Модифицированные изоляты streptomyces fungicidicus и их применение

Авторы патента:

ЗАБРИСКИ, Т, Марк (US)

C12P1/06 - актиномицетов

C12N1/20 - бактерии; питательные среды для них

C07K14/36 - из актиномикоза; из стрептомикоза (G)

Владельцы патента RU 2773311:

ИНТЕРВЕТ ИНТЕРНЭШНЛ Б.В. (NL)

Группа изобретений относится к штамму Streptomyces fungicidicus для продуцирования эндурацидина и способу получения эндурацидина с использованием указанного штамма. Предложен штамм Streptomyces fungicidicus, продуцирующий эндурацидин и имеющий депозитарный номер ATCC PTA-122342. Также предложен способ получения эндурацидина, включающий культивирование указанного штамма Streptomyces fungicidicus в культуральной среде в условиях, достаточных для получения эндурацидина, и выделение эндурацидина из культуральной среды. Группа изобретений обеспечивает эффективное продуцирование эндурацидина. 2 н.п. ф-лы, 6 табл., 4 пр., 1 ил.

Перекрестная ссылка на родственные заявки

В настоящей заявке в соответствии со ст.35 Кодекса законов США 119(с) испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США рег.№62/430455, поданной 6 декабря 2016 г., содержание которой во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к модифицированным изолятам Streptomyces fungicidicus, к композициям, содержащим эти изоляты, и к способам применения таких изолятов и композиций для биологического синтеза эндурацидина (энрамицина). Настоящее изобретение также относится к модифицированным изолятам Streptomyces fungicidicus, которые биологически синтезируют эндурацидин и способствуют более эффективному продуцированию энрамицина.

Предпосылки создания изобретения

Эндурацидин, также известный как энрамицин и имеющийся в продаже как Энрадин, в соответствии с программой Охраны здоровья животных MSD, представляет собой природный липодепсипептидный антибиотик из 17 аминокислот, который биологически синтезируется и секретируется бактерией Streptomyces fungicidicus, то есть природным продуцентом эндурацидина.

Эндурацидин представляет собой родовое название аналогов эндурацидина и включает эндурацидины A, B, C и D. Этот пептид может быть выделен из сбраживающего бульона, а в первую очередь, мицелиев в виде смеси эндурацидинов А и В, которые отличаются одним атомом углерода в присоединенной липидной цепи. По своей структуре, эндурацидины отличаются по С₁₂ или С₁₃-2Z,4E- разветвленной молекуле жирной кислоты, связанной амидной связью с остатком аспарагиновой кислоты, и присутствием множества непротеиногенных аминокислотных остатков, таких как эндурацидидин, 4-гидроксифенилглицин, 3,5-дихлор-4-гидроксифенилглицин, цитруллин и орнитин.

Эндурацидин обладает сильной антибактериальной активностью in vitro и in vivo, направленной против грамположительных микроорганизмов широкого спектра, включая Clostridium perfringens, резистентный к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA) и резистентный к ванкомицину Enterococcus (VRE). Эндурацидин ингибирует биосинтез пептидогликана бактериальной клеточной стенки посредством образования комплекса с внеклеточным липидом II, то есть предшественником клеточной стенки бактерий. Сайт образования комплекса липида II с эндурацидином отличается тем, что он распознается ванкомицином и ответственен за действие эндурацидина, направленное против микроорганизмов, резистентных к ванкомицину. В настоящее время не существует какого-либо документального подтверждения перекрестной резистентности эндурацидина с любыми применяемыми в клиниках антибиотиками, а также нет никаких данных о эволюционной, приобретенной или передаваемой резистентности. Благодаря отсутствию какой-либо известной формы механизма передачи резистентности, отсутствию биодоступности при пероральном введении, низкой токсичности, а также значительной антибактериальной активности по отношению к Clostridium spp., эндурацидин является ключевым антибиотиком для борьбы с энтеритом, вызываемым клостридиями у домашней птицы.

В соответствии с этим, эндурацидин, при его введении в корм домашней птицы, ингибирует рост бактерий, которые вызывают некротический энтерит и нарушение роста у домашней птицы. Эндурацидин также не имеет синдрома отмены. Кроме того, эндурацидин является стабильным в корме и в гранулах, может быть введен курам в очень низкой дозе и не остается в мясе и яйцах кур, обработанных этим средством.

В последние годы был получен ряд штаммов Streptomyces fungicidicus, которые были модифицированы для повышения эффективности этих эндурацидин-продуцирующих микроорганизмов, например, Streptomyces fungicidicus В-5477 (IFO-12439, АТСС-21013) и Streptomyces fungicidicus В-5477-m (IFO-12440, АТСС-21014) [см., например, патент США 3577530, патент США 3786142 и патент США 4465771]. Однако необходимость дальнейшего улучшения таких модифицированных изолятов Streptomyces fungicidicus для продуцирования еще более эффективных эндурацидин-продуцирующих микроорганизмов остается актуальной.

Любые цитируемые здесь документы не должны рассматриваться как указание на то, что эти документы относятся к «предшествующему уровню техники».

Сущность изобретения

В соответствии с этим, настоящее изобретение относится к новым модифицированным изолятам Streptomyces fungicidicus, которые более эффективно продуцируют эндурацидин. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus кодирует один или более или все из следующих белков: Orf2798, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 95% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 2; Orf3866, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 95% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, и в которой сохраняется треониновый остаток в положении аминокислоты 124; Orf5175, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 95% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 91; и Orf5387, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 95% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 164. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus, кроме того: (i) содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую Orf4755 и включающую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9, вместо нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 23; и/или (ii) не содержит функционального белка Orf682; и/или (iii) не содержит функционального белка Orf4868. В конкретных вариантах этого типа, отсутствие функционального белка Orf682 и/или отсутствие функционального белка Orf4868 обусловлено мутацией со сдвигом рамки считывания в гене, который кодирует белок Orf682 и/или белок Orf4868.

В конкретных вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus кодирует один или более или все из следующих белков: Orf2798, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 98% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 2; Orf3866, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 98% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, и в которой сохраняется треониновый остаток в положении аминокислоты 124; Orf5175, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 98% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 91; и Orf5387, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 98% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 164. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus кроме того: (i) содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую Orf4755 и включающую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9, вместо нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 23; и/или (ii) не содержит функционального белка Orf682; и/или (iii) не содержит функционального белка Orf4868. В конкретных вариантах этого типа, отсутствие функционального белка Orf682 и/или отсутствие функционального белка Orf4868 обусловлено мутацией со сдвигом рамки считывания в гене, который кодирует белок Orf682 и/или белок Orf4868.

В других вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus кодирует один или более или все из следующих белков: Orf2798, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 99% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 2; Orf3866, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 99% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, и в которой сохраняется треониновый остаток в положении аминокислоты 124; Orf5175, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 99% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 91; и Orf5387, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 99% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 164. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus кроме того: (i) содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую Orf4755 и включающую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9, вместо нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 23; и/или (ii) не содержит функционального белка Orf682; и/или (iii) не содержит функционального белка Orf4868. В конкретных вариантах этого типа, отсутствие функционального белка Orf682 и/или отсутствие функционального белка Orf4868 обусловлено мутацией со сдвигом рамки считывания в гене, который кодирует белок Orf682 и/или белок Orf4868.

В других вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus кодирует один или более или все из следующих белков: Orf2798, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; Orf3866, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; Orf5175, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и Orf5387, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus кроме того: (i) содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую Orf4755 и включающую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9, вместо нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 23; и/или (ii) не содержит функционального белка Orf682; и/или (iii) не содержит функционального белка Orf4868. В конкретных вариантах этого типа, отсутствие функционального белка Orf682 и/или отсутствие функционального белка Orf4868 обусловлено мутацией со сдвигом рамки считывания в гене, который кодирует белок Orf682 и/или белок Orf4868.

В родственных вариантах осуществления изобретения, модифицированный Streptomyces fungicidicus: (i) содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую Orf4755 и включающую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9, вместо нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 23; и/или (ii) не содержит функционального белка Orf682; и/или (iii) не содержит функционального белка Orf4868. В конкретных вариантах этого типа, отсутствие функционального белка Orf682 и/или отсутствие функционального белка Orf4868 обусловлено мутацией со сдвигом рамки считывания в гене, который кодирует белок Orf682 и/или белок Orf4868.

В конкретных вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus обладает иммуногенными и/или физическими и/или генетическими свойствами модифицированного изолята Streptomyces fungicidicus, имеющего депозитарный номер ATCC PTA-122342. В более конкретных вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus представляет собой изолят, имеющий депозитарный номер ATCC PTA-122342, или потомство и/или производное изолята, имеющего депозитарный номер ATCC PTA-122342. В родственном аспекте изобретения, все модифицированные Streptomyces fungicidicus согласно изобретению также рассматриваются как выделенные модифицированные изоляты Streptomyces fungicidicus.

В настоящее изобретение также входят наборы праймеров, имеющие нуклеотидные последовательности: SEQ ID NO: 29 и 30; SEQ ID NO: 31 и 32; SEQ ID NO: 33 и 34; SEQ ID NO: 35 и 36; SEQ ID NO: 37 и 38; SEQ ID NO: 39 и 40; SEQ ID NO: 41 и 42; SEQ ID NO: 43 и 44; SEQ ID NO: 45 и 46; SEQ ID NO: 47 и 48; SEQ ID NO: 49 и 50; и/или любые их комбинации. Кроме того, наборы, содержащие один или более из таких наборов праймеров, также являются частью настоящего изобретения. Кроме того, в настоящее изобретение входит применение этих праймеров в анализе на идентификацию генома Streptomyces fungicidicus согласно изобретению.

Эти и другие аспекты настоящего изобретения будут более поняты со ссылкой на Чертежи, Подробное описание и Примеры.

Краткое описание чертежа

На фиг.1 показано положение 11 полиморфизмов на геноме S. fungicidicus BM38, используемых в качестве маркеров мутации для ПЦР-скрининга, описанного ниже в Примерах.

Подробное описание изобретения

Получение вторичных бактериальных метаболитов или натуральных продуктов для их применения в коммерческих целях, например, в медицине или сельском хозяйстве, связано с такими проблемами, как низкие выходы нужного продукта из родительского микроорганизма/микроорганизма дикого типа. В последние десятилетия, благодаря прогрессу в понимании природы биосинтеза натурального продукта стало очевидным, что продуцирование вторичных метаболитов может регулироваться и контролироваться несколькими способами. В большинстве случаев, гены биосинтеза бактериальных природных продуктов, включая гены, ответственные за образование предшественника, структурную сборку, модификацию после сборки, ауторезистентность и регуляцию, образуют кластеры на бактериальной хромосоме. Биосинтез природных продуктов может быть вызван как внеклеточными, так и внутриклеточными сигнальными молекулами, которые взаимодействуют с путь-специфически регуляторами или плейотропными регуляторами, которые регулируют продуцирование более, чем одного продукта. Мутации, происходящие в любом из этих регуляторных генов или систем, могут повышать, снижать или прекращать продуцирование антибиотиков.

Улучшение штамма может играть определенную роль в экономически эффективном промышленном производстве антибиотиков или других вторичных микробных метаболитов. Мутантные штаммы, способные давать повышенные выходы конкретных метаболитов, могут быть созданы посредством случайных мутаций, путем направленной дизрупции специфических генов или путем введения гена(ов), который(е) устраняет(ют) нарушения пути биосинтеза. Было подтверждено, что генетические манипуляции регуляторных генов, а также генов биосинтеза для гиперпродуцирования специфических вторичных метаболитов, представляют собой эффективную и успешную стратегию улучшения штаммов актиномицетов. В конкретном аспекте изобретения были идентифицированы ключевые кодирующие последовательности Streptomyces fungicidicus, которые, при их модификации и/или элиминации дают изоляты с улучшенными свойствами, позволяющими осуществлять биосинтез и/или продуцирование эндурацидина в коммерческих целях.

Последовательность ДНК размером в 116 тысяч пар оснований, происходящая от штамма S. fungicidicus ATCC 21013 дикого типа, который имеет кластер гена биосинтеза эндурацидина и его фланкирующие области, была уже описана в литературе [в патенте США 8188245, который во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки] и имеется в GenBank [рег.No. DQ403252]. Как показано ниже, была определена общая геномная последовательность BM38-2 (ATCC NO. PTA-122342), и эту последовательность сравнивали с геномом дикого типа. Такой сравнительный анализ позволил идентифицировать по меньшей мере 77 полиморфизмов или мутационных различий между геномами, и провести отбор семи (7) ключевых открытых рамок считывания, которые относятся к улучшенным свойствам ATCC NO. PTA-122342, как показано ниже. Однако было неожиданно обнаружено, что ни одна из этих семи ключевых открытых рамок считывания не ассоциируется с кластером гена биосинтеза эндурацидина и его фланкирующими областями хромосомы S. fungicidicus. Однако независимо от этого, модификация этих семи ключевых открытых рамок считывания позволяет облегчить конструирование новых модифицированных изолятов Streptomyces fungicidicus с помощью стандартной рекомбинантной технологии, и эти изоляты будут иметь свойства, сравнимые со свойствами уже известных изолятов, или даже будут обладать гораздо лучшими свойствами.

Использование терминов в единственном числе для удобства описания никоим образом не должно рассматриваться как ограничение объема изобретения. Так, например, термин «изолят» включает один или более таких изолятов, если это не оговорено особо. Использование терминов во множественном числе также не должно рассматриваться как ограничение объема изобретения, если это не оговорено особо.

Используемый здесь термин «приблизительно» является синонимом термина «около» и обычно означает величину в пределах двадцати пяти процентов от указанной величины, если это не оговорено особо, например, увеличение уровня продуцирования эндурацидина «приблизительно» в 4 раза может означать увеличение продуцирования в 3-5 раз.

Используемая здесь одна аминокислотная последовательность является на 100% «идентичной» второй аминокислотной последовательности, если аминокислотные остатки обеих последовательностей являются идентичными. В соответствии с этим, аминокислотная последовательность является на 50% «идентичной» второй аминокислотной последовательности, если 50% аминокислотных остатков двух аминокислотных последовательностей являются идентичными. Сравнения последовательностей осуществляют по всей непрерывной последовательности аминокислотных остатков, содержащихся в данном белке, например, в сравниваемом белке или в части полипептида. В конкретном варианте осуществления изобретения, во внимание принимаются также выбранные делеции или инсерции, которые могут как-либо иначе влиять на соответствие между двумя аминокислотными последовательностями.

Процент идентичности используемых здесь нуклеотидных и аминокислотных последовательностей может быть определен с помощью алгоритма C, MacVector (MacVector, Inc. Cary, NC 27519), Vector NTI (Informax, Inc. MD), Oxford Molecular Group PLC (1996) и Clustal W, где параметры выравнивания и параметры оценки идентичности используются по умолчанию. Эти коммерчески доступные программы могут быть также применены для определения сходства последовательностей с использованием тех же самых или аналогичных параметров по умолчанию. Альтернативно, может быть проведен поиск с помощью модифицированной программы Blast в условиях фильтрации по умолчанию, например, с использованием программы Pileup GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) с параметрами по умолчанию.

Используемый здесь микроорганизм, который «не содержит функционального» полипептида, или в котором «отсутствует функциональный» полипептид (например, Orf682), представляет собой микроорганизм, который не экспрессирует этот полипептид и/или экспрессирует модифицированный полипептид, природная биологическая функция которого составляет максимум 10% от природной биологической функции соответствующего полипептида дикого типа, например, усеченного фермента, который обладает ферментативной активностью (например, ферментативной эффективностью, то есть Vmax/Km) по отношению к его природному субстрату, где такая активность составляет максимум 10% от активности соответствующего фермента дикого типа, как было определено путем проведения стандартного анализа в тех же самых условиях. В конкретных вариантах осуществления изобретения, «отсутствие функционального» полипептида в микроорганизме эквивалентно отсутствию конкретной биологической функции этого полипептида.

Используемая здесь открытая рамка считывания, которая является «отключенной», была модифицирована, например, путем введения делеции в рамку считывания, сдвига рамки считывания, инсерции и/или точковой мутации, в результате чего микроорганизм, который содержит «отключенную» открытую рамку считывания, вообще не экспрессирует полипептид, кодируемый соответствующей рамкой считывания дикого типа и/или экспрессирует модифицированный полипептид, природная биологическая функция которого составляет максимум 10% от природной биологической функции соответствующего полипептида дикого типа. В конкретных вариантах осуществления изобретения, в микроорганизме, содержащем «отключенную» открытую рамку считывания, наблюдается отсутствие конкретной биологической функции полипептида, кодируемого открытой рамкой считывания дикого типа.

Используемый здесь термин «генный кластер» означает набор генетических элементов, сгруппированных вместе на хромосоме, где белковые продукты этих кластеров обладают родственной функцией, такой как способность осуществлять природный путь биосинтеза продукта.

Консервативной заменой является аминокислотная замена, которая, по существу, не влияет на активность (специфичность или аффинность связывания) молекулы. Обычно, консервативные аминокислотные замены включают замены одной аминокислоты на другую аминокислоту с теми же самыми химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). В нижеследующей таблице представлены репрезентативные консервативные аминокислотные замены:

Исходный остаток	Консервативные замены	Исходный остаток	Консервативные замены
	Ser	Leu	Ile; Val
Arg			Arg; Gln; Glu
Asn	Gln; His	Met	Leu; Ile
Asp	Glu	Phe	Met; Leu; Tyr
Cys	Ser	Ser	Thr
Gln	Asn	Thr	Ser
Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp; Phe
His	Asn; Gln	Val	Ile; Leu

Получение модифицированного Streptomyces fungicidicus

Подходящие методы и материалы для осуществления раскрытых вариантов изобретения описаны ниже. Кроме того, осуществление раскрытых вариантов изобретения может быть проведено с применением любых соответствующих методов или технологий, хорошо известных специалистам. Некоторые стандартные методы и технологии согласно изобретению описаны, например, в руководствах Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rd ed., Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (и Дополнение к изданию 2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4^th ed., Wiley & Sons, 1999; Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990; Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999; и Kieser, T., Bibb, M.J., Buttner, M.J., Chater, K.F., and Hopwood, D.A.: Practical Streptomyces genetics, John Innes Centre, Norwich Research Park, Colney, Norwich NR4 &UH, England, 2000.

Рекомбинантные экспрессионные плазмидные векторы Streptomyces fungicidicus могут быть получены для их применения в целях создания модифицированных изолятов Streptomyces fungicidicus согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сконструированный рекомбинантный вектор Streptomyces fungicidicus содержит по меньшей мере одну отобранную открытую рамку считывания Streptomyces fungicidicus. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сконструированный рекомбинантный вектор Streptomyces fungicidicus содержит по меньшей мере одну отобранную открытую рамку считывания Streptomyces fungicidicus, экспрессируемую под контролем промотора. В других вариантах осуществления изобретения, промотором является сильный конститутивный промотор Streptomyces, который способствует усилению продуцирования эндурацидина, если вектор экспрессируется в штамме Streptomyces fungicidicus. В некоторых вариантах осуществления изобретения, открытая рамка считывания, вместо собственного нативного промотора, функционально присоединена к гетерологичному промотору. Так, например, она может быть функционально присоединена к конститутивному промотору, такому как сильный конститутивный экспрессионный промотор или индуцибельный промотор. В конкретных вариантах осуществления изобретения, сильным конститутивным промотором является ermE*p, происходящий от продуцента эритромицина, Saccharopolyspora erythraea. В других вариантах, индуцибельным промотором является индуцибельный промотор тиострептона, tipA. В других вариантах осуществления изобретения используется система P(nitA)-NitR [Herai et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 101(39):14031-14035 (2004)] или промотор стрептомицетов SF14. В других вариантах осуществления изобретения используется нативный промотор гена резистентности к апрамицину amRp.В других вариантах осуществления изобретения используются P_hrdB, P_tcp830 и/или Pneos. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сконструированный рекомбинантный вектор содержит открытую рамку считывания orf2798, включающую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, и/или открытую рамку считывания orf682, которая была «отключена».

В соответствии с этим могут быть сконструированы рекомбинантные штаммы Streptomyces fungicidicus, способные давать более высокие выходы эндурацидина по сравнению со штаммом Streptomyces fungicidicus дикого типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сконструированный рекомбинантный штамм Streptomyces fungicidicus содержит по меньшей мере одну отобранную открытую рамку считывания Streptomyces fungicidicus, введенную в хромосому и экспрессируемую под контролем промотора, такого как сильный конститутивный экспрессионный промотор Streptomyces, который способствует повышению уровня продуцирования эндурацидина в сконструированном штамме. В других вариантах осуществления изобретения, экспрессия введенной открытой рамки считывания в Streptomyces fungicidicus индуцируется не собственным нативным промотором, а гетерологичным промотором. Так, например, она может быть функционально присоединена к конститутивному промотору, такому как сильный конститутивный экспрессионный промотор или индуцибельный промотор. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сильным конститутивным промотором является ermE*p.В других вариантах осуществления изобретения, индуцибельным промотором является tipA. В некоторых примерах используется система P(nitA)-NitR [см. выше] или промотор SF14. В других вариантах осуществления изобретения, конститутивным экспрессионным промотором является amRp.В других вариантах осуществления изобретения используются промоторы P_hrdB, P_tcp830 и/или Pneos.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, сконструированный штамм содержит открытую рамку считывания orf3866 Streptomyces fungicidicus. В конкретных вариантах этого типа, открытая рамка считывания orf3866 функционально присоединена к гетерологичному промотору. Так, например, она может быть присоединена к сильному конститутивному промотору, такому как ermE*p.В других примерах, открытая рамка считывания orf3866 функционально присоединена к промотору tipA, SF14, amRp, P_hrdB, P_tcp830 и/или Pneos.

В других вариантах осуществления изобретения, сконструированый штамм кодирует измененную открытую рамку считывания orf4868. Открытая рамка считывания orf4868 может быть отключена посредством инсерционной дизрупции, делеции в рамке считывания, сдвига рамки считывания и/или точковой мутации. В некоторых примерах, открытая рамка считывания orf4868 отключена посредством делеции в рамке считывания. Вообще говоря, любая внутренняя делеция рамки считывания orf4868, из-за ее дефекта, должна приводить к отключению функции orf4868. В родственных вариантах осуществления изобретения, сконструированный штамм включает две, три, четыре, пять, шесть, семь или более открытых рамок считывания Streptomyces fungicidicus.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus происходит от родительского штамма дикого типа, такого как, но не ограничивающегося ими, Streptomyces fungicidicus, имеющийся в Американской коллекции тканевых культур (ATCC) No. 21013. В других вариантах осуществления изобретения, сконструированный штамм Streptomyces fungicidicus происходит от стандартных мутантных штаммов, таких как, но не ограничивающихся ими, штаммы Streptomyces fungicidicus ATCC 31729, Streptomyces fungicidicus ATCC 31730 и Streptomyces fungicidicus ATCC 31731.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, уровень продуцирования эндурацидина по меньшей мере в 1,2 раза, например, по меньшей мере в 1,5 раза, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 2,5 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 3,5 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 4,5 раза, включая, но не ограничиваясь ими, в 1,2-10 раз, 1,2-4,6 раз и приблизительно в 2-5 раз превышает уровень продуцирования эндурацидина по сравнению со штаммом Streptomyces fungicidicus дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, модифицированный Streptomyces fungicidicus может быть сконструирован путем интеграции рекомбинантной плазмиды, содержащей по меньшей мере одну открытую рамку считывания, усиливающую продуцирование эндурацидина, в хромосому родительского штамма Streptomyces fungicidicus. Интегрированный сопряженный вектор может иметь, или может быть сконструирован так, чтобы он имел сильный конститутивный промотор Streptomyces. В некоторых вариантах осуществления изобретения, плазмида может не содержать репликона стрептомицетов и может быть интегрирована в хромосому посредством гомологичной рекомбинации под действием одного сайт-специфического кроссинговера. В других вариантах осуществления изобретения, плазмида может присутствовать в виде свободной плазмиды. В некоторых вариантах осуществления изобретения, может быть сконструирован сопряженный вектор, в котором плазмидная вставка имеет частично или полностью делетированный представляющий интерес ген и его фланкирующие области, которые могут быть интегрированы в хромосому после двойной гомологичной рекомбинации посредством кроссинговера с образованием мутанта, имеющего делецию в рамке считывания.

Продуцирование эндурацидина из рекомбинантных штаммов Streptomyces fungicidicus

Рекомбинантные штаммы Streptomyces fungicidicus, раскрываемые в настоящей заявке, были использованы для разработки способов получения повышенных уровней эндурацидина. Технический прогресс в данной области позволяет значительно сэкономить затраты, связанные с производством эндурацидина. В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ получения эндурацидина включает культивирование раскрытого здесь рекомбинантного штамма Streptomyces fungicidicus в условиях, достаточных для получения эндурацидина. В других вариантах осуществления изобретения, этот способ также включает выделение эндурацидина из культуральной среды после культивирования. В других вариантах осуществления изобретения, способ также содержит определение антибактериальной активности полученного эндурацидина, например, с помощью ВЭЖХ-анализа или биоанализа с использованием S. aureus ATCC 29213 или Bacillis subtilis ATCC 6633 с указанием микроорганизмов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндурацидин получают с использованием раскрытого здесь штамма Streptomyces fungicidicus в условиях ферментации, описанных ранее для получения эндурацидина [Higashide et al., J. Antibiot. 21:126-137 (1968)]. После получения, соединения могут быть очищены и/или проанализированы с помощью ВЭЖХ-анализа. Методы получения эндурацидина и сбора этого соединения из культуральной среды можно найти в патенте США 4465771, который во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

В конкретных вариантах осуществления изобретения, раскрытый здесь изолят Streptomyces fungicidicus согласно изобретению культивируют в бульоне из триптона и сои (TSB) на шейкере (таком как шейкер, работающий на 225 об/мин и при 30°C в течение 48 часов), а затем переносят в среду для продуцирования эндурацидина (EPM, см. ниже Таблицу 1) на определенный период времени проведения непрерывной ферментации, например, по меньшей мере на пять дней и до одиннадцати дней, включая 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 дней непрерывной ферментации. В более конкретных вариантах осуществления изобретения, получение эндурацидина с использованием штаммов дикого типа и их производных осуществляют в автоматических ферментерах.

Таблица 1
Состав среды для получения эндурацидина (EPM) (pH 6,7)
Растворимый крахмал	1,5	KH₂PO4	0,05
Глюкоза	1,0	(NH₄)₂SO₄	0,15
Кукурузная мука	2,5	CaCO₃	0,5
Мука из кукурузного глютена	2,0	Лактоза	0,5
Кукурузный жидкий сироп	0,25	ZnCl₂	0,005
Хлорид натрия	0,25	Куриный жир	0,7
NaH₂PO₄	1,3

Таблица 2
Список последовательностей
SEQ ID NO:	Открытая рамка считывания	Тип	SEQ ID NO:	Открытая рамка считывания	Тип
	ATCC No. PTA-122342			WT B 5477
1	Orf2798	NA	15	Orf2798	NA
2	Orf2798	AA	16	Orf2798	AA
3	Orf3866	NA	17	Orf3866	NA
4	Orf3866	AA	18	Orf3866	AA
5	Orf 5175	NA	19	Orf 5175	NA
6	Orf 5175	AA	20	Orf 5175	AA
7	Orf5387	NA	21	Orf5387	NA
8	Orf5387	AA	22	Orf5387	AA
9	Orf4755	NA	23	Orf4755	NA
10	Orf4755	AA	24	Orf4755	AA
11	Orf682	NA	25	Orf682	NA
12	Orf682	AA	26	Orf682	AA
13	Orf4868	NA	27	Orf4868	NA
14	Orf4868	AA	28	Orf4868	AA
AA означает аминокислотную последовательность; NA означает последовательность нуклеиновой кислоты.

Биологический депозит

Культуры нижеследующего биологического материала были депонированы в нижеследующем Международном депозитарии: Американской коллекции типовых культур (ATCC) 10801, University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, U.S.A., в условиях, удовлетворяющих требованиям Будапештского договора.

Организм	Регистрационный No.	Дата депонирования
Streptomyces fungicidicus (BM38-2)	PTA-122342	5 августа 2015

Настоящее изобретение будет более очевидным со ссылкой на нижеследующие неограничивающие примеры, которые представлены как репрезентативные. Нижеследующие примеры приводятся для более полной иллюстрации предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Однако эти примеры никоим образом не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения.

Примеры

Пример 1

Модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus

Получение биомассы Streptomyces fungicidicus для ее применения в целях биосинтеза эндурацидина

Ферментация Streptomyces fungicidicus может быть проведена в глубоких промышленных ферментерах резервуарного типа, прошедших санитарную обработку и снабженных системами мониторинга и контроля рН, температуры, кислорода, аэрации и встряхивания. Каждую ферментированную партию S. fungicidicus берут из охарактеризованной и регулируемой рабочей посевной маточной культуры для продуцирования, хранящейся в охраняемом помещении в условиях низких температур. Процесс ферментации осуществляют в три стадии с последующим проведением дополнительной обработки, описанной ниже:

Стадия I:

Рабочие посевные культуры, содержащие 10⁷-10¹⁰ спор/мл, могут быть использованы для инициации продуцирования партий ферментации. 1-5 сосудов с замороженнй посевной культурой, хранящейся при низкой температуре, вынимают и либо оттаивают на лабораторном столике, либо помещают на водяную баню при 28-32°C до оттаивания содержимого сосудов. Оттаянную(ые) культуру(ы) асептически переносят в 800-1000 мл стерильной воды, хранящейся при комнатной температуре, и осторожно перемешивают для ресуспендирования культуры.

Стадия II:

Ресуспендированную культуру асептически переносят в посевную среду. Посевная среда состоит из глюкозы (0,5 г/л), декстрина (2,5 г/л), жидкого кукурузного сиропа (1,0-4,0 мл/л), соевого порошка (3,0 г/л), сульфата аммония (0,25 г/л), монофосфата калия (0,13-0,54 г/л), сульфата железа (0,00-0,5 г/л), гидроксида калия (0,13 мл/л), осажденного карбоната кальция (1,5 г/л), противовспенивающего агента на основе кремния (0,1 мл/л) и воды, добавляемой в достаточном количестве. Среду стерилизуют при 125°С в течение 45 минут, а затем охлаждают до 28°С.Объем среды регулируют с использованием стерильной воды до получения нужного рабочего объема. рН доводят до 6,6-6,8. Рабочие параметры промышленного посевного цикла включают: температуру инкубирования 28°С±2°С, внутреннее давление 0,5-1,5 кг/см², скорость аэрации 2-4 Нм³/мин, и скорость перемешивания приблизительно 80 оборотов в минуту, в зависимости от размера и конфигурации сосуда. Затем проводят мониторинг рН и потребления кислорода и мониторинг вязкости, но эти параметры не регулируют. Культивирование осуществляют в течение 50-60 часов, а затем переносят в основной ферментер для получения культуры. Вязкость в момент переноса должна составлять в пределах 350-600 сП, а рН должен составлять ≤6,0, при этом, потребление кислорода должно увеличиваться. Посевную культуру асептически переносят в основную среду для ферментации в целях завершения цикла ферментации.

Стадия III:

Состав среды в основном ферментере для получения культуры включает: кукурузную муку (13,0-15,0 мас./об.%), кукурузную глютеновую муку (3,0-6,0% мас./об.), муку из семян хлопчатника (0,3 мас./об.%), жидкий кукурузный сироп (0-0,6 об./об.%), хлорид натрия (0,3% мас./об.), сульфат аммония (0,25-0,6 мас./об.%), молочную кислоту (0-0,5 об./об.%), хлорид цинка (0,01% мас./об.), сульфат железа (0,0-0,02% мас./об.), гидроксид калия (0,20-0,5 об./об.%), сульфат кальция (0,0-0,5% мас./об.), осажденный карбонат кальция (0,5% мас./об.), альфа-амилазу (0,056% мас./об.), гидроксид калия (0,05 об./об.%), соевое масло (0,5-2,0 об./об.%), противовспенивающий агент и достаточное количество воды. Ингредиенты добавляют в указанном порядке. Воду добавляют к ингредиентам вплоть до введения альфа-амилазы, а затем полученную композицию нагревают до 80°С в течение 15 минут для того, чтобы фермент разлагал сложные углеводы. После этого добавляют остальные ингредиенты, рН доводят до pH 6,6-6,8, и добавляют достаточное количество воды. Среду стерилизуют при 125°С в течение 45 минут, охлаждают до 28°C, и добавляют воду в количестве, достаточном для достижения желаемого рабочего объема.

Содержимое ферментера для посева переносят в основную среду для ферментации, и в ферментере создают следующие условия: температуру 28°С, скорость аэрации 40 Нм³/мин, внутреннее давление 0,5 кг/см², и скорость аэрации, эквивалентную скорости, установленной приблизительно на 1,85 кВт/м³. Рабочие условия изменяют через два часа после начала цикла ферментации путем доведения уровня растворенного кислорода до 12,75 м.д., повышения скорости аэрации до 50 Нм³/мин, и увеличения внутреннего давления до 0,7 кг/см². После этого, скорость аэрации, внутреннее давление и скорость перемешивания корректируют для гарантии того, что уровень растворенного кислорода не будет скорость-ограничивающим. В культуру добавляют стерильную воду, если вязкость повышается до точки, при которой наблюдается ограничение уровня растворенного кислорода. В течение всего цикла, тщательно регулируют пенообразование для предотвращения загрязнения или оттока культуры. Приблизительно через 3 часа после увеличения подаваемого кислорода начинают осуществлять регуляцию рН. В течение всего цикла ферментации осуществляют регуляцию и/или мониторинг следующих параметров: рН, аэрации, растворенного кислорода, CО₂, вязкости, чистоты, скорости перемешивания, внутреннего давления и остаточного сахара. До прекращения роста бактерий, рН поддерживают на уровне 6,8, а затем его можно изменять вплоть до сбора. Типичный цикл ферментации составляет 220-300 часов. Культура считается готовой для сбора, если активность при биоанализе превышает 5000 мкг/л, рН повышается до рН 7,5 или более, вязкость уменьшается, а потребление кислорода прекращается. Культуру после ферментации собирают путем нагревания культуры до 70°С в течение 30 минут для инактивации бактерий, а затем собранную жидкость охлаждают до 25°-28°С.

Последующая обработка:

Из биомассы удаляют воду, после чего биомассу сушат, а затем формуют в предварительную смесь.

Пример 2

Эффект оптимизации продуцирования эндурацидина штаммом Streptomyces fungicidicus

В последние годы было достигнуто увеличение выходов путем обработки родительского штамма (как указано в Таблице 3). Штамм BM38-2 (РОТ-122342) дает самые высокие выходы эндурацидина. Штамм был оптимизирован путем обработки GAB-453 (ATCC 31729) с использованием ряда обработок с использованием методов культивирования и физических методов.

Таблица 3
Увеличение выхода Streptomyces fungicidicus B-54577
ATCC No.	Штамм	Обработка	Выход мкг/мл
ATCC 21013 (Ранее раскрытый)	B-5477	Родительский штамм дикого типа	730
ATCC 21014 (Ранее раскрытый)	B-5477m	γ-облучение	-
ATCC 31729 (Ранее раскрытый)	GAB-453	УФ-облучение	1290
ATCC 31730 (Ранее раскрытый)	Emt 36-3	м-фтор-DL-тирозин	2560
ATCC 31731 (Ранее раскрытый)	Emt 2-140	N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин+м-фтор-DL-тирозин	4360
PTA-122342 (Ранее не раскрытый)	BM38-2	Множество обработок с использованием методов культивирования и физических методов	9690

Ссылка: Патент 4465771; APR 14, 1984, Nogami, et.al. Takeda Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan.

Ссылка: Патент 3577530, 4 мая 1971, для ATCC 21388.

1. ATCC 21013: Исходный штамм Streptomyces fungicidicus B-5477 дикого типа, депонированный Takeda.

2. ATCC 21014: мутант, полученный путем γ-облучения штамма B-5477 и обозначенный как B-5477m, депонированный Takeda.

3. ATCC 31729: мутант, полученный путем УФ-облучения штамма B-5477 и обозначенный как GAB-453, депонированный Takeda.

4. ATCC 31730: мутант, полученный путем культивирования B-5477 на агаровых планшетах, содержащих м-фтор-DL-тирозин (MFT); мутант, обозначенный как Emt-36-3, депонированный Takeda.

5. ATCC 31731: двойной мутант, полученный путем обработки GAB-453 сначала N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанилином, а затем м-фтор-DL-тирозином (MFT) с получением мутантного штамма, обозначенного как Emt 2-140 и депонированного Takeda.

6. ATCC 21388: штамм, близкородственный штамму Streptomyces fungicidicus (S. macrosporeus) и депонированный Squibb & Sons.

Ниже представлены энрамицины в порядке снижения выхода биосинтеза от самого высокого до самого низкого:

ATCC No. PTA-122342>ATCC 31731>ATCC 31730>ATCC 31729>ATCC 21013 и ATCC 21014.

Примечательно то, что количество полученного эндурацидина ATCC PTA-122342 более чем в два раза превышает количество следующего по продуктивности изолята, и более, чем в 12 раз превышает количество эндурацидина по сравнению с родительским штаммом дикого типа.

Пример 3

Геномный анализ изолятов Streptomyces fungicidicus

Был проведен сравнительный геномный анализ штамма Streptomyces fungicidicus дикого типа, АТСС 21013 (В-5477), и производного штамма согласно изобретению, BM38-2, который включал области вокруг кластера гена биосинтеза эндурацидина (энрамицина).

Было идентифицировано всего 77 вариантов последовательностей ДНК, отличающихся по эффектам модификации физическими методами и методами культивирования родительского штамма В-5477. Информация, полученная в результате геномного анализа, позволила провести быстрое и окончательное сравнение штаммов путем отбора 11 репрезентативных вариантов, расположенных по всему геному BM38-2, как маркеров мутации (см. фиг. 1). Для каждого из маркеров мутации были сконструированы ПЦР-праймеры, которые амплифицируют фрагменты ДНК, содержащие сайты мутации, для последующего секвенирования и сравнения (см. Таблицу 4).

ПЦР-праймеры, нацеленные на маркерные области, были использованы для анализа пяти (5) штаммов, продуцирующих энрамицин, и одного (1) близкородственного штамма, имеющегося в АТСС, включая штаммы дикого типа и мутанты, депонированные Takeda, и эти штаммы сравнивали со штаммом BM38-2. В Таблице 5 систематизированы результаты и представлены ДНК-сигнатуры для 11 маркеров мутации.

Таблица 4
Наборы ПЦР-праймеров (с их соответствующими SEQ ID NN:), используемых для амплификации 11 маркеров мутации, расположенных на геноме S. fungicidicus BM38
Марк. мут. No.^#	SEQ ID №	Последовательность WT^†	Последовательность BM38-2	Праймер	SEQ праймеров	Размер продукта^* (п.о.)
1	29	G	A	SF1F	GGACGATGCCATCAAAACCG	737
	30			SF1R	ACTGCTTGATCACCGAGGTG
2	31	AC	TT	SF2F	CTGTTCAACCTGACCGGGAA	954
	32			SF2R	GAAGACCACGACCTCGATGG
3	33	G	A	SF3F	GGGCAGGAGTTCTTGAGGAC	864
	34			SF3R	CCACGTCAAGAACCTGGTGA
4	35	GA	AT	SF4F	GGCAAGTCGACCCTCATCAA	428
	36			SF4R	ATGACCGAGAACAGCGTCTC
5	37	A	G	SF5F	CGCATCTGTTCCAGGCAATG	459
	38			SF5R	TCATCGTGGCGCATAGGTAC
6	39	G	A	SF6F	TGTGGGGATGTCCTTCGGAA	173
	40			SF6R	CGACGATGCCAAGAGACTGT
7	41	AGGGCG	CGGGCC	SF7F	GGACGATGCCATCAAAACCG	685
	42			SF7R	ACTGCTTGATCACCGAGGTG
8	43	AT	GA	SF8F	TGCTGCTGTCGATCATGGAG	686
	44			SF8R	AGGAAGGGCTGGTAGGTCAT
9	45	G	C	SF9F	CGAGTCCGAAGCAGAAGGAG	745
	46			SF9R	GGGTCGGCAACATCTTCCTC
10	47	C	T	SF10F	GAGCACACGAGGACTGAGAG	976
	48			SF10R	GTACCCCCTCATAGCGCTTC
11	49	C	T	SF11F	AGAAGTACGGGATTCGGGGA	1000
	50			SF11R	ACTGCTTGATCACCGAGGTG
^#Маркер мутации No.; ^*Ожидаемый размер ПЦР-продукта;
^†Штамм дикого типа (WT): ATCC 21013.

Таблица 5A
Анализ с использованием маркеров мутации для депонированных штаммов Streptomyces fungicidicus по сравнению с ATCC NO. PTA-122342
Маркер мутации No.	Родительский ATCC 21013 B-5477	ATCC 21014 B-5477m	ATCC 21388*	ATCC 31729	ATCC 31730	ATCC 31731	PTA-122342
1	WT	WT	WT	WT	WT	WT	M
2	WT	WT	WT	WT	WT	WT	M
3	WT	WT	WT	M	WT	M	M
4	WT	WT	WT	WT	WT	WT	M
5	WT	WT	WT	M	M	M	M
6	WT	WT	WT	M	M	M	M
7	WT	WT	WT	WT	WT	WT	M
8	WT	WT	WT	WT	WT	WT	M
9	WT	WT	WT	WT	WT	WT	M
10	WT	M	M	M	M	WT	M
11	WT	WT	WT	WT	WT	WT	M
WT=Соответствует родительскому штамму дикого типа.
M=соответствует мутированной последовательности PTA-122342.
* Штамм S. macrosporeus, близкородственный штамму S. Fungicidicus.

Таблица 5B
Мутации, объединенные с BM38-2 или используемые в качестве маркеров для сравнения с помощью ПЦР
Нуклеотид No.	21013	31729	31730	31731	BM38-2	Маркер мутации No.
565,966	WT	M	WT	M	M	4
607,443	WT	M	M	M	M
608,938	WT	M	M	M	M
890,965	WT	M	WT	M	M
2,285,216	WT	WT	WT	WT	M
2,387,796	WT	WT	WT	WT	M	7
2,387,801	WT	WT	WT	WT	M	7
2,659,327	WT	M	M	M	M
2,900,485	WT	M	M	M	M
2,963,171	WT	WT	WT	WT	M	1
3,147,522	WT	M	M	M	M
3,164,639	WT	WT	WT	WT	M	8
3,358,400	WT	M	M	M	M
3,391,492	WT	M	M	M	M
3,428,632	WT	WT	WT	M	M
3,556,837	WT	M	M	M	M
3,607,398	WT	M	M	M	M
3,651,914	WT	M	M	M	M
3,743,503	WT	M	M	M	M
3,823,662	WT	M	M	M	M
4,046,322	WT	WT	WT	M	M
4,158,534	WT	M	M	M	M
4,225,769	WT	M	M	M	M
4,281,871	WT	M	M	M	M
4,294,357	WT	M	M	M	M
4,310,521	WT	M	M	M	M	10
4,449,891	WT	WT	WT	WT	M	6
4,450,937	WT	M	M	M	M
4,458,773	WT	M	M	M	M
4,462,128	WT	M	M	M	M
4,478,416	WT	M	M	M	M
4,954,366	WT	WT	WT	M	M
4,989,329	WT	M	M	M	M
5,259,346	WT	WT	WT	WT	M
5,340,994	WT	M	M	M	M	5
5,349,716	WT	M	WT	M	M	3
5,757,177	WT	WT	WT	WT	M	11
5,906,501	WT	WT	WT	WT	M	2
5,947,737	WT	M	M	M	M
6,140,913	WT	M	M	M	M
6,260,317	WT	M	M	M	M
6,703,003	WT	M	M	M	M
6,706,989	WT	M	M	M	M
7,321,611	WT	WT	WT	WT	M	9
WT=Соответствует родительскому штамму дикого типа.
M=соответствует мутированной последовательности PTA-122342.

В таблицах 5A-5B идентифицированы генетические различия между родительским штаммом (ATCC 21013 B-5477) и уже описанными штаммами. Большинство из этих уже описанных штаммов представляют собой производные штаммов ATCC 21013 B-5477, которые были получены путем модификации методом культивирования и/или физическим методом. Наиболее явные генетические различия были обнаружены для BM38-2 (ATCC No. PTA-122342). Очевидно, что праймеры, представленные в Таблице 4, могут быть также использованы для точной идентификации отличий BM38-2 (PTA-122342) от других штаммов Streptomyces fungicidicus и/или близкородственных штаммов Streptomyces sp.

Пример 4

Анализ отобранных мутаций в S. fungicidicus BM38-2

Промышленный штамм S. fungicidicus ATCC No. PTA-122342 был получен путем проведения повторных раундов мутагенеза с последующим отбором мутантов, продуцирующих высокие уровни энрамицина. Для получения информации о мутациях, введенных в штамм ATCC No. PTA-122342, который может давать повышенные уровни энрамицина, была определена общая геномная последовательность ATCC No. PTA-122342, и эту последовательность сравнивали с ее предшественником S. fungicidicus дикого типа. Этот сравнительный анализ позволяет идентифицировать по меньшей мере 77 полиморфизмов или мутационных отличий между двумя геномами. Неожиданно было обнаружено только одно различие в области хромосомы, несущей кластер гена биосинтеза энрамицина. Такое различие заключалось в замене одного нуклеотида в гене endC. Мутация нуклеотида C на T 6,260,317 в гене endC приводила к замене кодона CTC на кодон CTT, при условии, что молчащая мутация находится в кодонах для лейцина. Поэтому, маловероятно, что эта мутация играет значимую роль в явном увеличении выхода энрамицина, продуцируемого BM38-2. Отсутствие других мутаций в кластере гена энрамицина указывает на то, что хромосомные замены, ответственные за увеличение выхода энрамицина, продуцируемого BM38-2, могут сохраняться в плейотропных (не специфичных к определенному пути) регуляторных элементах или в общих регуляторных генах, расположенных в любом участке генома.

Было обнаружено, что несколько регуляторов ответа в актиномицетах влияют на биосинтез природного продукта более чем по одному пути. Ключевым примером является локус absA1A2, присутствующий в кластере гена CDA S. coelicolor, который кодирует двухкомпонентную систему передачи сигнала, аналогичную системе, присутствующей в кластере гена биосинтеза энрамицина на S. fungicidicus. Было показано, что фосфорилированная форма AbsA2 ингибирует продуцирование антибиотика благодаря непосредственному нарушению экспрессии путь-специфических регуляторов кластеров гена биосинтеза CDA, актинородина и ундецилпродигиозина. Мутации, которые ингибируют киназную активность AbsA2, повышают уровни продуцирования антибиотика. Другой пример плейотропной регуляции наблюдается в S. clavuligerus, где ген ccaR, присутствующий в кластере цефамицина С, кодирует регуляторный белок, регулирующий продуцирование цефамицина С и клавулановой кислоты.

Мутации в геноме ATCC No. PTA-122342, которые могут с наибольшей вероятностью повышать выходы энрамицина, могут присутствовать в генах, которые, как было предсказано с помощью биоинформационного анализа, кодируют регуляторные продукты, включая продукты, которые могут обладать плейотропными регуляторными свойствами. Ниже представлены примеры предполагаемых регуляторных генов, идентифицированных в геноме S. fungicidicus BM38-2, который имеет мутационные различия по сравнению со штаммом S. fungicidicus дикого типа [Мутационные различия в каждом из нижеследующих примеров показаны отсутствием звездочки, а отличающиеся/пропущенные/встроенные нуклеотиды показаны жирным шрифтом].

Сравнение последовательностей

orf682: Было предсказано, что этот ген кодирует регуляторный белок в семействе TetR, содержащем домен, связывающийся с ДНК, имеющей спираль-виток-спираль (HTH). Дополнительный G встроен в гомополимерную цепь, индуцирующую сдвиг рамки считывания.

>WT_682 транслированный генный продукт

VVSLTDKMSANAISDVWTAGGRRPLVMLRGGAEDGDGGASVRQTPVEALRQGTTGA GGLSLVERRKAALRFEIACAAVHLFTSQGVAATTGEQIAQSVGISSRTLWRHFPTKESCVLPLL TAALDFAVDRLRHWPAETSLLDFFAETCRKGDLPAATPEILDLIRMTSTEPALRAVWLQAHD DALPVLGGLLARRSGADAGDLRVTVHAATLNGALRAAVEDFARRYADRPDAADAELARCL DAALRAASEGLPY [SEQ ID NO: 26]

>BM38.2_682 транслированный генный продукт

VVSLTDKMSANAISDVWTAGGRRPLVMLRGGGRGRGRWSERAPDAG [SEQ ID NO: 12]

orf2798: Было предсказано, что этот ген кодирует ДНК-связывающийся регулятор транскрипции в семействе MurR/RpiR. Этот ген содержит домены спираль-виток-спираль (HTH) и сахар-изомеразы (SIS). Мутация G на A приводит к замене Gly на Ser.

>WT_2798 транслированный генный продукт

MGGTGSPAARLQALFEGHRLTPTQRRIAHSMVRRAADVPFLSSVELAELAGVSQPSVT RFAVALGFDGYPALRRHLR

EVAPAEPAPETGSSNEYQQAVEAEIENLRHLAEVLADPRPVRQAGRMLAGSRPLPVLG LRAAAAQAHGFAYFAAKVH

PDVRLLNEGGTMLHDRIDAAARAGASALLCFALPRHPREVVDALIHAKETGLTVVTV ADSPFAPVAGLSDLLLPAAV

GTGLAFDTACAPMLLGRVLLEAMCDDLPDAQARLEEFDVRAAARGLFVD [SEQ ID NO: 16]

>BM38.2_2798 транслированный генный продукт

MSGTGSPAARLQALFEGHRLTPTQRRIAHSMVRRAADVPFLSSVELAELAGVSQPSVT RFAVALGFDGYPALRRHLREVAPAEPAPETGSSNEYQQAVEAEIENLRHLAEVLADPRPVRQ AGRMLAGSRPLPVLGLRAAAAQAHGFAYFAAKVHPDVRLLNEGGTMLHDRIDAAARAGAS ALLCFALPRHPREVVDALIHAKETGLTVVTVADSPFAPVAGLSDLLLPAAVGTGLAFDTACAP MLLGRVLLEAMCDDLPDAQARLEEFDVRAAARGLFVD [SEQ ID NO: 2]

orf3866: Было предсказано, что этот ген кодирует ДНК-связывающийся регулятор ответа в семействе OmpR. Этот ген содержит домен REC, который принимает сигнал от сенсорного партнера в двухкомпонентных системах, и домен «крыло-спираль» (wHTH), характерный для регуляторных белков-антибиотиков Streptomyces (SARP). Мутация G на A приводит к замене Ala на Thr.

>WT_3866 транслированный генный продукт

LPARQAQARTDREHTRTESTGMADQTHVLFVEDDDVIREATQLALERDGFAVTAKPD GLSGLEAFHTDRPDIALLDVMVPGLDGVSLCRRIRDESMVPVIMLSARADAIDVVLGLEAGAD DYVAKPFDGAVLVARIRAVLRRFGRANGGREEPAADAGGVLAFGELEIDTGGMEVRRAGQP VALTPTEMRLLLEFSAAPGTVLSRDKLLERVWEYGWGGDTRVVDVHVQRLRTKIGQDRIETV RGFGYKLKA [SEQ ID NO: 18]

>BM38.2_3866 транслированный генный продукт

LPARQAQARTDREHTRTESTGMADQTHVLFVEDDDVIREATQLALERDGFAVTAKPD GLSGLEAFHTDRPDIALLDVMVPGLDGVSLCRRIRDESMVPVIMLSARADAIDVVLGLEAGAD DYVTKPFDGAVLVARIRAVLRRFGRANGGREEPAADAGGVLAFGELEIDTGGMEVRRAGQP VALTPTEMRLLLEFSAAPGTVLSRDKLLERVWEYGWGGDTRVVDVHVQRLRTKIGQDRIETV RGFGYKLKA

[SEQ ID NO: 4]

orf4755: Было предсказано, что этот ген кодирует фактор РНК-полимеразы сигма-70 семейства сигма-E. Мутация T на G в кодоне Arg (CGT (CGG) представляет собой молчащую мутацию.

>WT_4755 транслированный генный продукт

LHGKTETPVEGMTEEEFDAFYAAAFPRLTGQLYVFTGDLGEAQDVVQEAFVRAWDR RGRLIADEAPEAWVRTVAMRLAVSRWRRAKRWLELVRHSPPPETTPGPGPDRTALVAALRQ LPEHQRMAVVLHHLCDLSVEQVASETGAPVGTVKARLSRGRAALARHLAVDEADESAWRE GGRVG [SEQ ID NO: 24]

>BM38.2_4755 транслированный генный продукт

orf4868: Было предсказано, что этот ген кодирует белок регуляции транскрипции. Этот ген содержит домен приема сигнала REC, который принимает сигнал от сенсорного партнера в двухкомпонентных системах. Делеция (удаление C) в последовательности тандемных повторов приводит к мутации со сдвигом рамки считывания.

>WT_4868 транслированный генный продукт

MRPPVTHHHPAGGAARRPYRLLIVEDEKRLALSLAKGLTAEGYAVDVVHDGREGLHR ATEGTYDLLILDIMLPGLNGYRVCAALRAAGHDVPILMLTAKDGEYDEAEGLDTGADDYLTK PFSYVVLVARIKALLRRRPAGASPIHVHGDLKVDTAARRVFLGEDEVAL [SEQ ID NO: 28]

>BM38.2_4868 транслированный генный продукт

MRPPVTHHHPAGGAARRPYRLLIVEDEKRLALSLAKGLTAEGYAVDVVHDGREGLHR ATEGTYDLLILDIMLPGLNGYRVCAALRAAGHDVPILMLTAKDGEYDEAEGLDTGADDYLTK PFSYVVLVARIKALLRRRPAGASPSMSTATSRWTPPPAASS WARTKWR [SEQ ID NO: 14]

orf5175: Было предсказано, что этот ген кодирует белок регуляции транскрипции гистидин-киназы. Этот ген содержит домен приема сигнала REC, который принимает сигнал от сенсорного партнера в двухкомпонентных системах. Мутация C на T приводит к замене Pro на Ser.

>WT_5175 транслированный генный продукт

MVQKAKILLVDDRPENLLALEAILSALDQTLVRASSGEEALKALLTDDFAVILLDVQM PGMDGFETAAHIKRRERTRDIPIIFLTAINHGPHHTFRGYAAGAVDYISKPFDPWVLRAKVSVF VELYMKNCQLREQAALLRLQLDGGEKDDAEAGDSAGLLAELSARLAAVEEQAEALTKQLND ESTDAAAVATAAHLERKLTGLRRALDALEPGTGSASSVPSQN [SEQ ID NO: 20]

>BM38.2_5175 транслированный генный продукт

MVQKAKILLVDDRPENLLALEAILSALDQTLVRASSGEEALKALLTDDFAVILLDVQM PGMDGFETAAHIKRRERTRDIPIIFLTAINHGSHHTFRGYAAGAVDYISKPFDPWVLRAKVSVF VELYMKNCQLREQAALLRLQLDGGEKDDAEAGDSAGLLAELSARLAAVEEQAEALTKQLND ESTDAAAVATAAHLERKLTGLRRALDALEPGTGSASSVPSQN [SEQ ID NO: 6]

orf5387: Было предсказано, что этот ген кодирует регулятор транскрипции в семействе MerR. Этот ген содержит ДНК-связывающийся домен HTH и домен REC, который принимает сигнал от сенсорного партнера в двухкомпонентной системе. Мутация A на C приводит к замене Tyr на Ser.

>WT_5387 транслированный генный продукт

MVREALAALLELEDDIRVVAEVGSGEDVLDAARGTRPDLVIVDVNMPGLDGLTAAER LREQLPDSRILVLTVLDAPNVLRRAQDVRVDGYLVKNAPVEHLVKAVRQIMAGERVISPELA LAAWEGKASPLTAREADVLRIAAAGAETAEIAEYLHLSPGTVRNYMTTIIAKLDARNRLDAIR IARDAGWLLNS [SEQ ID NO: 22]

>BM38.2_5387 транслированный генный продукт

Очевидно, что все размеры оснований или аминокислот и все величины молекулярного веса или молекулярной массы приводятся здесь для описания нуклеиновых кислот и полипептидов согласно изобретению и имеют приближенные значения для стандартных вариантов измерения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Intervet International B.V.

Intervet Inc.

Zabriskie, T. Mark

<120> Модифицированные изоляты Streptomyces Fungicidicus и их применение

<130> 24130

<150> 62/430,455

<151> 2016-12-06

<160> 50

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 843

<212> ДНК

<213> streptomyces fungicidicus

<400> 1

atgagcggca ccgggagccc tgcggcgcgc ctgcaggcgc tcttcgaggg gcatcggctg 60

acgccgaccc agcggcgcat cgcgcacagc atggtccggc gcgccgccga cgtgccgttc 120

ctgtccagcg tggagctggc cgagctggcc ggggtcagcc agccgtcggt gacccggttc 180

gccgtcgccc tcggcttcga cggctatccg gcgctgcgcc ggcacctgcg cgaggtcgcg 240

cccgccgaac cggcgccgga gaccggctcc tccaacgagt accagcaggc cgtcgaggcc 300

gagatcgaga acctgcggca tctggcggag gtgctggccg acccccggcc ggtgcggcag 360

gccgggcgca tgctggcggg gagccggccg ctgcccgtgc tgggactgcg ggcggcggcg 420

gcccaggcgc acggcttcgc gtacttcgcc gccaaggtcc atcccgacgt acggctgctc 480

aacgagggcg gcaccatgct ccacgaccgg atcgacgccg ccgcgcgggc cggggcgagc 540

gccctgctgt gcttcgcgct gccccgccat ccccgggagg tcgtcgacgc cctcatccac 600

gccaaggaga cggggctgac cgtggtcacc gtcgccgact cgccgttcgc gccggtcgcc 660

gggctgtccg acctgctgct gcccgcggcc gtcgggaccg gcctcgcctt cgacacggcg 720

tgcgcgccga tgctgctggg ccgggtgctg ctggaggcga tgtgcgacga cctgcccgac 780

gcgcaggcac ggctggagga gttcgacgtg agggcggcgg cgcgcggact gttcgtggac 840

tga 843

<210> 2

<211> 280

<212> БЕЛОК

<213> streptomyces fungicidicus

<400> 2

Met Ser Gly Thr Gly Ser Pro Ala Ala Arg Leu Gln Ala Leu Phe Glu

1 5 10 15

Gly His Arg Leu Thr Pro Thr Gln Arg Arg Ile Ala His Ser Met Val

20 25 30

Arg Arg Ala Ala Asp Val Pro Phe Leu Ser Ser Val Glu Leu Ala Glu

35 40 45

Leu Ala Gly Val Ser Gln Pro Ser Val Thr Arg Phe Ala Val Ala Leu

50 55 60

Gly Phe Asp Gly Tyr Pro Ala Leu Arg Arg His Leu Arg Glu Val Ala

65 70 75 80

Pro Ala Glu Pro Ala Pro Glu Thr Gly Ser Ser Asn Glu Tyr Gln Gln

85 90 95

Ala Val Glu Ala Glu Ile Glu Asn Leu Arg His Leu Ala Glu Val Leu

100 105 110

Ala Asp Pro Arg Pro Val Arg Gln Ala Gly Arg Met Leu Ala Gly Ser

115 120 125

Arg Pro Leu Pro Val Leu Gly Leu Arg Ala Ala Ala Ala Gln Ala His

130 135 140

Gly Phe Ala Tyr Phe Ala Ala Lys Val His Pro Asp Val Arg Leu Leu

145 150 155 160

Asn Glu Gly Gly Thr Met Leu His Asp Arg Ile Asp Ala Ala Ala Arg

165 170 175

Ala Gly Ala Ser Ala Leu Leu Cys Phe Ala Leu Pro Arg His Pro Arg

180 185 190

Glu Val Val Asp Ala Leu Ile His Ala Lys Glu Thr Gly Leu Thr Val

195 200 205

Val Thr Val Ala Asp Ser Pro Phe Ala Pro Val Ala Gly Leu Ser Asp

210 215 220

Leu Leu Leu Pro Ala Ala Val Gly Thr Gly Leu Ala Phe Asp Thr Ala

225 230 235 240

Cys Ala Pro Met Leu Leu Gly Arg Val Leu Leu Glu Ala Met Cys Asp

245 250 255

Asp Leu Pro Asp Ala Gln Ala Arg Leu Glu Glu Phe Asp Val Arg Ala

260 265 270

Ala Ala Arg Gly Leu Phe Val Asp

275 280

<210> 3

<211> 759

<212> ДНК

<213> streptomyces fungicidicus

<400> 3

ttgccggccc gccaggcgca ggcgcgcacc gaccgagagc acacgaggac tgagagcacc 60

gggatggcag accagaccca cgtcctgttc gtcgaggacg acgacgtcat ccgcgaggcc 120

acccagctgg ccctggagcg ggacggcttc gcggtcaccg cgaagcccga cgggctgtcg 180

ggcctggagg cgttccacac cgaccgtccc gacatcgcgc tgctggacgt catggtcccc 240

ggtctggacg gggtgagcct gtgccggcgc atacgggacg agtcgatggt gccggtgatc 300

atgctgtcgg cgcgggccga cgccatcgac gtggtgctgg gcctggaggc gggcgccgac 360

gactatgtga ccaagccgtt cgacggcgcc gtgctggtgg cccggatccg cgcggtgctg 420

cgccgcttcg ggcgggcgaa cggcggccgg gaggaaccgg cggcggacgc cgggggtgtg 480

ctggcgttcg gcgaactgga gatcgacacc gggggcatgg aggtgcgccg ggcggggcag 540

ccggtggcgc tgacgccgac cgagatgcgg ctgctgctgg agttctcggc ggcgccgggc 600

acggtgctct cccgcgacaa gctgctcgaa cgggtgtggg agtacggctg gggcggtgac 660

acccgggtcg tcgacgtcca tgtgcagcgg ctgcgcacga agatcggcca ggaccgcatc 720

gagacggtcc gcggtttcgg ttacaagctg aaggcctga 759

<210> 4

<211> 252

<212> БЕЛОК

<213> streptomyces fungicidicus

<400> 4

Leu Pro Ala Arg Gln Ala Gln Ala Arg Thr Asp Arg Glu His Thr Arg

1 5 10 15

Thr Glu Ser Thr Gly Met Ala Asp Gln Thr His Val Leu Phe Val Glu

20 25 30

Asp Asp Asp Val Ile Arg Glu Ala Thr Gln Leu Ala Leu Glu Arg Asp

35 40 45

Gly Phe Ala Val Thr Ala Lys Pro Asp Gly Leu Ser Gly Leu Glu Ala

50 55 60

Phe His Thr Asp Arg Pro Asp Ile Ala Leu Leu Asp Val Met Val Pro

65 70 75 80

Gly Leu Asp Gly Val Ser Leu Cys Arg Arg Ile Arg Asp Glu Ser Met

85 90 95

Val Pro Val Ile Met Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ala Ile Asp Val Val

100 105 110

Leu Gly Leu Glu Ala Gly Ala Asp Asp Tyr Val Thr Lys Pro Phe Asp

115 120 125

Gly Ala Val Leu Val Ala Arg Ile Arg Ala Val Leu Arg Arg Phe Gly

130 135 140

Arg Ala Asn Gly Gly Arg Glu Glu Pro Ala Ala Asp Ala Gly Gly Val

145 150 155 160

Leu Ala Phe Gly Glu Leu Glu Ile Asp Thr Gly Gly Met Glu Val Arg

165 170 175

Arg Ala Gly Gln Pro Val Ala Leu Thr Pro Thr Glu Met Arg Leu Leu

180 185 190

Leu Glu Phe Ser Ala Ala Pro Gly Thr Val Leu Ser Arg Asp Lys Leu

195 200 205

Leu Glu Arg Val Trp Glu Tyr Gly Trp Gly Gly Asp Thr Arg Val Val

210 215 220

Asp Val His Val Gln Arg Leu Arg Thr Lys Ile Gly Gln Asp Arg Ile

225 230 235 240

Glu Thr Val Arg Gly Phe Gly Tyr Lys Leu Lys Ala

245 250

<210> 5

<211> 678

<212> ДНК

<213> streptomyces fungicidicus

<400> 5

atggtgcaga aggccaagat cctcctggtc gatgaccggc cggagaatct gctcgcgctg 60

gaggcgatcc tctcggcgct cgatcagacg ctggtgcggg catcgtccgg ggaggaagcg 120

ctcaaagcgc tgctgacgga cgacttcgcg gtcattctgc tggacgtcca gatgccgggc 180

atggacggtt tcgagaccgc ggcccacatc aagcggcggg aacgcacccg ggacatcccg 240

atcatcttcc tcaccgcgat caaccacggt tcgcaccaca cgttccgggg ctacgcggcg 300

ggtgcggtcg actacatctc gaagccgttc gacccgtggg tgctgcgcgc gaaggtctcg 360

gtcttcgtcg agctgtacat gaagaactgc cagctgcggg agcaggcggc gctgctgcgg 420

ctccagttgg acggcggcga gaaggacgat gccgaggcag gcgactcggc ggggctgctc 480

gccgagctgt cggcgcggct cgcggccgtc gaggagcagg ccgaggcgct gaccaagcag 540

ctcaacgacg agtcgacgga cgcggccgcg gtggccacgg cggctcatct ggagcgcaag 600

ctcacggggt tgcggcgggc gctggacgcc ctggagcccg ggaccggcag cgcgtcgtcg 660

gtgccgtcgc agaactga 678

<210> 6

<211> 225

<212> БЕЛОК

<213> streptomyces fungicidicus

<400> 6

Met Val Gln Lys Ala Lys Ile Leu Leu Val Asp Asp Arg Pro Glu Asn

1 5 10 15

Leu Leu Ala Leu Glu Ala Ile Leu Ser Ala Leu Asp Gln Thr Leu Val

20 25 30

Arg Ala Ser Ser Gly Glu Glu Ala Leu Lys Ala Leu Leu Thr Asp Asp

35 40 45

Phe Ala Val Ile Leu Leu Asp Val Gln Met Pro Gly Met Asp Gly Phe

50 55 60

Glu Thr Ala Ala His Ile Lys Arg Arg Glu Arg Thr Arg Asp Ile Pro

65 70 75 80

Ile Ile Phe Leu Thr Ala Ile Asn His Gly Ser His His Thr Phe Arg

85 90 95

Gly Tyr Ala Ala Gly Ala Val Asp Tyr Ile Ser Lys Pro Phe Asp Pro

100 105 110

Trp Val Leu Arg Ala Lys Val Ser Val Phe Val Glu Leu Tyr Met Lys

115 120 125

Asn Cys Gln Leu Arg Glu Gln Ala Ala Leu Leu Arg Leu Gln Leu Asp

130 135 140

Gly Gly Glu Lys Asp Asp Ala Glu Ala Gly Asp Ser Ala Gly Leu Leu

145 150 155 160

Ala Glu Leu Ser Ala Arg Leu Ala Ala Val Glu Glu Gln Ala Glu Ala

165 170 175

Leu Thr Lys Gln Leu Asn Asp Glu Ser Thr Asp Ala Ala Ala Val Ala

180 185 190

Thr Ala Ala His Leu Glu Arg Lys Leu Thr Gly Leu Arg Arg Ala Leu

195 200 205

Asp Ala Leu Glu Pro Gly Thr Gly Ser Ala Ser Ser Val Pro Ser Gln

210 215 220

Asn

225

<210> 7

<211> 582

<212> ДНК

<213> streptomyces fungicidicus

<400> 7

atggtgcggg aagcgctggc cgcactgctc gaactcgagg acgacatccg ggtggtggca 60

gaagtcggct ccggtgagga cgtactcgac gcggccaggg gaacacgtcc cgacctcgtg 120

atcgtggacg tcaacatgcc gggactcgac gggctcaccg cggccgagcg gctgcgcgag 180

cagctgcccg actcccgcat cctggtgctg accgtcctgg acgcgcccaa cgtcctgcgc 240

cgggcgcagg acgtccgggt cgacggctac ctcgtcaaga acgctccggt ggagcacctc 300

gtcaaggccg tgcgccagat catggccggg gaacgcgtca tctcaccgga gctggcgctg 360

gccgcctggg agggcaaggc cagcccgctc accgcgcggg aggccgatgt gctccggatc 420

gcggcggccg gcgcggagac cgccgagatc gccgagtacc tgcatctttc accgggcacg 480

gtgcggaact ccatgaccac catcatcgcc aagctcgacg cgcgcaaccg gctcgacgcc 540

atccgcatcg cacgcgacgc cgggtggctc ctcaactcct ga 582

<210> 8

<211> 193

<212> БЕЛОК

<213> streptomyces fungicidicus

<400> 8

Met Val Arg Glu Ala Leu Ala Ala Leu Leu Glu Leu Glu Asp Asp Ile

1 5 10 15

Arg Val Val Ala Glu Val Gly Ser Gly Glu Asp Val Leu Asp Ala Ala

20 25 30

Arg Gly Thr Arg Pro Asp Leu Val Ile Val Asp Val Asn Met Pro Gly

35 40 45

Leu Asp Gly Leu Thr Ala Ala Glu Arg Leu Arg Glu Gln Leu Pro Asp

50 55 60

Ser Arg Ile Leu Val Leu Thr Val Leu Asp Ala Pro Asn Val Leu Arg

65 70 75 80

Arg Ala Gln Asp Val Arg Val Asp Gly Tyr Leu Val Lys Asn Ala Pro

85 90 95

Val Glu His Leu Val Lys Ala Val Arg Gln Ile Met Ala Gly Glu Arg

100 105 110

Val Ile Ser Pro Glu Leu Ala Leu Ala Ala Trp Glu Gly Lys Ala Ser

115 120 125

Pro Leu Thr Ala Arg Glu Ala Asp Val Leu Arg Ile Ala Ala Ala Gly

130 135 140

Ala Glu Thr Ala Glu Ile Ala Glu Tyr Leu His Leu Ser Pro Gly Thr

145 150 155 160

Val Arg Asn Ser Met Thr Thr Ile Ile Ala Lys Leu Asp Ala Arg Asn

165 170 175

Arg Leu Asp Ala Ile Arg Ile Ala Arg Asp Ala Gly Trp Leu Leu Asn

180 185 190

Ser

<210> 9

<211> 549

<212> ДНК

<213> streptomyces fungicidicus

<400> 9

ttgcacggga agaccgagac accggtggag ggcatgaccg aggaagagtt cgacgctttc 60

tacgcggccg cgttcccccg cctgaccgga cagttgtacg tcttcaccgg tgacctcggc 120

gaggcccagg acgtcgtcca ggaggcgttc gtacgggcct gggaccggcg cgggaggctg 180

atcgccgacg aggcgcccga ggcgtgggtg cgcaccgtcg ccatgcggct cgcggtgagc 240

cgctggcgcc gcgcgaaacg ctggctggaa ctcgtacggc actccccgcc cccggagacg 300

acccccggcc cgggccccga ccgcaccgcc ctggtcgccg cgctgcgcca actgcccgag 360

caccagcgca tggccgtcgt cctccatcac ctgtgcgacc tcagcgtcga acaggtagcc 420

tccgagaccg gcgcacccgt gggcacggtc aaggccaggc tctcccgcgg acgggcggca 480

ctggccagac atctggcggt ggacgaggcc gacgagtcgg cctggaggga gggcggccgg 540

gtcggatga 549

<210> 10

<211> 182

<212> БЕЛОК

<213> streptomyces fungicidicus

<400> 10

Leu His Gly Lys Thr Glu Thr Pro Val Glu Gly Met Thr Glu Glu Glu

1 5 10 15

Phe Asp Ala Phe Tyr Ala Ala Ala Phe Pro Arg Leu Thr Gly Gln Leu

20 25 30

Tyr Val Phe Thr Gly Asp Leu Gly Glu Ala Gln Asp Val Val Gln Glu

35 40 45

Ala Phe Val Arg Ala Trp Asp Arg Arg Gly Arg Leu Ile Ala Asp Glu

50 55 60

Ala Pro Glu Ala Trp Val Arg Thr Val Ala Met Arg Leu Ala Val Ser

65 70 75 80

Arg Trp Arg Arg Ala Lys Arg Trp Leu Glu Leu Val Arg His Ser Pro

85 90 95

Pro Pro Glu Thr Thr Pro Gly Pro Gly Pro Asp Arg Thr Ala Leu Val

100 105 110

Ala Ala Leu Arg Gln Leu Pro Glu His Gln Arg Met Ala Val Val Leu

115 120 125

His His Leu Cys Asp Leu Ser Val Glu Gln Val Ala Ser Glu Thr Gly

130 135 140

Ala Pro Val Gly Thr Val Lys Ala Arg Leu Ser Arg Gly Arg Ala Ala

145 150 155 160

Leu Ala Arg His Leu Ala Val Asp Glu Ala Asp Glu Ser Ala Trp Arg

165 170 175

Glu Gly Gly Arg Val Gly

180

<210> 11

<211> 769

<212> ДНК

<213> streptomyces fungicidicus

<400> 11

gtggtgtcac tgactgacaa gatgtcggcg aacgccattt cggatgtgtg gacggcgggc 60

ggacggcggc ccctcgttat gctgcggggg gggggcagag gacggggacg gtggagcgag 120

cgtgcgccag acgccggttg aggcactgcg gcaggggacg acgggggccg ggggcctgtc 180

cctcgtcgag cgccgcaagg cggcactgcg cttcgagatc gcctgcgcgg cggtgcactt 240

gttcacctcg cagggggtcg ccgccacgac gggcgaacag atcgcgcagt ccgtggggat 300

ctcctcccgc accctgtggc gccatttccc cacgaaggag agctgcgtcc ttcccctgct 360

gacggcggcg ctcgacttcg ccgtggaccg cctgcgtcac tggccggcgg agacgagcct 420

gctggacttc ttcgccgaga cctgccgcaa gggtgacctg cccgccgcca ccccggagat 480

cctcgacctg atccgcatga cctccaccga accggccctg cgcgccgtgt ggctccaggc 540

ccacgacgac gcgcttcccg tcctcggcgg gcttctcgcg cggcgctccg gcgccgatgc 600

cggcgacctg agggtgacgg tgcacgcggc gacgctgaac ggcgccctgc gggcggcggt 660

ggaggacttc gcccggcggt acgcggaccg gccggacgcc gcggacgccg aactcgcccg 720

ctgtctcgac gccgccctgc gcgcggcctc ggagggactc ccctactga 769

<210> 12

<211> 46

<212> БЕЛОК

<213> streptomyces fungicidicus

<400> 12

Val Val Ser Leu Thr Asp Lys Met Ser Ala Asn Ala Ile Ser Asp Val

1 5 10 15

Trp Thr Ala Gly Gly Arg Arg Pro Leu Val Met Leu Arg Gly Gly Gly

20 25 30

Arg Gly Arg Gly Arg Trp Ser Glu Arg Ala Pro Asp Ala Gly

35 40 45

<210> 13

<211> 504

<212> ДНК

<213> streptomyces fungicidicus

<400> 13

atgcgcccgc ccgtcaccca ccaccaccct gccggaggcg ctgcgcgccg cccctatcga 60

ctcttgatcg tggaggacga gaaacgcctc gctctctccc tcgccaaggg actcaccgcc 120

gagggctacg ccgtggacgt cgtccacgac ggccgggagg gcctgcaccg ggccacggag 180

gggacgtacg acctcctcat cctggacatc atgctgcccg gtctcaacgg ctaccgggtc 240

tgcgccgcgc tccgcgccgc cggacacgac gtgccgatcc tgatgctcac ggccaaggac 300

ggcgagtacg acgaggcgga gggcctggac accggcgccg acgactacct caccaagccg 360

ttctcgtacg tcgtcctcgt cgccaggatc aaggcgctgc tgcgccgccg gccggccggg 420

gcctccccat ccatgtccac ggcgacctca aggtggacac cgccgcccgc cgcgtcttcc 480

tgggcgagga cgaagtggcg ctga 504

<210> 14

<211> 167

<212> БЕЛОК

<213> streptomyces fungicidicus

<400> 14

Met Arg Pro Pro Val Thr His His His Pro Ala Gly Gly Ala Ala Arg

1 5 10 15

Arg Pro Tyr Arg Leu Leu Ile Val Glu Asp Glu Lys Arg Leu Ala Leu

20 25 30

Ser Leu Ala Lys Gly Leu Thr Ala Glu Gly Tyr Ala Val Asp Val Val

35 40 45

His Asp Gly Arg Glu Gly Leu His Arg Ala Thr Glu Gly Thr Tyr Asp

50 55 60

Leu Leu Ile Leu Asp Ile Met Leu Pro Gly Leu Asn Gly Tyr Arg Val

65 70 75 80

Cys Ala Ala Leu Arg Ala Ala Gly His Asp Val Pro Ile Leu Met Leu

85 90 95

Thr Ala Lys Asp Gly Glu Tyr Asp Glu Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gly

100 105 110

Ala Asp Asp Tyr Leu Thr Lys Pro Phe Ser Tyr Val Val Leu Val Ala

115 120 125

Arg Ile Lys Ala Leu Leu Arg Arg Arg Pro Ala Gly Ala Ser Pro Ser

130 135 140

Met Ser Thr Ala Thr Ser Arg Trp Thr Pro Pro Pro Ala Ala Ser Ser

145 150 155 160

Trp Ala Arg Thr Lys Trp Arg

165

<210> 15

<211> 843

<212> ДНК

<213> streptomyces fungicidicus

<400> 15

atgggcggca ccgggagccc tgcggcgcgc ctgcaggcgc tcttcgaggg gcatcggctg 60