатирующего конъюгата антитела, витаминов, включая фолат и производные фолата, пептидов, минител и аффител.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей одну или более частиц по изобретению и разбавитель, носитель, сурфактант и/или эксципиент.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей количество радиоактивного изотопа, составляющее от 1кБк до 10 ГБк на дозу.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей количество радиоактивного изотопа, составляющее от 50 МБк до 100 ГБк, которое подходит для многодозового промышленного производства. Например, если дозы для 100 пациентов производят в виде одной партии в день, это может составлять в общей сложности дозы 1-10 ГБк, распределенные в 100 однодозовых ампул или готовых к использованию шприцев.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, представляющей собой суспензию частиц, содержащую монодисперсные или полидисперсные частицы, меченые излучающим альфа-частицы радиоактивным изотопом и/или радиоактивным изотопом, генерирующим излучающий альфа-частицы дочерний изотоп. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, подходящей для внутривенной или внутриполостной инъекции.

Другой аспект настоящего изобретения относится к частице или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для использования в качестве лекарственного средства.

Один из аспектов настоящего изобретения относится к частице по настоящему изобретению, представляющей собой медицинское устройство или содержащейся в медицинском устройстве.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к частице или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для использования в внутриполостной лучевой терапии, радиоэмболизации или радиосиновэктомии.

Другой аспект настоящего изобретения относится к частице или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для использования в лечении рака.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения рак выбирают из группы, состоящей из рака в брюшной полости, рака в интракраниальном пространстве, рака в плевре, рака мочевого пузыря, рака в сердце и рака в субарахноидальной полости.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения или ослабления заболевания, включающему введение частиц или фармацевтической композиции по настоящему изобретению индивидууму, который нуждается в этом.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения частицы по настоящему изобретению, включающему создание контакта между излучающим альфа-частицы радиоактивным изотопом и биоразлагаемым соединением с использованием или без использования носителя для радиоактивного изотопа.

Другой аспект настоящего изобретения относится к набору, включающему нано- или микрочастицы по настоящему изобретению, излучающий альфа-частицы радиоактивный изотоп или радиоактивный изотоп, генерирующий излучающий альфа-частицы дочерний изотоп, носитель, разбавитель и/или эксципиент и, необязательно, инструкции по использованию набора.

Другой аспект настоящего изобретения относится к набору, включающему нано- или микрочастицы по настоящему изобретению, излучающий альфа-частицы радиоактивный изотоп или радиоактивный изотоп, генерирующий излучающий альфа-частицы дочерний изотоп, носитель, разбавитель и/или эксципиент и, необязательно, инструкции по использованию набора для приготовления бифункционального фармацевтического раствора, содержащего суспензию частиц и раствор радиоиммуноконъюгата.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения набор включает конъюгированную с хелатором молекулу, в том числе, моноклональные антитело.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1. Распределение в тканях через 20 часов, 4 дня и 7 дней после внутрибрюшинной инъекции ²²⁴Ra-меченых микрочастиц CaCO₃ (A) и растворенного ²²⁴RaCl₂ (B) «голым» мышам. Измерения радиоактивности проводили минимум через 3 дня после умерщвления животных, то есть оставляя время для уравновешивания дочерних изотопов с ²²⁴Ra.

Фигура 2. Масса внутрибрюшинных опухолей SKOV-3, подвергнутых воздействию солевого раствора, немеченых частиц или ²²⁴Ra-меченых микрочастиц карбоната кальция, в день 44 и 45 после начала лечения.

Фигура 3. Выживаемость животных с асцитом брюшной полости при раке ES-2, получавших солевой раствор или ²²⁴Ra-меченые микрочастицы карбоната кальция.

Фигура 4. Гистограмма, иллюстрирующая эффективность мечения ²²⁴Ra и дочерним изотопом ²¹²Pb микрочастиц CaCO₃, имеющих средний размер 1,1 и 8,9 мкм. Столбики представляют средние значения из 14 и 12 отдельных экспериментов для мелких и крупных частиц, соответственно, и планки погрешностей представляют стандартное отклонение.

Фигура 5. Гистограмма, иллюстрирующая процентную долю радиоактивности ²²⁴Ra, сохраняющейся на микрочастицах CaCO₃ со средним размером 1,1 и 8,9 мкм в разные моменты времени. Столбики представляют средние значения из 5 и 4 отдельных экспериментов для мелких и крупных частиц, соответственно, и планки погрешностей представляют стандартное отклонение.

Фигура 6. Выживаемость мышей, которым вводили внутрибрюшинной инъекцией 1×10⁶ клеток ES-2 и через 22 часа вводили солевой раствор или ²²⁴Ra-меченые микрочастицы CaCO₃.

Фигура 7. Эффект лечения ²²⁴Ra-мечеными микрочастицами CaCO₃ на гематологические параметры: зависимость содержания лейкоцитов (WBC), эритроцитов (RBC) и тромбоцитов (PLT) от времени после начала лечения. Образцы собирали от 3-5 мышей в каждой группе в каждой временной точке. На графике показаны отдельные точки данных для каждой мыши наряду со средним значением для каждой группы, представленным горизонтальной планкой. Планки погрешностей соответствуют стандартному отклонению.

Фигура 8. Выживаемость мышей в модели асцита брюшной полости при раке ES-2 яичника, получавших солевой раствор или ²²⁴Ra-меченые микрочастицы CaCO₃ в разные моменты времени после инокуляции клеток.

Фигура 9. Выживаемость мышей, которым вводили внутрибрюшинной инъекцией 1×10⁵ клеток ES-2 и через 1 час вводили ²²⁴Ra-меченые микрочастицы CaCO₃ двух разных размеров, в сравнении с контрольной группой животных, получавших солевой раствор.

Фигура 10. Биораспределение у «голых» мышей, представленное в виде средней радиоактивности ²²⁴Ra в Бк на грамм ткани, через 20 часов, 4 дня и 7 дней после внутрибрюшинной инъекции ²²⁴Ra-меченых микрочастиц CaCO₃ (A) и раствора свободного ²²⁴Ra (B). Вводимую инъекцией радиоактивность нормировали до уровня 10 кБк/мышь. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение.

Фигура 11. Биораспределение у «голых» мышей дочернего изотопа ²¹²Pb, представленное в виде средней радиоактивности в Бк на грамм ткани, через 20 часов, 4 дня и 7 дней после внутрибрюшинной инъекции ²²⁴Ra-меченых микрочастиц CaCO₃ (A) и раствора свободного ²²⁴Ra (B). Вводимую инъекцией радиоактивность нормировали до уровня 10 кБк/мышь. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение.

Фигура 12. Выживаемость мышей, которым вводили внутрибрюшинной инъекцией 10×10⁶ клеток ES-2 и через 25 часов вводили солевой раствор или ²²⁴Ra-меченые микрочастицы CaCO₃.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения нашли способ лечения рака с меньшим риском кишечной токсичности, основанный на использовании излучателей альфа-частиц короткого радиуса действия.

Настоящее изобретение основано на использовании медленно распадающихся нано- или микрочастиц, содержащих излучающий альфа-частицы радиоактивный изотоп и/или радиоактивный изотоп, генерирующий излучающий альфа-частицы дочерний изотоп, например, ²²⁴Ra.

Таким образом, одним объектом настоящего изобретения является частица, содержащая распадающееся соединение и излучающий альфа-частицы радиоактивный изотоп и/или радиоактивный изотоп, генерирующий излучающий альфа-частицы дочерний изотоп.

Один из аспектов настоящего изобретения относится к частице, содержащей: CaCO₃, излучающий альфа-частицы радиоактивный изотоп ²²⁴Ra и радиоактивные продукты распада ²²⁴Ra, выбранные из группы, состоящей из ²²⁰Rn, ²¹⁶Po, ²¹²Pb и ²¹²Bi. ²²⁰Rn представляет собой дочерний радиоактивный изотоп ²²⁴Ra, ²¹⁶Po представляет собой внучатый радиоактивный изотоп ²²⁴Ra и ²¹²Pb представляет собой правнучатый радиоактивный изотоп ²²⁴Ra, и так далее.

Другой аспект настоящего изобретения относится к частице, содержащей: CaCO₃, излучающий альфа-частицы радиоактивный изотоп ²²⁴Ra и радиоактивные продукты распада ²²⁴Ra, выбранные из группы, состоящей из ²²⁰Rn, ²¹⁶Po и ²¹²Pb. ²²⁰Rn представляет собой дочерний радиоактивный изотоп ²²⁴Ra, ²¹⁶Po представляет собой внучатый радиоактивный изотоп ²²⁴Ra и ²¹²Pb представляет собой правнучатый радиоактивный изотоп ²²⁴Ra.

Радиоактивные изотопы

Радиоактивные изотопы по настоящему изобретению могут представлять собой любой излучающий альфа-частицы радиоактивный изотоп и/или радиоактивный изотоп, генерирующий излучающий альфа-частицы дочерний изотоп.

Основным преимуществом излучающих альфа-частицы соединений для локальной терапии, например, в брюшной полости, является короткий радиус действия, как правило, менее 0,1 мм для альфа-частиц, в сравнении с измеряемыми в мм или см радиусами действия бета-частиц используемых в медицине излучателей бета-частиц, таких как ⁹⁰Y, ¹³¹I и ³²P.

Использование излучателей альфа-частиц внутри полости снижает риск токсичности из-за облучения более глубоких областей внутренних органов, например, чувствительных к облучению клеток кишечной крипты в случае внутрибрюшинного использования. Кроме того, высокая линейная передача энергии излучаемых альфа-частиц имеет преимущество, поскольку очень немного ударов альфа-частиц требуется для уничтожения клетки, и механизм клеточной устойчивости, такой как высокая способность к репарации разрывов цепи ДНК, является меньшей проблемой из-за высокой вероятности возникновения непоправимых разрывов двойной цепи (Ritter et al., 1977).

Высокий эффект каждого распада означает, что требуется меньшее количество радиоактивности, это уменьшает необходимость экранирования больничного персонала и родственников, поскольку большинство излучателей альфа- и бета-частиц также излучают некоторое количество рентгеновских лучей и гамма-лучей, от которых требуется экранирование.

В таблице 1 приведены основные радиационные свойства ²²⁴Ra. Полный распад ²²⁴Ra и дочерних изотопов приводит к образованию в общей сложности 4 альфа-частиц. Важным аспектом является судьба ²²⁰Rn, поскольку этот изотоп потенциально может диффундировать от исходного изотопа вследствие того, что потенциально химически инертен в отношении связывания в кристаллах.

Это означает, что происходит первичный распад ²²⁴Ra до ²²⁰Rn (дочерний радиоактивный изотоп), затем до ²¹⁶Po (внучатый радиоактивный изотоп) и впоследствии до долгоживущего ²¹²Pb (правнучатый радиоактивный изотоп), который опять-таки распадается до ²¹²Bi.

Дочерними продуктами распада называют радиоактивные изотопы, которые являются результатом распада исходных радиоактивных изотопов. Таким образом, если ²²⁴Ra является исходным радиоактивным изотопом, то ²²⁰Rn (дочерний радиоактивный изотоп), ²¹⁶Po (внучатый радиоактивный изотоп) и ²¹²Pb (правнучатый радиоактивный изотоп), а также все радиоактивные изотопы, приведенные в таблице 1, будут считаться дочерними радиоактивными изотопами.

Таким образом, один вариант осуществления относится к излучающему альфа-частицы радиоактивному изотопу ²²⁴Ra с дочерним радиоактивным изотопом ²²⁰Rn, внучатым радиоактивным изотопом ²¹⁶Po и правнучатым радиоактивным изотопом ²¹²Pb. В случае частицы по настоящему изобретению, они все будут включены в частицу, если излучающим альфа-частицы радиоактивным изотопом является ²²⁴Ra.

Один из аспектов настоящего изобретения относится к частице по настоящему изобретению, представляющей собой медицинское устройство или содержащейся в медицинском устройстве.

Медицинское устройство представляет собой любой инструмент, аппарат, приспособление, программу, материал или другой продукт, используемый отдельно или в сочетании, включая программу, предназначенную ее разработчиком для использования специально для диагностических и/или терапевтических целей, и оно должно быть использовано надлежащим образом, предусмотренным его производителем, применительно к людям с целью: диагностирования, предотвращения, мониторинга, лечения или ослабления заболевания; диагностирования, мониторинга, лечения, облегчения или корректировки в случае травмы или увечья; исследования, замены или модификации анатомической структуры или физиологического процесса; контроля зачатия; и при этом устройство осуществляет свое основное предназначенное действие в, или на, теле человека не за счет фармакологических, иммунологических или метаболических средств, но его действию могут способствовать такие средства.

Медицинские устройства могут варьироваться в отношении их предполагаемого применения и назначения. Примеры включают целый спектр устройств от простых, таких как депрессоры языка, медицинские термометры и одноразовые перчатки, до сложных, таких как компьютеры, помогающие проведению медицинского тестирования, имплантаты и протезы.

По определению FDA медицинское устройство представляет собой «инструмент, аппарат, средство, машину, приспособление, имплантат, in vitro реагент, либо другой аналогичный или родственный продукт, включая комплектующую деталь или аксессуар, который: признан в официальном Национальном формуляре или в Фармакопее США, или любом приложении к ним, предназначен для использования в диагностике заболеваний или других состояний, либо в терапии, облегчении, лечении или предотвращении заболеваний у человека или других животных, либо предназначен для воздействия на структуру или любую функцию организма человека или других животных, и который достигает основной запланированной для него цели не за счет химического действия в, или на, теле человека или других животных, и который не должен быть метаболизирован для достижения какой-либо основной запланированной для него цели».

Настоящие частицы не метаболизируются и не оказывают какого-либо существенного химического действия в организме. Частицы являются носителями радиоактивности, которые спроектированы, чтобы не метаболизироваться и не оказывать какого-либо химического действия в организме, и благодаря этому радиотерапия имеет ограниченные нежелательные побочные эффекты, такие как токсичность.

Таким образом, в одном варианте осуществления термин «медицинское устройство» соответствует определению FDA, приведенному выше.

Таблица 1. Основные радиационные свойства изотопов серии ²²⁴Ra.

Радиоактивный изотоп (период полураспада)	Альфа- и бета-частицы (средняя энергия в МэВ)	Рентгеновское и гамма-излучение Энергия и % относительной представленности
224Ra (3,6 дней)	α 5,6	241 кэВ, 4,1%
220Rn (55,6 с)	α 6,3
216Po (145 мс)	α 6,8
212Pb (10,6 ч)	β 0,1	75 кэВ, 10,3% 77 кэВ, 17,1% 87 кэВ, 6,0% 90 кэВ, 1,5% 239 кэВ, 43,6% 300 кэВ, 3,3%
212Bi (1,0 ч)	α 6,1 × 0,36 (2,2 эффективной1) β 0,7 × 0,64 (0,4 эффективной)	727 кэВ, 6,7% (4,3% эффективной)
212Po (299 нс) (64% ветвь)	α 8,8 (5,6 эффективной)
208Tl (3,1 мин) (36% ветвь)	β 0,6 (0,2 эффективной)	75 кэВ, 3,4% (1,2% эффективной) 511 кэВ, 22,6% (8,1% эффективной) 583 кэВ, 85,0% (30,6% эффективной) 860 кэВ, 12,5% (4,5% эффективной) 2615 кэВ, 99,8% (35,9% эффективной)

¹Среднее значение для превращения ²²⁴Ra вследствие ветвления. Учитывали только рентгеновское или гамма-излучение с эффективной представленностью выше 1%. В сумме составляет общую эффективную энергию примерно 26,5 МэВ для альфа- и 0,7 МэВ для бета-частиц на полный распад ²²⁴Ra и дочерних изотопов.

Радий-224 является предпочтительным излучателем альфа-частиц, однако по настоящему изобретению можно использовать и другие.

Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения радиоактивный изотоп выбирают из группы, состоящей из ²²⁴Ra, ²¹²Bi, ²¹²Pb, ²²³Ra, ²²⁵Ra, ²²⁵Ac, ²¹³Bi, ²¹¹At, ²²⁷Th.

Очень выгодным фактом, установленном в примерах, явилось то, что количество радиоактивности, необходимое для оказания существенных терапевтических эффектов, составляло всего лишь 100 кБк на кг массы тела, - что эквивалентно всего лишь 2-2,5 кБк на мышь. Это выгодно отличается от нескольких сотен кБк на мышь изотопов ²¹¹At и ²¹²Pb, необходимых для радиоиммунотерапии альфа-частицами экспериментальных раковых опухолей в брюшной полости у мышей (Gustafsson et al., 2012; Boudousq et al., 2013). Это свойство может серьезно уменьшить проблемы, связанные с воздействием рентгеновского и гамма-излучения при введении и использовании частиц по настоящему изобретению, например, ²²⁴Ra-CaCO₃.

Количество ²²⁴Ra, используемого в дозе для пациента, может находиться в диапазоне от 1 кБк до 10 ГБк, более предпочтительно от 100 кБк до 100 МБк, еще более предпочтительно, диапазон составляет от 0,5 МБк до 25 МБк.

Доза будет зависеть от вида рака и, например, от того, насколько агрессивно заболевание. В одном варианте осуществления доза составляет 10-100 кБк/кг, например, 20-50 кБк/кг. В другом варианте осуществления доза составляет 10-1000 кБк/кг, например, 25-300 кБк/кг. В следующем варианте осуществления доза составляет 100-500 кБк/кг, например 150-300 кБк/кг.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит количество радиоактивного изотопа, которое соответствует от 1 кБк до 10 ГБк на дозу.

Например, если дозы для 100 пациентов производят в виде одной партии в день, это может составлять в общей сложности дозы 1-10 ГБк, распределенные в 100 однодозовых ампул или готовых к использованию шприцев.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит количество радиоактивного изотопа, которое подходит для многодозового промышленного производства, например, от 50 МБк до 100 ГБк.

Распадающееся соединение

Распадающееся соединение по настоящему изобретению может представлять собой любое соединение, которое может распадаться.

Распад может быть вызван любым фактором, выбранным из группы, состоящей из высокого pH, низкого pH, протеаз, ферментов, нуклеаз, и/или вызван клеточными процессами, такими как эндоцитоз, который также включает фагоцитоз.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения распадающееся соединение выбирают из группы, состоящей из CaCO₃, ПЭГ-модифицированного CaCO₃, модифицированного белком CaCO₃, модифицированного углеводом CaCO₃, модифицированного липидом CaCO₃, модифицированного витамином CaCO₃, модифицированного органическим соединением CaCO₃, модифицированного полимером CaCO₃ и/или модифицированного неорганическим кристаллическим соединением CaCO_3.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения распадающееся соединение представляет собой CaCO₃ (CC).

Частицы карбоната кальция (CC) могут быть использованы в виде композитов с другими солями или белками, или пептидами, и быть подвергнуты модификации поверхности при помощи сурфактантов, таких как олеаты и тому подобное.

В конкретном варианте осуществления CC используют с соединением, выбранным из группы, состоящей из модифицированных полиэтиленгликолем частиц карбоната кальция или модифицированных неорганическим кристаллическим соединением CC.

В конкретном варианте осуществления CC частицы модифицированы группами, связывающими функциональный рецептор и/или антиген, включая моноклональные антитела и производные, а также витамины и производные, что позволяет связывающимся с рецептором или антигеном частицам нацеливаться на отдельные клетки и пораженные болезнью ткани. Это означает, что модификации частиц связаны с добавлением соединений к CC. Это можно осуществлять разными способами за счет таких взаимодействий, как диполь-дипольные взаимодействия, ионно-дипольные и ионно-индуцированные дипольные силы, водородное связывание, силы Ван-дер-Ваальса, и с относительно разной силой взаимодействия.

Когда раствор ²²⁴Ra в равновесии с дочерними изотопами используют для мечения частиц в конкретном варианте осуществления, то в первую очередь добавляют в раствор хелатор для ²¹²Pb до контактирования с CC частицами, таким образом, создавая бифункциональную радиотерапевтическую смесь. Хелатор предпочтительно конъюгирован с аффинной для мишени молекулой, например, моноклональным или поликлональным антителом, или производным антитела, витаминами или производными витаминов.

Характеристики

Частицы могут иметь разные характеристики.

Размер частиц может варьироваться в зависимости от запланированных вариантов использования.

Тип кристаллов может представлять собой любую известную форму CC, можно использовать размеры от 1 нм до 500 мкм. Более предпочтительно, размер находится в диапазоне от 100 нм до 50 мкм, и более предпочтительно, размер находится в диапазоне 1-10 мкм.

В одном предпочтительном варианте осуществления размер составляет 1-10 мкм.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения размер частицы составляет от 1 нм до 500 мкм.

Для мышей, исходя из поверхности брюшной полости, количество CC частиц должно находиться в диапазоне от 0,1 мг до 50 мг, более предпочтительно, возможно, от 1 мг до 15 мг. В случае использования для человека количество, используемое для мышей, следует умножать на 10-10000, возможно, более предпочтительно использовать 0,1-10 г, например, для терапии в брюшной полости. В случае других полостей количества можно корректировать в зависимости от относительной площади поверхности или от объема присутствующей жидкости.

В примерах настоящего изобретения было установлено, что ²²⁴Ra можно использовать для радиоактивного мечения распадающегося карбоната кальция. Карбонат кальция имеет примерно на 14% более низкую плотность, чем гидроксиапатит кальция, и его может быть легче поддерживать в суспензии без осаждения, чем частицы гидроксиапатита кальция того же размера. Карбонат кальция был использован в качестве основного ингредиента с добавлением или без добавления небольших количеств копреципитата, например, сульфата бария, в качестве носителя для ²²⁴Ra.

Таким образом, в одном варианте осуществления добавляют копреципитат. Копреципитаты выбирают из группы, состоящей из сульфата бария, сульфата стронция и хромата бария. Количество, как правило, находится в диапазоне от 0,01% до 10% относительно количества карбоната кальция, и предпочтительно 0,1-1% относительно количества карбоната кальция.

Общее количество карбоната кальция в частице до добавления радиоактивного изотопа может варьироваться в зависимости от того, например, добавляют ли копреципитат. В одном из вариантов осуществления количество карбоната кальция составляет более 90%. Диапазон может составлять 90-95% или 90-99%. Количество также может превышать 98% или превышать 99%.

Дополнительные соединения в частице

Распадающаяся частица может содержать множество разных дополнительных соединений. Они могут служить разным целям, включая нацеливание, стабильность, растворимость и скорость распада.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения частица содержит одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из моноклонального антитела, поликлонального антитела, радиоиммуноконъюгата, иммуноконъюгата, хелатирующего конъюгата антитела, витаминов, включая фолат и производные фолата, пептидов, минител и аффител.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело выбирают из одного или более из группы, состоящей из трастузумаба, ритуксимаба, HH1, цетуксимаба, бевацизумаба, даратумумаба, алемтузумаба, пембролизумаба, эпратузумаба, L19, F8, F16, галиксимаба, торализумаба, алемтузумаба, офатумумаба, велтузумаба, афутузумаба, тозитумомаба, редитукса и ибритумомаба.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения соединение специфично для мишени, выбранной из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD33, CD37, CD38, CD45, CD74, CD138, PSMA, HER-2, EGFR, MUC-1, MUC-18, CEA, FBP, NG2, EPCAM, синдекана-1, Ca-125, LK-26, HMFG, CS-1 и BCMA.

В конкретном варианте осуществления фармацевтическая суспензия ²²⁴Ra-меченых частиц содержит ²¹²Pb-меченое антитело, фрагмент антитела или белок, или пептид, или производное витамина (нацеленный конъюгат) с аффинностью в отношении рецепторов, включая антигены на опухолевых клетках, в результате чего ²²⁴Ra-меченые частицы будут обеспечивать общее облучение альфа-частицами поверхностей брюшной полости, включая поверхности органов брюшной полости, а ²¹²Pb-меченое антитело, или тому подобное, будет обеспечивать специфическую дозу альфа-частиц для опухолевых клеток за счет связывания с рецептором или антигеном.

Радиоактивные изотопы по настоящему изобретению можно конъюгировать с нацеливающей молекулой при помощи бифункциональных хелаторов.

Хелаторы могут представлять собой циклические, линейные или разветвленные хелаторы. Конкретно можно упомянуть полиаминополикислотные хелаторы, которые имеют линейный, циклический или разветвленный полиазаалкановый каркас с кислотными (например, карбоксиалкильными) группами, присоединенными к атомам азота каркаса.

Примеры подходящих хелаторов включают производные DOTA, такие как п-изотиоцианатбензил-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота (p-SCN-Bz-DOTA) и вариант этого соединения DOTA с четырьмя первичными амидными группами, называемый TCMC, а также производные DTPA, такие как п-изотиоцианатбензилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (p-SCN-Bz-DTPA), первые являются циклическими хелаторами, а последние линейными хелаторами.

Металлизацию комплексообразующего фрагмента можно проводить до или после конъюгации комплексообразующего фрагмента с нацеливающим фрагментом.

Процедура радиоактивного мечения, как правило, будет более удобной с точки зрения затрачиваемого времени и так далее, если хелатор конъюгировать с антителом до проведения радиоактивного мечения. Принципы получения радиоактивно меченых конъюгатов с использованием хелаторов, связанных с антителами, описаны более подробно, например, в статье Liu, 2008.

Фармацевтическая композиция и композиции

Один из аспектов относится к композиции, содержащей частицу по настоящему изобретению. Композиция может представлять собой суспензию частиц, содержащую монодисперсные или полидисперсные частицы, меченые ²²⁴Ra и/или дочерними радиоактивными изотопами.

Композиция предпочтительно представляет собой водную композицию.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к композиции или фармацевтической композиции, содержащей одну или более частиц по изобретению и разбавитель, носитель, сурфактант, дефлокулянт и/или эксципиент.

Приемлемые носители и фармацевтические носители включают, но не ограничиваются ими, нетоксичные буферы, наполнители, изотонические растворы, растворители и сорастворители, противомикробные консерванты, антиоксиданты, увлажняющие средства, пеногасители, загустители и так далее. Более конкретно, фармацевтический носитель может представлять собой, но без ограничения, нормальный солевой раствор (0,9%), полунормальный солевой раствор, раствор Рингера лактат, растворенную сахарозу, декстрозу, например, 0,3% солевой раствор с 3,3% декстрозы. Физиологически приемлемый носитель может содержать радиолитический стабилизатор, например, аскорбиновую кислоту, человеческий сывороточный альбумин, который защищает целостность радиофармацевтического средства в процессе хранения и транспортировки.

Фармацевтические композиции могут содержать множество частиц. Частицы могут быть одинаковыми или разными.

Таким образом, другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, представляющей собой суспензию частиц, содержащую монодисперсные или полидисперсные частицы, меченые излучающим альфа-частицы радиоактивным изотопом и/или радиоактивным изотопом, генерирующим излучающий альфа-частицы дочерний изотоп.

Введение

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, подходящей для внутривенной, внутриопухолевой или внутриполостной инъекции.

Варианты применения

Применение излучающих альфа-частицы микрочастиц для лечения рака в брюшной полости было предложено ранее. В документе Archer et al. (US 4970062 A) предложено использование коллоидного раствора гидроксида железа в качестве носителя для излучателей альфа-частиц, с акцентом на ²¹²Pb, но с упоминанием некоторых других потенциально полезных излучателей альфа-частиц, включая ²²⁴Ra. В публикации Bloomer et al. (1981) предложено использование меченого ²¹¹At коллоидного раствора теллура, а в публикации Vergote et al. (1992) предложено использование ²¹¹At-меченых монодисперсных полимерных частиц. В документе Larsen and Salberg (US 8142758 B2) предложено использование гидроксиапатитных частиц, меченых ²²³Ra или другими излучателями альфа-частиц, включая ²²⁴Ra. Проблемой в случае публикации Archer et al. является то, что гидроксид может быть неподходящим для получения меченых радием частиц, поскольку гидроксид щелочноземельного металла, и, в частности, радия, имеет относительно высокую растворимость в воде (Kirby et al., 1964).

Меченый астатом-211 коллоидный раствор теллура, как показано, является нестабильным, подвергая воздействию щитовидную железу (Vergote et al., 1992), кроме того ²¹¹At-меченые полимерные частицы не являются биоразлагаемыми и вследствие короткого периода полураспада и ограниченных существующих производственных мощностей для получения ²¹¹At оказались бы дорогими и непрактичными для масштабного клинического применения. Также вследствие химической инертности и низкой комплексообразующей способности катионов радия коллоидные растворы теллура или полимерные частицы не рассматривались в качестве носителя для радия. Использование гидроксиапатита в качестве носителя для радия приводит к хорошему выходу при мечении, однако гидроксиапатит кальция имеет высокую плотность, что может приводить к более быстрому осаждению и недостаточно оптимальному распределению дозы излучения при использовании в полостной лучевой терапии в виде суспензии микрочастиц.

Тестирование и исследования, относящиеся к новым частицам, например ²²⁴Ra-меченым частицам карбоната кальция (CC), описанным в настоящем документе, привели к некоторым неожиданным результатам: удалось продемонстрировать высокий выход при мечении и относительную стабильность продукта in vitro, хорошее удержание в брюшной полости, совместимое с периодом полураспада ²²⁴Ra, медленное высвобождение ²²⁴Ra in vivo, хорошую переносимость частиц у мышей и значительную противоопухолевую активность в моделях опухолей на мышах. Особенно интересным и неожиданным результатом явилось хорошее поглощение внутрибрюшинным жиром, что важно, поскольку внутрибрюшинный жир, включая сальник, является площадкой для роста опухолевых метастазов (Gerber et al., 2006). Можно предположить, что для поглощения внутрибрюшинным жиром структуры должны быть более липофильными, таким образом, такое существенное поглощение частиц карбоната кальция, описанных в настоящем документе, явилось неожиданностью.

Другой аспект настоящего изобретения относится к частице или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для использования в качестве лекарственного средства.

Частицы и композиции по настоящему изобретению можно использовать в качестве радиотерапевтических соединений и/или радиотерапевтических смесей.

Лечебное применение частиц по настоящему изобретению включает применение в медицине или ветеринарии для (1) внутриполостной лучевой терапии, (2) радиоэмболизации, (3) радиосиновэктомии. Внутриполостная лучевая терапия может включать лечение, например, рака в брюшной полости, рака в интракраниальном пространстве, рака в плевре, рака мочевого пузыря, рака в сердце и рака в субарахноидальной полости. Примерами полостей, в которых можно использовать частицы, являются краниальная полость, грудная полость, полость легкого, полость позвоночника, полость таза, перикард, плевральная полость, полость мочевого пузыря или их сочетание, в том числе, частицы можно использовать для раковых опухолей, распространяющихся на брюшину или мягкие мозговые оболочки, а также органы внутри любой из этих полостей.

В конкретном варианте осуществления частицы по настоящему изобретению используют для лечения или ослабления внутриполостного заболевания, которое представляет собой инфекции или воспаление, отдельно или в сочетании с раком.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения инфекцию выбирают из группы, состоящей из бактериальной инфекции и вирусной инфекции.

Радиоэмболизация может включать лечение первичного или метастатического рака в органе, например, печени, путем введения частиц по настоящему изобретению в кровеносный сосуд, ведущий к опухоли в печени или другом паренхиматозном органе, инфильтрированном опухолевой тканью.

Радиосиновэктомия для заболеваний суставов, включая хронические воспаления, представляет собой направленную лучевую терапию для болезненных заболеваний суставов с использованием радиоактивных веществ. Сюда относится и лечение гемофилического артрита.

В настоящее время используют соединения, излучающие бета-частицы, для лечения воспалительных или ревматоидных заболеваний, или синовиального артроза различных суставов, в частности, колена, руки и лодыжки. Описанные в настоящем документе распадающиеся ²²⁴Ra-CC частицы могли бы быть очень полезны при радиосиновэктомии.

Частицы предпочтительно вводят локальной инъекцией, например, внутриполостной инъекцией.

В конкретном варианте осуществления частицы вводят инъекцией непосредственно в опухоль.

Соединения можно диспергировать в различных буферах, подходящих для медицинских инъекций, например, растворенных солях и/или белках, и/или липидах, и/или сахарах.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к частице или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для использования в внутриполостной лучевой терапии, радиоэмболизации или радиосиновэктомии.

Другой аспект настоящего изобретения относится к частице или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для использования в лечении рака.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения рак выбирают из группы, состоящей из рака в брюшной полости, рака в интракраниальном пространстве, рака в плевре, рака мочевого пузыря, рака в сердце и рака в субарахноидальной полости.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения рак выбирают из группы, состоящей из метастатического рака, рака легкого, рака яичника, колоректального рака, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака молочной железы, неопластического менингита, рака в брюшной полости, плеврального выпота, злокачественной мезотелиомы, рака молочной железы, сарком, рака головного мозга, такого как глиобластома и астроцитома, рака мочевого пузыря и рака печени.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения или ослабления заболевания, включающему введение частиц или фармацевтической композиции по настоящему изобретению индивидууму, который нуждается в этом.

Способы получения и наборы

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения частицы по настоящему изобретению, включающему создание контакта между излучающим альфа-частицы радиоактивным изотопом и биоразлагаемым соединением с использованием или без использования носителя для радиоактивного изотопа.

В раствор или композицию, содержащую излучатель альфа-частиц, то есть, в раствор или композицию ²²⁴Ra в смеси с дочерним изотопом ²¹²Pb, можно предварительно добавлять конъюгат хелатор-антитело для образования комплекса с ²¹²Pb до мечения частиц с тем, чтобы получить двухкомпонентную терапевтическую систему, содержащую радиоиммуноконъюгат для антиген-специфического воздействия ²¹²Pb и излучатель альфа-частиц, например, ²²⁴Ra-частицы, для общего воздействия на полость.

Один из вариантов осуществления относится к двухкомпонентной системе или набору, включающему радиоиммуноконъюгат для антиген-специфического воздействия ²¹²Pb и частицу по настоящему изобретению.

Предпочтительным вариантом осуществления этого был бы набор, включающий флакон A, содержащий конъюгированное с хелатором антитело, и флакон B с излучателем альфа-частиц, например, ²²⁴Ra в равновесии с дочерними изотопами, а также флакон C с микрочастицами, при этом содержимое флакона A добавляют во флакон B, или наоборот, и инкубируют от нескольких минут до нескольких часов перед тем, как смесь переносят во флакон C для дальнейшей инкубации от нескольких минут до нескольких часов перед тем, как перенести в шприц и ввести инъекцией пациенту.

Благодаря этому принципу можно значительно снижать уровень ²¹²Pb-радиоиммуноконъюгата, необходимый для терапии, поскольку ожидается, что ²²⁴Ra-CC частицы будут вносить большой вклад в противоопухолевую активность в такой системе.

Другой аспект настоящего изобретения относится к набору, включающему нано- или микрочастицу по настоящему изобретению, излучающий альфа-частицы радиоактивный изотоп или радиоактивный изотоп, генерирующий излучающий альфа-частицы дочерний изотоп, носитель, разбавитель и/или эксципиент и, необязательно, инструкции по использованию набора.

Другой аспект настоящего изобретения относится к набору, включающему композицию, содержащую CaCO₃, композицию, содержащую излучающий альфа-частицы радиоактивный изотоп ²²⁴Ra, и, необязательно, инструкции по использованию набора.

Другой аспект настоящего изобретения относится к набору, включающему нано- или микрочастицу по настоящему изобретению, излучающий альфа-частицы радиоактивный изотоп или радиоактивный изотоп, генерирующий излучающий альфа-частицы дочерний изотоп, носитель, разбавитель и/или эксципиент и, необязательно, инструкции по использованию набора для приготовления бифункционального фармацевтического раствора, содержащего суспензию частиц и раствор радиоиммуноконъюгата.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения набор включает конъюгированную с хелатором молекулу, в том числе моноклональные антитело.

Настоящие способы и продукт позволяют централизованно производить и доставлять препарат конечному пользователю, поскольку радиоактивный изотоп имеет период полураспада несколько дней. Другой аспект настоящего изобретения относится к применению биоразлагаемой частицы, которая медленно распадается на кальций и карбонат, тем самым добавляя незначительные количества веществ, которые уже в изобилии присутствуют в теле. Также стоит отметить следующую особенность: когда излучатель альфа-частиц, например, ²²⁴Ra, абсорбируется на поверхности частиц карбоната кальция, имеет место существенное высвобождение короткоживущего изотопа ²²⁰Rn (t_1/2=56 с), который вместе с ультракороткоживущим изотопом ²¹⁶Po (t_1/2=0,16 с) производит две альфа-частицы прежде, чем произойдет распад до более долговечного излучателя бета-частиц ²¹²Pb (t_1/2=10,6 ч). Свинец имеет очень высокую осаждаемость с карбонатом кальция, так что ²¹²Pb во внутрибрюшинной жидкости, как правило, будет повторно связываться с частицами, уменьшая утечку ²¹²Pb в систему кровообращения.

Таким образом, имеет место очень специфическая техническая особенность, заключающаяся в том, что ²²⁴Ra, распадаясь, превращается в газ, который может диффундировать из частицы, и затем далее распадается до ²¹²Pb, который осаждается с карбонатом кальция.

Может оказаться полезным, что ²²⁰Rn, высвобождающийся из микрочастиц, является в высокой степени липофильным, поскольку, например, рак в брюшной полости имеет сильную тенденцию к росту в сальнике, большой прокладке жировой ткани, которая покрывает кишечник в брюшной полости (Gerber et al., 2006).

Предварительно полученные частицы и последующее осаждение на поверхности или совместное осаждение с радиоактивным изотопом для более глубокого включения радиоактивного изотопа представляют собой два способа, используемые для получения терапевтического продукта. Первый способ сделает возможным некоторое высвобождение дочернего изотопа ²²⁰Rn, что позволяет уменьшать неоднородность дозы вследствие неравномерного распределения частиц. Из-за короткого периода полураспада (56 с) ²²⁰Rn не будет значительно перераспределяться из полости и не будет диффундировать в более глубокие слои поверхности тканей. Кроме того, количество радиоактивных изотопов является слишком небольшим, чтобы вызывать какие-либо серьезные физические или химические эффекты, например, давление газа в результате образования радона в полости. В какой-то степени было бы полезно использовать большее количество частиц, то есть, уменьшать удельную активность для улучшения поверхностного распределения радиоактивных изотопов серии ²²⁴Ra.

Бифункциональную суспензию можно получать, например, следующим образом: в раствор ²²⁴Ra в буфере с pH 5-6 добавляют TCMC-меченое антитело до концентрации 1 мг/мл и инкубируют от 2 минут до нескольких часов, после чего раствор добавляют в емкость с частицами карбоната кальция (CC) и инкубируют от 2 минут до нескольких часов. Смесь следует вводить как можно быстрее, чтобы избежать снижения удельной активности ²¹²Pb-меченого продукта. Возможно, эту систему лучше всего использовать в виде набора, в котором ²²⁴Ra находится во флаконе A, конъюгированный с хелатором белок находится во флаконе B и CC частицы находятся во флаконе C.

Также можно было бы добавлять ²¹²Pb для придания дополнительной силы нацеленному конъюгату в смеси с ²²⁴Ra-CC частицами. Как правило, соотношение ²²⁴Ra и ²¹²Pb в такой системе может быть близко к 1:1, однако в некоторых лечебных ситуациях может быть полезно увеличивать количество ²¹²Pb-конъюгата относительно частиц ²²⁴Ra вплоть до соотношения 10:1, или выше. В последнем случае потребовалось бы либо добавлять избыток ²¹²Pb перед приготовлением нацеленного конъюгата, либо удалять некоторое количество ²²⁴Ra-CC частиц перед введением терапевтической смеси.

Настоящее изобретение относится к новым радиотерапевтическим соединениям на основе излучателей альфа-частиц, таких как ²²⁴Ra с дочерними радиоактивными изотопами. Радий-224 абсорбируется на поверхности частиц карбоната кальция или может быть совместно осажден в процессе получения с использованием носителей, например, следовых количеств сульфата бария.

В конкретном варианте осуществления ²²⁴Ra может быть совместно кристаллизован с кальцием, с образованием кристаллов карбоната, при этом ²²⁴Ra находится внутри кристаллов, а не на поверхности, чтобы избежать утечки дочерних изотопов.

Однако в некоторых случаях частичное медленное высвобождение радиоактивных изотопов может быть полезным, поскольку это может способствовать большей однородности дозы, например, на поверхностях брюшной полости, и уменьшению излучения «горячих точек» из-за локальных агрегатов кристаллических частиц.

Радиус излучения основного компонента дозы из серии ²²⁴Ra, альфа-частиц, как правило, составляет менее 0,1 мм в тканях, что позволяет доставлять терапевтически эффективные уровни дозы излучения на поверхности брюшной полости и органов, находящихся в полости, не вызывая повреждения более глубоких областей тканей в брюшной полости. Из предыдущих исследований известно, что излучающие бета-частицы коллоиды и частицы могут проявлять некоторую противоопухолевую активность при использовании в качестве адъювантов в внутрибрюшинной лучевой терапии, однако отдаленные последствия вследствие облучения кишечника, и так далее, привели к тому, что соотношение затрат и пользы для этих продуктов стало неблагоприятным.

Основной причиной побочных эффектов является проникновение излучения в более глубокие области кишечника из-за радиуса действия излучения, составляющего несколько мм. С переходом на излучатели альфа-частиц проблемы проникновения излучения глубоко под поверхность тканей можно избежать. Другим аргументом в пользу альфа-частиц является высокая линейная передача энергии альфа-частиц, вызывающая большое количество летальных разрывов в двойной цепи ДНК в клетках и уменьшающая эффект кислородного статуса для выживания клеток после воздействия. Кроме того, относительная биологическая эффективность, как правило, значительно выше у альфа-частиц, чем у бета-частиц.

Настоящее изобретение имеет несколько отличий от описанных ранее излучающих альфа-частицы коллоидов. (1) Медленное высвобождение ²²⁴Ra и дочерних изотопов, что может иметь эффект «сглаживания» дозы, уменьшая проблемы неравномерного распределения альфа-частиц в области введения. (2) ²¹²Pb, который является долгоживущим дочерним изотопом (t_1/2=10,6 ч) после распада короткоживущих изотопов ²²⁰Rn (t_1/2=56 с) и ²¹⁶Po (t_1/2=0,15 с) легко повторно абсорбируется тестируемыми частицами, что может способствовать уменьшению утечки ²¹²Pb в систему кровообращения. Таким образом, было установлено, что частицы карбоната кальция являются особенно подходящими в качестве носителя для ²²⁴Ra. (3) Сам по себе материал частиц нетоксичен в используемых количествах, и частицы медленно распадаются на нетоксичные ионы, являясь, таким образом, биосовместимыми.

Можно получать частицы, имеющие размеры от нескольких нанометров до нескольких десятков микрометров, радиоактивно метить их с высоким выходом мечения и хранить в течение нескольких дней, что важно, поскольку это позволяет централизованно производить и доставлять в больницы готовые к использованию суспензии частиц. Можно использовать несколько разных видов кристаллов CC, включая гексагональные β-CaCO₃ и орторомбические λ-CaCO₃.

Общие положения

Следует понимать, что любой признак и/или аспект, обсуждаемый выше в связи с соединениями и частицами по изобретению, применяется по аналогии к способам и вариантам применения, описанным в настоящем документе.

Следующие далее фигуры и примеры приведены исключительно для иллюстрации настоящего изобретения. Они предназначены быть иллюстративными, но никоим образом не ограничивающими настоящее изобретение.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Получение ²²⁴Ra

Всю работу с концентрированными радиоактивными препаратами, включая выпаривание растворителя и так далее, проводили в защитной камере с перчатками. Источник ²²⁸Th в 1 M HNO₃ приобретали у коммерческого поставщика. Ac-смолу приобретали у компании Eichrom Technologies LLC (Lisle, IL, USA) в виде предварительно заполненного картриджа.

С целью использования меньшего объема растворителя примерно тридцать процентов материалов в картридже (картридж 1) извлекали и повторно использовали для набивки меньшей по размеру колонки (картридж 2), сделанной из 1-мл колонки для фильтрования (Isolute SPE, Biotage AB, Uppsala, Sweden). Густую суспензию, представляющую собой 20% содержимого исходного картриджа, использовали для иммобилизации ²²⁸Th в 500 микролитрах 1 M HNO₃, куда добавляли 500 микролитров 1 M HCl и инкубировали при встряхивании флакона (4-мл флакон, E-C sample, Wheaton, Millville, NJ, USA) в течение по меньшей мере 4 часов. В картридж 2 вносили небольшое количество (примерно 0,1 мл) Ac-смолы. Затем густую суспензию вносили в картридж 2, используя предварительно заполненный материал в качестве принимающего слоя. Радий был элюирован с картриджа 2 в 2 мл 1 M HCl. 2 мл раствора радия выпаривали до сухого состояния, используя нагревательный блок, флакон продували газообразным N₂ через входное и выходное отверстие тефлоновой трубки в резиново/тефлоновой перегородке на флаконе, направляя кислотные пары в химический стакан с насыщенным раствором NaOH потоком газообразного N₂.

Осадок растворяли в 0,5 мл 1 M HNO₃ и наносили на картридж 3, состоящий из 1-мл колонки Isolute^®, набитой примерно 250 мг анионообменной смолы Dowex. Картридж 3 промывали 7 мл 1 M HNO₃, удаляя ²¹²Pb, и, в завершение, 3-4 мл 8 M HNO₃ для элюции ²²⁴Ra. Элюат ²²⁴Ra выпаривали до сухого состояния, используя нагревательный блок и поток газообразного N₂, и осадок растворяли в 0,1 M HCl. Как правило, более 70% ²²⁴Ra, присутствующего в источнике ²²⁸Th, можно экстрагировать и очищать с использованием описанных методов.

Позже от этапа анионного обмена отказались, и 2 мл неочищенной 1 M HCl использовали без выпаривания и наносили на второй картридж с Ac-смолой, которую промывали дополнительно 0,5 мл HCl, с получением 2,5 мл элюата, содержащего ²²⁴Ra. Элюат выпаривали до сухого состояния, и осадок растворяли в 0,2 мл или более 0,1 M HCl. Перед использованием для мечения частиц в раствор ²²⁴Ra добавляли количество, соответствующее 10% по объему, 5 M раствора ацетата аммония для доведения pH до 5-6.

Пример 2. Измерение радиоактивных образцов

Радиоактивные образцы просчитывали на счетчике Cobra II Autogamma (Packard Instruments, Downer Grove, IL, USA) или счетчике Hidex Automatic Gamma Counter (Hidex, Turku, Finland). При экстракции ²²⁴Ra из источника ²²⁸Th использовали дозкалибратор CRC-25R (Capintec Inc., Ramsey, NJ, USA).

Для определения распределения ²²⁴Ra, ²¹²Pb и ²¹²Bi в реальном времени в образцах использовали охлаждаемый жидким азотом детектор на основе высокочистого германия (HPGe) (GWC6021, Canberra Industries, Meriden CT, USA). Его использовали в сочетании с цифровым анализатором сигналов DSA 1000 и программой Genie 2000 (Canberra).

Пример 3. Получение микрочастиц

Микрочастицы карбоната кальция получали методом спонтанного осаждения. 0,33 M раствор Na₂CO₃ (Merck, Germany) быстро вливали в равный объем 0,33 M раствора CaCl₂ (Merck, Germany). После интенсивного перемешивания на вихревой мешалке в течение 30 секунд суспензию частиц оставляли отстаиваться на 5 минут. Частицы фильтровали через бумажный фильтр, промывали примерно 30 мл воды и сушили в течение ночи при комнатной температуре. Фильтрование и промывание выполняли на стеклянном устройстве для вакуумного фильтрования (Whatman) с 0,45-мкм нитроцеллюлозным фильтром (Whatman). Сухие микрочастицы хранили при комнатной температуре. Полученные микрочастицы имели сферическую форму с диаметром в диапазоне 1-10 мкм и средним диаметром 3-5 мкм, что определяли под микроскопом, используя для анализа автоматический счетчик клеток Countess™ Automated Cell Counter (Invitrogen).

Пример 4. Радиоактивное мечение микрочастиц

Нужное количество частиц CaCO₃ переносили в пробирку эппендорф и суспендировали в 1 мл воды. Суспензию частиц обрабатывали в ультразвуковой бане в течение 10-15 минут, с последующими 4 этапами промывания; первые 2 раза по 1 мл воды, а затем 2 раза по 1 мл 0,1 M Na₂SO₄ (Alfa Aesar, Germany). Частицы отделяли от промывающего раствора центрифугированием. После промывания частицы суспендировали в DPBS (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина (0,1 мл на 15 мг частиц) и инкубировали на миксере HulaMixer (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) в течение 30 минут при комнатной температуре. Программа смешивания была следующей: показатель орбитального движения составлял 14 об/мин, показатель возвратно-поступательного движения составлял 20° и показатель вибрации составлял 3°. К суспензии частиц добавляли 0,1 M раствор Na₂SO₄ в объеме, соответствующем 3 мкг SO₄ на мг частиц (0,3%). Затем раствор ²²⁴Ra переносили в пробирку с суспензией частиц, после чего немедленно добавляли 0,07 M раствор BaCl₂⋅2H₂O (Merck, Germany) в объеме, соответствующем 3 мкг Ba на мг частиц (0,3%). В промежутках между добавлением разных растворов суспензию частиц тщательно перемешивали на вихревой мешалке. Если объем радиоактивного раствора и/или раствора BaCl₂⋅2H₂O, который предстояло добавлять, превышал 10 мкл, его добавляли поэтапно (5-10 мкл единовременно, с тщательным перемешиванием в промежутке). Общий объем раствора для радиоактивного мечения составлял 0,1 мл раствора на 15 мг частиц, то есть, объем супернатанта, удаляемого перед добавлением SO₄-раствора, был скорректирован в соответствии с объемами других добавляемых растворов. Частицы в растворе для радиоактивного мечения инкубировали на миксере HulaMixer в течение минимум 1 часа и 30 минут при комнатной температуре, с использованием той же программы смешивания, которая описана ранее. И наконец, частицы промывали 1-3 раза сахарозным буфером. Сахарозный буфер содержал 94 мг/мл сахарозы (Sigma Ultra, St. Louis, MO, USA) и 2,1 мг/мл Na₂SO₄. Эффективность мечения определяли путем измерения радиоактивности частиц и промывающего раствора(ов) HPGe детектором.

Результаты: для восьми отдельных экспериментов с частицами из трех разных партий частиц, показатели выхода были следующими: ²¹²Pb 96,5 ± 1,9%, ²¹²Bi 96,7 ± 2,1%, ²²⁴Ra 95,5 ± 3,2% (среднее ± SD). Результаты показывают, что ²²⁴Ra с дочерними изотопами эффективно абсорбируются микрочастицами. Частицы карбоната кальция, которые хранились в порошковой форме при комнатной температуре в течение 2 месяцев, абсорбировали ²²⁴Ra и его дочерние изотопы с эффективностью, аналогичной эффективности в случае свежеприготовленных частиц.

Пример 5. Стабильность in vitro радиоактивно меченых микрочастиц

Стабильность in vitro радиоактивно меченых микрочастиц, полученных, как описано в примере 4, изучали в 2 разных растворах. Частицы инкубировали либо в 1-1,4 мл сахарозного буфера при комнатной температуре, либо в 0,5 мл эмбриональной телячьей сыворотки при 37°C. В разные моменты времени суспензии центрифугировали и измеряли радиоактивность в супернатанте и осажденных частицах. Затем, если впоследствии планировалось продолжать изучение стабильности, осадок частиц ресуспендировали в новой аликвоте либо сахарозного буфера, либо эмбриональной телячьей сыворотки, и инкубацию продолжали.

Таблица 2. Удержание ²²⁴Ra частицами карбоната кальция in vitro.

Раствор	Временная точка	% высвобожденной радиоактивности
224Ra
Эмбриональная телячья сыворотка	22 часа	4,13 ± 3,01%
	3 дня	1,18 ± 0,69%
7 дней	1,76 ± 0,34%
Сахарозный буфер	16 часов	1,07%
3 дня	1,70 ± 1,81%

Данные показывают, что ²²⁴Ra хорошо удерживается частицами карбоната кальция в течение нескольких дней in vitro, свидетельствуя о многообещающих качествах для радиотерапевтического применения. Это также указывало на то, что продукт может иметь срок хранения несколько дней, это делает возможным централизованное производство и доставку находящимся в отдалении конечным пользователям.

Пример 6. Реабсорбция/связывание ²¹²Pb на микрочастицах

Микрочастицы CaCO₃ получали, как описано для процедуры радиоактивного мечения, за исключением добавления радиоактивного раствора. Вместо этого частицы инкубировали в смеси 450 мкл эмбриональной телячьей сыворотки и 50 мкл раствора ²²⁴Ra (предварительно нагретого до 37°C) для измерения количества ²¹²Pb, абсорбированного на «холодные» микрочастицы, полученные в тех же условиях, что и в случае радиоактивного мечения. Суспензию частиц инкубировали при 37°C со скоростью вращения 800 об/мин. Через 10 минут суспензию частиц осаждали, 250 мкл супернатанта переносили в пробирку эппендорф и измеряли радиоактивность. Затем частицы ресуспендировали в супернатанте и исследование продолжали с измерениями через 1 час и 24 часа. В таблице 3 приведены результаты исследования.

Таблица 3. Абсорбция ²¹²Pb из растворов на частицы карбоната кальция.

Время	% суммарной радиоактивности 212Pb, измеренный в супернатанте
детектор на основе германия, Canberra
0 минут	100%
10 минут	25,4%
1 час	17,9%
24 часа	29,0%

Данные показывают, что находящийся в среде ²¹²Pb в значительной степени абсорбируется из среды, это указывает на то, что вслед за диффузией ²²⁰Rn в микроокружение частиц карбоната кальция может происходить значительная реабсорбция дочернего изотопа ²¹²Pb. Это может способствовать уменьшению системной токсичности от поступления ²¹²Pb в кровь.

Пример 7. Биораспределение и стабильность in vivo радиоактивно меченых микрочастиц

Предпосылки: для оценки полезности ²²⁴Ra-меченых частиц карбоната кальция для использования в брюшной полости суспензию частиц вводили внутрибрюшинной инъекцией мышам и затем определяли биораспределение ²²⁴Ra. Методы: радиоактивно меченые микрочастицы получали, как описано в примере 4. После промывания осадок частиц ресуспендировали в сахарозном буфере при pH 7-7,5 до концентрации частиц примерно 13 мг/мл. Для исследований биораспределения использовали выведенных в Институте самок мышей Athymic Nude-Foxn1^nu в возрасте 6-19 недель с массой тела 17,1-28,3 г. Им вводили внутрибрюшинной инъекцией 0,4 мл суспензии частиц, содержащей 11-18 кБк ²²⁴Ra, связанного с примерно 5 мг микрочастиц. Мышей умерщвляли и собирали разные ткани для измерения радиоактивности через 20 часов (n=2), 4 дня (n=3) и 7 дней (n=3) после инъекции. В качестве контроля проводили эксперименты по изучению биораспределения свободного ²²⁴Ra (растворенного RaCl₂) путем введения 0,25 мл 0,9% раствора NaCl с примерно 12 кБк ²²⁴Ra внутрибрюшинной инъекцией каждой мыши. Раствор ²²⁴RaCl₂ имел pH 5,5. Для сравнения, группы из 3 мышей умерщвляли в те же временные точки после инъекции, что и в исследовании биораспределения с радиоактивными микрочастицами (фигура 1A).

Результаты: на фигурах 1A и B показаны профили биораспределения ²²⁴Ra-меченых частиц карбоната кальция и свободного ²²⁴Ra, соответственно. Исходя из поглощения в бедренной кости, высвобождение ²²⁴Ra из ²²⁴Ra-меченых частиц карбоната кальция происходит медленно, в количестве примерно одной пятой части через 20 часов, с возрастанием до примерно одной трети через 7 дней после введения. Это ограниченное высвобождение радиоактивного изотопа может в одном аспекте быть полезным, поскольку это позволяет уменьшать неоднородность дозы, поступающей из радиоактивно меченых частиц. Следует отметить, что имеет место значительное поглощение внутрибрюшинным жиром, что является многообещающим результатом, учитывая роль внутрибрюшинного жира в распространении раковых метастазов в брюшной полости. Заключение: ²²⁴Ra-меченые частицы карбоната кальция обладают очень перспективными свойствами распределения с точки зрения внутриполостной лучевой терапии.

Пример 8. Противоопухолевая активность ²²⁴Ra-меченых микрочастиц в модели рака в брюшной полости у «голых» мышей

Предпосылки: для тестирования терапевтической активности ²²⁴Ra-меченых микрочастиц карбоната кальция использовали модель опухоли с внутрибрюшинными микрометастазами на «голых» мышах. Материалы и методы: Клетки SKOV-3-luc (5×10⁶ клеток в 0,25 мл RPMI) вводили внутрибрюшинной инъекцией выведенным в Институте, 6-недельным самкам мышей Athymic Nude-Foxn1^nu с массой тела 17,7-23,6 г. Через три дня мышам вводили внутрибрюшинными инъекциями ²²⁴Ra-меченые микрочастицы карбоната кальция в сахарозном буфере с радиоактивностью 200 кБк/кг (0,25-0,3 мл), 600 кБк/кг (0,35-0,4 мл) или 3 инъекции в дозе 200 кБк/кг (0,25-0,4 мл). В последней группе промежуток между дробными инъекциями составлял 48 часов. Контрольные животные получали солевой раствор (0,4 мл) или 200 мг/кг (0,35-0,4 мл) немеченых микрочастиц в сахарозном буфере. Мышей рандомизировали по группам лечения до инокуляции клеток, при этом каждая группа состояла из 8 мышей. В день 44 и 45 после начала лечения всех животных подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации. При вскрытии наличие макроскопических опухолей оценивали путем тщательной визуальной инспекции каждого животного, и все видимые опухоли в брюшной полости извлекали и взвешивали.

Результаты: данные представлены на фигуре 2. Отсутствовали существенные различия между средней массой опухолей в двух контрольных группах животных, получавших либо солевой раствор, либо немеченые микрочастицы карбоната кальция. Во всех группах животных, получавших ²²⁴Ra-меченые микрочастицы, было отмечено сильное подавление опухолевого роста, о чем свидетельствовало сильное уменьшение массы опухолей со статистически достоверным различием по сравнению с контрольными животными. Хотя отсутствовали статистически значимые различия между группами лечения ²²⁴Ra, имела место тенденция к большему подавлению опухолевого роста при применении более высокой дозы ²²⁴Ra и дробного лечения.

Заключение: ²²⁴Ra-меченые микрочастицы карбоната кальция продемонстрировали сильную и устойчивую противоопухолевую активность у мышей с опухолями в брюшной полости.

Пример 9. Терапевтические эффекты в модели асцита при агрессивной форме рака

Предпосылки: рак яичника у человека часто приводит к асцитам брюшной полости. Клетки линии ES-2 рака яичника человека, введенные «голым» мышам, характеризуются агрессивным ростом опухолевых клеток и развитием связанных с раком асцитов.

Материалы и методы: клетки ES-2 (10×10⁶ клеток в 0,3 мл RPMI) вводили внутрибрюшинной инъекцией выведенным в Институте 6-недельным самкам мышей Athymic Nude-Foxn1^nu с массой тела 18,1-23,2 г. Через 25 часов мышам вводили внутрибрюшинными инъекциями ²²⁴Ra-меченые микрочастицы карбоната кальция в сахарозном буфере в дозе 100 кБк/кг (0,3 мл), 300 кБк/кг (0,3-0,35 мл) или 500 кБк/кг (0,3-0,35 мл). Контрольные животные получали 0,35 мл солевого раствора. Мышей рандомизировали по группам лечения до инокуляции клеток, при этом каждая группа состояла из 7-8 мышей. Животных взвешивали и контролировали прогрессирование заболевания минимум 3 раза в неделю, и ежедневно при появлении клинических признаков заболевания, указывающих на приближение конечной стадии заболевания. Всех мышей подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации в день, когда они достигали стадии критического ухудшения состояния, принимая во внимание растяжение брюшной полости, мешающее движению или дыханию, быструю потерю или увеличение массы тела, наряду с внешним видом и поведением животных. После эвтаназии мышей проводили вскрытие для макропатологического исследования.

Результаты: время выживания регистрировали, как дни после инокуляции клеток опухоли, и представляли в виде предварительной кривой выживаемости с включением данных до дня 20 периода последующего наблюдения (фигура 3). В день 19 после инокуляции клеток опухоли все мыши в группе получения солевого раствора и группе с наименьшей дозой (100 кБк/кг) были подвергнуты эвтаназии, в то время как 86% мышей (6/7) в группе средней дозы (300 кБк/кг) и высокой дозы (500 кБк/кг) не достигали критического состояния здоровья. Этих оставшихся животных оценивали в день 20. Средние показатели выживаемости для каждой группы представлены в таблице 4.

Таблица 4. Средняя выживаемость мышей с асцитами брюшной полости при раке ES-2, которым вводили солевой раствор или ²²⁴Ra-меченые частицы карбоната кальция

Группа лечения	Число мышей в группе	Среднее время выживания после инокуляции клеток
NaCl	8	12 дней
100 кБк/кг, микрочастицы 224Ra-CaCO3	8	13 дней
300 кБк/кг, микрочастицы 224Ra-CaCO3	7	более 20 дней
500 кБк/кг, микрочастицы 224Ra-CaCO3	7	более 20 дней

Заключение: Значительное продление жизни без признаков заболевания было достигнуто при введении ²²⁴Ra-меченых микрочастиц карбоната кальция, что указывает на существенный потенциал для лечения асцитов брюшной полости.

Пример 10A. Получение двухкомпонентной радиотерапевтической смеси

В некоторых аспектах может быть полезно комбинировать ²²⁴Ra-меченые частицы карбоната кальция со специфическим для клеток радиофармацевтическим средством. Этого достигают путем объединения раствора ²²⁴Ra в равновесии с дочерними изотопами с ²¹²Pb-связывающим хелатирующим конъюгатом до создания контакта с частицами карбоната кальция.

Методы: в 0,2 мл 0,5 M аммоний-ацетатного раствора ²²⁴Ra в равновесии с дочерними изотопами добавляли 1 мг/мл TCMC-меченого моноклонального антитела (мАт) (трастузумаб, цетуксимаб или OI-3) и инкубировали в течение 60 минут. Затем реакционную смесь добавляли к 30 мг микрочастиц карбоната кальция в 0,2 мл 1% бычьего сывороточного альбумина и смешивали в течение 30 минут. Затем смесь центрифугировали, супернатант и осадок просчитывали отдельно на гамма-счетчике и анализировали при помощи детектора на основе германия.

Готовили радиотерапевтическую смесь, состоящую из ²¹²Pb-меченого антитела и микрочастиц ²²⁴Ra-CaCO₃. Для мечения антитела ²¹²Pb антитело цетуксимаб сначала конъюгировали с хелатором, TCMC.

Для получения радиоиммуноконъюгата раствор ²²⁴Ra в 0,5 M растворе ацетата аммония (pH 5-6) смешивали с конъюгатом TCMC-цетуксимаб и проводили реакцию в течение 30 минут при 37°C со скоростью вращения 350 об/мин. Радиохимическую чистоту полученного продукта оценивали методом хроматографии на бумажных полосках (Biodex), и она превышала 95% для ²¹²Pb. Микрочастицы CaCO₃ получали, как описано для процедуры радиоактивного мечения, за исключением того, что добавленная радиоактивность представляла собой раствор, описанный выше, содержащий как свободный ²²⁴Ra, так и ²¹²Pb-меченый конъюгат TCMC-цетуксимаб. Через 1,5 часа инкубации при комнатной температуре на миксере HulaMixer частицы в содержащем радиоактивность растворе осаждали, и фракции супернатанта и частиц разделяли. Распределение радиоактивности ²²⁴Ra и ²¹²Pb в осадке частиц и супернатанте определяли при помощи детектора HPGe. Анализ радиохимической чистоты проводили на аликвоте супернатанта.

Данные представлены в таблицах 5 и 6. В таблице 6 показано, что 66,39% от общей радиоактивности ²¹²Pb было обнаружено в супернатанте, в то время как 98,41% ²²⁴Ra оставалось на частицах. Из высвобожденного ²¹²Pb, по меньшей мере 98% было связано с белком (таблица 5), что представляет собой фракцию связанного с антителом ²¹²Pb до того, как антитело было смешано с частицами. В таблице 6 представлены: фракция конъюгата ²¹²Pb-антитело, а также ²²⁴Ra в свободном состоянии и связанный с частицами карбоната кальция. Данные показывают, что ²²⁴Ra связывается с частицами, в то время как основная часть конъюгата с ²¹²Pb свободно циркулирует в среде. Таким образом, была получена бифункциональная радиотерапевтическая смесь, подходящая для инъекции.

Заключение: растворы ²²⁴Ra, смешанного с конъюгатами ²¹²Pb-TCMC-антитело, могут быть использованы для создания микрочастиц ²²⁴Ra-CC, с получением на выходе двухкомпонентной терапевтической смеси радиоиммуноконъюгата (RIC) и радиоактивно меченых микрочастиц, имеющей свойства нацеленности на антиген, а также радиотерапевтические свойства микрочастиц. Это может быть полезным для комбинирования общего облучения полости и специфического для клеток опухоли направленного лечения RIC против рака. Добавление RIC может способствовать увеличению микрораспределения альфа-излучения для повышения терапевтического эффекта в случае устойчивых раковых клеток.

Таблица 5. Анализ методом тонкослойной хроматографии конъюгата ²¹²Pb-TCMC-антитело до и после абсорбции на частицы карбоната кальция

RCP анализ связанной с белком фракции
	Время в буфере формулирования	Гамма-спектроскопия при помощи детектора на основе германия, Canberra	Гамма-счетчик Cobra II NaI
	212Pb		70-80 кэВ	220-260 кэВ
До смешивания с частицами	13 минут		98,2%		97,2%	95,2%
20 минут				99,6%	98,1%
После мечения частиц	10 минут				100,0%	98,1%
20 минут				98,2%	100,0%

Таблица 6. Абсорбция частицами ²²⁴Ra из раствора, содержащего конъюгат ²¹²Pb-TCMC-антитело

	% общей радиоактивности
212Pb	224Ra
Частицы	33,61%	98,41%
Фракция супернатанта/антитела	66,39%	1,59%

Пример 10B. Описание набора для получения радиотерапевтической смеси меченого ²¹²Pb радиоиммуноконъюгата и меченых ²²⁴Ra микрочастиц

Флакон (A) с раствором ²²⁴Ra в водном растворе (например, 0,5 M растворе ацетата аммония, pH 5-6) оставляют распадаться на 1 день или более для получения ²¹²Pb. Флакон (B) содержит водный раствор конъюгата TCMC-антитело, или конъюгата антитела с аналогичным хелатором, и флакон (C) содержит сухие или находящиеся в воде микрочастицы карбоната кальция. Содержимое флаконов A и B смешивают в одном из флаконов и инкубируют в течение срока от 1 минуты до 4 часов, а затем смешивают с содержимым флакона C и инкубируют в течение срока от 1 минуты до 4 часов. После каждого этапа инкубации можно проводить или не проводить контроль качества. В завершение, объединенную смесь A, B и C набирают в шприц и вводят пациенту.

Пример 11. Радиоактивное мечение микрочастиц разных размеров и удержание ими ²²⁴Ra и дочернего изотопа ²¹²Pb

Эффективность мечения и удержания с течением времени ²²⁴Ra и его дочернего изотопа ²¹²Pb изучали для радиоактивно меченых микрочастиц CaCO₃ 2 разных размеров в пределах предпочтительного диапазона размеров 1-10 мкм. Было установлено, что показатели средневзвешенного размера частиц составляли 1,1 и 8,9 мкм при определении методом оптического анализа одиночных частиц, таким образом, были представлены оба крайних значения предпочтительного диапазона размера частиц. Самые крупные частицы получали, как описано в примере 3, и самые мелкие частицы приобретали у компании PlasmaChem GmbH (Berlin, Germany). Частицы метили ²²⁴Ra, как описано в примере 4, за исключением того, что был опущен этап обработки ультразвуком и инкубации в 0,5% растворе БСА в DPBS. После завершения процедуры мечения радиоактивность частиц и промывающих растворов измеряли в течение 1 минуты в гамма-счетчике Hidex. Поскольку распад ²²⁴Ra приводит к очень небольшой эмиссии гамма-излучения, определение радиоактивности ²²⁴Ra в основном осуществляли путем измерения эмиссии гамма-излучения продукта его распада, ²¹²Pb. Импульсы диапазона 65-345 кэВ, которые включали радиоактивность гамма-излучения ²²⁴Ra, а также радиоактивность гамма- и рентгеновского излучения дочернего изотопа ²¹²Pb, выбирали и суммировали для дальнейших расчетов. Образцы оставляли для распада минимум на 24 часа после мечения для установления равновесия между ²²⁴Ra и ²¹²Pb, прежде, чем были проведены повторные измерения. Эффективность мечения определяли, как связанную радиоактивность: процент суммарной радиоактивности, добавленной к микрочастицам, который был связан с частицами после процедуры мечения.

где A_частиц представляет собой радиоактивность суспензии частиц после промывания и W_{растворов} представляет собой общую радиоактивность промывающих растворов. Измерения сразу после завершения мечения частиц использовали для оценки эффективности мечения ²¹²Pb, предполагая незначительный вклад эмиссии гамма-излучения ²²⁴Ra в окне 65-345 кэВ. Равновесие между ²²⁴Ra и дочерним изотопом ²¹²Pb достигается, когда скорость распада ²¹²Pb равна скорости его образования из ²²⁴Ra. Чистый источник ²²⁴Ra достигает условий равновесия через примерно 2 дня. В настоящем документе предполагается, что равновесие между ²²⁴Ra и ²¹²Pb в образцах достигается через 24 часа, поскольку ожидается, что образцы имеют относительно равное распределение двух изотопов после мечения, то есть, равновесие будет достигнуто быстрее, чем в случае чистого источника ²²⁴Ra. Вследствие этого, измерение образцов в состоянии равновесия использовали для оценки эффективности мечения ²²⁴Ra в момент времени 0.

Для определения удержания ²²⁴Ra и ²¹²Pb на частицах после мечения частицы инкубировали в 1 мл сахарозного буфера (94 мг/мл сахарозы, 2,1 мг/мл Na₂SO₄) при комнатной температуре. Через 24 часа, 3, 5 и 7 дней суспензию частиц центрифугировали и измеряли радиоактивность в супернатанте и осадке частиц. Затем, если исследования стабильности планировалось продолжать до более поздней временной точки, осадок частиц ресуспендировали в новой аликвоте сахарозного буфера и инкубировали далее. Удержанную радиоактивность оценивали, как процент от общей радиоактивности образца в конкретный момент времени, который не отделялся от частиц после удаления супернатанта (A_суп).

Образцы хранили в течение минимум 24 часов до повторного измерения и, как описано выше, удержанную радиоактивность ²¹²Pb оценивали на основании измерений, произведенных сразу после удаления супернатанта, в то время как удержанную радиоактивность ²²⁴Ra рассчитывали на основании измерений в состоянии равновесия.

Результаты: для 12 (14) отдельных экспериментов радиоактивного мечения с 1,1-мкм (8,9-мкм) частицами, показатели эффективности радиоактивного мечения были следующими (среднее ± стандартное отклонение): ²²⁴Ra: 93,6 ± 5,8% (88,8 ± 6,5%) и ²¹²Pb: 87,6 ± 7,7% (84,3 ± 7,7%). Результаты представлены на фигуре 4 и показывают, что ²²⁴Ra и дочерний изотоп ²¹²Pb абсорбируются с высоким выходом микрочастицами, независимо от различий в их размерах.

Результаты экспериментов по удержанию (фигура 5) показывают, что ²²⁴Ra и дочерний изотоп ²¹²Pb хорошо удерживаются на частицах CaCO₃ в течение нескольких дней in vitro в сахарозном буфере, который может быть подходящим фармацевтическим носителем для радиоактивно меченых частиц. В среднем, удержанная радиоактивность превышала 95% во всех временных точках для частиц обоих размеров. Это указывало на то, что продукт может иметь срок хранения несколько дней, это делает возможным централизованное производство и доставку находящимся в отдалении конечным пользователям.

Пример 12. Терапевтический и гематологический эффект ²²⁴Ra-меченых микрочастиц CaCO₃ у мышей с асцитами

Предпосылки: рак яичника у человека часто приводит к асцитам брюшной полости. Клетки линии ES-2 рака яичника человека, введенные «голым» мышам, характеризуются агрессивным ростом опухолевых клеток и развитием связанных с раком асцитов.

Методы: клетки ES-2 (1×10⁶ клеток в 0,35 мл RPMI) вводили внутрибрюшинной инъекцией выведенным в Институте 5-6-недельным самкам мышей Athymic Nude-Foxn1^nu с массой тела 17,0-23,9 г. Через двадцать два часа мышам вводили внутрибрюшинными инъекциями ²²⁴Ra-меченые микрочастицы CaCO₃ (8,9 мкм средний размер, определенный методом оптического анализа одиночных частиц) в сахарозном буфере в дозах 150 кБк/кг (0,25-0,35 мл), 300 кБк/кг (0,3-0,35 мл), 1000 кБк/кг (0,4 мл) или 2 инъекции в дозе 150 кБк/кг (0,3-0,4 мл). В последней группе промежуток между дробными инъекциями составлял 1 неделю. Контрольные животные получали 0,35 мл солевого раствора. Мышей рандомизировали по группам лечения до инокуляции клеток, при этом каждая группа состояла из 3-10 мышей. Животных подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации, когда они достигали заранее определенного критического состояния, как описано в примере 9. Мониторинг их состояния также проводили аналогично тому, как описано в примере 9. Кроме того, максимально 100 мкл крови собирали из боковой подкожной вены ноги за 13 дней до и через 13 и 26 дней после начала лечения. Образцы собирали от 3-5 мышей в каждой группе в каждой временной точке. Оценку потенциальной гематологической токсичности проводили путем подсчета лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов в автоматизированном ветеринарном гематологическом анализаторе (scil Vet abc, ABX Diagnostics, Montpellier, France).

Результаты: время выживания регистрировали, как дни после инокуляции клеток опухоли, и представляли в виде кривой выживаемости на фигуре 6 и в виде среднего времени выживания в таблице 7. Все дозы ²²⁴Ra-меченых микрочастиц CaCO₃ приводили минимум к удвоению среднего времени выживания по сравнению с контрольной группой животных, получавших солевой раствор. Эти результаты показывают, что ²²⁴Ra-меченые микрочастицы CaCO₃ даже в относительно низких дозах (2,6-3,6 кБк на мышь в группе 150 кБк/кг) имеют значительный потенциал для лечения асцитов брюшной полости. Результаты гематологических анализов (фигура 7) показывают отсутствие уменьшения количества лейкоцитов по сравнению с уровнем до начала лечения. Увеличение количества лейкоцитов в контрольной группе в день 13 и в группе 150 кБк/кг в день 26 по сравнению с более ранними временными точками, возможно, происходит вследствие иммунного ответа на накопление раковых клеток в асците брюшной полости, поскольку по времени это коррелирует с периодом времени, когда мыши в этих группах начинали испытывать сильную нагрузку асцитов и были близки к достижению критического состояния, при котором исследование заканчивалось. Среднее количество тромбоцитов во всех группах лечения существенно не отличалось от эталонных значений (1100 ± 143×10⁹/л) для этой линии мышей, согласно информации от заводчика (Envigo). Что касается эритроцитов, никаких заметных отличий в количестве не наблюдали ни в одной из групп лечения в сравнении с контрольной группой животных, получавших солевой раствор. Эти результаты свидетельствуют о том, что ²²⁴Ra-меченые микрочастицы CaCO₃ хорошо переносятся и не вызывают какие-либо признаки гематологической токсичности при терапевтически эффективных уровнях доз, протестированных в данном исследовании.

Выводы: значительное продление жизни без признаков заболевания было достигнуто после лечения ²²⁴Ra-мечеными микрочастицами CaCO₃. Не наблюдали какого-либо связанного с лечением влияния на гематологические параметры, в совокупности, эти результаты свидетельствовали о том, что лечение микрочастицами ²²⁴Ra-CaCO₃ хорошо переносится в дозах, приводящих к значительному терапевтическому эффекту.

Таблица 7. Среднее время выживания мышей, которым внутрибрюшинной инъекцией вводили 1×10⁶ клеток ES-2 и через 22 часа вводили солевой раствор или ²²⁴Ra-меченые микрочастицы CaCO₃

Группа лечения	Число мышей в группе	Среднее время выживания (в днях) после инокуляции клеток
NaCl	10	17
150 кБк/кг, микрочастицы 224Ra-CaCO3	9	34
300 кБк/кг, микрочастицы 224Ra-CaCO3	9	40
2×150 кБк/кг, микрочастицы 224Ra-CaCO3	9	36
1000 кБк/кг, микрочастицы 224Ra-CaCO3	3	46

Пример 13. Лечение мышей с асцитами брюшной полости на разных стадиях развития заболевания

Предпосылки: злокачественные асциты часто имеют место на поздних стадиях рака в брюшной полости и связаны с сокращением продолжительности жизни и ухудшением качества жизни пациентов, следовательно, существует медицинская потребность в усовершенствованных стратегиях лечения. Противоасцитную активность микрочастиц ²²⁴Ra-CaCO₃ оценивали в модели асцита при раке ES-2 на «голых» мышах, начиная лечение в разные дни после инокуляции клеток.

Методы: клетки ES-2 (1×10⁶ клеток в 0,2-0,35 мл RPMI) вводили внутрибрюшинной инъекцией выведенным в Институте 5-6-недельным самкам мышей Athymic Nude-Foxn1^nu с массой тела 17,0-23,9 г в момент инокуляции. Животные, рандомизированные по группам, состоящим из 5-10 мышей, получали внутрибрюшинные инъекции ²²⁴Ra-меченых микрочастиц CaCO₃ (8,9 мкм средний размер, определенный методом оптического анализа одиночных частиц) в сахарозном буфере через 22 часа, 2, 5, 7 и 9 дней после инокуляции клеток. Животные во всех группах лечения получали дозу 700 кБк/кг (0,29-0,4 мл), за исключением группы животных, лечение которых начинали через 22 часа после инокуляции клеток, им вводили дозу 300 кБк/кг (0,3-0,35 мл). Мыши в контрольных группах получали солевой раствор (0,35-0,4 мл) в день 1 (10 мышей), 5 (5 мышей) и 9 (10 мышей) после инокуляции клеток. Животных подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации, когда они достигали заранее определенного критического состояния, как описано в примере 9. Мониторинг их состояния также проводили аналогично тому, как описано в примере 9.

Результаты: время выживания регистрировали, как дни после инокуляции клеток опухоли, и представляли в виде кривой выживаемости на фигуре 8 и в виде среднего времени выживания в таблице 8. Увеличение среднего времени выживания по сравнению с животными в контрольной группе, получавшими солевой раствор, наблюдали, когда мыши получали ²²⁴Ra-меченые микрочастицы CaCO₃ через 1-7 дней после инокуляции клеток. Терапевтический эффект коррелировал с днем начала лечения, то есть, наиболее значительное увеличение продолжительности жизни наблюдали в случае начала лечения в самые ранние моменты времени после инокуляции клеток. Как видно из таблицы 8, также имело место уменьшение количества мышей, имеющих асциты в момент эвтаназии, в группах животных, получавших микрочастицы ²²⁴Ra-CaCO₃, по сравнению с контролем. Это несмотря на то, что получавшие лечение животные имели более длительный период выживания после инокуляции опухоли и, следовательно, больше времени для развития асцитов.

Выводы: лечение ²²⁴Ra-мечеными микрочастицами CaCO₃ имело заметный противоасцитный эффект у мышей, которым внутрибрюшинно инокулировали клетки ES-2.

Таблица 8. Среднее время выживания мышей в модели асцита брюшной полости при раке яичника ES-2, которым вводили солевой раствор или ²²⁴Ra-меченые микрочастицы CaCO₃ в разные моменты времени после инокуляции клеток

Группа лечения	Среднее время выживания (в днях) после инокуляции клеток	Число мышей, умерщвленных из-за асцита	Число мышей в группе	% мышей, умерщвленных из-за асцита
День 1+5+9: NaCl	16	25	25	100%
День 1: 300 кБк/кг, микрочастицы 224Ra-CaCO3	40	4	9	44%
День 2: 700 кБк/кг, микрочастицы 224Ra-CaCO3	33	4	5	80%
День 5: 700 кБк/кг, микрочастицы 224Ra-CaCO3	26	1	5	20%
День 7: 700 кБк/кг, микрочастицы 224Ra-CaCO3	20	2	5	40%
День 9: 700 кБк/кг, микрочастицы 224Ra-CaCO3	16,5	7	10*	78%

Пример 14. Терапевтический эффект ²²⁴Ra-меченых микрочастиц карбоната кальция в мышиной модели микрометастазов в брюшной полости

Предпосылки: у пациентов с раком яичника после максимальной циторедуктивной хирургии часто случаются рецидивы вследствие остающихся в брюшной полости клеток опухолей и микрометастазов. Для имитации ситуации остаточного заболевания в брюшной полости у пациентов, 1×10⁵ клеток линии ES-2, приводящих к развитию асцита, инокулировали «голым» мышам и через 1 час после введения клеток начинали лечение ²²⁴Ra-мечеными микрочастицами CaCO₃.

Методы: клетки ES-2 (1×10⁵ клеток в 0,2 мл RPMI) вводили внутрибрюшинной инъекцией выведенным в Институте 6-9-недельным самкам мышей Athymic Nude-Foxn1^nu с массой тела 18,5-28,8 г. Через час после инокуляции клеток мышам вводили внутрибрюшинными инъекциями дозу 750 кБк/кг ²²⁴Ra-меченых микрочастиц CaCO₃ 2 разных размеров в сахарозном буфере (0,31-0,5 мл). Животные контрольной группы получали 0,4 мл солевого раствора. Было установлено, что показатели средневзвешенного размера частиц составляли 1,1 и 8,9 мкм при определении методом оптического анализа одиночных частиц, таким образом, были представлены оба крайних значения предпочтительного диапазона размера частиц. Самые крупные частицы получали, как описано в примере 3, и самые мелкие частицы приобретали у компании PlasmaChem GmbH. Мышей рандомизировали по группам лечения до инокуляции клеток, при этом каждая группа состояла из 12-13 мышей. Животных подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации, когда они достигали заранее определенного критического состояния, как описано в примере 9. Мониторинг их состояния также проводили аналогично тому, как описано в примере 9.

Результаты: время выживания регистрировали, как дни после инокуляции клеток опухоли, и представляли в виде кривой выживаемости с включением данных до дня 80 периода последующего наблюдения, как показано на фигуре 9, и в виде среднего времени выживания в таблице 9. Среднее время выживания было увеличено на 42 дня (в 3,2 раза) и 36 дней (в 2,9 раза) по сравнению с животными в контрольной группе, получавшими солевой раствор, в случае лечения ²²⁴Ra-мечеными крупными и мелкими частицами CaCO₃, соответственно. В день 80 4/12 (33,3%) и 3/12 (25%) мышей, получавших частицы размером 8,9 мкм и 1,1 мкм, были живы, в сравнении с 1/13 (7,7%) животным в контрольной группе. Статистически значимые различия между кривыми выживаемости в двух группах животных, получавших ²²⁴Ra, отсутствовали.

Вывод: результаты показывают, что ²²⁴Ra-меченые частицы CaCO₃ обладают значительным потенциалом для лечения остаточного заболевания в брюшной полости, с примерно 3-кратным увеличением среднего времени выживания по сравнению с животными контрольной группы, получавшими солевой раствор, а также выживанием нескольких особей в течение длительного периода времени. Результаты также указывают на то, что частицы с обоими крайними значениями предпочтительного диапазона размера 1-10 мкм имеют сходную терапевтическую эффективность в данной модели, имитирующей микрометастатическое заболевание.

Таблица 9. Среднее время выживания мышей, которым внутрибрюшинной инъекцией вводили 1×10⁵ клеток ES-2 и через 1 час вводили ²²⁴Ra-меченые микрочастицы CaCO₃ двух разных размеров, по сравнению с контрольной группой животных, получавших солевой раствор

Группа лечения	Число мышей в группе	Среднее время выживания (в днях) после инокуляции клеток	% выживших в день 80 периода последующего наблюдения
NaCl	13	19	7,7%
750 кБк/кг, микрочастицы 224Ra-CaCO3 (8,9 мкм)	12	61	33,3%
750 кБк/кг, микрочастицы 224Ra-CaCO3 (1,1 мкм)	12	55	25,0%

Пример 15. Абсорбция ²¹²Pb на микрочастицы карбоната кальция

Для определения количества высвобожденного из ²²⁴Ra-меченых микрочастиц CaCO₃ ²¹²Pb, который абсорбировался на нерадиоактивные частицы в течение 24 часов, проводили диализ. Микрочастицы CaCO₃ метили ²²⁴Ra, как описано в примере 4, за исключением того, что был опущен этап обработки ультразвуком и инкубации в 0,5% растворе БСА в DPBS. Кроме того, готовили нерадиоактивные частицы точно таким же образом, за исключением этапа добавления радиоактивного раствора. Нерадиоактивные частицы (50 мг) разбавляли в DPBS (pH 7) до общего объема 14 мл в конической 15-мл центрифужной пробирке. Примерно 5 мг радиоактивных частиц в DPBS (0,15-0,40 мл) вносили в диализное устройство (Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices, 20 кДа НОММ, ThermoFisher) и помещали в пробирку, содержащую суспензию нерадиоактивных частиц, которая служила диализным буфером. Пробирку с находящимся внутри диализным устройством инкубировали в течение 24 часов со встряхиванием при комнатной температуре. После инкубации 15-мл пробирку центрифугировали и супернатант удаляли. Радиоактивность в диализном устройстве (A_д), в супернатанте диализного буфера (A_с) и в осажденных частицах из 15-мл пробирки (A_о) измеряли в гамма-счетчике Hidex. Процент высвобожденного в течение 24 часов ²¹²Pb оценивали следующим образом:

Процент высвобожденной радиоактивности ²¹²Pb, абсорбированной на нерадиоактивные частицы CaCO₃, определяли следующим образом:

В таблице 10 представлены результаты исследования, которые показывают, что ²¹²Pb, высвобожденный в DPBS из радиоактивно меченых частиц, абсорбируется в высокой степени на частицы CaCO₃. Более половины высвобожденной радиоактивности ²¹²Pb, как правило, повторно связывается с частицами. Это является свидетельством того, что, если дочерние изотопы ²²⁴Ra (²²⁰Rn, ²¹⁶Po или ²¹²Pb) высвобождаются из частиц, либо из-за энергии отдачи, либо из-за диффузии ²²⁰Rn, впоследствии может иметь место значительная реабсорбция дочернего изотопа ²¹²Pb. Это очень полезная концепция, поскольку это может способствовать уменьшению системной токсичности из-за перераспределения дочерних изотопов из брюшной полости, например, за счет предотвращения поступления ²¹²Pb в кровоток. Заключение: микрочастицы карбоната кальция особенно хорошо подходят для удержания ²²⁴Ra и продуктов его распада, поскольку они способны повторно абсорбировать свободный ²¹²Pb, возникающий в результате диффузии ²²⁰Rn из ²²⁴Ra-меченых частиц карбоната кальция.

Таблица 10. Количество ²¹²Pb, высвобожденного из ²²⁴Ra-меченых микрочастиц CaCO₃ и абсорбированного на нерадиоактивные частицы

Размер частиц	% высвобожденной радиоактивности 212Pb	% высвобожденной радиоактивности 212Pb, абсорбированной на частицах
1,1 мкм	6,6%	75,3%
8,9 мкм	5,9%	56,7%

Пример 16. Биораспределение и in vivo стабильность радиоактивно меченых микрочастиц

В этом примере данные из примера 7 вновь представлены в размерности Бк на грамм разных тканей. Инъецируемую дозу нормировали до величины 10 кБк на мышь. Измерения образцов через примерно 2,5-3 часа после умерщвления мышей использовали для оценки количества ²¹²Pb, при этом повторные измерения образцов через 3-4 дня после умерщвления мышей использовали для определения количества ²²⁴Ra. Для определения радиоактивности в образце в момент эвтаназии данные для ²²⁴Ra были скорректированы с учетом распада.

Результаты: распределение в тканях ²²⁴Ra-меченых частиц CaCO₃ через 20 часов, 4 и 7 дней после инъекции в сравнении с раствором свободного ²²⁴Ra представлено на фигуре 10 в виде средней радиоактивности на грамм ткани. На фигуре 11 показано биораспределение дочернего изотопа ²¹²Pb. Когда радиоактивная метка связана с частицами, имеет место значительный сдвиг в воздействии излучения на ткани, с сильно уменьшенным воздействием на скелет и высокой степенью воздействия, предположительно, на поверхность органов брюшной полости. Заключение: ²²⁴Ra-меченые микрочастицы карбоната кальция демонстрируют определенный потенциал в качестве локального радиотерапевтического средства для брюшной полости.

Пример 17. Терапевтический эффект в модели агрессивного асцита при раке

В этом примере данные из примера 9 были дополнены данными более длительного последующего наблюдения мышей и скорректированными уровнями доз после повторной калибровки дозкалибратора Capintec CRC-25R. Дозы, вводимые мышам, были скорректированы до 35 кБк/кг, 100 кБк/кг и 165 кБк/кг.

Результаты: время выживания регистрировали, как дни после инокуляции клеток опухоли, и представляли в виде кривой выживаемости с включением данных до дня 30 периода последующего наблюдения на фигуре 12 и в виде среднего времени выживания в таблице 11. Средняя и высокая доза частиц ²²⁴Ra-CaCO₃ приводили к почти удвоению среднего времени выживания по сравнению с контрольными животными, получавшими солевой раствор, в этой модели агрессивного асцита. Одна мышь в группе самой высокой дозы жила в течение 138 дней после инокуляции клеток и при ее эвтаназии признаки заболевания обнаружены не были.

Таблица 11. Среднее время выживания мышей, которым внутрибрюшинной инъекцией вводили 10×10⁶ клеток ES-2 и через 25 часов вводили солевой раствор или ²²⁴Ra-меченые микрочастицы CaCO₃

Группа лечения	Число мышей в группе	Среднее время выживания (в днях) после инокуляции клеток
NaCl	8	12
35 кБк/кг, микрочастицы 224Ra-CaCO3	8	13
100 кБк/кг, микрочастицы 224Ra-CaCO3	7	21
165 кБк/кг, микрочастицы 224Ra-CaCO3	7	21

Заключение: ²²⁴Ra-меченые микрочастицы карбоната кальция проявляют значительную противоопухолевую активность у мышей с агрессивной формой рака в брюшной полости, однако доза, превышающая 35 кБк/кг, является предпочтительной для достижения существенного противоопухолевого эффекта в отношении агрессивных форм рака.

Источники информации

Atcher RW and Hines JJ Colloid labelled with radionuclide and method US 4970062 A (дата подачи 1989 г.)

Bloomer, W.D., McLaughlin, W.H., Neirinckx, R.D., Adelstein, S.J., Gordon, P.R., Ruth, T.J., Wolf, A.P. Astatine-211-tellurium radiocolloid cures experimental malignant ascites. Science. 1981; 212: 340-341.

Boudousq V1, Bobyk L, Busson M, Garambois V, Jarlier M, Charalambatou P, Pèlegrin A, Paillas S, Chouin N, Quenet F, Maquaire P, Torgue J, Navarro-Teulon I, Pouget JP. Comparison between internalizing anti-HER2 mAbs and non-internalizing anti-CEA mAbs in alpha-radioimmunotherapy of small volume peritoneal carcinomatosis using 212Pb. PloS One. 2013 Jul 29; 8(7).

Gustafsson AM1, Bäck T, Elgqvist J, Jacobsson L, Hultborn R, Albertsson P, Morgenstern A, Bruchertseifer F, Jensen H, Lindegren S.Comparison of therapeutic efficacy and biodistribution of 213Bi- and 211At-labeled monoclonal antibody MX35 in an ovarian cancer model. Nucl Med Biol. 2012 Jan; 39(1): 15-22.

Kirby, H. W; Salutsky, Murrell L (1964). The Radiochemistry of Radium (PDF). National Academies Press, pp 5.

Larsen RH and Salberg G. Alpha-emitting hydroxyapatite particles. патент США № 8142758 B2 (дата подачи 2005 г.).

Liu S. Bifunctional coupling agents for radiolabeling of biomolecules and target specific delivery of metallic radionuclides. Adv Drug Deliv Rev. 2008, 60 (12), 1347-1370.

Ritter MA, Cleaver JE, Tobias CA. High-LET radiations induce a large proportion of non-rejoining DNA breaks. Nature. 1977 Apr 14;266(5603): 653-5.

Scott A. Gerber*, Viktoriya Y. Rybalko,* Chad E. Bigelow,† Amit A. Lugade,* Thomas H. Foster,† John G. Frelinger,* and Edith M. Lord* Preferential Attachment of Peritoneal Tumor Metastases to Omental Immune Aggregates and Possible Role of a Unique Vascular Microenvironment in Metastatic Survival and Growth. Am J Pathol. 2006 Nov; 169(5): 1739-1752.

Vergote I, Larsen RH, de Vos L, Nesland JM, Bruland O, Bjørgum J, Alstad J, Tropé C, Nustad K. Therapeutic efficacy of the alpha-emitter 211At bound on microspheres compared with 90Y and 32P colloids in a murine intraperitoneal tumor model. Gynecol Oncol. 1992 Dec; 47(3): 366-72.

ПУНКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Частица, содержащая распадающееся соединение и излучающий альфа-частицы радиоактивный изотоп и/или радиоактивный изотоп, генерирующий излучающий альфа-частицы дочерний изотоп.

2. Частица по п. 1, отличающаяся тем, что радиоактивный изотоп выбирают из группы, состоящей из ²²⁴Ra, ²¹²Bi, ²¹²Pb ²²³Ra, ²²⁵Ra, ²²⁵Ac, ²¹³Bi, ²¹¹At, ²²⁷Th.

3. Частица по любому из пунктов 1-2, отличающаяся тем, что распадающееся соединение выбирают из группы, состоящей из CaCO₃, ПЭГ-модифицированного CaCO₃, модифицированного белком CaCO₃, модифицированного углеводом CaCO₃, модифицированного липидом CaCO₃, модифицированного витамином CaCO₃, модифицированного органическим соединением CaCO₃, модифицированного полимером CaCO₃ и/или модифицированного неорганическим кристаллическим соединением CaCO_3.

4. Частица по любому из пунктов 1-3, размер которой составляет от 1 нм до 500 мкм.

5. Частица по любому из пунктов 1-4, дополнительно содержащая одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из моноклонального антитела, поликлонального антитела, радиоиммуноконъюгата, иммуноконъюгата, хелатирующего конъюгата антитела, витаминов, включая фолат и производные фолата, пептидов, минител и аффител.

6. Фармацевтическая композиция, содержащая одну или более частиц по любому из пунктов 1-5 и разбавитель, носитель, сурфактант и/или эксципиент.

7. Фармацевтическая композиция по п. 6, содержащая количество радиоактивного изотопа, составляющее от 1 кБк до 10 ГБк на дозу.

8. Фармацевтическая композиция по любому из пунктов 6-7, содержащая количество радиоактивного изотопа, составляющее от 50 МБк до 100 ГБк, которое подходит для многодозового промышленного производства.

9. Фармацевтическая композиция по любому из пунктов 6-8, представляющая собой суспензию частиц, содержащую монодисперсные или полидисперсные частицы, меченые излучающим альфа-частицы радиоактивным изотопом и/или радиоактивным изотопом, генерирующим излучающий альфа-частицы дочерний изотоп.

10. Фармацевтическая композиция по любому из пунктов 6-9, подходящая для внутривенной или внутриполостной инъекции.

11. Частица по любому из пунктов 1-5 или фармацевтическая композиция по пунктам 6-9 для использования в качестве лекарственного средства.

12. Частица по любому из пунктов 1-5 или фармацевтическая композиция по пунктам 6-9 для использования в внутриполостной лучевой терапии, радиоэмболизации или радиосиновэктомии.

13. Частица по любому из пунктов 1-5 или фармацевтическая композиция по пунктам 6-9 для использования в лечении рака.

14. Частица по любому из пунктов 1-5 или фармацевтическая композиция по пунктам 6-9 для использования по пунктам 12-13, при этом рак выбирают из группы, состоящей из рака в брюшной полости, рака в интракраниальном пространстве, рака в плевре, рака мочевого пузыря, рака в сердце и рака в субарахноидальной полости.

15. Способ лечения или ослабления заболевания, включающий введение частиц по любому из пунктов 1-5 или фармацевтической композиции по пунктам 6-9 индивидууму, который нуждается в этом, однократной или повторными дозами.

16. Способ получения частицы по любому из пунктов 1-6, включающий приведение излучающего альфа-частицы радиоактивного изотопа и биоразлагаемого соединения в контакт друг с другом с использованием или без использования носителя для радиоактивного изотопа.

17. Набор, включающий:

- нано- или микрочастицу по любому из пунктов 1-6,

- излучающий альфа-частицы радиоактивный изотоп или радиоактивный изотоп, генерирующий излучающий альфа-частицы дочерний изотоп,

- носитель, разбавитель и/или эксципиент, и

- необязательно, инструкции по использованию набора.

18. Набор, включающий:

- нано- или микрочастицу по любому из пунктов 1-6,

- излучающий альфа-частицы радиоактивный изотоп или радиоактивный изотоп, генерирующий излучающий альфа-частицы дочерний изотоп,

- носитель, разбавитель и/или эксципиент, и

- необязательно, инструкции по использованию набора для приготовления бифункционального фармацевтического раствора, содержащего суспензию частиц и раствор радиоиммуноконъюгата.

19. Набор по п. 18, дополнительно включающий конъюгированную с хелатором молекулу, в том числе, моноклональные антитело.

1. Частица для лечения внутриполостного рака, содержащая:

- CaCO₃,

- излучающий альфа-частицы радиоактивный изотоп ²²⁴Ra и

- продукты распада радиоактивного изотопа ²²⁴Ra, выбранные из группы, состоящей из ²²⁰Rn, ²¹⁶Po и ²¹²Pb.

2. Частица по п. 1, отличающаяся тем, что CaCO₃ выбирают из группы, состоящей из CaCO₃, ПЭГ-модифицированного CaCO₃, модифицированного белком CaCO₃, модифицированного углеводом CaCO₃, модифицированного липидом CaCO₃, модифицированного витамином CaCO₃, модифицированного органическим соединением CaCO₃, модифицированного полимером CaCO₃ и/или модифицированного неорганическим кристаллическим соединением CaCO_3.

3. Частица по любому из пп. 1, 2, дополнительно содержащая одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из моноклонального антитела, поликлонального антитела, радиоиммуноконъюгата, иммуноконъюгата, хелатирующего конъюгата антитела, витаминов, включая фолат, пептидов, минител и аффител.

4. Частица по любому из пп. 1-3 для использования в качестве лекарственного средства.

5. Композиция для лечения внутриполостного рака, содержащая одну или более частиц по любому из пп. 1-4 и разбавитель, носитель, сурфактант и/или эксципиент.

6. Композиция по п. 5, представляющая собой суспензию частиц, содержащую монодисперсные или полидисперсные частицы по пп. 1-3.

7. Способ получения частицы по любому из пп. 1-4, включающий приведение излучающего альфа-частицы радиоактивного изотопа ²²⁴Ra и CaCO₃ в контакт друг с другом с использованием или без использования носителя для радиоактивного изотопа.

8. Набор для получения частицы для лечения внутриполостного рака, включающий:

- композицию, содержащую CaCO₃,

- композицию, содержащую излучающий альфа-частицы радиоактивный изотоп ²²⁴Ra и продукты распада радиоактивного изотопа ²²⁴Ra, выбранные из группы, состоящей из ²²⁰Rn, ²¹⁶Po и ²¹²Pb.