Рекомбинантный вектор, содержащий иммуногенный белок вируса африканской чумы свиней, рекомбинантные бактерии и их применение
Изобретение относится к биотехнологии, а именно генетической рекомбинации. Предложен рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий иммуногенный белок вируса африканской чумы свиней, где за основу рекомбинантного экспрессионного вектора взят экспрессионный вектор Lactobacillus pVE5523, а нуклеотидная последовательность, кодирующая иммуногенный белок вируса африканской чумы свиней, клонирована между рестрикционными сайтами EcoFN и Sa/I взятого за основу вектора. Иммуногенный белок вируса африканской чумы свиней содержит белок р72 и белок р54 вируса африканской чумы свиней китайского штамма Jilin. Рекомбинантная Lactobacillus, экспрессирующая иммуногенный белок вируса африканской чумы свиней, содержит рекомбинантный экспрессионный вектор. Способ конструирования рекомбинантной Lactobacillus включает: (1) клонирование нуклеотидной последовательности, кодирующей белок р72 вируса африканской чумы свиней, и нуклеотидной последовательности, кодирующей белок р54 вируса африканской чумы свиней, в экспрессионный вектор Lactobacillus pVE5523 для конструирования рекомбинантных плазмид pVE5523-ASFV-p72 и pVE5523-ASFV-p54, соответственно; (2) трансформирование компетентных клеток Lactobacillus рекомбинантными плазмидами pVE5523-ASFV-p72 и pVE5523-ASFV-p54 с получением рекомбинантных Lactobacillus, экспрессирующих белок р72 вируса африканской чумы свиней, и рекомбинантных Lactobacillus, экспрессирующих белок р54 вируса африканской чумы свиней, соответственно. Предложено применение рекомбинантного экспрессионного вектора или рекомбинантной Lactobacillus для профилактики и/или лечения африканской чумы свиней или для изготовления лекарственных средств для профилактики и/или лечения африканской чумы свиней. Пероральный препарат живых бактерий для профилактики инфекции африканской чумы свиней, где активные ингредиенты перорального препарата живых бактерий содержат рекомбинантные Lactobacillus, экспрессирующие белок р72 вируса африканской чумы свиней, и рекомбинантные Lactobacillus, экспрессирующие белок р54 вируса африканской чумы свиней, сконструированные способом конструирования. Способ лечения африканской чумы свиней включает: прием животными перорального препарата живых бактерий, где принимаемое количество составляет 5 мл на животное. Изобретение позволяет безопасно, эффективно и быстро предупреждать инфицирование свиней вирусом африканской чумы свиней и не включает иммунный процесс. 7 н. и 6 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл., 8 пр.
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[01] В данной заявке испрашиваются преимущества и приоритет заявки на патент Китая №202010339345.5, поданной 26 апреля 2020 г, содержание которой включено в данную заявку во всей полноте путем ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[02] Изобретение относится к области генетической рекомбинации и, в частности, относится к рекомбинантному вектору, содержащему иммуногенный белок вируса африканской чумы свиней, рекомбинантным бактериям и их применению.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[03] Африканская чума свиней (ASF) представляет собой острое сопровождающееся лихорадкой высококонтагиозное инфекционное заболевание животных. Заболеваемость и смертность при ASF может достигать 100%, и она является убийцей номер один в свиноводстве. В настоящее время коммерческих вакцин не существует. Вирус африканской чумы свиней (ASFV) является единственным представителем рода вируса африканской чумы свиней семейства вируса африканской чумы свиней, который имеет диаметр 175-215 нм, икосаэдрическую симметрию, и нуклеокапсид которого покрыт капсульной мембраной. Геном ASFV представляет собой двуцепочечную линейную ДНК размером 170-190 т.п.н.
[04] Вирус африканской чумы свиней может легко передаваться при контакте между домашними свиньями и различными дикими кабанами, преимущественно проникая в организм свиней через ротовую полость и верхние дыхательные пути, вызывая инфекцию в носоглотке или миндалинах, затем быстро распространяясь в нижнечелюстные лимфатические узлы и поражая весь организм через лимфу и кровь.
[05] Поскольку коммерческой вакцины против ASFV на рынке не существует, наиболее безопасным, экономичным и эффективным способом профилактики и контроля является способ профилактики и контроля на основе биобезопасности, основным принципом которой является блокирование контакта между вирусом и организмом. Однако ни один из существующих способов не может гарантировать, что вирусом больше не придет в контакт с организмом.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[06] В этой связи задачей данного изобретения является предоставление рекомбинантного вектора, содержащего иммуногенный белок вируса африканской чумы свиней, рекомбинантных бактерий и их применения, для конструирования экспрессионной системы на основе Lactobacillus, экспрессирующей белки р72 и р54 вируса африканской чумы свиней, и предоставление теоретической основы для разработки перорального агента, блокирующего инфицирование слизистых, для блокирования вирусной инфекции.
[07] Для решения указанной задачи в данном изобретении предложено следующее техническое решение:
[08] В данном изобретении предложен рекомбинантный вектор, содержащий иммуногенный белок вируса африканской чумы свиней, где за основу рекомбинантного вектора взят экспрессионный вектор Lactobacillus pVE5523, а нуклеотидная последовательность, кодирующая иммуногенный белок вируса африканской чумы свиней, клонирована между рестрикционными сайтами EcoRV и SaiI взятого за основу вектора.
[09] В некоторых воплощениях иммуногенный белок вируса африканской чумы свиней содержит белок р72 и белок р54 вируса африканской чумы свиней китайского штамма Jilin. Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок р72 вируса африканской чумы свиней китайского штамма Jilin, представлена в SEQ ID NO:1, а нуклеотидная последовательность, кодирующая белок р54 вируса африканской чумы свиней китайского штамма Jilin, представлена в SEQ ID NO:2.
[10] В данном изобретении предложена рекомбинантная Lactobacillus, экспрессирующая иммуногенный белок вируса африканской чумы свиней, где указанная рекомбинантная Lactobacillus содержит указанный выше рекомбинантный вектор.
[11] В данном изобретении также предложен способ конструирования рекомбинантной Lactobacillus, включающий:
(1) клонирование нуклеотидной последовательности, кодирующей белок р72 вируса африканской чумы свиней, и нуклеотидной последовательности, кодирующей белок р54 вируса африканской чумы свиней, в экспрессионный вектор Lactobacillus pVE5523 для конструирования рекомбинантных плазмид pVE5523-ASFV-p72 и pVE5523-ASFV-p54, соответственно;
(2) трансформирование компетентных клеток Lactobacillus рекомбинантными плазмидами pVE5523-ASFV-p72 и pVE5523-ASFV-p54 с получением рекомбинантных Lactobacillus, экспрессирующих белок р72 вируса африканской чумы свиней, и рекомбинантных Lactobacillus, экспрессирующих белок р54 вируса африканской чумы свиней, соответственно.
[12] В данном изобретении также предложен пероральный препарат живых бактерий для профилактики инфекции африканской чумы свиней, где активные ингредиенты перорального препарата живых бактерий содержат рекомбинантные Lactobacillus, экспрессирующие белок р72 вируса африканской чумы свиней, и рекомбинантные Lactobacillus, экспрессирующие белок р54 вируса африканской чумы свиней, сконструированные вышеуказанным способом конструирования.
[13] В некоторых воплощениях соотношение живых бактерий для рекомбинантных Lactobacillus, экспрессирующих белок р72 вируса африканской чумы свиней, и рекомбинантных Lactobacillus, экспрессирующих белок р54 вируса африканской чумы свиней, составляет (0,8-1,2)×108 КОЕ (колоннеобразующих единиц): (0,8-1,2)×108 КОЕ.
[14] В изобретении предложен рекомбинантный вектор, содержащий иммуногенный белок вируса африканской чумы свиней, который можно использовать для конструирования рекомбинантных Lactobacillus, экспрессирующих иммуногенный белок вируса африканской чумы свиней, и после смешивания рекомбинантных Lactobacillus, экспрессирующих антигенные белки р72 и р54 вируса африканской чумы свиней, получают пероральный препарат живых бактерий для профилактики инфицирования вирусом африканской чумы свиней. В данном изобретении после того, как свиньи принимают препарат, антигенный белок (смесь белков р72 и р54), который секретируют Lactobacillus препарата, адгезирует к слизистой оболочке на поверхности клеток организма и формирует антигенную белковую биопленку на поверхности слизистой оболочки. Антигенный белок может присоединяться к сайту связывания вируса на клетках-мишенях и перекрывать сайт белка-рецептора вируса на поверхности слизистой оболочки, таким образом выполняя функцию "экологической оккупации". Когда живые вирусы из окружающей среды проникают в организм, сайт связывания вируса на клетке-мишени оказывается полностью блокированным биопленкой антигенного белка, и вирус не может связаться с сайтом связывания вируса на клетке-мишени, таким образом, присоединение вируса к рецептору на клеточной поверхности эффективно блокируется, и предотвращается африканская чума свиней.
[15] По сравнению с вакцинами, пероральный препарат, полученный согласно данному изобретению, является более безопасным, более эффективным и более быстродействующим. Безопасность перорального препарата, раскрытого в настоящем описании, проявляется в том, что эффективные компоненты секретируют только функциональные вирусные белки, вирусные гены отсутствуют, и не может быть вызвано варьирование вируса. Эффективность проявляется в том, что эффективные компоненты перорального препарата секретируют только защитные антигены, действуют на сайт слизистой на поверхности организма и покрывают поверхность слизистой, где располагаются клетки-мишени вируса африканской чумы свиней. При проникновении вируса сайт, обеспечивающий связывание между антигенным белком и клетками слизистой поверхности, блокируется и перекрывается, таким образом, блокируя путь вирусной инфекции. Быстродействие проявляется в том, что секретируемый белок, экспрессируемый Lactobacillus, непосредственно заранее занимает рецептор, через который вирус связывается с клеткой-мишенью, таким образом, инфицирование вирусом блокируется без необходимости развития иммунного ответа.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[16] Фиг. 1 представляет собой плазмидную структурную диаграмму рекомбинантного вектора pVE5523-ASFV-p72 согласно настоящему описанию;
[17] Фиг. 2 представляет собой плазмидную структурную диаграмму рекомбинантного вектора pVE5523-ASFV-p54 согласно настоящему описанию;
[18] Фиг. 3 представляет собой кривую амплификации для верификации экспрессии р72 согласно настоящему описанию;
[19] Фиг. 4 представляет собой кривую амплификации для верификации экспрессии р54 согласно настоящему описанию.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[20] Далее изобретение будет объяснено приведенными ниже воплощениями.
[21] В данном изобретении предложен рекомбинантный вектор, содержащий иммуногенный белок вируса африканской чумы свиней, где за основу рекомбинантного вектора взят экспрессионный вектор Lactobacillus pVE5523, а нуклеотидная последовательность, кодирующая иммуногенный белок вируса африканской чумы свиней, клонирована между рестрикционными сайтами EcoRV и SalI взятого за основу вектора.
[22] Иммуногенный белок вируса африканской чумы свиней содержит белок р72 и белок р54 вируса африканской чумы свиней китайского штамма Jilin. Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок р72 вируса африканской чумы свиней китайского штамма Jilin, представлена в SEQ ID NO:1, а нуклеотидная последовательность, кодирующая белок р54 вируса африканской чумы свиней китайского штамма Jilin, представлена в SEQ ID NO:2. Нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO:1, клонирована между рестрикционными сайтами EcoRV и SalI взятого за основу вектора с образованием рекомбинантного вектора pVE5523-ASFV-p72, а структура рекомбинантной плазмиды показана на Фиг. 1. Нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO:2, клонирована между рестрикционными сайтами EcoRV и SalI взятого за основу вектора с образованием рекомбинантного вектора pVE5523-ASFV-p54, а структура рекомбинантной плазмиды показана на Фиг. 2. В данном изобретении отсутствуют какие-либо специальные ограничения в отношении способа конструирования рекомбинантного вектора, и подходят стандартные способы конструирования рекомбинантных векторов.
[23] В данном изобретении предложена рекомбинантная Lactobacillus, экспрессирующие иммуногенный белок вируса африканской чумы свиней, где указанная рекомбинантная Lactobacillus содержит указанный рекомбинантный вектор.
[24] В данном изобретении также предложен способ конструирования рекомбинантной Lactobacillus, включающий:
(1) клонирование нуклеотидной последовательности, кодирующей белок р72 вируса африканской чумы свиней, и нуклеотидной последовательности, кодирующей белок р54 вируса африканской чумы свиней, в экспрессионный вектор Lactobacillus pVE5523 для конструирования рекомбинантных плазмид pVE5523-ASFV-p72 и pVE5523-ASFV-p54, соответственно;
(2) трансформирование компетентных клеток Lactobacillus рекомбинантными плазмидами pVE5523-ASFV-p72 и pVE5523-ASFV-p54 с получением рекомбинантных Lactobacillus, экспрессирующих белок р72 вируса африканской чумы свиней, и рекомбинантных Lactobacillus, экспрессирующих белок р54 вируса африканской чумы свиней, соответственно.
[25] Перед осуществлением стадии клонирования последовательности генов р72 и р54 вируса африканской чумы свиней китайского штамма Jilin, найденные в GenBank, предпочтительно оптимизируют с получением последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO:2, а затем осуществляют клонирование.
[26] При осуществлении клонирования вектор pVE5523 предпочтительно расщепляют SalI/EcoRV, и последовательности, представленные в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, расщепляют тем же ферментом. После лигирования указанных расщепленных фрагментов получают рекомбинантные плазмиды pVE5523-ASFV-p72 и pVE5523-ASFV-р54, показанные на Фиг. 1 и Фиг. 2.
[27] В изобретении рекомбинантные плазмиды используют для трансформации компетентных клеток Lactobacillus casei АТСС393 посредством электротрансформации, чтобы получить рекомбинантные Lactobacillus. После получения рекомбинантных Lactobacillus рекомбинантные Lactobacillus предпочтительно размножают в жидкой среде MRS и выделяют рекомбинантные плазмиды для детектирования посредством флуоресцентной количественной ПЦР (полимеразная цепная реакция). Праймеры и амплифицируемые последовательности, используемые для детектирования посредством флуоресцентной количественной ПЦР в данном изобретении, представляют собой следующие:
[28] Детектирование р72 посредством флуоресцентной количественной ПЦР:
[29] Прямой праймер р72 (SEQ ID NO:3): AGTTCGGATGTCACAACGCTTG;
[30] Обратный праймер р72 (SEQ ID NO:4): TTTGCTTTGGTGCGGCTTGT;
[31] Амплифицируемая последовательность р72 (SEQ ID NO:5):
[32] AGTTCGGATGTCACAACGCTTGTGCGCAAATTTTGCATCCCAGGGGATAAA ATGACTGGATATAAGCACTTGGTTGGCCAGGAGGTATCGGTGGAGGGAACCAGTG GCCCTCTCCTATGCAACATTCATGATTTGCACAAGCCGCACCAAAGCAAA;
[33] Детектирование p54 посредством флуоресцентной количественной ПЦР:
[34] Прямой праймер р54 (SEQ ID NO:6): AGCCACTCCACAACCAGGTAC;
[35] Обратный праймер р54 (SEQ ID NO:7): GCCCTCCAGTTGCCATGATTAG;
[36] Амплифицируемая последовательность р54 (SEQ ID NO:8):
[37] AGCCACTCCACAACCAGGTACCTCTAAACCGGCTGGAGCCACTACAGGCA ACGTAGGCAAGCCAATTACAGACAGGCCAGTTGCCATGAATAGGCCAGTTACGAA CAGCTCGGTCGCGGACAGGCCAGTTATGAACAACCCAGTTACGGACAGACTAATC ATGGCAACTGGAGGGC.
[38] Рекомбинантные Lactobacillus, полученные способом конструирования, могут секретировать рекомбинантные иммуногенные белки р72 и р54 вируса африканской чумы свиней, в зависимости от различных рекомбинантных плазмид.
[39] В данном изобретении также предложен пероральный препарат живых бактерий для профилактики инфекции африканской чумы свиней, где активные ингредиенты перорального препарата живых бактерий содержат рекомбинантные Lactobacillus, экспрессирующие белок р72 вируса африканской чумы свиней, и рекомбинантные Lactobacillus, экспрессирующие белок р54 вируса африканской чумы свиней, сконструированные вышеуказанным способом конструирования.
[40] В пероральном препарате живых бактерий соотношение живых бактерий для рекомбинантных Lactobacillus, экспрессирующих белок р72 вируса африканской чумы свиней, и рекомбинантных Lactobacillus, экспрессирующих белок р54 вируса африканской чумы свиней, составляет (0,8-1,2)×108 КОЕ: (0,8-1,2)×108 КОЕ, более предпочтительно 1×108КОЕ.
[41] Далее рекомбинантный вектор, содержащий иммуногенный белок вируса африканской чумы свиней, рекомбинантные бактерии и их применение, предложенные в данном изобретении, будут описаны более подробно со ссылками на Примеры, однако их не следует считать ограничивающими объем правовой защиты данного изобретения.
ПРИМЕР 1
[42] Получение последовательностей генов р72 и р54 вируса африканской чумы свиней
[43] Белок р54 вируса африканской чумы свиней находится во внутренней оболочке вирусных частиц, является одним из основных структурных белков и сильных иммуногенных белков ASFV и участвует в адсорбции и проникновении вируса в клетки-мишени. Последовательности генов р72 и р54 (Р72: GenBank: МК189456.1; Р54: GenBank: МК214679.1) вируса африканской чумы свиней китайского штамма Jilin в GenBank были оптимизированы и модифицированы, затем синтезированы в компании Nanjing Genescript Biotechnology Co., Ltd, и последовательности оснований представлены в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2.
[44] Получение рекомбинантных экспрессирующих векторов pVE5523-ASFV-p72 и pVE5523-ASFV-p54
[45] 1. Материалы и методы
[46] 1.1 Материалы и источники
[47] Все рестрикционные ферменты SalI и EcoRV приобретали в компании NEB, а фермент Taq, dNTP, маркеры длины ДНК DL2000, DL15000, набор для очистки ДНК из агарозного геля и набор для очистки плазмид Mini BEST приобретали в компании Dalian Takara, а клонирующий вектор pVE5523 был предоставлен компанией Nanjing Genescript Biotechnology Co., Ltd.
[48] 1.2 Способ исследования
[49] Фрагменты клонирующего вектора pVE5523, расщепленного SalI/EcoRV, лигировали с фрагментами генов р72 и р54, расщепленных тем же ферментом SalI/EcoRV, после электротрансформации, рекомбинантную плазмиду выделяли и отправляли в компанию Nanjing Genescript Biotechnology Co., Ltd для верификации посредством секвенирования.
[50] 2. Результаты исследования
[51] Результаты секвенирования рекомбинантной плазмиды: рекомбинантную плазмиду после секвенирования сравнивали с встраиваемыми генными фрагментами р72 и р54, и результаты секвенирования совпадали с ожиданиями, что означало, что синтезированные генные фрагменты р72 и р54 были успешно встроены в вектор Lactobacillus pVE5523, и рекомбинантная плазмида была успешно сконструирована, положительные плазмиды обозначали как pVE5523-ASFV-p72 и pVE5523-ASFV-p54, соответственно.
ПРИМЕР 3
[52] Получение и детектирование экспрессируемых генов р72 и р54 вируса африканской чумы свиней
[53] 1. Материалы и методы
[54] 1.1 Материалы и источники
[55] Эритромицин (Emr) приобретали в Biodee Biotechnology Co., Ltd.
[56] 1.2 Способ исследования
[57] Электротрансформация Lactobacillus АТСС393 целевыми генами и скрининг устойчивых штаммов: электротрансформированные Lactobacillus АТСС393 распределяли по поверхности культуральной чашки с твердой средой MRS, содержащей 5 мкг/мл эритромицина, чашку культивировали в инкубаторе при 30°С в течение 72 часов, отбирали с чашки колонии и инокулировали жидкую кулыуральную среду MRS, содержащую 5 мкг/мл эритромицина, и культивировали при 30°С в течение 72 часов. Выделяли плазмиды из бактерий и идентифицировали посредством количественной флуоресцентной ПЦР. Идентифицированные праймеры и амплифицированные последовательности представляют собой следующие:
[58] Детектирование р72 посредством флуоресцентной количественной ПЦР:
[59] Прямой праймер р72 (SEQ ID NO:3): AGTTCGGATGTCACAACGCTTG;
[60] Обратный праймер р72 (SEQ ID NO:4): TTTGCTTTGGTGCGGCTTGT;
[61] Амплифицируемая последовательность р72 (SEQ ID NO:5):
[62] AGTTCGGATGTCACAACGCTTGTGCGCAAATTTTGCATCCCAGGGGATAAA ATGACTGGATATAAGCACTTGGTTGGCCAGGAGGTATCGGTGGAGGGAACCAGTG GCCCTCTCCTATGCAACATTCATGATTTGCACAAGCCGCACCAAAGCAAA;
[63] Детектирование p54 посредством флуоресцентной количественной ПЦР:
[64] Прямой праймер р54 (SEQ ID NO:6): AGCCACTCCACAACCAGGTAC;
[65] Обратный праймер р54 (SEQ ID NO:7): GCCCTCCAGTTGCCATGATTAG;
[66] Амплифицируемая последовательность р54 (SEQ ID NO:8):
[67] AGCCACTCCACAACCAGGTACCTCTAAACCGGCTGGAGCCACTACAGGCA
ACGTAGGCAAGCCAATTACAGACAGGCCAGTTGCCATGAATAGGCCAGTTACGAA
CAGCTCGGTCGCGGACAGGCCAGTTATGAACAACCCAGTTACGGACAGACTAATC
ATGGCAACTGGAGGGC.
[68] 2. Результаты исследования
[69] Детектирование амплифицированных рекомбинантных плазмид осуществляли посредством флуоресцентной количественной ПЦР, и кривые амплификации показаны на Фиг. 3 и Фиг. 4, соответственно. Положительные рекомбинантные плазмиды имеют типичную кривую амплификации со значениями Ct, варьирующими от 19 до 22, тогда как у контрольных компетентных клеток АТСС393 отсутствует кривая амплификации, что указывает на успешную трансформацию компетентных клеток АТСС393 рекомбинантными плазмидами pVE5523-ASFV-p54 и pVE5523-ASFV-p72.
ПРИМЕР 4
[70] Способ культивирования рекомбинантной системы экспрессии Lactobacillus [71] Рекомбинантную систему экспрессии Lactobacillus инокулировали в жидкую среду MRS для культивирования Lactobacillus в инокулируемом количестве 1% и получали культуральную жидкость при 35°С в течение 72 ч. [72] Подсчет живых рекомбинантных Lactobacillus [73] Способом рассева на плоской поверхности:
[74] 1. Нумерование: 9 наборов стерильных культуральных чашек с твердой агаризованной средой MRS маркировали как 10-4, 10-5 и 10-6, соответственно (по 3 комплекта для каждого разведения). Брали еще 6 пробирок, содержащих 4,5 мл стерильной воды, и, в свою очередь, маркировали как 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 и 10-6.
[75] 2. Разведение: 0,5 мл тщательно перемешанной суспензии Lactobacillus (исследуемый образец) переносили в пробирку с маркировкой 10-1 при помощи пипетки на 1 мл, что представляло собой разведение в 10 раз. Пробирку с маркировкой 10-1 помещали на шейкер для пробирок, чтобы равномерно перемешать бактериальную жидкость. Другую пипетку на 1 мл использовали для погружения в пробирку с маркировкой 10-1, чтобы втягивать и выдувать бактериальную суспензию туда и обратно в течение трех раз, чтобы дополнительно диспергировать и перемешать бактерии. 0,5 мл бактериальной жидкости из пробирки с маркировкой 10-1 переносили в пробирку с маркировкой 10-2 при помощи пипетки, использованной на предыдущей стадии, получая разведение в 100 раз, и продолжали далее аналогичным образом.
[76] 3. Отбор образцов и нанесения покрытия: 0,2 мл разведенных суспензий бактерий отбирали из пробирок с маркировкой 10-4, 10-5 и 10-6, соответственно, и вносили в пронумерованные соответствующим образом чашки со стерильной агаризованной средой, бактериальную суспензию равномерно распределяли на агаризованной среде при помощи стерильной стеклянной палочки для нанесения покрытия и культивировали бактерии в инкубаторе, поддерживающем постоянную температуру 37°С.
[77] 4. Подсчет: После 48 часов культивирования чашку с агаризованной средой вынимали для подсчета колоний и подсчитывали среднее количество колоний для трех чашек с одинаковым разведением, причем формула для подсчета представляла собой следующую:
[78] Колониеобразующие единицы (КОЕ) на миллилитр = среднее количество колоний для трех повторностей с одинаковым разведением × кратность разведения × 5.
ПРИМЕР 5.
[79] Lactobacillus, способные секретировать рекомбинантные белки р72 и р54, полученные в Примере 4, разводили до бактериальной жидкости с 0,8-1,2 × 108 КОЕ/мл и смешивали в соотношении 1:1. Смешанный бактериальный раствор вводили SPF (свободным от специфических патогенов) новозеландским кроликам и крысам SD в форме пероральной жидкости. При этом группа отрицательного контроля А получала такой же объем нормального физиологического раствора, а контрольная группа В получала такой же объем культурального раствора MRS. За четырьмя новозеландскими кроликами и крысами SD каждой группы наблюдали в течение 2 недель, и среди 24 животных не было отмечено отклоняющихся от нормы проявлений, таких как отклоняющаяся от нормы температура тела или развитие аллергии. Таким образом, Lactobacillus, способные секретировать рекомбинантные белки р72 и р54, полученные согласно изобретению, является безопасной и не вызывает побочных эффектов.
ПРИМЕР 6.
[80] На ферме в округе Taihu провинции Anhui было приблизительно 300 свиней, размером от 20 кг до 100 кг, которые были разделены между тремя производственными площадками, некоторые свиньи на второй производственной площадке заболели и пали одна за другой. 23 января 2020 года на этой ферме провели исследование препарата рекомбинантных Lactobacillus, исследование продолжалось 21 сутки и включало три группы, каждая из свиней получала дозу 5 мл перорально. Контрольная группа находилась на первой производственной площадке и включала в общей сложности 112 свиней, опытная группа находилась на второй и третьей производственных площадках. Перед экспериментом свиньи на первой и третьей производственных площадках были здоровы, а на второй производственной площадке до начала исследования 23 января имела место вспышка африканской чумы свиней.
[81] Результаты исследования приведены в Таблице 1, при этом число свиней в контрольной группе изменилось со 112 до 66, и 46 свиней пали, показатель смертности составил 41,07%. Поскольку вторая производственная площадка находилась в стадии заболевания до эксперимента, после применения препарата рекомбинантных Lactobacillus их число уменьшилось с 45 до 28, и 17 пали, показатель смертности составил 37,78%. На третьей производственной площадке в ходе исследования пала одна свинья, показатель смертности составил 1,08%. На протяжении всего исследования в опытной группе (вторая и третья производственные площадки) пали 18 свиней, показатель смертности составил 13,04%. Результаты показали, что препарат рекомбинантных Lactobacillus оказал хороший эффект.
ПРИМЕР 7.
[83] Эпидемия африканской чумы свиней возникла на ферме в городе Yiyang провинции Hunan в 2019, более 400 свиней на откорме были безвредно утилизированы, а ферма была полностью дезинфицирована. В апреле 2020 года было заведено в общей сложности 120 молочных поросят и свиней на откорме, а 27 мая было заведено 402 свиньи, до заведения детектирование патогена, вызывающего африканскую чуму свиней, не проводилось. Среди свиней, заведенных в апреле, некоторые свиньи отказывались от пищи, страдали от плохого психического состояния и т.п., а одна свинья пала. Случайным образом было отобрано 40 свиней для детектирования патогена, вызывающего африканскую чуму свиней, и у 2 молочных поросят заподозрили африканскую чуму свиней, и фермеры немедленно изолировали свиней с подозрением на заболевание и усилили меры биобезопасности на ферме, две свиньи с подозрением на заболевание пали в течение недели, а затем пали одна за другой. С 21 мая 500 мл препарата рекомбинантных Lactobacillus, полученного в Примере 4, растворяли в 30 кг воды и смешивали с 25 кг корма (суточное количество корма для 100 свиней), и давали дважды в сутки, 2-3 раза в неделю. После применения препарата общее состояние здоровья свиней заметно улучшилось, и падеж отсутствовал.
[85] Все 402 свиньи, которых завели в мае, хорошо росли при применении схемы из Примера 4, и ни одна свинья не была инфицирована.
ПРИМЕР 8.
[86] Свиная ферма в городе Jinhua провинции Zhejiang не была положительной в отношении эпидемии в ноябре 2019. На данный момент поголовье включало 380 свиноматок и приблизительно 3900 свиней на откорме. Всем свиноматкам и свиньям на откорме вводили продукты рекомбинантных Lactobacillus, полученные в Примере 4. С начала года и до мая свиньи получали перорально по 10 мл на животное, один раз каждые 3 суток. Начиная с 17 мая, 500 мл препарата рекомбинантных Lactobacillus, полученного в Примере 4, растворяли в 30 кг воды и смешивали с 25 кг корма (суточное количество корма для 100 свиней), и давали дважды в сутки, 2-3 раза в неделю. После весеннего фестиваля в 2020 в районе Wucheng, Jinhua, произошла вспышка, не представлявшая собой чуму, и к 10 августа на свиной ферме все было в норме.
[87] Выше приведены только предпочтительные воплощения данного изобретения. Следует отметить, что специалисты в области техники могут привнести ряд усовершенствований и модификаций, не изменяя сущности данного изобретения, и такие усовершенствования и модификации также следует считать подпадающими под объем правовой охраны данного изобретения.
--->
Перечень последовательностей
<110> Changsha Lvye Biotechnology Co., Ltd.
<120> РЕКОМБИНАНТНЫЙ ВЕКТОР, СОДЕРЖАЩИЙ ИММУНОГЕННЫЙ БЕЛОК
ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ, РЕКОМБИНАНТНЫЕ БАКТЕРИИ
И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
<130> GWPCTP202103494
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2128
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок p72 вируса
африканской чумы китайского штамма Jilin
<400> 1
gtcgacatgg gtgtactgct cacacagagg acgctgctca gtctggtcct tgcactcctg 60
tttccaagca tggcgagcat gcatatgaaa gggatgcacg tggcccaacc tgcagtagtg 120
ctggccaaca gccggggtgt tgccagcttt gtgtgtgagt atgggtctgc aggcaaagct 180
gccgaggtcc gggtgacagt gctgcggcgg gccggcagcc agatgactga agtctgtgcc 240
gcgacatata ctgtggagga tgagttgacc ttccttgatg actctacatg cactggcacc 300
tccaccgaaa acaaagtgaa cctcaccatc caagggctga gagccgtgga cactgggctc 360
tacatctgca aggtggagct cctgtaccca ccaccctact atgtgggtat gggcaacggg 420
acccagattt atgtcattga tccagaacca tgcccagatt ctgatggtgg cggtggctcg 480
ggcggtggtg gatctggtgg cggcggatct acaaagacca aaccaccatc ccccatatcg 540
ccaggctccg aagtggccgg gtcctcggtc ttcatcttcc ctccaaaacc caaggacacc 600
ctcatgatct cccagacccc cgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtcag caaggagcac 660
gccgaggtcc agttctcctg gtacgtggac ggcgtagagg tgcacacggc cgagacgaga 720
ccaaaggagg agcagttcaa cagcacctac cgtgtggtca gcgtcctgcc catccagcac 780
caggactggc tgaaggggaa ggagttcaag tgcaaggtca acaacgtaga cctcccagcc 840
cccatcacga ggaccatctc caaggctata gggcagagcc gggagccgca ggtgtacacc 900
ctgcccccac ccgccgagga gctgtccagg agcaaagtca ccgtaacctg cctggtcatt 960
ggcttctacc cacctgacat ccatgttgag tggaagagca acggacagcc ggagccagag 1020
ggcaattacc gcaccacccc gccccagcag gacgtggacg ggaccttctt cctgtacagc 1080
aagctcgcgg tggacaaggc aagatgggat catggagaaa catttgagtg tgcggtgatg 1140
cacgaggctc tgcacaacca ctacacccag aagtccatct ccaagactca gggtaaacct 1200
cctccatacc agcctctcgg cggcggcggc agcgaattcg gatcccatat ggacaagatt 1260
atattggccc aagacttgct gaatagcagg atctctaaca ttaaaaatgt gaacaaaagt 1320
tatgggaaac ccgatcccga acccactttg agtcaaatcg aagaaacaca tttggtgcat 1380
tttaatgcgc attttaagcc ttatgttcca gtagggtttg aatacaataa agtacgcccg 1440
catacgggta cccccacctt gggaaacaag cttacctttg gtattcccca gtacggagac 1500
tttttccatg atatggtggg ccatcatata ttgggtgcat gtcattcatc ctggcaggat 1560
gctccgattc agggcacgtc ccagatgggg gcccatgggc agcttcaaac gtttcctcgc 1620
aacggatatg actgggacaa ccaaacaccc ttagagggcg ccgtttacac gcttgtagat 1680
ccttttggaa gacccattgt acccggcaca aagaatgcgt accgaaactt ggtttactac 1740
tgcgaatacc ccggagaacg actttatgaa aacgtaagat tcgatgtaaa tggaaattcc 1800
ctagacgaat atagttcgga tgtcacaacg cttgtgcgca aattttgcat cccaggggat 1860
aaaatgactg gatataagca cttggttggc caggaggtat cggtggaggg aaccagtggc 1920
cctctcctat gcaacattca tgatttgcac aagccgcacc aaagcaaacc tattcttacc 1980
gatgaaaatg atacgcagcg aacgtgtagc cataccaacc cgaaatttct ttcacagcat 2040
tttcccgaga actctcacaa tatccaaaca gcaggtaaac aagatattac tcctatcacg 2100
gacgcaacgt atctggacat aagatatc 2128
<210> 2
<211> 574
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок p54 вируса
африканской чумы китайского штамма Jilin
<400> 2
gtcgacatgg attctgaatt ttttcaaccc gtttatccgc ggcattatgg cgaatgtttg 60
tcaccaacct ctacaccgag cttcttctcc acacatatgt gtactattct cgttgctatc 120
gtggtcttaa tcattattat catcgttcta atttatctgt tttcttcaag aaagaaaaaa 180
gctgctgccc ccgctattga ggaggaagat atacagttta taaatcctta tcaagatcag 240
cagtgggcag gagccactcc acaaccaggt acctctaaac cggctggagc cactacaggc 300
aacgtaggca agccaattac agacaggcca gttgccatga ataggccagt tacgaacagc 360
tcggtcgcgg acaggccagt tatgaacaac ccagttacgg acagactaat catggcaact 420
ggagggccag cggccgcaag tgctccttcg gatgagcttt atacaacagc cactactcag 480
aacactgctt cacaaacaat gccggctgtt gaagctctac ggcaaagaag cacctataca 540
cacaaagacc tggaaaactc cttgtaagat atca 574
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер p72
<400> 3
agttcggatg tcacaacgct tg 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер p72
<400> 4
tttgctttgg tgcggcttgt 20
<210> 5
<211> 156
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Амплифицируемая последовательность p72
<400> 5
agttcggatg tcacaacgct tgtgcgcaaa ttttgcatcc caggggataa aatgactgga 60
tataagcact tggttggcca ggaggtatcg gtggagggaa ccagtggccc tctcctatgc 120
aacattcatg atttgcacaa gccgcaccaa agcaaa 156
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер p54
<400> 6
agccactcca caaccaggta c 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер p54
<400> 7
gccctccagt tgccatgatt ag 22
<210> 8
<211> 176
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Амплифицируемая последовательность p54
<400> 8
agccactcca caaccaggta cctctaaacc ggctggagcc actacaggca acgtaggcaa 60
gccaattaca gacaggccag ttgccatgaa taggccagtt acgaacagct cggtcgcgga 120
caggccagtt atgaacaacc cagttacgga cagactaatc atggcaactg gagggc 176
<---
1. Рекомбинантный экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий иммуногенный белок вируса африканской чумы свиней, где за основу рекомбинантного экспрессионного вектора взят экспрессионный вектор Lactobacillus pVE5523, а нуклеотидная последовательность, кодирующая иммуногенный белок вируса африканской чумы свиней, клонирована между рестрикционными сайтами EcoFN и Sa/I взятого за основу вектора;
где иммуногенный белок вируса африканской чумы свиней содержит белок р72 и белок р54 вируса африканской чумы свиней китайского штамма Jilin, где нуклеотидная последовательность, кодирующая белок р72 вируса африканской чумы свиней китайского штамма Jilin, представлена в SEQ ID NO: 1, а нуклеотидная последовательность, кодирующая белок р54 вируса африканской чумы свиней китайского штамма Jilin, представлена в SEQ ID NO: 2.
2. Рекомбинантная Lactobacillus, экспрессирующая иммуногенный белок вируса африканской чумы свиней, где рекомбинантная Lactobacillus содержит рекомбинантный экспрессионный вектор по п. 1.
3. Способ конструирования рекомбинантной Lactobacillus по п. 2, включающий:
(1) клонирование нуклеотидной последовательности, кодирующей белок р72 вируса африканской чумы свиней, и нуклеотидной последовательности, кодирующей белок р54 вируса африканской чумы свиней, в экспрессионный вектор Lactobacillus pVE5523 для конструирования рекомбинантных плазмид pVE5523-ASFV-p72 и pVE5523-ASFV-p54, соответственно;
(2) трансформирование компетентных клеток Lactobacillus рекомбинантными плазмидами pVE5523-ASFV-p72 и pVE5523-ASFV-p54 с получением рекомбинантных Lactobacillus, экспрессирующих белок р72 вируса африканской чумы свиней, и рекомбинантных Lactobacillus, экспрессирующих белок р54 вируса африканской чумы свиней, соответственно.
4. Способ конструирования по п. 3, где перед осуществлением клонирования на стадии (1) способ дополнительно включает оптимизацию последовательностей генов р72 и р54 вируса африканской чумы свиней китайского штамма Jilin, найденных в GenBank, с получением последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, а затем осуществление клонирования.
5. Способ конструирования по п. 3, где после получения рекомбинантных Lactobacillus на стадии (2) способ дополнительно включает размножение рекомбинантных Lactobacillus в жидкой среде MRS и выделение рекомбинантных плазмид для детектирования посредством флуоресцентной количественной ПЦР (полимеразная цепная реакция).
6. Способ конструирования по п. 5, где пары праймеров, используемых для детектирования посредством флуоресцентной количественной ПЦР, включают, соответственно:
праймеры для детектирования р72 посредством флуоресцентной количественной ПЦР включают прямые праймеры р72 с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, и обратные праймеры р72 с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4;
праймеры для детектирования р54 посредством флуоресцентной количественной ПЦР включают прямые праймеры р54 с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, и обратные праймеры р54 с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 7.
7. Применение рекомбинантного экспрессионного вектора по п. 1 или рекомбинантной Lactobacillus по п. 2 для профилактики и/или лечения африканской чумы свиней.
8. Применение рекомбинантного экспрессионного вектора по п. 1 или рекомбинантной Lactobacillus по п. 2 для изготовления лекарственных средств для профилактики и/или лечения африканской чумы свиней.
9. Применение по п. 8, где лекарственное средство содержит пероральный препарат живых бактерий.
10. Пероральный препарат живых бактерий для профилактики инфекции африканской чумы свиней, где активные ингредиенты перорального препарата живых бактерий содержат рекомбинантные Lactobacillus, экспрессирующие белок р72 вируса африканской чумы свиней, и рекомбинантные Lactobacillus, экспрессирующие белок р54 вируса африканской чумы свиней, сконструированные способом конструирования по п. 3.
11. Пероральный препарат живых бактерий по п. 10, где соотношение живых бактерий для рекомбинантных Lactobacillus, экспрессирующих белок р72 вируса африканской чумы свиней, и рекомбинантных Lactobacillus, экспрессирующих белок р54 вируса африканской чумы свиней, составляет (0,8-1,2)×108 КОЕ (колониеобразующих единиц) : (0,8-1,2)×108 КОЕ.
12. Пероральный препарат живых бактерий по п. 11, где соотношение живых бактерий для рекомбинантных Lactobacillus, экспрессирующих белок р72 вируса африканской чумы свиней, и рекомбинантных Lactobacillus, экспрессирующих белок р54 вируса африканской чумы свиней, составляет 1×108 КОЕ : 1×108 КОЕ.
13. Способ лечения африканской чумы свиней, включающий: прием животными перорального препарата живых бактерий по любому из пп. 10-12, где принимаемое количество составляет 5 мл на животное.
