Способ выращивания растительного сырья ириса сибирского (iris sibirica l.) с заданным содержанием экстрактивных веществ
Владельцы патента RU 2773523:
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Алтайский государственный университет" (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для индустриального производства высокоценного сырья с целью получения лекарств, биологически активных добавок, функциональных пищевых продуктов, лечебно-профилактической косметики и индивидуальных биологически активных веществ. Изобретение представляет собой способ получения растительного сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.) клональным микроразмножением и выращиванием в условиях гидропоники с заданным содержанием экстрактивных веществ, включающий введение эксплантов в культуру in vitro, культивирование на питательной среде MS для получения регенерантов, их размножение и укоренение, согласно изобретению культивирование проводят на трехъярусной универсальной аэропонной установке, заполненной питательным раствором по прописи Мурасиге-Скуга с концентрацией макро-, микросолей, кальция хлористого и хелата железа с добавлением 10,0 мкМ БАП + 1,0 мкМ НУК + 0,1 мкМ ИМК для получения сырья с содержанием экстрактивных веществ 15,5±0,5% на абсолютно сухое сырье (на а.с.с.) и флавоноидов 6,9±0,9% на а.с.с., или 5,0 мкМ БАП для получения сырья с содержанием гидроксикоричных кислот 5,19±0,09% на а.с.с. и дубильных веществ 2,0±0,3% на а.с.с. Посредством изобретения осуществляется выход растительного сырья ириса сибирского с заданным содержанием флавоноидов, гидроксикоричных кислот и дубильных веществ. 1 ил., 1 табл., 4 пр.
Изобретение относится к биотехнологии, фармакологии, физиологии растений и может быть использовано для индустриального производства высокоценного сырья с целью получения лекарств, биологически активных добавок, функциональных пищевых продуктов, лечебно-профилактической косметики и индивидуальных биологически активных веществ.
Биологически активные вещества в течение многих десятилетий получали преимущественно из дикорастущих растений. Однако такой подход со временем приводит к исчерпанию их природных популяций и ставит отдельные виды лекарственных растений на грань исчезновения. Нельзя забывать и о том, что многие лекарственные растения относятся к исчезающим видам, имеющим узкий ареал распространения. Продовольственная и сельскохозяйственная организация (ФАО) при Организации Объединенных Наций (ООН) ежегодно публикует безвозвратные потери видов растений, в том числе лекарственных, в связи с варварскими методами заготовки.
Выращивание растений на плантациях - прекрасная альтернатива сбору дикорастущих растений, хотя это и требует больших экономических затрат. Появляются проблемы и с качеством сырья, поскольку возникает необходимость использования инсектицидов, гербицидов и других поллютантов. Новым и перспективным подходом для получения вторичных метаболитов растительного происхождения является использование биотехнологических методов. Известен способ получения культуры чая (Camellia sinensis L.), включающий выращивание каллусов на питательной среде, содержащей макро- и микросоли, витамины, аденин, дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), агар, при 26°С, перенос их в жидкую питательную среду того же состава и воздействие L-фенилаланина в концентрации 3 мМ, причем неизмельченный каллус помещают в жидкую питательную среду Хеллера, содержащую макро- и микросоли по Хеллеру, витамины по Уайту, мезоинозит - 20 мг/л, Са-пантотенат - 0,1 мг/л, аденин - 5 мг/л, 2,4-Д - 5 мг/л, глюкозу - 25 г/л, выращивают при относительной влажности воздуха 70%, на качалке с частотой 90 об/мин в условиях темноты 14 дней, а в качестве растворителя для L-фенилаланина используют воду. Изобретение позволяет увеличить количество фенилпропаноидов в 4-5 раз по сравнению с контролем, что отмечается на протяжении всего цикла выращивания. Прирост каллусной культуры чая в темноте к 14 дню культивирования составляет 135,2%), что является ее характерной особенностью (Патент РФ №2709692 МПК А01Н 4/00 Способ получения каллусной культуры чайного растения (Camellia sinensis. L.) / Нечаева Т.Л., Гончарук Е.А., Зубова М.Ю., Загоскина Н.В. Заявитель и патентообладатель: ФГБУН РАН «Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева». Заявка №2019110068 от 05.04.2019, патент опубликован 19.12.2019). Недостатком данного способа является использование каллусной культуры и малых объемов получения сырья в лабораторных условиях.
Такие биотехнологические подходы, как гидропонные технологии, имеют потенциал для крупномасштабного выращивания растений и производства вторичных метаболитов. Микроклональное размножение дает возможность получить здоровый посадочный материал в необходимом количестве, независимо от времени года, в том числе многолетних и трудно размножаемых видов. Сочетание этих двух технологических подходов позволяют предложить биотехнологию производства лекарственного растительного сырья в промышленных объемах.
Известен способ микроклонального размножения ириса сибирского (Патент РФ №2479992, МПК А01Н 4/00 Способ микроклонального размножения ириса сибирского (I. sibirica L), / Тихомирова Л.И., Смирнов С.В., Куцев М.Г. Заявитель и патентообладатель: ФГБОУ ВПО «Алтайский государственный университет». Заявка №2011143089 от 25.10.2011, патент опубликован 27.04.2013). Данный способ предполагает размножение культуре ткани I. sibirica за счет получения регенерантов прямым методом, минуя каллусную культуру, и повышение выхода саженцев за счет увеличения коэффициента размножения.
Недостатком данного способа (аналога) является отсутствие этапа адаптации и выращивания I. sibirica, с целью получения растительной биомассы.
Наиболее близким (прототипом) является способ получения растительного сырья ириса сибирского (Патент РФ №2677921 МПК: А01Н 4/00 «Способ получения растительного сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.) методами биотехнологии» / Тихомирова Л.И., Базарнова Н.Г., Ильичева Т.Н. Заявитель: ФГБОУ ВПО «Алтайский государственный университет», Заявка на патент №2017142221 от 21.11.2017, патент опубликован 22.01.2019). Данный способ предполагает получение растительного сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.) клональным микроразмножением и выращиванием в условиях гидропоники, включает следующие этапы: введение эксплантов в культуру in vitro, культивирование на питательной среде MS для получения регенерантов их размножение и укоренение. На этапе собственно микроразмножения чередуют питательные среды через один пассаж содержащие MS + (2,5-10,0) мкМ БАП + 1,0 мкМ НУК + 0,1 мкМ ИМК и MS + 1 мкМ БАП + 100 мг/л L-глютамин + 100 мг/л аденин сульфат, полученный посадочный материал выращивают в гидропонной установке промышленного образца на питательной среде MS, содержащей половинный набор макросолей и микросолей, полный набор витаминов, хелата железа и кальция хлористого.
В производстве лекарственного растительного сырья преследуют две цели: наращивание биомассы и накопление растениями максимального количества биологически активных соединений. Недостатком данного способа (прототипа) является отсутствие возможности регулирования содержания в сырье экстрактивных веществ.
Задачей заявляемого изобретения является выращивание методами биотехнологии растительного сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.) с заданным содержанием экстрактивных, в том числе флавоноидов, гидроксикоричных кислот и дубильных веществ.
Пример 1. Питательные среды готовят по прописи MS (Мурасиге и Скуга), содержащие 30 г/л сахарозы. В них вводят фитогормоны 2,5-10,0 мкМ БАП (6-бензиламинопурин), 1,0 мкМ НУК (α-нафтилуксусную кислоту) и 0,1 мкМ ИМК (3-индолилмасляную кислоту). рН среды доводят до 5,8-5,9 и добавляют 0,6% агара. Среды разливают в пластиковые контейнеры (по 30 мл в каждый) или в культуральные флаконы (по 10 мл в каждый). Автоклавируют приготовленные питательные среды в течение 20 мин. при 120°С. Экспланты культивируют в условиях фотопериода 16/8 часов свет/темнота при 24-260°С. Через 30 суток в ткани эксплантов развиваются вегетативные побеги, достаточной величины для пересадки на среды размножения. Укоренение проводят на питательной среде MS, дополненной 3,0 мкМ НУК.
Растения-регенеранты размноженные на питательной среде MS + (2,5-10,0) мкМ БАП + 1,0 мкМ НУК + 0,1 мкМ ИМК и укорененные на среде с 3,0 мкМ НУК отмывают от остатков агара и пересаживают в аэропонную установку для адаптации и выращивания растительной биомассы. В работе используют трехъярусную универсальную аэропонную установку (фиг. 1), разработанную в ФГБНУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии (автор и разработчик Ю.Ц. Мартиросян). Установка построена по принципу модульности и может быть использована для научно-исследовательских работ для размножения и выращивания сельскохозяйственных и лекарственных растений. Для аэропонного выращивания объектов исследования питательный раствор готовят по прописи Мурасиге-Скуга с 
концентрации мкро-, микросолей, кальция хлористого и хелата железа.
Для получения сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.), с максимальным в пределах опыта содержанием экстрактивных веществ 15,5±0,5% на абсолютно сухое сырье (на а.с.с), необходимо выращивать биомассу на питательной среде MS + 10,0 мкМ БАП + 1,0 мкМ НУК + 0,1 мкМ ИМК (таблица 1).
Содержание экстрактивных веществ определяют в соответствии с ОФС.1.5.3.0006.15 (ОФС 1.5.3.006.15 Определение содержания экстрактивных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах // ГФ РФ XIV. 2018. Т. 2. С. 2355-2360).
Пример 2. Получение растительного сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.) осуществляют аналогично Примеру 1. Для получения сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.), с наибольшим в пределах опыта содержанием флавоноидов 6,9±0,9% на а.с.с, необходимо выращивать биомассу на питательной среде MS + 10,0 мкМБАП + 1,0 мкМ НУК + 0,1 мкМ (таблица 1).
Для определения содержания суммы флавоноидов берут около 1,0 г сухого сырья, помещают в круглодонную колбу вместимостью 100 мл, заливают 30 мл 70% этилового спирта, нагревают до кипения и кипятят в течение 30 минут. Полученный экстракт фильтруют через беззольный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Отфильтрованное сырье повторно дважды подвергают экстракции. Объединенное извлечение доводят до метки 70% этиловым спиртом.
Аликвоту извлечения, равную 1 мл, помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляют 2 мл 2% раствора алюминия хлорида, 0,5 мл кислоты уксусной и доводят объем раствора до метки водой. Раствор сравнения готовят следующим образом: в мерную колбу вместимостью 25 мл вносят 1 мл извлечения, 2 мл спирта этилового 96%, 0,5 мл кислоты уксусной и доводят водой до метки. Спустя 40 минут измеряют оптическую плотность полученного комплекса флавоноидов в извлечении с алюминия хлоридом на спектрофотометре в кювете с толщиной стенки 10 мм при длине волны 396 нм. Длина волны 396 нм наиболее близка к максимуму поглощения апигенина (398 нм). Содержание суммы флавоноидов в пересчете на апигенин (в % на а.с.с.) рассчитывают по формуле с использованием удельного показателя поглощения апигенина (491):
где: А - оптическая плотность испытуемого раствора; W - потеря в массе при высушивании сырья, в %.
Пример 3. Получение растительного сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.) осуществляют аналогично Примеру 1. Для получения сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.), с наибольшим в пределах опыта содержанием гидроксикоричных кислот 5,19±0,09% на а.с.с, необходимо выращивать биомассу на питательной среде MS + 5,0 мкМБАП (таблица 1).
Для определения содержания суммы гидроксикоричных кислот берут около 1.0 г измельченного сухого сырья, помещают в колбу вместимостью 200 мл, заливают 100 мл спирта этилового 70%. Колбу с содержимым взвешивают и присоединяют к обратному холодильнику для экстрагирования на кипящей водяной бане в течение 45 минут. После охлаждения колбу взвешивают и при необходимости доводят до первоначальной массы спиртом этиловым 70%, извлечения фильтруют через бумажный фильтр и отбрасывают первые 10 мл фильтрата.
0,5 мл полученного извлечения переносят в мерную колбу на 25 мл и доводят объем спиртом этиловым 70% до метки. Оптическую плотность приготовленного раствора измеряют на спектрофотометре в кювете с толщиной стенки 10 мм при длине волны 328 нм. В качестве раствора сравнения используют спирт этиловый 50%.
Содержание суммы гидроксикоричных кислот в пересчете на хлорогеновую кислоту вычисляют по формуле с использованием удельного показателя поглощения хлорогеновой кислоты (504).
где: А - оптическая плотность испытуемого раствора; W - потеря в массе при высушивании сырья, в %, m - масса навески сырья.
Пример 4. Получение растительного сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.) осуществляют аналогично Примеру 1. Для получения сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.), с наибольшим в пределах опыта содержанием дубильных веществ 2,0±0,3% на а.с.с, необходимо выращивать биомассу на питательной среде MS + 5,0 мкМБАП (таблица 1).
Содержание экстрактивных веществ определяют в соответствии с ОФС.1.5.3.00008.18. (ОФС.1.5.3.00008.18. Определение содержания дубильных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах // ГФ РФ XIV. 2018. Том II. С. 2365-2369).
Способ получения растительного сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.) клональным микроразмножением и выращиванием в условиях гидропоники с заданным содержанием экстрактивных веществ, включающий введение эксплантов в культуру in vitro, культивирование на питательной среде MS для получения регенерантов, их размножение и укоренение, отличающийся тем, что культивирование проводят на трехъярусной универсальной аэропонной установке, представленной на фиг.1, заполненной питательным раствором по прописи Мурасиге-Скуга с 
концентрации макро-, микросолей, кальция хлористого и хелата железа с добавлением 10,0 мкМ БАП + 1,0 мкМ НУК + 0,1 мкМ ИМК для получения сырья с содержанием экстрактивных веществ 15,5±0,5% на абсолютно сухое сырье (на а.с.с.) и флавоноидов 6,9±0,9% на а.с.с., или 5,0 мкМ БАП для получения сырья с содержанием гидроксикоричных кислот 5,19±0,09% на а.с.с. и дубильных веществ 2,0±0,3% на а.с.с.
